1
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS
GRUPO DE INVESTIGACIÓN EN COLORANTES NATURALES
EVALUACIÓN DEL ACEITE ESENCIAL EXTRAÍDO DEL ARRAYÁN (Myrciantes rophaloides) APLICADO A SOPORTE DE PAPEL DE CARÁCTER
PATRIMONIAL. ASPECTOS QUÍMICOS Y MICROBIOLÓGICOS
RUBEN DARIO LAVERDE FONSECA
ESTUDIANTE DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
BOGOTÁ D.C. SEPTIEMBRE 2015
2
3
TABLA DE CONTENIDO
I. INTRODUCCION ............................................................................................................ 5
II. OBJETIVOS .................................................................................................................. 5
1. MARCO TEORICO ........................................................................................................ 5
1.1. CARACTERÍSTICAS DE LA ESPECIE .............................................................................. 5 1.2. SISTEMA DE ARRASTRE CON VAPOR ........................................................................... 6 1.3. ACEITES ESENCIALES ................................................................................................ 6
1.3.1. Análisis y control de calidad del aceite esencial ............................................... 7 1.3.1.1. Índice de refracción ........................................................................................... 8 1.3.1.2. Densidad ......................................................................................................... 9 1.3.1.3. Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (CG-MS) ................. 9
1.4. EL PAPEL ................................................................................................................ 10 1.4.1. Deterioro y biodeterioro del papel ................................................................... 11 1.4.2. Tratamiento del biodeterioro en papel ............................................................ 11 1.4.3. Índices de degradación del papel ................................................................... 11
2. PROCEDIMIENTO ....................................................................................................... 12
2.1. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ................................................................................ 12 2.2. OBTENCIÓN DEL ACEITE ESENCIAL ........................................................................... 12 2.3. DETERMINACIÓN DE CONSTANTES FÍSICAS Y RENDIMIENTO ........................................ 13
2.3.1 Índice de refracción ......................................................................................... 13 2.3.2 Densidad ......................................................................................................... 13 2.3.3 Rendimiento .................................................................................................... 14
2.4. CARACTERIZACIÓN CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE
MASAS (CG-MS) ........................................................................................................... 14 2.5. PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS ................................................................................... 15
2.5.1. Ensayo por contacto ....................................................................................... 15 2.5.2. Ensayo por componentes volátiles ................................................................. 15
2.6. CARACTERIZACIÓN Y TRATAMIENTO PARA LAS MUESTRAS DE PAPEL ........................... 15 2.7. ANÁLISIS DE DEGRADACIÓN DE CELULOSA EN MUESTRAS DE PAPEL ............................ 17
2.7.1. Método de Nelson-Somogyi ........................................................................... 17 2.7.2. Método de Dubois .......................................................................................... 19
2.8. DETERMINACIÓN DE PH ........................................................................................... 21 2.8.1. Método de determinación de la concentración de iones hidrogeno (pH) en extracto de papel (método de extracción en frio) ...................................................... 21 2.8.2. Método de determinación de la concentración de iones hidrogeno (pH) de superficie ................................................................................................................. 21
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................... 21
3.1 ÍNDICE DE REFRACCIÓN, DENSIDAD Y RENDIMIENTO .................................................... 22 3.2. CARACTERIZACIÓN CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE
MASAS (CG-MS) ........................................................................................................... 22 3.3. PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS ................................................................................... 27 3.4. EVALUACIÓN DE LOS MÉTODOS ................................................................................ 28
3.4.1 análisis de degradación de celulosa ................................................................ 28 3.4.1.1. Método de Nelson-Somogyi ............................................................................. 28 3.4.1.2. Método de Dubois ........................................................................................... 28 3.4.2. Determinación de pH en muestras de papel ................................................... 28
4
3.4.2.1. Método de determinación de la concentración de iones hidrogeno (pH) en extracto de
papel ......................................................................................................................... 28 3.4.2.2. Método de determinación de la concentración de iones hidrogeno (pH) por contacto
................................................................................................................................. 29 3.5. CARACTERIZACIÓN DEL PAPEL CON CARÁCTER PATRIMONIAL ..................................... 29 3.6. ANÁLISIS DE DEGRADACIÓN DE CELULOSA EN EL PAPEL PATRIMONIAL ......................... 30 3.7. DETERMINACIÓN DE PH EN EL PAPEL CON CARÁCTER PATRIMONIAL............................ 32
4. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 32
BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................... 33
5
I. INTRODUCCION Este trabajo de grado, modalidad pasantía de investigación, se desarrolló como parte del proyecto de Investigación: ”Estudio de aceites esenciales a partir de especies vegetales promisorias, como posibles productos de control del biodeterioro del patrimonio bibliográfico Colombiano” en el marco del convenio de cooperación No. 1078/13 suscrito entre la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, Proyecto Curricular de Licenciatura en Química y el Ministerio de Cultura, Biblioteca Nacional de Colombia. En su desarrollo se estudiaron los posibles efectos de la aplicación del aceite esencial de Arrayán (Myrcianthes rophaloides) como control biocida en el papel patrimonial. A partir de la extracción y monitoreo del aceite obtenido, de la selección y empleo de métodos para la aplicación optima del aceite sobre el papel, caracterización del papel patrimonial empleado, control de la actividad biocida y adecuación de análisis para evaluar los índices de degradación del papel que se manifiestan principalmente en cambios en el contenido de celulosa y variación del pH.
II. OBJETIVOS
General Evaluar la acción química y microbiológica del aceite esencial del Arrayán (Myrciantes rophaloides) aplicado sobre soporte de papel, como agente biocida en documentación patrimonial. Específicos Establecer el diseño experimental de obtención del aceite esencial y monitoreo para verificar las condiciones de composición, estabilidad y rendimiento para su aplicación sobre soportes de papel en documentos patrimoniales. Establecer un diseño experimental para la evaluación de la acción de los aceites esenciales sobre soportes de papel en documentos patrimoniales.
1. MARCO TEORICO
1.1. Características de la especie El arrayan negro Myrciantes rhopaloides (KUNTH) McVaugh es un árbol de hasta 15 metros del altura de tronco cilíndrico, hojas simples, opuestas y de limbo ovalado, consistencia coriácea; con el borde entero a veces involuto, con ápice marginado y base redondeada; haz lustroso de color verde oscuro y envés verde amarillento con a nervadura central prominente. Peciolo corto lignificado, flores hermafroditas, completas y estaminoidea, cáliz dialisépalo, color verde, corona con pétalos libres color blanco, estambres muy numerosos de 9 a 10 mm de largo. Fruto en drupa, carnoso y de forma orbiculada. Esta especie se observa en la figura 1 (Pico, 2004;(Setzer, Setzer, Moriarity, Bates, & Haber, 1999).
6
Figura 1. Arrayan negro. Myrciantes rhopaloides (KUNTH) McVaugh.
La muestra fue recolectada en el municipio de Machetá (Cundinamarca), Colombia posicionada geográficamente en W 73° 37’ 15.636’’, N 5° 5’ 8.667’’ a una altura de 2299 metros sobre el nivel mar ,a partir de 18 de febrero de 2015 hasta 18 de abril 2015.
1.2. Sistema de arrastre con vapor Es una técnica sencilla donde su fundamento físico se basa en las leyes de las presiones parciales de Dalton, que plantea que si dos o tres gases (que no reaccionan) están en un recipiente cerrado a temperatura constante, ejercerá la misma presión si ocupara todo el volumen del recipiente, por lo tanto, la suma de las presiones equivalen a la presión total del sistema. Pero el interés de esta ley radica en que la temperatura de ebullición del líquido más volátil será la temperatura a la cual la suma de las presiones sea igual a la temperatura atmosférica 560 mmHg en el caso de Bogotá D.C. (Otalora, 2012;(Tongnuanchan & Benjakul, 2014). Los aceites esenciales son líquidos que presentan una temperatura de ebullición dependiendo del tipo de aceite, pero en general mayor a la temperatura de ebullición normal del agua, pero con volatilidad más elevada que se facilita el proceso de extracción. 1.3. Aceites Esenciales Los aceites esenciales están constituidos de metabolitos secundarios que cumplen diversas funciones en especial las relaciones ecológicas y en algunos casos alcanzan el 2% de la masa total de la especie (Azcón-Bieto & Talón, 2008; Bakkali, Averbeck, Averbeck, & Idaomar, 2008; Borrego et al., 2012; Tongnuanchan & Benjakul, 2014). Estos compuestos se caracterizan por:
- Ser una mezcla compleja de compuestos. - Presentar alta volatilidad y fuerte aroma.
Los aceites esenciales pueden verse afectados en calidad, cantidad y composición debido a muchos factores como el método de obtención, además de factores químicos, biológicos y ecológicos como lo son el suelo, clima y procesos fenológicos (Calo, Crandall, Bryan, & Ricke, 2015; Tongnuanchan & Benjakul, 2014).
7
Están compuestos, por lo general, de una mezcla de 20 a 60 moléculas que son monoterpenos, sesquiterpenos, fenilpropanos y compuestos alifáticos de bajo peso molecular. Los terpenos forman estructural y funcionalmente diversas clases debido a las amplias combinaciones que presentan las unidades de isopreno (C5), mediante trasformaciones de enzimas terpeno-sintetasas donde los terpenos oxigenados son denominados terpenoides (Bakkali et al., 2008). 1.3.1. Análisis y control de calidad del aceite esencial Debido al amplio uso de los aceites esenciales en el mercado se han desarrollado algunas estrategias para adulterar el rendimiento de los aceites esenciales, donde también se ven afectados en sus parámetros fisicoquímicos, por lo tanto existe una legislación que regula la calidad de los aceites esenciales, estas son muy similares, pero especificas para cada país con referente al uso por las implicación que tiene en los diversos campos de aplicación, pero en general validan el control y vigilancia de estos productos mediante la determinación de parámetros físicos y químicos. En Colombia el control de estos productos está legislado por el INVIMA y la certificación de calidad por INCONTEC, pero en general es regida por farmacopeas internacionales como se establece en el parágrafo primero del artículo 22 del decreto 677 de 1995, en especial para la industria farmacéutica, cosmética y alimentaria. En los aceites esenciales las normas internacionales ISO involucran la determinación de parámetros de calidad como muestreo, almacenamiento y parámetros de control físicos y químicos, ver tabla 1 (Do, Hadji-Minaglou, Antoniotti, & Fernandez, 2015). Tabla 1. Técnicas de calidad para aceites esenciales. Ventajas y desventajas.
ANALISIS MÉTODO VENTAJAS Y DESVENTAJAS
Sensorial
Olor, color, apariencia. La sensibilidad humana para percibir olor. Se necesita panelistas experimentados y la repuesta sensorial es diversa.
Físico
Gravedad especifica, contenido de humedad, rotación especifica, índice de refracción, punto de congelación y solubilidad en etanol.
Permite verificar la calidad y estabilidad. No permiten caracterizar compuestos.
Químico
Índice de acidez, índice de esteres, índice de saponificación, índice de acetilo, índice de fenoles.
Determinan presencia de adulteraciones, verificar calidad y estabilidad. No permiten caracterizar compuestos.
Instrumental
Técnicas espectrofotométricas.
Espectrofotometría UV-Visible
Permite identificar presencia de cromoforos. No es específica.
Espectrometría de masas (MS)
Detector para métodos de separación para caracterización. No es específica para mezclas de compuestos.
Resonancia Magnética Nuclear (RMN 1
H,13
C)
Permite información sobre estructuras. No es separativa y costosa.
8
Espectrofotometría infrarroja (FTIR)
Rápido y no destructivo. No es separativo, se limita a cuantificar, sensibilidad.
Técnicas de separación
Cromatografía de capa delgada (TLC)
Caracterización de componentes. Baja resolución.
Cromatografía de gases acoplada a masas (CG-MS)
Simple, robusto, buena sensibilidad, amplio rango de caracterización. Análisis de termoestabilidad, coelucion.
Cromatografía de alta eficiencia (HPLC)
Bajos rangos de temperatura para compuestos termolábiles. No hay bases de referencia.
Otras técnicas Electronic nose No destructiva, utiliza poca muestra. No es selectiva.
Chemometrics Es rápido y económico. Necesita mayor información de las muestras.
Para este caso solo se analizara como parámetros de control y estabilidad de componentes para el aceite esencial del Arrayan Myrciantes rhopaloides la densidad (gravedad especifica), índice de refracción y como técnica instrumental cromatografía de gases acoplado a masas (CG-MS). 1.3.1.1. Índice de refracción Esta magnitud física determina la proporción del cambio de la dirección de un rayo de luz al cambiar el medio donde se desplaza, para este caso en contacto de un líquido. Este es un valor propio para cada uno de los aceites esenciales y permite identificar si presenta alguna adulteración como la adición de solventes u otros aceites esenciales, por lo tanto sirve como índice de pureza de los aceites. La determinación del índice de refracción se basa en la ley de Snell. La expresión matemática relaciona el ángulo de incidencia de un rayo de luz sobre una superficie liquida, con un ángulo de refracción. Como se observa en la figura 2.
Figura 2. Representación del fenómeno de refracción.
9
Para obtener el valor del índice de refracción del segundo medio para este caso del aceite esencial (n2) se asume el primer medio (n1) como el aire, con un índice de refracción de 1,0003, mediante un refractómetro es posible determinar la variación del ángulo de la luz incidente al entrar al aceite, debido a que la temperatura influye en el movimiento de las partículas en el medio líquido expresado como la gravedad especifica y este a su vez depende de la temperatura, por lo tanto se debe tener en cuenta para su determinación (Stamm 1970). 1.3.1.2. Densidad Esta magnitud física consiste en la relación de la masa con el volumen de la materia y depende de la temperatura. El sistema internacional de medidas SI la unidad correspondiente es Kg/m3, para el caso de los aceites esenciales debido a la poca cantidad obtenida se expresa en g/cm3, g/mL. Esta unidad permite tener un monitoreo de la reproducibilidad del aceite obtenido para cada extracción y evaluar la calidad durante el tiempo para observar que no existan cambios drásticos de composición (Calderon, De Nigrinis, Calle, 1974). 1.3.1.3. Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (CG-MS) La cromatografía es básicamente una técnica de separación, donde un soluto gaseoso (o vapor de líquidos volátiles) es trasportado por una fase móvil gaseosa, donde la separación se da por la diferencia de coeficientes de distribución entre las dos fases dependiendo de la naturaleza de los componentes, por lo que posee una gran capacidad para resolver muestras complejas. Un esquema de un cromatógrafo de gases se observa en la figura 3, este consta básicamente de:
- Fuente de gas. - Sistema de inyección. - Horno y columna cromatográfica. - Sistema de detección. - Sistema de registro.
Figura 3. Esquema de un cromatógrafo de gases (K. Rubinson, J. Rubinson 2001).
10
La muestra en un líquido volátil se inyecta en un septo de goma, en un puerto de inyección caliente donde se vaporiza la muestra, esta muestra es arrastrada por un gas portador inerte (He, N2 o H2), que realiza la función de fase móvil y no presenta influencia en los procesos de sorción-desorción y partición que se producen en la columna que cumple la función de fase estacionaria, la cual está ubicada en un horno que tiene como objetivo servir de termostato a temperaturas fijas con precisión y permita incrementar la temperatura para trabajar con temperaturas programadas hasta donde fluyen por un detector, donde la respuesta se observa en un registrador (Harris 1992). El detector empleado se basa en la espectrometría de masas que acoplado a el sistema de separación permite brindar información estructural de los componentes de la mezcla, mediante la fragmentación causada por corrientes electrónicas. En CG-MS se emplea como criterios de identificación los tiempos e índices de retención, junto a la información estructural que aporta los espectros de masas. El sistema de espectrometría de masas consiste en un sistema de inyección el cual esta acoplado al cromatógrafo, la fuente de ionización donde se empieza a fragmentar la molécula, un analizador de iones, sistema de detección y registro, sistema de alto vacio para facilitar el trasporte de iones y un sistema de recolección de los datos (McNair, Miller 1997). 1.4. El papel El papel es un material compuesto de fibras no homogéneas en dos niveles, una capa externa rígida formada por una masa orgánica no celulósica denominada lignina y una capa interna compuesta de celulosa y hemicelulosa en diferente proporción incluyendo ciertos aditivos para mejorar características en especial organolépticas (Delgado, Farías, & Rodriguez, 2007; Martin & Casals, 1965). La composición química y estructural de las fibras de papel es diversa debido a las distintas fuentes de obtención ya sea de madera o vegetales papeleros, donde su composición es variada entres las especies, dentro de la misma especie y la pared fibrosa donde se pueden agrupar en nueve grupos, como lo son:
- Pajas de cereales. - Cañas. - Lino y cáñamo. - Fibras de hojas. - Bambúes. - Esparto. - Línteres de algodón. - Coniferas. - Frondosas.
Cada grupo tiene una composición química distinta de lignina, celulosa y hemicelulosa que influye en las fibras a nivel morfológico por lo tanto intervienen en las propiedades del papel como lo son la longitud y el diámetro de la fibra, espesor de la pared, flujo luminoso y peso especifico, por lo tanto es importante realizar una caracterización de las fibras de papel (García, 1998).
11
1.4.1. Deterioro y biodeterioro del papel El papel es material vulnerable a procesos de deterioro que causan perdida de sus propiedades en algunos casos irreversibles, debido a la influencia de condiciones ambientales (luz solar, humedad relativa y temperatura) además de generar condiciones que favorecen la contaminación biológica por diversos organismos como hongos y bacterias que conllevan procesos de biodeterioración (Guiamet, Borrego, Lavin, Perdomo, & Saravia, 2011; Zotti, Ferroni, & Calvini, 2008). 1.4.2. Tratamiento del biodeterioro en el papel Existen diversos tipos de tratamientos para la conservación del papel que pueden ser físicos como la deshidratación, irradiación gamma, corriente de alta frecuencia, ambientes bajos de oxigeno, radiación ultravioleta y aumento de temperatura, en el caso de los tratamientos químicos se encuentra la implementación de alcoholes, agentes alquilantes como el óxido de etileno o formol, azoles antifúngicos, derivados fenólicos, vapores de timol y aceites esenciales entre otros. Estos últimos presentan como características que sus efectos son poco nocivos en los microorganismos para el manejo de la biocontaminación o que presentan efectos adversos en los soportes celulósicos que dificultan la conservación (Sequeira, Cabrita, & Macedo, 2012). De acuerdo con (Sequeira et al., 2012) los aceites esenciales presentan una actividad fungistática en lugar de actividad fungicida, incluyendo que al ser sustancias con funciones ecológicas en las plantas sea posible que puedan atraer o alejar insectos. En el caso de efectos que puedan presentar en el papel tomaremos en cuenta el trabajo de (Rakotonirainy & Lavédrine, 2005) donde el vapor de linalool en muestras de papel evidenció que no presenta efectos en el brillo ni en el grado de polimerización de la celulosa pero si la disminución del pH. 1.4.3. Índices de degradación del papel El papel es un material susceptible a las condiciones biológicas y ambientales debido a su composición, estos cambios alteran la composición química generando cambios a nivel físico. Los cambios producidos por factores ambientales que se dan de manera natural se conoce como el proceso de envejecimiento, por ejemplo el componente de lignina sometida a luz ultravioleta produce oscurecimiento similar a el cambio de temperatura y humedad que producen cambios de coloración incluyendo que facilitan procesos de despolimerización por hidrolisis o oxidación de la celulosa generando desintegración de las fibras produciendo perdida de propiedades mecánicas del material como resistencia a la tensión, al rasgado y al plegado (Feller, 1994; Rodriguez & Mejia, 2010). Para evaluar el efecto que presenta este proceso en el papel y compararlo con el que presenta el aceite esencial se desarrolla la prueba de envejecimiento acelerado mediante la alteración de las condiciones ambientales como lo son el aumento de temperatura y la exposición directa a la luz solar. En el papel la celulosa es la que permite la estructura fibrosa, pero la hemicelulosa un poco amorfa es fácil de modificar por componentes polares, entre ellos los iones hidrogeno (H+) alterando las interacciones dentro de los filamentos miscelares y exponiendo la estructura cristalina. Lo cual causa efectos quebradizos en el material por la enorme concentración de iones. La lignina, polímero de estructuras fenólicas, está fuertemente ligada a la malla celulósica favoreciendo el trasporte de iones (Martin &
12
Casals, 1965). Un efecto del aceite esencial es la formación de compuestos hidroperóxidos que facilitan la oxidación de compuestos susceptibles a este proceso disminuyendo el pH (Sequeira et al., 2012). En el presente trabajo se determinara el efecto del aceite esencial de Arrayán (Myrcianthes rophaloides) aplicado en el papel, partiendo de los estudios microbiológicos realizados para el aceite esencial extraído en abril 2015 (comparado con los resultados obtenidos con el aceite esencial obtenido por (Silva & Tellez, 2013) bajos las condiciones de extracción explicadas en la sección 2.2 para identificar la acción del aceite esencial sobre soportes documentales con valor patrimonial mediante la determinación de índices de degradación como son el pH y la degradación de la celulosa. Los métodos para evaluar estos índices en el papel patrimonial son seleccionados a partir de dos técnicas para cada uno, esta selección se efectúa a partir de papeles de prueba posteriormente los métodos óptimos se aplican en el papel de carácter patrimonial caracterizado por medio del procedimiento planteado por (Rodríguez, 2015) donde se compara con el mismo papel con la adición de aceite esencial para identificar el efecto que presenta sobre este tipo de material teniendo en cuenta la degradación del papel sometido a condiciones que favorecen su envejecimiento.
2. PROCEDIMIENTO 2.1. Preparación de la muestra Como muestra de partida se recolectaron las hojas del arrayan como que se observa en la figura 4, posteriormente las hojas fueron cortadas en trozos para favorecer la obtención del aceite, debido a que estos compuestos se encuentran situados en glándulas dentro de la hoja.
Figura 4. Hojas de Arrayan negro. Myrciantes rhopaloides.
2.2. Obtención del aceite esencial Luego del proceso de corte de la hoja se determinó la masa de hojas y se adicionó a un balón de reacción conectado al sistema de arrastre con vapor, recogiendo el destilado y separado mediante decantación. Proceso que se presenta en la figura 5.
13
Figura 5. Sistema de extracción de arrastre con vapor (Silva & Tellez, 2013).
El aceite esencial obtenido se filtra con cloruro de calcio anhídrido para eliminar la presencia de humedad y es almacenado en un recipiente de vidrio hermético bajo refrigeración. 2.3. Determinación de constantes físicas y rendimiento La determinación de constantes físicas fueron realizadas a temperatura ambiente (en caso de estar refrigerado se dejo un tiempo para que obtenga esta temperatura), esto permitió mantener un monitoreo a los aceites esenciales desde su extracción, además de controlar los parámetros que permiten indicar la estabilidad en el tiempo. 2.3.1 Índice de refracción: Esta magnitud física se determino mediante un refractómetro ABBE AR4 a temperatura ambiente (entre 19±2°C). Este valor cumple la ecuación 1.
( ) ( ) (1)
Donde: n1= Índice de refracción del aire. n2= Índice de refracción del aceite esencial. θ1= Ángulo incidente. θ2= Angulo refractado.
El resultado obtenido mediante el instrumento es el valor de despegar n2 en la ecuación 1, cumpliendo con la ley de Snell.
Inicialmente se calibra el instrumento limpiándolo con hisopos de algodón impregnados de acetona, luego se determina el índice de refracción de agua (1,333; 20°C) y de la acetona (1,359; 20°C), posteriormente se agrega una pequeña cantidad de aceite esencial y se determina esta magnitud.
2.3.2 Densidad: Teniendo en cuenta la temperatura ambiente (entre 19±2°C) se determina la masa de un vial de vidrio vacio, limpio y seco, se adiciona un volumen definido de aceite esencial a este vial calculando también la masa, por lo tanto por diferencia de masas se determina la masa del aceite y se aplica la siguiente ecuación 2.
( )
( ) (2)
14
2.3.3 Rendimiento: Partiendo de la densidad del aceite es posible determinar la masa de aceite obtenido, por lo tanto se tiene en cuenta la masa de hojas depositado en el balón de reacción y se aplica la ecuación 3.
( )
( ) (3)
2.4. Caracterización cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (CG-MS) La caracterización de componentes del aceite esencial se realiza mediante el cromatógrafo de gases Shimadzu QP2010-plus acoplado a un espectrómetro de masas con ionización electrónica de 70 eV y un ionizador de masas cuadrupolar. Este equipo presenta una librería interna (NIST 08) para comprobar mediante índices de retención, este equipo se puede observar en la figura 6.
Figura 6. Cromatógrafo de gases Shimadzu QP2010-plus.
Las características de la columna cromatografica de la marca RESTEK, de referencia Rtx®-5MS-Low-Bleed de 0,25 mm x 0,25 mm, con una fase de baja polaridad compuesta de 95% dimetilpoloxiloxano y 5% difenil, un rango de temperatura de -60°C a 350°C y longitud de 60 m.
Los compuestos dentro del aceite esencial son caracterizados mediante indicies de retención de Kovats, teniendo en cuenta un cromatograma con iguales condiciones para una serie de parafinas desde C8 hasta C20, aplicando la ecuación 4 y son comparados los resultados mediante la base de datos de referencia estándar para compuestos químicos (NIST, 2015).
[ ( ) ( ) ( )
( ) ( )] (4)
Donde:
n es el número de átomos de carbono en el alcano menor. N es el número de átomos de carbono en el alcano mayor. tr(x) es el tiempo de retención para el compuesto de interés. tr(n) es el tiempo de retención para el alcano menor. tr(N) es el tiempo de retención para el alcano mayor.
15
Las condiciones establecidas para CG-MS para todas las determinaciones son de 40°C de temperatura del horno, 250°C temperatura de inyección, modo Splitless, tiempo de muestreo 1:00 minutos, 112,0 kPa de presión, flujo total de 14 ml/min,flujo de columna 1 mL/min, con rampas de temperatura de la siguiente manera: velocidad 0.0, temperatura 40°C, tiempo de espera 5 min, velocidad 4.00, temperatura 160°C, tiempo de espera 0 min, velocidad 2,5, temperatura 220°C, tiempo de espera 0 min, velocidad 8,0, temperatura 280°C, tiempo de espera 4 min. La muestra para la inyección es preparada con 20 µL de aceite esencial, 1 µL de
tetradecano (patrón interno) y se completa a un 1 mL con diclorometano almacenado en viales cromatograficos. 2.5. Pruebas microbiológicas La metodología se llevó a cabo considerando el protocolo para evaluación de aceites esenciales del laboratorio de Ciencias de la Biblioteca Nacional de Colombia (Villalba 2012). Microorganismos evaluados: Penicillium Sp. Morfotipo 5 (BNH37) y Bacteria aerobia Gram positiva (BD20), aislados de material documental y conservados en el Cepario del Laboratorio de Ciencias de la Biblioteca Nacional de Colombia. Las dosis aplicadas por (Silva & Tellez, 2013) fueron 25 µl y 100µl, para este caso se tomó la dosis de 100µl. Los resultados son interpretados mediante la inhibición del crecimiento de las colonias midiendo su diámetro en el tiempo de incubación 3, 7 y 10 días a 20°C, comparado con un control ausente de aceite esencial. 2.5.1. Ensayo por contacto
La dosis de aceite esencial fue adicionada a un medio de cultivo líquido PDA (Papa Dextrosa Agar) estéril por vertido a placas, el ensayo se montó por triplicado y como control se prepararon placas con medio PDA sin adición de aceite esencial. La inoculación se realizó con discos del microorganismo. 2.5.2. Ensayo por componentes volátiles Se prepararon placas de medio PDA sin adición de aceite esencial, cada una fue inoculada con el microorganismo a evaluar de la misma forma que en el ensayo por contacto. Cada placa de Petri fue colocada en posición invertida y se incorporó una mota de algodón estéril de aproximadamente 2 cm de diámetro en la tapa. La dosis de aceite esencial fue impregnada en cada mota de algodón y para el control se adicionó agua destilada estéril. Las placas fueron selladas e incubadas en posición invertida por 7 días a 20°C. El ensayo se llevó a cabo por triplicado.
2.6. Caracterización y tratamiento para las muestras de papel Las muestras de papel son tratadas según el protocolo desarrollado en la Biblioteca Nacional de Colombia por (Rodríguez, 2015) para la identificación de fibras de papel (morfología).
16
La caracterización morfológica del papel por microscopia óptica se realizó sobre la muestra de papel de carácter patrimonial y no para las muestras de papel periódico obtenido comercialmente. Para la evaluación de los métodos se tomo un pliego de papel periódico que fue dividido en cuatro partes iguales donde cada fracción de papel fue sometido distinto tiempo a luz solar de 0, 5 ,10 y 15 días, el tratamiento de las muestras se describe en la sección 2.2. La muestra de papel de carácter patrimonial tomada por la microbióloga Luz Stella Villalba de la Biblioteca Nacional de Colombia, corresponde a papel artesanal probablemente del siglo XIX. Este papel fue sometido a los métodos evaluados mediante los resultados del pH y degradación de celulosa en las muestras de papel periódico. Inicialmente el papel se recortó en dos partes, una se deja intacta y la a otra parte es sometida a la aplicación de una solución del 80% de aceite esencial como se observa en la figura 7.
Figura 7. Muestras de papel control y control con aceite esencial.
Enseguida cada muestra se corta en dos partes obteniendo cuatro fracciones que se guardan separadas, en lugares secos alejados de la luz, hasta que las fracciones que fueron tratadas con el aceite esencial estén secas. Posteriormente se aplico el tratamiento a cada fracción como se muestra en la tabla 2. Enseguida para las fracciones sin la aplicación de aceite esencial una se dejo intacta (Control) mientras la otra fracción (Envejecido) se sometió al proceso de envejecimiento. En el caso de las fracciones con la aplicación del aceite esencial una se deja intacta mientras la otra se sometió al proceso de envejecimiento. Tabla 2. Tratamiento de muestras de papel con carácter patrimonial.
Muestra de papel Tratamiento
Control Ninguno. Control + AE Aplicación superficial del aceite esencial. Envejecido Luz solar por 7 días y 3 días a 80°C.
Envejecido + AE Aplicación superficial del aceite esencial, luz solar por 7 días y 3 días a 80°C.
Las cuatro fracciones se almacenaron lejos de la luz en lugares secos hasta la realización de las medidas que fueron tomadas el mismo día, en el mismo lugar, con los mismos instrumentos y por el mismo analizador.
17
Antes del corte y la aplicación del aceite esencial se tomo una muestra de papel cortada en forma cuadrada, con lados definidos para medir el área y se calculo la masa para aplicar la ecuación 5 obteniendo el gramaje. Enseguida se obtuvo a partir de un corte pequeño del papel (aprox. 0,2 g) la fibras de papel separadas mediante el proceso de desintegración por la adición de una solución de 60 mL de hidróxido de sodio 1% con 5 mL de etanol caliente durante 20 minutos con el objetivo de eliminar presencia de grasas o aglutinantes que puedan interferir en el proceso de tinción. Se lavan las fibras con agua destilada para eliminar la solución alcalina y se colocan en una lámina portaobjetos, esta se ubica en un estereoscopio donde se separan las fibras con ayuda de un bisturí donde mínimo se puedan determinar 50 fibras del papel.
( )
( ) (5)
Estas fibras separadas son sometidas a una prueba de tinción mediante el colorante Graff “C”, se coloca el cubreobjetos y es llevado a un microscopio donde se observa su color y composiciones morfológicas contrarrestado con los resultados de protocolo de laboratorio para análisis de fibras de papel por método de tinción (Rodríguez, 2015). 2.7. Análisis de degradación de celulosa en muestras de papel Para la identificación de la degradación de celulosa se tuvo en cuenta los métodos colorimétricos para azucares reductores de Nelson-Somogyi y azucares totales de Dubois. En los dos métodos se utiliza 1,5 g de papel cortado en pequeños trozos y se adicionan en 25 mL de solución de agua-metanol relación 80:20 en matraces que son colocados en un agitador orbital a 150 rpm durante 24 horas a temperatura ambiente, a continuación las muestras son filtradas para eliminar la presencia de cualquier tipo de material sólido y almacenadas para ser preparada de acuerdo con el método colorimétrico. 2.7.1. Método de Nelson-Somogyi (Delgado et al., 2007) La determinación se basa en la formación del oxido de molibdeno, este se obtiene mediante la reducción del ion cúprico (Cu2+) al reaccionar con los azucares reductores, en especial la glucosa (producto de la degradación de la celulosa), para formar el precipitado de color rojo de oxido de cuproso, este en medio alcalino reacciona con el ion molibdato oxidando el cobre (I) al ion cúprico (Cu2+) y formando el oxido de molibdeno de color azul proporcional a los componentes reductores con una longitud analítica de 660 y 830 nm, la reacción 1, ilustra lo descrito anteriormente (Delgado et al., 2007; Gama, Teixeira, & Mota, 1991).
18
Reacción 1. Obtención del oxido de molibdeno (azul) a partir de azucares reductores (Chemaxon, 2015). Reactivos:
Somogyi I:
- Na2CO3 • 10 H2O. Carbonato de sodio pentahidratado.
- KNaC4H4O6 (99,6%). Tartrato de sodio y potasio.
- NaHCO3. Bicarbonato de sodio.
- Na2SO4 Sulfato de sodio anhidrido.
- H2O Agua destilada.
Somogyi II:
- CuSO4 • 5H2O. Sulfato de cobre (II) pentahidratado.
Nelson:
- (NH4)6Mo7O24. Molibdato de amonio tetrahidratado.
- [H2SO4]. Ácido sulfúrico.
- KH2PO4. Dihidrogenfosfato de potasio.
Patrones de glucosa:
- C6H12O6. Glucosa anhídrida.
- H2O. Agua destilada.
Procedimiento Solución de Somogyi I: se pesan 3,40 g Carbonato de sodio pentahidratado; 1,25 g
Tartrato de sodio y potasio; 1 g bicarbonato de sodio y 10 g sulfato de sodio anhídrido
estos compuestos se disuelven a 100 mL de agua destilada en un balón aforado.
Solución de Somogyi II: se pesa 1,5 g de sulfato de cobre (II) pentahidratado, se disuelven
con agua y se ompleta a un volumen de 50 mL en un balón aforado.
Reactivo de Nelson: se pesa 1,5 g de molibdato de amonio y disolviendo en 45 mL de
agua, se adiciona 2,1 mL de ácido sulfúrico, mientras por aparte se disuelven 0,131g de
dihidrogenfosfato de potasio en 2,5 mL de agua, estas soluciones se mezclan y se
colocan a 28 °C durante 24 horas.
19
Mediante una balanza analítica se cuantifican 25 mg de glucosa anhídrida disolviéndolos
en un balón aforado de 25 mL y la preparación de patrones para curva de calibración se
realiza de acuerdo con la tabla 3.
Tabla 3. Diluciones a partir de un patrón de 1,0 mg/ml de glucosa.
Concentración glucosa mg/mL
Factor de dilución Volumen total Volumen stock Volumen solvente
0,8 1,25 10 mL 8 mL 2 mL 0,5 2 10 mL 5 mL 5 mL 0,2 5 10 mL 2 mL 8 mL 0,1 10 10 mL 1 mL 9 mL
Las muestras para su correspondiente determinación se realizan siguiendo el esquema 1:
Esquema 1. Procedimiento para el tratamiento de los patrones y muestras problema.
La determinación espectrofotométrica se realiza en una longitud de onda de 830 nm,
posteriormente el contenido de glucosa por gramo de papel se calcula por medio de la
ecuación 6.
(6)
2.7.2. Método de Dubois (Rodriguez & Mejia, 2010) El método consiste en retirar de la muestra de papel los carbohidratos solubles en agua en este caso en su mayoría glucosa (monómero de la celulosa) y cuantificarlo mediante espectrofotometría. La determinación consiste en la formación de un compuesto coloreado obtenido mediante una reacción de deshidratación causada por un ácido fuerte formando derivados de furfural que interactúan con el fenol por el grupo carbonilo, como se muestra en la reacción 2, el compuesto presenta una longitud de onda de mayor absorción en 490 nm (Rodriguez & Mejia, 2010).
AGREGAR 1 mL de muestraTubo de ensayo
AGREGAR
CALENTAR20 minutos
91 °CBaño de maria
AGITAR
800 µL somogyi I
200 µL somogy II
Vortex
ENFRIAR
ADICIONAR
AGITAR
AGREGAR
2 minutos
5 °CBaño de hielo
1 mL Reactivo de
Nelson
Vortex
7 mL agua
destilada
20
Reacción 2. Reacción de Dubois Formación del complejo coloreado (Chemaxon, 2015).
Reactivos
Reactivo de Dubois:
- fenol C6H6O.
- ácido sulfúrico H2SO4.
- agua H2O.
Patrones de glucosa:
- C6H12O6. Glucosa anhídrida.
- H2O. Agua destilada
Los patrones de glucosa son preparados de acuerdo con la tabla 4, a partir de una solución patrón de 1 mg/mL al disolver 10 mg de glucosa anhidra en un balón aforado de 10 mL con agua destilada. Tabla 4. Preparación de patrones a partir de un patrón de 1 mg/ml de glucosa de 10 mL.
Concentración glucosa mg/mL
Factor de dilución
Volumen total µL Volumen stock µL
Volumen solvente µL
1,000 1 2000 2000 0 0,500 2 2000 1000 1000 0,200 5 2000 400 1600 0,175 5,7 2000 350 1650 0,150 6,6 2000 300 1700 0,125 8 2000 250 1750 0,100 10 2000 200 1800 0,075 13,3 2000 150 1850 0,050 20 2000 100 1900 0,025 40 2000 50 1950
0 - 2000 0 2000
Posteriormente se prepara una solución de fenol al 80% p/v, pesando 0,8 g de fenol en 0,2 mL de agua destilada agitándose suavemente hasta observar homogeneidad, la solución debe estar lo más incolora posible. La preparación y determinación espectrofotométrica se realiza a una longitud de onda de
490 nm, preparando los patrones y las muestras problema de acuerdo con el esquema 2.
21
Esquema 2. Preparación de patrones y muestras para determinación colorimétrica.
El contenido de glucosa por gramo de papel se calcula por medio de la ecuación 7.
(7)
2.8. Determinación de pH Para la identificación de este índice se implementara el método para determinar la concentración de iones hidrogeno (pH) en extractos de papel (método de extracción en frio) según la Norma Técnica Colombiana 848 y como segundo método la determinación de iones hidrogeno por contacto o de superficie se describe en la norma TAPPI T529. 2.8.1. Método de determinación de la concentración de iones hidrogeno (pH) en extracto de papel (método de extracción en frio) El papel es introducido en una probeta con agua fría durante una hora, posteriormente mediante un pH-metro portátil HANNA instruments HI 9124 se determina la concentración de iones hidrogeno en la solución. 2.8.2. Método de determinación de la concentración de iones hidrogeno (pH) de superficie Para este método se implementa un pH-metro SCHOTT con electrodo combinado Blue Line 27 para determinación en superficie permitiendo establecer la concentración de iones hidrogeno en el papel, como se observa en la figura para evaluar la precisión mediante tres mediciones en diferentes puntos dentro del material bajo las mismas condiciones.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN El aceite esencial (AE) de Arrayan (Myrciantes rhopaloides) se comparara con los resultados obtenidos anteriormente (Silva & Tellez, 2013), con sus correspondientes análisis.
AGREGAR1) 2000 µL de muestra.
2)140 µL fenol 80%.
3) 5 µL ácido sulfúrico.
Tubo de ensayo
ESPERAR1 minuto de
reacción.
DETERMINARAbsorbancia del
blancoEspectrofotometro
MEDIRAbsorbancia curva
de calibración y
muestras
22
3.1 Índice de refracción, densidad y rendimiento En la tabla 5 se observan los resultados de los parámetros físicos, obtenidos en diferentes momentos.
Tabla 5. Propiedades físicas del aceite esencial de Arrayan (Myrciantes rhopaloides).
Fecha de extracción Fecha de análisis/ Temperatura
Mayo 2013 Mayo 2013/ 20 °C
Mayo 2013 Abril 2015/ 22°C
Abril 2015. Abril 20015/ 22°C
Índice de refracción 1,470 1,452 1,475 Densidad (g/mL) 0,691 0,618 0,632 Rendimiento (%) 0,280 - 0,270
En la tabla 5, debido a que las condiciones de temperatura en la cual se midió el índice de refracción y la densidad del aceite extraido en mayo de 2013 no son las mismas, no se pueden utilizar como un criterio de caracterización del mismo. En el caso del aceite extraido en abril 2015 sus valores dan indicios de una muestra de aceite esencial de arrayan de composición diferente a la muestra extraida en mayo 2013 y evaluada a la misma temperatua en mayo 2015.Suposicion que se confirmara más adelante con el análisis GC-MS.
3.2. Caracterización cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (CG-MS) Para obtener los componentes de los aceites esenciales se analizaron cada uno de los cromatogramas (corriente iónica total) mediante el tiempo de retención y espectros de masas comparados con NIST 2015. Posteriormente se determinaron los índices de retención experimentales aplicando la ecuación 4, este resultado es comparado con los resultados teóricos respaldado con los espectros de masas.
Figura 8. Corriente iónica total del AE- Myrciantes rhopaloides extraido en mayo 2013.
A partir de la corriente iónica total para cada aceite se obtienen los picos que corresponden a los compuestos separados mediante CG con los porcentajes de área en relación a la suma de todas las áreas como se observa en la tabla enseguida de los cromatogramas para la extracción.
23
Tabla 6. Componentes AE- Myrciantes rhopaloides extraído en mayo 2013 (Silva & Tellez, 2013).
Compuesto Clasificacióna Tiempo de
retención % Área IkT
b IkE
c
α-Pineno M 19,976 4,2 939 940,68
β-Pineno M 21,996 4,16 980 984,88
β-Mirceno M 22,347 17,7 991 992,14
P-cimeno M 23,941 0,31 1026 1030,76
D-limoneno M 24,169 1,07 1031 1036,39
β-Pelandreno M 24,265 0,99 1031 1038,74
β-Ocimeno M 24,741 0,45 1050 1050,28
γ-terpineno M 25,375 0,56 1062 1064,89
β-Linalol M 26,917 0,14 1098 1100,44
Citronelal M 29,094 27,34 1153 1158,15
Isopulegol M 29,233 2,33 1156 1161,69
Neo-Isopulegol M 29,562 6,59 1164 1169,99
Isomentona M 29,938 0,37 1168 1179,37
Mentol M 30,342 0,21 1173 1189,32
Rodinol M 31,837 15,49 1228 1243,17
Geraniol M 32,653 0,46 1255 1275,59
Geranial M 33,333 1,43 1270 1304,69
Propanoato de citronelol M 36,085 1,92 1354 1349,01
α-Cubebeno M 36,434 0,34 1351 1358,07
α-copaeno M 37,563 0,47 1376 1390,44
β –Elemene S 37,945 1,18 1391 1400,93
Cariofileno S 39,264 2,45 1418 1438,47
Humuleno S 40,560 1,11 1454 1474,14
Germacreno D S 41,453 0,49 1480 1498,07
α-farneseno S 41,788 2,23 1508 1503,79
γ-Cadieno S 42,657 0,44 1503 1516,18
Óxido de cariofileno S 45,338 0,2 1581 1552,88
α-cadinol S 47,913 0,2 1653 1686,14
Eudesmol S 48,146 0,59 1652 1689,06
Total de componentes 95,42%
a (M) Monoterpeno, (S) Sesquiterpeno, (HA) Hidrocarburo alifático.
b Índice de retención de Kovats (Adams, 2007);
c Índice de retención experimental.
24
Figura 9. Corriente iónica total del AE- Myrciantes rhopaloides extraído en mayo 2013 analizado en
abril de 2015.
Tabla 7. Componentes AE- Myrciantes rhopaloides extraído en mayo 2013 y analizado en abril de 2015.
Compuesto Clasificacióna Tiempo de
retención % Área IkT
b IkE
c
α-Pineno M 16,111 15,51 940 937,32
β-Pineno M 16,829 9,06 980 978,07
β-Mirceno M 17,827 13,38 992 993,11
P-cimeno M 18,065 2,18 1020 1018,06
D-limoneno M 18,287 47,60 1018 1019,23
β-Pelandreno M 18,541 3,86 1031 1028,54
β-Ocimeno M 19,178 0,17 1027 1029,31
γ-terpineno M 20,100 5,76 1062 1054,12
Total de componentes 97,52%
a (M) Monoterpeno, (S) Sesquiterpeno, (HA) Hidrocarburo alifático.
b Índice de retención de Kovats (Adams, 2007);
c Índice de retención experimental.
Figura 10. Corriente iónica total del AE- Myrciantes rhopaloides extraído en abril 2015.
25
Tabla 8. Componentes AE- Myrciantes rhopaloides extraído en abril 2015.
Compuesto Clasificacióna Tiempo de
retención % Área IkT
b IkE
c
α-Pineno M 16,119 5,56 940 937,32
Canfeno M 16,818 0,26 952 958,56
β-Pineno M 18,072 3,64 980 978,07
β-Mirceno M 18,545 3,55 992 993,11
Ψ-Limoneno M 19,171 0,33 1006 1011,34
P-cimeno M 20,099 2,18 1020 1018,53
D-limoneno M 20,377 10,41 1018 1019,23
β-Ocimeno M 20,922 0,17 1027 1029,31
Melonal M 21,173 0,27 1044 1039,18
2-nonanona HA 22,698 1,12 1052 1047,71
β-Linalol M 23,091 0,51 1082 1086,35
Rose oxide M 24,200 0,19 1114 1119,18
Citronelal M 24,351 20,16 1158 1158,15
Citronelol M 25,315 0,37 1179 1173,89
Isopulegol M 25,718 9,85 1196 1189,52
Terpin-4-ol M 26,377 0,53 1137 1175,66
Criptona M 26,593 0,25 1184 1181,43
L-α-terpineol M 26,891 0,5 1287 1233.67
Rodinol M 28,215 22,82 1245 1243,17
(-) – Carvona M 28,735 0,21 1243 1264,61
Geraniol M 28,872 0,46 1267 1278,54
α-Citral M 29,499 1,84 1279 1284,03
Ionona M 30,089 0,17 1296 1302,50
(R) - ácido citronélico M 31,134 0,7 1322 1311,16
Pinanediol M 31,438 0,23 1313 1314,21
2-(2-hidroxi-2-propil) -5 metil Ciclohexanol
M 32,089 0,33 1320 1323,06
Acetato de citronellol M 32,273 4,29 1339 1324,43
α-Cubebeno S 32,393 0,83 1344 1348,07
Acetato de geranilo M 33,192 0,38 1352 1357,23
α-copaeno S 33,422 0,88 1372 1383,44
β-elemene S 33,569 0,16 1398 1401,43
Cariofileno S 33,839 4,30 1415 1418,74
Total de componentes 97,45%
a (M) Monoterpeno, (S) Sesquiterpeno, (HA) Hidrocarburo alifático.
b Índice de retención de Kovats (Adams, 2007);
c Índice de retención experimental.
En los resultados obtenidos para los aceites esenciales recién extraídos y analizados tablas 6, 8 y figuras 8, 10 se puede observar variabilidad en los componentes minoritarios, incluyendo los sesquiterpenos, y variación en la relación entre los componentes mayoritarios en la tabla 9.
26
Con relación a la estabilidad que presenta el aceite en el tiempo al comparar la tabla 6 con la tabla 7 y la figura 8 con la 9 se evidencia la pérdida de diversos compuestos y que los componentes con mayor estabilidad son los de más baja polaridad.
Tabla 9. Componentes mayoritarios para los tres Aceites esenciales de Myrciantes rhopaloides.
Fecha de extracción Fecha de análisis
Abril 2015
Abril 2015
Mayo 2013
Mayo 2013
Mayo 2013
Abril 2015
Compuesto % Área % Área % Área
α-Pineno 5,56 4,2 15,51 β-Mirceno 3,55 17,7 13,38 D-Limoneno 10,41 1,07 47,6 Citronelal 20,16 27,34 Ausente Rodinol 22,82 15,49 Ausente
Este resultado indica un químiotipo para la especie M. rophaloides, donde en la muestras frescas predomina el citronelal y rodinol, estas moléculas se pueden observar en la figura 11.
Figura 11. Estructuras de monoterpenos comunes en la especie Myrciantes rophaloides.
De acuerdo con la tabla 9 la relación de sus componentes mayoritarios, se tiene en común el citronelal y el rodinol, pero su relación es diferente en su tercer componente puesto que en el extraído en mayo de 2013 presenta mayor cantidad de β-mirceno contrario al extraído en abril de 2015 con mayor relación de D-limoneno. Tabla 10. Compuestos mayoritarios del aceite esencial de Arrayan Myrciantes rhopaloides en diversas ubicaciones.
Localización Compuestos mayoritarios (%) Referencia
Colombia Machetá Rodinol (22,8) Citronelal (20,2) D-Limoneno (10,4)
Trabajo actual
Ecuador
No especifico
Geranial (34) Neral (25) α-Pineno (7)
(Lizcano & Vergara, 2008)
Costa Rica
Chomogo
Linalol (17,7) α-Cadinol (14,4) spathulenol (11,1)
(Cole, Haber, Lawton, & Setzer, 2008)
α-Pineno β-Mirceno D-Limoneno Citronelal Rodinol
27
Brillante (E)-Hex-2-enal (46,1) 1,8 Cineole (12,5) α-Cadinol (6,7)
En la tabla 10 se puede observar que los componentes de aceite esencial presentan una gran variabilidad debido a la sensibilidad de las especies del género Myrciantes ante factores como la edad, ubicación o cantidad de nutrientes lo que produce inestabilidad en la formación de las enzimas terpeno-sintetasas de estas especies incluido el M. rophaloides (Padovan, A., Keszei, A., Külheim, C., & Foley, W. J. 2013), por lo que no es posible considerar un quimiotipo único para la especie pero, si la presencia de moléculas comunes con baja relación en comparación a los componentes mayoritarios α-pineno y β-pineno. 3.3. Pruebas microbiológicas En la tabla 11 se presenta los resultados obtenidos en los ensayos microbiológicos por el aceite esencial de Arrayan Myrciantes rhopaloides extraído en mayo de 2013 en condiciones actuales con el obtenido en abril de 2015. Tabla 11. Porcentaje de inhibición del aceite esencial Myrciantes rhopaloides.
Tiempo días
% de inhibición
Ensayo de contacto Ensayo de compuestos volátiles
Aceite esencial
Abril 2015 Mayo 2015
Condiciones actuales Abril 2015
Mayo 2015 Condiciones actuales
3 100 0 93,2 69,5 7 81 24 44 22 10 32 14 35 12
Los ensayos evidencian un alta inhibición del aceite extraído en abril de 2015 en comparación con el aceite extraído en el 2013 analizado en el 2015, pero a nivel microscópico los microorganismos en el aceite extraído actualmente no presenta diferencia con el control y en 15 días recupera las características a nivel macroscópico por lo tanto la actividad del aceite es fungistática. La tabla 12 presenta los resultados del porcentaje de inhibición presente por el aceite esencial a los siete días de aplicación con relación al aceite esencial obtenido en abril de 2015. Tabla 12. Porcentaje de inhibición del aceite esencial de Arrayan M. rhopaloides durante 7 días de aplicación.
Fecha de extracción % de inhibición
Ensayo de contacto Ensayo de compuestos volátiles
Mayo 2013 100 100 Abril 2015 81 44
Comparado los resultados obtenidos por (Silva & Tellez, 2013) la inhibición presentada por la aplicación del aceite en ese trabajo fue mayor que la presentada por el aceite obtenido en abril de 2015, esto se podría atribuir a los efectos sinérgicos que se pueden presentar debido a diferencia en composición de los dos aceites, como se puede observar en la tabla 9.
28
Los componentes del aceite esencial de Myrcianthes rhopaloides (Kunt) McVaugh, sus componentes mayoritarios citronelal y rodinol, estas moléculas no han sido reportadas como agentes biocidas, ya sea antifúngica o antibacteriana. 3.4. Evaluación de los métodos de degradación de celulosa y pH Los siguientes resultados inicialmente muestran la evaluación de los métodos óptimos para la determinación de los índices de degradación de la celulosa y el pH, posteriormente muestran los resultados de los técnicas seleccionadas como optimas para el trabajo sobre papel de carácter patrimonial. 3.4.1 Análisis de degradación de celulosa 3.4.1.1. Método de Nelson-Somogyi El método presenta una curva de calibración de mayor concentración a las muestras diluidas, además de acuerdo con (Owen, 2000) a baja absorbancia el ruido de las medidas causa una baja precisión por lo que las medidas pueden ser inexactas, por lo tanto el método no será tenido en cuenta para aplicarlo sobre el papel de carácter patrimonial. Los resultados obtenidos se presentan en la tabla 13. Tabla 13. Resultados obtenidos por el método de Nelson-Smomogyi.
Muestras de papel días
Absorbancia Corregida
Concentración mg/mL glucosa
Degradación mg glucosa/ g papel
0 0,005 0,003 0,50 5 0,011 0,006 1,00 10 0,023 0,013 2,16 15 0,031 0,018 3,00
3.4.1.2. Método de Dubois A partir de los resultados obtenidos en la tabla 14, se observa buena sensibilidad a concentraciones bajas, facilidad del método en cuanto al tiempo comparado con el método de Nelson-Somogy, este método será el que se aplique en el papel del siglo XIX. Tabla 14. Resultados obtenidos por el método de Dubois.
Muestras de papel días
Absorbancia Corregida
Concentración mg/mL glucosa
Degradación mg glucosa/g papel
0 0,023 0,014 0,83 5 0,106 0,064 3,81 10 0,122 0,074 4,40 15 0,160 0,097 5,77
3.4.2. Determinación de pH en muestras de papel 3.4.2.1. Método de determinación de la concentración de iones hidrogeno (pH) en extracto de papel (método de extracción en frio) Los resultados se presentan en la tabla 15, donde presenta una gran variación respecto a los resultados de la sección 3.4.2.2. Debido a la poca precisión obtenida por este método, otra razón para no aplicarlo sobre el papel es que es destructivo y es una dificultad por la poca cantidad de muestra disponible.
29
Tabla 15. Resultados de pH por extracción en frio.
Muestras de papel Días
1 2 3 pH
0 6,37 6,49 6,31 6,39±0,09 5 6,24 6,28 6,22 6,25±0,03 10 6,17 6,19 6,21 6,19±0,02 15 6,12 6,13 6,09 6,11±0,02
3.4.2.2. Método de determinación de la concentración de iones hidrogeno (pH) por contacto Los resultados obtenidos por este método (tabla 16) presentan mayor precisión comparados con los resultados anteriores, es un método no destructivo por lo que será tomado en cuenta para realizarlo sobre el papel patrimonial. Tabla 16. Resultados de pH de superficie.
Muestras de papel Días
1 2 3 pH
0 6,48 6,44 6,46 6,46±0,02 5 6,38 6,39 6,36 6,38±0,02 10 6,32 6,30 6,31 6,31±0,01 15 6,25 6,25 6,27 6,26±0,01
3.5. Caracterización del papel con carácter patrimonial La muestra de papel patrimonial en la figura 12 a) de 64 cm2 presenta una masa de 0,612 g mediante la ecuación 1 el gramaje del papel es de 95,6 g/m2, enseguida con el procedimiento de la sección 2.1 una pequeña cantidad de papel fue desintegrada y evaluada en el microscopio al someterla a tinción con el reactivo de Graff C, el resultado obtenido se observa en la figura 12 b) es un amarrillo claro y un pardo azuloso, con fibras estriadas en el canal interno.
Figura 12. a) Muestra de papel patrimonial y b) sus correspondientes fibras teñidas al microscopio.
De acuerdo con la descripción anterior y sus características morfológicas las fibras de papel se ajustan al grupo de fibras compuestas por esparto, paja de cereal, caña de maíz, bambú y bagazo de caña. Estos resultados dan indicio sobre la composición y época de fabricación al ser materiales comúnmente usados para la elaboración del papel en el siglo XIX.
30
3.6. Análisis de degradación de celulosa en el papel patrimonial
De acuerdo con la sección 3.4.1. Se realiza la curva de calibración del método de Dubois y los resultados de la curva de calibración se presentan en la tabla 17. Tabla 17. Absorbancia corregida de los patrones de glucosa.
Concentración glucosa mg/mL
Absorbancia
patrón 1 patrón 2 patrón 3 Promedio
0,025 0,041 0,035 0,046 0,041
0,050 0,078 0,089 0,071 0,079
0,075 0,117 0,122 0,109 0,116
0,100 0,156 0,149 0,167 0,157
0,125 0,195 0,189 0,205 0,196
0,150 0,234 0,228 0,246 0,236
0,175 0,273 0,284 0,271 0,276
0,200 0,312 0,322 0,319 0,318
0,500 0,78 0,813 0,779 0,791
1,000 1,56 1,512 1,604 1,559
A partir de la tabla 17 se elabora la curva de calibración como se observa en la grafica 1 evidenciando que dentro de estas concentraciones existe una linealidad, es decir, el método produce resultados directamente proporcionales a la concentración en las muestras, por lo que las medidas se ajustan al método de regresión para determinar la concentración de las muestras problemas.
Grafica 1. Curva de calibración de los patrones de glucosa la ecuación de la recta.
La tabla 18 presenta los resultados obtenidos por las muestras de papel, la concentración se obtiene a partir de la ecuación presente en la grafica 1, la cantidad de carbohidratos en el papel por medio de la ecuación 7 y el porcentaje de azucares en la muestra se obtiene por la ecuación 8.
(
) (8)
y = 1,5605x + 0,0024 R² = 0,9999
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
1,200
1,400
1,600
1,800
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000
Ab
so
rban
cia
Concentración de glucosa mg/mL
31
Tabla 18. Absorbancias y resultados de las muestras de papel con carácter patrimonial.
Muestras de papel
Absorbancia Concentración azucares
mg/mL
Masa papel
(g)
Azucares mg/ g papel
% Azúcar total en papel 1 2 3 ẋ
Control 0,136 0,131 0,133 0,133 0,084 1,566 4,781 0,748
Control + AE 0,141 0,139 0,140 0,140 0,088 1,588 4,957 0,787
Envejecido 0,169 0,170 0,171 0,170 0,107 1,505 6,369 0,959
Envejecido + AE 0,176 0,177 0,174 0,176 0,111 1,507 6,576 0,991
Grafica 2. Porcentaje de azúcar total en las muestras de papel.
Los resultados obtenidos en el papel patrimonial del siglo XIX evidencian el cambio mínimo que se presenta por la aplicación del aceite esencial como se observa en la gráfica 2, para las muestras sin procesos físicos de degradación (control y control + AE) el aumento de azúcares por la acción del aceite esencial es de solo 0,039% similar a las sometidas a envejecimiento por calor (envejecido y envejecido +AE) que el aumento de azúcares es de 0,032%. Cabe realizar una comparación en la degradación del papel teniendo en cuenta los trabajos realizados por (Delgado et al., 2007) y (Rodriguez & Mejia, 2010), como se evidencian en la tabla 19. Tabla 19. Comparación en la degradación del papel vegetal.
Muestra de papel Origen
Tratamiento de envejecimiento
mg glucosa/g papel Referencia
0 días 10 días
Vegetal 1968 Archivo de Bogotá
Humedad relativa 80%, temperatura 90°C
4,80 10,65 (Delgado et al., 2007)
Vegetal 1968 Archivo de Bogotá
Radiación ultravioleta 254 nm
2,16 3,58 (Rodriguez & Mejia,
2010)
Vegetal siglo XIX Biblioteca Nacional
7 días luz solar y 3 días 90°C
4,78 6,37 Trabajo actual
De acuerdo con la tabla 19 se presenta el nivel de degradación de tres muestras de papel en condiciones iniciales y 10 días después del tratamiento de envejecimiento, por lo tanto el papel del siglo XIX se encuentra en mejor estado debido a que esta en menor grado de deterioro por la despolimerización de la celulosa comparado con el papel del trabajo realizado por Delgado et al., 2007. Otro aspecto importante es el tratamiento de envejecimiento acelerado debido al aumento de 5,85 mg de glucosa por el proceso
0,75 0,79
0,96 0,99
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Control Control + AE Envejecido Envejecido + AE
% d
e a
zú
care
s t
ota
les
32
realizado por Delgado et al., 2007, en el caso de Rodriguez & Mejia, 2010 el aumento es de 1,42 mg de glucosa y para el papel del siglo XIX el aumento es de 1,59 mg de glucosa. 3.7. Determinación de pH en el papel con carácter patrimonial La determinación del pH se realizo para cada muestra como se observa en la figura 13, teniendo en cuenta 3 puntos aleatorios dentro del papel, para obtener un valor significativo y con precisión, como se presentan en la tabla 20.
Figura 13. Determinación de pH en muestras de papel patrimonial.
Tabla 20. Valores de pH para muestras de papel con carácter patrimonial.
Muestra de papel Determinación de pH
1 2 3 promedio
Control 5,50 5,48 5,47 5,48 Control + AE 5,42 5,44 5,43 5,43 Envejecido 5,00 5,05 5,02 5,02
Envejecido + AE 4,96 4,92 4,92 4,93
Para el caso del pH se puede observar en la tabla 20 donde la variación por la aplicación del aceite esencial en las muestras sin tratamiento de degradación física (Control y Control + AE) presentan una disminución en la escala de 0,05 y para las muestras sometidas a luz y calor (Envejecido y Envejecido + AE) su disminución es de 0,09. Mientras en las muestras sometidas a procesos de degradación la diferencia en la escala de pH en las muestras sin aplicación de aceite (Control + Envejecido) es de 0,46 para las muestras con aplicación del aceite esencial (Control + AE y Envejecido + AE) su cambio es de 0,50. 4. CONCLUSIONES El diseño experimental para la obtención de aceite permitió obtener cantidades apropiadas de aceite esencial (rendimiento del 0,6%) para verificar las condiciones físicas (IR, D), realizar un seguimiento para un control riguroso de la posible descomposición o cambio estructural de los compuestos,( mediante el analisis por GC-MS) para asegurar que no se afecten los resultados en los ensayos microbiológicos y se puedan replicar sobre el papel. Se establecio como método adecuado para el análisis de la degradación de celulosa en papel patrimonial el método de Dubois y para medir los cambios en la concentración de iones hidrogeno (pH) el método por contacto.
33
La aplicación del aceite esencial de arrayan sobre papel patrimonial presenta un efecto mínimo en la oxidación de la celulosa y en la disminución del pH en comparación con los procesos de envejecimiento. De acuerdo al análisis microbiológico el aceite esencial del Arrayan M. rhopaploides obtenido presenta actividad bacteriostática y fungistática Los métodos seleccionados y adaptados en este trabajo para evaluar la degradación del papel servirán para ser empleados en los trabajos que se realizan en el marco del proyecto de cooperación entre la Biblioteca Nacional de Colombia y el Proyecto Curricular de Licenciatura en Quimica. Recomendaciones En este trabajo se analizaron los posibles efectos químicos causados por la aplicación del aceite de arrayan en papel patrimonial, se recomienda continuar con la evaluación de evaluación de los aspectos físicos . Es importante seguir investigando cual es la influencia que presenta los métodos colorimétricos para evaluar la oxidación de la celulosa, por lo tanto sería importante aplicar el método de DNS para la cuantificación de azucares reductores. Para el tratamiento biocida de documentos patrimoniales es importante realizar el análisis de distintos aceites esenciales para identificar el que presente actividad fungicida como alternativa de tratamiento en el papel, sería significativo analizar el efecto del aceite en el papel por contacto sección 2.6. y de componentes volátiles como (Rakotonirainy 2005). El aceite esencial obtenido debido a que posee propiedades bacteriostáticas y no bactericidas y propiedades fungistática y no fungicidas no es óptimo para el tratamiento de hongos y bacterias en el papel ( a pesar de no causar efectos quimicos en su aplicación como se demostró) pero, por sus componentes con actividad disuasoria sería importante realizar análisis para el control o tratamiento de otros organismos degradadores de papel como ácaros e insectos que son problema para el almacenamiento de material bibliográfico Agradecimientos El autor presenta enormes agradecimientos la Biblioteca Nacional de Colombia por su colaboración en el desarrollo de este proyecto en especial a Luz Stella Villalba y Dario Rodríguez, Archivo de Bogotá por sus aportes en la investigación en especial a Liliana Mejia, además, a Laura Rojas y Willy Cely por la valiosa ayuda en ciertos aspectos de la investigación.
BIBLIOGRAFIA Azcón-Bieto, J., & Talón, M. (2008). Fundamentos de Fisiologia Vegetal. Madrid,
España: McGraw-Hill. Bakkali, F., Averbeck, S., Averbeck, D., & Idaomar, M. (2008). Biological effects of
essential oils – A review. Food and Chemical Toxicology, 46, 446–475. doi:10.1016/j.fct.2007.09.106
Borrego, S., Valdés, O., Vivar, I., Lavin, P., Guiamet, P., Battistoni, P., … Borges, P.
34
(2012). Essential oils of plants as biocides against microorganisms isolated from Cuban and Argentine documentary heritage. doi:10.5402/2012/826786
Calderon, E., De Nigrinis, S. & Calle, J. (1974) Estudio de aceites esenciales Colombianos III aceites esenciales de Eucaliptus I. Revista Colombiana de Ciencias Quimico-Farmaceuticas. Bogotá, Colombia.
Calo, J. R., Crandall, P. G., O. Bryan, C. A., & Ricke, S. C. (2015). Essential oils as antimicrobials in food systems – A review. Food Control, 54, 111–119. doi:10.1016/j.foodcont.2014.12.040
Chemaxon. (2015, December 6). Marvin Beans. Chemaxon Ltd. Delgado, J., Farías, D., & Rodriguez, D. (2007). Método Colorimétrico para determinar la
degradación de celulosa en papel vegetal sometido a procesos de envejecimiento acelerado.
Do, T. K. T., Hadji-Minaglou, F., Antoniotti, S., & Fernandez, X. (2015). Authenticity of essential oils. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 66, 146–157. doi:10.1016/j.trac.2014.10.007
Feller, R. (1994). Accelerated Aging: Photochemical and thermal aspects. Gama, F. M., Teixeira, J. A., & Mota, M. (1991). Direct determination of endoglucanase
activity on cellulose insoluble fibres. Biotechnology Techniques, 5, 377–382. doi:10.1007/BF00185018
Garcia, J. (1998). Constituyentes Fibrosos de Pastas y Papeles. Morfología Análisis microscópico. Terrassa, España: Edisgraf S.A.
Guiamet, P., Borrego, S., Lavin, P., Perdomo, I., & Saravia, S. G. de. (2011). Biofouling and biodeterioration in materials stored at the Historical Archive of the Museum of La Plata, Argentine and at the National Archive of the Republic of Cuba. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 85, 229–234. doi:10.1016/j.colsurfb.2011.02.031
Harris, D. (1992) Análisis Químico Cuantitativo. Grupo Editorial Iberiamérica S.A. Mexico D.F. Mexico.
International Organization for Standardization. (2013). Catálogo de Normas. Consultado el 20 de Marzo de 2015, en http://www.iso.org/iso/home/store/catalogue_tc/catalogue_tc_browse.htm?commid=48956
Lizcano, A. J., & Vergara, J. L. (2008, July 18). Evaluación de la actividad antimicrobiana de los extractos etanolicos y aceites esenciales de las especies vegetales Valeriana pilosa, Hesperomeles ferruginea, Myrcianthes rhopaloides y Passiflora manicata frente a microrganismos patogenos y fitopatogenos. Pontificia Universidad Javeriana, Bogota, Colombia.
Martin, G., & Casals, R. (Trans.). (1965). Físico-química del papel. Barcelona, España: Publs.Offset.
McNair, H., Miller, J. (1996) Basic Gas Chromatography. Ed. Wiley-Interscience publication. New York, United States.
National Institute Standart and Techiques NIST (2015) Data base Chemsitry Book. Consultado el 15 Agosto de 2015 en http://webbook.nist.gov/chemistry/
NTC 848, Papel y cartón. Método para determinar la concentración de iones hidrogeno (pH) en extracto de papel (método de extracción en frio), Icontec Internacional, Bogotá D.C., 2012.
Otarola, I. (2012) Extraccion por arrastre con vapor “Importancia y aplicación”. Universidad Mayor de San Simon, Cochabamba, Bolivia.
Owen, T. (2000). Fundamentos de espectroscopía UV-visible moderna Conceptos basicos. Alemania: Agilent Technologies.
Padovan, A., Keszei, A., Külheim, C., & Foley, W. J. (2013). The evolution of foliar
35
terpene diversity in Myrtaceae. Phytochemistry Reviews, 13, 695–716. doi:10.1007/s11101-013-9331-3
Pico, A. (2004). Realizar un evento para el intercambio de experiencias sobre el uso de recursos florísticos nativos y productivos para la seguridad alimentaria, entre productores de la Localidad de Sumapaz. Informe técnico. Departamento Administrativo de Medio Ambiente, DAMA. Bogotá.
Rakotonirainy, M. S., & Lavédrine, B. (2005). Screening for antifungal activity of essential oils and related compounds to control the biocontamination in libraries and archives storage areas. International Biodeterioration & Biodegradation, 55, 141–147. doi:10.1016/j.ibiod.2004.10.002
Rodríguez, D. (2015). Protocolo de Laboratorio para Análisis de Fibra de Papel por el Método de Tinción (p. 20). Bogotá D.C.: Grupo de Conservación.
Rodríguez, D., & Mejia, L. (2010, March). Determinación del deterioro de la celulosa del papel bajo acción de la luz ultravioleta por el método de espectroscopía UV-Visible. Grupo de Conservación, Restauración y Reprografía, Bogotá D.C., Colombia.
Sequeira, S., Cabrita, E. J., & Macedo, M. F. (2012). Antifungals on paper conservation: An overview. International Biodeterioration & Biodegradation, 74(0), 67–86. Retrieved from http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0964830512001904
Setzer, W. N., Setzer, M. C., Moriarity, D. M., Bates, R. B., & Haber, W. A. (1999). Biological activity of the essential oil of Myrcianthes sp. nov. “black fruit” from Monteverde, Costa Rica. Planta Medica, 65(5), 468–469. doi:10.1055/s-2006-960816
Silva, D. A., & Tellez, M. F. (2013). Estudio de aceites esenciales obtenidos de cinco especies vegetales, como posibles productos de control del biodeterioro del patrimonio cultural colombiano. Universidad Distrital Francisco Jose de Caldas, Bogota, Colombia.
Stamm, M. D. (1970). Modernos conocimientos sobre la química de aceites esenciales. Madrid: Patronato Alonso de Herrera.
Tongnuanchan, P., & Benjakul, S. (2014). Essential Oils: Extraction, Bioactivities, and Their Uses for Food Preservation. Journal of Food Science, 79. doi:10.1111/1750-3841.12492
Villalba L. (2012). Evaluación de actividad microbiana de productos naturales (protocolo de trabajo). Consultado 2011 septiembre 18.
Zotti, M., Ferroni, A., & Calvini, P. (2008). Microfungal biodeterioration of historic paper: Preliminary FTIR and microbiological analyses. International Biodeterioration & Biodegradation, 62, 186–194. doi:10.1016/j.ibiod.2008.01.005
