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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO GRANDE DO NORTE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E SOCIEDADE

IANARA MENDONÇA DA COSTA

COMPORTAMENTO PLÁSTICO DAS CÉLULAS HIPOCAMPAIS EM CULTURA APÓS

TRATAMENTO COM ASTRAGALOSIDEO IV

MOSSORÓ, RN

2018

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COMPORTAMENTO PLÁSTICO DAS CÉLULAS HIPOCAMPAIS EM CULTURA

APÓS TRATAMENTO COM ASTRAGALOSIDEO IV

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Saúde e Sociedade da Universidade

do Estado do Rio Grande do Norte, como requisito

para obtenção do grau de Mestre em Saúde e

Sociedade.

Orientador: Prof. Dr. Fausto Pierdoná Guzen

Co-orientador: Prof. Dr. Marco Aurélio de Moura Freire

MOSSORÓ, RN

2018

© Todos os direitos estão reservados a Universidade do Estado do Rio Grande do Norte. O conteúdo desta obra é deinteira responsabilidade do(a) autor(a), sendo o mesmo, passível de sanções administrativas ou penais, caso sejaminfringidas as leis que regulamentam a Propriedade Intelectual, respectivamente, Patentes: Lei n° 9.279/1996 e DireitosAutorais: Lei n° 9.610/1998. A mesma poderá servir de base literária para novas pesquisas, desde que a obra e seu(a)respectivo(a) autor(a) sejam devidamente citados e mencionados os seus créditos bibliográ�cos.

Catalogação da Publicação na Fonte.Universidade do Estado do Rio Grande do Norte.

C837c Costa, Ianara Mendonça daComportamento plástico das células hipocampais em

cultura após tratamento com Astragalosideo IV. / IanaraMendonça da Costa. - Mossoró, RN, 2018.

142p.

Orientador(a): Prof. Dr. Fausto Pierdoná Guzen.Coorientador(a): Prof. Dr. Marco Aurélio de Moura

Freire.Dissertação (Mestrado em Programa de Pós-

Graduação em Saúde e Sociedade). Universidade doEstado do Rio Grande do Norte.

1. Astragalosideo IV. 2. Plasticidade. 3. Hipocampo. I.Pierdoná Guzen, Fausto. II. Universidade do Estado doRio Grande do Norte. III. Título.

O serviço de Geração Automática de Ficha Catalográ�ca para Trabalhos de Conclusão de Curso (TCC´s) foi desenvolvidopela Diretoria de Informatização (DINF), sob orientação dos bibliotecários do SIB-UERN, para ser adaptado àsnecessidades da comunidade acadêmica UERN.

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COMPORTAMENTO PLÁSTICO DAS CÉLULAS HIPOCAMPAIS EM CULTURA

APÓS TRATAMENTO COM ASTRAGALOSIDEO IV

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Saúde e Sociedade da

Universidade do Estado do Rio Grande do Norte, como requisito para obtenção do grau de

Mestre em Saúde e Sociedade.

Data da Defesa ____/______/_____

COMISSÃO EXAMINADORA

_______________________________________________________________

Prof. Dr. Fausto Pierdoná Guzen

Universidade do Estado do Rio Grande do Norte

_______________________________________________________________

Prof. Dr. Marco Aurélio de Moura Freire

Universidade do Estado do Rio Grande do Norte

________________________________________________________________

Prof ª. Dra. Amália Cinthia Meneses do Rêgo

Universidade Potiguar

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Este trabalho é dedicado aos meus pais, por seu

carinho e apoio e ao meu orientador pela

fascinante oportunidade de desenvolver este

trabalho.

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AGRADECIMENTOS

Gostaria de expressar meus sinceros agradecimentos a todos aqueles que tornaram possível a

realização desta dissertação:

A Deus que me permitiu trilhar estes caminhos, me dando forças e discernimento a cada

dia para superar obstáculos e por me permitir conhecer e conviver com as pessoas as quais serei

profundamente grata...

A minha família, meu alicerce, minha origem. Agradeço aos meus pais: Micheline

Mendonça da Costa Firmino e Maraton Lira da Costa, por toda dedicação e esforço para

que nada me faltasse e por me ensinar que a educação e o respeito são a base para todos os

outros pilares. A meu irmão Thallys Mendonça da Costa, minhas tias, avós e tio. Agradeço a

Saulo Freitas, pelo apoio, compreensão e estímulo. Amo vocês!

Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Fausto Pierdoná Guzen, por todo o ensinamento

e confiança depositada em mim. Pelo apoio diário e incondicional em todos os momentos

necessários, por seu companheirismo, dedicação e amizade. Sinto-me honrada em tê-lo como

orientador. Sem dúvidas a confiança que o senhor deposita em mim, foi/é combustível para a

realização deste trabalho. Obrigada por despertar em mim o desejo incessante de manter-me no

caminho da pesquisa e docência. Representa uma rara união de competência, humildade e

caráter. Ter o seu apoio diário é uma fonte de motivação inesgotável!

Ao meu co-orientador Prof. Dr. Marco Freire, obrigada por sua amizade e

companheirismo, seu apoio me deu coragem e confiança para acreditar que tudo daria certo.

Pela paciência, dedicação e por estar disponível sempre. Obrigada por me permitir conviver

com uma pessoa tão competente e de grande coração. E por todos os valores que tive a

oportunidade de aprender contigo, vão muito além do conhecimento científico. Em você vejo

alguém que tem amor por tudo o que faz. Aprendo muito contigo diariamente e todo o

aprendizado me fez crescer, aprender e ter um coração grato por tudo.

Ao Prof. Dr. José Rodolfo Lopes, agradeço por todas as palavras e momentos

compartilhados, o Sr. sempre esteve disponível, oferecendo uma palavra de apoio seja sobre

momentos acadêmicos ou conselhos pessoais. Sua amizade é fundamental em minha vida, pois

contigo aprendi valores que desejo repassar como exemplo de dedicação, humildade e caráter

sempre, sua motivação foi essencial em todos os momentos. Agradeço ao Prof. Rodolfo, mais

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uma vez por me incumbir a responsabilidade administrativa do laboratório, o que me trouxe

conhecimento e experiência.

Ao Prof. Eudes Euler e Salvador Vianna que sempre estiveram á disposição para tudo

o que os fosse incumbido para a concretização deste projeto. A Profa. Dayane Pessoa pela

oportunidade de ministrar aula na Faculdade de Enfermagem e convite para palestrar no GAIPP

(Grupo de Apoio Interativo ao Portador de Parkinson), uma experiência extraordinária, sem

dúvidas.

Ao coordenador do programa de pós-graduação em saúde e sociedade, Thallys Alyrio

bem como de todos os profissionais responsáveis pelo programa. A todos os Professores do

PPGSS, meus sinceros agradecimentos e admiração pela maneira como conduzem com

eficiência o seu trabalho.

Aos amigos do Laboratório de Neurologia Experimental, por sua presença constante e

momentos agradáveis os quais compartilhamos. Por suas ajudas mútuas durante a realização

dos experimentos. Todos os momentos compartilhados foram gratificantes e essenciais em

minha formação. Obrigada! As amigas Bianca Norrara e Isleânia Marques, pelos conselhos

e companheirismo, vocês foram essenciais durante esta trajetória, transmitindo confiança e

apoio incondicional. Aos amigos Rodrigo Freire, Rodrigo Dias e Francisca Overlânia, Alini

Dantas pelas palavras de amizade e conforto. Ao amigo Lucídio Cleberson e Eligleidson por

estar presente sempre que necessário. As meninas da sala de cultura pela realização dos

experimentos juntas Luciana e Neta, por compartilhar esses momentos e pela realização das

imunos juntas nas madrugadas. Ao amigo Gerian Lopes por sua amizade e a sua querida mãe

Fátima Lopes, pela maravilhosa estadia em sua casa durante as aulas de Estatística em Caicó

RN, a Nickson Melo, pela companhia agradável durante as viagens para Caicó. A Starlyn

Freire pela possibilidade de participamos de um projeto brilhante juntos. Tenho orgulho de

fazer parte da família Labneuro!

Agradeço aos amigos do Laboratório de Bioquímica e Biomologia Molecular, Micássio,

por sua amizade e ... “Pelo melhor café do mundo”. A Dayane, Rackel, Júlia Lorena e nossa

secretária do PPGSS, Luzia.

A minhas amigas de longa data, Jenifer Alves e Raissa Kelly que nenhuma distância

foi capaz de nos separar, sempre estamos unidas em pensamento e coração torcendo pela

felicidade uma da outra.

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Aos Profs. Drs. Amália Cynthia Rêgo e Irami Araújo Filho pela participação em

nossos trabalhos recentemente publicados e por suas importantes considerações (A vocês, meu

agradecimento especial!). Aos Profs. Drs. Dinalva Brito de Queiroz e Marco Antônio

Botelho que junto a empresa Evidence Soluções Farmacêuticas Ltda® forneceram o composto

ativo utilizado no presente estudo, sem o qual a realização deste trabalho não seria possível.

A Luiz Carlos de Aquino, por suas sábias palavras de motivação diária e apoio amigo

que sempre nos ampara e fornece conselhos. A todos os profissionais e funcionários da

Faculdade de Ciências da Saúde que me receberam da melhor forma possível e que me fizeram

sentir-se em casa.

Aos alunos do curso de Medicina da Faculdade de Ciências da Saúde – FACS/UERN,

turmas de 2016 e 2017, pela oportunidade de ministrar aulas e compartilhar informações

valiosas. Pela atenção e entusiasmo com os temas abordados que me fizeram reafirmar e

reconhecer que este é um dos encargos que desejo exercer e honrar com muito carinho e

dedicação, a nobre missão de ser Professora e pesquisadora!

Agradeço profundamente ao Laboratório de Estudos Neuroquímicos (LENQ-UFRN),

onde realizei uma das etapas deste trabalho, em especial ao Prof. Dr. Jeferson de Souza

Cavalcanti por sua colaboração.

A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização deste trabalho e a

Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior).

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“Se vi mais longe foi por estar de pé sobre ombros de gigantes”

Isaac Newton – Carta para Robert Hoke (15 de Fevereiro de 1676)

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A parte experimental da presente Dissertação foi desenvolvida no Laboratório de Neurologia

Experimental, do Departamento de ciências biomédicas, Faculdade de Ciências da Saúde da

Universidade do Estado do Rio Grande do Norte, sob orientação dos Professores Drs. Fausto

Pierdoná Guzen e Marco Aurélio de Moura Freire. O presente trabalho recebeu auxílio

financeiro da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior.

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RESUMO

Objetivos: Analisar os efeitos da suplementação com dosagens diferenciadas de

Astragalosídeo (AS-IV) na plasticidade de células nervosas do hipocampo em cultura.

Métodos: Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos sob licença da Comissão

de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da Universidade do Estado do Rio Grande do

Norte (UERN), com número de parecer 015/2016. As células do hipocampo foram coletadas

de ratos neonatos da linhagem Wistar, logo após sendo cultivadas em diferentes grupos: um

controle (D-10) e os demais contendo diferentes concentrações de (AS-IV) (5, 10, 15, 20 e 25

µl). A morfometria celular foi avaliada ao longo de 96 horas, através da microscopia de

contraste de fase, sendo em seguida realizada a avaliação fenotípica a partir da

imunocitoquímica para GFAP e GAP-43. Os grupos foram comparados estatisticamente através

do teste de Kruskal-Wallis em múltiplas comparações pareadas, sendo considerado

estatisticamente significante quando p<0,05. Resultados e conclusões: Com os procedimentos

adotados, foi possível avaliar a aderência, os efeitos plástico e trófico das células em cultura

nos distintos grupos. As culturas de células realizadas, quando cultivadas em D-10 acrescido

de AS-IV, apresentaram alterações morfológicas mais visíveis quando comparadas com

culturas desprovidas desse tratamento. Deste modo, o AS-IV promoveu a manutenção da

expansão das células nos grupos experimentais, principalmente nos tratados com meio

condicionado de 15 e 20 μl, possibilitando a identificação mais evidente da morfologia das

células, indicando sua ação na plasticidade das células hipocampais.

Palavras-chave: Astragalosideo IV; Hipocampo; Plasticidade.

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ABSTRACT

Objectives: Analyze the effects of supplementation with differentiated doses of Astragaloside

IV (AS-IV) on the plasticity of nerve cells of the hippocampus in culture. Methods: All the

experimental procedures were conducted under license from the Ethics Committee on Animal

Experimentation (CEEA) of the University of the State of Rio Grande do Norte (UERN), ID

015/2016. The hippocampus cells were collected from newborn Wistar rats, and then cultured

in different groups: one control (D-10) and the other containing different concentrations of (AS-

IV) (5, 10, 15, 20 and 25 μl). Cell morphometry was evaluated over 96 hours by phase contrast

microscopy, and then the phenotypic evaluation was performed from immunocytochemistry for

GFAP and GAP-43. The groups were statistically compared using the Kruskal-Wallis test in

multiple paired comparisons, being considered statistically significant when p <0.05. Results

and conclusions: With the procedures adopted, it was possible to evaluate the adherence, the

plastic and trophic effect of the cells in culture in the different groups. Cell cultures performed

on D-10 plus AS-IV showed more visible morphological changes when compared to cultures

lacking this treatment. Thus, AS-IV promoted the maintenance of cell expansion in the

experimental groups, mainly treated with conditioned medium of 15 and 20 μl, allowing the

most evident identification of the cell morphology, indicating its action on the plasticity of

hippocampal cells.

Keywords: Astragaloside IV; Hippocampus; Plasticity.

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LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1. Vistas e lobos do encéfalo........................................................................... 19

FIGURA 2. Anatomia intrínseca do hipocampo............................................................. 21

FIGURA 3. Mapa de conexões entre estruturas relacionadas à memória no LTM........ 22

FIGURA 4. Metabolismo do glutamato e GABA........................................................... 23

FIGURA 5. Síntese de glutamato e ciclo entre neurônios e glia.................................... 24

FIGURA 6. Histologia em Nissl do hipocampo de rato Wistar...................................... 25

FIGURA 7. Ressonância Magnética – Caso H.M........................................................... 29

FIGURA 8. Neurogênese no hipocampo adulto no Giro denteado................................ 34

FIGURA 9. Mecanismo da formação de LTP na memória declarativa.......................... 36

FIGURA 10. Plasticidade neural de curto e longo prazo................................................ 37

FIGURA 11. Astragalosideo IV (Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.................... 40

FIGURA 12. Estrutura química do Astragalosídeo IV................................................... 41

FIGURA 13. Exposição e remoção do hipocampo......................................................... 46

FIGURA 14. Delineamento do estudo: Formação dos grupos de observação celular.... 47

FIGURA 15. Campos de observação células em placas de 24 poços............................ 49

FIGURA 16. Aspectos Morfológicos das células neuronais e gliais.............................. 50

FIGURA 17. Morfologia das células após formação dos grupos experimentais por 96

horas.................................................................................................................................

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FIGURA 18. Perímetro de células neuronais observadas em cada grupo experimental

às 24 horas........................................................................................................................

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às 48 horas........................................................................................................................

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às 72 horas........................................................................................................................

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às 96 horas........................................................................................................................

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FIGURA 22. Área de células neuronais observadas em cada grupo experimental às 24

horas.................................................................................................................................

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horas.................................................................................................................................

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horas.................................................................................................................................

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horas.................................................................................................................................

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FIGURA 26. Comprimento axonal de células neuronais observadas em cada grupo

experimental às 24 horas.................................................................................................

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experimental às 96 horas..................................................................................................

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FIGURA 30. Perímetro de células gliais observadas em cada grupo experimental às 24

horas.................................................................................................................................

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horas..................................................................................................................................

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horas..................................................................................................................................

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horas..................................................................................................................................

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FIGURA 34. Área de células gliais observadas em cada grupo experimental às 24

horas.................................................................................................................................

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horas.................................................................................................................................

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horas.................................................................................................................................

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horas.................................................................................................................................

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FIGURA 38. Células do G1, G2, G3, G4,G5 e G6 submetidas a imunofluorescência do

anticorpo GAP-43............................................................................................................

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FIGURA 39. Células do G1, G2, G3, G4,G5 e G6 submetidas a imunofluorescência do

anticorpo GFAP...............................................................................................................

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LISTA DE TABELAS

TABELA 1. Lista de anticorpos primários........................................................................ 48

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LISTA DE ABREVIATURAS

AST: Astragalosídeo

AS-IV: Astragalosídeo IV

CE: Córtex entorrinal

GD: Giro denteado

CA: Corno de Amon

CA 1: Corno de Amon 1



CP: Córtex perirrinal

CPH: Córtex parahipocampal

DA: Doença de Alzheimer

LTP: Long-term potentiation

LTD: Long-term depression

LAM: Labirinto Aquático de Morris

LCE: Labirinto em Cruz Elevado

BDNF: Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro

μl: Microlitro

ZSG: Zona Subgranular do Giro Denteado

CTN’S: Células tronco neuronais

DP: Doença de Parkinson

NOS: Óxido nítrico sintetase

6-OHDA: 6- hidroxidopamina

MPP +: 3-[4,5-Dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolium brometo

MPTP: 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina

SH-SY5Y: Linhagem de células de neuroblastoma humano.

IG: Intragástrico

LCE: Labirinto em Cruz Elevado

ROS: Espécies Reativas de Oxigêneo

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RSZ: Resveratrol

UERN: Universidade do Estado do Rio Grande do Norte

UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte

IGF- R: Receptor de Fator de Crescimento Semelhante a Insulina

ICMM: Compromentimento Cognitivo Leve Amnésico

MTLE-EH: Epilepsia do Lobo Temporal Medial

NAT: Núcleos Anteriores do Tálamo

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO....................................................................................................... 17

1.1 JUSTIFICATIVA.................................................................................................. 18

1.2 REFERENCIAL TEÓRICO.................................................................................. 19

1.2.1 Organização morfofuncional do hipocampo.................................................. 19

1.2.2 Aspectos clínicos relacionados ao hipocampo................................................ 29

1.2.3 Plasticidade no hipocampo............................................................................... 33

1.2.4 Astragalosideo IV - Astragalus membranáceus (Fisch.) Bge......................... 39

1.3 OBJETIVOS.......................................................................................................... 45

1.3.1 Objetivo geral.................................................................................................... 45

1.3.2 Objetivos específicos......................................................................................... 45

2 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................. 45

2.1 DESENHO EXPERIMENTAL............................................................................. 45

2.2 EXTRAÇÃO E CULTIVO DAS CÉLULAS DO HIPOCAMPO........................ 45

2.3 SUBCULTIVO DAS CÉLULAS DO HIPOCAMPO E OS GRUPOS

EXPERIMENTAIS......................................................................................................

46

2.4 MARCAÇÃO IMUNOCITOQUÍMICA............................................................... 48

2.5 ANÁLISES DOS DADOS.................................................................................... 49

3 RESULTADOS....................................................................................................... 50

3.1 MUDANÇAS MORFOLÓGICAS E EXPANSÃO DAS CÉLULAS

NEURONAIS..............................................................................................................

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3.2 MUDANÇAS MORFOLÓGICAS E EXPANSÃO DAS CÉLULAS GLIAIS.... 61

3.3 FENÓTIPO DAS CÉLULAS NEURONAIS E GLIAIS....................................... 66

4 DISCUSSÃO............................................................................................................ 69

5 CONCLUSÕES........................................................................................................ 77

6 REFERÊNCIAS...................................................................................................... 78

APÊNDICE A............................................................................................................. 91

APÊNDICE B............................................................................................................. 93

APÊNDICE C............................................................................................................ 95

APÊNDICE D............................................................................................................. 107

APÊNDICE E............................................................................................................. 138

APÊNDICE F............................................................................................................. 140

ANEXO A................................................................................................................... 141

ANEXO B................................................................................................................... 142

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1 INTRODUÇÃO

Recebemos diariamente um número imenso de informações, e parte delas fica registrada

e disponível para ser lembrada. A esta capacidade de adquirir informações, recuperá-las e

utilizá-las em nosso cotidiano atribuímos a memória. Ou seja, a memória possui implicações

nos processos mentais, cognitivos e perceptivos no processo de aquisição de conhecimento e a

aquisição destas memórias denomina-se aprendizado, ambos sendo propriedades básicas do

sistema nervoso, não existindo atividade nervosa que não inclua ou não esteja relacionada a

estes dois eventos. (Izquierdo, 1986; Lent, 2010).

O hipocampo é uma estrutura encefálica bilateral localizada no lobo temporal,

pertencente ao Sistema límbico, sendo um importante centro de plasticidade sináptica (Diehl,

2010) e responsável por coordenar os processos de consolidação da memória explícita, tipo de

memória caracterizada pela aquisição de novos fatos e eventos (Leuner e Gould, 2010; Mainardi

et al., 2015).

Danos ao hipocampo podem provocar graves distúrbios de memória e patologias

envolvidas em seus aspectos clínicos são evidenciadas, por exemplo, na esclerose hipocampal,

isquemia e na Doença de Alzheimer (DA). Em todo o mundo, milhões de pessoas são afetadas

por distúrbios neurológicos. Uma média global de 47,5 milhões de pessoas vivem com

demência e anualmente cerca de 7,7 milhões de novos casos são registrados, sendo a DA a

causa mais comum de demência, contribuindo para 60 ou 70% dos casos (WHO, 2016). O

impacto econômico dos cuidados com o paciente também é elevado, com serviços e recursos

neurológicos desproporcionalmente escassos, o que pode influenciar em sua sobrevida (WHO,

2016).

Além disso, na DA pode ocorrer uma diminuição na capacidade de linguagem,

resolução de problemas e outras habilidades cognitivas (Alzheimer’s, 2015). Deste modo, os

sintomas trazem consequências relevantes à sociedade e aos indivíduos portadores desses

distúrbios, pois se caracterizam por uma incapacidade progressiva para desenvolver atividades

cotidianas e afetam o convívio social, devido à dificuldade de reconhecer pessoas e objetos,

características de memórias consolidadas pelo hipocampo (Rubin et al., 2014).

As repercussões clínicas e sociais revelam uma importante temática de estudo e

empenho para estruturar estratégias que possam contribuir com a qualidade de vida da

sociedade. Pesquisas científicas têm explorado quais estímulos e substâncias podem contribuir

para a plasticidade de células neurais, resultando em melhora na qualidade de vida de pessoas

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com depressão, DA, Doença de Parkinson (DP), entre outras patologias relacionadas com o

Sistema Nervoso (Zhang et al., 2011).

Uma alternativa proposta são os medicamentos fitoterápicos, que apresentam relevância

científica no tratamento das doenças neurológicas por conter múltiplos compostos e

fitoquímicos que podem ter efeito neuroprotetor, com uma consequente ação benéfica para a

saúde em diferentes distúrbios neuropsiquiátricos e neurodegenerativos (Kumar e Khanum,

2012). Entre estes compostos pode-se destacar o astragalosideo IV (AS-IV), uma saponina

triterpenóide presente na raiz de Astragalus membranaceus, um fitoterápico originário da

medicina tradicional chinesa, alvo do presente estudo (Li et al., 2017).

Suas propriedades biológicas e farmacológicas apresentam efeito protetor potente em

patologias, devido a seu efeito antioxidante, antiviral, antibacteriano (Wagner et al., 1997;

Zheng, 2015), anti-inflamatório, antifibrótico, anti-asmático, anti-diabético, imunorregulador e

cardioprotetor (Li et al., 2017), capaz de melhorar o sistema imunológico, a digestão e

promover cura de feridas e lesões (Yang et al., 2013). De acordo com os estudos existentes e

das práticas clínicas, o AS-IV possui potencial para ampla aplicação em inúmeras doenças e

também apresenta efeito neuroprotetor (Kumar e Pandey, 2013).

1.1 JUSTIFICATIVA

Considerando a importância clínica e social de patologias que envolvem em sua base

fisiopatológica o hipocampo e os déficits de memória e aprendizagem relacionados a esta

estrutura, busca-se a caracterização de substâncias que possam contribuir para a plasticidade de

células neurais e gliais. O alvo do presente estudo, portanto, é a avaliação do principal composto

ativo presente em um fitoterápico originário da cultura Ayurveda (o AS-IV), haja vista que

princípios ativos similares aos encontrados no Astragalus membranaceus já foram identificados

em outros fitoterápicos e descritas suas propriedades de proteção celular, torna-se relevante

avaliar através de cultura de células do hipocampo sua ação direta, para averiguar como estas

se comportam durante a atuação do composto ativo e assim analisar o possível efeito do AS-IV

para fornecer evidências científicas de sua ação na neuroplasticidade, a fim de ampliar estas

terapias.

19

1.2 REFERENCIAL TEÓRICO

1.2.1 Organização morfofuncional do hipocampo

Devido a complexidade de estímulos internos e externos adquiridos e devido ao fato de

todas as células neuronais serem excitáveis e processarem informações, o ser vivo necessita de

um sistema que efetue a resposta adequada a esses mesmos estímulos – o sistema nervoso. Este

sistema é assim composto pelo Sistema Nervoso Central (SNC) e pelo Sistema Nervoso

Periférico (SNP) (Arendt et al., 2008).

O SNC, responsável pelo processamento de informação, é essencialmente constituído

pelo encéfalo e pela medula espinal. O encéfalo, por sua vez, possui três subdivisões principais:

cérebro (constituído pelo telencéfalo, onde se encontram os hemisférios cerebrais, e pelo

diencéfalo), cerebelo e tronco encefálico (subdividido em mesencéfalo, ponte e bulbo). Já o

SNP é composto por nervos, gânglios e terminações nervosas.

Entre estas estruturas destacamos o cérebro, o principal órgão do SNC e a estrutura que

nos interessa investigar. Nesta se localizam os hemisférios cerebrais, que são compostos por

cinco lobos: frontal, parietal, occipital, temporal e insular, que podem ser observados em

diferentes vistas: superior, medial, inferior e lateral (Arendt et al., 2008) (Figura 1).

Figura 1: Vistas e lobos do encéfalo.

Adaptado de: https://www.auladeanatomia.com/novosite/sistemas/sistemanervoso/telencefalo/

O lobo temporal inclui áreas com função auditiva, olfatória, vestibular, visual e

linguística. Uma das áreas localizadas neste lobo, que desperta grande interesse científico, é o

hipocampo, estrutura que após dissecada e observada pelo anatomista Julius Caesar Aranzi,

recebeu esta nomenclatura por sua semelhança morfológica com um cavalo marinho. Arantius

então batizou a estrutura como “hipocampo”, da palavra grega hippos – “cavalo” e kampos –

“monstro marinho” (Bir et al., 2015). No encéfalo humano esta estrutura está localizada no lobo

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temporal medial, enquanto no rato estende-se rostralmente dos núcleos septais até o córtex

temporal, caudalmente (Shepherd, 2003).

O hipocampo consiste em uma faixa curva de córtex filogeneticamente primitivo

(Arquicórtex), localizado em ambos os hemisférios, possuindo aproximadamente 7 cm de

comprimento no encéfalo humano (Rao et al., 2012) e aproximadamente 5 á 5,4 mm no encéfalo

do rato (Paxinos e Franklin, 2004). Sua estrutura anatômica é organizada em corno de Ammon

(hipocampo propriamente dito) e o giro denteado, separados pela fissura hipocampal (Lavenex

et al., 2007). Além disso, é envolvido pelo giro para-hipocampal, que está posicionado abaixo,

com a parte anterior deste giro se inclinando e repousando em si mesma, formando o uncus

(Zeidman e Maguire, 2016).

Anatomicamente, o hipocampo está dividido no sentido antero-porterior em três

porções: cabeça, corpo e calda. A extremidade anterior da cabeça apresenta sulcos rasos com

elevações que são denominadas “pé do hipocampo” por sua aparência característica. A

extremidade posterior de sua cauda continua-se com o fórnix. No sentido medial e inferior, o

hipocampo é contíguo ao subiculum, presubiculum e o parasubiculum, repousando sobre o

córtex entorrinal e o giro parahipocampal (Kivisaari et al., 2013).

A formação hipocampal é constituída pelo hipocampo, giro denteado (GD), complexo

subicular (formado por presubiculum, subiculum e parasubiculum) e o córtex entorrinal (CE)

(Khalaf-Nazzal e Francis, 2013). Também relaciona-se intimamente à amigdala e a outras áreas

límbicas como o hipotálamo, corpos mamilares, tálamo e giro do cíngulo (Amaral e Witter,

1989; Knowles, 1992).

As informações oriundas das áreas de associação neocorticais, incluindo áreas frontais,

temporais e parietais são direcionadas ao hipocampo. Essas informações se convergem para os

córtices parahipocampal (CPH) e perirrinal (CP) e se projetam para o CE, daí então seguindo

para o hipocampo. Este é comumente utilizado para descrever um conjunto de duas regiões: o

GD e o hipocampo propriamente dito (“Corno de Amon”). Ambos possuem uma organização

interna trilaminada, composta por dois tipos de células principais: as células granulares do GD

que contém a fascia dentada e o hilo e as células piramidais do Corno de Amon, sendo estes

divididas nos setores de CA1, CA2 e CA3. Cada uma dessas regiões mantém um padrão

organizado de conexões intrínsecas e extrínsecas, com a principal aferência para o hipocampo

originando-se no córtex entorrinal (David e Pierre, 2009).

21

Figura 2. Anatomia intrínseca do hipocampo e via trissináptica.

Fonte: Neves et al., 2008.

As fibras que saem do CE em direção ao hipocampo constituem a chamada via

perfurante e inervam os dendritos das células granulares na região da camada molecular do GD.

Os axônios das células granulares do GD (fibras musgosas) se projetam para as células

piramidais da região de CA3, que por sua vez emitem fibras para a região de CA1 constituindo

a chamada via colateral de Schaffer. De CA1, as fibras projetam-se para complexo subicular, e

em seguida para o presubiculum e o parasubiculum, com sua projeção cortical mais

proeminente sendo dirigida para as camadas profundas do CE (David e Pierre, 2009) (Figura

2).

Ao sair do hipocampo estas informações podem seguir rotas diferentes e estabelecer

conexões que envolvem os sistemas de memória. As saídas sinápticas do hipocampo podem

estabelecer conexões com a amigdala, que atua como botão de disparo das experiências

emocionais, ao passo que também pode se convergir para o córtex prefrontal de forma direta,

além de essa informação poder também passar por diferentes estruturas até chegar ao córtex

pré-frontal (CPF) e reiniciar o ciclo novamente, retornando ao hipocampo (Bartsch e Wulff,

2015).

Essas rotas passam pela via perfurante ou seguem ao fórnix até os corpos mamilares do

hipotálamo, se projetam para o Trato Mamilo Talâmico (TMT) então podendo estabelecer

conexões com os núcleos anteriores talâmicos e se convergir para o cíngulo, córtex retrosplenial

para que finalmente retorne ao córtex parahipocampal (CPH) e reinicie o ciclo e/ou retorne às

áreas de associação. Contudo também podem ser enviadas ao CPF de forma indireta, quando

estas informações são encaminhadas ao núcleo medial talâmico para que logo em seguida sejam

enviadas ao CPF (Bartsch e Wulff, 2015), como esquematizado na Figura 3.

22

Figura 3. Mapa de conexões entre as estruturas relacionadas à memória no lobo temporal, áreas

de associação neocortical e núcleos diencefálicos, fluxo de informações.

Fonte: Bartsch e Wulff (2015)

As sinapses deste circuito trissináptico são predominantemente excitatórias, e sua

inibição se faz principalmente através de interneurônios localizados no hilo do GD e na região

do CA. Os principais neurotransmissores envolvidos neste circuito são o glutamato e o ácido

gama-aminobutírico (GABA) (Amaral e Witter, 1989; Andersen, 2007).

O glutamato (L-Glu) é o aminoácido livre mais abundante no cérebro e o principal

mediador dos sinais excitatórios do SNC dos mamíferos, exercendo papel essencial em

mecanismos subjacentes à plasticidade sináptica (Zhou and Danbolt, 2014), que será abordado

na sequência deste trabalho. Esses mecanismos fazem parte da base fisiológica de processos

comportamentais como cognição e memória (Prybylowski et al., 2005).

No cérebro, o L-Glu atua como precursor imediato do GABA, que é formado por

descarboxilação do L-Glu catalisado pela glutamato descarboxilase (GAD) como mostrado pela

primeira vez por Roberts e Frankel (1950). Como pode ser observado na Figura 4, em uma via

de síntese do glutamato o α-cetoglutarato produzido no ciclo de Krebs atua como substrato para

a enzima GABA transaminase (GABA-T) que transamina de modo redutivo o α-cetoglutarato

intraneuronal a glutamato. Por sua vez, o glutamato é convertido em GABA pela enzima

descaboxilase do ácido glutâmico (GAD), que retira uma de suas carboxilas (Golan et al., 2009;

Schousboe et al., 2013).

23

O L-Glu e o GABA desempenham papéis duplos no cérebro, como metabólitos e

neurotransmissores importantes que medeiam sinais excitatórios e inibitórios, respectivamente

(Schousboe, 2012; Schousboe et al., 2013). A GABA-T catalisa a conversão do GABA em

semi-aldeído succinico (SSA), que é oxidado a ácido succinico pela SSA desidrogenase, que

segue ao ciclo de Krebs, onde é transformado em α-cetoglutarato, a seguir sendo o glutamato

regenerado a partir de α-cetoglutarato pela ação da GABA-T (Golan et al., 2009).

Figura 4. Metabolismo do glutamato e GABA.

Fonte: Golan et al., 2009.

Os neurônios não podem realizar a síntese líquida de L-Glu e GABA a partir da glicose

devido ao fato de que os neurônios não possuem a enzima de síntese de glutamina (GS) e a

enzima piruvato carboxilase (PC) (Bak et al., 2006; Norenberg e Martinez-Hernandez, 1979;

Yu et al., 1983). Os astrócitos, por sua vez, expressam essas duas enzimas e são, portanto,

essenciais para manter um suprimento de glutamina, a precursora de L-Glu e GABA (Bak et

al., 2006). A troca de GABA, L-Glu e glutamina é referida como a ciclo glutamato-glutamina

(Bak et al., 2006).

O glutamato absorvido pelas células astrogliais pode ser metabolizado através do ciclo

do ácido tricarboxílico e ser utilizado na síntese de proteínas ou convertido em glutamina. A

glutamina pode ser liberada para o fluido extracelular por um transportador excitatório de

aminoácidos (EAATs) (Nissen-Meyer et al., 2011). A conversão de glutamato em glutamina é

catalisada pela enzima glutamina sintetase (GLUL) de forma dependente de ATP (Marcaggi e

Coles, 2001).

Como observado na figura 5, as células gliais sintetizam a glutamina, que é então

transportada para neurônios e convertida em glutamato pela atividade da enzima glutaminase

mitocondrial. Uma vez sintetizado, o glutamato é armazenado nos neurônios e secretado por

vesículas dos transportadores vesiculares de glutamato (VGLUTs). Após estimuladas, essas

vesículas podem se fundir com a membrana celular, permitindo assim a liberação do

24

neurotransmissor para o espaço sináptico. O glutamato então é removido a partir da fenda

sináptica por transportadores de aminoácidos excitatórios (EAATs) e dá continuidade ao ciclo

(Marmiroli e Cavaletti, 2012).

O glutamato e GABA estão envolvidos no processo de neurogênese (formação de novos

neurônios), que se inicia com a proliferação das células progenitoras que diferenciam-se em

células granulares no giro denteado e algumas em células gliais (Gonçalves et al., 2016).

Figura 5. Síntese de glutamato e ciclo entre neurônios e glia.

Fonte: Purves, 2010.

No que se refere à histologia hipocampal, há duas camadas de tecido cortical interligadas

entre si, organizadas à volta de dois diferentes tipos de células, a camada de células granulares

do GD e camada de células piramidais do CA. O GD é constituído por três camadas: o Stratum

Moleculare, que contém dendritos dos neurônios granulosos; o Stratum Granulosum, que

contém os corpos celulares das células granulosas; o Stratum Polymorfum, também conhecido

como região hilar, constituído pelos neurônios polimórficos (interneurônios) e axônios dos

neurônios granulares (Shepherd, 2003).

O hipocampo ou CA é composto também por três camadas: molecular, polimórfica e

camada de células piramidais. Devido à diferença na organização dos axônios e dendritos, estas

camadas são subdivididas em seis lâminas: inicialmente, o Epêndima ou zona epitelial, que

forma o revestimento da superfície ventricular do hipocampo; o Alveus, constituído por fibras

aferentes e principalmente eferentes da formação hipocampal que originam a fimbria e o fórnix;

Stratum Oriens, que contém os dendritos basais das células piramidais, contém outros tipos

celulares como as células em cesto que são interneurônios inibitórios do hipocampo (Figura 6).

25

Outros estratos presentes são o Stratum Piramidale, que contém os corpos celulares das

células piramidais. Estas células correspondem a cerca de 90% dos neurônios do hipocampo;

Stratum radiatum é a camada que se caracteriza por corpos celulares esparsos e vários sistemas

de fibras com aspecto radiado que contém (na área CA1 as fibras colaterais de Schaffer, os

axônios das células da região CA3, que formam sinapses com os dendritos das células

piramidais da região CA1) e o Stratum lacunosum-moleculare que contém os dendritos apicais

das células piramidais. As regiões CA1-CA3 são classificadas em quatro camadas (piramidal,

stratum oriens, stratum lucidum, stratum radiatum) (Da Silva et al., 1990; Lorente de Nó,

1934).

Figura 6. Histologia em Nissl do hipocampo de rato Wistar. A. Vista dorso-lateral do cérebro,

com indicação do nível da secção. B. Vista frontal do hipocampo, em plano coronal. C

Principais estruturas que compõem o hipocampo e desenho das células granulares e piramidais.

D Stratos (h – hillus; g- granular; m- molecular; Alveus, Stratum Oriens – s.o; Stratum

piramidal – s.p; Stratum radiatum – s.r; Stratum Lacunosum moleculare – s.lm).

26

O hipocampo recebe aferências de quase todas as áreas de associação neocortical através

dos córtices perirhinal e parahipocampal e finalmente através do córtex entorrinal (Van Strien

et al., 2009) e participa de um circuito em forma de anel cortical contínuo que foi nomeado

lobo límbico, constituído pelo giro do cíngulo, giro parahipocampal e hipocampo, considerado

por Broca (1850) como um lobo independente. Em 1937 o neuroanatomista James Papez propôs

um novo mecanismo para explicar as emoções, nomeado de circuito de Papez (Machado;

Haertel, 2014).

Posteriormente, o sistema límbico passou a ser conceituado como um conjunto de

estruturas corticais e subcorticais interligadas morfologicamente e funcionalmente,

relacionadas com as emoções e com a memória. Atualmente, estudos apontam que o hipocampo

está ligado às estruturas límbicas - o circuito começa a partir da formação do hipocampo,

subículo, atravessa os fórmix, os corpos mamilares e depois pelo trato mamilo talâmico e

estabelece sinapses no núcleo talâmico anterior. A partir daí, atinge o cíngulo, segue ao córtex

entorrinal e retorna à formação do hipocampo (Bhattacharyya, 2017).

O hipocampo participa de algumas modalidades do processo de aprendizagem e

coordena o processo de consolidação de engramas da memória explícita, desempenhando

também um papel importante na aquisição da aprendizagem espacial (Lavenex et al., 2007).

Para que ocorra a formação de memória, informações originárias de fontes externas

(experiências sensoriais oriundas da interação com o ambiente), mas também internas

(cognição, emoção) devem ser adquiridas (Cocenas-Silva et al., 2012; McGaugh, 2000).

Os sistemas de memória podem ser representados por uma sequência de etapas: o

primeiro processo mnemônico é a aquisição, que consiste no contato ou o acesso à informação

para os sistemas neurais ligados a memória. Durante a aquisição ocorre uma seleção, que

prioriza alguns aspectos mais relevantes e estes são armazenados por algum tempo. Esse é o

processo de retenção, e a informação fica disponível para ser recuperada. Com o passar do

tempo, a informação pode desaparecer, processo chamado de esquecimento ou pode sofrer um

processo chamado consolidação, que é a formação da rede neural de memória (Lent et al., 2010,

p.646-647).

São vários os tipos e subtipos de memória, que podem ser classificadas em função do

intervalo de tempo: a memória de curta duração possui uma capacidade de recordação limitada,

com duração de segundos a minutos (Eysenck, 1988). A memória de longo duração pode ser

dividida em não-declarativa (implícita) e declarativa (explícita) (Anderson, 2013). A memória

não-declarativa está relacionada ao processo de aquisição de habilidades, sobretudo motoras

27

(Salmon e Butters, 1995), enquanto a memória declarativa pode ainda ser subdividida em

memórias semântica e episódica (Lent, 2008).

A memória espacial consiste em uma subcategoria da memória episódica, abrangendo

o conhecimento da localização dentro de um contexto ambiental (Foster et al., 2012). Esse tipo

de memória envolve a habilidade para codificar, armazenar e recuperar informações sobre

localizações espaciais, configurações ou rotas (Buffalo, 2015). Deste modo, sua função permite

lembrar a localização de objetos ou encontrar um trajeto dentro de um ambiente.

Evidências do papel crítico desempenhado pelo hipocampo na memória declarativa são

relatadas quando se observam pacientes com lesões nessa estrutura, consequentemente em

conexões subcorticais, e são constatados déficits de memória, que afetam seletivamente a

modalidade declarativa. No entanto, a capacidade de distinguir novos objetos com

caracterísiticas familiares permanece intacta (Eichenbaum e Cohen, 2014; Giovanello et al.,

2003).

Além disso, foi constatado que, nesses pacientes, o hipocampo tem a função de manter

a capacidade de associar objetos na memória e lembrar associações contextuais (Addis et al.,

2004; Bartsch et al., 2010). Outros estudos clínicos têm demonstrado que o córtex

parahipocampal é ativado durante a apresentação de cenas espaciais ou durante a gravação de

objetos relacionados fortemente com locais específicos (Churchwell et al., 2010; Stone et al.,

2011). O hipocampo é, por conseguinte, uma estrutura crítica para processar e lembrar

informação espacial e contextual (Bannerman et al., 2004; Fanselow e Dong, 2010; Hernández

et al., 2015).

Estudos experimentais mostram que o hipocampo não opera como uma estrutura

unitária, e que suas funções fisiológicas podem ser divididas em duas importantes áreas

topográficas: a porção dorsal (ou posterior) e a porção ventral (ou anterior). Em concordância

com esta divisão, a porção dorsal está diretamente envolvida com funções cognitivas, como

aprendizagem e memória espacial e contextual, enquanto a porção ventral participa

especificamente relacionadas aos aspectos emocionais como ansiedade e estresse (Bannerman

et al., 2004; Fanselow e Dong, 2010). Neste contexto, além da questão cognitiva, mediada pela

porção dorsal, o hipocampo também poderia estar participado ativamente na sensibilização

locomotora através da modulação de aspectos emocionais, via porção ventral.

Trabalhos anteriores mostraram esta distinção, pois lesões restritas ao hipocampo dorsal

afetam particularmente a memória e navegação espacial, explicando que esta parte medeia

funções a este tipo de memória, enquanto lesões restritas ao hipocampo ventral de tamanho

28

semelhante afetam especialmente os comportamentos relacionados à ansiedade (Bannerman et

al., 2004; Fanselow e Dong, 2010; Moser et al., 1995).

No que se refere à navegação espacial, pode-se constatar que ocorre uma participação

de ambos os hipocampos, pois existe um gradiente ao longo do eixo longitudinal destes. Os

estudos pioneiros de O’Keefe e Dostrovsky (1971) estabeleceram que havia um grupo

específico de células observadas no hipocampo de ratos que disparavam quando em testes

comportamentais o animal percorria um local bem definido e eram “silenciosas” quando o

animal percorria outros locais não específicos. Estas células receberam então a denominação

de “células de lugar” (place cells) (O’Keefe e Dostrovsky, 1971).

Estas células são responsáveis pela atuação da navegação espacial e estão presentes em

70% do hipocampo dorsal, atuando na codificação da memória espacial, pois uma pequena

porção deste hipocampo mostrou-se suficiente para realizar esta codificação. Contudo, para

haver a recuparação da memória codificada se requerem terços dorsais do hipocampo, que

envolve o hipocampo ventral, demonstrando que esta porção atua durante a aprendizagem

espacial (Jung et al., 1994; Moser et al., 1995; Moser e Moser, 1998).

Os padrões de conectividade explicam as funções relacionadas às emoções das regiões

do hipocampo, especialmente o eixo dorsoventral, pois a amígdala basolateral, que apresenta

função crucial na aprendizagem do medo, recebe projeções consideráveis do eixo dorsoventral

(Fanselow e LeDoux, 1999). Evidências crescentes mostram que o hipocampo ventral, e não o

hipocampo dorsal, atua como mediador do comportamento incondicionado do medo, ou seja,

esta região do hipocampo atua quando é provocada uma resposta natural e automática ao medo

(Kjelstrup et al., 2008).

O estudo citado anteriomente demonstrou que lesões no hipocampo ventral reduzem

respostas defensivas ao medo quando expostos a um ambiente ameaçador incondicionado. Esta

hipótese pode ser constatada pois mesmo quando expostos a lesões seletivas na amigdala não

foi observada redução da resposta defensiva, o que sugere que o hipocampo ventral de fato pode

influenciar na expressão do medo, enquanto também foi observado que lesões nos dois terços

dorsais do hipocampo não afetaram a expressão do medo, diferente do que ocorre quando há

pequenas lesões na porção ventral (Kjelstrup et al., 2008).

Os danos a esta estrutura primordial para os processos de informações e navegação

espacial poderiam conduzir a dificuldade em estabelecer novas memórias ou impossibilitá-las,

características estas que estão envolvidas em aspectos clínicos.

29

1.2.2 Aspectos clínicos relacionados ao hipocampo

Múltiplas evidências sugerem um papel importante para o hipocampo na memória

episódica e espacial (Neves et al., 2008). Grande parte dos dados que dispomos sobre a memória

proveio da prática e do estudo de casos clínicos pelos neurologistas. O caso mais estudado e

que apresentou grande repercussão na literatura médica foi do paciente Henry G. Molaison,

conhecido pelas siglas H.M., que trouxe importante contribuição para a compreensão da relação

do hipocampo como estrutura responsável por consolidar a memória expícita (Scoville e

Milner, 1957).

O paciente H.M. sofria de crises convulsivas epilépticas desde os 10 anos de idade e o

agravamento dessas crises não só comprometeu sua saúde, mas também interrompeu seu

desempenho escolar e sua vida social. Desta forma, em 1953 o paciente com 27 anos foi

submetido a um procedimento neurocirúrgico realizado por William Scoville, que realizou a

remoção bilateral dos setores do lobo temporal medial, incluindo grandes partes de ambos os

hipocampos e regiões CE, CP e CPH e amigdala com a intenção de propiciar uma melhora em

sua qualidade de vida. Porém logo após o procedimento H.M. apresentou um grave quadro de

amnésia (Annese et al., 2014).

O quadro apresentado por H.M. era caracterizado por incapacidade de formar novas

memórias episódicas (amnésia anterógrada total), associado a um quadro de amnésia retrógrada

parcial, restrita ao período imediatamente anterior a cirurgia (Neves et al., 2008). Após varios

anos de investigação, em 1997 foi realizado um exame de ressonância magnética (RM)

morfológica que demonstrou ausência dessas regiões cerebrais (Figura 7).

Figura 7. Ressonância magnética mostrando (A) Regiões do cérebro de um paciente em

condições fisiológicas normais, (B) Caso do paciente H.M. com remoção das regiões Legendas:

MMN – Lobo temporal Medial; A – Amigdala; EC – Córtex entorrinal, H – Hipocampo; PR –

Córtex Parahipocampal; V- Ventrículo.

Fonte: Adaptado de (D’Esposito et al., 2009)

30

A neuroimagem confirmou que as estruturas do lobo temporal medial haviam sido

atingidas, sendo, portanto, as responsáveis pelas funções perdidas. Também pôde ser constatado

que a aquisição e a retenção da memória temporária não sofreram alterações com a lesão, pois

H.M. se mostrou capaz de aprender tarefas características da memória de procedimentos, como

novas habilidades motoras e reter informações de curta duração em sua memória operacional.

Além disso, os engramas já consolidados foram preservados e a lesão não havia atingido a

retenção duradoura das memorias antigas nem os seus processos de evocação, indicando que as

funções atingidas pela lesão envolviam a memória explícita (Neves et al., 2008).

A participação específica do hipocampo foi elucidada por meio de um caso clínico de

um paciente estudado posterior ao de H.M. e demonstrou características semelhantes. O

paciente conhecido como R.B. apresentou um quadro de isquemia cerebral bilateral durante

uma cirurgia que repercutiu em amnésia na região medial temporal. A análise post mortem

detalhada das características neuropatológicas eram histológicas e não macroscópicas e também

permitiu concluir que as regiões adjacentes não estão envolvidas no processo de consolidação,

demonstrando que os danos limitavam-se ao hipocampo e formação hipocampal, causando um

comprometimento na memória (Zola-Morgan et al., 1986).

Os aspectos clínicos do hipocampo envolvem o comprometimento da memória e outras

funções características desta estrutura em patologias como a DA e outros tipos de demência,

esclerose hipocampal, isquemia, e outras condições clínicas que envolvem a conexão do

hipocampo com regiões relacionadas à memória como na Síndrome de Korsakoff (Zubaran et

al., 1996).

A demência é uma enfermidade mental caracterizada por prejuízo cognitivo, sobretudo

da memória e do comportamento. Existem muitas doenças que resultam em demência, sendo

os tipos mais comuns de demência a do tipo vascular, demência com corpos de Lewy,

frontotemporal e a DA, que é o mais comum tipo de demência (Santos et al., 2014).

A DA, caracterizada pelo neuropatologista alemão Alois Alzheimer em 1907, é uma

condição clínica degenerativa e progressiva que resulta em danos à memória, pensamento e

comportamento (Cole e Frautschy, 2006; Harman, 1996). Esta patologia caracteriza-se por um

comprometimento da linguagem, resolução de problemas e outras habilidades cognitivas que

afetam a capacidade do indivíduo de realizar atividades cotidianas (Alzheimer’s, 2015).

Uma média global de 47,5 milhões de pessoas vivem com demência e anualmente cerca

de 7,7 milhões de novos casos são registrados, sendo a DA a causa mais comum de demência,

contribuindo para 60 ou 70% dos casos (WHO, 2016). O impacto econômico dos cuidados com

31

o paciente também é elevado, com serviços e recursos neurológicos desproporcionalmente

escassos, o que pode influenciar na sobrevida do indivíduo (WHO, 2016).

As principais características patológicas da DA são as agregações de proteína amilóide-

beta (Aβ) e proteína tau. A Aβ é produzida a partir da proteína precursora de amiloide (PPA)

pela ação sequencial de duas proteínas, β e α secretases, pois o produto da β gera amiloide

tóxico. A tau é uma proteína associada aos microtúbulos, atuando na sua estruturação e

estabilização, com sua capacidade de ligação aos mesmos sendo dependente do número de

fosforilações presentes. Quanto maior o estado de fosforilação mais comprometida fica a

interação com os microtúbulos e logo o transporte de componentes axonais (Fauci e others,

2008).

A produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) também parece estar envolvida na

manutenção do ciclo de degeneração da DA, fazendo com que ocorram danos ao DNA

mitocondrial (Patten et al., 2010) e diminuição da atividade de enzimas antioxidantes, como a

superóxido dismutase (SOD), catalase e glutationa peroxidase (GSH) (Xiao et al., 2000). As

ROS produzidas principalmente a partir da maquinaria da energia celular podem por sua vez

atuar em diferentes níveis e prejudicar a função mitocondrial, ativando as proteínas da família

caspase, causando a perda de potencial de membrana mitocondrial e desregulação das vias

MAPKs e AKT (Swerdlow, 2007), que são proteínas sinalizadoras importantes (veja Apêndice

A).

Os danos causados por radicais livres ocorrem por um desequilíbrio entre a sua

produção e a sua neutralização por sistemas antioxidantes celulares no corpo humano (Houstis,

2007) e são sugeridos para desempenhar um papel importante no processo de neurodegeneração

relacionada com a idade e declínio cognitivo (Uttara et al., 2009). Este declínio ocorre porque

as células nervosas em regiões do cérebro envolvidas na função cognitiva foram danificadas e

não funcionam mais normalmente (Heneka e O’Banion, 2007; Mattson, 2004).

A esclerose do hipocampo (EH) é uma patologia comum encontrada na epilepsia do

lobo temporal medial (MTLE-EH), bem como em outras síndromes de epilepsia e em ambas as

práticas cirúrgicas e post-mortem (Thom, 2014). É a mais frequente epilepsia fármaco-

resistente e a maioria dos pacientes portadores apresentam uma história de lesão inicial

precipitante, como infecção do SNC, trauma ou convulsões febris (CF). Dentre esses fatores, a

CF é o mais comum e 50% - 80% dos pacientes com MTLE-EH têm história prévia de CF

complicada (Leal et al., 2017).

Esta patologia é caracterizada por um ciclo vicioso crônico de dano e perda neuronal e

consequentemente atrofia do hipocampo, o que contribui para um início mais precoce da doença

32

como observado na população do estudo citado anteriormente. Deste modo, a hipótese de que

os pacientes com Alelo Apolipoproteína E (Apoe) são mais propensos a prejudicar a

recuperação neuronal após uma lesão, além de estar associada à instabilidade da rede do SNC

e menor proteção contra a oxidação e inflamação, influenciando no crescimento e recuperação

neuronal (Leal et al., 2017).

Um estudo recente trata da relação do hipocampo com o comprometimento cognitivo

leve amnésico (ICMM). A análise de tarefas de memória-fMRI demonstrou que o recall

primário está associado a uma maior ativação do hipocampo e das regiões corticais têmporo-

parietal e frontal em indivíduos saudáveis, enquanto no estado de repouso foi revelado por

ressonância magnética funcional (fMRI) que esta conectividade funcional do hipocampo (FC)

com áreas neocorticais do cérebro e regiões da rede de modo padrão (DMN) é alterada no

ICMM (Brueggen et al., 2016).

A esquizofrenia e o transtorno do pânico também têm sido associados a alterações

límbicas, como volumes reduzidos do hipocampo e da amígdala. As alterações cognitivas são

características centrais na esquizofrenia, permanecendo relativamente estáveis durante todo o

curso da doença (Cortizo-Vidal et al., 2015).

O hipocampo possui conexões importantes com o diencéfalo, especialmente com os

corpos mamilares do hipotálamo e indiretamente com os Núcleos anteriores do tálamo (NAT).

Deste modo, estas regiões também atuam na consolidação da memória explícita, o que pode ser

constatado por casos de pacientes com lesões diencefálicas que apresentam sintomas

amnésicos. As amnésias diencefálicas são predominantemente anterógradas, quadro clínico

frequente em alcóolatras graves que apresentam a síndrome de Korsakoff, causada pela

deficiência de tiamina (Vitamina B1), repercutindo em lesões no diencéfalo que atingem

principalmente as regiões que estabelecem conexões com o hipocampo (Silva e Enes, 2013).

Evidências sugerem que as crianças de mulheres diabéticas exibem anormalidades

intelectuais e comportamentais acompanhadas por modificação da estrutura e função do

hipocampo. Múltiplas alterações biológicas, incluindo hiperglicemia, hiperinsulinemia,

estresse oxidativo, hipóxia e deficiência de ferro ocorrem em gestações com diabetes e afetam

o desenvolvimento do SNC do feto. A conclusão de vários estudos é que a perturbação na

glicose e homeostase da insulina em mães e lactentes são fatores teratogênicos importantes no

desenvolvimento do SNC (Hami et al., 2015).

Essas crianças são mais susceptíveis a anormalidades do desenvolvimento neurológico,

incluindo deficiências na capacidade de aprendizagem, nível de atividade e funcionamento

motor. Algumas dessas deficiências são bem conhecidas como fatores de risco para desenvolver

33

esquizofrenia mais tarde, mas o grau de risco é variável e pode estar relacionado com a

gravidade da desordem nas mães com diabetes (Delascio Lopes et al., 2011; Georgieff, 2006;

Ornoy et al., 2001; Sells et al., 1994).

Uma explicação para estes efeitos são os receptores de insulina e IGF-1 (IR e IGF1R,

respectivamente), pois estão distribuídos em um padrão altamente específico com alta

densidade em algumas regiões cerebrais, tais como o hipocampo. Pesquisas recentes

estabeleceram claramente que o diabetes materno interrompe a regulação de IR e IGF1R no

hipocampo de ratos neonatos (Hami et al., 2015).

Outros estudos estão em desenvolvimento para analisar a relação do hipocampo com os

aspectos clínicos de patologias, de modo a averiguar como se comportam as células presentes

nesta região durante sua progressão e quais as alterações anatômicas, patológicas e bioquímicas

envolvidas, para que desta forma, possa investigar novas terapias administradas nesta região

límbica e em demais regiões que estabelecem conexões aferentes e eferentes com o hipocampo.

1.2.3 Plasticidade no hipocampo

Durante a maior parte do século XX, a comunidade de neurociências assumiu que o SNC

dos mamíferos se torna estruturalmente estável logo após o nascimento, tornando-se uma

estrutura rígida que não poderia ser modificada e que lesões seriam permanentes, pois suas

células não poderiam ser reconstituídas ou reorganizadas (Kessler et al., 2011; Leuner e Gould,

2010). Entretanto, avanços técnicos nas últimas décadas trouxeram uma nova perspectiva a este,

pois observou-se que o cérebro é uma estrutura modificável à medida que é estimulado

(Pascual-Leone et al., 2005).

O termo plasticidade foi introduzido por volta de 1930 por Albrecht Bethe, um

fisiologista alemão. Plasticidade seria a capacidade do organismo em adaptar-se às mudanças

ambientais externas e internas, graças à ação sinérgica de diferentes órgãos, coordenados pelo

SNC. Os trabalhos pioneiros de Santiago Ramón y Cajal e Eugênio Tanzi (citados por

Rosenzweig, 1996) apresentam relações diretas entre plasticidade e o sistema nervoso. Tanzi

propôs que durante a aprendizagem ocorreriam mudanças plásticas em junções neuronais

enquanto Cajal sugeriu que o exercício mental poderia causar maior crescimento de

ramificações neurais (Rosenzweig, 1996).

Atualmente há a aceitação quase universal de que alguns neurônios são gerados

continuamente na idade adulta e adicionados aos circuitos neurais estabelecidos (Shors, 2008).

Ainda há controvérsia sobre a extensão regional da neurogênese adulta, mas o hipocampo é

34

uma região cerebral onde se chegou ao consenso de que a produção de novos neurônios

granulares está em curso ao longo da vida (Gould, 2007).

O hipocampo é uma região do cérebro de mamíferos que apresenta uma impressionante

capacidade de reorganização estrutural. Os circuitos neurais sofrem modificações na

complexidade dendrítica e número de sinapse, e novas conexões neurais são formadas através

do processo de neurogênese (Shors, 2008), como observado na representação esquemática na

Figura 8.

Quando ocorre a formação de novos neurônios do grânulo e esta é acompanhada pelo

crescimento de axônios, dendritos e sinapses, a neurogênese adulta aumenta a plasticidade do

hipocampo através de múltiplos processos. Além disso, os neurônios do grânulo preexistentes

do GD e dos neurônios piramidais nas áreas CA3 e CA1 sofrem modificações dinâmicas em

seus dendritos, bem como na formação e eliminação de sinapses. Todos esses tipos de

plasticidade estrutural estão sujeitos a modificações por uma variedade de fatores e condições,

sugerindo que podem ser substratos para a mudança dependente da experiência (Leuner e

Gould, 2010).

Figura 8. Neurogênese no hipocampo adulto no giro denteado.

Fonte: Lie et al., 2004.

O processo de neurogênese no hipocampo adulto se inicia com proliferação e

determinação do destino, com as novas células migrando para o interior da camada granular

que são inervadas por GABA (Ácido Gama Amino butírico), então as células-tronco na zona

subgranular do giro dentado dão origem a células de trânsito amplificando que se diferenciam

em neurônios imaturos. A segunda etapa é a migração, onde neurônios imaturos migram para

a camada de células granulares do giro dentado. E finalmente a terceira ocorre a diferenciação

ou integração, onde os neurônios imaturos transformam-se em maduros, os chamados novos

neurônios granulares, recebendo entradas do CE e estendendo projeções em CA3 (Lie et al.,

35

2004). É nesta fase de maturação neuronal que ocorre a transição de inputs de GABA para

imputs glutamatérgicos (Gonçalves et al., 2016).

Durante o processo de aprendizado ocorrem modificações estruturais e funcionais nos

neurônios. Ou seja, esse processo promove modificações plásticas (Pascual-Leone et al., 2005).

Uma experiência pode modificar redes neurais pré-estruturadas alterando a eficiência da

transmissão sináptica em conexões seletivas, modificando assim o fluxo de informações dentro

da rede. Deste modo, encontra-se a plasticidade sináptica, considerada como fenômeno

essencial para a aprendizagem e memória.

Mais especificamente, a plasticidade sináptica é a capacidade de modificação na

eficiência da transmissão sináptica (aumento ou diminuição da resposta pós-sináptica) pela

atividade neural gerada por uma experiência. Os fenômenos de plasticidade sináptica podem se

subdividir em duas categorias: plasticidade sináptica de curta duração e de longa duração. A

plasticidade sináptica de curta duração ocorre quando um padrão de atividade neural gera uma

alteração na transmissão sináptica por curto período de tempo (dezenas ou centenas de

milissegundos) sendo possível observar inibição ou facilitação da resposta do neurônio pós-

sináptico (Citri e Malenka, 2008).

Os mecanismos moleculares da inibição envolvem a inativação de canais de sódio (Na+)

e canais de cálcio (Ca2+) dependentes de voltagem ou a depleção de vesículas sinápticas. No

caso da facilitação, ocorre acúmulo de íons Ca2+ no terminal pré-sináptico, o que favorece a

liberação de uma quantidade maior de neurotransmissores. Acredita-se que esses dois

mecanismos de plasticidade sináptica de curta duração possuam um papel importante nas

adaptações rápidas a estímulos sensoriais, mudanças transitórias em estados comportamentais

e formas curtas de memória (Zucker e Regehr, 2002).

A plasticidade sináptica de longa duração, por sua vez, atua gerando alterações que

duram horas ou dias e pode ser estudada através de dois mecanismos: a potenciação de longa

duração (LTP, do inglês long-term potentiation) e a depressão de longa duração (ou LTD, do

inglês long-term depression). A LTP é observada experimentalmente quando estímulos

elétricos são aplicados em alta frequência sobre uma população específica de neurônios,

podendo provocar a potenciação dos potenciais pós-sinápticos de uma determinada região

encefálica que recebe projeções axonais da população estimulada (Bliss e Lømo, 1973). As

propriedades básicas atuantes na LTP fazem com que esta se constitua um modelo celular de

memória, especialmente porque pode ser gerada rapidamente, fortalecida e prolongada por

repetição (Colbran, 2015).

36

A formação da memória pode ocorrer quando uma determinada via neural é formada.

Esse mecanismo ocorre devido a LTP. Entretanto, quando a força sináptica de uma via neural

é diminuída, os estímulos externos deixam de provocar uma resposta pela LDP durante a

habituação (Mayford et al., 2012).

Estudos moleculares e farmacológicos de preparações do hipocampo identificaram

alguns dos principais eventos de sinalização que são acionados. A memória declarativa de longo

prazo por LTP é transformada no hipocampo. O neurotransmissor glutamato é então liberado

pelo neurônio pré-sináptico e se liga aos receptores AMPA e NMDA na membrana plasmática

do neurônio pós-sináptico (Zheng XY, 2015). Então a despolarização iniciada pela ativação dos

receptores AMPA atenua o bloqueio de magnésio no canal do receptor NMDA e o Ca2+ entra

no neurônio pós-sináptico com o Na+. O aumento de Ca2+ ativa a calmodulina quinase II,

proteína quinase c e tirosina quinase (enzimas indutoras da LTP) (Mayford et al., 2012).

Uma série de outras proteínas cinases parece estar implicada na indução da LTP como

PKC e MAPK. A calmodulina quinase II fosforila os receptores AMPA, aumentando sua

condutância e aumenta o número de receptores AMPA na membrana celular. É importante

ressaltar que poucos receptores AMPA exibem resposta pós-sináptica fraca ao L-Glu. Porém,

após indução de LTP as sinapses apresentam atividade excitatória, o que explica possivelmente

a incorporação de receptores AMPA à membrana pós-sináptica (Citri e Malenka, 2008). Após

a indução da LTP, um sinal químico de óxido nítrico (NO) é liberado pelo neurônio pós-

sináptico e é transmitido ao neurônio pré-sináptico, causando aumento da duração na liberação

do glutamato (Mayford et al., 2012), como demonstrado na Figura 9.

Figura 9. Mecanismo da formação de LTP na memória declarativa.

Fonte: Barrett et al., 2010. Pág. 287.

Outra forma de plasticidade neural com formação de memória declarativa pode ocorrer

com a participação de receptores de glutamato (GluR1) e pela ativação do fator de transcrição

CREB-1. Neste mecanismo de indução de LTP e memória a transdução de sinal ocorre via

receptor NMDA (NMDAR). A plasticidade de curto prazo é promovida pela sinalização de

37

Ca2+ dependente de NMDAR e o recrutamento de novos receptores de glutamato, enquanto a

plasticidade de longo prazo requer ativação gênica dependente de CREB pela ação de múltiplas

proteínas quinases. A plasticidade e a memória também requerem a síntese da isoforma ativa

da proteína quinase C (PKC) (Mayford et al., 2012), como esquematizado na Figura 10.

Figura 10: Plasticidade neural de curto e longo prazo.

Fonte: Mayford et al., 2012

As proteínas-quinases ativadas por mitógenos (MAPK) também são proteínas

sinalizadoras importantes ativadas pelos neurotransmissores e por vários fatores de

crescimento. Um membro dessa família é a quinase regulada por sinais extracelulares (ERK).

A cascata ERK é utilizada em todas as regiões cerebrais em que a plasticidade sináptica ocorre

e sua ativação é requerida para a formação de novas memórias, o que pode ser constatado se a

atividade das ERKs for bloqueada por meio da injeção de um inibidor em uma região cerebral

como no hipocampo, com consequente bloqueio de todos os modos de aprendizado associados

a esta estrutura (English e Sweatt, 1997).

Whittlock e colaboradores (2006) mostraram que durante uma tarefa de aprendizado

comportamental a LTP pôde ser registrada in vivo em células hipocampais, indicando que

padrões de atividade durante uma tarefa de aprendizado são suficientes para induzir LTP

(Whitlock et al., 2006). Em concordância, o trabalho de Yao e colaboradores (2007) mostraram

que a injeção de inibidores da enzima PKM (Proteína cinase) aboliu tanto a manutenção da LTP

quanto o armazenamento de um aprendizado espacial, sugerindo que a manutenção (fase tardia)

da LTP é requerida para se manter a memória (Yao et al., 2007).

O aumento da neurogênese e efeitos facilitadores da plasticidade pode ser produzido por

uma variedade de tratamentos, incluindo o ambiente enriquecido, a atividade física ou ação de

drogas (Faillace et al., 2015). Um estudo realizado por Suzuki e colaboradores (2011)

38

demonstrou os efeitos facilitadores do bilobalide, um constituinte do Ginkgo biloba, na

transmissão sináptica e plasticidade em subcampos do hipocampo.

Este composto ativo, presente no fitoterápico citado anteriormente, quando

administrado na concentração de 50 μM apresenta capacidade para potencializar picos

populacionais na região CA1 do hipocampo, em células piramidais e protege o cérebro contra

morte celular. Neste estudo, os efeitos do bilobalide na transmissão sináptica e sua plasticidade

em subcampos de hipocampo de rato foram investigados eletrofisiologicamente, demonstrando

efeitos facilitadores na plasticidade sináptica em sinapses na via perfurante, em que a indução

de LTD foi bloqueada na presença de bilobalide (Suzuki et al., 2011).

Outro fitoterápico que apresentou ação benéfica na plasticidade foi a Camellia sinensis

(chá verde, do inglês green tea) que apresenta como principal composto epigallo-catequina-3-

galato (EGCG). No estudo realizado por Ortiz-López e colaboradores (2016), a ação deste

composto ativo aumentou a sobrevivência neuronal na neurogênese do hipocampo adulto in

vivo e in vitro. Com uma curva dose-resposta que atingiu o pico a 2,5 mg/kg de EGCG com

aumento significativo da sobrevivência celular sem afetar a proliferação celular mas

diminuindo as células apoptóticas (Ortiz-López et al., 2016).

Os flavonoides presentes nas flores da baicaleína também apresentam ação de

potencializar a plasticidade hipocampal. Em um estudo recente foi observado que houve

aumento da ação da LTP (longo prazo), dado que a baicaleína possui várias atividades

biológicas, especialmente os seus efeitos sobre a plasticidade sináptica e função cognitiva,

função sináptica in vitro e in vivo no modelo AD. A baicaleína foi administrada oralmente, 40

mg/kg ou 80 mg/kg para ratos APP/PS1 e ratos de tipo selvagem. O tratamento teve início

quando os animais tinham 5 meses de idade e foram realizados testes cognitivos até os 7 meses,

pelo teste do labirinto aquático de Morris (Gu et al., 2016). Neste contexto, a administração

oral de longo prazo de baicaleína inibiu a atividade GSK3β, reduziu a enzima β-secretase

(BACE1), diminuiu a concentração de Aβ total e evitou a fosforilação de Tau em ratos

APP/PS1. Enquanto isso, a baicaleína restaurou a plasticidade sináptica e os déficits de

memória (Gu et al., 2016).

Agentes nutracêuticos como o resveratrol (RSV), um fenol encontrado na pele de uvas

e bagas vermelhas, bem como em nozes, também estão em investigação. O RSV foi relatado

por apresentar propriedades antioxidantes e antitumorais, mas seus efeitos na plasticidade

neural estão em debate. Em geral, os achados indicam que este nutracêutico pode melhorar a

cognição e a plasticidade do hipocampo, embora alguns estudos relatem que também pode gerar

efeitos adversos, por isso estudos com novas dosagens precisam ser realizados. Além disso, ele

39

pode ser estabelecido como coadjuvante seguro na prevenção e no tratamento de doenças

neuropsiquiátricas (Dias et al., 2016).

Embora a busca por fármacos eficazes seja a base destas investigações, a suplementação

nutricional também surge com um potencial coadjuvante para a prevenção e tratamento da DA

(Maruszak et al., 2014; Rege et al., 2014). Com finalidade de investigar o potencial

neuroprotetor dos efeitos do RSV no contexto da DA, um estudo in vitro utilizando células

neuronais do hipocampo de ratos foi realizado utilizando RSV na concentração de 75 μM em

células após incubação com Aβ (25 μM) (Rege et al., 2015).

Neste estudo, foram constatados resultados encorajadores, pois o RSV conseguiu

atenuar a peroxidação lipídica e restaurar outros marcadores de danos oxidativos, melhorando

os níveis de ácido ascórbico, glutationa redutase, SOD, entre outros. Além disso, também foi

capaz de melhorar os níveis de proteínas no hipocampo como a sinaptofisina.

Um ambiente favorável para a plasticidade celular também pode ser observado a partir

da ativação do Fator de crescimento de Fibrobastos-2 (FGF-2) no gânglio da raiz dorsal (DRG)

após lesão da medula espinal do rato (Guzen et al., 2016). O GDNF quando adicionado ao

enxerto de nervo favoreceu a recuperação motora, o crescimento de fibras neuronais locais e a

neuroplasticidade na medula espinal (Guzen et al., 2009). Outro fator de crescimento

evidenciado na literatura por desempenhar um papel crítico na sobrevivência neuronal,

plasticidade sináptica e memória é a neurotrofina BDNF, por atuar na regulação da estrutura e

função neuronal no desenvolvimento do SNC do adulto (Lu et al., 2014).

Estes estudos mostram que fatores de crescimento e compostos naturais presentes em

fitoterápicos podem em princípio modular a plasticidade cerebral. No capítulo subsequente,

tratamos dos mecanismos de ação do fitoterápico estudado, bem como de estudos anteriores

que avaliaram seus constituintes funcionais.

1.2.4 Astragalosideo IV (Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.)

O Astragalus membranaceus é uma planta perene de floração nativa, disseminada na

medicina tradicional chinesa como “astragalus”, raiz de leite-ervilhica membranosa (inglês), ou

Huang qi (chinês) que significa “líder amarelo”, originária das regiões norte e leste da China e

da Mongólia, pertence à família das Angiospermas Fabaceae, subfamília Faboideae (Li et al.,

2017). É considerada uma das mais importantes ervas medicinais cultivadas nestas regiões com

finalidade de promoção à saúde e desenvolve-se principalmente em zonas semi-áridas, sendo

este gênero particularmente distribuído no Sudeste da Ásia (Kim et al., 2014).

40

A raiz do astrágalo é a parte da planta utilizada com finalidade medicinal, sendo

colhidas de plantas com 4 anos de idade que crescem de 16 a 36 polegadas de altura, que é uma

unidade de comprimento usada no sistema imperial de medidas britânico, com seu extrato

orgânico em pó tendo uma aparência marrom-amarelada (Figura 11). Os astragalosídeos são

amplamente distribuídos na natureza, contendo mais de 2.000 espécies, embora apenas duas

sejam usadas com finalidade medicinal, o Astragalus membranaceus e o Astragalus

mongholicus (Gao et al., 2007) .

O principal composto ativo presente na raíz do Astragalus membranaceus é o

Astragalosídeo IV (AS-IV). As propriedades biológicas e farmacológicas do AS-IV apresentam

efeito protetor potente em patologias, devido a seu efeito antioxidante, antiviral, antibacteriano

(Wagner et al., 1997; Zheng, 2015), anti-inflamatório, antifibrótico, anti-asmático, anti-

diabético, imunorregulação e efeito cardioprotetor (Li et al., 2017), capaz de aumentar o

metabolismo, melhorar o sistema imunológico, a digestão e promover cura de feridas e lesões

(Yang et al., 2013). De acordo com os estudos existentes e das práticas clínicas, o AS-IV possui

potencial para ampla aplicação em inúmeras doenças e também apresenta efeito neuroprotetor

e antioxidante, provavelmente devido a presença de seus constituintes funcionais (Kumar e

Pandey, 2013).

Figura 11. Astragalus membranaceus (Fabaceae). (A), detalhes das raízes (B), fatias de raízes

secas (C), extrato obtido após secagem e moagem (D).

Fonte: https://nccih.nih.gov/health/astragalus

Os principais constituintes bioativos de Astragalosídeo membranaceos incluem

polissacarídeos, saponinas, flavonoides, aminoácidos e oligoelementos (Park et al., 2009),

isoflavonóide astragalosídeo (Song et al., 2004; Wu e Chen, 2004) e Ácido gama amino butírico

(GABA) (McKenna et al., 2002). Entre estes constituintes, os astragalósideos formam uma

classe de substâncias naturais chamadas cicloartanos triterpenoides tipo glicosídeos que

indicam a qualidade da raiz e seus principais subtipos são AS I, II, III ou IV (Kwon et al., 2013;

41

Xu et al., 2011). No presente estudo trataremos da ação do AS-IV, uma saponina presente na

raiz seca de Astragalosídeo membranaceus. Sua estrutura química está ilustrada na Figura 12.

O componente ativo mais presente no Astragalosídeo consiste em uma saponina

triterpenoide tetracíclica em forma de álcool de lanolina (Shen et al., 2013). Esses terpenóides

(também chamados isoprenóides) são um dos maiores grupos de produtos distribuídos na

natureza, com mais de 30.000 exemplos conhecidos, e seus números continuam a crescer de

forma constante (Davis e Croteau, 2000). Os triterpenos são um grande grupo de compostos

que estão dispostos numa configuração de 4 ou 5 anéis de 30 carbonos. E as saponinas

triterpenóides são triterpenos que pertencem ao grupo de compostos de saponina (Moses et al.,

2014).

Saponinas são um grupo importante de produtos naturais de plantas bioativas (Lin et al.,

2014), compostos não nitrogenados que formam os grupos de glicosídeos presentes em plantas,

de maior distribuição em angiospermas, cuja característica mais relatada é a capacidade de

formar espuma em soluções aquosas devido sua ação tensoativa. A presença de saponinas foi

reportada em mais de 100 famílias de plantas, das quais pelo menos 150 saponinas naturais

foram caracterizadas. São atribuídas às saponinas a atividade anti-cancerígena, moluscicida,

anti-inflamatória, antifúngica, antibacteriana, antiparasítica, antiviral, imunomoduladora e

citotóxica. São classificadas em: glicosídeos saponosídicos do tipo esteróide e do tipo

triterpênico, que é característica do AS-IV (Man et al 2010).

Figura 12. Estrutura química do Astragalosideo IV – Fórmula química C41H68O14.

Adaptado de: Chan et al., 2009.

AS-IV também apresenta um mecanismo que explica o efeito promotor de longevidade

e antienvelhecimento que pode ser elucidado pelo tempo em que a célula é replicada de forma

fisiologicamente saudável. Os telômeros são importantes para a replicação dos cromossomos

durante a divisão celular, sendo constituídos de 1000 a 2000 cópias de uma sequência de DNA

repetida, e cada vez que a célula se divide são encurtados até o momento de tornarem-se

42

incapazes de se dividirem, haja vista que células com telômeros curtos tornam-se senescentes

e desgastadas, eventualmente, causando danos ao funcionamento interno da célula (Muntoni et

al., 2008).

Estudos tem investigado a ação do astragalus como ativador de telomerase, enzima que

tem como função adicionar sequências específicas e repetidas de DNA à extremidade dos

cromossomos, atrasando assim o encurtamento dos telômeros e prolongando a duração da vida

celular. O primeiro estudo a esclarecer este mecanismo relacionando seu efeito

antienvelhecimento à resposta imune utilizou 40 mg/kg/dia i.g, durante 10 semanas e constatou

melhora tanto na resposta motora como na memória e também aumento da imunidade celular

deteriorada em ratos tratados envelhecidos com 17 meses de idade induzidos com D-gal (Lei et

al., 2003).

Um estudo realizado posteriormente mostrou que um ativador de pequenas moléculas

de telomerase (TA-65) purificado a partir da raiz de AST pela ação de seus compostos

astragalosídeo e cicloastragenol é capaz de aumentar o comprimento médio dos telômeros e

diminuir a porcentagem de telômeros curtos e danos ao DNA em camundongos adultos e

idosos, aumentando seu intervalo de vida sem aumentar a incidência de câncer nestes animais

(de Jesus et al., 2012). O cicloastragenol, uma aglicona presente no AST também é um potente

ativador da telomerase em células neuronais e apresentou implicações para o controle da

depressão em modelos experimentais (Ip et al., 2014).

O AS-IV apresenta efeito neuroprotetor e tem sido investigado em modelos

experimentais de DP. Seu mecanismo de ação nesta patologia pode ser explicado através de

evidências que o estresse oxidativo é o principal indutor da perda de neurônios dopaminérgicos

no SN (Ding et al., 2004; Olanow e Tatton, 1999) e que a reconstrução da rede neuronal é a

condição essencial para a recuperação da função cerebral (Tohda et al., 2006). Estas evidências

são demonstradas através de estudos experimentais que induzem a DP em cultura de células da

substância negra, através da ação toxinas neuronais como a 6-hidroxidopamina (6-OHDA) que

tem como característica induzir neurotoxicidade, geração de ROS e a depleção mitocondrial,

além de também inibir a tirosina hidroxilase (TH), que é a enzima limitante da velocidade para

a síntese de dopamina (Perese et al., 1989). Neste estudo, o AS-IV administrado nas

concentrações de 50 ~ 200 uM, durante 25h, atenuou a perda de neurônios dopaminérgicos e o

grupo tratado apresentou germinação intacta, crescimento de neurites e aumentou TH e NOS

imunorreativa, sobretudo no grupo que recebeu a concentração de 100 uM (Chan et al., 2009).

Seus mecanismos propostos estão dispostos no Apêndice B.

43

Outro estudo desenvolvido com finalidade de conhecer os efeitos do AS-IV na DP,

administrando uma outra toxina, o MPP+, forma ativa da droga MPTP é um material clássico

para estabelecer o modelo de DP in vitro, utilizado em estudos para avaliar o efeito

neuroprotetor de drogas (Schmidt e Ferger, 2001). Seu efeito sobre cultivo de células SH-

SY5Y, contendo 25 ~ 50 uM de astragalosídeo, durante 26h, notavelmente aumentou a

sobrevivência de células, inverteu a geração intracelular de ROS e condensação nuclear, inibiu

a via mediada por Bax, além de suprimir a atividade de caspase-3 (Zhang et al., 2012).

Astragalus membranaceus é amplamente utilizado no tratamento de AVC e doenças

crônicas debilitantes na China e os estudos têm demonstrado que o AS-IV tem efeitos

neuroprotetores em modelos isquêmicos cerebrais (Li et al., 2017). Sua ação em modelos focais

de isquemia/reperfusão cerebral foi observada sobre a permeabilidade da barreira

hematoencefálica desde sua ruptura e foi constatado que o AS-IV quando administrado nas

concentrações 10 e 20 mg/kg atenuou significativamente a permeabilidade (Qu et al., 2009).

O AS-IV também apresentou ação positiva sobre deficiência de memória induzida por

isquemia cerebral transitória e reperfusão em camundongos, bem como a mecanismos de

sinalização associados, também com a indução de déficits de memória severa por oclusão

comum da artéria carótida (BCCAO) em camundongos como indicado em teste

comportamental realizado no labirinto aquático de Morris. Contudo a administração oral de

AS-IV (10 e 20 mg / kg, uma vez por dia) atenuou os déficits de memória e neuroinflamação

(Li et al., 2017). Efeitos semelhantes da ação in vivo dos Astragalosideos em apresentar efeito

protetor em modelo de isquemia foram observados em outros estudos recentes (Wu et al., 2014;

Yin et al., 2010).

Alguns estudos sugerem a ação do Astragalus em modelos experimentais com DA,

induzida por diferentes substâncias. Considerando a hipótese que os glicocorticoides estão

correlacionados com a progressão da demência em pacientes com DA (Li et al., 2011), o estudo

administrou dexametasona (DEX) intragástrico durante 21 dias em ratos machos e avaliou ação

do Astragalus nas concentrações de 10, 20 e 40 mg/kg através dos testes atividade motora

espontânea (AMS) e LAM um teste comportamental estabelecido para avaliar a memória e

aprendizagem (Morris et al., 1982). Os resultados deste estudo mostraram que a administração

de 40 mg/kg aumentou significativamente a AMS, em 10 dias e o tempo de permanência de

nado no quadrante da plataforma, indicando resultados positivos de sua eficácia no processo de

aprendizagem e memória em ratos. Este estudo também realizou imunohistoquímica para

caspase-3, 9 e citocromo c no hipocampo, regiões CA1 – CA3 e neocórtex, sendo constatado

44

que o tratamento com o extrato regulou o nível de caspases em ambas as regiões (Li et al.,

2011).

Em 2012, o mesmo grupo publicou estudo ampliando estes resultados a DEX (1,5 mg /

kg) em adição a Ab25-35 (10 µg, injeção CA1 do hipocampo) e tratamento com AST

(Astragalus) (8, 16 e 32 mg/kg, IG) durante 14 dias, com os resultados indicando benefícios na

aprendizagem e memória, pela diminuição da expressão de APP, b-secretase e Ab1-40 no

hipocampo (Li et al., 2012). Anterior a este estudo Park e colaboradores (2009) já mostravam

que o tratamento com 400 mg/kg administrada por via oral durante 14 dias (2h/dia), reduzia os

déficits induzidos por estresse no aprendizado para tarefas de memória espacial avaliando o

desempenho de ratos através de testes LAM e LCE (Park et al., 2009).

Outros estudos recentes também investigaram a ação dos Astragalosideos na DA (Sun

et al., 2014a), mostrando que o pré-tratamento com astrágalo (10, 25 e 50 uM) aumentou

significativamente a viabilidade das células neuronais, reduziu a apoptose, diminuiu a geração

de ROS e diminuiu da superóxido mitocondrial na presença de Ab1- 42. Além disso, o pré-

tratamento inibiu a abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (PTPm).

Corroborando com este estudo, Chang e colaboradores (2016), avaliaram a ação dose

Astragalosideos no córtex cerebral após infusão de AB, evidenciando que a administração de

40 mg/kg/dia i.p. do fitoterápico, uma vez ao dia durante 14 dias, reduziu apoptose e disfunção

mitocondrial em células corticais, pelo bloqueio por inibição da fosfoinositol 3-quinase (PI3K)

da proteína quinase, mais conhecido como AKT (Chang et al., 2016).

Este efeito protetor foi observado ao avaliar a estrutura mitocondrial em camundongos

diabéticos e Astragalus a 700mg/kg por dia, que foi capaz de preservá-la (Mao et al., 2009). As

membranas mitocondriais podem ser danificadas pela peroxidação lipídica (Paradies et al.,

1997), que se sabe aumentar com a idade (Spiteller, 2001). Os polissacáridos de ASL exercem

uma inibição dose-dependente da peroxidação lipídica a partir de uma concentração de 2mg/L

e podem inibir mais de 90% peroxidação lipídica nas mitocôndrias do fígado e 78% nos

neurônios em uma concentração de 32mg/L (Li et al., 2012).

Diante do exposto, a literatura dispõe de um número limitado de estudos relativos ao

tratamento com AS-IV nos déficits de aprendizagem e memória, com os estudos citados tendo

sido realizados in vivo. Desta forma, torna-se relevante avaliar através de cultura de células do

hipocampo sua ação direta, para averiguar como estas se comportam durante a atuação do

extrato, conhecer seus mecanismos subjacentes e assim analisar o possível efeito do AS-IV para

fornecer evidências científicas de sua ação na neuroplasticidade, a fim de ampliar estas terapias.

45

1.3 OBJETIVOS

1.3.1 Objetivo Geral

Analisar os efeitos da suplementação com dosagens diferenciadas de

Atragalosídeo IV na plasticidade de células nervosas do hipocampo em cultura.

1.3.2 Objetivos Específicos

Avaliar o trofismo morfológico promovido pelo Astragalosídeo a partir dos

seguintes parâmetros:

Evolução de área, perímetro, comprimento axonal e morfologia neuronal e glial por 96

horas, pela microscopia de contraste de fase;

A imunorreatividade da proteína ácida fibrilar glial (GFAP) mediante

imunofluorescência;

As imunorreatividade da proteína associada ao crescimento 43 (GAP-43) mediante

imunofluorescência;

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 DESENHO EXPERIMENTAL

Para a realização do experimento foram utilizados 2 ratos neonatos (linhagem Wistar -

Rattus novergicus), com idade de 03 dias para obtenção dos hipocampos. O projeto atendeu as

normas para a realização de pesquisa em animais com todos os procedimentos, passando pela

Comissão de Ética no Uso de Animais da Universidade do Estado do Rio Grande do Norte

(UERN), mediante parecer consubstanciado de número 015/2016, e a norma internacional que

rege a pesquisa foi baseada no guia para o cuidado e uso de animais de laboratório e de acordo

com o princípio dos 3R’s.

2.2 EXTRAÇÃO E CULTIVO DAS CÉLULAS DO HIPOCAMPO

As células do hipocampo foram coletadas de 2 ratos Wistar com 3 dias de vida. Os

neonatos foram submetidos à incisão na região facial, sendo rebatido o tecido tegumentar. Em

seguida, foi realizada secção na região anterior do crânio e recortada lateralmente a calota

craniana, resultando em exposição do encéfalo. Após isso, sob o fluxo laminar com auxílio de

tesoura, pinça e espátula o tecido cerebral foi rebatido e exposto o hipocampo, possibilitando

46

assim a sua remoção e inclusão em placa de petri contendo 4mL de meio Leibovitz-15 (L-15:

GIBCO Invitrogen Corporation).

Novos tubos cônicos Falcon de 15mL com 4mL de meio Knockout DMEM low

(Dulbecco’s modified Eagle`s medium), suplementados com 10% de soro bovino fetal e 100 μl

de gentamicina obtida da Cultilab® (Meio denominado D-10) foram preparados e receberam os

hipocampos extraídos para realizar a suspensão celular. A suspensão foi centrifugada a

3000rpm durante cinco minutos a uma temperatura de 37oC, após o qual o sobrenadante foi

desprezado e as células ressuspendidas em 1mL de meio, procedimento repetido por três vezes.

Placas para cultura de 24 poços para o plaqueamento foram preparadas com 1,5mL de D-10,

em seguida sendo realizado o gotejamento das células recém-extraídas, mantidas em estufa

úmida a 37oC com 5% de CO2 e 95% de ar. A microscopia de luz invertida com contraste de

fases foi utilizada para observação da adesão celular no fundo das placas, para possibilitar um

suprimento nutricional adequado, eliminar células hematopoiéticas e desprendidas, bem como

possibilitar uma adequada adesão celular no fundo das placas.

Figura 13. Exposição e remoção do hipocampo (seta). Cabeça de seta apontam

hipocampos direito e esquerdo após remoção. Escala de 5 mm.

2.3 SUBCULTIVOS DAS CÉLULAS DO HIPOCAMPO E OS GRUPOS EXPERIMENTAIS

Quando as células do hipocampo atingiram 70-90% de confluência no fundo da placa,

o meio básico foi removido e adicionado aos poços 2 ml de tripsina/EDTA (0,25% de tripsina

contendo 1 mM de EDTA-Cutilab/Brasil®). A suspensão celular foi colocada em tubo cônico

tipo Falcon com o mesmo volume de meio D-10 por 10 minutos, com o objetivo de inativar a

tripsina. A suspensão foi centrifugada a 1500 rpm durante cinco minutos três vezes, após o qual

o sobrenadante foi desprezado e as células foram ressuspendidas em 1 mL de meio.

47

As células foram depositadas em placas de 24 poços, sendo 4 poços para cada grupo, e

foram adicionadas lamínulas redondas estéreis de 13 mm. As células foram então observadas

em quatro períodos de tempo: 24, 48 e 72 e 96 horas. Com este procedimento foi possível

avaliar a aderência e plasticidade das células do hipocampo nos seguintes grupos:

Grupo 1 (G1): Hipocampo + meio D-10;

Grupo 2 (G2): Hipocampo + Astragalosideo 5µl;



Grupo 5 (G5): Hipocampo + Astragalosideo 20µl.

Grupo 6 (G6): Hipocampo + Astragalosideo 25µl.

O extrato seco em pó do AS-IV foi obtido a partir da Evidence Soluções Farmacêuticas

Ltda®. A concentração utilizada para diluição foi 500 µg de AS-IV para 500 µl de água

bidestilada (ABD).

*As análises físico-química e toxicológica do AS-IV encontram-se disponíveis no Anexo B.

Figura 14. Delineamento do estudo: Formação dos grupos de observação celular

Para observação celular foi utilizado um microscópio invertido com contraste de fases

CKX41 (Olympus®) com câmera digital Moticam 3.0 (Motic®) acoplada.

48

A morfometria das células foi realizada usando microscopia de fases em 4 campos não

sobrepostos no aumento de 20x. Foram feitas microfotografias dos 6 grupos em 24 horas, 48,

72 e 96 horas. Após 96 horas de observação celular, procedeu-se a imunocitoquímica.

2.4 MARCAÇÃO IMUNOCITOQUÍMICA

No quarto dia (96 horas), com as células já aderidas às placas, o meio foi retirado e as

células lavadas em duas etapas de cinco minutos com tampão de fosfato de sódio, 0,1M, pH

7,4, fixadas em paraformaldeído (4%) por trinta minutos e, novamente, lavadas em três banhos

de PBS (cinco minutos cada). Em seguida, as células foram tratadas com Triton a 0,5%

(Sigma®) por 10 minutos e lavadas em PBS. Posteriormente, bloqueios de sítios inespecíficos

foram feitos durante 30 minutos em solução PBS 0,1M contendo 0,2% de Triton e 1% de

albumina do soro de boi (BSA). As células foram então incubadas com um dos anticorpos

primários descritos abaixo por 2 horas à temperatura ambiente (Tabela 1).

Tabela 1. Lista de anticorpos primários.

Anticorpo 1° Animal Concentração Fornecedor

GFAP Mouse 1:400 Sigma

Gap 43

Mouse

1:2600

Sigma

1. Anti-proteína ácida fibrilar glial (GFAP) feita em camundongo (Sigma) para

marcação de astrócitos na concentração de 1:400; Este gene codifica uma das principais proteínas

de filamentos intermediários de astrócitos maduros. Ele é utilizado como um marcador para

distinguir os astrócitos de outras células gliais durante o desenvolvimento.

2. Anti-GAP 43 feito em mouse (Sigma). Para marcação de células em processo de

plasticidade na concentração de 1:2600; Trata-se da proteína 43 associada ao crescimento

específico neural é uma fosfoproteína intracelular encontrada exclusivamente nos sistemas

nervoso periférico e central. Gap43 é uma proteína principal de cones de crescimento axonal.

(marca toda a plasticidade em células que expresse esse gene).

Ao término desta etapa, as células foram lavadas em PBS (0,1M; pH 7,4) por cinco

minutos e incubadas por 1 hora com anticorpo secundário anti-mouse produzidos em donkey

49

(Jackson, EUA) conjugados ao fluoróforo AlexaFluor 594, mantidas em ambiente refrigerado

com ausência de luz. Após a incubação secundária, as células foram lavadas com PBS por cinco

minutos e imediatamente examinadas no microscópio de fluorescência do Laboratório de

Neurologia Experimental da UERN (Eclipse E200, Nikon®) e posteriormente no microscópio

de fluorescência do Laboratório de Estudos Neuroquímicos da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte / UFRN (Eclipse Ni, Nikon®).

Foram realizadas fotomicrografias com as câmeras digitais Moticam 3.0 e 5.0 (Motic®)

nos aumentos de 4x, 10x, 20x em 4 campos numa sequência definida previamente em cada

placa (Figura 15). Na ocorrência de marcações fluorescentes registrada nas células do

hipocampo, existiu o cuidado de examinar o compartimento subcelular, citoplasmático ou

nuclear das imunorreatividades.

Figura 15. Campos de observação celular em placas de 24 poços, cada poço com 4 campos

campos de observação

2.5 ANÁLISE DOS DADOS

Dois investigadores independentes previamente calibrados (kappa = 0,94), aferiram o

perímetro (μm), área (μm2) e comprimento de axônio de cada célula em campos visuais não

sobrepostos aleatoriamente, usando cultura de células de no mínimo 3 experimentos diferentes

com aumento de 20x. Foram utilizados o software Motic Images Plus 2.0 (Motic®) para

observação morfológica e aferição, bem como o software Adobe Photoshop CS6.0 (Adobe®)

para correção mínima de brilho e contraste das fotomicrografias.

O banco de dados da pesquisa foi construído na plataforma do software SPSS®

(Statistical Package for Social Sciences) versão 22.0, com posterior verificação de consistência

da digitação. Após a estruturação final do banco de dados, foi realizada

inicialmente uma análise da normalidade dos dados através do teste de Kolmogorov-

Smirnov e Shapiro-Wilk onde foi constatado que os dados tratavam-se de não paramétricos,

com isso os dados foram transformados em logaritmos com base 10. Os dados de expansão

50

celular (área, perímetro e comprimento) ao longo de 96 horas foram comparados

estatisticamente através do teste de Kruskal-Wallis em múltiplas comparações em forma de

pares sendo considerando significante quando p< 0,05.

3 RESULTADOS

Após realizar os procedimentos de cultivo, as células ficaram aderidas ao fundo das

placas e foram acompanhadas para observação de suas mudanças morfológicas, como pode ser

observado na Figura 16.

Figura 16. Aspectos Morfológicos das células gliais (cabeça de seta) e células neuronais (seta)

confluentes antes do subcultivo. Imagem obtida através da microscopia de contraste de fases.

Escala: 200 μm.

Após realizar os procedimentos de subcultivos, formação dos grupos de estudo e

observação da adesão das células, estas foram ressuspendidas e replaqueadas, e acompanhadas

ao longo de 4 dias para observação de suas variações morfológicas (área, perímetro e

comprimento axonal) conforme microscopia de contraste de fases.

As culturas de células realizadas, quando cultivadas em D-10 acrescido de AS-IV,

apresentaram alterações morfológicas mais visíveis quando comparadas com culturas

desprovidas desse tratamento, possibilitando a identificação mais evidente da morfologia das

células gliais e neuronais, resultando desta forma em efeito plástico, indicando que o AS

promoveu a manutenção da expansão das células nos grupos experimentais, principalmente nos

grupos de tratamento com meio condicionado de 20 e 15μl, respectivamente, como ilustrado

nas imagens subsequentes.

51

A1 B1 C1 D1

A2 B2 C2 D2

A3 B3 C3 D3

Controle 96 houras 24 houras

5 μl

48 houras 72 houras

10 μl

52

Figura 17. Morfologia das células após formação dos grupos experimentais por 96 horas. Grupo 1: painéis A1 (24 horas), B1 (48 horas), C1 (72 horas), D1 (96 horas); Grupo

2: Painéis A2 (24 horas), B2 (48 horas), C2 (72 horas) D2 (96 horas); Grupo 3: Painéis A3 (24 horas), B3 (48 horas), C3 (72 horas), D3 (96 horas); Grupo 4: Painéis A4 (24

horas), B4 (48 horas), C4 (72 horas), D4 (96 horas); Grupo 5: Painéis A5 (24 horas), B5 (48 horas), C5 (72 horas), D5 (96 horas). Grupo 6: A6 (24 horas), B6 (48 horas), C6

(72 horas) e D6 (96 Horas). Escala: 100 μm.

A4 B4 C4 D4

A5 B5 C5 D5

A6 B6 C6 D6

15 μl

20 μl

25 μl

53

3.1 MUDANÇAS MORFOLÓGICAS E EXPANSÃO DAS CÉLULAS NEURONAIS

Ao fim das 96 horas de observação verificou-se que as populações apresentaram

expansão em perímetro, área e comprimento axonal progressivamente desde as 24 até as 96

horas. Contudo, sua maior expressividade surge a partir das 48 horas e se mantém. Avaliando

o trofismo morfológico das células neuronais ao longo dos 4 dias de observação, destacam-se

os grupos G4: tratamento com 15 microlitros de AS-IV e o G5: tratamento com 20 microlitros,

conforme demonstrado nos gráficos.

Especificando as comparações entre os grupos experimentais, às 24 horas de tratamento

das células ocorreram diferenças estatísticas entre o G4 que se demonstrou superior quando

comparado aos grupos G1 (p=0,046) e G2 (p=0,002) e o G5 quando comparado aos grupos G1

(p=0,002) e G2 (p=0,000), demonstrando que no primeiro momento de observação após o

tratamento os grupos de 20 e 15 μl apresentaram resultados superiores aos grupos de 5 μl e ao

controle, como observado na Figura 18.

Figura 18. Perímetro de células neuronais observadas em cada grupo experimental às 24 horas.

P valores (a=0,002; b=0,046; c=0,000; d=0,002).

Ao observar o perímetro das células neuronais após 48 horas de tratamento com AS-IV,

foi verificado que todos os grupos experimentais com exceção ao G6 apresentaram perímetro

celular superior ao G1: G2 (p=0,002), G3 (p=0,000), G4 (p=0,007) e G5 (p=0,000), além disso

também foi constatado que no G5 (p=0,000) este parâmetro se manteve superior ao G6 (Figura

19).

54


P valores (a=0,000; b=0,007; c=0,000; d=0,002; e=0,000).

Quando avaliado o perímetro das células neuronais às 72 horas, observa-se que os

grupos mencionados anteriormente mantêm seus resultados e novas diferenças estatísticas

podem ser evidenciadas. Todos os grupos experimentais, com excessão ao G6 se mantiveram

superiores ao G1: G2 (p=0,006), G3 (p=0,021), G4 (p=0,000) e G5 (p=0,000). O G5 também

se mantém superior ao G2 (p=0,000), e se demonstrou superior aos grupos G3 (p=0,000) e G6

(p=0,000) (Figura 20).


P valores (a=0,000; b=0,000; c=0,021; d=0,000; e=0,006; f=0,000; g= 0,000).

55

Ao final das 96 horas de observação, confrontando os grupos experimentais pode ser

observado que ambos mantiveram o perímetro neuronal superior ao G1: G2 (p=0,002), G3

(p=0,005); G4 (p=0,004), G5 (p=0,000) e o G6 (p=0,042). Também foram observadas

diferenças significativas entre o G5, que demonstrou superioridade quando comparado aos

seguintes grupos: G2 (p=0,001), G3 (p=0,017), G4 (p=0,007) e G6 (p=0,000) (Figura 21).


P valores (a=0,042; b=0,000; c=0,004; d=0,005; e=0,002; f=0,001; g=0,007; h=0,000; i=0,017).

Quando observada a área neuronal ao longo das 96 horas foram identificadas diferenças

principalmente entre o G4 e o G5 que se demonstraram superiores quando comparados aos

demais grupos experimentais. Especificando entre os grupos, após 24 horas de subcultivo e

tratamento das células o G5 se demonstrou superior quando comparado aos demais grupos: G1

(p=0,000), G2 (p= 0,002), G3 (p=0,003), G4 (p=0,003), demonstrando que o astragalosídeo

proporcionou a manutenção dos aspectos morfológicos mesmo após um período curto de

tratamento, e entre o G6 que se demonstrou superior ao G1 (p=0,046) (Figura 22).

56

Figura 22. Área de células neuronais observadas em cada grupo experimental às 24 horas. P

valores (a=0,046; b=0,000; c=0,003; d=0,002; e=0,003).

Após 48 horas de observação, foram identificadas diferenças estatísticas entre os grupos

G3 (p=0,000), G4 (p=0,000) e G5 (p=0,000) que demonstraram-se superiores quando

comparado ao G1. Além disso foi demonstrado que o G4 (p=0,012) e o G5 (0,000) apresentou

diferenças estatísticas superiores ao G2 (Figura 23).

57


valores (a=0,000; b=0,000; c=0,000; d=0,012; e=0,000).

Após 72 horas de cultivo e observação das mudanças da área de células neuronais, o

grupo tratado com 20 μl (G5) manteve resultados superiores aos grupos G1 (p=0,000), G2

(p=0,002), G3 (p=0,003) e ao G4 (p=0,003). E o G6 se manteve superior ao G1 (p=0,046)

(Figura 24).


valores (a=0,046; b=0,000; c=0,002; d=0,003; e=0,003).

Ao final das 96 horas de acompanhamento da observação morfológicas das células,

observou-se que a área das células neuronais no G5 manteve superior a todos os grupos

experimentais, com exceção ao G6: O G1 (p=0,000), G2 (p=0,000), G3 (p=0,012) e G4

(p=0,000), assim como o G6 (p=0,000) manteve significância estatística superior quando

comparado ao G1 (Figuras 25).

58


valores (a=0,000; b=0,000; c=0,000; d=0,012; e=0,000).

Sendo o comprimento axonal considerado um aspecto morfológico das células

neuronais, pode ser constatado que os grupos de 20 e 15 μl demonstraram-se superiores,

especialmente o grupo de tratamento com 20 μl de AS-IV. Especificando as diferenças

estatísticas foi constatado que os G3 (p=0,012), G4 (p=0,000) e G5 (p=0,000) demonstraram-

se superiores quando comparados ao G1. Ambos os G4 (0,006) e G5 (p=0,001) também

apresentaram diferenças estatísticas superiores ao G2 (Figura 26).

59

Figura 26. Comprimento de axônio de células neuronais observadas em cada grupo

experimental às 24 horas. P valores (a=0,000; b=0,000; c=0,012; d=0,006; e=0,001).

Após 48 horas de observação das mudanças morfológicas das células neuronais, foram

observadas diferenças estatísticas entre o G3 superior ao G6 (p=0,015) e o G5 superior ao G1

(p=0,000) e ao G6 (p=0,004) (Figura 27).


experimental às 48 horas. P valores (a=0,000; b=0,015; c=0,004).

Após 72 horas de observação da morfologia das células, diferenças estatísticas foram

evidenciadas quando comparado ao G4 que se manteve superior: G1 (p=0,000), G2 (p=0,039)

e G6 (p=0,004) e o G5 superior ao G1 (p=0,000), G2 (p=0,000), G3 (p=0,041) e G6 (p=0,000)

(Figura 28).

60


experimental às 72 horas. P valores (a=0,000; b=0,000; c=0,004; d=0,039; e=0,000; f=0,000;

g=0,041).

No último dia de observação do comprimento axonal dos neurônios, confrontando os

grupos experimentais, foi constatado que o G4 se manteve superior aos grupos G1 (p=0,000),

G2 (p=0,013) e G6 (p=0,013) e o G5 superior aos grupos G1 (p=0,000), G2 (p=0,000), G3

(0,000) e G6 (p=0,000) (Figura 29).


experimental às 96 horas. P valores (a=0,000; b=0,000; c=0,013; d=0,013; e=0,000; f=0,000;

g=0,002).

61

3.2 MUDANÇAS MORFOLÓGICAS E EXPANSÃO DAS CÉLULAS GLIAIS

Após as 96 horas de observação, verificou-se que as populações apresentaram expansão

de perímetro e área glial progressivamente desde as 24 horas até as 96 horas. Sua maior

expressividade surge a partir das 48 horas e ocorre uma redução de diferenças estatísticas entre

os grupos às 72 horas. Contudo, no último dia de tratamento observam-se diferenças estatísticas

significativas entre os grupos, destacando os G4 (15) e G5 (20 μl).

Especificamente, no primeiro dia de observação após o tratamento das células com meio

condicionado de AS-IV, foi constatado que os G4 (p=0,012), G5 (p=0,000) e G6 (0,001)

apresentaram-se superiores ao G1. Também foi evidenciado que os G5 (p=0,002) e G6

(p=0,005) foram superiores ao G2 (Figura 30).

Figura 30. Perímetro de células gliais observadas em cada grupo experimental às 24 horas. P

valores (a=0,001; b=0,000; c=0,012; d=0,005; e=0,002).

Após 48 horas de tratamento e observação das mudanças morfológicas foi constatado

que os G3 (p=0,005), G4 (p=0,000) e G5 (p=0,000) apresentaram perímetro glial superior ao

G1. Além disso, diferenças estatísticas foram observadas quando comparado ao G2 que

apresentou-se inferior aos G3 (p=0,014), G4 (p=0,000) e G5 (p=0,000). Também apresentaram

diferenças os G4 (p=0,004) e G5 (p=0,001) superiores ao G6 (Figura 31).

62


valores (a=0,000; b=0,000; c=0,005; d=0,000; e=0,000; f=0,014; g=0,001; h=0,004).

Quando observado o perímetro glial após 72 horas de tratamento, foram constatadas

diferenças estatísticas entre os grupos: G4 (p=0,005) e G5 (p=0,036) superiores ao G1 (Figura

32).


valores (a=0,036; b=0,005).

63

No último dia de observação várias diferenças significativas foram observadas entre os

seguintes grupos: O G3 apresentou perímetro glial superior quando comparado ao G1 (P=0,009)

e ao G6 (p=0,002); O G4 apresentou resultados superiores aos seguintes grupos, G1 (p=0,000),

G2 (p=0,000), G3 (p=0,001), G6 (p=0,000). E o G5 também superior ao G1 (p=0,000), G2

(p=0,000), G3 (p=0,001), G6 (p=0,000) (Figura 33).


valores (a=0,000; b=0,000; c=0,009; d=0,000; e=0,000; f=0,001; g=0,002; h=0,001; i=0,000;

j=0,000).

Ao observar a área glial ao longo das 96 horas, podem ser constatadas diferenças

significativas principalmente nos G4 e G5 quando comparado aos demais grupos

experimentais. Especificamente após 24 horas de tratamento diferenças estatísticas foram

observadas entre os G4 (p=0,012), G5 (p=0,001) e G6 (p=0,000), que demonstraram-se

superiores quando comparados ao G1. Quando observados os G5 (p=0,029) e G6 (p=0,001)

demonstraram superioridade comparados ao G2 (Figura 34).

64

Figura 34. Área de células gliais observadas em cada grupo experimental às 24 horas. P valores

(a=0,012; b=0,001; c=0,000; d=0,029; e=0,001).

Após 48 horas de tratamento quando observado a diferenciação morfológicas das células

gliais nos diferentes grupos, apresentaram diferenças estatísticas, o G4 (p=0,002) e o G5

(p=0,010) quando comparados ao G1. Os outros grupos mantiveram área glial não diferente

estatisticamente quando comparado as 24 horas de observação (Figura 35).


(a=0,010; b=0,002).

65

Após 72 horas de observação das diferenças morfológicas da área de células gliais,

foram identificadas diferenças estatísticas entre o G4 (p=0,011) e G5 (0,016) superiores quando

comparados ao G1. Também foram constatadas diferenças entre o G4 (0,034) superior ao G2

(Figura 36).


(a=0,016; b=0,011; c=0,034).

Ao final das 96 horas de observação morfológicas das células gliais os grupos que

apresentaram diferenças estatísticas foram o G4 (p=0,000) e o G5 (p=0,000) que demonstraram-

se superiores quando comparados ao G1, apresentando ação trófica direta das células

imunológicas nestes grupos, identificando assim, diferenças estatísticas sobretudo nos grupos

5 e 4, respectivamente, ao longo dos 4 dias de subcultivo e diferenciação dos grupos

experimentais (Figura 37).

66


(a=0,000; b=0,000).

3.3 FENÓTIPO DAS CÉLULAS NEURONAIS E GLIAIS

Após 96 horas de observação, procedeu-se a imunocitoquímica dos 6 grupos do

experimento. Foi realizado o fechamento dos filtros do microscópio de fluorescência para

validar a marcação. As células do G1 expressaram proteína glial e neuronal (GFAP e GAP-43)

(Figuras 38 e 39). E como observado, os grupos tratados com o AS-IV apresentaram reatividade

superior para estas proteínas, especialmente os grupos 4 e 5, inferindo os resultados

anteriormente observados através da microscopia de contraste de fases.

67

Figura 38. Células do G1, G2, G3, G4, G5 e G6 submetidas a imunofluorescência do anticorpo GAP-43. Escala: 100 μm

68

Figura 39: Células do G1, G2, G3, G4, G5 e G6 submetidas a imunofluorescência do anticorpo GFAP. Escala: 100 μm

69

4 DISCUSSÃO

As repercussões clínicas e sociais de patologias que envolvem o hipocampo em sua base

fisiopatológica revelam uma importante temática de estudo e empenho para estruturar

estratégias que possam contribuir com a qualidade de vida dos indivíduos, revertendo-se em

consequente benefício da sociedade. Com base nisso, pesquisas científicas têm investigado

estratégias terapêuticas com a finalidade de retardar ou impedir a neurodegeneração e quais

estímulos e substâncias podem contribuir para a plasticidade celular, haja vista que as terapias

atuais para a DA e outros tipos de demência apenas oferecem benefícios discretos para os

sintomas clínicos da patologia e não evitam a degeneração das células neuronais.

Conforme relatado, as terapias farmacológicas constituem uma opção usual. Contudo,

diferentes produtos desenvolvidos com compostos ativos extraídos de plantas foram avaliados

extensivamente ao longo dos anos e alguns alcançaram resultados promissores. Atualmente,

existem aproximadamente 350.000 tipos de ervas naturais como fontes de drogas no mundo e

os extratos e compostos isolados são benéficos para a saúde humana, demonstrando eficácia no

tratamento de patologias (Wang et al., 2017). À luz destes esclarecimentos, entre estes

compostos pode-se destacar o astragalosideo IV (AS-IV), uma saponina triterpenóide com peso

molecular (MW= 784 DA) presente na raiz de Astragalus membranaceus, um fitoterápico

originário da medicina tradicional chinesa (Li et al., 2017). Esta pequena saponina exerce

múltiplos efeitos benéficos na prevenção e tratamento de doenças, bem como efeito

neuroprotetor em modelos experimentais (Kim et al., 2015).

No presente estudo, foi desenvolvido um meio condicionado com AS-IV, com a

finalidade de observar o comportamento das células do hipocampo suplementadas com

diferentes concentrações. Deste modo, esperava-se que as células se tornassem reativas e

secretassem naturalmente fatores que favorecessem um ambiente propício à plasticidade neural.

As mudanças morfológicas mais evidentes das células nos grupos 4 e 5 são indicativas de ação

do meio condicionado. O meio DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) utilizado como

controle foi primordial para averiguar se as células hipocampais adquiriram fenótipos distintos

no decorrer do tempo de observação. Como o mecanismo de ação das saponinas é amplamente

discutido, o uso do AS-IV poderia potencializar os efeitos fenotípicos das células bem como

induzir uma maior plasticidade celular.

Evidências acumuladas sugerem que as saponinas apresentam efeitos neuroprotetores

significativos na atenuação de distúrbios do SNC, como acidente vascular cerebral, DA, DP e

doença de Huntington (Sun et al., 2015). Os mecanismos propostos de sua função

70

neuroprotetora incluem antioxidação, modulação de neurotransmissores, anti-apoptose, anti-

inflamatório, atenuação do influxo de Ca2+, fatores neurotróficos moduladores, inibição da

fosforilação de tau e regeneração de redes neurais atuando sobre o microambiente celular (Sun

et al., 2015).

O aspecto mais importante para a manutenção destas células em um tecido receptor é o

seu microambiente. O microambiente celular é constituído por fatores que afetam diretamente

condições em torno de uma célula ou grupo de células que têm efeito direto ou indireto sobre o

comportamento celular através de rotas biofísicas, bioquímicas ou outras (Barthes et al., 2014),

possibilitando assim condições essenciais para sobrevivência celular (Caddick et al., 2006).

Correntemente, como documentado, uma crescente atenção tem sido devotada aos estudos com

medicamentos fitoterápicos na manutenção do microambiente celular (Xia et al., 2017).

O presente estudo analisou o comportamento plástico de células gliais e neuronais após

96 horas de tratamento com AS-IV, confrontando estes achados entre os grupos tratados com

diferentes concentrações e com o grupo controle (estabelecido com meio DMEM). As células

gliais, além de suas funções de nutrição, sustentação, isolamento dos neurônios, destruição de

patógenos, remoção de neurônios mortos, manutenção da homeostase e formação da mielina

também exercem função primordial na plasticidade sináptica (Kettenmann et al., 2013).

Estudos anteriores já demonstravam que a eficácia sináptica é aprimorada pela ação das

células gliais, haja vista que poucas sinapses se formam na ausência dessas células e que estas

sinapses são funcionalmente imaturas (Ulian et al., 2001). Os astrócitos aumentam o número

de sinapses funcionais nos neurônios do SNC em sete vezes e são necessários para manutenção

sináptica in vitro. Em seu estudo, Ullian e colaboradores mostraram também que a maioria das

sinapses são geradas simultaneamente com o desenvolvimento de glia in vivo. Desta forma,

estes dados demonstram que a células gliais atuam na indução e estabilização das sinapses do

SNC, indicando que o número de sinapse do SNC pode ser profundamente regulado por sinais

não-neuronais e que a glia pode ativamente participar da plasticidade sináptica (Pfrieger e

Barres, 1997; Ullian et al., 2001).

Deste modo, conhecendo a importante função das células gliais na eficácia da

transmissão sináptica, observamos nos distintos grupos de tratamento com meio condicionado

de AS-IV quais os grupos em que estas células apresentavam maior desenvolvimento ao longo

do tempo de observação, sendo os grupos de 15 e 20 microlitros os que apresentaram resposta

superior tanto quando avaliados área e perímetro de células gliais como quando avaliados área,

perímetro e comprimento axonal de neurônios, o que possivelmente pode ser explicado pela

71

função do meio condicionado em modular o microambiente celular e pela função das células

gliais em modular o microambiente dos neurônios. Além disso, estas células também podem

atuar secretando fatores de crescimento como GDNF e BDNF que atuam no trofismo celular e

como observado cresceram em efeito sinérgico aos neurônios nestes grupos.

Como descrito na literatura, a hiperativação glial ocorre em grande escala em idosos

e/ou em patologias. São condiçoes que ocorrem pois com a repetição da resposta inflamatória

há um preparo e exarcebação da microglia que pode repercutir em agravamento da resposta

inflamatória e declínio cognitivo. Em condições fisiológicas sua ativação é essencial, pois está

associada a uma resposta inflamatória reparadora, que suprime a resposta pró-inflamatória

(Cunningham e Hennessy, 2015; Holmes, 2013).

Aspectos importantes elencados no presente estudo foram área e perímetro celular.

Ambos foram avaliados primordialmente para descrição morfológica das células ao longo dos

dias, com relevância na análise estatística ao longo das 96 horas de observação. O tamanho da

célula depende do tipo celular e de seu estágio no ciclo celular (Kharitonova e Vasiliev, 2008).

No cultivo, as alterações do tamanho e área celular acontecem durante o crescimento (Vasiliev,

2004). A forma é controlada por estruturas do citoesqueleto interno e estruturas de adesão

fixando a célula à superfície (Moizhess e Vasiliev, 2001; Rovensky et al., 2001).

O AS-IV promoveu a manutenção da expansão das células neuronais e gliais; contudo

foi constatado que no grupo de maior dose (células tratadas com meio condicionado de 25μl de

AS-IV) não se observou crescimento e expansão das células gliais e neuronais, o que

possivelmente indica o início de dose tóxica. Em concordância com nossos resultados, Cheng

et al. (2006), ao avaliarem a regeneração de nervo periférico a um intervalo de 15 mm do nervo

ciático de ratos, tratando com diferentes doses de AS-IV, observaram que após 8 semanas de

tratamento com dose de 50 mM, os animais apresentaram taxa de regeneração bem sucedida e

um número significativamente maior de axônios mielinizados. Em contrapartida, a alta dose de

tratamento (200 mM) de AS-IV inverteu completamente este efeito positivo e inibiu a

capacidade de promover o crescimento e a regeneração do nervo (Cheng et al., 2006).

Corroborando com este estudo, Chan et al. (2009), ao avaliarem a capacidade do AS-

IV de proteger neurônios dopaminérgicos em modelo experimental induzido com 6-OHDA em

culturas de células, observaram que, após tratamento com diferentes concentrações, apenas a

concentração de 100 mM demonstrou-se efetiva e capaz de proteger os neurônios

dopaminérgicos contra a degeneração induzida por 6-OHDA, apresentando efeito protetor em

células TH e NOS-imunopositivas. Em contrapartida, as análises de citometria de fluxo e

72

imunofluorescência mostraram que nenhum aumento significativo das porcentagens de

neurônios dopaminérgicos (células TH positivas e germinantes) foi observado quando

cultivadas no co-tratamento com 50 mM de AS-IV. Além disso, o grupo de alta dose, 200 mM

de AS-IV em co-tratamento com 6-OHDA, apresentou porcentagem de neurônios

dopaminérgicos significativamente reduzida (Chan et al., 2009), resultados corroborados por

nossos achados, pois os grupos de menor dose e alta dose apresentaram capacidade de

manutenção das células inferior.

Conforme o estudo supracitado, os autores acreditam que administrar quantidades

excessivas de AS-IV pode provocar respostas adversas à recuperação de neurônios

degenerados. Contudo, quando administrado em doses adequadas, como relatado em seus

achados, indicam que pode promover o crescimento de neurites. O aumento de comprimento

de neurites provavelmente pode melhorar a função cerebral e a memória no modelo de DP

estudado e, embora os mecanismos subcelulares subjacentes a estes efeitos farmacológicos não

sejam aprofundados, acreditam que este conjunto de características favorecidas pelo tratamento

com AS-IV é semelhante a das neurotrofinas. Fatores neurotróficos são capazes de promover a

sobrevivência, diferenciação e manutenção de neurônios no desenvolvimento do sistema

nervoso de vertebrados adultos, tais como o fator neurotrófico derivado da linha celular glial e

o fator neurotrófico da dopamina, que é um dos fatores neurotróficos mais potente para os

neurônios dopaminérgicos (Lindholm et al., 2007). Deste modo, sugere-se que o AS-IV pode

exibir efeito semelhante a fatores neurotróficos e efeito antioxidante relevante à patogênese da

DP e outras doenças neurodegenerativas (Chan et al., 2009).

Em concordância com estes achados, o presente estudo demonstrou que nos grupos

tratados com meio condicionado de AS-IV houve expansão celular e comprimento axonal mais

desenvolvidos quando comparados ao grupo controle, sugerindo que esta saponina pode atuar

promovendo sobrevivência e manutenção de neurônios do hipocampo em cultura.

Estudos anteriores demonstraram que AS-IV pode ter efeitos neuroprotetores através de

suas propriedades antioxidantes, promovendo a regeneração axonal em nervo periférico e a

reconstrução de sinapses neuronais (Cheng et al., 2006; Luo et al., 2004). O AS-IV auxiliou na

reconstrução de sinapses em neurônios danificados (atrofia axonal e perda sináptica causada

pelo peptídeo amiloide) (Tohda et al., 2006).

Conforme demonstrado, um dos possíveis mecanismos de ação do AS-IV na DA é

modular a atividade de PPARy (Receptor Nuclear de peroxissoma ativado por proliferador

gama), um receptor que tem sido bem documentado pelo seu papel modulador na regulação

73

transcricional de BACE-1, pois possui sítios de ligação exercendo efeitos diretos na sua

transcrição (Chen et al., 2012, 2009; Sastre et al., 2006), um achado importante pois quando

este receptor está ativado se liga ao PPRE (Pré-elemento peroxissoma proliferador de respostas)

e controla a expressão de BACE1, uma protease essencial que cliva APP para gerar peptídeos

Ab (Wang et al., 2017), um componente central de placas neuríticas em cérebros de paciente

com AD (Zhou et al., 2010). In vitro, as células SH-SY5Y foram transfectadas com pEGFP-

N1-BACE1 para estabelecer um modelo de célula que sobre-expressa o gene BACE1. Os

achados indicam que 500 μg/mL de AS-IV regularam os níveis de PPARγ quando comparados

com o grupo controle, enquanto a expressão de BACE1 e os níveis de Aβ diminuíram

significativamente.

O estudo acima mencionado também realizou experimentos in vivo em camundongos

transgênicos APP/PS1, um modelo usado para investigar os mecanismos da DA e para avaliar

efeitos de drogas. Os achados deste experimento demonstraram-se consistente com os

resultados in vitro, pois o AS-IV diminuiu a expressão de BACE-1 a partir da regulação de

PPARy, inibindo a produção de Aβ e deposição de placa senil (Wang et al., 2017).

O presente estudo realizou a marcação imunocitoquímica como técnica para identificar

a plasticidade celular, e para tanto foram elencados marcadores, um da linhagem neuronal

(GAP-43) e um da linhagem glial (GFAP). A proteína ácida fibrilar glial é um elemento

estrutural de astrócitos fibrilares, sendo o GFAP utilizado como um marcador astrocítico,

embora também possa ser expresso em células neurais progenitoras imaturas (Schwindt et al.,

2009). Já a proteína associada ao crescimento 43, GAP-43 (também conhecida como F1,

neuromodulina ou B-50), participa da regulação do desenvolvimento do crescimento axonal e

da formação de redes neurais via regulação mediada por proteína quinase C dos elementos do

citoesqueleto. Em uma série de espécies adultas de mamíferos, o GAP-43 tem sido implicado

na regulação da transmissão sináptica e plasticidade, como a potencialização a longo prazo, a

sensibilização ao fármaco e as mudanças nos processos de memória (Holahan, 2015).

Marcações celulares foram observadas em todos os grupos, com destaque aos grupos

G4 e G5, para ambos os marcadores (glial e neuronal). Nesses grupos foi possível observar

assim a atuação do AS-IV, promovendo uma expressão fenotípica neuronal e glial com maior

eficiência uma vez que estes grupos apresentaram forte marcação dessas classes celulares.

Outros estudos observaram a ação neuroprotetora do AS-IV em modelos experimentais

de doenças neurodegenerativas. O estudo realizado por Kim et al. (2015) avaliou o efeito do

AS-IV em déficits comportamentais induzidos por hipoperfusão cerebral crônica em ratos, com

74

dosagens de 10 e 20 mg/Kg, diariamente durante 28 dias a partir da 5ª semana após oclusão

bilateral da artéria carótida comum. Foi constatado que o AS-IV atuou sobre o sistema de defesa

antioxidante e atenuou significativamente o nível de MDA no hipocampo quando comparado

ao grupo controle com indução de patologia. Este estudo realizou marcação imunohistoquímica

para GFAP, importante pois esta proteína atua como um marcador de ativação de astrócitos e

microglia, atuando sobre o sistema de defesa. Contudo, quando avaliada em casos de

hipoperfusão, estas células indicam processos inflamatórios, haja vista que a ativação glial

excessiva e persistente é uma característica de neuroinflamação e é considerado um mediador

para danos secundários, morte neuronal e progressão da doença (Minghetti et al., 2005).

O estudo supracitado mostrou que o grupo pBCAO (oclusão da artéria carótida comum

bilateral permanente) apresentou aumento significativo de GFAP e Iba1 (um marcador de

ativação microglial) da expressão da proteína no tecido do hipocampo em comparação com o

grupo controle, especialmente nas regiões CA1 e GD do hipocampo de ratos. O tratamento com

AS-IV reduziu significativamente a expressão da proteína GFAP a uma dose de 20 mg/kg e

expressão da proteína Iba1 em doses de 10 e 20 mg/kg em comparação com o grupo pBCAO.

Em contrapartida, a finalidade de nosso estudo foi avaliar a capacidade do AS-IV atuar

na manutenção destas células com função auxiliar dos neurônios e na plasticidade, haja vista

que as células gliais podem assumir ambas as funções, reduzindo a resposta pró-inflamatória.

Como descrito anteriormente, os grupos que apresentaram manutenção e expansão de células

gliais também apresentaram expansão de células neuronais, possivelmente indicando que o AS-

IV promoveu esta manutenção e que as células da glia também auxiliaram na modulação do

microambiente, resultando em efeito plástico.

Uma correlação direta entre dano oxidativo, apoptose neuronal e déficits de memória

sob hipoperfusão cerebral crônica é demonstrada no estudo de Kim et al. (2015). Assim, o AS-

IV apresentou efeitos neuroprotetores durante a lesão cerebral isquêmica/reperfusão cerebral

focal possivelmente por suas propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e anti-apoptóticas,

fatos estes bem documentados por outros autores (He et al., 2013; Kim et al., 2015; Li et al.,

2017; Wang et al., 2017). Suas propriedades antioxidantes incluem o aumento da atividade

SOD, redução da geração de ROS e peroxidação lipídica (Hu et al., 2009; Zhang et al., 2012),

entretanto ressaltando-se que as vias de sinalização do AS-IV durante I/R cerebral ainda não

estão relatadas completamente e são necessário estudos complementares (Wang et al., 2017).

Na DA, estudos sugerem que o AS-IV atenua a neurotoxicidade Aβ através da inibição

da permeabilidade mitocondrial e abertura de poro de transição de permeabilidade mitocondrial

75

(mPTP) (Sun et al., 2014b), uma ação neuroprotetora importante, uma vez que a abertura do

poro tem um papel central na morte de células neuronais em doenças neurodegenerativas, tendo

como um dos fatores que causam sua abertura a presença de ROS (Halestrap, 2006). Os

Astragalosideos melhoram a deficiência cognitiva via redução da expressão da proteína

precursora amilóide (Li et al., 2012). Contudo são necessários estudos complementares para

avaliar o comportamento das células após atuação do composto ativo e se AS-IV é capaz de

modular os neurotransmissores envolvidos em processos cognitivos e plasticidade sináptica.

Um estudo recente demonstrou que o AS-IV atua sobre a proliferação e diferenciação

das células-tronco neurais (NSC) enxertadas, cultivadas do hipocampo de embriões de ratos.

As células foram tratadas e transplantadas para o hipocampo de ratos em modelos de AD. In

vitro, mostrou-se que 10-5 AS-IV induziu as NSC’s a se diferenciarem em β-tubulina III, um

marcador que está relacionado com a formação de microtúbulos e com a estrutura do neurônio

(Haiyan et al., 2016). Nossos achados nos permitiram observar aumento de células expressando

GFAP superiores ao grupo controle e realizamos análise de um marcador específico que regula

a transmissão sináptica e plasticidade, o Gap-43, indicando que o AS-IV atua na manutenção

dos mecanismos de plasticidade.

Outro fitoterápico que também possui saponinas em sua composição é a Camellia

sinensis (chá verde). No estudo realizado por Ortiz-López et al. (2016), a ação deste composto

ativo propiciou a manutenção das células e aumentou a sobrevivência neuronal no hipocampo

adulto in vivo e in vitro, sem afetar a proliferação celular mas diminuindo as células apoptóticas

(Ortiz-López et al., 2016). Em concordância, estudos mostram que o AS-IV também possui

propriedades anti-apoptóticas (He et al., 2013; Kim et al., 2015; Sun et al., 2014b; Yang et al.,

2012; Zhang et al., 2012) que podem ser explicadas devido sua capacidade de atuar sobre o

balanço entre as proteínas Bax/Bcl-2, fator importante, pois a sobrevivência celular na fase

inicial da cascata apoptótica depende muito deste balanço entre a proteína anti-apoptótica (Bcl-

2) e a pró-apoptótica (Bax) como observado em estudos prévios (Levy et al., 2009). Como base

nisso, Zhang et al. (2012) observaram que em modelo experimental de DP induzido por MPP+

a proporção destas proteínas se encontra desregulada, favorecendo a Bax. Adicionalmente, seus

achados indicam que o tratamento com AS-IV atuam sobre estas proteínas mesmo após a

desregulação causada por MPP+, reduzindo a expressão de Bax e aumentando Bcl-2, regulando

o balanço entre estas proteínas in vitro, também inibindo a atividade da caspase-3 através do

bloqueio de uma via Bax-dependente e diminuição da geração de ROS em células SH-SY5Y

(Zhang et al., 2012).

76

Esta ação anti-apoptótica do AS-IV demonstrada em estudos anteriores possivelmente

é mais um de seus mecanismos que explicam o favorecimento de um microambiente propício

para a manutenção celular observado no presente estudo.

O pré-tratamento de AS-IV inibiu significativamente a apoptose neural induzida por

isoflurano no hipocampo, também atenuando significativamente o estresse oxidativo e

liberação de citocinas pró-inflamatórias (Sun et al., 2016). O AS-IV mostrou boa ação junto a

outras drogas (Yang et al., 2012). Neste estudo, Yang et al. (2012) investigou os efeitos do

AS-IV e tetrametilpirazina no modelo de lesão isquêmica/reperfusão cerebral em ratos. Os

autores concluíram que o AS-IV e a tetrametilpirazina desempenharam um papel fundamental

de proteção sinérgica contra o dano de reperfusão cerebral isquêmica focal. Deste modo, é

possível inferir que o tratamento do AS-IV administrado em associação a outros fitoterápicos

ou o desenvolvimento de suplementos com AS-IV e outras drogas poderiam atuar de forma

sinérgica sobre a morfologia das células do hipocampo.

Um dos componentes mais importantes do microambiente é a matriz extracelular, pois

a mesma é acoplada a elementos efetores do citoesqueleto e de sinalização que direcionam

funções cruciais, como crescimento celular, sobrevivência e atividade transcricional (Hynes,

2002). As modificações bioquímicas e biomecânicas do microambiente da matriz extracelular

são transmitidas às células e induzem as mudanças resultantes em seu comportamento (Weber

et al., 2011). O microambiente além de ser controlado por sua matriz extracelular também pode

ser controlado através da entrega de agente bioativos (Barthes et al., 2014), como drogas e

fatores de crescimento. Deste modo, sugere-se que a entrega do AS-IV ao microambiente

celular modulou de forma positiva a sobrevivência e crescimento celular.

Outro aspecto relevante para a sobrevivência das células in vitro é a adesão celular,

pois a matriz extracelular e seus componentes atuam de forma direta para que as células se

mantenham aderidas. Um dos principais exemplos de sinalização celular é a sinalização

mediada pela integrina, que atuam nos mecanismos de adesão celular e são receptores que

facilitam o intercâmbio do meio celular externo com o meio celular interno, fundamental pois

muitos processos como morfologia celular e diferenciação são possíveis devido a esse trânsito

(Docheva et al., 2007, 2007).

Nesse contexto, o presente estudo mostrou que a aplicação do AS-IV beneficia o

ambiente celular, atuando sobre a manutenção de células do hipocampo em cultura, pois nos

grupos tratados com AS-IV (G4 e G5) a manutenção das células foi superior aos demais grupos

77

experimentais, constatando que estes grupos apresentaram reatividade superior para as

proteínas GAP-43 e GFAP.

5 CONCLUSÕES

As células do hipocampo demonstraram uma morfologia típica e rápida expansão,

sobretudo as células que foram expostas ao meio condicionado na presença de AS-IV. Além

disso, a expansão celular observada nos grupos 4 e 5 em curto período de tempo asseguram seu

potencial de manutenção in vitro sob a exposição a estímulos adequados. Em linhas gerais, o

ambiente condicionado por AS-IV adicionado ao cultivo de células hipocampais promoveu a

manutenção das células neuronais e gliais, estas últimas atuando como suporte aos neurônios

na eficácia da transmissão sináptica, indicando assim a capacidade do AS-IV de auxiliar nas

mudanças morfológicas, possibilitando plasticidade nervosa.

No que se refere as mudanças morfológicas neuronais e gliais, os grupos tratados com

AS-IV apresentaram melhor manutenção celular, e a partir das 24 horas de observação

verificou-se que as populações apresentaram expansão em perímetro, área e comprimento

axonal progressivamente até as 96 horas. Ainda destacamos que as células tratadas

apresentaram fenótipos condizentes com os achados uma vez que o tratamento com meio

condicionado de AS-IV especialmente nas concentrações de 15 e 20 μl expressaram mais

proteínas tanto de aspecto neuronal quanto glial (GAP-43 e GFAP).

Nessa perspectiva, o presente estudo possibilitou um maior entendimento sobre a

plasticidade de células do hipocampo a partir da atuação do AS-IV na manutenção destas

células, também facilitando a compreensão na busca por melhores técnicas com terapia celular

sobre a plasticidade do sistema nervoso.

78

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91

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Legenda: No estágio A, mostra uma célula neuronal com características patológicas da Doença de

Alzheimer (AD), com formação e agregação de proteína B-amilóide e hispanfosforilação da proteína

tau, uma ação seqüencial entre a atividade dessas proteínas, potencializando a toxicidade e estresse

celular, os dendritos tornam-se menos ramificados como resultado da desregulamentação com ROS e

radicais livres aumentados pelo desacoplamento de pelo menos um elétron em suas orbitais externas.

No passo B. representa a disfunção mitocondrial ocorrendo uma diminuição das enzimas do sistema de

defesa antioxidante celular com exceção de SOD (superóxido dismutase) que é alta, então o anião

superóxido (O2-) é convertido em peróxido de hidrogênio que pode ser convertido em ião hidroxilo que

ativa a peroxidação lipídica. No estágio C, a enzima citocromo C ativa Apaf-1 (fator de ativação da

apoptose 1) que ativa as procaspases e, posteriormente, ativa a caspase efetora 3 e resulta em apoptose.

No estágio D, a hiperativação celular ocorre devido ao influxo excessivo de Ca2 + causando

excitotoxicidade. O beta amilóide é formado pela ação de PPA (proteína aminóide precursora) e pela

degradação de sua molécula por BACE (Beta secretase), então o produto BACE também é clivado por

y-secretase resultando na formação de AB42 (Amyloid tóxico) que culmina em placas senis, a

desregulamentação das camadas MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) e AKT (Family of Protein

Kinase) também ocorre. No passo E. A hiperativação glial ocorre no hipocampo, indicando

neuroinflamação.

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Figura (Legenda): Na etapa A o efeito protetor do AS-IV (10 e 20 mg/kg) observado em modelo

experimental de isquemia/reperfusão, como esquematizado preveniu a acumulação de neutrófilos

positivos para CD11b/ CD18 e reduziu a expressão da molécula de adesão intracelular-1 (ICAM-1) que

é parcialmente alcançada pela atenuação forte da produção de TNF-α e IL-1b mecanismo anti-

inflamatório pela supressão destas moléculas relacionadas a adesão de neutrófilos. Outro mecanismo

proposto é a diminuição da permeabilidade da BBB (Barreira Hemato Encefálica) e diminuição da

infiltração de linfócito devido a ação anti-inflamatória que resulta em diminuição da neuroinflamação.

Na etapa B o AS-IV agiu sobre a região isquêmica, diminuindo o metabolismo da glicose resultando

em redução da área do coágulo, atenuando o volume do infarto cerebral. A ação anti-edema do AS-IV

também está correlacionada com a regulação de AQP4 (Aquaporin 4) que medeia o fluxo de água no

SNC com consequente diminuição do edema cerebral e diminuição da ativação microglial, seguindo da

diminuição da interrupção da BBB e de MMP9 (Matrix metaloproteinase), relacionados ao edema

vasogênico, os quais foram inibidos significativamente pelo AS-IV que atua também na diminuição da

infiltração de linfócitos. Na etapa C O efeito do AS-IV foi observado em cultura de neurônios

dopaminérgicos quando administrado 100 Mm. O modelo representado de 6-OHDA apresentou morte

celular na SNCP (Substância Negra Pars Compacta), enquanto o grupo tratado com AS-IV notavelmente

aumentou a sobrevivência de células atenuando a perda de neurônios dopaminérgicos, pois apresentou

germinação intacta e na etapa D aumentou a enzima TH (Tirosina Hidroxilase) de síntese de dopamina,

NO (óxido nítrico) e NOS (Oxido Nítrico Sintase) que estão envolvidos na elevação da liberação de

dopamina no estriado. Na etapa E O AS-IV evita a disfunção mitocondrial à medida que atua através

do aumento da ação das enzimas do sistema de defesa antioxidante SOD e GSH que converte o peróxido

de hidrogênio em H2O e O2 evitando a peroxidação lipídica e o dano mitocondrial. O AS-IV atua

inibindo a via apoptótica em ambos os mecanismos de ação propostos para as doenças

neurodegenerativas, representada de forma sucinta, uma vez que estas foram avaliadas nos estudos

revistos, de modo que o AS-IV reduz a ativação do canal BAX (o que acelera a morte celular programada

e aumenta a regulação de Bcl-2 que é repressivo da apoptose, além disso, o AS-IV previne a ativação

de procaspases que ativam a caspase 3 efetora, evitando o stress oxidativo, apoptose e diminuição de

MDA (Malondialdeído) que catalisa a formação de numerosas ROS. Em função do dano mitocondrial

o AS-IV também age aumentando o potencial mitocondrial e geração de ATP, inibindo a abertura do

poro de membrana e consequentemente revertendo a oxidação mitocondrial. Na etapa F é proposta a

ação do AS-IV no modelo experimental induzido por β-amilóide, pois inibiu sua formação pela APP

(Proteína Precursora de Amilóide) inibindo a enzima Beta-secretase-1 (BACE-1) que cliva esta proteína

gerando o amilóide tóxico, além disso inibiu expressão de presenilin-1.

95

APÊNDICE C – Artigo de Revisão Sistemática Aprovado na revista Phytotherapy

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APÊNDICE D – Artigo de Revisão Sistemática submetido a revista Current

Neuropharmacology

Astragaloside IV supplementation promoting a neuroprotective

effect in experimental models of neurodegenerative diseases:

a systematic review

Ianara Mendonça da Costa1; Francisca Overlânia V. Lima1; Luciana Cristina B. Fernandes1;

Bianca Norrara1; Francisca Idalina Neta1; Rodrigo Dias Alves1; Marco Aurelio M. Freire1;

José Rodolfo Lopes P. Cavalcanti1; Eudes Euler S. Lucena1; Jeferson de Souza Cavalcante2;

Amália Cinthia M. do Rêgo3; Irami Araújo Filho3; Dinalva Brito de Queiroz3; Fausto

Pierdoná Guzen1,3

1Laboratory of Experimental Neurology, Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health

Sciences, University of the State of Rio Grande do Norte (UERN), Mossoró/RN, Brazil

2Laboratory of Neurochemical Studies, Center of Biological Sciences, Federal University of Rio

Grande do Norte, Natal/RN, Brazil

3Post Graduation Program in Biotechnology, Health School, Potiguar University (UnP), Natal/RN,

Brazil

Running Title: Neuroprotective effect of Astragaloside IV

*Corresponding author:

Fausto Pierdoná Guzen, PhD

Laboratory of Experimental Neurology, Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health

Sciences, University of the State of Rio Grande do Norte, Mossoró/RN, Brazil.

Tel/Fax: +55 84 987087847

Email address: [email protected]

mailto:[email protected]

108

Abstract

Background: Neurodegenerative diseases constitute a growing worldwide concern due to the progressive aging

of the population and the risky behavior they represent. Herbal medicines have scientific relevance in the

treatment of these pathologies. One of these substances, Astragaloside IV (AS-IV), is the main active compound

present in the root of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge., a Chinese medicinal herb with neuroprotective

properties.

Objective: In the present study we performed a systematic review that sought to comprehend the neuroprotective

effect presented by AS-IV in experimental models of neurodegenerative diseases.

Method: This study is a systematic review, where an electronic search in United States National Library of

Medicine (PubMed), Science Direct, Cochrane Library, Scientific Electronic Library Online (SciELO), Scopus,

Web of Science, Medline via Proquest and Periodicos Capes databases covering the years between 2007 and

2017, using “Astragaloside IV” and “Neurodegenerative diseases” as reference terms.

Results: A total of 14 articles were identified, in which the efficacy of AS-IV was described in experimental

models of Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease, cerebral ischemia and autoimmune encephalomyelitis, by

improving motor deficits and/or neurochemical activity, especially antioxidant systems, reducing inflammation

and oxidative stress.

Conclusion: The findings of the present study indicate that the administration of AS-IV can improve behavioral

and neurochemical deficits largely due to its antioxidant, antiapoptotic and anti-inflammatory properties,

emerging as an alternative therapeutic approach for the treatment of neurodegenerative diseases.

Keywords: Neurodegenerative diseases, Parkinson’s disease, Alzheimer’s disease, cerebral ischemia,

Astragaloside IV, brain.

109

List of abbreviations

PD (Parkinson’s disease); AD (Alzheimer’s disease); MTT+ (1-methyl-4-phenylpyridnium); LV (Lateral

ventricles); i.g. (Intragastric); Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1); Level of inhibition of nuclear

factor-jB (NF-jB); Myeloperoxidase (MPO); Peripheral benzodiazepine receptors (PBR); Intercellular adhesion

molecule-1 (ICAM-1); nuclear factor-jB (NfJ-B); Reactive Oxygen Species (ROS); Mitochondrial permeability

transition pore (Mptp); Methylprednisolone (MPD); Beta-secretase 1 (BACE-1); C-reactive protein (CPR);

Inducible nitric oxide synthase (iNOS); Interferon gamma (IFNγ); ionized calcium-binding adapter molecule 1

(IBA1); Interleukin 1 beta (IL-1β); Tumor Necrosis Factors Alpha (TNF-α); ribonucleic acid (RNA); Type I

transmembrane proteins (CD11b/CD18); Deoxyribonucleic acid (DNA); Zonae occludens-1 (ZO-1); Nitric

Oxide Synthase (NOS); Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); Blood brain barrier (BBB); Morris

aquatic labyrinth (MAL); myeloperoxidase (MPO); Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP (TUNEL);

Cornu Ammonis 1 (CA1); Cornu Ammonis 3 (CA3); Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE);

Notch toll-like receptor 4 (TLR4); Matrix metallopeptidase 9 (MMP-9); Dexamethasone (Dex); Qi deficiency

and blood stasis (QDBS); Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG); Malondialdehyde (MAD); Superoxide

dismutase (SOD); Transmission electronic microscopy (TEM); middle cerebral artery occlusion (MCAO);

Bilateral common carotid artery occlusion (BCAO); 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

bromide (MTT); Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE); intrapreritonial (i.p.); intragastric (i.g),

Q ideficiency and blood stasis (QDBS), Hydroxysafflor yellow A (HSYA), Huangqi_Honghua combination

(HH), Cerebral ischemia-reperfusion (IR).

Introduction

Neurodegenerative diseases constitute a growing worldwide concern due to the progressive aging of

the population and the risky behavior they represent. These are pathologies that affect the central (CNS) and

peripheral (PNS) nervous systems, including epilepsy disorders, Alzheimer’s disease and other dementias,

cerebrovascular diseases including strokes, migraine and other headache disorders, multiple sclerosis,

Parkinson’s disease, neuroinfections, brain tumors, traumatic disorders of the nervous system due to head

trauma and neurological disorders as a result of malnutrition [1-3].

Millions of people around the world are affected by neurological disorders. Estimates suggest that

more than 6 million people die from stroke every year; more than 50 million people have epilepsy worldwide;

an overall average of 47.5 million people live with dementia and about 7.7 million new cases are recorded

annually, of which Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia, accounting for 60% to

70% of cases. The prevalence of migraines occurs in more than 10% of the world population [4].

The economic impact of treatment is also high with disproportionately scarce neurological services

and resources, which can be determinant for patient survival. Studies show that more than 80% of stroke patients

die in low- and middle-income countries [5]. In the United States (USA) alone, the combined annual costs of

https://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81cido_desoxirribonucleico

110

these diseases total nearly $800 billion, which is likely to increase in the coming years due to the aging of the

population, resulting in a severe economic burden [6].

Recent advances in understanding the pathophysiological mechanisms related to neurodegenerative

diseases point to new strategies in drug development. Animal models have contributed considerably to these

advances and play an even greater role in the evaluation of possible drugs with therapeutic potential, not only

to alleviate these pathologies, but to modify the disease process [7].

In the recent decades, interest in natural products has increased significantly, with a concomitant

expansion of the use of herbal medicines [8], some of which presenting a neuroprotective effect. In this context,

Astragaloside IV (AS-IV), a triterpenoid saponin present in the root of Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge.,

a phytotherapeutic described as the dry root of legumes belonging to the family Fabaceae, subfamily Faboideae

and native to the traditional Chinese culture [9], which was first described in the Chinese book Shen Nong Ben

Cao Jing in AD 200 with a range of beneficial effects and without toxicity.

The biological and pharmacological properties of AS-IV include a potent protective effect in

pathologies due to its wide range of beneficial actions, such as antioxidant, antiviral, antibacterial [10,11], anti-

inflammatory, antifibrotic, antiasthmatic, antidiabetic, immunoregulation and cardioprotective effects, avoiding

myocardial failure in rats [9,12], capable of increase metabolism, improve immune system, digestion and

promote healing of wounds and injuries [13].

Herbal medicines have scientific relevance in the treatment of neurological diseases, as they contain

multiple compounds and phytochemicals that may have neuroprotective effects, with consequent beneficial

action on health among different neuropsychiatric and neurodegenerative disorders [14]. In light of this, we can

highlight AS-IV due to its above cited action on nerve regeneration and functional recovery in animals, in

addition to its neuroprotective activity [15,16]. Thus, the present study aims to evaluate the neuroprotective

effect of AS-IV in experimental neurodegenerative disease models based on a systematic review of the

literature.

2. Materials and Methods

2.1. Databases and keywords

111

The present study comprises a systematic review of the literature concerning the effects of AS-IV on

experimental models of neurodegenerative diseases that were published between the years of 2007 and 2017. It

was developed based on previously established stages of search, identification, selection and eligibility

strategies. The search strategy in the databases was performed using the terminologies referring to the search,

filters and descriptors for articles published in eight databases: PubMed, Science Direct, Cochrane Library

databases, SciELO, Scopus, Web of Science, Medline via Proquest and Periodicos Capes (the latter is a

Brazilian database that gathers several International Journals). The terms used for the research were previously

selected considering the regular vocabulary used to index articles in the field of health sciences, the Medical

Subject Headings (MeSH) of the US National Library of Medicine (NLM) through which the descriptors

“Astragaloside IV” and “Neurodegenerative diseases” were found. The keywords were used together in the

search, seeking to detect all studies that analyzed the effects of Astragaloside IV supplementation in

experimental models of neurodegenerative diseases.

2.2. Eligibility/exclusion criteria

The search for studies was carried out independently by two expert evaluators in the context discussed,

including titles, abstracts, or both, resolving discrepancies through a subsequent consensus meeting. The terms

were initially used separately, and then searched together. A language restriction was considered for the

selection, with only articles published in English being analyzed. Screening of the studies was performed based

on the titles and abstracts, and the publications were subsequently read in full and compared.

Experimental studies using AS-IV in in vitro or in vivo analyses with the following pathological

characteristics were included: Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), cerebral ischemia and

encephalomyelitis, evaluating its neuroprotective action (antioxidant activity); and studies that performed the

in vivo analysis evaluating reduced symptoms of the pathology through behavioral analysis. The following

exclusion criteria were considered: 1) The article was not original; 2) Other experimental models other than

mice, rats or cell culture were used; 3) Studies that analyzed the AS-IV action along with other compounds

without an isolated group for AS-IV; 4) Absence of control group (the control group had to be comparable to

the group supplemented with AS-IV).

112

The following eligibility criteria were considered: 1) Experiments performed on mice, rats or cell

culture induced on the neurological lesion; 2) Treated with AS-IV before or after damage; 3) Analysis of the

AS-IV effect on injury and action mechanisms; and 4) All animals or models used should present clinical

symptoms of the pathologies.

The studies evaluated in this systematic review present high levels of heterogeneity in important

aspects, such as the inducing agent of neurodegenerative diseases, the duration of AS-IV treatment and the

behavioral tests used. The studies used different compounds to simulate neuronal damage in these experimental

models and all of them work through different mechanisms of action. In addition, these compounds were

administered at different doses and through different routes, aspects that reinforce the heterogeneity of the

studies. Based in the methodological heterogeneities among studies with different neurodegenerative diseases

analyzed in different experimental models, grouping statistics were not considered. Thus, the meta-analyzes

were not performed for the accessed data.

3. Results

According to the initial screening of the studies using the previously mentioned descriptors, 165

articles were found published in the last 10 years, of which 34 appeared in Medline via Proquest, 33 in Science

Direct, 11 in Scopus, 72 in Periodicos Capes, 8 in the PubMed database and 7 in Web of Science, and none

were found in the Cochrane Library and in SciELO.

The first criterion adopted was only considering articles published in the last 10 years, which resulted

in identification of the 165 articles mentioned above. Next, search filters were implemented, which excluded a

total of 69 articles (41 excluded by duplication, 21 excluded for being reviews and 7 book chapters), resulting

in 96 studies on the subject.

After analysis of the titles, 18 articles were excluded, with 22 articles excluded after reading the

abstract because they had no relation to the theme. Thus, 56 articles were read in their entirety. After analyzing

these articles, 42 studies failed on at least 1 criterion and were excluded (such as studies that used experimental

models that were not mice, rats or cell culture, or that analyzed AS-IV action along with other compounds

without isolating the AS-IV group), totaling 14 articles at the end of the analysis (see the flowchart in Figure 1,

which graphically details the systematic review process for inclusion/exclusion of articles).

113

The studies showed variations regarding several characteristics. Through the search we found studies

analyzing the AS-IV action on different neuropathological conditions: PD (2), AD (3), ischemia (8) and

encephalomyelitis - experimental model of lateral sclerosis (1), including different in vivo (9), in vitro (3) and

in vivo and in vitro tests (2).

The similar and individual methodological criteria performed by the 14 articles included in the study

are described below. The studies performed different experimental procedures and observations, thus the total

number of the evaluations performed will differ from the amount of studies mentioned, since we intend to verify

how many studies have evaluated certain methodologies to obtain results.

Regarding the gender of the animals (rats) the in vivo studies used in the research, 9 studies used males,

1 used females and 1 study used both genders. The neuropathology experimental models were induced through

administrating different substances: for PD, 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) (1) and 6-

hydroxydopamine (6-OHDA) (1); for AD, by intracerebral beta-amyloid induction (2) and in cells transfected

with pEGFP-N1-BACE1 (1); for ischemia by middle cerebral artery occlusion (MCAO) (5) and bilateral

common carotid artery occlusion (BCAO) (2); and for encephalomyelitis by complex injection of the Freund+

MOG35-55 + Mycobacterium tuberculosis H37RA+ Pertussis toxin (1).

Regarding the behavioral analysis, the studies used the Morris aquatic labyrinth (MAL) test (3),

evaluated neurological (1) and neurobehavioral activity (4) or were focused on cell cultures such as cell line

human neuroblast from neural tissue SH-SY5Y (1), human neuroblastoma cell line - SH-N-SH (1) and cells

from the substantia nigra (1). Other studies evaluated the cellular defense system through the enzymes

superoxide dismutase (SOD) (6), malondialdehyde (MDA) (5), catalase (CAT) (1) and glutathione peroxidase

(GSH-Px) (2), in addition to caspase-3 (3), expression of BAX (3), cytochrome c (1), nitric oxide synthase

(NOS) (3) and reactive oxygen species (ROS) (4).

Among the most used tests are the tests for 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium

bromide (MTT) (4), Western blot (9), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (4), polymerase chain

reaction (PCR) (3), immunohistochemistry (7), immunofluorescence (3) and tumor necrosis factor alpha (TNF-

α) (3).

Concerning the duration of the AS-IV treatment, the minimum time in the in vitro study was 24 hours

and the minimum and maximum dosages used in these studies were +10 μM-500 μM; for studies performed in

114

vivo, the minimum and maximum dosages were 10-200 mg/kg. Supplementation duration in the studies was

between 7 and 28 days, and in vivo and in vitro studies up were to 3 months. The characteristics of the selected

studies are shown in Table 1.

The study designs showed great variation, in which data on the pathology and the type of lesion in the

animal, experimental model, experimental groups, substance dosages, performed analyses and tests and the

findings (results that the authors obtained with their studies) have been collected. One study used other

phytotherapeutic agents in conjunction with the AS-IV group, however there were also isolated groups for both

substances.

Table 1 indicates the findings related to neurodegenerative diseases and the implications of AS-IV.

The studies not only point to its neuroprotective effect, but also to an anti-oxidant, anti-apoptotic, anti-

inflammatory action, improvement in mitochondrial damage and behavioral deficiencies.

4. Discussion

Neurodegenerative diseases are debilitating conditions that compromise the quality of life of patients

and interfere in society as a whole. The consequences and the social and economic impacts generated by these

pathologies establish an important theme of study, since the elucidation of their mechanisms and the search for

natural medicines that act repairing its damage and sequelae are necessary.

As reported, herbal medicines and their multiple bioactive compounds have scientific relevance in

treating neurodegenerative diseases, acting on the symptomatology presented by the pathologies. In this context,

we have investigated the neuroprotective action of AS-IV, a triterpenoid saponin present in the root of

Astragalus membranaceus, described in the literature as a compound capable of acting in the repair of

experimental damage in pathologies such as PD, AD and cerebral ischemia, as evidenced in the systematic

search.

The abovementioned neurodegenerative pathologies involve similar pathophysiological aspects, as

observed in the experimental models studied. In this context, AS-IV acts on the antioxidant defense system,

maintaining the adequate levels of enzymes that act in the maintenance of this system, acts on apoptotic

pathways, maintaining the ideal proportions between Bax and Bcl-2, as will be described later, blocks the

activation of effector caspases in apoptotic cell death caused by neurotoxins such as MPTP, 6-OHDA, toxin

pertussis and amyloid-β, also acting on inflammatory markers common to these pathologies.

115

Parkinson’s disease (PD)

AS-IV has a neuroprotective effect and it has been investigated in experimental models of Parkinson’s

disease (PD). One of the possible explanations for its mechanism of action in this pathology may be associated

with the evidence that oxidative stress is the main inducer in the loss of dopaminergic neurons in the CNS

[17,18].

This evidence is demonstrated through experimental studies that induce PD in substantia nigra cell

culture through the action of neuronal toxins such as 6-OHDA, which has the characteristic of inducing

neurotoxicity, ROS generation and mitochondrial depletion, as well as inhibiting tyrosine hydroxylase (TH),

which is the rate-limiting enzyme for dopamine synthesis [19]. A study carried out by Chan et al. (2009),

showed that AS-IV administered at concentrations of 50 ~ 200 µM for 25 h attenuated the loss of dopaminergic

neurons, and the treated group presented intact germination, neurite growth and increased TH and nitric oxide

synthase (NOS) expression, especially in the group that received the concentration of 100 mM [15].

Another study developed with the purpose of understanding the effects of AS-IV in PD was carried

out in a model for induction by MPP+ (active form of MPTP drug, classic model to establish PD in vitro) [20].

The study by Zhang et al. (2012) in observing AS-IV action on SH-SY5Y cell culture containing 25 ~ 50 uM

Astragaloside for 26 h found a remarkable increase in cell survival, as well as an inversion of the intracellular

generation of ROS and nuclear condensation, in addition to inhibiting the Bax-mediated pathway and

suppressing caspase-3 activity [21]. Modification of the apoptotic cascade and ROS regulation may be crucial

events in preventing PD pathology [21]. Cell survival in the phase that the apoptosis cascade begins

considerably depends on the balance between pro- and antiapoptotic Bcl-2 family proteins; therefore, the

Bax/Bcl-2 ratio may be a determinant factor for cell growth and protection [22].

Previous findings regarding Bcl-2 proteins indicate that members of the pro-apoptotic family

participate in neuronal death in several PD models [23]. According to Zhang et al. (2012), the proportion of

pro-apoptotic Bax to antiapoptotic Bcl-2 increased as a response to MPP+, with the treatment with AS-IV

significantly reducing Bax expression [21], while also increasing Bcl-2 expression in the in vitro model for PD.

The effect of AS-IV on apoptosis induced by MPP+ can be partly explained by this regulatory mechanism.

In our recently published systematic review, we describe the action mechanism of various

phytotherapeutic compounds and extracts which also had a neuroprotective effect on PD, capable of protecting

116

neural cells against the toxicity of both 6-OHDA and MPP+ toxins due to the presence of multiple bioactive

antioxidant compounds such as flavonoids, saponins and phenolic compounds [24].

Alzheimer’s disease (AD)

Alzheimer’s disease (AD) leads to a progressive degeneration of neurons that results in damage to

memory, thinking and behavior [25]. This degeneration occurs due to several factors, among which the

aggregates of the amyloid protein which is produced from the amyloid precursor protein (APP) [26]. Thus, as

the major component of senile plaques, beta-amyloid (Aβ) is an important histopathological indication for AD

[27].

Previous studies have demonstrated that Aβ can induce apoptotic and necrotic cell death [28]. A study

carried out by Sun et al. (2014) described that SK-N-SH cells treated with Aβ1-42 5 mM for 24 h presented

lower viability and higher levels of cellular apoptosis, and that pretreatment of AS-IV at concentrations of 25

and 50 mM significantly decreased ROS and SOD generation and reduced the number of apoptotic cells, thereby

providing a better cell viability in the presence of Aβ1-42 [29]. Moreover, pretreatment with Astragalus

inhibited the mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening, an important neuroprotective action

since the pore opening plays a central role in the death of neuronal cells in neurodegenerative diseases, in which

the presence of ROS acts as one of the factors that cause its opening [30].

A recent study showed that chronic stress could increase levels of corticosterone in conjunction with

increases in the β-amyloid peptide levels of brain tissue and deposition of the Aβ plate in a Tg2576 mouse

model for AD [31]. In addition, dexamethasone (DEX) administration associated with the damage presented by

APP/PS1/MAPT transgenic rats increased brain levels of APP [32]. According to these authors, the exposure

to dexamethasone (5 mg/kg) at the stress threshold may induce learning deficits and memory impairment,

damage of hippocampal neurons, as well as increase in Aβ formation, expression of APP and the cleavage

enzyme β-APP, suggesting an interaction between the stress level and Aβ formation [33,34].

Li et al. (2011) propose the action of Astragalus extract in experimental models with AD induced by

different substances. Since glucocorticoids may play a crucial role in dementia progression in AD patients [32],

the study administered dexamethasone (DEX) (i.g) for 21 days in male rats and evaluated the action of

Astragalus at concentrations of 10, 20 and 40 mg/kg according to spontaneous motor activity (SMA) and MAL

test, an established behavioral test to evaluate memory and learning [35].

117

The results of this study showed that administration of 40 mg/kg of Astragalus significantly increased

SMA in 10 days and the swim time of the animals within the platform quadrant, which expresses the animal’s

preference and spatial learning, pointing to positive results regarding its efficacy in the learning process and

memory in rats. This study also performed immunohistochemistry for caspase-3,9 and cytochrome c in the

hippocampus (CA1-CA3 regions) and neocortex, noting that the treatment with the extract regulated the level

of caspases in both regions [32].

Accordingly, Astragalus action can be explained based on regulating the release of caspases and

cytochrome c (both being apoptosis inducing factors), since cytochrome binds to Apaf-1 and Procaspase-9c

when it is released in cytosol, forming a functional apoptosome, and subsequently triggering the sequential

activation of caspase-3 and 9 [36]. Various stimuli that induce apoptosis lead to the release of cytochrome c

from mitochondria, which plays a pivotal role in a common path of caspase activation [36,37]. In addition,

caspase-3 activation has been shown to be a key step in the apoptosis process and its inhibition can block cell

apoptosis.

A study carried out by Haiyan et al. (2016) investigated whether treatment with AS-IV could promote

the proliferation and differentiation of grafted neural stem cells (NSCs) and investigated the improvement of

cognitive impairment caused after administrating intracerebral injection with Aβ protein in rat models with AD

[38]. Based on this hypothesis, stem cell-based therapy would be a promising treatment strategy for

neurodegenerative diseases such as AD. These cells (NSCs) originating from the hippocampus of rats and from

embryos were cultured and treated with AS-IV, then grafted onto the hippocampus of rats with AD, resulting

in an improvement in cognitive impairment after administrating a intracerebral Aβ protein injection.

AS-IV treatment resulted in improvements in learning and memory in AD models, promoting NSC

proliferation and differentiation in part through the Notch signal pathway, which is one of the major signal

systems that govern neurogenesis. This signaling pathway plays a critical role in maintaining and renewing

neural progenitor cells (NPCs). The activation of this pathway was sufficient to keep NPCs in their proliferative

state, whereas loss-of-function mutations in critical components caused early neuronal differentiation and NPC

depletion [39].

Other results found in the aforementioned study indicate that administration of 10-5 M AS-IV did not

increase the rate of cell proliferation; however, it induced stem cell differentiation into Nestin + GFAP cells.

118

Besides, the differentiation indices were similar to those of positive controls using 1% serum/saline solution.

The results were also consistent with the findings by [40], who demonstrated that Astragaloside plays a double

role in peripheral nerve regeneration, with low doses (50 μM) inducing a higher rate of regeneration, and with

a high dose not demonstrating this effect (200 µM).

Clinical and epidemiological evidence suggests that there is a direct relationship between type II (DM

II) diabetes associated with an increased risk of AD [41]. Drugs used in the treatment of DM II such as

thiazolidinediones (TZDs) act as agonists in the nuclear receptor and peroxisome proliferator-activated receptor

gamma (PPARγ), tested as potential drugs for treating neurodegenerative disorders such as AD [42,43].

As mentioned, the major pathological features of AD are the aggregations of Aβ and tau proteins. Aβ

is produced from the APP by the sequential action of two proteins, α and β secretases. The breakdown of the β-

secretase product by Y-secretase produces two substances: toxic Ab42 and non-toxic Ab40 [26]. Sastre and

coworkers (2006) reported that PPARγ inhibits the activity of the BACE1 promoter gene in response to the

binding of a PPARγ-peroxisome responsive element [44]; the proliferator-response element (PPRE) located in

the BACE1 promoter gene is an enzyme responsible for the cleavage of the site in Aβ precursor protein [44,45].

Thus, it becomes clear that the PPARγ agonist modulates APP processing through the regulation of β-secretase.

Corroborating the aforementioned study, Wang et al. (2017) evaluated the action of AS-IV treatment

which was able to increase PPARγ activity and inhibit BACE1 in vitro. As a result, Aβ levels significantly

decreased. The in vivo treatment with AS-IV increased the expression of PPARγ and BACE1 and reduced the

formation of neuritic plaque and Aβ levels in the brain of APP/PS1 rats [46].

Also corroborating this study, Chang et al. (2016) evaluated the action of AS-IV in the cerebral cortex

after infusion of Aβ, showing that i.p. administration of 40 mg/kg/day of the herbal compound once a day for

14 days reduced apoptosis levels with mitochondrial dysfunction in cortical cells having been blocked by

inhibition of protein kinase phosphoinositol 3-kinase (PI3K), known as AKT [47].

Amyotrophic lateral sclerosis (encephalomyelitis)

AS-IV has also been tested in rat models with experimental autoimmune encephalomyelitis that exhibit

similar characteristic symptoms to amyotrophic lateral sclerosis (ALS) [48]. In this model, AS-IV given at a

dose of 20 mg/kg significantly attenuated the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)

in rats. The study suggested that AS-IV may be effective for clinical therapy/prevention of multiple sclerosis,

119

having been able to improve the antioxidant defense system by increasing antiapoptotic and anti-inflammatory

pathways, and to modulate the differentiation of T cells and their infiltration [48].

Another study carried out posteriorly by the above mentioned authors evaluated the action of

Astragalosides I, II and IV (25 and 50 mg/kg) present in the composition of AST [49]. The results showed a

similar pattern in which Astragalosides prevented the infiltration of inflammatory cells in rats and decreased

oxidative stress and glial activation in the hippocampus by anti-inflammatory and antioxidant actions.

Moreover, an assessment of neuronal injury caused by inflammatory infiltrating T cells (a common feature of

EAE) demonstrated that the treatment with AST acted in neutralizing neuronal damage through the expression

of proteins associated with apoptosis, Bax regulation and Bcl-2 inhibition [49].

Cerebral ischemia

Cerebral ischemia facilitates an inflammatory process as one of its components that aggravates brain

damage and plays an important role in the disease progression. As a response to ischemia or trauma, the CNS

responds by activating resident microglia/astrocytes and peripheral leukocyte infiltration, resulting in

microvessel obstruction, edema formation, cell death and tissue infarction [50,51]. Activated microglia release

inflammatory cytokines including IL-1β, TNF-α and other cytotoxic molecules such as NO and ROS [52,53].

Li et al. (2017) assessed the expression of Iba1, an activated microglial marker after ischemia. The

results indicated an increase in Iba1, IL-1β and TNF-α expression in the control group with lesion, unlike the

AS-IV treated group which decreased these abnormal increases [54]. Thus, AS-IV presented neuroprotective

effects during cerebral ischemic brain injury/focal reperfusion, possibly due to its antioxidant, anti-

inflammatory and antiapoptotic properties; facts well-described by other authors [48,54-56].

Some studies suggest that the protective effect on cerebral focal ischemia in rats at different reperfusion

time points is related to antioxidation, regulating expressions of neuronal growth factor, tropomyosin kinase A

receptors and messenger RNA [57,58] assessed the potential of AS-IV and Astragalosides to protect the cause

of cerebral inflammation caused by cerebral focal ischemia and reperfusion with dosages of 10 or 20 mg/kg in

rats, observing a protective effect through the remarkable decrease in the percentage of positive neutrophils for

CD11b/CD18 and negative expression regulation of the intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), which is

partially achieved by attenuating the production of TNF-γ and IL-1β and inhibition level of nuclear factor-β

120

(NF-β). In this study, the anti-inflammatory mechanism evoked by AS-IV occurred by suppressing molecules

related to neutrophil adhesion, exerting neuroprotection against ischemia/reperfusion (I/R) injury.

In their analysis, Kim et al. (2015) evaluated the effect of AS-IV on learning and memory deficits

induced by chronic cerebral hypoperfusion in rats at dosages of 10 and 20 mg/kg daily for 28 days starting at

the 5th week after bilateral carotid artery occlusion. It was observed that a dosage of 20 mg/kg significantly

improved spatial learning and memory deficits assessed using the MAL test in rats with chronic cerebral

hypoperfusion [55]. In addition, it significantly attenuated neuronal apoptosis as well as levels of superoxide

dismutase and lipid peroxidation markers, including malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal in the

hippocampus, and significantly reduced the expression of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine, an agent that causes

oxidative DNA damage; moreover, it significantly inhibited the activation of astrocytes and microglia in the

hippocampus, indicating that AS-IV has the therapeutic potential for preventing dementia caused by cerebral

hypoperfusion, suggesting that the enhancement effect of AS-IV on learning and memory deficits may be the

result of neuronal apoptosis and oxidative damage suppression in the hippocampus [55]. It should be noted that

the signaling pathways of AS-IV during cerebral I/R are still not fully reported [56].

Another extremely relevant event for the promotion of brain lesions in the ischemic process is the

blood brain barrier (BBB) dysfunction. Interruption of BBB plays an important role in cell damage in

neurological diseases, including acute and chronic cerebral ischemia, cerebral trauma, multiple sclerosis, brain

tumors and brain infections [59].

The increase in BBB permeability and vascular rupture may be possibly the initiating factors for

developing cerebral infarcts [60]. A cascade of molecular events occurs during a lesion, and is terminated by

BBB interruption by radicals and free proteases, which attack membranes and degrade tight junction proteins

in endothelial cells.

Oxygen and nitrogen free radicals and proteases, matrix metalloproteinases (MMP9) and

cyclooxygenase are important in early and late BBB interruption as the neuroinflammatory response progresses.

The damage caused by BBB rupture contributes to disease progression, as well as to cognitive changes in the

affected individual. Thus the protection of the BBB in brain tissues may be potentially beneficial for the

neuronal recovery of I/R injury [59,61]. In the pioneering study by Qu et al. (2009), they evaluated the effect

of Astragaloside IV purified extract on BBB in a focal model of cerebral I/R injury at the dosage of 10 and 20

121

mg/kg, observing a significant reduction in BBB permeability in comparison with the control group. In this

study, an increase in the expression of ocludin and ZO-1 in the endothelial cells was observed in groups treated

with the extract compared to other vehicle groups, and these mechanisms may possibly implicate the potential

activity where AS-IV protects the BBB against I/R-induced rupture by upward regulation of the expression of

tight junctional proteins [61].

BBB permeability is closely related to cerebral edema and is a critical complication following post-

acute intravascular thrombosis. In the study by Li et al. (2013), post-ischemia/reperfusion cerebral edema was

evaluated in animals treated with AS-IV at a dose of 10 and 20 mg/kg and BBB permeability with similar

technique to the previous study using Evans blue leak [62]. The results showed that AS-IV significantly

attenuated brain water content and provided better neurological results in treated animals in comparison to the

control group. In addition, BBB permeability improved significantly, also indicating the potential protective

effect of AS-IV to BBB. MMP9 and aquaporin 4 (AQP4) expressions related to cerebral vasogenic edema or

cytotoxic edema were increased in control animals, but were significantly inhibited by the administration of

AS-IV, thus proposing the anti-edema effect. The potential mechanisms proposed for the AS-IV action in

experimental models of neurodegenerative diseases are represented in Figure 2.

In another study, Shao et al. (2014) subsequently evaluated cerebral edema in animals with

subarachnoid hemorrhage and it was reported that edema was significantly attenuated following AS-IV

administration when compared to the vehicle group, as well as an improvement in neurobehavioral outcomes

and alleviation of brain injury through antioxidant and antiapoptotic effects. These effects were also evaluated

in neonates who were pre-treated with AS-IV or solvent by oral probe for three days, and then exposed to

isoflurane [63].

A double-blind, randomized, controlled clinical study enrolled a total of 68 patients within 24 hours

after hemorrhagic stroke [64]. This study demonstrated that Astragalus membranaceus acted improving the

functional recovery of patients after hemorrhagic stroke in the group treated with oral or nasopharyngeal

administration of the substance at a rate of 3 g three times a day for 14 days. Some adverse effects were observed

by the authors, such as the occurrence of dizziness, rash or fever, but these events were classified as minor, with

the study indicating that Astragalus membranaceus has an excellent safety profile for treatment because it is

122

well tolerated and no serious adverse events were related to the use of the drug. However, the authors point the

need for complementary studies for a better understanding of their protective functions [64].

Exposure to general anesthesia can cause severe neurotoxicity in the development of the brain due to

neuronal apoptosis. However, pre-treatment with AS-IV significantly inhibited isoflurane-induced neural

apoptosis in the hippocampus, also significantly alleviating oxidative stress and the proinflammatory release of

cytokines [65]. AS-IV has been shown to work well with other drugs, as reported [66]. This study investigated

the effects of AS-IV and tetramethylpyrazine on a cerebral I/R injury model in rats. The authors concluded that

AS-IV and tetramethylpyrazine played a key role in synergistic protection against I/R-induced focal brain

damage.

Conclusions

In our systematic review we point evidence that the administration of AS-IV is effective in both in

vivo and in vitro models of neurodegenerative diseases such as PD and AD, cerebral ischemia and

encephalomyelitis, by the characterization by the antioxidant, antiapoptotic, anti-inflammatory action of this

bioactive compound on the various neurochemical and behavioral mechanisms present in these pathologies,

mainly by avoiding mitochondrial damage and behavioral deficiencies.

Accordingly, it can be seen that the mechanisms presented by AS-IV offer a possible future alternative

for the potential treatment of these pathologies. In addition, long-term and clinical studies with new dosages

are needed, as this compound represents a promising approach.

Conflict of interest

The authors certify that they have no affiliation with or financial involvement in any organization with

a direct financial interest in the subject matter or materials discussed in the manuscript. This study did not

receive any specific grant from funding agencies in the public, commercial, or not-for-profit sectors.

Acknowledgements

Work supported by funding from the National Counsel of Technological and Scientific Development

(CNPq) and the Coordination for Improvement of High Level Staff (CAPES). This study was part of the

123

requirements for the Master’s degree obtained by IMC (PPGSS/UERN). IMC was a recipient of a CAPES

fellowship. All authors have made a substantial, direct and intellectual contribution to the work, and gave final

approval for its publication.

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128

Figure 1. Flowchart showing the selection process of the studies used in this systematic

review.

129

Legends of Figures and Table

Figure 1. Flowchart showing the selection process of the studies used in this systematic review.

Figure 2. Potential mechanisms proposed for the AS-IV action in experimental models of

neurodegenerative diseases. In step A, the protective effect of AS-IV (10 and 20 mg/kg) observed in

an experimental I/R model as outlined prevented the accumulation of CD11b/CD18 positive neutrophils

and reduced the expression of the intracellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), which is partially

achieved by the strong attenuation of TNF-α and IL-1β anti-inflammatory mechanism production by the

suppression of these molecules related to neutrophil adhesion. Another proposed action mechanism is

the reduction of BBB permeability and decreased lymphocyte infiltration due to anti-inflammatory

action that results in decreased neuroinflammation.

In step B, the AS-IV acted on the ischemic region, decreasing the metabolism of glucose and resulting

in the reduction of clot area, attenuating the volume of cerebral infarction. The anti-edema action of AS-

IV is also correlated with AQP4 regulation, which mediates the flow of water in the CNS with a

consequent decrease of the cerebral edema and reduced microglial activation, followed by reduced BBB

interruption and MMP9 (Matrix metaloproteinase) related to vasogenic edema, which was inhibited by

AS-IV and that also act on decreasing lymphocyte infiltration.

In step C, the effect of the AS-IV was observed in a culture of dopaminergic neurons when 100 μM was

administered. The represented model of 6-OHDA showed cell death in the SNpc (substantia nigra pars

compacta), while the group treated with AS-IV notably increased cell survival attenuating the loss of

dopaminergic neurons, since it presented intact germination; and in step D, the AS-IV prevents

mitochondrial dysfunction as it acts by increasing the enzyme action of the SOD and GSH antioxidant

defense system which converts hydrogen peroxide into H2O and O2, thereby preventing lipid

peroxidation and mitochondrial damage. AS-IV acts by inhibiting the apoptotic pathway among both

action mechanisms proposed for neurodegenerative diseases; they were shortly summarized and

evaluated in the reviewed studies, so that AS-IV reduces the activation of the BAX channel (which

accelerates programmed cell death) and increases Bcl-2 that represses apoptosis. Furthermore, AS-IV

prevents the activation of procaspases that activate the effector caspase 3, thus preventing oxidative

stress, apoptosis and a decrease in MDA (malondialdehyde) which catalyzes the formation of numerous

ROS. AS-IV also acts in increasing mitochondrial potential and ATP generation, inhibiting the

membrane pore opening and consequently reverting the mitochondrial oxidation.

In step E, AS-IV action in the experimental model induced by Aβ-amyloid is proposed, since it inhibits

its formation by the APP, thus inhibiting the BACE-1 which cleaves this protein by generating the toxic

amyloid, and it also inhibited presenilin-1 expression. In step F it increased TH enzyme of dopamine,

NO and NOS synthesis, which are involved in elevating dopamine release in the striatum.

Table 1. In vivo and in vitro models of studies of neurodegenerative diseases and the

implications of Astragaloside IV in the treatment.

130

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138

APÊNDICE E – Trabalho apresentado no Simpósio Internacional em Neuroinflamação

PLASTIC BEHAVIOR OF GLIAL CELLS OF THE HYPOCAMPUS IN CULTURE

AFTER TREATMENT WITH ASTRAGALOSIDE IV

Ianara Mendonça da Costa1, Fausto Pierdoná Guzen1,2, Francisca Idalina Neta1, José Rodolfo Lopes de

Paiva Cavalcanti1, Marco Aurélio de Moura Freire1, Salvador Viana Gomes Júnior1, Luciana Cristina

Borges Fernandes1,3, Francisca Overlânia Vieira Lima1, Eudes Euler de Souza Lucena1, Jeferson de

Souza Cavalcante4

1 Laboratory of Experimental Neurology, Department of Biomedical Sciences, Faculty of Health

Sciences, State University of Rio Grande do Norte, Mossoró-RN, Brazil

2 Postgraduate Program in Biotechnology, School of Health, Potiguar University, Natal-RN, Brazil

3 Postgraduate Program in Science Animal, Federal University of the Semi-Arid, Mossoró-RN, Brazil

4 Laboratory of Neurochemical Studies, Department of Physiology, Bioscience Center, Federal

University of Rio Grande do Norte, University Campus, Natal-RN, Brazil

ABSTRACT

Neurodegerenative diseases are a growing worldwide problem due to the aging population and

the risky behavior associated. According to the World Health Organization (WHO), a global

average of 47.5 million people live with dementia nowadays, with Alzheimer's Disease (AD)

being the most common cause. One of the major brain regions affected by this pathology is the

hippocampus, leading to severe memory disorders. Herbal medicines are widely used in health

care. One of these substances is Astragaloside IV (AS-IV), which presents biological and

pharmacological activity. In light of this, the present study aimed to analyze the effects of

supplementation with differentiated doses of AS-IV on the plasticity of glial nerve cells of the

hippocampus in culture.

All experimental procedures of the present project were conducted under license from the local

Animal Experimentation Ethics Committee (EAEC - Protocol 015/2016)

139

The hippocampal cells were collected from newborn Wistar rats,being then cultured in different

groups: one control and the other containing different concentrations of AS-IV (5, 10, 15, 20

and 25 μl). Cell morphometry was evaluated over 96 hours by phase contrast microscopy,

following immunocytochemistry for GFAP (Glial Fibrillary Acid Protein). All groups were

compared statistically in multiple comparisons in the form of pairs, with differences being

considered significant when p<0.05. With the adopted procedures, it was possible to evaluate

the plastic (area and perimeter) and trophic effects of the glial cells in culture. AS-IV promoted

the maintenance of glial cell expansion, especially in the treatment groups with conditioned

medium of 20 and 15 μl, demonstrating direct trophic action of the immune cells, acting as a

possible future alternative for the potential treatment of neurodegenerative diseases.

Keywords: Astragaloside IV; Hippocampus; Plasticity.

Field of knowledge: Neuroinflammation in Neurodegenerative Diseases

Sponsor names: This study was supported by the National Counsel of Technological and

Scientific Development (CNPq) and the Coordination for Improvement of High Level Staff

(CAPES) - Brazil.

140

APÊNDICE F – Artigo aceito para publicação na revista Current Neuropharmacology

Curr Neuropharmacol. 2018 Jan 16. doi: 10.2174/0929867325666180117112610. [Epub ahead of print]

Supplementation with Curcuma longa reverses neurotoxic and

behavioral damage in models of Alzheimer's disease: A

systematic review.

da Costa IM1, de Moura Freire MA1, de Paiva Cavalcanti JRL1, Pessoa de Araujo D1, Norrara B1, Rosa

IMMM1, Pereira de Azevedo E2, Meneses do Rego AC2, Filho IA2, Guzen FP1.

BACKGROUND:

The formation of senile plaques and neurofibrillary tangles of the tau protein are the main

pathological mechanism of Alzheimer's disease (AD). Current therapies for AD offer

discrete benefits to the clinical symptoms and do not prevent the continuing degeneration

of neuronal cells. Therefore, novel therapeutic strategies have long been investigated, where

curcumin (Curcuma longa) has shown some properties that can prevent the deleterious

processes involved in neurodegenerative diseases.

OBJECTIVE:

The aim of the present work is to review studies that addressed the effects of curcumin in

experimental models (in vivo and in vitro) for AD.

METHOD:

This study is a systematic review conducted between January and June 2017, in which a

consultation of scientific articles from indexed periodicals was carried out in Science Direct,

United States National Library of Medicine (PubMed), Cochrane Library and Scielo

databases, using the following descriptors: "Curcuma longa", "Curcumin" and "Alzheimer's

disease".

RESULTS:

A total of 32 studies were analyzed, which indicated that curcumin supplementation

reverses neurotoxic and behavioral damages in both in vivo and in vitro models of AD.

CONCLUSION:

The administration of curcumin in experimental models seems to be a promising approach

in AD, even though it is suggested that additional studies must be conducted using distinct

doses and through other routes of administration.

Copyright© Bentham Science Publishers; For any queries, please email at [email protected].

KEYWORDS:

Alzheimer’s disease; Aβ aggregation; brain.; brain.Alzheimer’s disease; curcumin; oxidative stress;

therapeutics.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29338678

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=da%20Costa%20IM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=29338678

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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Filho%20IA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=29338678

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Guzen%20FP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=29338678

141

ANEXO A - Parecer de aprovação no CEEA

142

ANEXO B – Certificado da Análise físico-química e microbiológica do AS-IV

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