UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
THAÍS HELENA SILVA FERREIRA
AVALIAÇÃO DO PAPEL DA SUBUNIDADE II DA ATP
SINTASE NA TOLERÂNCIA A ESTRESSES ABIÓTICOS EM
CANA-DE-AÇÚCAR.
ASSESSING THE ROLE IN TOLERANCE OF THE ATP
SYNTHASE SUBUNIT II UNDER ABIOTIC STRESS IN
SUGARCANE.
CAMPINAS
(2016)
THAÍS HELENA SILVA FERREIRA
AVALIAÇÃO DO PAPEL DA SUBUNIDADE II DA ATP SINTASE NA TOLERÂNCIA A ESTRESSES ABIÓTICOS EM CANA-DE-AÇÚCAR
ASSESSING THE ROLE IN TOLERANCE OF THE ATP SYNTHASE SUBUNIT II UNDER ABIOTIC STRESS IN SUGARCANE.
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética vegetal e Melhoramento.
Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Genetic and Molecular Biology in Plant Genetics and Breeding.
Orientador: MARCELO MENOSSI TEIXEIRA
CAMPINAS
(2016)
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À
VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA
ALUNA THAÍS HELENA SILVA FERREIRA E
ORIENTADA PELO MARCELO MENOSSI
TEIXEIRA.
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2012/06908-1; CNPq,
211317/2013-6
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca do Instituto de Biologia
Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Ferreira, Thaís Helena Silva, 1986-
F413a FerAvaliação do papel da subunidade II da ATP sintase na tolerância a
estresses abióticos em cana-de-açúcar / Thaís Helena Silva Ferreira. –
Campinas, SP : [s.n.], 2016.
FerOrientador: Marcelo Menossi Teixeira.
FerTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de
Biologia.
Fer1. Estresse abiótico. 2. Cana-de-açúcar. 3. Adenosina trifosfato. 4.
Proteômica. 5. Cloroplastos. I. Menossi, Marcelo,1968-. II. Universidade
Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Assessing the role in tolerance of the ATP synthase subunit II
under abiotic stress in sugarcane
Palavras-chave em inglês:
Abiotic stress
Sugarcane
Adenosine triphosphate
Proteomics
Chloroplasts
Área de concentração: Genética Vegetal e Melhoramento
Titulação: Doutora em Genética e Biologia Molecular
Banca examinadora:
Marcelo Menossi Teixeira [Orientador]
Renato Vicentini dos Santos
Monalisa Sampaio Carneiro
Paulo Mazzafera
Carlos Takeshi Hotta
Data de defesa: 31-08-2016
Programa de Pós-Graduação: Genética e Biologia Molecular
Campinas, 31 de agosto de 2016.
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Marcelo Menossi Teixeira
Prof. Dr. Carlos Takeshi Hotta
Prof. Dr. Renato Vicentini dos Santos
Profa. Dra. Monalisa Sampaio Carneiro
Prof. Dr. Paulo Mazzafera Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Aos meus pais e ao meu irmão com
muito amor por todo carinho,
dedicação e confiança.
Agradecimentos
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp), processo
número 2012/06908-1 e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
(CNPq), processo número 211317/2013-6 pelas bolsas de estudos concedidas e ao Programa
de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, da Universidade Estadual de Campinas,
pela oportunidade de realizar esse projeto de doutorado.
Ao Prof. Dr. Marcelo Menossi, pela oportunidade de fazer parte da sua equipe e pela
orientação.
Ao pesquisador Dr. Prakash Lakshmanan pela supervisão e ao Instituto SRA-Sugar
Research Australia (Austrália) pela oportunidade de realização de grande parte do projeto.
Ao pesquisador Dr. Tiago Balbuena e à Bruna Marques pela orientação, dedicação e
ajuda.
A toda equipe do Laboratório de Genoma Funcional pelo apoio e auxílio prestados e
principalmente à Doutra Agustina Gentile e aos amigos Max, Valter, Giane, Isabella e
Raphael.
A todos os pesquisadores que contribuíram direta ou indiretamente para a realização
do presente trabalho e aos membros da banca avaliadora pela disposição em participar da
defesa dessa tese.
À minha família toda pelo amor e incentivo. Pai, mãe e Lucas, obrigada por tudo.
Resumo
É sabido que uma nova revolução verde será necessária para alcançar as demandas
por alimento e combustível com o aumento da população mundial. Nesse contexto, a importância
da cana-de-açúcar como biocombustível reforça a necessidade por aumento de sua produção e o
melhoramento através da biotecnologia se faz necessário para atingir tais proporções. O Brasil é o
principal produtor de cana-de-açúcar do mundo. Dentre os diversos estresses que afetam a
produtividade agrícola, a resposta ao estresse hídrico ocupa uma posição central como o fator
mais limitante ao crescimento das plantas.
Aumentar a capacidade fotossintética de cultivares comerciais é uma promissora
ferramenta para aumento do crescimento de plantas cultiváveis e consequentemente,
aumentando a produção . A partir dos dados de expressão gênica, o gene que codifica um
polipeptídeo com similaridade à subunidade II da ATP sintase foi selecionado e o seu papel na
proteção contra estresses abióticos foi estudado em tabaco (Nicotiana tabacum). A
superexpressão do gene de cana conferiu tolerância aos estresses hídrico e salino em plantas
transgênicas de tabaco. Assim, o objetivo desta tese foi realizar um estudo funcional do gene que
codifica a subunidade II da ATP sintase de cana-de-açúcar, através da superexpressão desse gene
em plantas transgênicas de cana-de-açúcar.
Através de dados de proteômica, o presente trabalho também trouxe um melhor
entendimento do funcionamento de cloroplasto de cana-de-açúcar sob estresse hídrico, sendo
capaz de identificar pontos com potencial biotecnológico para produção de plantas transgênicas
capazes de aumentar sua capacidade de realizar o transporte cíclico de elétrons e
consequentemente, com potencial de maior tolerância à seca.
Abstract
Sugarcane is one of the most important crop plants on the world. Among the
various stresses that affect agricultural productivity, drought is the most limiting factor for
plant growth. Thus, the development of new sugarcane cultivars that are tolerant to drought
becomes an important focus of research. From microarray expression data, the gene that
encodes a polypeptide with similarity to the II subunit of ATP synthase was selected and its
role under abiotic stresses has been studied in tobacco (Nicotiana tabacum). Overexpression
of this gene conferred tolerance to drought and salt stresses in transgenic tobacco.
Considering the previous work done by our group, and the literature as regards on the
possible role of the ATP synthase in increase tolerance to abiotic stresses, the goal of this
work is to perform a functional study of the sugarcane gene that encodes the ATP synthase II
subunit, by sugarcane transgenic plants overexpressing this gene and analyze the responses
of these plants when subjected to periods of drought. We also bring an overview of the
proteomic of sugarcane chloroplast under drought conditions and new insights in the
regulation of photosynthesis under stress by differentially expressed chloroplast proteins.
Índice
Introdução ........................................................................................................ 10
1. Cana-de-açúcar e seca .................................................................... 10
2. ATP sintase, fotossíntese e seca ..................................................... 11
3. Proteômica no estudo de plantas sob estresse .............................. 13
Hipótese ............................................................................................................ 14
Objetivos ........................................................................................................... 15
Apresentação do trabalho ................................................................................ 16
Capítulo I ........................................................................................................... 17
Capítulo II .......................................................................................................... 45
Capítulo III ......................................................................................................... 69
Conclusões ........................................................................................................ 106
Referências ....................................................................................................... 107
Anexo I .............................................................................................................. 120
Anexo II ............................................................................................................. 121
10
Introdução
Cana-de-açúcar e seca
A cana-de-açúcar, uma planta monocotiledônea pertencente à família Poaceae e
ao gênero Saccharum, é uma das mais importantes plantas cultiváveis do planeta
(Stevenson, 1965; Watson et al., 1985). Os cultivares comerciais são híbridos e seu genoma é
o resultado de hibridações de duas a quatro espécies de Saccharum. Poliplóides e
aneuplóides, os híbridos possuem de 100 a 120 cromossomos num total de 10 Gpb de DNA
(D'Hont A. et al., 2001).
Possui o metabolismo fotossintético do tipo C4 e é considerada altamente
eficiente na conversão de energia radiante em energia química. As características dos
cultivares influenciam a eficiência fotossintética da cana, além das variações climáticas que
prevalecem durante o desenvolvimento da cultura, como mudanças na intensidade e
qualidade de luz, na concentração de CO2, na temperatura e na disponibilidade de água e de
nutrientes (Rodrigues, 1995).
A cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância econômica, sendo
responsável por aproximadamente 75% da produção de açúcar no mundo, sendo cada vez
mais relevante na produção de energia renovável (Gentile et al., 2015). O Brasil é o maior
produtor mundial de cana-de-açúcar (FAO, 2015) e sua lavoura continua em expansão. São
produzidos 600 milhões de toneladas por ano, sendo 42% usados para a produção de açúcar
e 58% usados para produção de etanol (Conab, 2015) .
Uma situação de déficit hídrico, quando a taxa de transpiração excede a
absorção de água, durante a fase vegetativa destas plantas (desenvolvimento inicial da parte
aérea e desenvolvimento tardio de folhas) diminui a biomassa e consequentemente o
crescimento de colmos, reduzindo drasticamente a produtividade. A produtividade média
brasileira sofre com declínios periódicos, sendo uma das causas a escassez de chuvas que
muitas vezes não permite o pleno desenvolvimento dos canaviais (Conab, 2013; Gentile et
al., 2015).
11
Como a seca é uma das principais causas de perdas na produtividade de cana-de-
açúcar, a compreensão dos mecanismos fisiológicos de resposta ao estresse hídrico bem
como sua base genética são de grande relevância para produção de variedades com maior
produtividade em situações de restrição hídrica.
ATP sintase, fotossíntese e seca
Com o estresse por seca, ocorre o declínio na taxa de assimilação de carbono
devido ao fechamento estomático. Em condições mais severas ocorre também inibição de
enzimas e metabólitos essenciais para a fotossíntese em cana-de-açúcar (Du et al., 1996;
Inman-Bamber and Smith, 2005; Lakshmanan and Robinson, 2014).
O ATP e NADPH produzidos durante as reações luminosas da fotossíntese são
usados para o funcionamento do ciclo fotossintético de redução do carbono. Em plantas C3,
quando em concentrações altas de CO2, a queda na taxa de produção de ATP prevalece em
relação ao consumo de ATP (Kiirats et al., 2009), atrasando a regeneração de RuBP
(Ribulose-1, 5-bisphosphate), o que por sua vez, limita o transporte de elétrons (von
Caemmerer and Evans, 2010).
É sabido que o conteúdo de subunidades da ATP sintase decai com o aumento do
estresse por seca (Hoshiyasu et al., 2013; Tezara et al., 1999). Em tabaco transgênico, a
repressão de subunidades da ATP sintase restringiu o transporte de elétrons, a assimilação
de CO2 e o crescimento, devido à superacidificação do lúmen do tilacóide. Também foi
demonstrado o papel determinante desse complexo na capacidade fotossintética desse
organismo (Rott et al., 2011; Yamori et al., 2011).
As ATP sintases são importantes enzimas que fornecem energia para as células e
são conservadas evolutivamente. As enzimas bacterianas possuem essencialmente a mesma
estrutura daquelas encontradas nas mitocôndrias de animais, plantas e fungos e também
nos cloroplastos das plantas. Na maioria dos sistemas, as ATP sintases são localizadas nas
membranas e catalisam a síntese de ATP a partir de ADP e fosfato através de um movimento
de rotação, direcionado pelo fluxo de prótons entre a membrana, gerado pela transferência
de elétrons. O fluxo parte do lado fotoquímico positivo (alto potencial eletroquímico) para o
lado fotoquímico negativo. A reação catalisada pela ATP sintase é completamente reversível
(Futai, 2006; McCarty, 1992).
Em plantas, existem duas formas diferentes deste complexo enzimático, uma
localizada nas mitocôndrias e outra nos cloroplastos. A ATP sintase de cloroplasto consiste
12
de dois componentes multiméricos; o CF0 é integrante da membrana dos tilacóides e CF1 é
hidrofílico (McCarty et al., 2000). A porção CF0 é responsável pela translocação de prótons e
contém quatro subunidades (I1, II1, III14 e IV1 codificadas pelos genes: atpF, atpG, atpH,
atpI), enquanto CF1 abriga o núcleo catalítico e é composto por cinco subunidades (α3, β3,
γ1, δ1 e ε1 codificadas pelos genes: atpA, atpB, atpC, atpD, atpE ) (Curtis, 1988). As
subunidades I e II são responsáveis pela conexão entre as duas porções e conferem
flexibilidade suficiente para estabilizar o complexo enzimático inteiro submetido a tensões
geradas pela rotação (Dunn et al., 2001; Poetsch et al., 2007). Apenas as subunidades II, γ e δ
são codificadas por genes localizados no genoma nuclear, enquanto que os demais estão
localizados no genoma do cloroplasto (Allen et al., 2011).
Com relação aos estudos moleculares em cana-de-açúcar, diversos grupos do
Estado de São Paulo desenvolveram o projeto SUCEST-FUN (http://sucest-fun.org), cuja
finalidade foi associar funções aos genes sequenciados pelo projeto genoma da cana –
SUCEST. A partir dos dados gerados, foi iniciado o projeto “Transcriptoma da cana-de-
açúcar”, que produziu microarranjos em lâminas de vidro contendo 6.139 elementos. Nesse
projeto estão concentrados os primeiros esforços de análise de expressão gênica em larga
escala de plantas de cana com experimentos de seca (Rocha et al., 2007a), o qual foi
realizado em casa de vegetação com uma variedade de cana-de-açúcar susceptível à seca,
SP90-1638 (CTC, 2002), submetida à suspensão de rega por 24, 72 e 120 horas.
Dentre os diversos polinucleotídeos de cana identificados como diferencialmente
expressos sob condições de seca, o que codifica um polipeptídeo com similaridade à
subunidade II da ATP sintase de cloroplasto, que teve sua expressão reduzida sob estresse,
foi selecionado e o seu papel na proteção contra estresses abióticos foi estudado em tabaco
(Nicotiana tabacum) pelo nosso grupo (Souza, 2012). Nesse trabalho, a superexpressão do
polinucleotídeo de cana conferiu tolerância aos estresses hídrico e salino em plantas
transgênicas de tabaco. Os tabacos transgênicos apresentaram uma maior taxa de
crescimento e sobrevivência em relação às plantas selvagens em condições limitantes de
estresse por seca e salino.
Dessa forma, considerando o trabalho realizado anteriormente por nosso grupo
e o que há na literatura sobre a importância da regulação da ATP sintase na resposta ao
estresse por seca, é necessário o estudo mais aprofundado da subunidade II da ATP sintase,
pois possibilitará uma melhor compreensão do papel desse gene na proteção contra
13
estresse abiótico, com potencial para produção de plantas transgênicas de cana mais
tolerantes ao estresse por seca.
Proteômica no estudo de plantas sob estresse
Componentes fotossintéticos são os mais vulneráveis ao estresse, que causa
mudanças nos pigmentos e na estrutura de cloroplastos, redução na taxa fotossintética e
restrição do transporte de elétrons e da atividade enzimática (Marian et al., 2004).
Mudanças ambientais resultam em reajuste da composição do aparato fotossintético,
alterando a capacidade de produzir ATP e NADPH e a utilização da luz (Schottler et al., 2015).
Essas mudanças no conteúdo e na atividade de complexos fotossintéticos estão intimamente
relacionada com fluxo linear de elétrons e capacidade de assimilação de CO2 da folha,
sugerindo que o complexo citocromo b6f e ATP sintase são os pontos predominantes de
controle de fluxo fotossintético (Schottler et al., 2015). Como foi descrito anteriormente,
para plantas C3, em altas concentrações de CO2, o limitante para a assimilação de carbono,
passa a ser a disponibilidade de ATP para recuperação de RuBP (Ribulose 1,5-bisfostato).
Como plantas C4 possuem mecanismos de concentração de CO2, evitando limitações da
fotossíntese por baixas concentrações de CO2 disponíveis para a Rubisco (Ribulose 1,5-
bisfosfato carboxilase), um fator limitante da taxa fotossintética pode ser a quantidade de
ATP, que por sua vez pode ser controlado pela quantidade de ATP sintase.
A proteômica tem provado ser uma ferramenta poderosa em explorar as vias
bioquímicas e os mecanismos complexos de resposta de plantas para vários estresses
abióticos (Zhou et al., 2015). Considerando a importância da proteômica em estudos sob
condições de estresse hídrico, para compreender melhor o funcionamento do cloroplasto de
cana-de-açúcar durante esse estresse, principalmente o papel da ATP sintase, foi realizado
um estudo de proteômica de cloroplastos de cana-de-açúcar submetidas a um tratamento
de suspensão de rega.
14
Hipótese
A hipótese deste trabalho é que a subunidade II da ATP sintase tem um papel
importante na tolerância à seca. Assim, a sua superexpressão pode conferir tolerância a
estresses abióticos em cana-de-açúcar, estabilizando o complexo como um todo.
Adicionalmente, os níveis de proteínas cloroplastidiais de cana-de-açúcar variam com
estresse por seca, o complexo da ATP sintase pode ter um papel chave no controle da
fotossíntese de cana-de-açúcar sob estresse hídrico, através da diminuição da quantidade de
suas subunidades, reduzindo a produção de ATP.
15
Objetivos
Objetivo geral:
O objetivo deste trabalho é realizar um estudo funcional do gene que codifica a
subunidade II da ATP sintase de cana-de-açúcar, que está associada à tolerância à seca. Para
tal, foram produzidas plantas transgênicas de cana-de-açúcar superexpressando o gene
correspondente a essa subunidade.
O presente estudo também tem como objetivo identificar proteínas
cloroplastidiais de cana-de-açúcar, assim como identificar aquelas que são influenciadas pelo
deficit hídrico.
Objetivos específicos:
-Produção de plantas transgênicas de cana-de-açúcar que superexpressem o
gene que codifica a subunidade II da ATP sintase de cana-de-açúcar.
-Caracterização fisiológica das plantas obtidas, para ampliar o conhecimento
sobre a função do gene selecionado.
- Avaliação da resposta das plantas transgênicas geradas quanto à tolerância ao
estresse hídrico, salino e oxidativo.
- Comprovação da localização subcelular da proteína codificada pelo gene alvo
através da fusão com GFP.
-Identificação de proteínas cloroplastidiais de cana-de-açúcar por espectrometria
de massas.
-Identificação de proteínas cloroplastidiais diferencialmente expressas em
plantas de cana-de-açúcar submetidas ao estresse hídrico.
16
Apresentação do trabalho
O presente trabalho consiste em três capítulos. O Capítulo I é dedicado ao
estudo funcional do gene alvo em plantas transgênicas de cana-de-açúcar. O Capílulo II
descreve um estudo de proteômica de cloroplastos para identificação de proteínas
moduladas pela seca. O capítulo III contém uma revisão dos estudos fisiológicos e
moleculares de seca em cana-de-açúcar, referente a um manuscrito enviado à revista
Frontiers in Plant Science.
17
Capítulo I
Avaliação do papel da subunidade II da ATP sintase na
tolerância a estresses abióticos em plantas transgênicas de cana-de-
açúcar
Este capítulo trata do estudo funcional do gene que codifica a subunidade II da
ATP sintase de cana-de-açúcar e do seu envolvimento na resposta ao estresse hídrico,
através da obtenção de plantas transgênicas de cana-de-açúcar.
Resultados e discussão
Obtenção e confirmação do gene candidato
A sequência completa de nucleotídeos da subunidade da ATP sintase de cana-de-
açúcar foi obtida por análises in silico, provenientes do sequenciamento do genoma da cana-
de-açúcar (Figura 1). A sequência completa possui 642 nucleotídeos (Figura 1A) e codifica
uma proteína de 213 aminoácidos (Figura 1B).
A
ATGGCCACGG CTATGATGGC TGCATCCACC ACCTCCTGCT CCCCGCGCCG CGCCGCGCCG 60
CTCCTGAAGC CGGTGGCCTC CTCCTCCTCC CCCAGCAGCA GCTCGGCGCG GCGGCGGCGG 120
CCCTTGGCGC AGCAGCTCCC GCGGCTGCTG GCGACGGCGG CGGCGGCGGT GGCGGCCGCG 180
CCGCTCCCGG CGCTGGCGGA GCAGATGGAG AAGGCCGCGC TGTTCGACTT TAACCTGACG 240
CTCCCGGCGA TCGCGACCGA GTTCCTGCTG CTCATGGTGG CGCTGGACAA GCTCTACTTC 300
ACGCCCCTGG GCAAGTTCAT GGACGAGCGG GACGCCAAGA TCCGCGGCGA GCTCGGCGAC 360
GTCAAGGACG CCTCCGAGGA GGTGAAGCAG CTGGAGGAGC AGGCGGCCGC CATCATGAAG 420
GCGGCGCGCG CCGAGATCGC GGCGGCGCTC AACAAGATGA AGAAGGAGAC CACCGCGGAG 480
CTGGAGGCCA AGCTGGAGGA GGGCCGCAGC CGCGTGGAGG CCGAGCTCGT CGAGGCGCTC 540
GCCAACCTCG AGGCGCAGAA AGAGGAGGCC GTCAAGGCGC TCGACGCGCA GATCGCCTCG 600
CTCAGCGATG AGATCGTCAA GAAGGTGCTC CCATCCGCCT GA 642
B
MATAMMAAST TSCSPRRAAP LLKPVASSSS PSSSSARRRR PLAQQLPRLL ATAAAAVAAA 60
PLPALAEQME KAALFDFNLT LPAIATEFLL LMVALDKLYF TPLGKFMDER DAKIRGELGD 120
VKDASEEVKQ LEEQAAAIMK AARAEIAAAL NKMKKETTAE LEAKLEEGRS RVEAELVEAL 180
ANLEAQKEEA VKALDAQIAS LSDEIVKKVL PSA 213
18
Figura 1: A: Sequência completa do gene que codifica a subunidade II da ATP sintase obtida a partir do sequenciamento do genoma de cana-de-açúcar. B: Sequência proteica deduzida.
Para confirmar a provável função da proteína codificada pelo gene alvo, foi
gerada uma árvore filogenética de máxima verossimilhança seguindo o modelo de evolução
de sequências WAG (Whelan and Goldman, 2001), para confirmar a homologia entre a
sequência alvo de cana e as subunidades II da ATP sintase de cloroplasto de outras espécies
de plantas (Figura 2).
Figura 2: Árvore de máxima verossimilhança da subunidade alvo de cana-de-açúcar (Ssp) e as subunidades β, I e II da ATP sintase de cinco espécies de plantas. A subunidade da ATP sintase de cana-de-açúcar está destacada por uma flecha vermelha. Os grupos estão divididos de acordo com a subunidade. Grupo 1: subunidade II, Grupo 2: subunidade I e Grupo 3: subunidade β. O valor de bootstrap é baseado em 1000 réplicas e está indicado abaixo de cada nó. Os Loci estão especificados na tabela 1.
Para tal, foi realizado o alinhamento múltiplo entre as sequências proteicas da
subunidade alvo de cana-de-açúcar e das subunidades β, I e II de quatro espécies de
gramíneas (Oryza sativa, Brachypodium distachyon, Zea mays e Sorghum bicolor) e uma
dicotiledônea (Arabidopsis thaliana) (Tabela 1). Para as comparações foram escolhidas uma
19
subunidade catalítica proveniente do genoma do cloroplasto (β) e a subunidades I, já que I e
II são estruturalmente e funcionalmente parecidas, sendo provenientes do mesmo gene
ancestral (Herrmann et al., 1993; Michl et al., 1999).
Tabela 1: Loci utilizados nas análises filogenéticas.
Sequências provenientes dos seguintes bancos de dados: Phytozome e GenBank
As diferentes subunidades foram divididas em três grupos distintos (Grupo 1:
subunidade II, Grupo 2: subunidade I e Grupo 3: subunidade β). A subunidade de cana-de-
açúcar faz parte do grupo 1, que representa as relações filogenéticas entre a subunidade II
de ATP sintase de diferentes plantas, indicando que o gene isolado de cana-de-açúcar
codifica a subunidade II da ATP sintase de cloroplasto. O gene foi então nomeado ScatpG.
Locus EspécieSubunidade
daATPsintase
OrniCp031 Oryzasativa Β
OrniCp020 Oryzasativa I
Os03g17070 Oryzasativa II
BrdiC_p032 Brachypodiumdistachyon Β
BrdiC_p021 Brachypodiumdistachyon I
Bradi3g56270 Brachypodiumdistachyon II
ZemaCp031 Zeamays Β
ZemaCp019 Zeamays I
GRMZM5G825759 Zeamays II
SobiCp028 Sorghumbicolor Β
SobiCp018 Sorghumbicolor I
Sb01g039270 Sorghumbicolor II
BAA84392.1 Arabidopsisthaliana Β
BAA84371 Arabidopsisthaliana I
AT4G32260 Arabidopsisthaliana II
20
Após amplificação com primers específicos para o gene ScatpG, a região
codificante do gene foi clonada no vetor pTZ57R/T e a confirmação foi feita por digestão
com as enzimas BamHI + XbaI e SacI (Figura 3) e por sequenciamento.
Figura 3: Digestão enzimática do plasmídeo pTZ57R/T contendo o gene ScatpG. L: marcador de peso molecular Gene Ruler 1KB Plus (Thermo Scientific). C: plasmídio sem digerir. P1-P4: Plasmídeos provenientes de colônias isoladas 1 a 4. D1: Dupla digestão com enzimas BamHI e XbaI (padrão de bandas esperado: 2.876 pb e 654 pb). D2: Digestão com enzima SacI (padrão esperado de bandas: 2.977 pb, 379 pb e 174 pb).
Como parte do conhecimento funcional dessa subunidade e confirmação da
obtenção do gene da subunidade II de cloroplasto, foi realizada a localização subcelular
dessa subunidade fusionada à proteína GFP através da agroinfiltração de folhas de Nicotiana
benthamiana. Conforme pode ser observado na Figura 4, a construção pGWB7:ScatpG:GFP,
contendo uma fusão da proteína ScATPG com a proteína GFP, tem uma colocalização com
cloroplastos.
Figura 4: Microscopia confocal revelando a localização subcelular da proteína referente à subunidade II da ATP sintase de cana-de-açúcar fusionada a GFP e agroinfiltrada em folhas de Nicotiana benthamiana. A: luz branca. B: mRFP (controle citoplasmático). C: auto-fluorescência cloroplasto (controle de cloroplasto). D: pGWB7:ScatpG:GFP. E: combinação das imagens B, C e D.
Produção de plantas transgênicas de cana-de-açúcar superexpressando o gene que codifica
a subunidade II da ATP sintase de cana-de-açúcar.
Plantas transgênicas de cana-de-açúcar superexpressando o gene ScatpG foram
produzidas para verificar se, assim como em tabaco, elas apresentam tolerância a estresses
abióticos.
21
O fragmento correspondente ao gene da subunidade II da ATP sintase de cana-
de-açúcar foi clonado sob controle do promotor Ubi1 de milho e terminador 3´ NOS no vetor
de expressão pUBILN (Camargo, 2007). O vetor utilizado para transformação de cana-de-
açúcar foi denominado pUBILN:ScatpG (Figura 5). Discos foliares embriogênicos e calos de
cana-de-açúcar da variedade australiana Q208 foram co-bombardeados em experimentos de
transformação, com os vetores pUBILN:ScatpG e com o vetor pUKN (SRA, AU) que confere
resistência à geneticina, antibiótico utilizado para seleção em meio de cultura dos eventos
transformados.
Figura 5. A: Diagrama do vetor pUBLIN:ScatpG. O gene que codifica a subunidade II da ATPsintase de cana-de-açúcar foi clonado sob controle do promotor Ubi1 de milho e terminador 3´ NOS. Os sítios de restrição das enzimas mais relevantes são indicados. O plasmídeo possui resistência ao antibiótico ampicilina para seleção em bactéria.
Foram produzidos 18 eventos independentes de transformação, confirmados por
PCR de DNA genômico de folha (Figura 6). As reações foram realizadas com
oligonucleotídeos específicos para a amplificação do cassete de expressão pUBI:ScatpG:NOS,
nas quais o primer direto anela-se ao gene alvo enquanto o primer reverso anela-se ao
terminador NOS.
Figura 6: PCR de DNA genômico de folha dos 18 eventos de cana-de-açúcar usando primers específicos para a confirmação da integração do cassete de expressão. L: Marcador de peso
22
molecular Gene Ruler 1KB (Thermo Scientific, USA). C+: Controle positivo (vetor pUBILN:ScatpG). C-: Controle negativo (água). WT: Selvagem. Tamanho da banda esperado: 431 pb. Primer direto liga-se ao gene alvo enquanto o primer reverso liga-se ao terminador NOS.
As plantas regeneradas foram transferidas para meio de propagação e meio de
enraizamento e posteriormente foram transferidas para solo em casa de vegetação até
atingirem 3 meses de idade para primeira análise de tolerância a estresses abióticos (Figura
7).
Figura 7: Dezoito eventos de cana-de-açúcar transgênica e selvagem transferidos para solo. A e B: Plantas recém- transferidas para solo mantidas por dois dias em ambiente úmido e escuro antes de serem transferidas para casa de vegetação. C e D: Plantas transferidas para aclimatação em casa-de-vegetação.
Para avaliar a expressão do gene alvo nas plantas transgênicas de cana-de-açúcar
foi realizada uma análise quantitativa por PCR em tempo real específica para a amplificação
do cassete de expressão, confirmando a expressão do transgene em todos os eventos e
unicamente nas plantas transformadas, já que o selvagem apresentou expressão zero
(ausência de expressão do gene analisado) (Figura 8).
A B
C D
23
Figura 8: Perfil de expressão do transgene em 18 eventos e selvagem para confirmação da expressão do cassete pUBI:ScatpG:NOS. Plantas de cana-de-açúcar com aproximadamente 1 mês de idade mantidas em casa de vegetação sob condições normais de irrigação. Expressão relativa ao evento 6. n=3. WT= selvagem.
Avaliação da resposta de plantas transgênicas de cana-de-açúcar ao estresse
hídrico
A avaliação da resposta à seca das plantas transformadas foi dividida em dois
experimentos realizados em casa-de-vegetação: o primeiro experimento (poucas réplicas e
todos os eventos) foi realizado para escolher os melhores fenótipos para serem usados no
segundo experimento (muitas réplicas e poucos eventos).
O primeiro experimento consistiu em plantas transgênicas dos 18 eventos
confirmados e selvagens de cana-de-açúcar delineadas em blocos casualizados com três
repetições, mantidas sob condições normais de rega até atingirem três meses de idade. Em
seguida as plantas foram expostas a capacidades de pote diferentes e decrescentes (70%,
50%, 30%) determinadas através do peso e período de suspensão total de rega e
reidratação. O evento 10 não resistiu à transferencia para pote e aclimatação em casa-de-
vegetação, não sendo portanto avaliado neste experimento.
A taxa fotossintética (A) declinou conforme o aumento do estresse (capacidades
de pote menores) (Figura 9). Os eventos não apresentaram diferenças estatísticas
significantes de A entre as capacidades de pote 100, 70 e 50% (Figura 9). Foi possível dividir
os eventos em dois grupos de planas de acordo com a diferença na taxa fotossintética entre
100% e 30% de capacidade de pote. O primeiro grupo consiste de plantas mais suscetíveis à
seca, ou seja, com taxa fotossintética a 30% de capacidade de pote (CP) significativamente
0
10
20
30
40
50
60
1 13 14 4 12 9 8 11 2 18 7 17 10 5 3 16 15 6 WT
Exp
ress
ão R
ela
tiva
Eventos
Expressão do transgene em plantas de Cana em casa-de-vegetação
24
menor que a taxa observada em plantas com 100% de CP. O segundo grupo, na maioria dos
eventos, apresentou taxas fotossintéticas a 30% de CP também inferiores às taxas
observadas a 100% de CP, mas essas diferenças foram menores e não significativas
estatisticamente (Figura 9). Dessa forma, a maioria dos eventos (E4, E7, E12, E5, E16, E11,
E6, E14, E8, E9 e E1) sofre menos com o estresse, mantendo a taxa de fotossíntese,
enquanto que os eventos 15, 18, 17, 2, 13 e 12 mais o selvagem sofrem mais com o estresse,
apresentando um declínio significativo da mesma (Figura 9).
Figura 9: Fotossíntese (A) de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar com três meses mantidas em casa- de-vegetação sob diferentes capacidades de pote. n=3. ANOVA F (p=0.00) e teste Tukey (Alpha=0,05). CP= capacidade de pote. WT= selvagem. *= diferenças estatísticas significativas entre capacidade de pote 100% e 30% de um mesmo evento.
Os eventos também apresentaram uma variação pequena e não estatisticamente
significativa de tamanho (Figura 10A) e de crescimento durante o experimento (Figura 10B).
Análises de correlação linear entre a expressão relativa do transgene e o tamanho das
plantas antes do estresse, o crescimento durante o experimento e a fotossíntese durante o
estresse de 30% de capacidade de pote apresentaram uma correlação linear fraca, já que os
valores dos coeficientes de determinação são muito próximos de zero (Figura 11).
25
Figura 10: A: Altura do caule de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar inicialmente com três meses de idade mantidas em casa-de-vegetação sob diferentes capacidades de pote durante 1 mês de experimento. A, AB e B = grupos estatísticos segundo ANOVA com significante F (p=0,02) e teste de Tukey (Alpha=0,05) para capacidade de pote 100%. B: Crescimento (diferença entre altura das plantas no final do experimento e no início) de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar inicialmente com três meses de idade mantidas em casa-de-vegetação sob diferentes capacidades de pote durante 1 mês de experimento,. n=3. PC= capacidade de pote. WT= selvagem.
Figura 11: Gráfico de dispersão dos dados de expressão gênica, crescimento, fotossíntese e altura. A: Correlação entre crescimento e expressão relativa do transgene. B: Correlação entre fotossíntese durante o estresse de 30% de capacidade de pote e expressão relativa do transgene. C: Correlação entre altura das plantas transformadas com três meses de idade e expressão relativa do transgene. CP= capacidade de pote. Y= equação da reta. R2= coeficiente de determinação linear.
Ao longo do experimento, através do peso do pote medido diariamente e a
quantidade de água adicionada para se atingir a capacidade de pote desejada, foi possível
inferir a quantidade de água perdida (consumida e evaporada pela planta) em cada pote,
26
considerada como uso da água (Figura 12 A). Os transgênicos apresentaram uma perda
menor (números absolutos em gramas) de água do que o selvagem (Figura 12A). Ao final do
experimento, foi recolhido o total de massa seca (colmo, folhas e perfilho), de maneira que o
selvagem apresentou o maior acúmulo de massa (Figura 12B).
Figura 12: A: Perda de água por pote (água consumida e perdida por evaporação por plantas transgênicas de cana-de-açúcar). ANOVA com valor de F não- significativo (p= 0,22), n=3. B: Biomassa total de plantas transgênicas de cana-de-açúcar (massa seca do colmo, folhas e perfilho). ANOVA com valor de F não- significativo (p= 0,20), n=3. WT= selvagem.
A fim de relacionar os parâmetros analisados com o uso da água, outra
característica associada à resposta ao estresse hídrico em cana-de-açúcar, a WUE (eficiência
do uso da água), também foi calculada. Duas formas de WUE foram analisadas: a eficiência
do uso da água da produtividade (Figura 13) e a eficiência do uso da água da fotossíntese
(Figura 14). Para analisar a WUE da produtividade, dois cálculos foram realizados: o primeiro
foi a razão entre o crescimento e a quantidade de água perdida por pote por dia ao longo do
experimento (Figura 13A) e o segundo foi a razão entre a biomassa (massa seca total final) e
a quantidade de água perdida (Figura 13B). Os eventos e o selvagem não apresentaram
diferenças na eficiência do uso da água da produtividade, não sendo esse um parâmetro
interessante para diferenciá-los quanto ao desempenho durante estresse por seca.
27
Figura 13: Eficiência do uso da água (WUE) da produtividade de plantas transgênicas de cana-de-açúcar. A: Razão entre o crescimento (cm) e a quantidade de água (g) consumida e perdida por evaporação por plantas transgênicas de cana-de-açúcar. ANOVA com valor de F não- significativo (p= 0,45), n=3. B: Razão entre a material seca total (biomassa) (g) e a quantidade de água (g) consumida e perdida por evaporação por plantas transgênicas de cana-de-açúcar. ANOVA com valor de F não- significativo (p= 0,59), N=3. WT= selvagem.
A eficiência do uso da água da fotossíntese foi calculada através da razão entre a
razão entre a fotossíntese no estresse 30% de capacidade de pote e a taxa de transpiração
na mesma condição (Figura 14). Não houve diferenças estatísticas entre eventos e selvagem
(Figura 14).
Figura 14: Eficiência do uso da água (WUE) da fotossíntese de plantas transgênicas de cana-de-açúcar. Razão entre a fotossíntese no estresse 30% de capacidade de pote e a taxa de transpiração na mesma condição. ANOVA com valor de F não-significativo (p=0,49). WT= selvagem.
De maneira geral, os transgênicos sofrem menos com o estresse, mantendo a
fotossíntese (Figura 9). O objetivo do primeiro experimento foi escolher eventos que
possuem um fenótipo que melhor responde ao estresse hídrico dentre os 18 eventos. Dessa
forma, foram escolhidos os eventos 1 e 14 para uma investigação mais profunda da
fotossíntese em resposta à seca pelos seguintes motivos: o evento 1 apresenta a maior
expressão do transgene, os dois eventos fazem parte do grupo que sofreu menos com o
28
estresse (pouca diferença da fotossíntese quando submetidos a 100% capacidade de pote e
a 30% capacidade de pote). Além disso, o evento 14, mesmo apresentando tamanho similar
ao selvagem apresenta uma eficiência do uso da água melhor que a maioria dos eventos
transgênicos e do que o selvagem, mesmo que não estatisticamente relevante na população
(Figura 13).
Assim, no segundo experimento apenas clones dos eventos 1 e 14 e do selvagem
foram utilizados para coleta de dados. O experimento foi delineado em blocos casualizados
com sete repetições, sendo colocado em cada bloco plantas com tamanhos aproximados, de
forma que as diferenças de tamanho estão principalmente entre os blocos, não dentro dos
blocos, apesar do evento 1 ser ligeiramente menor que os demais (Figura 15). Os dados
foram coletados a 50%, 25% e 0% de capacidade de pote. Porém, como controle irrigado, em
cada bloco foram mantidas plantas transformadas e não-transformadas a 100% de
capacidade de pote.
Figura 15: A: Altura do caule de plantas transgênica e selvagem de cana-de-açúcar mantidas a 100% de capacidade de pote. ANOVA com valor de F significativo (p=0,00) e teste de comparação de médias Tukey (Alpha= 0.05), n= 14. A e B = grupos estatísticos B: Altura do caule de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar mantidas a 100% de capacidade de pote, mostrando a diferenças entre blocos. ANOVA com valor de F significativo (p=0,00) e teste de comparação de médias Tukey (Alpha= 0.05), N= 14. Letras em maiúsculo = grupos estatísticos. WT= selvagem.
As plantas mantidas a 100% de capacidade de pote apresentaram maior
crescimento do que as plantas submetidas ao estresse hídrico. Porém, não houve diferenças
significativas entre os eventos e o selvagem (Figura 16).
29
Figura 16: Crescimento do caule de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar submetidas ao estresse hídrico. Plantas controle: plantas mantidas a 100% de capacidade de pote. Plantas estressadas: plantas submetidas ao estresse hídrico, diminuindo a capacidade de pote gradativamente, dados coletados ao final do experimento de 1 mês de duração, quando as plantas estavam submetidas ao estresse de aproximadamente 0% de capacidade de pote. Fatorial ANOVA com F significante para evento (p=0,0012), com F significante para tratamento (p= 0,00) e F não significante para evento e tratamento (p=0,48). Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0.05), n= 7. Letras em maiúsculo = grupos estatísticos. WT= selvagem.
Durante a queda gradativa da capacidade de pote os parâmetros como taxa
fotossintética, condutância estomática, PhiPS2, ETR e Fv/Fm também foram decrescendo,
como esperado, mostrando que as plantas estavam sofrendo com a falta de água (Figura
17). Porém, entre as capacidades de pote 100% e 50% pouca diferença foi encontrada, ou
seja, as plantas ainda não estão estressadas o suficiente para repercutir em uma baixa
eficiência fotossintética. As diferenças estão principalmente entre os tratamentos 100 e
50%, comparativamente aos tratamentos 25% e 0%, já que os eventos transgênicos e o
selvagem comportaram-se de maneira igual durante o estresse, comprovando que as
plantas sofrem com o estresse, mas sofrem da mesma forma.
30
Figura 17: A: Taxa fotossintética de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar quando submetidas a estresse hídrico. Fatorial ANOVA com F não significante para tratamento e evento (p=0,41), com F significante para tratamento (p= 0,00) e F não significante para evento (p=0,47). Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0,05), n= 7. Letras em maiúsculo = grupos estatísticos. B: Condutância estomática (gs) de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar quando submetidas a estresse hídrico. Fatorial ANOVA com F não significante para tratamento e evento (p=0,78), com F significante para tratamento (p= 0,00) e F não significante para evento (p=0,83). Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0,05), n= 7. Letras em maiúsculo = grupos estatísticos. C: Rendimento quântico efetivo do PSII (PhiPS2) de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar quando submetidas a estresse hídrico. Fatorial ANOVA com F não significante para tratamento e evento (p=0,93), com F significante para tratamento (p= 0,00) e F não significante para evento (p=0,90). Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0,05), n= 7. Letras em maiúsculo = grupos estatísticos. D: Taxa de transporte de elétrons (ETR) de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar quando submetidas a estresse hídrico. Fatorial ANOVA com F não significante para tratamento e evento (p=0,97), com F significante para tratamento (p= 0,00) e F não significante para evento (p=0,95). Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0,05), n= 7. Letras em maiúsculo = grupos estatísticos. E: Rendimento quântico máximo do PSII (Fv/Fm) de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar quando submetidas a estresse hídrico. Fatorial ANOVA com F não significante para tratamento e evento (p=0,95), com F significante para tratamento (p= 0,00) e F não significante para evento (p=0,66). Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0,05), n= 7. Letras em maiúsculo = grupos estatísticos. E1= evento 1, E14= evento 14 e WT= selvagem.
A assimilação de carbono decai principalmente a partir da capacidade de pote
50% (Figura 17A), reflexo do fechamento estomático (Figura 17B) e também da deficiência
do PSII em absorver luz e usá-la nas reações fotoquímicas (Figura 17C). O decaimento da
31
taxa de transporte de elétrons (Figura 17D) e o decaimento da Fv/Fm (< 0,8) (Figura 17E),
sugerem processos de fotoinibição resultantes de estresse ambientais (Ogren and Sjostrom,
1990), ou seja, mudanças na eficiência de processos não-fotoquímicos. Ambos fatores
podem explicar a baixa eficiência do PSII (Maxwell and Johnson, 2000).
O quenching fotoquímico (qP) é a dissipação da fluorescência da clorofila
associada às reações fotoquímicas, relacionado com a quantificação da energia de excitação
capturada pelos centros de reação abertos (Quinona a oxidada), representando a fração
“aberta” do PSII em relação à fração total desse fotossistema (Hall, 1993; Krause and Weis,
1991).
Para acessar o qP durante o estresse, uma curva de indução foi feita, de forma
que plantas adaptadas ao escuro foram submetidas a consecutivos pulsos de saturação
(período de 20s entre pulsos) durante a aplicação de luz actínia (Figura 18). Espera-se que o
qP decresça na proporção que os centros de reação são fechados, ou seja, redução da Qa
(Quinona a) (Hall, 1993). Quando as plantas são mantidas a capacidade de pote de 50% não
há diferença no decaimento do qP em relação às plantas mantidas a 100% capacidade de
pote e os valores de qP são mantidos ao longo do período de medição (Figura 18A). Também
não há diferenças entre os eventos e selvagem quando submetidos a essas capacidades de
pote (Figura 18A). Porém, quando as plantas são submetidas ao estresse de 25% de
capacidade de pote, passam a existir diferenças estatisticamente significantes de qP entre
tratamentos, de forma que os eventos e o selvagem apresentam valores maiores de qP
durante o estresse e também um decaimento desses valores ao longo do tempo, resultado
de uma maior proporção de centros de reação fechados durante o tempo, devido à
saturação da fotossíntese pelo estresse (Maxwell et al., 1994; Maxwell and Johnson, 2000)
(Figura 18B). Porém, não existem diferenças estatísticas entre os eventos e selvagem (Figura
18B). Da mesma forma, quando submetidas ao estresse de 0% de capacidade de pote, as
plantas estressadas apresentam valores de qP maiores e o declínio desses valores é mais
evidente do que a 25% de capacidade de pote (Figura 18C). Novamente, diferenças
estatisticamente significantes dos valores de qP entre tratamentos existem, com os eventos
e o selvagem apresentam valores maiores de qP durante o estresse (Figura 18C). Também
existem diferenças estatísticas entre evento 14 controle e evento 14 a 0% capacidade de
pote e entre selvagem controle e a 0% capacidade de pote, enquanto que para o evento 1
quase não houve diferença entre os tratamentos. Assim, pode-se dizer que os valores de qP
32
são mais afetados devido ao estresse no evento 14 e no selvagem, do que no evento 1
(Figura 18C).
Figura 18: A: Quenching fotoquímico (qP) de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar quando submetidas a estresse hídrico 50% capacidade de pote. Fatorial ANOVA com F não significante (p=0,95) Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0,05), n= 7. B: Quenching fotoquímico (qP) de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar quando submetidas a estresse hídrico 25% capacidade de pote. Fatorial ANOVA com F não significante (p=0,99) Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0,05), n= 7. C: Quenching fotoquímico (qP) de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar quando submetidas a estresse hídrico 0% capacidade de pote. Fatorial ANOVA com F não significante (p= 0,99). Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0,05), n= 7. Tempo: medições realizadas a cada 20s durante aplicação de luz actínia após período de adaptação ao escuro. CP= capacidade de pote. E1= evento 1, E14= evento 14 e WT= selvagem.
O quenching não-fotoquímico (NPQ) é o decréscimo da fluorescência associado
principalmente à dissipação termal de energia de excitação (Pospisil, 1997), e reflete o
excesso de energia liberado em forma de calor.
Novamente as medidas realizadas durante a capacidade de pote 50% não
mostram diferenças significativas quando compradas à situação controle e também quanto
ao comportamento dos eventos e do selvagem durante o estresse (Figura 19A). No ponto t8
(NPQ máximo), quando o evento 14 e selvagem são submetidos ao estresse 25% CP, os
valores de NPQ em relação ao controle são maiores estatisticamente (Figura 19B) e quando
as plantas são submetidas à capacidade de pote 0%, os valores do NPQ do selvagem
continuam maiores estatisticamente em relação ao controle (Figura 19C). Dessa forma,
pode-se considerar que o evento 1 sofre menos com a fotoinibição durante o estresse do
33
que o evento 14 e o selvagem.
Figura 19: A: Quenching não-fotoquímico (NPQ) de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar quando submetidas a estresse hídrico 50% capacidade de pote. Fatorial ANOVA com F não significante (p=0,07) Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0,05), n= 7. B: Quenching não-fotoquímico (NPQ) de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar quando submetidas a estresse hídrico 25% capacidade de pote. Fatorial ANOVA com F não significante (p=0,60) Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0,05), n= 7. C: Quenching não-fotoquímico (NPQ) de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar quando submetidas a estresse hídrico 0% capacidade de pote. Fatorial ANOVA com F não significante (p= 0,99). Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0,05), n= 7. Tempo: medições realizadas a cada 20s durante aplicação de luz actínia após período de adaptação ao escuro. CP= capacidade de pote. E1= evento 1, E14= evento 14 e WT= selvagem.
Os eventos apresentam uma quantidade ligeiramente maior de ATP em relação
às plantas selvagens (Figura 20), que apresentam uma leve diminuição dos níveis de ATP
após o período de estresse hídrico, revelando indícios de regulação da quantidade de ATP
como consequência desse estresse (Figura 20). As diferenças estatísticas não significativas
podem ter ocorrido em razão do reduzido número amostral (n=3). Dessa forma, ainda não se
pode concluir que o melhor desempenho do evento 1 em relação ao evento 14 e ao
selvagem se deve à maior produção de ATP pelo complexo enzimático da ATP sintase.
34
Figura 20: Quantidade relativa de ATP em cloroplastos de folha +1 de cana-de-açúcar submetidas ao estresse hídrico. Plantas controle= plantas mantidas a 100% de capacidade de pote. Plantas estressadas= plantas submetidas ao estresse hídrico, diminuindo a capacidade de pote gradativamente, dados coletados ao final do experimento de 1 mês de duração, quando as plantas estavam submetidas ao estresse de aproximadamente 0% de capacidade de pote. Fatorial ANOVA com F não significante (p=0,4). Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0,05), n= 3. Letras em maiúsculo = grupos estatísticos. E1= evento 1, E14= evento 14 e WT= selvagem.
A fim de quantificar o conteúdo de subunidade II da ATP sintase nas plantas
transgênicas e selvagens sob situação controle e após estresse, anticorpos específicos para essa
subunidade (Agrisera, EUA) foram usados em ensaios de Western blot. Porém, a proteína alvo não
foi detectada em plantas transgênicas, nem no selvagem depois da revelação dos filmes. Isso pode
se dever ao fato do anticorpo comercial não capaz de detectar eficientemente a proteína de cana-
de-açúcar, apesar de informações do fabricante preverem a utilização em uma grande gama de
monocotiledôneas.
Avaliação dos efeitos do estresse salino e oxidativo em folhas de plantas transgênicas
Também foram avaliados os efeitos dos estresses salino e oxidativo em folhas
dos eventos transgênicos 1 e 14 e do selvagem (Figuras 21 e 22).
35
Figura 21: Estresse salino em discos foliares de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar. WT= selvagem. E1= evento 1. E14= evento 14. A. Discos foliares submetidos a diferentes concentrações de NaCl em meio MS líquido. Foto de uma das triplicatas do experimento. B. Quantificação de Clorofila a. Fatorial ANOVA F (p>0.05), n=3.
Figura 22: Estresse oxidativo em folhas de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar. WT= selvagem. E1= evento 1. E14= evento 14. A. Discos foliares submetidos a diferentes concentrações de H2O2 em meio MS líquido. Foto de uma das triplicatas do experimento. B. Quantificação de Clorofila a. Fatorial ANOVA F (p>0.05), n=3.
No experimento de estresse salino, nenhum dos eventos ou o selvagem
apresentou mudanças estatisticamente significativas na quantidade dos pigmentos com o
aumento da salinidade. Isso pode ter ocorrido devido ao estresse não ter sido severo ou
longo o suficiente para que houvesse a perda significativa de pigmentação. Com o aumento
das concentrações de H2O2, ocorre o declínio na quantidade de clorofila, porém as diferenças
entre eventos e selvagem também não são significativas.
Avaliação da expressão do gene ScatpG em folhas de plantas transgênicas
Como parte da caracterização funcional desse gene ScatpG e tentativa de relacionar
sua expressão com a seca, foi traçado o perfil de expressão do gene endógeno que codifica a
subunidade II e do transcrito derivado do cassete pUBI:ScatpG:NOS. Também foi quantificada a
expressão do gene que codifica a subunidade Delta da ATP sintase de cana, para verificar se a
superexpressão de uma subunidade pode acarretar na indução de expressão de outra, ou até
mesmo do complexo inteiro, devido ao estresse. Para tal foram empregadas plantas transgênicas e
selvagens de cana-de-açúcar em situação controle e após estresse hídrico, através de análises
quantitativas por PCR em tempo real (Figura 23). Oligonucleotídeos específicos para a sequência
codificante do gene da subunidade II bem como do transgene foram desenhados.
36
Figura 23: Perfil de expressão de plantas transgênicas e selvagem de cana-de-açúcar em situação controle e após estresse hídrico A: Perfil de expressão do gene que codifica a subunidade Delta da ATP sintase de cana-de-açúcar. Expressão relativa ao selvagem controle. Fatorial ANOVA com F não significante (p=0,55). Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0,05). B: Perfil de expressão do gene endógeno que codifica a subunidade II mais do cassete pUBI:ScatpG:NOS. Expressão relativa ao selvagem controle. Fatorial ANOVA com F não significante (p=0,90). Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0,05). C: Perfil de expressão do cassete pUBI:ScatpG:NOS. Expressão relativa ao evento 14 estressado. Fatorial ANOVA com F não significante (p=0,77). Teste de comparação de médias LSD (Alpha= 0,05). Plantas controle= plantas mantidas a 100% de capacidade de pote. Plantas estressadas= plantas submetidas ao estresse hídrico, diminuindo a capacidade de pote gradativamente, dados coletados ao final do experimento de 1 mês de duração, quando as plantas estavam submetidas ao estresse de aproximadamente 0% de capacidade de pote. E1= evento 1, E14= evento 14 e WT= selvagem. n=3. Letras em maiúsculo = grupos estatísticos.
A subunidade Delta não apresentou diferenças na expressão devido ao estresse
hídrico (Figura 23A), enquanto que a subunidade II apresenta uma tendência de redução na
expressão devido a esse estresse, apesar das diferenças entre as médias não serem
estaticamente significantes (Figura 23B), mas que concordam com os dados de
experimentos realizados em plantas com 7 meses em campo, submetidas a estresse (G.M.
Souza, IQ-USP, dados não publicados). Apesar das plantas transgênicas apresentarem forte
expressão do cassete introduzido, que emprega o promotor da ubiquitina de milho (Figura
23C), o impacto nos níveis totais dos transcritos da subunidade II foi pequeno e não
estatisticamente significativo, em relação ao selvagem (Figura 23B).
Dessa forma, os perfis de expressão descritos acima podem explicar as
pequenas diferenças encontradas nas análises fisiológicas entre a maioria dos transgênicos e
37
o selvagem, já que os níveis de expressão da subunidade II são praticamente iguais. Ainda
assim, pode-se observar que há uma tendência de que a produção de ATP nas plantas
transgênicas é maior que nas plantas selvagens (Figura 20). Adicionalmente, o evento 1
apresenta maiores níveis de expressão da subunidade II, em linha com um provável maior
nível de ATP, que estão alinhados com uma melhor performance fotossintética desse evento
em relação ao selvagem durante o estresse hídrico descritos nas figuras 9, 18B e C e 19B e C,
nas quais o evento 1 mantém mais próximo do controle os valores da taxa fotossintética (A),
qP e NPQ durante o estresse aplicado.
Para entender melhor os resultados obtidos das plantas transgênicas de cana
produzidas nesse trabalho, foi utilizado um estudo sobre o transcriptoma de folha de cana-
de-açúcar empregando RNAseq (Mattiello, 2015). A análise consiste na comparação da
expressão do gene da poliubiquitina e da subunidade II da ATP sintase em partes diferentes
da folha de cana-de-açúcar (Figura 24), a fim de inferir sobre o nível de atividade dos
promotores dos genes.
Figura 24: Perfil de expressão do gene da Poliubiquitina e da ATP sintase Subunidade II ao longo da folha+1 de cana-de-açúcar. P= ponta (terço superior da folha+1). M= meio (terço médio da folha+1). B= base (terço inferior da folha+1). ANOVA F (p<0.01), n=4 e 3, teste LSD (Alpha=0.05).
Os perfis de expressão descritos acima podem explicar o baixo impacto nos
níveis totais dos transcritos da subunidade II, uma vez que a expressão endógena do gene é
muito alta, três vezes maior que a do gene da poliubiquitina que é expresso
constitutivamente e é amplamente utilizado como normalizador (Papini-Terzi et al., 2005).
Considerando que os níveis de atividade dos promotores da poliubiquitina de cana-de-
açúcar e de milho são similares (Wei et al., 2003), podemos concluir que o promotor de
BB B
A A A
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
P M B
RP
KM
Poliubiquitina
ATP sintaseSubuidade II
38
milho empregado na construção do cassete de expressão não foi forte o suficiente para
aumentar significativamente os níveis de transcritos da subunidade II. Dessa forma, o
acréscimo na expressão da ATP sintase nas plantas transgênicas pode ter sido insuficiente
para gerar algum fenótipo contrastante.
Conclusão
Do trabalho descrito pode-se concluir que a sequência isolada corresponde ao
gene ScatpG, que codifica a subunidade II da ATP sintase de cloroplasto de cana-de-açúcar.
Também foi possível inferir que o promotor do gene ScatpG é mais forte que o promotor da
poliubiquitina, resultando em um pequeno acréscimo na expressão de ScatpG nas plantas
transgênicas e consequentemente, na ausência de fenótipo claro. Apesar da escolha do gene
ter sido proveniente de ensaios anteriores de seca em cana-de-açúcar, os níveis de
expressão do gene ScatpG não são claramente modulados pela seca. É provável que outros
fatores influenciem a expressão do gene em questão, assim como é possível que as
diferentes condições de estresse por seca aplicados nos experimentos discutidos, possam ter
refletido em respostas diferentes.
Materiais e métodos
Obtenção e confirmação do gene candidato
O cluster do SUCEST correspondente ao gene selecionado (SCACSD2014C10.g)
não possui a região codificante completa. A sequência completa de nucleotídeo da
subunidade da ATP sintase de cana-de-açúcar foi obtida por análises in silico, provenientes
do sequenciamento do genoma da cana-de-açúcar, realizado por um grupo de cientistas
vinculados ao Programa FAPESP de Pesquisa em Bioenergia (BIOEN), coordenado pela Dra.
Glaucia Mendes Souza (IQ, Universidade de São Paulo- USP).
A construção da árvore filogenética de máxima verossimilhança se deu através
do programa MEGA5 (Tamura et al., 2011). Foi utilizado o modelo de evolução de
sequências de WAG, usando o programa de alinhamento múltiplo webPRANK (Loytynoja and
Goldman, 2010).
A partir da sequência obtida, primers direto e reverso (GGA TCC ATG GCC ACG
GCT e ACG CGT TCA GGC GGA TGG) foram desenhados para a amplificação da região
codificante completa, possuindo sítios das enzimas de restrição BamHI e MluI (Thermo
39
Scientific, EUA) respectivamente, para posterior clonagem direcional nos vetores de
expressão.
A reação de amplificação foi realizada com a enzima Phusion High-Fidelity DNA
polimerase (Thermo Scientific, EUA), seguindo protocolo específico para produtos com alto
conteúdo de GC.
Foram utilizados 1,0 µL de DNA, 0,4 µL dNTP (10 mM), 1,0 µL de primer direto
(10 µM), 0,1 µL primer reverso (10 µM), 4,0 µL tampão GC Phusion HF 5x, 0,2 µL Phusion
High-Fidelity polimerase, 11,8µL de água Milli-Q e 0,6 µL DMSO. Essa reação foi submetida
ao seguinte programa de amplificação: 30 segundos à 98°C, mais 35 ciclos de 10 segundos a
98°C, 30 segundos a 60°C, 1 minuto a 72°C e uma extensão final de 7 minutos a 72°C.
O produto correspondente ao tamanho esperado (642 pb) foi extraído do gel de
agarose 1%, purificado com o Kit GeneJETTM Gel Extraction (Thermo Scientific, EUA) e
clonado no vetor pTZ57R/T (Thermo Scientific, EUA). Para tal, foi preciso submeter o
produto da PCR a uma reação de adenilação, que consistiu em 5 µL do produto purificado,
0,5 µL de enzima Taq polimerase (Thermo Scientific, EUA), 0,2 µL dATP (10 mM), 1 µL de
tampão Taq 10 x, 0,6 µL MgCl2 (25 mM) e 2,7 µL de água Milli-Q, colocada à 72°C por 30
minutos.
O vetor pTZ57R/T contendo o gene da subunidade II da ATP sintase foi
transformado em Escherichia coli DH5α termo-competentes que foram estriadas em placas
de Petri contendo meio LB com ampicilina 50 µg/mL e incubadas à 37°C pelo período de 16
horas. Colônias isoladas foram inoculadas em 5 mL de meio de cultura LB líquido com o
antibiótico adequado e incubada à 37°C por 16 horas sob agitação de 250 rpm. Alíquotas de
850 µL das culturas bacterianas foram separadas e acrescidas de 150 µL de glicerol 50%
(w/v) e armazenadas a -80°C para estoque permanente. O restante das suspensões
bacterianas foi utilizado para minipreparação de DNA plasmidial por lise alcalina utilizando o
kit “QIAprep Spin Miniprep Kit” (Qiagen®, EUA), segundo orientações do fabricante. Os
plasmídeos extraídos foram confirmados por digestão com as enzimas BamHI + XbaI e SacI
(Thermo Scientific, EUA) e por sequenciamento utilizando os primers M13/PUC (-20) direto e
reverso.
Localização subcelular
A região codificante do gene ScatpG foi clonada sem códon de parada no vetor
Gateway pENTR/D-TOPO (Life Technologies, EUA) e confirmada por sequenciamento. A
40
recombinação foi realizada através da enzima LR Clonase (Life Technologies, EUA) com o
vetor de destino pB7WG2 (Karimi et al., 2002) promovendo a fusão C-terminal da proteína
verde fluorescente GFP. O ensaio foi realizado através da agroinfiltração de folhas de
Nicotiana benthamiana de acordo com o protocolo de (Sparkes et al., 2006).
Construção do vetor de expressão para transformação de cana-de-açúcar
O fragmento correspondente ao gene da subunidade II da ATP sintase de cana-
de-açúcar foi retirado do vetor de subclonagem pTZ57R/T com as enzimas de restrição
BamHI e MluI, extraídos de gel de agarose 1% e purificados com o Kit GeneJETTM Gel
Extraction (Thermo Scientific, EUA) para clonagem direcionada no vetor de expressão
pUBILN (Camargo, 2007) correspondente ao vetor pAHC17 (Christensen and Quail, 1996)
com o sítio de múltipla clonagem modificado. O vetor pUBILN foi digerido com as mesmas
enzimas de restrição e o produto da digestão correspondente ao vetor também foi extraído
e purificado de gel de agarose 1%. Os fragmentos contendo o gene alvo e o vetor pUBILN
foram ligados pela ação da enzima T4 DNA ligase (Thermo Scientific) à 4°C, por 16 horas. O
vetor final para transformação de cana-de-açúcar foi denominado pUBILN:ScatpG e foi
transformado em E. coli DH5α termo-competentes. As colônias que foram confirmadas por
digestão com as enzimas de restrição BamHI e MluI e tiveram sua sequência validada por
sequenciamento foram armazenadas a -80°C para estoque permanente.
Transformação genética de cana-de-açúcar via biobalística
A transformação genética de cana-de-açúcar via biobalística e as análises
fisiológicas dos transgênicos foram realizadas no Instituto SRA-Sugar Research Australia
(Austrália) supervisionado pelo pesquisador Dr. Prakash Lakshmanan.
Ponteiros de plantas saudáveis de cana-de-açúcar da variedade australiana Q208
com aproximadamente sete meses de idade tiveram suas folhas removidas até a obtenção
do palmito (aproximadamente 3 mm de diâmetro), que foi cortado transversalmente,
produzindo discos foliares com 2- 3 mm de espessura. Os discos obtidos foram transferidos
para meio MS padrão (Murashige and Skoog, 1962) com 2,4-D (1 mg/L) no escuro por 2-3
semanas para produção de discos foliares embriogênicos e por 4-6 semanas para produção
de calos embriogênicos para experimentos transformação (Figura 25).
41
Figura 25. Produção de discos foliares e calos embriogênicos: A: Ponteiros de cana-de-açúcar variedade Q208. B e C: Ponteiros descascados até o palmito. D, E e F: Produção dos discos e transferência para meio MS. G: Tecido embriogênico. H: Discos foliares prontos para bombardeamento.
Nos experimentos de transformação, o vetor pUBILN:ScatpG foi co-
bombardeado com o vetor pUKN (SRA, AU) que contém a sequência codificadora do gene
nptII, da enzima neomicina fosfotransferase II, que confere resistência ao antibiótico
geneticina, sob controle do promotor do gene da poliubiquitina de milho (Ubi -1) e do
terminador NOS do gene da nopalina sintase de Agrobactéria.
Após o bombardeamento, os calos foram transferidos para meio MS contendo
geneticina (30 mg/L) e 2,4- D (1 mg/L) e mantidos no escuro por 4-6 semanas para seleção
dos transformantes. Após o período de escuro, os tecidos regenerados foram transferidos
para meio seletivo sem 2,4-D e mantidos na luz (fotoperíodo 16/8), sendo repicados a cada 3
semanas (Figura 26).
H
F
D
B A
C
E
G
42
Figura 26. Seleção e regeneração de plântulas a partir de tecido embriogênico de cana-de-açúcar: A: Calos em meio seletivo. B: Plântula regenerada a partir de calo bombardeado em meio seletivo, considerada um evento único. C: Plântulas clones de um mesmo evento individualizadas em meio de propagação. D: Plântulas clones individualizadas em meio de enraizamento.
As plantas regeneradas foram transferidas para meio de propagação (meio MS
padrão com adição do hormônio sintético BAP (1,2mg/L), a fim de produzir o maior número
de clones de cada evento e posteriormente para meio de enraizamento (meio com metade
da concentração de MS), a fim de preparar os clones para transferência ao solo.
Os clones foram mantidos em meio de cultura, sendo que 3 clones de cada
evento e do selvagem (não contendo o transgene, mas que passaram por todo o processo de
transformação) transferidos para pote contendo 60% de solo e 40% de areia. Esses clones
foram mantidos em casa-de-vegetação até atingirem 3 meses de idade para primeira análise
de tolerância a estresses abióticos.
PCR de DNA genômico e RT- qPCR
Para confirmação por PCR, DNA genômico foi extraído de tecido de folha
processada em FastPrep-24 em 200 uL de tampão TPS (100mM Tris pH 9,5, 1M KCl, 10mM
EDTA). Óligos específicos para amplificação da construção foram desenhados e foram
realizadas reações de PCR usando as especificações para amplificação da Go Taq Green
Master Mix (Promega).
Para avaliar a expressão do gene alvo nas plantas transgênicas de cana-de-açúcar
foi realizada uma análise quantitativa por PCR em tempo real. Para tal, RNA total foi extraído
de 50 mg de folha de plantas transgênicas e do selvagem através do RNeasyR Mini Kit
(QIAGEM, EUA) segundo instruções do fabricante e posteriormente tratado com DNAse
(Promega RQ1 DNase, EUA). Foram usados Randons Primers (Invitrogen, EUA) e Improm -
A B
C D
43
IITM Reverse Transcriptase (Promega, EUA) para a produção de cDNA, segundo
recomendações do fabricante.
Oligonucleotídeos específicos para a amplificação do cassete de expressão,
desenhados para amplificar a porção entre a região 5’UTR da poliubiquitina de milho e
região codificante do gene da subunidade II da ATP sintase de cana, foram utilizados em um
ensaio de PCR em tempo real (Applied Biosystems, USA) com Sensi Mix SYBER Low-ROX PCR
(BIOLINE, USA) num volume total de 10 𝜇L e as corridas foram realizadas em triplicata.
Os dados foram analisados segundo o método comparativo 2-ΔΔCT (Livak and
Schmittgen, 2001). Foi usado como gene referência a região codificante do gene ADF (Fator
depolimerizador da Actina) de cana-de-açúcar.
Análise de parâmetros fotossintéticos
Os parâmetros fotossintéticos como taxa fotossintética ou fotossíntese (A) e
condutância estomática (gs) foram medidos utilizando o equipamento IRGA (LI-6400 version
5, LI-COR biotechnology, USA), numa concentração de CO2 de 400 µL L-1, intensidade de luz
de 2000 µmol m-2 s-1, fluxo de gás 500 mL min-1 e temperatura dentro da câmara de 30°C em
folhas +1, assim como dados de fluorescência, como rendimento quântico efetivo do
fotossistema II (PhiPS2) e taxa de transporte de elétrons (ETR). Parâmetros que necessitam
de plantas adaptadas ao escuro (20 minutos utilizando-se clipes foliares), como rendimento
quântico máximo do PSII (Fv/Fm) e quenching não-fotoquímico e fotoquímico foram
coletados através do fluorômetro portátil (MINI-PAM, Heinz Walz, Alemanhã).
Quantificação de ATP
A concentração de ATP no cloroplasto foi determinada através do ensaio de
bioluminescência luciferina-luciferase usando o kit CLS II (Roche Diagnostic, EUA) de acordo
com o fabricante. Para tal, cloroplastos intactos foram extraídos de acordo com Motohashi
et al. (2001) de folha +1 de cana em condição controle e após período de estresse hídrico.
Ensaios de estresse salino e oxidativo
Para a avaliação do efeito do estresse salino, discos foliares de 0,35cm (5 discos
por tratamento) de folhas dos eventos 1 e 14 e do selvagem foram colocados em MS com
diferentes concentrações de NaCl (0, 100, 200 e 300 mM) por 9 dias e foi medido o conteúdo
de clorofila A. A extração dos pigmentos foi realizada em acetona 100% e as concentrações
calculadas segundo (Lichtenthaler, 2001). O experimento foi realizado em triplicata.
44
Para avaliação do efeito do estresse oxidativo, discos foliares de plantas
transgênicas e selvagens de cana-de-açúcar medindo 0,5 cm de diâmetro serão tratados com
1 mL de peróxido de hidrogênio (H2O2) nas concentrações: 0, 0,25, 0,5, 0,75 e 1 M, por 48
horas. O experimento foi realizado em triplicata por evento. Após o período de estresse
oxidativo foi realizada a extração da clorofila total através da maceração das folhas na
presença de acetona, seguida de sua quantificação como descrito por (Lichtenthaler, 2001).
45
Capítulo II
Proteômica de cloroplasto de plantas de cana-de-açúcar
submetidas ao estresse hídrico
Este capítulo é dedicado para o melhor entendimento do funcionamento de
cloroplasto de cana-de-açúcar durante o estresse hídrico, assim como da subunidade II da
ATP sintase, possibilitando a identificação de genes com papel chave na resposta à seca para
futuros ensaios biotecnológicos.
Resultados e discussão
Aplicação do estresse hídrico e isolamento de cloroplastos de cana-de-açúcar
Plantas de cana-de-açúcar da variedade SP80-3280 foram submetidas a estresse
hídrico através de suspensão de rega em casa-de-vegetação. Para controle do estresse, a
taxa fotossintética foi avaliada ao longo do experimento e a coleta da folha+1 foi realizada
quando a diferença entre irrigado e estressado foi estatisticamente significante (Figura 1).
Figura 1: Ensaio de estresse hídrico de plantas de cana-de-açúcar em casa de vegetação. A: Plantas de cana-de-açúcar estressadas (7 dias de suspensão de rega) e controle (irrigado). B: Taxa fotossintética durante ensaio de estresse hídrico de plantas de cana-de-açúcar em casa de vegetação. * = diferença significativa entre tratamentos (p<0,01), teste de comparação de medias (teste –T), n=6. Sétimo dia= ponto de coleta.
-5.
0.
5.
10.
15.
20.
25.
30.
35.
40.
45.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A(umolCO2m
-2s-1)
Dias
Fotossíntese
Irrigado
Seca
*
A B
* *
*
46
Para análise de proteômica, cloroplastos das plantas estressadas e controle
foram isolados (Figura 2A) e através de microscopia foi verificada sua integridade (Figura
2B).
Figura 2. Isolamento de cloroplastos em cana-de-açúcar. A. Banda de cloroplastos intactos na interface entre as camadas de 40% e 80% de Percoll. B. Microscopia de cloroplastos intactos de cana-de-açúcar. 10μL da suspensão plastidial concentrada depositada em uma lâmina de vidro coberta com lamínula em aumento de 100x.
Identificação de proteínas cloroplastidiais de cana-de-açúcar
Foram identificadas 278 proteínas de cloroplasto de cana-de-açúcar (Tabela
suplementar 1), das quais 264 (95%) foram anotadas através de alinhamentos por BLAST
usando o programa Blast2GO (Conesa et al., 2005), enquanto que 14 não tiveram hit com
nenhuma outra sequência. Das sequências anotadas, 230 (87%) possuem similaridade maior
que 75% com o melhor hit encontrado. As demais (34 sequências) apresentam similaridade
superior a 50%. A espécie com maior número de melhores hits foi Sorghum bicolor, seguida
de Zea mays (Figura 3).
47
Figura 3. Distribuição das espécies de referência para os melhores hits de cada sequência proteica identificada no ensaio de proteômica, anotadas via Blast2GO, em função do nível de similaridade do alinhamento.
O programa Gene Onthology Consortium (2010) define três classes principais nas
quais os produtos dos genes podem ser associados:
1. Função Molecular: Atividade molecular desempenhada pelo produto do gene.
2. Componente celular: Onde na célula o produto do gene exerce sua função.
3. Processo biológico: Processos e vias metabólicas compostas das atividades de
vários genes e seus produtos.
Cada uma destas classes contém categorias, ou termos, organizadas
hierarquicamente, de forma que os níveis superiores da árvore são mais abrangentes, e os
níveis mais profundos são altamente específicos. Existem relações diretas entre as
categorias, sendo que uma ou mais categorias específicas sempre estão contidas em uma
categoria de nível superior, e também existem conexões dentro no mesmo nível da
hierarquia, e entre níveis, que descrevem tipos de relação mais complexas.
A anotação é realizada por alinhamento das sequências estudadas com
sequências já anotadas anteriormente. É comum que genes ou proteínas sejam associados a
diversas categorias, e que seja progressivamente menor a disponibilidade de referências
anotadas em níveis muito específicos da árvore.
A tabela 1 contém o resumo desses resultados para o conjunto completo das
proteínas identificadas e para o grupo diferencialmente expresso sob estresse hídrico.
0
50
100
150
200
250
>75% >50% >25% <25% não anotadas
Nú
mer
o d
e se
qu
ênci
as
Similaridade dos hits
Anotação BLAST2GO - melhores hits
Outras
Saccharum sp
Setaria Italica
Zea mays
Sorghum bicolor
48
Foi realizado o teste de Fisher para identificar termos enriquecidos no grupo
tratado, mas não foi identificada nenhuma categoria de GO super ou sub-representada em
comparação com o conjunto total (p < 0,05).
Tabela 1. Resumo da anotação de Gene Onthology.
Embora grande parte das proteínas tenha sido anotada, muitos desses
resultados estão limitados aos níveis 1, 2, 3 e 4 da hierarquia de GO e, portanto, são pouco
específicos. A partir no nível 5, no entanto, algumas informações mais relevantes podem ser
obtidas.
Foram anotadas 233 proteínas (83,4% do total) nas categorias da classe de
componentes celulares. A distribuição da anotação em componentes celulares mostra forte
viés para a localização no plastídio. Também foram comuns, para essas mesmas proteínas,
termos GO ligados à mitocôndria, ribossomo, núcleo, membrana e outros, o que é esperado,
dada a composição do plastídio e os processos moleculares que ocorrem em seu interior.
Um número menor de proteínas pôde ser anotado em termos mais específicos, como
estroma, membrana do cloroplasto, membrana do tilacóide, e até como componentes de
complexos proteicos das reações luminosas da fotossíntese. Do total de proteínas
identificadas, 74 são diferencialmente expressas sob tratamento de estresse hídrico. Para
este conjunto, foram anotados os termos GO de plastídio, mitocôndria e núcleo
(respectivamente, 73,6%, 17% e 15% das sequências anotadas).
Em relação à função molecular, 72,5% dos SAS foram anotados como proteínas
com atividade de ligação, e 55,4% foram anotadas com GO de atividade catalítica. Dentro de
atividade catalítica estão representados os termos para atividade de oxidoredutase,
transferase e hidrolase. Para atividades de ligação, os principais termos foram ligação à íons,
Identificadas Expressãodiferencial
Total 278 74
Anotadas 258(92,8%) 61(82,4%)
FunçãoMolecular 193(69,4%) 48(64,8%)
ProcessoBiológico 217(78%) 47(63,5%)
ComponenteCelular 233(83,4%) 53(71,6%)
49
ligação à compostos heterocíclicos e ligação a compostos orgânicos cíclicos. Entre as
diferencialmente expressas, 70,8% foram anotadas como proteínas com atividade de
ligação, enquanto 64,6% em atividade catalítica.
Para as categorias de processo biológico, os termos superiores mais relevantes
foram processo metabólico (68,6%), processo celular (68,6%) e processos de organismo
único (58%). Alguns dos termos com maior número de proteínas anotadas no nível 5 desta
classe foram processo metabólico de proteínas, modificação de proteínas, modificação de
macromoléculas, expressão gênica, e biossíntese de macromoléculas.
Foram identificadas proteínas já descritas como participantes de processos como
Ciclo de Calvin, reações do ciclo fotossintético C4, metabolismo de lipídeos, reações
luminosas, eliminação de ROS, metabolismo de ácidos nucléicos, metabolismo de
aminoácidos, entre outros. Zhao et al. (2013) revisaram estudos de proteômica de
cloroplastos em Zea mays onde proteínas envolvidas nestes processos também foram
identificadas. Os estudos revisados também investigaram a diferença na presença de
proteínas entre cloroplastos de células do mesófilo e da bainha, além de efeitos de estresses
salino, por luz e por temperatura.
Análise de proteínas de cloroplasto diferencialmente expressas sob estresse hídrico.
Das 74 proteínas diferencialmente expressas (Tabela suplementar 2), 18 são
de função desconhecida ou não apresentam alinhamento algum. Outras 48 são proteínas
ribossomais, histonas, chaperonas, subunidades com domínios de ligação à ácidos nucléicos
ou outras funções envolvidas no metabolismo de lipídeos, proteínas e metabolismo de
clorofila. As demais proteínas diferencialmente expressas foram anotadas e identificadas
como participantes do ciclo de Calvin, das reações luminosas e do ciclo C4 (Tabela 2).
Tabela 2. Proteínas de cloroplasto de cana-de-açúcar diferencialmente expressas em condições de estresse hídrico anotadas como participantes do ciclo de Calvin, das reações luminosas e do ciclo C4.
50
up: proteínas induzidas pelo estresse hídrico. down: proteínas reprimidas pelo estresse hídrico. 1: presença somente em condições de estresse hídrico. -1: presença somente no irrigado (controle).
As proteínas diferencialmente expressas envolvidas nas reações luminosas estão
representadas na figura 4.
Figura 4. Proteínas identificadas e diferencialmente expressas de cloroplasto de cana-de-açúcar sob estresse hídrico. Verde: proteínas reprimidas pelo estresse. Vermelho: proteínas induzidas pelo estresse. Cinza: proteínas identificadas que não possuem expressão variável neste experimento. Azul: subunidade II identificada, porém não é diferencialmente expressa. Modificada de Taiz e Zeiger, (2006).
Dentre as proteínas reprimidas pelo estresse hídrico, encontram-se Psbp-like,
STN8 (serina treonina quinase) e OHP2. É sabido que Psbp-like são proteínas extrínsecas que
compõe o complexo de evolução do oxigênio (CEO), que por sua vez é responsável por
remover 4 elétrons de duas moléculas de água para formar oxigênio molecular (Roose et al.,
2007). Essas proteínas não são necessárias para o funcionamento do complexo, mas
possuem papel importante no aumento de sua capacidade (Ishihara et al., 2007; Seidler,
1996). STN8, é uma quinase que possui um papel central na fosforilação da proteína D1,
proteína do centro de reação PSII, protegendo-a da degradação indesejada que resulta na
produção de espécie reativas de oxigênio. Por outro lado, a degradação de D1 é um
importante passo para evitar fotoinibição. Dessa forma STN8 está envolvida no ajuste fino
da degradação de D1 (Kato and Sakamoto, 2014). OHP2 é um membro da família LHC (light-
harvesting chlorophyll a/b-binding proteins), que compõe o complexo antena. Ohp2 é
51
induzido quando há alta intensidade luminosa, sendo uma estratégia de fotoproteção do PSI
em resposta ao estresse por luz intensa (Andersson et al., 2003). Essas evidências sugerem
que essas proteínas exercem um papel importante no controle do fluxo linear de elétrons,
que por sua vez está sendo reprimido pelo estresse hídrico. Por outro lado, o aumento da
expressão de Ferredoxina e da subunidade psaK sugerem que o fluxo cíclico de elétrons está
sendo favorecido. Ferredoxina é um forte aceptor de elétrons do PSI e a subunidade psaK
está envolvida na interação entre LHCI e o centro de reação do fotossistema I (Jensen et al.,
2000). O transporte linear de elétrons da água ao NADP+ ocorre através do PSII e PSI. Devido
ao transporte de elétrons linear, H+ é acumulado no lúmen resultante da oxidação da água e
da translocação de prótons pela membrana através do complexo Cytb6f (Citocromo b6f),
resultando na geração de uma força próton-motriz que direciona a produção de ATP. Em
contrapartida, o transporte cíclico de elétrons em torno do PSI recicla os elétrons da
Ferredoxina reduzida e transporta para a plastoquinona, contribuindo para a geração da
força próton-motriz sem produção de NADPH (Nakamura et al., 2013). Como a razão da
produção ATP/NADPH é fixa (1,29) através do transporte linear (Allen 2003), o transporte
cíclico de elétrons é importante para preencher o restante requerido para o metabolismo (1,
4 a 5) em células de plantas C4 (Munekage and Taniguchi, 2016). A fotossíntese C4 requer
mais ATP por carbono fixado para concentrar CO2 nas células da bainha, necessitando de
mais energia do que necessita a fotossíntese C3 (Munekage and Taniguchi, 2016).
Estudos revelam que NDH desidrogenase está envolvida no transporte cíclico de
elétrons pelo PSI em plantas C3, reciclando elétrons da Ferredoxina para Plastoquinona e
consequentemente para o PSI através do Cytb6f (Yamori and Shikanai, 2016). Acredita-se
que em plantas C4, como milho e sorgo, esse complexo também esteja envolvido na geração
de ATP através do transporte cíclico de elétrons (Darie et al., 2006; Kubicki et al., 1996;
Takabayashi et al., 2005). No presente trabalho, a subunidade I da NDH desidrogenase é
reprimida, o que sugere a repressão do complexo e, consequentemente, que o transporte
cíclico de elétrons de cana-de-açúcar quando submetida ao estresse hídrico não é NDH-
dependente.
Subunidades do Cytb6f e da ATP sintase foram identificadas, incluindo a
subunidade II, mas não foram diferencialmente expressas sob condições de seca. Dessa
forma, a indução ou repressão desses complexos não são o principal fator regulatório da
cadeia de elétrons e da produção de ATP e consequentemente da fotossíntese em plantas
52
de cana-de-açúcar submetidas à seca. O ATP produzido é utilizado nas reações subsequentes
da fotossíntese, como as reações do ciclo de Calvin. Nesse contexto, grandes quantidades de
ATP são necessárias para que ocorra a regeneração de Ribulose- 1,5- bisfosfato. No presente
trabalho frutose-1,6- bifosfato adolase e a maior subunidade da RuBisco (Ribulose-1,5-
bisfosfato carboxilase) foram induzidas pelo estresse (Figura 5), sugerindo uma alta
demanda de carboxilação e regeneração da Ribulose-1,5-bifosfato e consequentemente um
maior consumo de ATP pelas plantas estressadas para manter a fotossíntese.
A enzima do metabolismo C4, PEPC (fosfoenolpiruvato carboxilase), responsável
pela catálise irreversível de carboxilação do fosfoenolpiruvato em oxalacetato, também foi
encontrada como sendo induzida ela seca. Essa enzima é sabidamente citosólica, porém
estudos em arroz demostram a existência de PEPC intrínseca de cloroplasto, com um papel
fundamental na assimilação de amônia em folhas (Masumoto et al., 2010). Uma investigação
mais aprofundada seria necessária, para inferir o papel dessa enzima em cloroplastos de
cana-de-açúcar submetida a estresse hídrico.
Figura 5. Proteínas identificadas e diferencialmente expressas participantes do ciclo de Calvin de cloroplasto de cana-de-açúcar sob estresse hídrico. Vermelho: proteínas induzidas pelo estresse. Azul: proteína identificada que não possui expressão variável neste experimento. Modificada Taiz e Zeiger, (2006).
Conclusão
Os níveis de proteínas cloroplastidiais de cana-de-açúcar variam com estresse
por seca. Porém, o complexo da ATP sintase e Citocromo b6f não controlam a fotossíntese
de cana-de-açúcar sob estresse hídrico, através da diminuição da quantidade de suas
53
subunidades.
A alta demanda de ATP para as reações de concentração de CO2 e carboxilação
são compensadas pelo transporte cíclico de elétrons, sendo pontos estratégicos para
regulação da fotossíntese proteínas envolvidas na evolução do oxigênio (PsbP-like),
regulação da captação de energia pelo PSII e reciclagem de elétrons (Ferredoxina e psaK).
Estas duas últimas proteínas têm potencial biotecnológico para aumento da produção de
ATP em plantas submetidas ao estresse por seca.
Materiais e métodos
Material vegetal e aplicação do estresse hídrico
Plantas de cana de açúcar cultivar SP80-3280 foram crescidas em casa de
vegetação (Campinas, Brasil, 22°S, 47°W) sob irrigação diária por três meses em potes de 30
L. Em outubro de 2015, foi realizada a suspensão de rega para a evolução do estresse.
O ensaio foi delineado em blocos casualizados, dividido em três blocos com duas
réplicas por tratamento. O parâmetro utilizado para guiar as coletas foi a taxa fotossínteca
(A). Após 7 dias, a folha+1 foi coletada de plantas estressadas e controle (sem suspensão de
rega), quando a diferença na taxa fotossintética entre estressado e controle foi
estatisticamente significante.
Os parâmetros fotossintéticos foram medidos utilizando o equipamento IRGA (LI-
6400 XT, LI-COR biotechnology, EUA), numa concentração de CO2 de 400 µL L-1, intensidade
de luz de 2.000 µmol m-2 s-1, fluxo de gás 400 mL min-1 e temperatura dentro da câmara de
30 °C.
Isolamento de Cloroplastos
Para o isolamento de cloroplastos foi utilizado o Chloroplast Isolation Kit (CP-ISO,
Sigma Aldrich, EUA), segundo indicações do fabricante, com algumas adaptações. Três
gramas de folha+1 de plantas estressadas e do controle dos dois pontos de coleta foram
depositados em tubo contendo 18 mL de chloroplast isolation buffer (CIB) com BSA 0,1%
gelado. As amostras foram processadas em homogeneizador Turrax Omni GLH, em 3 ciclos
de 5 segundos, em velocidade média, depois filtradas em membrana de Nylon (Mesh 100) e
em seguida centrifugado a 200xg por 3 minutos a 4 °C para remover células intactas e
pedaços de parede celular. Para precipitar os cloroplastos, o sobrenadante foi coletado em
novo tubo e centrifugado a 1000 xg por 7 minutos a 4 °C. O pellet foi ressuspendido em 1 mL
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de CIB com BSA 0,1%.
A suspensão de cloroplastos foi adicionada a um gradiente de Percoll 80%/40%
na proporção 1:2 v/v, que foi posteriormente submetido a centrifugação em 4.000 rpm por
15 minutos a 4°C. Os cloroplastos intactos foram coletados, formando uma banda na
interface entre as camadas de 40% e 80% de Percoll e transferidos para um novo tubo para
etapas de lavagem.
Foi adicionado um volume igual a 3 vezes o volume dos cloroplastos coletados de
CIB, seguido de centrifugação a 1.700 xg por 3 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado
e o pellet de cloroplastos foi ressuspendido em 500 μL de CIB.
Extração de proteínas de cloroplasto e processamento das amostras
A extração das proteínas dos cloroplastos foi realizada segundo protocolo
adaptado de (Shiraya et al., 2014). Foi adicionado à suspensão de cloroplastos cinco vezes o
volume de tampão de extração de proteínas (Tioureia; CHAPS; 1M Tris-HCl, pH 8; Glicerol
50%; Triton X-100; 1 M DTT e 8 M Ureia), seguido de centrifugação a 4.000 rpm por 5min a
4°C para remoção de material membranoso. O sobrenadante foi coletado e transferido para
um novo tubo.
Foi adicionado um volume igual a 10 vezes o volume do sobrenadante de
acetona gelada que foi armazenado por 48 horas a -20 °C. O conteúdo de acetona foi
submetido a centrifugação a 4.000 rpm por 15 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi
descartado e o pellet proteico foi ressuspendido em tampão de amostra contendo 125 mM
Tris pH 6,8; 20% glicerol; 1% SDS e 1% DTT, armazenado a -80 °C.
A suspensão proteica foi precipitada através da adição de acetona gelada, que foi
incubada apor 1hora a 4 °C, posteriormente centrifugada por 10 min a 10.000 g. O
sobrenadante foi descartado. O procedimento foi repetido mais duas vezes. Em seguida foi
realizada a digestão com tripsina e dessalinização através do kit Pierce C18 Spin Columns
(Thermo Fischer Scientific, Bremen, Alemanhã) previamente às análises por espectrometria
de massas.
Análises por espectrometria de massas e identificação de proteínas
Previamente às análises no espectrômetro de massas, os peptídeos digeridos
foram ressuspendidos em solução aquosa de 0,1% de ácido fórmico e separados em um
sistema cromatográfico do tipo EASY-nLC1000 (Thermo Fischer Scientific, Bremen,
Alemanhã).
55
A ionização e injeção dos peptídeos no espectrômetro de massas (Q-Exactive,
Thermo) foi realizada por electrospray (ESI), utilizando-se 2,5kV de potencial aplicado
diretamente na agulha de injeção.
A identificação das proteínas foi realizada por buscas baseadas nas sequências de
proteínas do banco de dados de cana-de-açúcar do SUCEST. O alinhamento e a anotação
foram realizados por meio do uso do programa Blast2GO (Conesa et al., 2005).
Análise de proteínas de cloroplasto diferencialmente expressas sob estresse
hídrico.
A expressão das proteínas identificadas foi normalizada através do fator NSAF
(normalized spectral abundance factor), descrito por Zybailov et al. (2006). A comparação
entre a abundância de proteínas nos tratamentos Seca e Controle foi representada em fold-
change e foram consideradas diferencialmente expressas as que apresentaram fold-change
maior que 1,5 e aquelas que estão presentes em um dos tratamentos e ausentes no outro.
Como os dados não apresentaram distribuição normal, o teste estatístico aplicado foi o não-
paramétrico Kruskal-Wallis.
56
Material Suplementar
Tabela Suplementar 1. Resultados resumidos da anotação via Blast2GO e expressão diferencial das proteínas identificadas.
SAS Descrição sinal | fold change Lembke et al. (2012) Vias envolvidas Blast E-Value Blast Similarity Mean
SCRULR1020D09.g phosphoenolpyruvate carboxylase 8,75
C4 (PEPC) 0.00E+00 96.4
SCJFLR1073E09.g ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase large partial (chloroplast) 5,87
Ciclo de Calvin 0.00E+00 98.55
SCRULR1020D11.g 1-fructose 1,6-bisphosphate aldolase precursor [Avena sativa] 3,36 -1 Ciclo de Calvin 0.00E+00 94.2
SCCCCL3004H07.b lipid-transfer [Zea mays parviglumis] 1
lipid metabolism 2.20E-23 94.1
SCCCCL6003G04.g terminal uridylyltransferase 7-like 1
metabolismo de ácidos nucleicos 0.00E+00 84.55
SCEZLB1007D07.g polyphenol oxidase 1
metabolismo de aminoácidos 0.00E+00 61.25
SCUTLR2008B06.g Photosystem I reaction center subunit chloroplastic 1 -1
reações luminosas 1.10E-84 88.9
SCQSLR1018G03.g ferredoxin [Zea mays] 1
reações luminosas 3.40E-108 96.6
SCSGHR1070G09.g BTB/POZ domin containing protein 1 -1
3.90E-36 70.05
SCAGLR1043B12.g putative Histone h2 1 -1
1.60E-36 65.35
SCRLFL1006C10.g Sem alinhamento 1
- -
SCMCSB1108H03.g Sem alinhamento 1
- -
SCEPSD2071D04.g Sem alinhamento 1
- -
SCQGFL4073G04.g Desconhecido 1
3.30E-114 76.1
SCAGFL1087C05.g Desconhecido 1
7.80E-88 85.2
SCEPAM1108G04.g Desconhecido 1
1.10E-63 93.25
SCEZLB1010E01.g Desconhecido 1
0.00E+00 87.55
SCEZSD1080E02.g Desconhecido 1
5.80E-98 96.95
SCCCLR1065E11.g Desconhecido 1
3.70E-61 70.3
SCEZLR1031G05.g Desconhecido 1
2.20E-69 67.25
57
SCQGLR1019B01.g ubiquinol oxidase 4, chloroplastic/chromoplastic 1
0.00E+00 87.35
SCEQRT1030E10.g transcription factor 25 1
1.00E-177 73
SCJLLR1104C06.g probable zinc metallopeptidase EGY3 1
1.30E-104 72.7
SCCCLR2001H07.g 20 kDa chaperonin 1
2.80E-159 89.25
SCCCCL3001E11.g DNA-binding MNB1B [Zea mays] 1
1.30E-93 88.65
SCMCAM1100D08.g F-box At5g06550-like 1
2.30E-41 87.85
SCCCCL4001C01.g glycine-rich RNA-binding 2 [Zea mays] 1
5.10E-52 94.65
SCBGLR1082F03.g histone H1 1
2.90E-43 91.55
SCJLRZ1020C10.g IQ-DOMAIN 1 isoform X1 [Glycine max] 1
5.50E-38 52.35
SCAGCL6013C02.g NRT1 PTR FAMILY -like isoform X2 [Brachypodium distachyon] 1
0.00E+00 74.9
SCACSB1038B04.g ribosomal l21 domain-containing 1
3.30E-13 81
SCCCLR1022H05.g signal recognition particle receptor subunit beta-like [Setaria italica] 1
8.60E-170 90.35
SCCCCL4001F10.g thylakoid lumenal chloroplastic 1
3.50E-110 85.1
SCACCL6006F08.g translation elongation initiation factor family [Zea mays] 1
4.10E-93 80.35
SCQGHR1010A04.g allene oxide chloroplastic -1
lipid metabolism 1.10E-115 79.8
SCSGLR1045A10.g polyphenol oxidase -1
metabolismo de aminoácidos 0.00E+00 58.35
SCBFLR1039A03.g polyphenol oxidase family [Zea mays] -1
metabolismo de aminoácidos 1.70E-129 60.15
SCUTAD1032C08.g magnesium protoporphyrin IX chloroplastic-like [Populus euphratica] -1
metabolismo de clorofila 1.30E-109 76.85
SCMCRZ3064A10.g protoporphyrinogen chloroplastic -1
metabolismo de clorofila 9.50E-154 92.25
SCCCLR1C01C08.g translocase of chloroplast chloroplastic-like -1
protein transport to chloroplast 0.00E+00 86.3
SCCCRZ3004E12.g PsbP-like protein -1 -1 reações
luminosas 2.90E-31 94.6
SCRUHR1077G03.g LHC - chlorophyll a-b binding -1
reações luminosas 1.00E-79 74.35
SCCCCL4005F05.g serine threonine- kinase chloroplastic -1
reações 0.00E+00 93.85
58
luminosas
SCJLFL3015D04.g protease Do-like chloroplastic -1
Reparo do PS II 4.30E-95 84.85
SCEQLR1092A06.g Desconhecido -1 -1
3.10E-148 66.5
SCRUFL1114B10.b Desconhecido -1 -1
1.10E-63 96.6
SCRFLR1034H12.g 50S ribosomal L6 [Zea mays] -1 -1
1.90E-158 91.4
SCCCCL4005E12.g Chaperona -1 -1
0.00E+00 94.9
SCBFLR1046G09.g Desconhecido -1
2.40E-130 92.2
SCQGFL4080D02.g Desconhecido -1
3.90E-133 79.8
SCRURT2008F10.g Desconhecido -1
0.00E+00 81.9
SCJLRZ1019E11.g Desconhecido -1
1.10E-146 81.35
SCJLLR2013F04.g Desconhecido -1
2.00E-51 72.1
SCJFRZ2013E11.g Desconhecido -1
2.00E-73 78.25
SCBGLR1002D04.g protein phosphatase 2C 57 -1
0.00E+00 91.6
SCJFRZ2033G02.g plastid lipid-associated protein 3 -1
2.40E-60 91.8
SCEZRZ1014F10.g peroxiredoxin-2E -1
1.70E-124 88.4
SCCCLR1024C11.g heat shock 70 kDa protein 6, chloroplastic -1
0.00E+00 95.15
SCAGLR2011F12.g apolipoprotein D-like (lipocalin) -1
3.70E-137 89.8
SCRLSB1041E06.g NADH dehydrogenase subunit I (chloroplast) [Alloteropsis semialata] -1
1.40E-89 83.05
SCCCLR2C03E02.g 50S ribosomal chloroplastic -1
1.70E-117 84.7
SCMCRT2105E09.g 50S ribosomal chloroplastic-like -1
4.00E-160 95.95
SCCCLR1079F10.g Chaperona -1
0.00E+00 86.4
SCBGLR1117A10.g chaperone chloroplastic [Setaria italica] -1
0.00E+00 93.7
SCUTAM2113D10.g LOW PSII ACCUMULATION chloroplastic -1
0.00E+00 75.4
SCQSLB1049G04.g ML domain precursor [Zea mays] -1
2.30E-93 87.55
SCEPRZ1010F09.g partial 1-phosphatidylinositol-3-phosphate 5-kinase fab1 [Triticum urartu] -1
0.00E+00 92.85
SCEQLB1066H12.g partial Copper-transporting ATPase 2 [Gossypium arboreum] -1
6.40E-60 86.65
59
SCCCLB1C05F02.g peptidase serine-type peptidase [Zea mays] -1
0.00E+00 77.45
SCMCLR1010F05.g rhodanese-like domain-containing chloroplastic -1
2.70E-93 81.55
SCACSB1035E05.g ribosomal L2 (chloroplast) [Alloteropsis semialata] -1
7.10E-109 94.2
SCRUFL3061F12.b ribosomal S15-like [Oryza sativa Japonica Group] -1
1.10E-32 95.55
SCEQRT1031E01.g ribosomal S8 (chloroplast) [Oryza barthii] -1
2.00E-33 96.95
SCEZLR1031H11.g spliceosomal [Zea mays] -1
1.10E-169 90.9
SCJFRT1060F11.g cytosolic orthophosphate dikinase
C4 7.10E-179 97.2
SCCCLR2002G03.g soluble inorganic pyrophosphatase chloroplastic-like
C4 0.00E+00 89.1
SCSGFL4C07B01.g NADP-dependant malate partial
C4 4.40E-168 98.3
SCVPRT2075C09.g cytosolic orthophosphate dikinase
C4 0.00E+00 97.35
SCCCCL3001F10.b phosphoenolpyruvate carboxylase [Zea mays]
C4 (PEP) 0.00E+00 95
SCSBSB1096D03.g
gi|108864053|gb|ABG22386.1|Fructose-bisphosphate aldolase, chloroplast precursor, putative, expressed [Oryza sativa Japonica Group]
Ciclo de Calvin 4.30E-153 96.4
SCSBSB1052D07.g Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
Ciclo de Calvin 0.00E+00 94
SCEZLB1006F11.g phosphoglycerate kinase [Zea mays]
Ciclo de Calvin 0.00E+00 96.6
SCCCLR1048B08.g triosephosphate chloroplastic-like
Ciclo de Calvin 0.00E+00 96.5
SCCCLR1001E04.g ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase small subunit
Ciclo de Calvin 5.60E-120 91.45
SCUTSD1024B11.g triose phosphate phosphate non-green plastid,chloroplast precursor
Ciclo de Calvin 3.50E-125 93.05
SCBGLR1044D06.g ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase (chloroplast) [Zea mays]
Ciclo de Calvin 3.80E-107 94.3
SCEQLB1068G07.g glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase chloroplastic-like
Ciclo de Calvin 2.10E-47 95.4
SCBGLR1099C04.g Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase chloroplastic
ciclo de Calvin 0.00E+00 91.6
SCCCRZ1004G05.g ru large subunit-binding subunit chloroplastic-like
Ciclo de Calvin ? 0.00E+00 94.85
60
SCJFRT1007H07.g lipoxygenase [Zea mays]
lipid metabolism 0.00E+00 87.95
SCSBFL5014H12.g lipoxygenase partial
Lipid metabolism 1.40E-109 90.55
SCRLLR1016C10.g lipoxygenase [Zea mays]
lipid metabolism 0.00E+00 92.3
SCEPAM1051D07.g polyphenol oxidase
metabolismo de aminoácidos 0.00E+00 60.25
SCUTSB1076D12.g photosystem II repair PSB27- chloroplastic
reações luminosas 6.00E-95 87.65
SCSGAD1009E08.b ATP Synthase delta chain
reações luminosas 9.80E-131 82.55
SCSFST3077H01.g chlorophyll a-b binding [Zea mays]
reações luminosas 0.00E+00 91.55
SCRLAM1006E01.g lil3 [Zea mays]
reações luminosas 8.40E-139 80.9
SCQGLR2025B12.g photosystem I reaction center subunit XI [Zea mays]
reações luminosas 8.80E-139 94.5
SCQGLR1085G01.g photosystem I reaction center subunit V [Zea mays]
reações luminosas 1.50E-91 85.55
SCEZLR1031G02.g chlorophyll a-b binding 6A [Zea mays]
reações luminosas 5.40E-176 93
SCEQLR1092B06.g rubredoxin 1
reações luminosas 4.90E-65 91
SCEPSD2005D11.g NAD(P)H-quinone oxidoreductase subunit chloroplastic
reações luminosas 3.60E-138 77.5
SCEPAM1021H11.g rubredoxin
reações luminosas 1.40E-114 79.7
SCCCST1002F06.g chlorophyll a-b binding 4 [Zea mays]
reações luminosas 9.50E-173 92.5
SCBGLR1114G09.g photosystem II oxygen-evolving complex 3-like [Arabidopsis thaliana]
reações luminosas 7.70E-141 81.8
SCSFAM1075A09.g photosystem II stability assembly factor chloroplastic
reações luminosas 7.20E-176 98.1
SCAGFL1086E09.g photosystem II 22 kDa chloroplastic
reações luminosas 1.60E-124 94.55
SCJFLR1073E07.g photosystem II 10 kDa polypeptide [Zea mays]
reações luminosas 1.20E-70 85.9
SCACLR2022A04.g photosystem I reaction center subunit IV A [Zea mays]
reações luminosas 1.80E-27 97.1
61
SCACLR1129A11.g photosystem I reaction center subunit chloroplastic-like
reações luminosas 2.00E-53 95.45
SCSBHR1051G02.g photosystem I reaction center subunit chloroplastic-like
reações luminosas 1.20E-143 85.15
SCCCLR1001F08.g Photosystem I reaction center subunit chloroplastic
reações luminosas 4.30E-78 96.95
SCRFLR1012A09.g photosystem I P700 chlorophyll a apo partial (chloroplast)
reações luminosas 9.30E-144 99.95
SCSFLV1045B05.g NAD(P)H-quinone oxidoreductase subunit organellar chromatophore
reações luminosas 1.30E-98 81.3
SCCCRZ1004B12.g light-induced 1-like [Zea mays]
reações luminosas 3.70E-56 73.15
SCQSRZ3037D06.g ferredoxin [Zea mays]
reações luminosas 0.00E+00 90.1
SCEPRZ3130G10.g ferredoxin [Zea mays]
reações luminosas 1.50E-98 79.65
SCAGAD1074D07.g electron carrier electron transporter iron ion binding [Zea mays]
reações luminosas 9.80E-98 75.8
SCBFLR1046F03.g cytochrome f (chloroplast) [Zea mays mays]
reações luminosas 2.50E-42 100
SCQSLR1018H02.g cytochrome b6-f complex iron-sulfur subunit [Zea mays]
reações luminosas 4.80E-160 90.95
SCSBST3096E08.g chlorophyll a-b binding of LHCII type III [Zea mays]
reações luminosas 0.00E+00 96.05
SCJFSB1014F03.b chlorophyll a-b binding CP24 [Zea mays]
reações luminosas 1.70E-59 96.95
SCACLR2007B05.g chlorophyll a-b binding CP24 [Zea mays]
reações luminosas 2.20E-173 89.5
SCCCLR2C02D12.g chlorophyll a-b binding chloroplastic-like
reações luminosas 0.00E+00 93.05
SCCCLR1066F06.g chlorophyll a-b binding chloroplastic
reações luminosas 0.00E+00 95.15
SCAGLR1043A06.g chlorophyll a-b binding chloroplastic
reações luminosas 0.00E+00 89.65
SCVPHR1094B09.g chlorophyll a-b binding chloroplastic
reações luminosas 4.30E-178 87.55
SCRLLR1131G03.g chlorophyll a-b binding chloroplastic
reações luminosas 1.50E-95 85.25
62
SCJFLR1074A11.g chlorophyll a-b binding 2 [Zea mays]
reações luminosas 0.00E+00 94.65
SCCCRZ1003G06.g ATP synthase subunit mitochondrial-like
reações luminosas 0.00E+00 91.8
SCJFRT1010C10.g ATP synthase gamma chloroplastic [Vigna radiata radiata]
reações luminosas 0.00E+00 88.6
SCACSD2014C10.g ATP synthase B chain [Zea mays]
reações luminosas 6.60E-68 92.9
SCCCLR1070D02.g oxygen-evolving enhancer 1 [Zea mays]
reações luminosas 0.00E+00 93.5
SCRLFL4026H03.g thylakoid-bound ascorbate peroxidase
ROS scavenging 5.10E-154 94.25
SCJLLB2080E05.g thioredoxin-like protein HCF164
2.10E-61 86.65
SCSGFL4118D10.g skin secretory protein xP2-like
6.60E-41 58.6
SCACSB1122B11.g protein TIC 62, chloroplastic isoform X2
1.50E-104 70.85
SCCCLR2001B09.g protein MEMO1
0.00E+00 93.95
SCCCRZ2C03C06.g protein EARLY RESPONSIVE TO DEHYDRATION 15-like isoform X2
8.80E-80 63.85
SCJFRT1012F09.g probable serine/threonine-protein kinase At1g01540 isoform X1
0.00E+00 93.3
SCSBSD1054G03.g probable plastid-lipid-associated protein 13, chloroplastic
1.20E-83 91.2
SCJLRT1016A04.g Plastid-lipid-associated protein, chloroplast precursor, putative
0.00E+00 85.9
SCJFLR2035B05.g Photosystem I reaction center subunit VI, chloroplastic
2.90E-95 86.8
SCCCLR1C03B07.g Oxygen-evolving enhancer protein 2
5.70E-174 85.6
SCCCRT1C06B08.g NAD(P)H-quinone oxidoreductase subunit S
5.30E-109 70.6
SCMCSB1108C10.g microtubule-associated protein TORTIFOLIA1-like
3.00E-55 89.65
SCCCFL5093B04.g MAR-binding filament-like protein 1
1.90E-144 84
SCQGAM2111G08.g LOW QUALITY PROTEIN: psbQ-like protein 2, chloroplastic
5.20E-97 66.7
SCEPFL4180E10.g hydroperoxide lyase
6.50E-128 81.85
SCCCLR2001E04.g huntingtin-interacting protein K
2.60E-77 94.35
63
SCCCCL3001G02.g glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1, cytosolic-like
0.00E+00 97.75
SCCCLR2C02D04.g germin-like protein 8-14
2.70E-141 88.2
SCCCLR1077F04.g Elongation factor Tu
0.00E+00 95.15
SCJFRZ2028B05.g dynamin-related protein 5A
0.00E+00 92.1
SCBFLR1005E05.g death domain-associated protein 6-like isoform X1
2.20E-129 88.1
SCCCST1001B11.g chlorophyll a-b binding protein of LHCII type 1-like
0.00E+00 96.9
SCUTST3086G11.g chlorophyll a-b binding protein 5, chloroplastic
0.00E+00 93.3
SCEZRZ1016A03.g 37 kDa inner envelope membrane, chloroplastic
0.00E+00 90.2
SCSBFL5019H06.g 2-methyl-6-phytyl-1,4-hydroquinone methyltransferase
1.50E-100 92.35
SCCCLR1022D05.g 14-3-3 protein
0.00E+00 98.15
SCEQRT1025D06.g 14-3-3 protein
7.10E-126 97.25
SCRUHR1076E02.g 50S ribosomal chloroplastic
5.60E-133 85.95
SCRLRZ3039A08.g 30S ribosomal chloroplastic
2.20E-142 88.35
SCQGLR2025H03.g geranylgeranyl diphosphate chloroplastic
0.00E+00 92.85
SCJLST1022G06.g chlorophyll a-b binding chloroplastic
0.00E+00 92.5
SCJLRZ1021F11.g 50S ribosomal chloroplastic
2.40E-110 89.1
SCJLLR1107G06.g Desconhecido
1.80E-56 89.7
SCJLLR1102C07.g psbP chloroplastic isoform X1
3.00E-145 84.55
SCJFLR2036D12.g plastid ribosomal partial
1.70E-91 85.65
SCEZAD1081D01.g Aspartyl-protease like
1.00E-68 84.05
SCEQLR1094C07.g NAD(P)-linked oxidoreductase superfamily protein isoform 1
2.50E-132 91.95
SCEQLB1063H05.g Desconhecido
5.30E-151 83.15
SCCCLB1021E12.g protoporphyrinogen IX oxydase
1.20E-141 95.35
SCCCCL5001D04.g 50S ribosomal chloroplastic
0.00E+00 87.35
SCCCCL4001F08.g malate glyoxysomal
1.90E-121 86.9
64
SCBGLR1096C09.g peroxiredoxin chloroplastic
8.40E-108 92.8
SCBFST3133G05.g Desconhecido
2.60E-68 88.65
SCBFSD1037F06.g Desconhecido
5.50E-161 84.35
SCBFRZ2049F01.g 50S ribosomal chloroplastic
2.40E-143 88.65
SCAGAM2126G09.g Desconhecido
1.50E-82 80.6
SCAGAM2018H09.g rhodanese-like domain-containing chloroplastic
1.00E-137 88.9
SCACLR1132D10.g calcium sensing chloroplastic
0.00E+00 83.65
SCRURT2005E10.g zinc C3HC4 type family [Zea mays]
0.00E+00 78.85
SCBGLR1120G09.g Ycf54 [Glycine soja]
2.80E-137 86.05
SCAGLR2026D06.g Desconhecido
0.00E+00 96.9
SCJLFL3014H03.g Desconhecido
7.90E-100 96.45
SCUTSD1028A10.g Desconhecido
2.40E-132 95.95
SCCCLR1072C08.g Desconhecido
1.60E-83 94.55
SCJFST1013G10.g Desconhecido
0.00E+00 91.9
SCMCLR1010F09.g Desconhecido
2.80E-96 89.35
SCBFST3133G05.b Desconhecido
5.00E-128 87.45
SCSGSB1006C01.g Desconhecido
7.60E-119 86.5
SCJFHR1031E10.g Desconhecido
1.10E-85 85.9
SCCCRZ2004B02.g Desconhecido
4.60E-83 85.4
SCVPRZ2040C10.g Desconhecido
1.90E-116 83.05
SCVPFL3048C02.g Desconhecido
9.10E-117 82.5
SCACAM2041D01.g Desconhecido
7.80E-96 81.75
SCCCCL3003F01.b Desconhecido
6.40E-41 81.4
SCCCLR1048A01.g Desconhecido
4.40E-120 81.3
SCJLAM2094A04.g Desconhecido
4.50E-86 80.85
SCBGST3104H11.g Desconhecido
5.20E-113 78.05
SCEZLR1031A01.g Desconhecido
9.80E-123 75.25
SCVPRT2074A01.g Desconhecido
0.00E+00 74.9
65
SCACSD1015D03.g Desconhecido
2.40E-14 73.44
SCQSST1036C05.g Desconhecido
5.60E-85 72.2
SCQSRT2032E10.g Desconhecido
3.60E-77 68.4
SCQSST3115D10.g Desconhecido
2.00E-29 68.15
SCCCST1004C01.g Desconhecido
1.90E-133 56.6
SCBGRT1049E09.g Desconhecido
4.10E-20 60.8
SCCCAM1C01D09.g uncharacterized aarF domain-containing kinase chloroplastic-like
5.40E-78 92.45
SCEZAM1083E11.g ubiquinone biosynthesis ubiB [Zea mays]
0.00E+00 86.9
SCAGAD1074C03.g tyrosine [Medicago truncatula]
1.70E-92 81.5
SCAGSD1040G09.g Tubulin beta-2C chain [Schistosoma japonicum]
2.90E-120 88.25
SCEQLB1068F06.g transposon En Spm sub-class [Oryza sativa Japonica Group]
7.90E-54 57.9
SCQGLB1037B10.g transposon [Zea mays]
1.30E-67 75.88
SCUTSB1073E10.g transcription factor PCF6-like [Musa acuminata malaccensis]
3.40E-95 71.6
SCBFSD1035F05.g thylakoid lumenal 19 kDa chloroplastic
1.20E-102 82.65
SCQSLR1089C08.g THYLAKOID chloroplastic-like
0.00E+00 91.05
SCCCLR1024B08.g threonine endopeptidase [Zea mays]
2.50E-97 86.05
SCQGLB2044G06.g threonine endopeptidase [Zea mays]
9.50E-98 83.7
SCJFRZ3C03H10.g SHOOT1 [Oryza sativa Japonica Group]
3.70E-128 78.65
SCJFRZ1005E12.g seed maturation [Zea mays]
1.30E-85 78.55
SCQGLR1019C05.g SAP domain containing expressed [Oryza sativa Japonica Group]
0.00E+00 76.4
SCACAD1036C04.g SAM domain family
2.50E-143 92.7
SCEZHR1047F05.g rhodanese-like domain-containing chloroplastic
0.00E+00 74.05
SCRUFL1021F12.g retrotransposon [Zea mays]
1.50E-49 56.55
SCEQLB1064D12.g protochlorophyllide reductase B [Zea mays]
0.00E+00 91.5
SCUTLR2015H12.g probable membrane-associated 30 kDa chloroplastic
0.00E+00 92
66
SCEPLR1008D05.g probable histone H2A variant 3 [Musa acuminata malaccensis]
1.70E-90 94.15
SCCCLR1C08H04.g plastocyanin [Zea mays]
2.00E-99 85.75
SCSGST1070A12.g Pheophorbide a chloroplastic
0.00E+00 88.8
SCEQSD2075C07.g PGR5 chloroplastic
6.00E-113 91.85
SCEZAD1C01C10.g peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP16- chloroplastic-like
1.60E-75 77.7
SCCCLR1C01H02.g peptidyl-prolyl cis-trans isomerase CYP20- chloroplastic-like
7.10E-179 88.5
SCEQFL5044B07.g Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase chloroplastic
7.50E-101 97.8
SCQGSB1142B10.g partial gi|670445397|ref|XP_008662993.1|PREDICTED:
1.40E-62 87.4
SCJFRT1012A02.g outer envelope pore chloroplastic-like
2.60E-153 80.25
SCBGLR1023C10.g NHL repeat-containing 2
8.50E-152 73.4
SCEPSD1004E09.g NAD(P)-linked oxidoreductase [Arabidopsis thaliana]
1.20E-79 81.55
SCRFFL4006G07.g metal tolerance C4-like
1.70E-143 96.4
SCJFST1011F08.g homeobox-leucine zipper HOX4-like
2.00E-29 66.29
SCAGLB1070C07.g histone H4 [Zea mays]
8.40E-65 100
SCVPLB1017H05.g histone H3 [Zea mays]
9.70E-92 100
SCCCLR2001C09.g histone H2A-like [Setaria italica]
5.00E-96 90.6
SCCCRZ2002H03.g histone H2A
2.80E-99 92.4
SCVPLR1049C05.g histone [Zea mays]
8.50E-66 99.5
SCUTST3128B03.g harpin binding 1
3.70E-147 87.05
SCCCRZ2C03D05.g glutamate decarboxylase [Oryza sativa Japonica Group]
0.00E+00 90.85
SCQSST1039F02.g formin 7
5.20E-116 84.6
SCEPAM1024D04.g elongation factor 1-gamma 3 [Zea mays]
5.90E-95 87.85
SCSBRT3039F07.g elongation factor 1 alpha
1.50E-97 84
SCCCLR1022B11.g cysteine protease 1 precursor [Zea mays]
0.00E+00 92
67
SCMCSD1061A04.g CURVATURE THYLAKOID chloroplastic
8.50E-23 92.95
SCAGFL1085C10.g chloroplast lipocalin
0.00E+00 87.5
SCSFSB1069B03.g chloroplast lipocalin
8.70E-137 87.15
SCBGLR1115C01.g chlorophyll chloroplastic
0.00E+00 94.1
SCSBHR1050F02.g carbonic anhydrase [Zea mays]
5.10E-148 93
SCEQRT1029D05.g ATP-dependent zinc metalloprotease FTSH chloroplastic
0.00E+00 95.85
SCBFRZ2019D01.g ATP-dependent zinc metalloprotease chloroplastic
0.00E+00 93.45
SCCCFL8003E02.g ABC-type Co2+ transport permease component [Zea mays]
1.30E-114 83.35
SCAGLR2026E10.g 50S ribosomal chloroplastic [Nelumbo nucifera]
1.60E-117 86.5
SCEQLB1066D08.g 50S ribosomal chloroplastic
0.00E+00 90.85
SCEZLR1031E05.g 50S ribosomal chloroplastic
1.20E-90 90.1
SCVPRZ2040F06.g 40S ribosomal S15a-5-like [Brachypodium distachyon]
4.20E-89 93.75
SCRURT2013B06.g 30S ribosomal S13
1.70E-93 95.05
SCBFST3135D12.g 30S ribosomal chloroplastic
0.00E+00 91.65
SCAGLR1043F11.g 30S ribosomal chloroplastic
3.90E-131 80.2
SCJLLR1033F07.g 2-cys peroxiredoxin BAS1 [Zea mays]
0.00E+00 89.05
SCAGLR1021D10.g Sem alinhamento
- -
SCBGLB2015F06.g Sem alinhamento
- -
SCBGLR1120G04.g Sem alinhamento
- -
SCBGST3110E02.g Sem alinhamento
- -
SCEPSD2007G09.g Sem alinhamento
- -
SCEQAD1015D09.g Sem alinhamento
- -
SCJFST1009B04.b Sem alinhamento
- -
SCJLFL3011E06.g Sem alinhamento
- -
SCRFLR2038F10.g Sem alinhamento
- -
SCRUAD1062D06.g Sem alinhamento - -
68
69
Capítulo III
Sugarcane drought-resistance mechanisms and its implications on
biotechnology strategies
Thais H S Ferreira, Max S Tsunada, Denis Bassi, Pedro Araújo, Lucia Mattiello,
Giovanna V Guidelli, Germanna L Righetto, Vanessa R Gonçalves , Marcelo Menossi*
Laboratório de Genoma Funcional, Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes, Instituto de
Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brazil
* Correspondence:
Marcelo Menossi
Keywords: Sugarcane 1, Drought2, Resistance3, Avoidance4, Tolerance5, Transgenic6,
Trait7, Gene expression8
Abstract
Sugarcane is one of the most economically important crops due its capacity to produce
and accumulate high amounts of sugar inside harvestable parts. Additionally, sugarcane has
become an exponent source for renewable fuels. The increase in sugarcane demand makes
necessary the advance over new production areas where water deficit is a reality leading to
increase of production costs due to the irrigation needs or to considerable yield. For this
reason, the development of drought-resistant sugarcane plants is an important achievement
and biotechnology is a crucial tool. However, before this goal is achieved, is mandatory to
understand sugarcane responses to drought exposure and to reveal the traits and genes that
might be involved in the tolerance. This review summarizes the physiological and molecular
studies on drought-stress in sugarcane that aimed to understand the response mechanisms and
the genes behind them. We highlight that plant response is based on two mainly strategies:
dehydration avoidance and dehydration tolerance, which must drives all the studies. We also
bring an overview of transgenic studies in sugarcane, which aims tolerance, with emphasis on
the potential strategies to accomplish this objective.
Introduction
Environmental conditions limit plant growth and crop productivity (Lobell et al.,
2011; Mahajan and Tuteja, 2005). Drought is considered the most deleterious abiotic factor,
affecting crop productivity worldwide (Rampino et al., 2006; Wang et al., 2003). Sugarcane,
an important source of sugar and ethanol, is extremely water demanding to reach high
productivity, with water needs between 1,500 and 2,000 millimeters over the growing season
(2015). In a survey on losses due to water deficit in sugarcane, Gentile et al. (2015) found
reductions up to 40% in productivity (2015). For this reason, production areas are
70
concentrated to those with favorable rain regime to sugarcane growth and development
(Moreira et al., 2007), while in areas where irrigation is required there are additional costs that
reduce crop profit (Walter et al., 2013).
In this scenario, drought-resistant sugarcane plants are of paramount importance.
Plants have evolved degrees of resistance by activation of stress-responsive genes to cope
with drought stress (Hirayama and Shinozaki, 2010; Hu and Xiong, 2014; You and Chan,
2015) and much effort has been done to identify these key genes (Hu and Xiong, 2014; Wang
et al., 2016; Wang et al., 2003; Yamaguchi and Blumwald, 2005). Biotechnology and
molecular breeding techniques are thought to be crucial tools to enhance crop productivity
under drought stress. Despite the amount of information that has been produced regarding to
drought response pathways in plants, engineering for drought resistance is still a great
challenge (Hu and Xiong, 2014; Wang et al., 2016; Wang et al., 2003). This is not only owing
to the complexity of the response, which involves many different genes and mechanisms (Hu
and Xiong, 2014; Wang et al., 2016; Wang et al., 2003), but also due to the difficulty of
defining stress tolerant traits and mimicking what happens on the field in experiments under
controlled conditions (Cominelli et al., 2013; Tardieu, 2011).
The objective of this review is to report recent advances in the study of drought stress-
response mechanisms in sugarcane to contribute to a better understanding of drought
resistance in this crop, taking into consideration the molecular, biochemistry, physiology and
experimental condition perspectives. We also bring an overview of how the studies have been
conducted so far to engineer a tolerant sugarcane plant, highlighting what we consider to be
promising strategies to achieve this goal.
Sugarcane morphological and physiological responses under drought
Sugarcane development can be divided into three stages: germination, vegetative
growth and flowering. The vegetative stage is the target of many studies because of its
commercial importance (Bonnett, 2014). In addition, the susceptibility of sugarcane to water
stress is greater in the stem elongation phase (Inman-Bamber and Smith, 2005; Machado et
al., 2009) and leaf and tillering development (Machado et al., 2009; Ramesh, 2000) due to the
high water demand. However, moderate drought during the development of the culm
(maturation phase) has positive effects on sucrose yield, since photosynthesis is less affected
than growth, driving CO2 assimilated to sucrose accumulation into the stalk (Inman-Bamber,
2004).
Drought stress affects the entire plant, from the shoot to root. Morphological and
physiological responses of sugarcane plants can vary according to the genotype, the duration
(rapid or gradual) and the intensity (severe or mild) of stress and also to the tissue in question
(Bartels and Sunkar, 2005; Da Graça et al., 2010; Inman-Bamber et al., 2012; Smit and
Singels, 2006). The most common alterations observed in sugarcane during drought stress are
leaf rolling, early stomatal closure, leaf senescence and reduced leaf area (Inman-Bamber et
al., 2012; Inman-Bamber and Smith, 2005). Moreover, sugarcane growth is impaired under
drought, since the cell elongation is interrupted (Inman-Bamber and Smith, 2005; Machado et
al., 2009) and elongation of leaves is more affected than the stem (Inman-Bamber, 2004;
Inman-Bamber et al., 2008). Root development is also influenced by water deficit (Inman-
Bamber and Smith, 2005; Smit and Singels, 2006). It has being observed changes in the root
distribution (Smith et al., 2005) and, as harmful consequences of stress, root length, root
surface area and root volume can significantly be reduced by even a short drought imposition
period (Jangpromma et al., 2012).
71
Under moderate water stress, sugarcane plants show a decrease in stomatal
conductance (gs), transpiration rate (E), internal CO2 concentration (Ci) and photosynthetic
rate, mainly due to stomatal limitations (Da Graça et al., 2010; da Silva et al., 2012a; Du et
al., 1996; Endres et al., 2010; Inman-Bamber and Smith, 2005; Medeiros et al., 2013; Silva et
al., 2007). This is the first line of defense when sugarcane plants are subjected to dehydration
(Inman-Bamber and Smith, 2005). However, non-stomatal limitations have also been reported
as cause of photosynthesis inhibitions after water deficit in sugarcane (Ribeiro et al., 2013).
When drought stress becomes severe, the decline in photosynthetic rate is mainly caused by a
decrease in enzyme activity, such as phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPcase) and
ribulose-1,5-biphosate carboxylase (Rubisco) (Du et al., 1996; Inman-Bamber and Smith,
2005; Lakshmanan and Robinson, 2014).
Photosynthesis rate is also impacted by sugar accumulation in the leaves (McCormick
et al., 2008). In this way, low sugar content promotes photosynthesis and reserve
mobilization, while high sugar content promotes growth and carbohydrate storage
(Goldschmidt and Huber, 1992). These molecules can act as hormones, triggering differential
gene expression (Gupta and Kaur, 2005). Besides playing this signaling role, under abiotic
stress, soluble sugar promotes osmotic adjustment, preventing dehydration. For example, an
increase in trehalose content can provide protection against water shortage and damages to
cell membrane (Delorge et al., 2014). This capacity to accumulate trehalose was demonstrated
in sugarcane roots under drought. Moreover, an increase in soluble sugar was observed due to
starch hydrolysis, maintaining the carbon supply even in a reduced CO2 fixation condition,
facilitating the recovery after stress (Sales et al., 2012).
Drought-resistant sugarcane
First of all, it is crucial to understand the concept of a drought-resistant cultivar (Blum,
2005). Stress is defined as any restriction of normal functions and development that plants
have to confront during their life cycles. In order to survive and grow under stress, plants have
evolved mechanisms of resistance, which comprises the concepts of escape, avoidance and
tolerance (Levitt, 1972).
Escape encompass mechanisms that do not permit the stressor agent to get in
contact with the plant, for example, rapid development to complete life cycle
before drought stress (Kooyers, 2015);
Dehydration avoidance involves mechanisms to sustain high water status or
cellular hydration, such as low stomatal conductance during drought stress (Blum,
2005; Kooyers, 2015), and
Dehydration tolerance is referred to mechanisms that allow plants to withstand
and conserve plant function despite the stress (Blum, 2005; Levitt, 1972).
Those mechanisms are not exclusive and the same plant can present a combination of
them (Bueno et al., 2006; Pimentel, 2004). Avoidance mechanisms are important traits in
areas with terminal drought, mainly because it enhances capture of soil moisture, limiting
water loss and retaining cellular hydration, thereby, allowing crop recovery when re-watered.
However, those mechanisms reduce biomass accumulation in drought scenarios other than
72
severe by decreasing transpiration through reduced leaf area, limited growth and stomatal
closure (Blum, 2005; Cominelli et al., 2013; Tardieu, 2011). On the other hand, tolerance
mechanisms are positive traits to mild and moderate stress conditions, because these
mechanisms allow growth maintenance during the stress. Tolerance traits are directly linked
to high stomatal conductance, sustaining the photosynthesis rate and also heat stress
avoidance by decreasing leaf temperature (Blum, 2005; Cominelli et al., 2013; Tardieu,
2011).
All concepts considered, this section brings an overview of some morphological and
physiological alterations that have been used so far as accurate traits to differentiate degrees
of resistance in sugarcane genotypes by the researchers and breeders (Table 1 and 2). In spite
of the definition of drought resistance, it is noted that most of the studies consider tolerance
and resistance as synonymous. Therefore, the genotypes are classified into tolerant or
sensitive based on features other than the differences between avoidance and tolerance
mechanisms. For this reason, in this review, we follow the author’s classification, even when
the mechanisms are not discriminated.
As discussed above, dehydration tolerance mechanisms are linked to a better
performance regarding to yield. Some traits can be used to access this performance. For
example, Silva et al. (2008) concluded that higher productivity under stress is associated with
higher stalk number, stalk height and stalk weight. On the other hand, stalk diameter shows to
be fairly variable among varieties, being more dependent on the genotype than the
environment (Da Silva and Da Costa, 2004; Domaingue, 1995; Silva et al., 2008; Soares et
al., 2004). Leaf chlorophyll content (SPAD index), leaf temperature, photosynthesis rate,
stomatal conductance (gs) and transpiration rate (E) are also used as an indirect selection tool
of sugarcane genotypes tolerant to drought (da Silva et al., 2012b; Endres et al., 2010; Silva et
al., 2007). Leaf chlorophyll content is an indicator of a “stay-green“ phenotype, as observed
in late-senescence cultivars, being an important characteristic for sustaining yield potential
(Blum, 2005; Thomas and Howarth, 2000). Considering the definition of tolerance
mechanisms, genotypes with lower leaf temperature, higher stomatal conductance and higher
transpiration under drought condition have tolerant features and therefore a pool of genes
involved in tolerance.
Fluorescence emission has been used as an indirect indicator of photochemical
capacity. Light energy, when absorbed by the photosystem II (PSII), can be converted into
photochemical energy (in the form of ATP and NAPH) or be dissipated as heat or
fluorescence. Thus, all the photochemical reactions affect the fluorescence emission. For
example, if the electron transport is impaired, the result is a higher fluorescence production
(Guo and Tan, 2015). Several studies have reported the diminishing of Fv/Fm (Fig. 1) when
sugarcane plants are submitted to drought stress (Da Graça et al., 2010; Silva et al., 2007;
Silva et al., 2014a; Silva et al., 2013). This parameter is broadly used to indicate the
maximum energy that can be converted into chemical energy or photochemical quenching
(Silva et al., 2014a). The reduction of photosystem II quantum yield (PSII yield or Fv’/Fm’)
(Fig. 1) has also been reported as a drought stress effect in sugarcane (Cha-Um and
73
Kirdmanee, 2008; Ribeiro et al., 2013). Higher Fv’/Fm’ can be an indicator of a genotype with
better performance under mild water deficit (Silva et al., 2007).
Root characteristics are also helpful to identify the ability of many plants to adapt to
drought stress (Songsri et al., 2008; Wang et al., 2009). In sugarcane, the development of
deep and large root systems can be used as selection criteria for drought resistance (Smith et
al., 2005). Higher root length density result in better water uptake, a positive trait when deep
soils moisture is available (Blum, 2005; Tardieu, 2011; Tardieu et al., 1992). Endres et al.
(2010) found a drought resistance genotype with better performance under drought stress
because of a higher root density, which allows stomatal opening maintenance in a broader
range of leaf potential.
In sum, drought-resistant sugarcane can be a result of two different strategies:
dehydration avoidance and dehydration tolerance. Because these strategies are linked to the
intensity of stress (mild, moderate and severe), they can have positive or negative effects
depending on the drought scenario (Fig. 2). Therefore, molecular studies involving
engineering tolerant plants should consider these strategies, since they reflect the different set
of genes and alleles that play important roles in specific drought environment. Lastly, some of
the traits are useful to access levels of resistance (Table 1 and 2) and are essential to drive
drought assays to find the keys genes and mechanisms involved in sugarcane drought
response.
Morphological and physiological changes are consequences of diverse signaling
cascades. Drought stress signaling networks trigger biochemical processes, accompanied by a
major change in gene expression. Some knowledge of stress-induced metabolic changes in
sugarcane, such as: increase of ABA levels, enhanced production of reactive oxygen species
(ROS), enzymatic and non-enzymatic ROS scavenging, changes in amino acids profile and
lipid peroxidation are compiled below and summarized in Fig 3.
Drought stress and ABA signaling
Abscisic acid (ABA) plays a key role as mediator between environmental constraints
perception and cellular stress response in plants, review by Himmelbach et al. (2003). ABA is
mainly biosynthesized and metabolized in vascular tissues but acts in distant guards cells
(Umezawa et al., 2010) and its signaling occurs through different tissues and cell types by
efflux and influx through specific transporters (Wilkinson and Davies, 2010). The
accumulation of ABA under drought conditions triggers multiple adaptive responses, for
instance: stomatal closure; reduction growth rates of leaf and stem; deeper root system; higher
root and shoot hydraulic conductivity and also non-specific stress-induced mechanisms,
including assimilate remobilization; induction of senescence; maintaining turgor tension;
expression of antioxidant proteins; and seed dormancy (Chaves et al., 2003; Han and Yang,
2015; Parent et al., 2009; Zeevaart and Creelman, 1988).
Regarding to stomatal movement, ABA is one of the most important regulatory
signaling molecule (An et al., 2016; Dodd, 2003; Tanaka et al., 2005). According to Li et al.
(2016), when sugarcane plants are exposed to 3, 7 and 9 days of drought stress, the stomatal
74
conductance and transpiration rate decrease gradually, while ABA content increases
dramatically. It is known that the stomatal closure in plants can be induced by endogenous
and exogenous ABA supply (Wilkinson and Davies, 2002) via one of several signaling
pathways (Neill et al., 2008), involving other intermediate molecules, including secondary
metabolites and ions (An et al., 2016; Li et al., 2006; Wang and Song, 2008). For example, an
increase in H2O2 mediate by ABA signaling pathway raises cytosolic Ca2+ concentration in
guard cells, inducing stomatal closure (Pei et al., 2000).
Redox changes mediated by ABA also interfere in physiological antioxidant defense
system (Zhang et al., 2006a). Jiang and Zhang et al. (2002) demonstrated that the inhibition
of ABA biosynthesis reduces ROS generation and the antioxidant enzymes expression in
maize leaves under drought stress. In addition, several authors suggest that H2O2 has an
important intermediary role between ABA signal transduction pathway and the induction of
antioxidant genes (Guan et al., 2000; Jiang and Zhang, 2001, 2002), since ABA promotes
H2O2 production, which in turn activates the mytogen-activated protein kinases (MAPK)
signaling pathway (Zhang et al., 2006a).
ABA-response to environmental stresses can involve cis-acting elements and trans-
acting factors (Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2007). ABRE (ABA responsive
element) works as a cis-acting DNA element involved in ABA-regulated gene expression and
is related to dehydration responses (Narusaka et al., 2003; Shinozaki and Yamaguchi-
Shinozaki, 1997). The DRE (dehydration-responsive element) acts together with ABRE in
response to ABA to induce the rd29A gene (stress-responsive gene) (Narusaka et al., 2003).
The rd29A promoter from Arabidopsis is activite in sugarcane (Wu et al., 2008), suggesting
the pathway is conserved between the two species. Basic leucine zipper (bZIP) transcription
factors family regulate physiological and stress responses. According to Schlögl et al. (2008),
ABA regulates six sugarcane bZIPs, with two genes being up-regulated (ScbZIP29 and
ScbZIP31) and four genes down-regulated (ScbZIP21, ScbZIP24, ScbZIP70 and ScbZIP79) in
sugarcane plants exposed to ABA in vitro. The authors suggested a model where ABA-
activated kinase proteins activate or stabilize bZIPs proteins by phosphorylation, which in
turn could bind to cis-elements (e.g ABRE and/or DRE), controlling gene expression (Schlögl
et al., 2008).
Among ABA-responsive genes involved in drought response in sugarcane, the
SoNCED encodes a 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, that controls a rate-limiting step in
ABA biosynthesis and is induced in leaves and roots tissues during stress, enhancing ABA
accumulation (Li et al., 2013). SoDip22 (sucrose-phosphate synthase) is involved in the
regulation of water status in bundle sheath cells (Sugiharto et al., 1997). The ScCAT1
(catalase) gene protects against ROS induced by environmental stimuli (Su et al., 2014). The
SodERF3 gene, encoding a transcriptional regulator of ethylene response, resulted in taller
plants when overexpressed in tobacco (Trujillo et al., 2008).
These data indicate that sugarcane shares the mechanisms controlled by ABA that
allow plants to withstand drought, as observed in several. This knowledge can be used for
75
crop improvement and development of genotypes with superior performance under water
deficit conditions.
ROS accumulation and antioxidant activity
ROS are by-products of several metabolic reactions in plants, such as photosynthesis
and respiration (Ahmad et al., 2010). Their biological function depends on the amount of
molecules produced and the cellular scavenging rates (Mittler et al., 2011). ROS are key
regulators of several processes, including growth, development, response to biotic and abiotic
stimulus and programmed cell death (Baxter et al., 2014; Luis, 2015; Mittler et al., 2011).
When plants are submitted to long periods of drought stress, changes in cellular homeostasis
induce ROS outburst. If the production overcomes antioxidant mechanisms, different cellular
outcomes take place, for example, damage to membranes, DNA and proteins, which may
result in cell death (Cruz de Carvalho, 2008; Gill and Tuteja, 2010; Miller et al., 2010).
Whereas, at low levels, ROS are involved in relaying stress signal to activate acclimation and
defense pathways (Mittler et al., 2004).
The antioxidant defense in plants is divided into enzymatic and non-enzymatic. The
superoxide dismutase (SOD) activity plays the first line of enzymatic ROS scavenging,
catalyzing the conversion of O2- into a H2O2 within the cell. In sugarcane, SOD activity is
genotype-dependent and is also modulated by drought (dos Santos and de Almeida Silva,
2015; dos Santos et al., 2015; Hemaprabha et al., 2004; Jain et al., 2015; Sales et al., 2015).
Moreover, Jangpromama et al.(2010) showed that sugarcane cultivars classified as drought-
tolerant exhibit higher levels of SOD activity under water deficit conditions. Considering that
sugarcane cultivars display different SOD isoforms with a complex expression pattern, in
which some plants showed higher expression level of a different SOD isoform, Boaretto et al.
(2014) and Cia et al. (2012) speculated that some SOD isoforms may display a major effect
on antioxidant response in sugarcane plants during stress conditions.
The second point of antioxidant enzymatic defense includes the hydrogen peroxide
scavenging (Cruz de Carvalho, 2008; Mittler, 2002). APX (ascorbate peroxidase) and CAT
(catalase) activities regulate redox levels in cells (Luna et al., 2005) and may contribute to a
better ability of some sugarcane cultivars to decompose H2O2 under drought conditions (dos
Santos and de Almeida Silva, 2015). APX activity is increased in cultivars evaluated under
water deficit, while CAT activity depends on sugarcane genotypes and the correlation with
drought resistance is not clear (Boaretto et al., 2014; Cia et al., 2012; dos Santos and de
Almeida Silva, 2015; dos Santos et al., 2015; Sales et al., 2015). Even though, some authors
consider CAT as a potential marker to assess the drought sensitivity among sugarcane
cultivars (dos Santos et al., 2015).
Non-enzymatic antioxidant molecules can work synergistically to enzymatic ROS
scavenging mechanisms to protect plant cells against oxidative damage. The non-enzymatic
system is composed by ascorbic acid (AA), reduced glutathione (GSH), α-tocopherol,
carotenoids, phenolics, flavonoids and proline (Das and Roychoudhury, 2014; Gill and
Tuteja, 2010). Proline (Pro) participates in antioxidant response as an efficient scavenger of
OH and 1O2. Furthermore, Pro can function as compatible osmolyte, molecular chaperone,
76
carbon and nitrogen storage and also in keeping the cytosolic pH balance (Das and
Roychoudhury, 2014; Verbruggen and Hermans, 2008). During drought, Pro is accumulated
in plants mainly due to increased synthesis and reduced degradation. Pro biosynthesis from
glutamate is catalyzed by the enzymes Δ1-pyrroline-5-carboxylate (P5C) synthetase (P5CS)
and P5C reductase (P5CR). Alternatively, Pro can be formed from ornithine that is converted
into P5C/GSA via ornithine-δ-aminotransferase (OAT) (Bhaskara et al., 2015; Liang et al.,
2013).
According to Guimaraes et al., (2008) free-proline content is correlated to drought
tolerance level of different sugarcane cultivars. The mechanisms that Pro plays during
drought were evaluated using transgenic sugarcane plants expressing a heterologous P5CS,
showing a positive correlation between enhanced proline content, biomass yield and
photoquemical efficiency PSII (Molinari et al., 2007). The authors also suggest that stress-
inducible Pro accumulation in transgenic plants acts as component of antioxidant defense
system rather than an osmotic adjust mediator. Moreover, Iskander et al. (2011) showed that
Pro has the lowest increased level among other amino acids in mature sugarcane culms plants
under drought. According to these authors, all amino acids concentration was increased after
water stress, especially asparagine, in young and mature sugarcane culms. The Pro
concentration supports its role as an antioxidant defender, while other amino acids act as
osmoprotectant during sucrose accumulation in the culms. The accumulation of free amino
acids is commonly found in plants under stresses (Pagariya et al., 2012; Patade et al., 2008;
Rutherford, 1989), raising the osmotic pressure, and therefore, operating as an osmotic
adjustment mediator (Boaretto et al., 2014; Molinari et al., 2004; Venekamp et al., 1987).
Taken all together, the data point to a correlation between drought stress and the
response of the antioxidant system in sugarcane. The activity of ROS-scavenging
enzymes can be used as drought stress-biomarker in sugarcane, providing insights into
resistance levels of cultivars.
Lipid Peroxidation
The peroxidation of lipids is the most obvious symptom of oxidative stress in plants,
being an indicator of ROS damage (Huang et al., 2012). Under drought, when the levels of
ROS exceed the scavenging capacity, lipid peroxidation (LP) of membranes increases,
effecting cellular functioning (Montillet et al., 2005). The most common LP pathway includes
O2 molecules originated from photosystem II (PSII). These molecules are incorporated into
plastid membranes and catalyzed by lipoxygenases (LOX) into LOOH (lipid hydroperoxide),
which makes the membrane vulnerable to fragmentation and leads to a cascade of damaging
events (Barclay and McKersie, 1994; Skorzynska-Polit, 2007). The fragmentation process can
trigger and propagate new radicals. For instance, peroxyl radicals (LOO*) generates a high
number of intermediates during LP, changing membrane structure and causing severe
membrane damage or death (Scandalios, 1993; Spiteller, 2003). Malondialdehyde (MDA) is
one of different products of this process and causes changes in cell membrane properties:
fluidity, ion transport and enzyme activity (Sharma et al., 2012). Thiobarbituric acid reactive
substances (TBARS) is extensively used to monitoring changes in the level of aldehydic
77
products (MDA and 4-HNE) and is accepted as a marker of oxidative stress in plants (Hodges
et al., 1999; Pagariya et al., 2012; Shulaev and Oliver, 2006).
High levels of H2O2 accompanied by an increase in lipid peroxidation were observed
in young sugarcane plants during the initial growth phase under severe water stress (Boaretto
et al., 2014). In addition, it was demonstrated a correlation between drought tolerance and
lower levels of lipid peroxidation (Cia et al., 2012; Sales et al., 2015). According to Abbas et
al. (2014) lipid peroxidation is one among the several traits used to identify drought tolerant
sugarcane varieties.
In sum, drought stress affects several morphophysiological and metabolic
characteristics, indicating sugarcane behavior when its normal function and development are
restricted. In order to survive and grow under stress, sugarcane plants evolved mechanisms
that block or minimize the damage and that allows plants to withstand the stress. All these
changes reveal the complexity of the sugarcane drought response, which its highly variable
among genotypes and stress conditions.
Differential gene expression under drought stress
In order to better understand the molecular basis of the physiological responses of
sugarcane under stress conditions, high throughput studies have been conducted, showing that
gene expression is largely modified by drought stress in this crop (Papini-Terzi et al., 2005;
Papini-Terzi et al., 2009; Rocha et al., 2007b; Rodrigues et al., 2011). Such studies have
focused on signaling transduction and the role of phytohormones, since drought stimuli result
in extensive signaling network, which involves transcription factors, protein kinases and
phosphatases (Rabbani et al., 2003; Singh et al., 2002; Xiong et al., 2002; Zhu, 2001, 2002).
Additionally, as part of the plants responses to drought are ABA-dependent, both drought and
ABA exposure share several differentially expressed genes (Himmelbach et al., 2003; Seki et
al., 2002; Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2007).
Due to its complex genome (highly polyploidy and aneuploidy and an estimated size
of 7,440 Mb), ESTs collections are an important tool to identify sugarcane genes and assess
their function. The Brazilian Sugarcane Expressed Sequence Tags (ESTs) Sequencing Project
(SUCEST) was a breakthrough in the analysis of sugarcane genes. Back in 2003, the
projected sequenced over 238,000 ESTs from different sugarcane tissues and cultivars that
were grouped into approximately 43,000 SAS (Sugarcane Assembled Sequences) (Vettore et
al., 2003), providing the basis for important transcriptome studies (Camargo, 2007; Nogueira
et al., 2003; Papini-Terzi et al., 2005; Rocha et al., 2007b; Rodrigues et al., 2011; Rodrigues
et al., 2009). For example, hybridization-based approaches based in DNA arrays have been
the most used tool for large-scale gene expression profiling analysis in sugarcane under
drought stress (Lembke et al., 2012; Papini-Terzi et al., 2009; Rocha et al., 2007b; Rodrigues
et al., 2011; Rodrigues et al., 2009).
Rocha et al. (2007b), Rodrigues et al. (2011) and Li et al. (2016) conducted cDNA
arrays to verify the expression profile in leaves from sugarcane plants submitted to water
deprivation. The data were collected at three sampling times, according to the type of the
78
drought stress applied (Table 3). There are classes of differentially expressed genes conserved
between the experiments and treatments, such as cellular metabolism (eg. cell wall, amino
acid, lipid and protein metabolism), signal transduction (transcription factors, hormone
signaling proteins, calmodulins and kinases), transport (ABC transporter, lipid transfer
protein, aquaporins) hormone biosynthesis (proteins involved in the syntheses of auxin and
ABA), stress response (heat shock proteins, peroxidase). In spited of that, the expression
pattern of individual genes showed considerable differences, notably throughout the time of
stress and certainly also due to intensity of the water deficit.
In an attempt to find a correlation between drought resistance and gene expression
Rodrigues et al. (2009) performed a macroarray study from leaf libraries generated by the
SUCEST project (Table 3). The comparison between genotypes classified as drought tolerant
(SP83-5073) and sensitive (SP90-1638) resulted in 165 genes differentially expressed in the
former and 432 in the latter. Both genotypes present an increase in the number of
differentially expressed genes along the time and intensity of stress. During the experiment,
the sensitive plants showed earlier symptoms of stress, such as leaf rolling and stomatal
closure, while the tolerant started showing the same symptoms after moderate stress. The
authors suggested that these morphophysiological data corroborated with the expression
profile, since the sensitive plants activate metabolic changes earlier than the tolerant plants:
most of the differentially expressed genes (93.3%) were up-regulated under severe stress in
the tolerant cultivar. Whereas, in the sensitive plants, 36% of the differentially expressed
genes were repressed, including stress-responsive genes (e.g.: heat shock proteins) and genes
involved in photosynthesis. An interesting finding described by all those studies is the fact
that the largest functional class is composed by unknown proteins, revealing the complexity
of sugarcane genome and also a possible new exploratory field regarding to a sugarcane-
specific response to drought conditions.
Another fact that deserves attention is the expression of antisense transcripts in
sugarcane plants submitted to drought (Lembke et al., 2012), suggesting an additional layer to
the complex gene regulation under stress condition (Lapidot and Pilpel, 2006). In this context,
post-transcriptional regulation during water stress has been described in sugarcane, especially
after the next generation sequencing (NGS) has revolutionized transcriptomics studies. For
instance, analyses focused on the expression profiles of sugarcane miRNAs under drought
conditions (Ferreira et al., 2012; Gentile et al., 2013; Thiebaut et al., 2014) demonstrate that
the microtranscriptome is modulated in different genotypes and growth phase to cope with
different types of stress, as reviewed by Gentile et al (2015). In brief, besides the complexity
of drought response in plants, all these studies draw differences among sugarcane genotypes
regarding to drought resistance and also show a great variation in the gene expression profile
due to the stress conditions.
It is important to highlight that these experiments were performed on pot and
withholding the water in a few days period (table 3), mimicking a severe drought scenario,
evaluating avoidance traits rather than tolerance. According to Skirycz et al. (2011), mild
conditions would favor plants maintaining growth, photosynthesis and metabolism under
stress, opening a new paradigm for tolerance alleles identification and must be the target of
79
new studies. The only study, to our knowledge, using field grown sugarcane plants is the one
conducted by Gentile et al. (2013), that evaluated micro RNAs. When the expression profiles
of these field grown plants were compared with glasshouse plants (Ferreira et al., 2012), a
wide array of differences were observed. Therefore, studies with plants under field conditions
certainly will provide a different set of genes and expression profiles used by plants that
might not be detected under glasshouse conditions.
The interplay between drought stress and sucrose accumulation has also been
investigated (Iskandar et al., 2011; Papini-Terzi et al., 2009). When differentially expressed
genes from genotypes with different Brix (sugar) levels were compared to those gene
expression data of sugarcane subjected to drought produced by Rocha et al. (2007b), an
extensive overlap between both datasets were found (Papini-Terzi et al., 2009). A further
investigation was performed by Iskandar et al. (2011) and despite sharing differentially
expressed stress-related genes, the expression profile of both conditions are different. Based
on that, the authors suggest that the stress caused by sucrose accumulation in the culms has
different responsive mechanisms than those induced by water deficit.
Despite the sugarcane transcriptome responses to drought stress vary widely according
to the genetic background of the cultivar and the stress applied, Iskandar et al. (2011)
indicated that a strong correlation can be define between drought stress and the expression of
a sequence similar to dehydrin. The dehydrin proteins are a group of late embryogenesis
abundant (LEA) proteins and has a role in the protection of cellular membranes and
organelles during dehydration in sugarcane leaves (Wahid and Close, 2007). As the stress
became more severe, the expression of this gene is also induced (Rocha et al., 2007b) and
there is no significant difference in its expression regarding to sucrose content (Iskandar et al.,
2011; Papini-Terzi et al., 2009). For these reasons, it can be used as a molecular marker for
drought stress in sugarcane experiment, in order to validate the physiological stress (Ferreira
et al., 2012; Gentile et al., 2013).
As the roots are the first system to detect water deficit and to signal the stress to other
cells, tissues and organs, the study of their expression pattern under drought is a helpful
strategy to understand the adaptive mechanisms involved in drought resistance. Vantini et al.
(2015) observed differentially expressed genes between tolerant and sensitive sugarcane
varieties along time (1, 3, 5 and 10 days after water withholding) in root tissues. At the
beginning of the stress (1 and 3 days), genes encoding proteins with protection function
(chaperones, heat shock proteins, antioxidant enzymes and protease inhibitor proteins) were
induced in the tolerant variety. As discussed above, considering that withholding the water
can favor avoidance mechanisms, earlier induction of those genes in the tolerant variety not
necessarily are linked to tolerance, but indeed can reflect avoidance traits. Gene encoding a
protein involved in ABA-response, a trehalose-phosphatase synthase (enzyme involved in the
synthesis of trehalose) and serine/threonine kinase receptors also showed induced expression
in the tolerant variety, reveling differences between sugarcane genotypes caused by drought.
It is known that water channels proteins (aquaporins) are involved in the acclimation
against abiotic stress (Alexandersson et al., 2005; Matsumura et al., 2011; Maurel et al.,
2008). Aquaporins are classified into four subfamilies: PIPs (plasma membrane intrinsic
proteins), TIPs (tonoplast intrinsic proteins), NIPs (26 kDa intrinsic proteins) and SIPs (small
80
basic intrinsic proteins) (Maurel et al., 2008). Da Silva et al. (2013) verified the expression
profile of aquaporins in sugarcane roots under drought stress. Some isoforms (e.g. PIP1-1,
NIP3-1, SIP1-2) were exclusively up-regulated in tolerant varieties, suggesting an
involvement of specific isoforms in avoidance mechanisms in sugarcane.
In general, sugarcane large-scale studies are a very useful tool for gene identification
under drought conditions. Expression analyses have enabled the discovery of genes that are
involved in drought response in sugarcane, but it is still difficult to directly correlate their
function with tolerance levels. One of the reasons is the fact that the varieties used in the
experiment were classified into tolerant and sensitive based on final productivity in field
experiments. This classification cannot be replicated in greenhouse experiments due to
different stress conditions, which is based on withdrawing irrigation, not taking into account
the information on stress symptoms that usually appear after long periods of moderate or mild
stress. In this sense, the mechanisms used by a tolerant variety in the field probably are not
the same used in greenhouse experiments. Lastly, further investigation, such as gene
overexpression or silencing in transgenic plants, are necessary for functional assessment to
link physiological and molecular responses. However, it is also evident the importance of
defining the strategy to apply the stress, since it strongly influences plant responses at the
molecular level.
Relative expression analyses of sugarcane under drought stress
The increased use of transcriptomic approaches has reinforced the necessity of real-
time quantitative PCR (qRT-PCR) as a tool for data validation (Czechowski et al., 2005;
Gutierrez et al., 2008). This technique has been largely used in different sugarcane
transcriptome and microtranscriptome experiments (Ferreira et al., 2012; Gentile et al., 2013;
Vargas et al., 2014), transgenic plant studies (Augustine et al., 2015b; Ramiro et al., 2016)
and expression profile assays under stress (da Silva et al., 2013; Thiebaut et al., 2014; Yang et
al., 2014). The presence of suitable internal controls is critical for real-time reliability (Bustin,
2002; Bustin, 2000). Despite its extensive use, parameters to qRT-PCR data normalization
remain a source of debate (Bustin, 2002; Bustin, 2000; Gutierrez et al., 2008).
Among classical reference genes (25S rRNA, GAPDH, actin and tubulin), Iskandar et
al. (2004) concluded that GAPDH is the best protein-coding sugarcane gene for
normalization. These authors evaluated 2 sugarcane cultivars and 3 other Saccharum species
under drought and salinity conditions. Recently, some works have combined qRT-PCR assay
and statistical tools to determine the most suitable gene to be used as reference in sugarcane
(Guo et al., 2014; Ling et al., 2014; Silva et al., 2014b). Silva et al (2014b) analyzed the
performance of 6 candidate genes encoding 25S rRNA, GAPDH, α-tubulin, histone H1,
ubiquitin and S-adenosylmethionine decarboxylase in roots samples of drought-tolerant and
drought-sensitive sugarcane varieties exposed or not to drought for 24 h. They observed that
GAPDH, α-tubulin and histone H1 were the most reliable genes for normalization of
sugarcane gene expression analyses under stress.
In a broader analysis, Ling et al (2014) analyzed the stability of 13 candidate reference
genes across a wide range of sugarcane samples, comprising five different tissues, plants
under abiotic stress and hormone treatment. Not only the authors considered GAPDH, eEF-1α
and Eukaryotic initiation factor 4 α (EIF-4α) the most stable genes for sugarcane qRT-PCR,
but they also found that a combination of some genes had a better performance in different
81
sets of samples: CUL (Cullin) and eEF-1α were more suitable for normalization of hormone
treatment experiments, CAC and CUL for abiotic stress and CAC (Clathrin adaptor complex),
CUL, APRT (Adenine Phosphoribosyl Transferase) and TIPS-41 (Tonoplastic Intrinsic
Protein 41) for tissue samples. During an investigation of sugarcane under drought and
salinity stress, Guo et al (2014) found similar results. After statistical validation, GAPDH and
eEF-1α were considered good reference genes for normalization of sugarcane samples under
salinity and drought stress. Additionally, they found that despite the lower expression of given
target gene, when it is normalized with two or more reference genes, its expression data
becomes less variable across the samples. Thus, the most reliable genes for normalization of
sugarcane under stress are CAC+APRT, GAPDH+eEF1 and CAC+CUL.
Finally, the association of qRT-PCR and statistical analysis is the best tool for
reference genes selection. Further, reference gene validation for each set of experiment and
the use of them in combination are decisive to ensure a better performance of relative
expression analysis under drought conditions.
Engineering drought-resistance sugarcane
Currently, only few works have succeeded in improving drought resistance in
sugarcane plants by using transgene approaches (Table 4). In all of them, the chosen gene is
associated with drought mechanisms that were already confirmed in other species. These
genes are involved with important pathways regarding to water deficit response, including
gene regulation, sugar metabolism and antioxidant defense (Augustine et al., 2015c; Ramiro
et al., 2016; Reis et al., 2014; Zhang et al., 2006b).
Regulatory genes are potential candidates to develop plants more resistant to drought
(Reis et al., 2014). DREB genes constitute the first family of transcription factors that were
associated with gene regulation under abiotic stress (Moran et al., 1994). The AtDREB2A CA
overexpression enhanced drought resistance in sugarcane, as demonstrated by higher relative
water content (RWC), photosynthetic rate, sucrose content and bud sprouting, without
affecting negatively biomass accumulation (Reis et al., 2014). Additionally, the
overexpression of Erianthus arundinaceus DREB2 gene increased drought and salinity
tolerance in sugarcane according to Augustine et al. (2015c). However, when associated with
the PDH45 (pea DNA helicase 45) gene, the authors suggested that the transgenic plants
showed higher salinity tolerance but lower drought tolerance compared to DREB2 individual
overexpression. The PDH45 gene encodes a motor protein from the helicase class. This
protein group plays an important role, being responsible for nucleic acids duplex unwinding.
Besides, Augustine et al. (2015b) had demonstrated that PDH45 overexpression in sugarcane
plants enhanced drought and salinity tolerance.
HSP70s are molecular chaperones involved with membrane and protein stabilization,
reestablishing the normal protein conformation under stress conditions. Sugarcane transgenic
plants overexpressing an E. arundinaceus HSP70 showed enhanced drought and salinity
stress resistance, exhibiting high membrane thermostability, RWC, gas exchange parameters,
chlorophyll content and photosynthetic efficiency under water deficit and better bud
germination ability under salt stress (Augustine et al., 2015a).
82
The manipulation of genes related to osmotic gradient under water deficit is an
important approach to study drought resistance mechanisms (Nelson, 1994; RAZA et al.,
2016). The Arabidopsis H+-PPase (AVP1) gene encodes a vacuolar membrane protein
capable to increase vacuolar solute content by H+ uptake from the cytoplasm into the
vacuoles. The AVP1 overexpression in transgenic sugarcane improved drought and salt
resistance (Kumar et al., 2014; RAZA et al., 2016). The transgenic plants showed an
increased RWC and leaf water, osmotic and turgor potential of shoots and size, depth and
biomass of roots.
Regarding to sugar metabolism, transgenic sugarcane plants overexpressing a
trehalose synthase gene (TSase) from Grifola frondosa improved drought resistance through
trehalose accumulationZhang et al. (2006b). The TSase-overexpressing lines show higher
chlorophyll contents and antioxidant enzymes activity, lower plasma membrane permeability
and reduced malondialdehyde content.
The BAX subfamily stands out among the proteins that regulate the induction of ROS
signaling (Watanabe and Lam, 2008). The overexpression of a BAX inhibitor from A.
thaliana (BI-1) enhanced drought resistance in sugarcane plants for more than 20 days, by
suppressing endoplasmic reticulum-stress-induced plant cell death (Ramiro et al., 2016).
All the efforts in increasing drought resistance in transgenic sugarcane so far were
done through the overexpression of target genes (Table 4). This approach allows to identify
and characterize genes related to stress resistance, even those functionally redundant
(Abdeeva et al., 2012; Ito and Meyerowitz, 2000; Kondou et al., 2010; Nakazawa et al.,
2001). This technology became more widespread compared to gene silencing, because
sugarcane genome complexity and high polyploidy make the last more difficult.
The use of constitutive promoters is the most common approach in sugarcane
transformation. The cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S gene promoter is the most widely
used for plant transformation (Porto et al., 2014), producing high transgene expression levels
(Dutt et al., 2014). Its effects can be increased by including additional sequences, as
duplicated 35S elements (Dhadi et al., 2009). Although these high levels of transgene
expression are particularly common in dicotyledonous plants (Battraw and Hall, 1990; Benfey
et al., 1990), in monocotyledonous plants 35S activity and stability are significantly lower
(Christensen et al., 1992; Gupta et al., 2001; Lakshmanan et al., 2005; Park et al., 2010;
Weeks et al., 1993). Recent researches point to ubiquitin promoters as an emerging choice for
constitutive expression in transgene sugarcane (Lakshmanan et al., 2005), mainly due to their
transgene expression levels being significantly higher compared to other promoters, such as
CaMV 35S promoter, the rice actin Act1 promoter (McElroy et al., 1991) and the synthetic
Emu promoter (Last et al., 1991).
The use of conditional promoters can be more advantageous (Dutt et al., 2014; Kizis
and Lumbreras, 2001), since these promoters theoretically allow the control of gene
expression in specific developmental stages and tissues in response to environmental
stimulus. This could reduce yield losses in stress tolerant crops, since it eliminates the
negative effects in plant development caused by the imbalance in transgene expression under
83
no stressed conditions (Peleg and Blumwald, 2011). Reis et al. (2014) used the stress-
inducible ABA-responsive Rab17 gene promoter to induce the DREB2A CA gene expression
from A. thaliana in sugarcane plants, avoiding plant growth problems associated with
constitutive promoters (Kasuga et al., 1999). However, the availability of conditional
promoters for sugarcane is limited (Chakravarthi et al., 2016).
Two main strategies are widely used to produce transgenic plants in sugarcane: direct
transformation via microprojectile (biolistics) (Bower and Birch, 1992) and indirect
transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens (Arencibia et al., 1998). Biolistics is
a common method used for sugarcane transformation (Moore et al., 1999) due to its simplicity
and applicability to a wide range of tissues and genotypes (Lakshmanan et al., 2005).
However, it presents some disadvantages as low reproducibility, integration of a large number
of transgene copies (Zhangsun et al., 2007). On the other hand, Agrobacterium-mediated
transformation has the potential to produce complete and single copy transgene insertions,
stable expression, heritability and lower cost (Lakshmanan et al., 2005; Singh et al., 2013;
Somers and Makarevitch, 2004; Zhangsun et al., 2007). However, its disadvantages include
genotype dependency (Lakshmanan et al., 2005; Shrawat and Lörz, 2006) and low efficiency
(Shrawat and Lörz, 2006). Since both methods have advantages and disadvantages, the best
choice for sugarcane transformation depends on the protocol established in a laboratory, the
expertise of the group and the sugarcane genotype.
There are still many challenges to overcome to produce drought-resistance transgenic
sugarcane, mainly because is also necessary focus the efforts in the evaluation of transgenic
plants under field conditions, considering differences in soil conditions, climates and
possibility of stress combination. Moreover, the sugarcane genome complexity and absence of
published complete genome sequence challenge the biotechnology application to crop
improvement (Lakshmanan et al., 2005). However, there were advances of drought studies in
sugarcane with the contribution of biotechnological tools. The possibility of gene
manipulation and the analysis in the crop have accelerated the functional validation of
drought-response genes.
Conclusion
In despite of the fact that there are some limitations regarding to definition of
tolerant plants, many advances have been made in the study of sugarcane physiological and
molecular responses to drought stress. Most of the molecular responses associated with
sugarcane during drought stress seem to agree with that observed in other crops and model
plants. Genes involved in dehydration avoidance and/or dehydration tolerance trigger all the
drought-resistance mechanisms and the knowledge in sugarcane is compiled in this review.
Drought stress traits should be evaluated considering both strategies used by plants. Many
experiments have been performed through withdrawing irrigation and evaluating plants under
severe condition, in which genes have been characterized and drought-resistance plants have
been developed. All these efforts contribute to a better understanding of sugarcane responses
to a drought scenario. Moreover, it is important to consider information of sugarcane
performance under mild and moderate stresses as the focus of future studies, since it is a more
84
realist condition, which better mimics the field scenario, in order to develop drought-tolerant
sugarcane plants for crop areas.
85
Tables
Table 1: Morphological traits used to differentiate the degrees of drought resistance in sugarcane genotypes.
Morphological Trait Age
(DAP) Stress applied
Time of stress
(Days) Experimental conditions Reference
Number of tiller 60 water withholding 90 F Venkataramana et al. (1986); Silva et al. (2008)
Stalk diameter and length 55; 60;
90
water withholding; 7 cycles
of four days (water supply
at first day followed by three
days of water withholding)
12; 28; 90 G / F Wagih et al. (2003); Silva et al. (2008);
Hemaprabha et al. (2012); Zhao et al. (2013)
Single stalk weight 60 water withholding 90 G / F Silva et al. (2008); Hemaprabha et al. (2012)
Internode length and
weight 60 water withholding 90 G / F Silva et al.(2008); Hemaprabha et al. (2012)
Number of internodes 60 water withholding 90 G / F Silva et al. (2008); Hemaprabha et al. (2012)
Shoot dry mass 60; 83 water withholding 4; 25 G Medeiros et al. (2013); Ribeiro et al. (2013)
Root dry mass 60; 100 water withholding 4; 10 G Jangpromma et al. (2012); Medeiros et al. (2013);
Leaf parameters (lenght,
width and number of green
leaves)
90
7 cycles of four days (water
supply at first day followed
by three days of water
withholding)
28 G Wagih et al. (2003)
Root parameters (lenght,
surface area and volume) 100 water withholding 10 G Jangpromma et al. (2012)
86
Table 2: Physiological traits used to differentiate the degrees of drought resistance in sugarcane genotypes.
Physiological Trait Age
(DAP) Stress applied
Time of stress
(Days)
Experimental
conditions Reference
Photosynthetic rate,
stomatal conductance and
transpiration rate
15; 55;
60; 83;
180
water withholding; 80% of
water lost by (ET); 20% of
available water; 50% capacity
for the pots water retention
4; 12; 15; 25;
60; 70 G / F
Du et al. (1996); Da Graça et al. (2010);
Endres et al. (2010); da Silva et al., (2012a);
Medeiros et al. (2013); Ribeiro et al. (2013);
Zhao et al. (2013); Silva et al. (2013)
PSII (photosystem II
quantum yield)
15; 60;
83; 180
water withholding; 20% of
available water 25; 70; 90 G / F
Silva et al. (2007); Da Graça et al. (2010);
da Silva et al., (2012a); Ribeiro et al. (2013);
Silva et al. (2013)
Activity of enzymes of
photosynthetic apparatus 15 water withholding 4 G Du et al. (1996)
Leaf pigments content
(chlorophylls and
carotenoids)
15; 60;
55; 180
water withholding; 20% of
available water; 50% of
capacity for the pots water
retention
4; 12; 70; 90 F / G
Du et al. (1996); Silva et al. (2007); da Silva et al.,
(2012a); Medeiros et al. (2013); Zhao et al. (2013);
Silva et al. (2013)
Leaf temperature* 15; 180 20% of available water 70; 90 G / F Silva et al.(2007); Da Graça et al. (2010);
da Silva et al., (2012a)
Leaf water potential 15; 60;
83; 180
water withholding; 20% of
available water; 50% of
capacity for the pots water
retention
4; 25; 70; 90 G / F
Du et al. (1996); Silva et al. (2007);
Da Graça et al. (2010); Endres et al. (2010);
da Silva et al., (2012a); Ribeiro et al. (2013);
Medeiros et al. (2013); Silva et al. (2013)
87
Table 3: Experimental conditions of large-scale gene expression assays in sugarcane under drought.
Parameters Rocha et al. (2007 Rodrigues et al.
(2011) Li et al. (2016) Rodrigues et al. (2009)
Genotype SP90-1638 SP83-2847 GT21 SP83-5073 SP90-1638
Age (DAP) 90 60 150 60 60
Experimental
conditions G G G G G
Stress applied water withholding water withholding water withholding water withholding water withholding
Time of stress
(hours) 24, 72 and 120 72, 192 and 240 72, 168 and 216 72, 192 and 240 72, 192 and 240
Hybridization-based
approach 1,545 SAS (microarray)
3,575 ESTs
(macroarray) 15,593 genes
(microarray)
3,575 ESTs
(macroarray)
3,575 ESTs
(macroarray)
Differentially
expressed sequences 93 genes 1,670 ESTs 1,501 genes 165 genes 432 genes
88
Table 4: Sugarcane drought resistance transgenic studies.
Reference Promoter Gene choice Gene function Transformation
method
Age
(DAP)
Time of
stress
(days)
Experimental
conditions
Zhang et al., 2006 p35S
enhanced Tsase
biomolecules
stabilization Agrobacterium 90 15 G/F
Kumar et al., 2014 p35S AVP1 osmotic regulation Agrobacterium 21 15 G
Reis et al., 2014 pRab17 DREB2A CA gene regulation Biolistic 90 6 G
Augustine et al.,
2015a pUbi PDH45
nucleic acids
metabolism Agrobacterium 120 10 G
Augustine et al.,
2015b pUbi PDH4; DREB2
nucleic acids
metabolism; gene
regulation
Agrobacterium/
biolistic 120 10 G
Augustine et al.,
2015c pUbi HSP70
cellular
componentes;
stabilization
Agrobacterium 120 10 G
Ramiro et al., 2016 pUbi BI-1 PCD regulation Biolistic 90 21 G
Raza et al., 2016 p35S
enhanced AVP1 osmotic regulation Biolistic 60 180* G
89
Figure and Table legends
Table 1and 2: DAP: days after planting. ET: evapotranspiration. G: greenhouse. F: field *:
increase under drought.
Table 3: DAP: days after planting. SAS: sugarcane assembled sequence. ESTs: expression
sequence tags. G: greenhouse.
Table 4: PCD: programmed cell death. DAP: day after planting. G: greenhouse. F: field.* :
irrigation reduced 50%.
Figure 1: Fluorescence emission under drought stress. Fluorescence dynamics on dark- or
light-adapted leaves when cultivated under normal conditions (green lines) or under drought
stress (red lines). When leaves are dark-adapted the QA (Plastoquinone) is maximally oxidized
and the PSII is called “open”. The exposure of the leaf to a weak measuring light (asterisks
mark the point where the measuring light was turned on) results in a minimal level of
measured fluorescence (F0). A saturating pulse is emitted (blue arrows) and Fm, or maximum
fluorescence is recorded. The difference between Fm and F0 in called Fv or variable
fluorescence. The Fv/Fm is called maximum quantum yield of QA reduction or PSII
photochemistry. When the leaf is light adapted, the minimal level of fluorescence shifts above
the original background (F’). In this situation less QA is oxidized and when a light pulse is
emitted the maximum fluorescence for light adapted leaves (Fm’) is recorded and its level is
lower that the Fm because when the plants are subjected to stress the photochemical quenching
is diminished due to the photoinativation of the PSII leading to a higher level of the non-
photochemical quenching (NPQ) or the dissipation of energy through heat. Fv’ is calculated as
Fm’-F’. Fv’/Fm’ is called maximum PSII efficiency. This parameter is used to measure the
contribution of the NPQ on the observed changes on the PSII operation.
Figure 2: Scheme of sugarcane drought-response mechanisms.
Figure 3: Known biochemical drought
90
Figures
Figure1:
91
Figure 2:
92
Figure 3:
93
Conflict of Interest
The authors declare that the research was conducted in the absence of any commercial or
financial relationships that could be construed as a potential conflict of interest.
Author Contributions
Contributed equally to this work: TF, MT, DB. Substantial contributions to the conception or
design of the work: TF, MT, DB, LM, PA, GG, GR, VG. Drafting the work: TF, MT, DB, LM, PA,
GG, GR, VG. Revising it critically for important intellectual content: MM, TF, MT, DB. Final
approval of the version to be published: MM. Agreement to be accountable for all aspects of the work
in ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately
investigated and resolved: MM, TF, MT, DB, LM, PA, GG, GR, VG.
Acknowledgments
The Laboratório de Genoma Funcional (LGF) is supported by São Paulo Research
Foundation (FAPESP), National Council for Scientific and Technological Development
(CNPq) and Brazilian Federal Agency for Support and Evaluation of Graduate Education
(CAPES).
94
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Conclusão
O estudo funcional do gene ScatpG, que codifica a subunidade II da ATP sintase
de cloroplasto de cana-de-açúcar, permitiu inferir que os níveis de expressão do gene ScatpG
não é claramente modulados pela seca.
Os dados de expressão de proteínas de cloroplastos de cana-de-açúcar
submetidas ao estresse hídrico, permitiram identificar proteínas induzidas envolvidas no
transporte cíclico de elétrons através do PSI, permitindo inferir seu papel fundamental na
regulação da fotossíntese e na produção de ATP durante o estresse por seca.
Dessa forma, aumentar a capacidade de plantas de cana-de-açúcar a realizar o
transporte cíclico em condições ambientais desfavoráveis é um possível caminho para
produção de plantas com maior tolerância à seca e a outros estresses ambientais
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Anexos
Anexo I: Termo referente a Bioética e/ou Biossegurança
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Anexo II: Declaração refente a direitos autoriais
