UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia
Dissertação
Expressão diferencial da proteína internalina A em Listeria
monocytogenes do sorotipo 4b de diferentes origens em
caldos de enriquecimento seletivos e não-seletivos
Vanessa Silva da Silva
Pelotas, 2011.
2
Expressão diferencial da proteína internalina A em Listeria
monocytogenes do sorotipo 4b de diferentes origens em caldos
de enriquecimento seletivos e não-seletivos
Orientadora: Ângela Nunes Moreira
Co-Orientador: Fabricio Rochedo Conceição
Pelotas, 28 de novembro de 2011.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências (área de conhecimento:
Imunologia Aplicada).
3
Banca examinadora
Prof. Dr. Eliezer Avila Gandra, Centro de Ciências Químicas, Farmacêuticas e de
Alimentos (CCQFA), Universidade Federal de Pelotas.
Dra. Élen Silveira Nalério, Pesquisadora da Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (EMBRAPA Pecuária Sul).
Dra. Daiane Drawanz Hartwig, Bolsista de Pós-Doutorado em Biotecnologia,
Núcleo de Biotecnologia – CDTec, Universidade Federal de Pelotas.
4
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus que iluminou meu caminho, me deu saúde e forças para
continuar a lutar, apesar de todos os contratempos, chegando até aqui.
A minha querida mãe, Maria Glória, pelas companhias de estudos até altas
madrugadas, pelas palavras de carinho e incentivo, por acreditar em mim, pelos
belos exemplos de vida, pelo amor incondicional e incansável dedicação;
Ao meu pai, Álvaro, pelos exemplos e “puxões de orelha” durante minha vida toda,
os quais foram de suma importância para a formação de meus conceitos,
personalidade e, consequentemente, da pessoa que hoje sou.
Ao meu irmão Lucas pela amizade, companheirismo e bom humor diários, que por
várias vezes me pôs em alto astral, justamente nos momentos em que mais precisei.
Ao meu namorado, Guilherme Camargo pelo carinho, incentivo e compreensão
desde o inicio da jornada até este momento.
Ao Centro de Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas pelo abrigo,
subsídio e a oportunidade de aprendizado.
Aos meus orientadores, professora Ângela Nunes Moreira e Fabricio Rochedo
Conceição pela oportunidade, confiança, dedicação e ensinamentos que fizeram
com que eu crescesse como aluna e profissional.
Aos amigos e colegas do Centro de Biotecnologia e do Laboratório de Imunologia
Aplicada, em especial ao amigo Marcelo Mendonça pelos ensinamentos, paciência e
belo exemplo de dedicação e perseverança.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
apoio financeiro que permitiu a conclusão deste estudo.
Muito obrigada!
5
RESUMO
SILVA, Vanessa Silva da. Expressão diferencial da proteína internalina A em Listeria monocytogenes do sorotipo 4b de diferentes origens em caldos de enriquecimento seletivos e não-seletivos. 2011. 69p. Dissertação (Mestrado) – Programa de Pós Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas.
Listeria monocytogenes é um microrganismo infeccioso causador de listeriose, uma doença de origem alimentar que acomete principalmente imunocomprometidos, gestantes, idosos e crianças. Considerado patogênico tanto para homens quanto para animais, está distribuído naturalmente no ambiente e possui a capacidade de multiplicar-se sobre condições adversas, como alta salinidade e temperaturas de refrigeração. Todavia, sua detecção em alimentos é dificultada por ser trabalhosa, demorada e dispendiosa. Por isso, vem-se buscando métodos de detecção mais simples e rápidos. Os métodos imunológicos são muito promissores neste sentido, mas as condições em que o microrganismo é cultivado devem ser ideais para maximizar a expressão e consequente detecção do antígeno alvo. A proteína internalina A (InlA) de L. monocytogenes é um excelente alvo para detecção desse patógeno em testes imunológicos, porém as condições ideais para potencializar sua expressão ainda não foram descritas. Portanto, nesse trabalho analisou-se a expressão de InlA em duas cepas de L.monocytogenes sorotipo 4b, uma de origem clínica e outra não-clínica, nos caldos de enriquecimento não seletivos Luria-Bertani (LB), Brain Heart Infusion (BHI) e Tryptic Soy Broth (TSB), assim como nos caldos seletivos Fraser Broth (FRA), Listeria Enrichment Broth (LEB) e Listeria Enrichment Broth - University of Vermont Medium (UVM), a 29 e 37 °C, utilizando ELISA indireto e RT-PCR em tempo real. Todos os dados obtidos foram submetidos a análises estatísticas considerando um nível de significância de 5% (p<0,05). Através do ELISA indireto verificou-se que a expressão da InlA é cepa-especifica, ou seja, foi influenciada pela origem da cepa, pois a L. monocytogenes não-clínica apresentou maiores níveis de expressão de InlA do que a cepa clínica, e que os meios utilizados interferem diretamente na expressão desse antígeno, sendo os meios de enriquecimento mais indicados para uso em métodos de detecção, independentemente da origem da cepa, o FRA, TSB e LEB. Observou-se também que não ocorreu diferença significativa na expressão de InlA quando as cepas foram cultivadas a 29 e 37°C. O RT-PCR em tempo real apresentou dados inconclusivos, visto que não houve diferença estatística significativa entre as condições analisadas, necessitando, dessa forma, de maiores estudos.
Palavras-chave: Cepa clínica. cepa não-clínica. temperatura de incubação. ELISA
indireto. RT-PCR em tempo real.
6
ABSTRACT
SILVA, Vanessa Silva da. Differential expression of internalina A protein in Listeria monocytogenes serotype 4b from different origins in selective and non-selective enrichment broths. 2011. 69p. Dissertação (Mestrado) – Programa
de Pós Graduação em Biotecnologia. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas. Listeria monocytogenes is an infectious microorganism causing listeriosis, a
foodborne illness affecting immunocompromised, pregnant, elderly and childrens. Pathogenic to men and animals is found naturally in the environment and has the ability to multiply on adverse conditions such as high salinity and chilling temperatures. However, their detection in food is difficult because it is laborious, time consuming and expensive. Therefore comes to searching for methods to detect simple and fast. Immunological methods are very promising in this regard, but the conditions under which the organism is grown should be ideal for maximizing the expression and subsequent detection of the target antigen. Internalin A protein (InlA) of L. monocytogenes is an excellent target for detection of this pathogen in immunological tests, but the ideal conditions to enhance its expression had not yet been described. Therefore thus study analyzed the expression of InlA in two strains of L. monocytogenes serotype 4b, a clínical and other non-clínical, in non selective enrichment broths Luria-Bertani (LB), Brain Heart Infusion (BHI), Tryptic Soy Broth (TSB) and selective broths Fraser Broth (FRA), Listeria Enrichment Broth (LEB), Listeria Enrichment Broth - University of Vermont Medium (UVM), to incubation at 29 and 37 °C, through the ELISA and real time RT-PCR. All data were statistically analyzed considering a significance level of 5% (p <0.05). In the ELISA it was found that expression of InlA is strain-specific, in other words, was influenced by the origin of the strain, because the strain non-clínical of L. monocytogenes showed higher InlA expression levels than the clínical strain, and the medium used directly interfere with the expression of this antigen, and the most appropriate medium of enrichment for use in detection methods, regardless of the origin of the strain,was FRA, TSB and LEB. It was also observed that there was no significant difference in the expression of InlA when strains were grown at 29 and 37 °C. The real-time RT-PCR data showed inconclusive, since there was no statistically significant difference between the conditions analyzed, requiring thus more study. In conclusion, it was found that InlA gene expression on influenced by origin of the strain and culture media. Regardless of the origin of the strain, the preferred media for use in InlA protein detection methods are FRA, TSB and LEB
Keywords: Clinicall strain. non-clínical strain. grow temperature. ELISA. RT-PCR real time.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Análise da expressão de InlA em cepas clínica e não-clínica
do sorotipo 4b de L. monocytogenes em diferentes meios de enriquecimento seletivos e não-seletivos, a 29 e 37 ºC, por ELISA indireto (UVM: Listeria Enrichment - University of Vermont Medium; FRA: Fraser Broth; LEB: Listeria Enrichment Broth; TSB: Tryptic Soy Broth; LB: Luria-Bertani Broth; BHI: Brain Heart Infusion Broth). Os resultados são expressos como a média ± desvio padrão. Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre as médias..........................................................
61
Figura 2 Análise da expressão de InlA em cepas clínica e não-clínica do sorotipo 4b de L. monocytogenes em diferentes meios de enriquecimento seletivos e não-seletivos, a 29 e 37 ºC, por RT-PCR em tempo real (UVM: Listeria Enrichment - University of Vermont Medium; FRA: Fraser Broth; LEB: Listeria Enrichment Broth; TSB: Tryptic Soy Broth; LB: Luria-Bertani Broth; BHI: Brain Heart Infusion Broth). Os resultados são expressos como a média ± desvio padrão.........................
62
Figura 3 Análise da expressão de InlA em cepa clínica do sorotipo 4b de L. monocytogenes em diferentes meios de enriquecimento seletivos e não-seletivos, a 37 ºC (a) por ELISA indireto; (b) por RT-PCR em tempo real (UVM: Listeria Enrichment - University of Vermont Medium; FRA: Fraser Broth; LEB: Listeria Enrichment Broth; TSB: Tryptic Soy Broth; LB: Luria-Bertani Broth; BHI: Brain Heart Infusion Broth).........................
63
Figura 4
Análise da expressão de InlA em cepa não-clínica do sorotipo 4b de L. monocytogenes em diferentes meios de enriquecimento seletivos e não-seletivos, a 37 ºC (a) por ELISA indireto; (b) por RT-PCR em tempo real (UVM: Listeria Enrichment - University of Vermont Medium; FRA: Fraser Broth; LEB: Listeria Enrichment Broth; TSB: Tryptic Soy Broth; LB: Luria-Bertani Broth; BHI: Brain Heart Infusion Broth).........................
64
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Primers utilizados no RT-PCR em tempo real para avaliação
do nível de expressão da proteína InlA sob diferentes
condições de crescimento de L.monocytogenes......................
60
Tabela 2 Correlação entre os testes de ELISA e RT-PCR para
avaliação do nível de expressão da proteína InlA sob
diferentes condições de crescimento de L. monocytogenes....
60
9
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BHI Brain Heart Infusion
ELISA Enzime-linked immunossorbent assay
FRA Fraser Broth
ºC grau(s) Célsius
x g força centrífuga
h hora
InlA Internalina A
r-InlA Internalina A recombinante
InlB Internalina B
ActA Proteína de polimerização da actina
IPTG Isopropil ß-D-tiogalactosídeo
kDa kilodalton
LB Luria-Bertani
LEB Listeria Enrichment Broth
mL mililitro(s)
μg micrograma(s)
μL microlitro(s)
mg miligramas
kg kilogramas
min minutos
nm nanômetros
g gramas
kv quilovolt
DO densidade óptica
s segundos
kHz quilohertz
mM milimolar
M molar
UFC unidade formadora de colônia
PBS salina tamponada fosfatada
PBST PBS adicionado de 0,05% de Tween 20
10
PCR Polymerase Chain Reaction
RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
rpm rotações por minuto
SDS dodecil-sulfato de sódio
TRIS tris (hidroximetil) aminobutano
TSB Tryptic Soy Broth
UVM University of Vermont Medium
pH potencial hidrogeniônico
USDA United States Department Agriculture
FDA Food and Drug Administration
RAPD Random amplification of polymorphic DNA
MAb Anticorpo Monoclonal
PAb Anticorpo Policlonal
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
IgG Imunoglobulina G
IL-8 Interleucina 8
11
SUMÁRIO
PROJETO DE PESQUISA...................................................................................... 12
RELATÓRIO DO TRABALHO DE CAMPO............................................................. 33
ARTIGO................................................................................................................... 35
1 RESUMO........................................................................................................ 37
2 INTRODUÇÃO................................................................................................ 38
3 MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................. 41
3.1 Cepas bacterianas e condições de cultivo............................................ 42
3.2 Produção da proteína InlA recombinante (rInlA)................................... 42
3.3 Produção, purificação e caracterização do soro policlonal (PAb)
anti-rInlA.................................................................................................
43
3.4 Avaliação do nível de expressão da proteína InlA sob diferentes
condições de crescimento de L.monocytogenes........................................
44
3.4.1 ELISA........................................................................................ 44
3.4.2 Real-time Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR em
tempo real)..................................................................................
45
3.5 Análise Estatística................................................................................. 46
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................... 46
5 REFERENCIAS............................................................................................... 54
CONCLUSÕES...................................................................................................... 65
REFERÊNCIAS...................................................................................................... 66
12
PROJETO DE PESQUISA
13
Avaliação da expressão da proteína internalina A de Listeria monocytogenes sob diferentes condições de crescimento para a otimização de sua detecção
através de métodos imunológicos
Equipe: Ângela Nunes Moreira
Fabricio Rochedo Conceição Wladimir Padilha da Silva José Antonio Guimarães Aleixo Odir Antonio Dellagostin Marcelo Mendonça Vanessa Silva da Silva
Ângela Nunes Moreira
Pelotas, março de 2010
14
1. Caracterização do Problema
Bactérias do gênero Listeria são bacilos Gram-positivos, anaeróbios
facultativos, não formadores de esporos e intracelulares facultativos que estão
amplamente distribuídos no meio ambiente e podem ser encontrados em animais
selvagens e domésticos (HOBBS & ROBERTS,1998) e em alimentos como leite e
produtos lácteos, carnes, aves, vegetais, alimentos marinhos entre outros.
Listeria monocytogenes é a espécie mais importante desse gênero por ser
causadora da listeriose, uma infecção de origem alimentar que afeta tanto homens
quanto animais, e por estar diretamente envolvida em casos de meningite, abortos,
meningoencefalites e septicemia, podendo levar a morte (HOBBS &
ROBERTS,1998; FARBER et al. 1991). Os principais atingidos por esse
microrganismo são indivíduos imunocomprometidos, crianças, idosos, gestantes e
fetos (CALLEJO et al., 2008).
O alto risco a saúde pública se dá pelo fato de L. monocytogenes possuir a
capacidade de sobreviver e multiplicar-se em condições adversas, como
temperatura de refrigeração (4° - 6 °C) (HOBBS & ROBERTS, 1998), faixas de pH
fora da neutralidade (4,3 – 9,6), altas concentrações de sais, congelamento e baixa
umidade (DONNELLY, 2001).
A detecção de L. monocytogenes em alimentos pode ser realizada
utilizando-se métodos de cultivo tradicionais seguidos de caracterização bioquímica,
como o método desenvolvido pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos
(USDA) e pelo Food and Drug Administration (FDA) (SILVA et al., 1997) ou, então,
por meio de técnicas alternativas experimentais, como a Reação em Cadeia de
Polimerase (PCR), ribotipagem, Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR
(qRT-PCR TaqMan), nested PCR, amplificação ao acaso do DNA polimórfico
(RAPD), entre outros (NORTON & BATT, 1999; BYUNA et al., 2001, JARADAT et
al., 2001; CHASSEIGNAUX et al., 2002, HOLKO et al.; 2002). Tais métodos, apesar
de serem, geralmente, sensíveis e específicos, são demorados ou dispendiosos. Por
isso, cada vez mais buscam-se métodos de detecção alternativos específicos,
sensíveis, mais simples e rápidos, e como alternativa aplicável surgem os métodos
imunológicos. Para o êxito da detecção através desse tipo de método, a utilização
de anticorpos que apresentem alta afinidade e especificidade a um antígeno de
superfície, expresso em grande quantidade e conservado somente entre os
15
diferentes sorotipos de L. monocytogenes é de suma importância. Entretanto, a
maioria dos kits disponíveis comercialmente detecta todas as espécies de Listeria
(LATHROP et al., 2007). Além disso, são importados e apresentam um custo
elevado.
L. monocytogenes possui diversos fatores de virulência como a internalina A
(InlA) que é uma proteína de membrana essencial para a adesão e internalização da
bactéria às células do hospedeiro (SCHUBERT et al., 2002). É expressa em grande
quantidade por cepas de L. monocytogenes (BIERNE et al., 2007; CABANES et al.
2002) e ausente nas outras espécies do gênero Listeria. A elevada expressão da
proteína InlA e sua localização na superfície celular de L. monocytogenes tornam
este antígeno um excelente alvo para a produção de anticorpos com o intuito de
serem utilizados em métodos de detecção de L. monocytogenes. Por isso, estudos
visando desenvolver métodos rápidos, específicos e sensíveis para detecção desse
patógeno em alimentos, utilizando anticorpos monoclonais (MAbs) e policlonais
(PAbs) contra internalina A, estão sendo desenvolvidos por nosso grupo de
pesquisa.
Outro fator essencial para o sucesso de metodologias que visam utilizar
anticorpos na detecção de patógenos, que influencia diretamente na sua
sensibilidade e especificidade, é o elevado nível de expressão celular do antígeno
alvo. Condições de crescimento ou fatores ambientais como a concentração de
nutrientes, acidez, temperatura, fontes de carbono, concentração de sais e estresses
oxidativo e osmótico podem regular a expressão de antígenos nas células e, assim,
afetar a detecção de microrganismos baseada na relação antígeno alvo-anticorpo
(HAHM e BHUNIA, 2006). Portanto, a investigação das condições de crescimento e
fatores ambientais ideais para a expressão de antígenos alvos torna-se necessária.
Diversos estudos têm observado variações nos níveis de expressão de
antígenos de Listeria sob diferentes condições de crescimento e ambientais.
Alessandria (2009), pesquisando a expressão de genes de virulência, observou que
a expressão dos genes de L. monocytogenes está mais relacionada às condições de
crescimento das cepas do que a sua origem. Milenbachs et al. (1998) e Milohanic et
al. (2003) demonstraram que carboidratos, temperatura e concentrações de sais
afetam consideravelmente a regulação e a expressão de genes de virulência em
Listeria.
16
Ao testar cepas virulentas e não virulentas de L. monocytogenes em meios
de cultivo seletivos, Gracieux et al. (2003) verificaram que o crescimento e
expressão dos genes de virulência era favorecido em meios seletivos. Geng et al.
(2006) observaram que várias proteínas de L. monocytogenes são diferencialmente
expressas na superfície das células em diferentes caldos de enriquecimento
seletivos e não seletivos e Lathrop et al. (2007) observaram que caldos de
enriquecimento seletivos promovem a expressão da proteína de polimerização da
actina (ActA), enquanto caldos não-seletivos promovem a expressão da internalina B
(InlB). Nannapaneni et al. (1998) observaram uma grande variabilidade na detecção
de espécies de Listeria por anticorpos monoclonais em função do meio de cultura
utilizado para o enriquecimento das células bacterianas.
Os efeitos de meios de enriquecimento seletivos e não seletivos e de
diferentes temperaturas e pHs sobre a expressão de InlA não são conhecidos. Por
isso, o objetivo do presente estudo é avaliar a expressão da proteína InlA de L.
monocytogenes sob diferentes condições de crescimento. A determinação das
condições ideais para maior expressão da InlA por L. monocytogenes aumentará a
sensibilidade e especificidade de métodos imunológicos de detecção desse
patógeno em alimentos baseados na detecção desse antígeno.
17
2. Objetivos e Metas
2.1 Objetivo geral
Avaliar a expressão da proteína internalina A (InlA) de Listeria
monocytogenes sob diferentes condições de crescimento visando a otimização de
sua detecção através de métodos imunológicos.
2.2 Objetivos específicos
- Expressar a proteína InlA recombinante (rInlA) em larga escala;
- Produzir anticorpos policlonais (PAbs) anti-rInlA em camundongos;
- Purificar e caracterizar os PAbs obtidos;
- Avaliar o nível de expressão da proteína InlA após crescimento de L.
monocytogenes em diferentes meios de cultura e condições ambientais através das
técnicas de ELISA, Western blot e real time PCR.
2.3 Metas
1o semestre: Expressão da proteína InlA recombinante em larga escala, purificação
e caracterização.
2o semestre: Produção, purificação e caracterização dos soros policlonais obtidos a
partir de camundongos. Padronização da quantificação dos extratos celulares de L.
monocytogenes para avaliação dos níveis de expressão de InlA.
3o semestre: Avaliação dos níveis de expressão da proteína InlA sob diferentes
condições de crescimento de L. monocytogenes por ELISA e Western-blot.
4o semestre: Avaliação dos níveis de expressão da proteína InlA sob diferentes
condições de crescimento de L. monocytogenes por real time PCR.
18
3. Metodologia e Estratégia de ação
3.1 Bactérias
Cepas padrão de L. monocytogenes sorotipos 4b, 1/2a e 1/2b serão utilizadas
nesse experimento. A virulência das cepas será recuperada através da inoculação
intra-peritonial de 100 µL de extrato celular (105 UFC.mL-1) de L. monocytogenes em
camundongos da linhagem BALB/c (machos de 4 semanas). Os baços e fígados dos
camundongos serão macerados individualmente e lavados em 2 mL de caldo LEB
(Listeria Enrichment Broth). Um mililitro desse lavado será incubado em 9 mL de
Caldo LEB por 24 h a 37 ºC sob agitação (200 rpm). Colônias características serão
obtidas por esgotamento do cultivo em placas contendo Agar Oxford e Palcam,
submetidas a testes confirmatórios e mantidas em Agar Conservação a 4º C e
liofilizadas. Para uso nos experimentos, as cepas serão cultivadas em caldo Brain
Heart Infusion (BHI) por 16 - 18 h à 37 °C sob agitação de 200 rpm. A proteína
recombinante será expressa em Escherichia coli BL21(DE3) pLysS.
3.2 Animais
Serão realizados dois experimentos utilizando animais. Camundongos BALB/c
provenientes do Biotério Central da UFPel, machos e fêmeas, com 6 a 8 semanas
de idade e peso variando entre 15 - 20 g. Os animais serão mantidos em gaiolas
apropriadas (contendo, no máximo, 5 camundongos/gaiola) sob temperatura média
de 22º C e ciclo de luz de 12 h e serão alimentados com ração PET específica para
roedores. Água será fornecida ad libitum.
Ao total, serão utilizados 12 camundongos para o desenvolvimento dos
experimentos. Na recuperação das cepas de L. monocytogenes, serão utilizados 6
machos. Estes camundongos serão colocados em gaiolas individuais e cada um
deles receberá uma dose de 100 µL de extrato celular (105 UFC.mL-1) de um
sorotipo de L. monocytogenes. No prazo de dez dias, após a inoculação, esses
camundongos serão eutanasiados, seus fígado e baço serão extraídos e
posteriormente processados. Para a produção de soro policlonal, serão utilizadas 6
fêmeas. Dessas fêmeas, 5 receberão doses de proteína recombinante InlA (50µg)
com adjuvante incompleto de Freund e 1 controle recebendo somente adjuvante
incompleto de Freund. Essa inoculação será realizada semanalmente durante 5
semanas.
19
Os camundongos serão anestesiados e sacrificados de acordo com as
normas internacionais e em consonância com os princípios éticos de
experimentação animal do COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal).
O método de anestesia que será utilizado antes de procedimentos cirúrgicos que
impliquem em dor ou desconforto dos animais consistirá na utilização de tiopental
(40 a 80 mg/Kg via intraperitoneal) e o método de eutanásia consistirá de
deslocamento cervical.
3.3 Produção da proteína InlA recombinante
Células competentes de Escherichia coli BL21(DE3) pLysS serão
transformadas com o plasmídeo de expressão em E. coli pAE contendo o gene inlA
(pAE/inlA, MENDONÇA et al., 2008) por eletroporação, visando à expressão da
proteína recombinante InlA (rInlA). As células recombinantes serão selecionadas em
ágar Luria-Bertani (LB) contendo ampicilina, cultivadas em caldo LB e incubadas em
agitador orbital (37 ºC/200 rpm) até a fase log de crescimento. A expressão de rInlA
será induzida com 0,5 mM de IPTG (isopropil ß-D-tiogalactosídeo) a 28 ºC, sob
agitação (200 rpm) por 16 - 18 h. Após, alíquotas de 1 mL da cultura serão
coletadas e centrifugadas para a confirmação da expressão da rInlA através de
eletroforese em gel de poliacrilamida a 12% (SDS-PAGE) como descrito por
Sambrook (2001).
A purificação da rInlA será realizada em coluna Hi-Trap HP (GE Healthcare)
carregada com níquel (Ni+2-Sepharose) utilizando o sistema de cromatografia
líquida de baixa pressão ÄKTAPrime (GE Healthcare) conforme instruções do
fabricante.
3.4 Produção do soro policlonal (PAb) anti-rInlA
Soro policlonal anti-rInlA será produzido em camundongos BALB/c (com
idade entre 6 e 8 semanas) utilizando protocolos de imunização propostos por
Harlow & Lane (1998).
3.5 Purificação e caracterização do PAb
Anticorpos IgG serão purificados a partir do soro obtido através de
cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A utilizando o sistema ÄKTA
prime. A concentração final dos anticorpos será estimada pelo método Bradford
20
(BRADFORD, 1976), sua atividade será determinada por ELISA e sua pureza será
confirmada através de SDS-PAGE (LAEMMLI, 1970).
3.6 Avaliação do nível de expressão da proteína InlA sob diferentes
condições de crescimento de L. monocytogenes através das técnicas de
ELISA, Western blot e real time PCR
Para avaliação dos níveis de expressão de InlA sob diferentes condições de
crescimento, L. monocytogenes recuperada em caldo BHI a 37º C por 16-18 horas
será cultivada a 1% (v/v) em meios líquidos não seletivos (caldo BHI; LB e Tryptic
Soy Broth, TSB), meios seletivos (caldo University of Vermont Medium, UVM; Fraser
e Listeria Enrichment Broth, LEB) e incubada a diferentes temperaturas até a fase
estacionária (16 - 20 h).
Cultivos de L. monocytogenes nos diferentes meios e temperaturas de
incubação serão centrifugados (2200 x g, 15 min) e lavados três vezes em PBS. A
concentração protéica dos extratos celulares será estimada pelo método Bradford e
uma mesma concentração de proteínas será utilizada em ELISA indireto e Western
blotting (TOWBIN et al., 1979) para avaliação da expressão da proteína InlA.
Para o ELISA indireto, cavidades de placas de 96 cavidades serão cobertas
com 25 g/ml dos extratos protéicos em tampão carbonato-bicarbonato 0,05 M, pH
9.6. Placas serão incubadas a 4ºC /16 – 18 h e lavadas 3 vezes com PBS, pH 7.2
contendo 0.05% (v/v) de Tween 20 (PBST). O anticorpo policlonal anti-InlA (diluído
1:600) será adicionado às cavidades (50 l/cavidade), as placas serão incubadas
por 1 h a 37 ºC, lavadas 3x com PBST e o anticorpo anti-Ig de camundongo
produzido em cabra conjugado a peroxidase (1:2000) será adicionado. Excesso de
conjugado será removido através de 5 lavagens com PBST e a solução de substrato
da enzima/cromógeno (H2O2/ ortophenylenodiamine) em tampão citrato-fosfato pH
5,0 será adicionada. A reação ocorrerá no escuro por 10 minutos e a densidade
óptica será lida a 450 nm em um leitor de ELISA automatizado.
Para análise da expressão da proteína InlA através de Western blotting, 20 g
dos extratos protéicos obtidos como mencionado acima serão aplicados em
cavidades de um gel de poliacrilamida e separados através de SDS-PAGE. Após a
eletroforese, as proteínas serão transferidas para uma membrana de nitrocelulose e
os sítios de ligação livres serão bloqueados com 5% de leite em pó suspenso em
21
PBS. A membrana será lavada com PBS e incubada com os anticorpos policlonais
anti-InlA por 1 h a 37 ºC. Após lavagens, a membrana será incubada com o
anticorpo anti-Ig de camundongo produzido em cabra conjugado a peroxidase
(1:2000). Bandas serão visualizadas após a adição do substrato 4-chloro-1-naphtol e
o desenvolvimento de cor será cessado com água destilada.
Para a análise da expressão da proteína InlA através de real time PCR, 10
ml de cada cultivo será centrifugado (7500g, 10 min) e o RNA total dos cultivos será
extraído com TRIzol ® Reagent (Invitrogen) de acordo com protocolo do fabricante.
Concentrações finais de RNA serão determinadas utilizando o kit QuBit ®
fluorometer (Invitrogen). Duas microgramas dos RNAs serão utilizadas para a
síntese de cDNA através de transcrição reversa utilizando o kit High Capacity
cDNA® (Applied Biosystems) de acordo com o protocolo do fabricante. Primers para
amplificar o gene InlA e primers para 16s rRNA, para serem utilizados como controle
interno em todos os experimentos, serão desenhados com o auxílio do software
Vector NTI e sintetizados pela Invitrogen. A PCR em tempo real será realizada de
acordo com as recomendações de Livak e Schmittgen (2001).
22
4. Resultados e Impactos esperados
Indicadores de Progresso ao final de cada 6 meses de projeto:
1o semestre: Proteína rInlA expressa em E.coli em larga escala, purificada e
caracterizada.
2o semestre: Soro policlonal anti-rInlA obtido a partir de coelhos e
camundongos, purificado e caracterizado. Cepas expressando InlA. Quantificação
dos extratos celulares de L.monocytogenes padronizada para avaliação dos níveis
de expressão de InlA.
3o semestre: Níveis de expressão da proteína InlA sob diferentes condições
de crescimento de L. monocytogenes avaliados por ELISA e Western-blot.
4o semestre: Níveis de expressão da proteína InlA sob diferentes condições
de crescimento de L. monocytogenes avaliados por real time PCR
Indicadores de resultados ao final do projeto:
- Condições de crescimento ideais determinadas para maximização da
expressão da proteína InlA por L. monocytogenes, a fim de otimizar metodologias de
detecção dessa bactéria em alimentos que utilizam anticorpos anti-InlA;
- 1 aluno de mestrado treinado;
- 2 alunos de iniciação científica treinados;
- 1 trabalho publicado em revista indexada;
- 3 trabalhos apresentados em congressos;
Repercussão e/ou impactos dos resultados:
Ao final do projeto espera-se ter identificado as condições de cultivo in vitro
sob as quais a proteína InlA é expressa em L. monocytogenes em maior quantidade,
visando à otimização da detecção desse patógeno em alimentos através de métodos
imunológicos baseados na detecção desse antígeno desenvolvidos no Brasil. As
metodologias de detecção de patógenos em alimentos disponíveis no Brasil são
importadas e extremamente caras.
23
O impacto gerado por esse trabalho deverá ocorrer na área de metodologias rápidas
de análises microbiológicas de alimentos que ainda é incipiente no Brasil. A
determinação das condições ideais para maior expressão da InlA por L.
monocytogenes aumentará a sensibilidade e especificidade de métodos
imunológicos de detecção desse patógeno em alimentos baseados na detecção
desse antígeno. Ao mesmo tempo, por existir o envolvimento de estudantes de
graduação e pós-graduação no projeto, haverá a capacitação técnica de vários
indivíduos que estarão treinados para atuar nesta área de segurança alimentar no
futuro e que servirão de difusores da tecnologia gerada.
24
5. Cronograma, Riscos e Dificuldades
BIMESTRES
ATIVIDADES 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Revisão de literatura x x x x X x x x x x x x
Expressão da proteína InlA recombinante em larga escala, purificação e caracterização
x x x
Produção de anticorpos policlonais em camundongos
x x X
Purificação e caracterização dos anticorpos policlonais obtidos
x X x
Padronização da quantificação dos extratos celulares de L. monocytogenes
x X x
Avaliação dos níveis de expressão da proteína InlA sob diferentes condições de crescimento de L. monocytogenes por ELISA
x x x
Avaliação dos níveis de expressão da proteína InlA sob diferentes condições de crescimento de L. monocytogenes por Western-blot
x x x
Avaliação dos níveis de expressão da proteína InlA sob diferentes condições de crescimento de L. monocytogenes por real time PCR
x x x
25
6. Outros Projetos e Financiamentos
Projetos em andamento
Diversos projetos visando o desenvolvimento de testes aplicados no controle
de qualidade e na detecção de patógenos em alimentos, visando a avaliação da
segurança alimentar de produtos transgênicos, bem como a obtenção de
bioprodutos usados como aditivos em alimentos vêm sendo desenvolvidos. Outros
projetos em andamento visam buscar soluções modernas e inovadoras para
problemas da criação animal, envolvendo desenvolvimento de novas vacinas, testes
de diagnóstico de doenças e desenvolvimento de probióticos. Projetos que visam o
desenvolvimento de técnicas de congelamento de sêmen, maturação, fertilização in
vitro, sexagem e congelamento de embriões, clonagem de embriões e obtenção de
animais transgênicos e projetos que utilizam ferramentas da moderna biotecnologia
para estudos de genômica funcional e engenharia genética, visando à obtenção de
novos produtos com características de interesse científico e econômico também vêm
sendo desenvolvidos.
Trabalhos científicos, tecnológicos e de inovação já desenvolvidos na
área/tema do projeto
Nosso grupo vem atuando nos últimos anos regularmente na Linha de
Pesquisa de Segurança Alimentar, principalmente no Desenvolvimento de Métodos
Imunoquímicos e Moleculares de Detecção de Patógenos em Alimentos. Foram
desenvolvidos um ELISA indireto para detecção de salmonelas em alimentos,
usando anticorpos policlonais comercialmente disponíveis e anticorpos monoclonais,
e separação imunomagnética com anticorpos monoclonais associada à PCR.
Anticorpos monoclonais contra proteínas de superfície específicas de Listeria
monocytogenes e salmonelas estão sendo produzidos, sendo os últimos utilizando
imunização genética. Dessa forma, o gene que codifica para o antígeno de interesse
é clonado em um plasmídeo de expressão em eucariotos, injetado nos animais e a
proteína é expressa in vivo. Em outra linha de pesquisa do grupo, Epidemiologia de
Toxi-Infecções Alimentares, foram realizadas investigações regionais sobre
prevalência de Salmonella e de Escherichia coli verotoxigênicas em alimentos e em
bovinos.
26
Atualmente, Ângela Nunes Moreira coordena os projetos “Desenvolvimento
de metodologia para detecção de salmonelas em alimentos que usa nanopartículas
magnéticas cobertas com anticorpos monoclonais obtidos por imunização genética e
PCR”, financiado pelo CNPq (Edital MCT/CNPq nº 62/2008, R$ 32.085,00),
“Avaliação do potencial probiótico de Pichia pastoris”, “Avaliação da expressão da
proteína internalina A de Listeria monocytogenes sob diferentes condições de
crescimento para a otimização de sua detecção através de métodos imunológicos” e
“Avaliação da expressão da proteína FimA de salmonelas sob diferentes condições
de crescimento”. Participa dos projetos “Anticorpos monoclonais contra Salmonella
enterica por imunização genética: produção, caracterização e aplicação diagnóstica”
(contemplado com uma bolsa de mestrado pelo Edital MCT/CNPq 27/2007),
“Aspectos epidemiológicos e moleculares de Listeria monocytogenes na cadeia
produtiva de frangos no sul do Brasil” (R$ 15.000,00), “Detecção de Listeria
monocytogenes em alimentos por IMS-PCR com anticorpos monoclonais contra
InlA” (aprovado pelo Edital Universal MCT/CNPq 15/2007, R$ 39.000,00) e
“Utilização de Materiais Nanoestruturados em Processos Biológicos Aplicados a
área de Saúde” (aprovado pelo edital CAPES 004/2008/Rede Nanobiotecnologia -
Brasil, R$ 1.200.000,00). Além disso, participou dos projetos “Detecção de
salmonelas em alimentos” financiado pela Secretaria de Ciência e Tecnologia do
RS- Pólo de Inovação Tecnológica, com vigência entre agosto de 2004 a julho de
2006 (R$ 50.000,00), “Métodos imunoquímicos baseados em anticorpos
monoclonais para detecção de salmonelas em alimentos” (bolsa doutorado CAPES)
e “Clonagem e expressão de proteínas recombinantes visando o desenvolvimento
de uma vacina de subunidade para o controle da Pneumonia Enzoótica Suína”, de
fevereiro de 2006 a janeiro de 2007, financiado pela FAPERGS (R$ 15.000,00).
Fabricio Rochedo Conceição é coordenador do projeto “Produção e
avaliação de quimeras de antígenos de Mycoplasma hyopneumoniae visando o
desenvolvimento de vacinas recombinantes contra a Pneumonia Micoplásmica
Suína”, aprovado pelo Edital Universal MCT/CNPq 15/2007 (R$ 50.000,00), participa
dos projetos “Produção de vacinas recombinantes em Pichia pastoris”, aprovado
pelo Edital FAPERGS - PROADE 3, “Avaliação de antígenos recombinantes de
Mycoplasma hyopneumoniae: desenvolvimento de vacinas e testes diagnósticos”
(aprovado pelo Edital CNPq/MAPA/SDA Nº 64/2008, R$ 450.000,00), “Utilização de
Materiais Nanoestruturados em Processos Biológicos Aplicados a área de Saúde”
27
(aprovado pelo Edital CAPES 004/2008/Rede Nanobiotecnologia – Brasil, R$
1.200.000,00) e foi bolsista ProDoc da CAPES atuando no projeto “Expressão de
proteínas por Pichia pastoris recombinante”. Além disso, participa dos mesmos
projetos que Ângela Moreira, dos projetos “Desenvolvimento de vacina recombinante
contra pneumonia micoplásmica suína” e “Programa de Investigação de Genomas
Sul (PIGS)”, de projetos de Odir Dellagostin e José Aleixo e participou de projetos
avaliando o uso e o efeito de probióticos em nutrição animal.
José Antonio G. Aleixo foi responsável pelos projetos “Detecção de
salmonelas em alimentos” financiado pela Secretaria de Ciência e Tecnologia do
RS- Pólo de Inovação Tecnológica, com vigência entre agosto de 2004 a julho de
2006 (R$ 50.000,00), “Métodos imunoquímicos baseados em anticorpos
monoclonais para detecção de salmonelas em alimentos” (bolsa doutorado CAPES)
e “Produção de anticorpos monoclonais contra antígeno específico de Leptospira
interrogans para uso diagnóstico” aprovado no edital universal do CNPq de 2005 (R$
35.000,00) e em vigência. Foi também responsável pelo projeto “Métodos
imunoquímicos para diagnóstico de leptospirose” desde 2004. Este projeto foi
desenvolvido em colaboração com a FIOCRUZ e por ela financiado. A vigência do
projeto foi até março de 2007 e o recurso recebido foi de cerca de R$ 60.000,00
anuais. Atualmente é coordenador do projeto “Anticorpos monoclonais contra
Salmonella enterica por imunização genética: produção, caracterização e aplicação
diagnóstica” (contemplado com uma bolsa de mestrado pelo Edital MCT/CNPq
27/2007) e participa dos projetos de Ângela Moreira.
Odir A. Dellagostin é responsável pelos projetos “Avaliação de antígenos
recombinantes de Mycoplasma hyopneumoniae: desenvolvimento de vacinas e
testes diagnósticos”, financiado pelo CNPq (Edital CNPq/MAPA/SDA Nº 64/2008),
“Utilização de Materiais Nanoestruturados em Processos Biológicos Aplicados a
área de Saúde”, financiado pela CAPES (Edital 004/2008/Rede Nanobiotecnologia -
Brasil), “Desenvolvimento de vacina recombinante contra leptospirose para uso
veterinário”, em vigência desde dezembro de 2006 e financiado pelo CNPq (R$
45.698,00), e participa de alguns projetos de Ângela Moreira e Fabricio Conceição.
Além disso, foi responsável pelos projetos “Clonagem e expressão de proteínas
recombinantes visando o desenvolvimento de uma vacina de subunidade para o
controle da Pneumonia Enzoótica Suína”, de fevereiro de 2006 a janeiro de 2007,
28
financiado pela FAPERGS (R$ 15.000,00), “Desenvolvimento de testes de
diagnóstico e vacina recombinante contra leptospirose”, de novembro 2004 a agosto
2006, financiado pelo CNPq (Bolsa de doutorado) e FIOCRUZ (R$ 230.000,00),
“Desenvolvimento de vacina recombinante contra pneumonia micoplásmica suína”,
de novembro de 2003 a janeiro de 2005, financiado pelo CNPq (R$ 47.758,52),
“Programa de Investigação de Genomas Sul (PIGS)”, de março de 2002 a março de
2005, financiado pelo MCT, FAPERGS, SCT (R$ 4.500.000,00), “Development of
recombinant BCG multivaccine and complementary diagnostics for predominant
parasitic and epizootic disease of ruminants in Latin America”, de outubro de 2001 a
setembro de 2005, financiado pela Comunidade Européia ICA4 1999 40006 (Euros
986.000,00, sendo 97 mil euros para o Lab. de Biologia Molecular do Cenbiot),
“Epidemiologia molecular de tuberculose no estado do Rio Grande do Sul”, de
novembro de 2000 a outubro de 2002, financiado pelo CNPq (R$ 35.000,00).
Wladimir Padilha da Silva é coordenador dos projetos “Aspectos
epidemiológicos e moleculares de Listeria monocytogenes na cadeia produtiva de
frangos no sul do Brasil” (R$ 15.000,00) e “Detecção de Listeria monocytogenes em
alimentos por IMS-PCR com anticorpos monoclonais contra InlA” (aprovado pelo
Edital Universal MCT/CNPq 15/2007, R$ 39.000,00) e coordena e participa de
diversos outros projetos na área em questão.
29
7. Aspectos Éticos (quando aplicável)
Os animais utilizados neste projeto serão tratados de acordo com as normas
internacionais e em consonância com os princípios éticos de experimentação animal
do COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal).
30
8. Referências Bibliográficas
ALESSANDRIA, V. Virulence gene expression in Listeria monocytogenes strains
isolated from different sources. 14th Workshop on the Developments in the Italian PhD Research on Food Science Technology and Biotechnology - University of Sassari, 2009.
BIERNE, H.; SABET, C.; PERSONNIC, N., COSSART, P. Internalins: a complex
family of leucine-rich repeat-containing proteins in Listeria monocytogenes. Microbes and Infection v. 9, p.1156-1166, 2007.
BRADFORD, M.A. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72, p. 248-254, 1976.
CABANES, D.; DEHOUX, P.; DUSSURGET, O.; FRANGEUL, L.; COSSART, P.
Surface proteins and the pathogenic potential of Listeria monocytogenes. Trends in Microbiology, 10:5. p. 238-245, 2002.
CALLEJO, R.; PRIETO, M.; MARTÍNEZ, C. ; AGUERRE, L. ; ROCCA, F.;
MARTÍNEZ, G. ; PALMIERI, O. Estudio mediante PCR múltiple de serotipos de Listeria monocytogenes aislados en Argentina. Revista Argentina de Microbiología, p. 89-92, 2008.
FARBER, J. M.; PETERKIN, P. I. Listeria monocytogenes, a Food-Borne Pathogen.
Microbiological Reviews, v. 55, n. 3, p. 476–511, 1991. GENG, T., HAHM, B.K. AND BHUNIA, A.K. Selective enrichment media affect the
antibody-based detection of stress-exposed Listeria monocytogenes due to differential expression of antibody-reactive antigens identified by protein sequencing. Journal of Food Protection, v. 69, n. 8 p. 1879–1886, 2006.
GRACIEUX, P.; ROCHE, S. M.; PARDON, P. ;VELGE, P. Hypovirulent Listeria
monocytogenes strains are less frequently recovered than virulent strains on PALCAM and Rapid' L. mono media. International Journal of Food Microbiology, v. 83, p. 133-145, 2003.
HAHM, B.K. BHUNIA, A.K. Effect of environmental stresses on antibody-based
detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella enterica serotype Enteritidis and Listeria monocytogenes. Journal of Applied Microbiology, p.1017–1027,
2006. HARLOW, E.; LANE, D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1988, 726 p.
HOBBS, B.C. & ROBERTS, S. Toxinfecções e controle higiênico-sanitário de
alimentos. São Paulo: Varela. 1998. 6ªed. 376p.
31
LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, v. 227, p. 680-685, 1970.
LATHROP, A.A.; BANADA, P.P.; BHUNIA, A.K. Differential expression of InlB and
ActA in Listeria monocytogenes in selective and nonselective enrichment broths. Journal of Applied Microbiology, p.627–639, 2008.
LIN, M.; ARMSTRONG,S.; RONHOLM, J.; DAN, H.; AUCLAIR, M.-E.; ZHANG, Z.;
CAO, X. Screening and characterization of monoclonal antibodies to the surface antigens of Listeria monocytogenes serotype 4b. Journal of Applied Microbiology, p.1705–1714, 2009.
LIVAK K.J., SCHMITTGEN T.D. Analysis of relative gene expression data using real-
time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods 25, p. 402-408, 2001.
MENDONÇA, M. ; CONRAD, N. L. ; França, R.C. ; Conceição, F.R ; Moreira, A.N ;
SILVA, W.P ; Aleixo, J.A.G . Produção da proteína InlA de Listeria monocytogenes em Escherichia coli visando à obtenção de anticorpos monoclonais. In: XVII Congresso de Iniciação Científica e X Encontro de Pós-Graduação, 2008, Pelotas. Anais do XVII Congresso de Iniciação Científica e X Encontro de Pós-Graduação. Pelotas : Editora Universitária UFPel, 2008.
MILENBACHS, A.A., BROWN, D.P., MOORS, M. AND YOUNGMAN, P. (1998)
Carbon source regulation of virulence gene expression in Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology, n. 23, p. 1075– 1085., 1998.
MILOHANIC, E., GLASER, P., COPPEE, J.-Y., FRANGEUL, L., VEGA, Y.,
VAZQUEZ-BOLAND, J.A., KUNST, F., COSSART, P. et al. Transcriptome analysis of Listeria monocytogenes identifies three groups of genes differently regulated by PrfA. Molecular Microbiology, n. 47, p. 1613–1625, 2003.
NANNAPANENI, R.; STORY, R.; BHUNIA, A. K..; JOHNSON, M.G. Reactivities of
Genus-Specific Monoclonal Antibody EM-6E11 against Listeria Species and Serotypes of Listeria monocytogenes Grown in Nonselective and Selective Enrichment Broth Media. Journal of Food Protection, v.61, n.9, p. 1195-1198(4) 1998.
SAMBROOK J., FRITSCH E. & MANIATIS T.. Molecular cloning: A Laboratory
Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001 SANTOS, L.A.G.; PINTO, P.S.A.; MORAES, M.P.; VANETTI, M.C.D.; BEVILACQUA,
P.D.; PINTO, M.S.; DIAS, F.S. Pesquisa molecular e convencional de Listeria monocytogenes para o controle de qualidade da carne suína. Revista Ceres, v. 53, n. 308, p. 481-486, 2006.
SCHUBERT, W.D.; URBANKE, C.; ZIEHM T.; HEINZ D.W. Structure of internalin, a
major invasion protein of Listeria monocytogenes, in complex with Its Human Receptor E-Cadherin. Cell, v. 111, n. 13, p. 825–836, 2002.
32
SILVA, N. da; JUNQUEIRA, V.C.A; SILVEIRA, N. F.A. Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos, Livraria Varela, São Paulo, 1997, 295p.
TOWBIN, H., STAEHELIN, T., GORDON, J. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrcellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Science of the USA, v. 76, p. 4350-4354, 1979.
33
RELATÓRIO DE CAMPO
1. Atividades realizadas
A proteína recombinante (rInlA), produzida em E. coli BL21(DE3) pLysS transformada com pAE/inlA, foi produzida em larga escala para as imunizações e para utilizar como controle nos testes de ELISA.
A transformação e indução da expressão foram satisfatórias, o que foi verificado em eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). As proteínas foram purificadas em coluna Hi-Trap HP (GE Healthcare) carregada com níquel (Ni+2-Sepharose) utilizando o sistema de cromatografia líquida de baixa pressão ÄKTAPrime (GE Healthcare). Ao final obteve-se 3 diferentes alíquotas de proteína com, aproximadamente, 4 mL cada. Fez-se um SDS-PAGE com todas as alíquotas para confirmar a pureza. Entretanto, durante a diálise da proteína purificada contra PBS, houve precipitação, fazendo com que fosse necessário o uso de um tampão diferente (NaCl 250 mM e TRIS 150 mM, pH 8,0) a fim de solubilizar a proteína.
A quantificação das alíquotas de proteína foi realizada pelo método de Bradford.
Para a produção de anticorpos anti-InlA , foram inoculados, intraperitonialmente, 50 µg de rInlA juntamente com 450 µL de adjuvante incompleto em todas as inoculações (4 ao todo). O protocolo de inoculação seguiu as recomendações de Harlow & Lane (1998) e produção de ascite segundo Cevenini (1991).
O soro produzido foi avaliado contra a proteína recombinante em ELISA indireto e purificado através de cromatografia de afinidade em uma coluna de proteína A utilizando o sistema ÄKTA prime.
Os anticorpos IgG purificados tiveram sua concentração aferida em espectrofotômetro e foram titulados por ELISA indireto
Para avaliar a capacidade de reconhecer a proteína na forma nativa e a especificidade do soro policlonal, fez-se um ELISA indireto contra células bacterianas íntegras e lisadas de L. monocytogenes sorotipos 1/2a 1/2b, 4b , L. innocua, Salmonella enterica e Bacillus cereus var. Toyoi.
As cepas de L. monocytogenes sorotipos 1/2a, 1/2b, 4be L. innocua foram
recuperadas em camundongos da linhagem BALB/c machos, pois estava m há muito tempo armazenadas in vitro, o que poderia diminuir a capacidade de expressão da InlA. Após confirmação bioquímica, as cepas recuperadas foram conservadas em glicerol a -70 °C e alíquotas foram testadas para verificar a qualidade da conservação e garantir a pureza do cultivo.
Fez-se também cultivos nos meios seletivos e não seletivos das três cepas de L. monocytogenes recuperadas, da cepa de L. innocua e de Salmonella Typhimurium. Os cultivos foram incubados a 37 °C/16-18h. Ajustou-se a DO600 1,0 e efetuou-se a contagem em placas e em câmara de Petroff-Hausser para confirmar a quantificação. Entretanto, os valores obtidos nas três tentativas foram variáveis, necessitando novas experimentações.
Como as cepas obtidas não apresentaram um perfil satisfatório,ou seja, não foram detectadas pelo teste de ELISA indireto e nem por Western-blot, o que dificultaria o desenvolvimento do trabalho proposto, decidiu-se, após reunião com comissão de acompanhamento, utilizar outras cepas já caracterizadas e sorotipadas.
Após alguns meses de busca, as duas cepas do sorotipo 4b das duas origens utilizadas no experimento foram obtidas, as quais eram provenientes do
34
Laboratório de Microbiologia de Alimentos do DCTA/UFPel e foram gentilmente cedidas pelo prof. Wladimir Padilha
As duas cepas foram recuperadas em caldo BHI e posteriormente avaliadas quanto à expressão de InlA, utilizando meios de enriquecimento seletivos (Fraser, LEB e UVM) e não seletivos (LB, TSB e BHI) e sob duas temperaturas de incubação (29°e 37 °C)
Repetiu-se os cultivos de L .innocua e Salmonella enterica para utilização como controles negativos durante o ELISA indireto e Western-blot.
Os cultivos foram padronizados por espectrofotometria antes de serem processados. Aliquotas de 50 µL foram subtraídas para confirmação da contagem através de câmara de Petroff-Hausser.
As amostras padronizadas puderam, então, ser fracionadas obtendo-se duas alíquotas, uma destinada ao ELISA e Western-blot e outra para o RT-PCR em
tempo real.
A avaliação por Western-blot foi realizada simultaneamente a por ELISA. Entretanto, não se obteve resposta positiva com os Western-blot realizados, sendo, portanto, retirado do escopo do estudo. Nenhuma das repetições do Western-blot apresentou reação positiva, nem mesmo com os controles.
O cronograma sofreu atrasos relevantes, pois, além das reformas no laboratório, o material necessário para os ensaios de RT-PCR em tempo real demorou a ser entregue devido a problemas de importação.
Depois de alguns meses de espera pelo material, este foi entregue e possibilitou a realização dos ensaios de RT-PCR em tempo real utilizando DNA extraído das amostras congeladas em Trizol a – 70 °C. Esses ensaios contaram com a ajuda do Prof. Vinicius Campos.
Tendo disponíveis os dados dos testes acima citados, foi realizada a análise estatística dos mesmos para verificar a significância das diferenças nos níveis de expressão da InlA em L.monocytogenes.
2. Dificuldades encontradas
Durante a diálise da proteína houve precipitação, a qual foi resolvida substituindo o tampão de diálise por outro com pH mais alcalino;
Com a reforma do laboratório, houve atraso no cronograma devido a contaminações nos materiais e conseqüente necessidade de substituição de soluções e meios de cultivo, assim como de repetição dos cultivos e dos testes.
As cepas recuperadas nos camundongos não reagiram com o soro purificado no ELISA indireto, indicando falha no procedimento ou dificuldade de expressão após o estresse. Por isso foram substituídas por outras;
Ocorreu uma demora na obtenção das novas cepas caracterizadas e obtivemos somente duas;
Os Western-blot foram repetidos diversas vezes com novas soluções, entretanto não foi possível resolver os problemas de detecção, provavelmente oriundos do reagente utilizado como substrato na reação (3,3 Diaminobenzidine - DAB), pois foi um problema compartilhado entre os colegas de laboratório e o mesmo foi solucionado após aquisição de novo lote do produto.
Ocorreu uma demora na entrega do material para dar continuidade aos ensaios.
35
ARTIGO
Expressão diferencial da proteína internalina A em Listeria monocytogenes do
sorotipo 4b de diferentes origens em caldos de enriquecimento seletivos e
não-seletivos
Revista: Brazilian Journal of Microbiology
ISSN 0001-3714 versão impressa
ISSN 1678-9881 versão online
36
Expressão diferencial da proteína internalina A em Listeria monocytogenes do
sorotipo 4b de diferentes origens em caldos de enriquecimento seletivos e
não-seletivos
Vanessa S.Silva1; Marcelo Mendonça1; Rodrigo C. França1; Marcelle M. Silveira1;
Vinicius F. Campos2; José Antonio G. Aleixo1; Wladimir P. Silva3; Fabricio R.
Conceição1; Ângela N. Moreira1,4*.
Laboratório de Imunologia Aplicada1 e Laboratório de Embriologia Molecular e
Transgênese 2, Centro de Desenvolvimento Tecnológico, Núcleo de Biotecnologia,
Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Brasil.
Laboratório de Microbiologia de Alimentos3, Departamento de Ciência e Tecnologia
Agroindustrial, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Brasil.
Departamento de Nutrição4, Faculdade de Nutrição, Universidade Federal de
Pelotas, Pelotas, Brasil.
* Correspondência: Laboratório de Imunologia Aplicada, Centro de Desenvolvimento
Tecnológico, Núcleo de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, Campus
universitário S/N, 96010-900, Pelotas, RS, Brasil. Fone: (+55 53) 32757583
fax: (+55 53) 32757551.
E-mail: [email protected]
37
1 RESUMO
Listeria monocytogenes é uma bactéria patogênica de grande importância para
homens e animais, está distribuída naturalmente no ambiente e possui a capacidade
de multiplicar-se sobre condições adversas. Devido ao fato da metodologia
convencional utilizada para sua detecção ser trabalhosa, demorada e dispendiosa,
buscam-se métodos de detecção mais simples e rápidos, surgindo como alternativa
os métodos imunológicos. A proteína internalina A (InlA) de L. monocytogenes é um
excelente alvo para uso em testes imunológicos que visam a detecção desse
patógeno. Porém, as condições ideais para potencializar a expressão deste antígeno
ainda não foram descritas. Nesse trabalho, analisou-se a expressão de InlA em duas
cepas de L. monocytogenes sorotipo 4b, uma de origem clínica e outra não-clínica,
nos caldos não seletivos Luria-Bertani (LB), Brain Heart Infusion (BHI) e Tryptic Soy
Broth (TSB) e nos caldos seletivos Fraser Broth (FRA), Listeria Enrichment Broth
(LEB) e Listeria Enrichment Broth - University of Vermont Medium (UVM), a 29 e 37
°C, utilizando ELISA indireto e RT-PCR em tempo real. Através do ELISA indireto
verificou-se que a expressão da InlA foi influenciada pela origem da cepa, pois a
cepa não-clínica apresentou maiores níveis (p<0,05) de expressão de InlA do que a
cepa clínica, e que os meios utilizados interferem na expressão desse antígeno,
sendo os meios mais indicados FRA, TSB e LEB. O RT-PCR em tempo real
apresentou dados inconclusivos, visto que não houve diferença estatística
significativa entre as condições analisadas, necessitando, dessa forma, de maiores
estudos.
Palavras - chave: cepa clínica, cepa não-clínica, temperatura de incubação, ELISA
indireto, RT-PCR em tempo real.
38
2 INTRODUÇÃO
Listeria monocytogenes é o patógeno causador da listeriose, uma infecção
de origem alimentar que afeta homens e animais. Este patógeno está diretamente
envolvido em casos de meningite, abortos, meningoencefalites e septicemia,
podendo levar a morte e apresentando altas taxas de mortalidade (20 e 30%) (12,
17). Os principais atingidos por esse microrganismo são indivíduos
imunocomprometidos, crianças, idosos, gestantes e fetos (7).
Esse patógeno possui a capacidade de sobreviver e multiplicar-se em
condições adversas, como à temperatura de refrigeração (4 - 6 °C) (17), faixas de
pH fora da neutralidade (4,3 – 9,6), altas concentrações de sais, congelamento e
baixa umidade (11). Além disso, tem a capacidade de invadir os enterócitos e de
escapar do sistema imunológico através da utilização de fatores de virulência como
listeriosina O e fosfolipases, possibilitando a disseminação aos tecidos adjacentes e
consequente difusão a todo o organismo (30).
São conhecidos 13 sorotipos de L. monocytogenes, dos quais três (1/2a,
1/2b e 4b) têm sido relacionados a mais de 90% dos casos e surtos de listeriose (6).
Segundo Lianou et al. (23) os sorotipos 1/2a e 1/2b estão mais envolvidos em casos
esporádicos de listeriose, enquanto que o sorotipo 4b é o mais associado a surtos.
Apesar da importância desse patógeno, sua pesquisa não é rotineira tanto em
casos clínicos, quanto em indústrias de alimentos. Esse fato ocorre devido à
obrigatoriedade da detecção estar restrita às indústrias de queijo de alta umidade e
aos custos elevados dos insumos para seu isolamento e identificação. As
metodologias de detecção normatizadas aceitas no Brasil, as quais utilizam métodos
de cultivo tradicionais seguidos de caracterização bioquímica, como o desenvolvido
39
pelo United States Department of Agriculture (USDA) e pelo Food and Drug
Administration (FDA) (40) e métodos alternativos, como a Polymerase Chain
Reaction (PCR), Ribotipagem, qPCR TaqMan , Nested PCR, Random Amplification
of Polymorphic DNA (RAPD), entre outros (34, 4, 20, 8, 18) são, geralmente,
sensíveis e específicos. Entretanto, apresentam custo elevado ou a quantidade de
tempo dispendido ainda é alta. Por isso, cada vez mais buscam-se métodos de
detecção alternativos específicos, sensíveis, mais simples e rápidos, e como
alternativa aplicável surgem os métodos imunológicos.
Para o êxito da detecção através de métodos imunológicos, a utilização de
anticorpos que apresentem alta afinidade e especificidade a um antígeno de fácil
acesso aos anticorpos, que seja exclusivo da espécie e que se mantenha
conservado entre os diferentes sorotipos de L. monocytogenes é de suma
importância. Porém, a maioria dos kits para testes imunológicos, disponíveis
comercialmente, detecta todas as espécies de Listeria, não distinguindo patogênicas
de não-patogênicas (22) e/ou são importados e apresentam um custo elevado.
Outro fator essencial para o sucesso dos métodos imunológicos de detecção
é o elevado nível de expressão celular do antígeno alvo. Condições de crescimento
ou fatores ambientais como a concentração de nutrientes, acidez, temperatura,
fontes de carbono, concentração de sais, estresses oxidativo e osmótico, podem
regular a expressão de antígenos nas células e, assim, afetar a detecção de
microrganismos baseada na relação antígeno-anticorpo (13). Pesquisas têm
observado variações nos níveis de expressão de antígenos de Listeria sob
diferentes condições de crescimento e ambientais (28, 31, 29, 14, 13, 22, 1). Assim
torna-se necessário o estudo das condições ideais a fim de melhorar a expressão do
antígeno alvo.
40
Analisando o potencial de utilização dos fatores de patogenicidade de L.
monocytogenes como antígenos detectáveis em testes imunológicos, observou-se
que a internalina A (InlA), uma proteína de membrana utilizada pelo patógeno para
sua adesão e internalização às células do hospedeiro (38), apresenta-se como
excelente alvo para a produção de anticorpos e utilização em métodos de detecção
desse microrganismo. Isto porque, além da sua localização na superfície celular da
bactéria, também é expressa em grande quantidade por cepas de L. monocytogenes
(2, 5) e ausente nas outras espécies do gênero Listeria (35). Por isso, estudos
visando desenvolver métodos rápidos, específicos e sensíveis para detecção desse
patógeno em alimentos, utilizando anticorpos monoclonais (MAbs) e policlonais
(PAbs) contra internalina A, estão sendo desenvolvidos (26).
Os efeitos da associação de meios de enriquecimento seletivos e não
seletivos, diferentes temperaturas e origem das cepas sobre a expressão de InlA
não são conhecidos. A determinação das condições ideais para maior expressão da
InlA por L. monocytogenes poderá aumentar a sensibilidade e especificidade de
métodos imunológicos de detecção desse patógeno em alimentos baseados na
identificação do antígeno InlA. Por isso, o objetivo do presente estudo foi avaliar o
nível de expressão da proteína InlA em L. monocytogenes do sorotipo 4b de duas
origens (clínica e não-clínica) sob diferentes condições de crescimento (em três
meios de enriquecimento seletivos e três não-seletivos, e sob as temperaturas de
incubação de 29 e 37 º C).
41
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Cepas bacterianas e condições de cultivo
Com a intenção de produzir a proteína recombinante InlA (rInlA), utilizou-se
a cepa Escherichia coli BL21(DE3) pLysS (Invitrogen, USA). O cultivo foi realizado
em caldo Luria-Bertani (LB) (10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura e 10 g de
cloreto de sódio por litro) com adição de 34 μg.mL-1 de cloranfenicol, quando
necessário, e 100 μg.mL-1 de ampicilina e incubado à 37 °C por 16 - 18h em agitador
orbital a 200 rpm.
Foram utilizadas duas cepas padrão de L. monocytogenes pertencentes ao
sorotipo 4b (uma clínica e uma não-clínica), uma cepa de L. innocua e uma de
Salmonella enterica, todas provenientes da coleção de culturas do Laboratório de
Microbiologia do Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial da
Universidade Federal de Pelotas (LM/DCTA/UFPel). As cepas foram recuperadas
em caldo Brain Heart Infusion (BHI) (Oxoid, UK), por 16 - 18 h à 37 °C sob agitação
de 200 rpm.
3.2 Produção da proteína InlA recombinante (rInlA)
Visando à expressão da proteína rInlA, células competentes de E. coli
BL21(DE3) pLysS foram transformadas com o plasmídeo de expressão pAE
contendo o gene inlA (pAE/inlA) por eletroporação (200 OHMS, 2,5 kv, 25 uFD) e
após incubação por 1h/37 °C em caldo LB, adicionou-se o cultivo a placas contendo
ágar LB com ampicilina e cloranfenicol nas concentrações já descritas.
As colônias recombinantes selecionadas em ágar LB com antibióticos foram
transferidas para 25 mL de caldo LB contendo ampicilina e cloranfenicol, e então,
incubadas em agitador orbital (37 ºC/200 rpm) por 16 – 18h. Posteriormente, os 25
mL foram adicionados a 500 mL de caldo LB contendo as mesmas concentrações
42
dos antibióticos já citados e o cultivo novamente incubado a 37 °C/200 rpm até a
fase log de crescimento (DO600 de 0,5 a 0,7) .
A expressão de rInlA foi induzida com 0,5 mM de isopropil ß-D-
tiogalactosídeo (IPTG) a 28ºC, sob agitação (200 rpm) por 16 – 18h. Aliquotas pré e
pós indução foram retiradas e centrifugadas a 20.000 x g durante 2 min para
confirmação da expressão da rInlA através de eletroforese em gel de poliacrilamida
a 12% (SDS-PAGE) (21).
A purificação da proteína rInlA foi realizada conforme descrito por Sambrook
& Russell (2001), com modificações. O cultivo de 500 mL foi centrifugado e o pellet
suspenso em 30 mL de tampão de lise (20 mM de NaH2PO4; 500 mM de NaCl; 10
mM de Imidazole). Adicionou-se lisozima (1mg. mL-1) e a solução foi incubada em
câmara fria (4 °C) por 30 min sob agitação. Em seguida, as células foram sonicadas
(6x, 15s, 20 kHz) e a solução foi centrifugada a 10.000 x g por 30 min a 4 °C.
Sabendo-se que a proteína produzida é totalmente solúvel (26), após
sonicação, o sobrenadante contendo a proteína foi processado. Primeiramente
filtrou-se o sobrenadante em membrana de 0,8 μm (Millipore, USA) e, após,
purificou-se a proteína através de cromatografia de afinidade em coluna Hi-Trap HP
(GE Healthcare, UK) carregada com níquel (Ni+2-Sepharose, Invitrogen, USA),
utilizando o sistema de cromatografia líquida de baixa pressão ÄKTAPrime (GE
Healthcare, UK), conforme instruções do fabricante. Ao final da purificação, eluiu-se
o purificado em frações utilizando tampão de eluição (20 mM de NaH2PO4; 500 mM
de NaCl; 250 mM de Imidazole) e o grau de pureza das alíquotas de proteína
recombinante foi verificado através de SDS-PAGE 12%.
Selecionadas as frações contendo rInlA pura, estas foram depositadas em
membrana de diálise e dialisadas contra salina tamponada fosfatada (PBS), pH 7.2,
43
durante 48 h à 4 °C, realizando-se trocas de tampão a cada 12 h. Então, a proteína
rInlA foi concentrada em solução de polietilenoglicol a 20% e quantificada pelo
método Bradford (3).
3.3 Produção, purificação e caracterização do soro policlonal (PAb) anti-
rInlA
Soro policlonal anti-rInlA foi produzido em camundongos da linhagem
BALB/c (com idade entre 6 e 8 semanas) utilizando protocolo de imunização
proposto por Harlow & Lane (16) e produção de ascite segundo Cevenini et al. (9),
com modificações. Camundongos foram imunizados intra-peritonialmente com 50 µg
de rInlA em 450 µL de adjuvante de Freund® incompleto (Sigma-Aldrich, USA) nos
dias 0, 7, 14 e 21. No sexto dia após a primeira imunização os camundongos
receberam uma dose de 500 µL de Pristane® (Sigma-Aldrich, USA). A ascite
produzida foi recolhida por punção em tubos de 15 mL e centrifugada a 12.000 x g
por 1 min, para retirar possíveis células presentes..
Anticorpos IgG foram purificados por cromatografia de afinidade em coluna de
proteína A-Sepharose de acordo com as instruções do fabricante (Amersham, MS),
utilizando o sistema ÄKTA prime. A pureza dos anticorpos foi confirmada através de
SDS-PAGE, sua concentração final foi estimada pelo método Bradford (3) e sua
diluição de uso, capacidade de reconhecer a proteína InlA de L. monocytogenes na
forma nativa (com a célula íntegra e com a célula lisada) e especificidade
determinadas por ELISA indireto. O PAb foi armazenado a -20 °C até o momento do
uso.
44
3.4 Avaliação do nível de expressão da proteína InlA sob diferentes
condições de crescimento de L. monocytogenes
Para avaliação dos níveis de expressão de InlA sob diferentes condições de
crescimento, cada uma das duas cepas de L. monocytogenes recuperadas
previamente em caldo BHI, foram cultivadas a 1% em 10 mL dos caldos não
seletivos LB, BHI (Oxoid,UK) e Tryptic Soy Broth (TSB) (Oxoid,UK) e dos caldos
seletivos Fraser (FRA) (Oxoid,UK), Listeria Enrichment Broth (LEB) (Oxoid,UK) e
Listeria Enrichment Broth - University of Vermont Medium (LEB-UVM) (Oxoid,UK) e
os cultivos incubados sob agitação de 200 rpm a 29 e 37 °C por 16 - 18 h. Para
confirmação dos resultados foram realizadas três repetições do experimento
contando com duplicatas de cada amostra.
3.4.1. Enzyme-Linked Immunoabsorbent Assay (ELISA)
Para avaliação da expressão da proteína InlA através de ELISA indireto, os
cultivos de L. monocytogenes nos diferentes meios e temperaturas foram
centrifugados (2200 x g, 15 min), lavados três vezes em PBS e suspensos em 5 mL
de tampão carbonato-bicarbonato 0,05 M, pH 9,6. Após, as concentrações celulares
foram padronizadas através de espectrofotometria, ajustando-se a DO600 a 1,0, a
qual equivalia a uma contagem em câmara de Petroff-Hausser de aproximadamente
1,5 x 108 UFC.mL-1.
Placas de 96 cavidades foram cobertas com 50 µl dos extratos celulares
padronizados (7,5 x 106 UFC) em tampão carbonato-bicarbonato 0,05M, pH 9,6.
Como controles positivo e negativo do ELISA, foram dispostos na placa 1,5 µg de
rInlA e 50 µL de extrato celular (7,5 x 106 UFC) de Salmonella enterica.
45
Anticorpo policlonal anti-rInlA (diluído 1:1000) foi adicionado às cavidades
como anticorpo primário e anticorpo anti-Ig totais de camundongo produzido em
cabra conjugado a peroxidase (1:2000) foi utilizado como anticorpo secundário
marcado. Todas as reações ocorreram por 1 h a 37ºC (com exceção da
sensibilização que ocorreu por 16 – 18 h a 4 ºC), os reagentes foram utilizados a um
volume de 50 µL/cavidade e após todas as etapas de incubação, as placas foram
lavadas 3 vezes com 200 µL/cavidade de PBS, pH 7,2 contendo 0,05% (v/v) de
Tween 20 (PBST). Excesso de conjugado foi removido através de cinco lavagens
com PBST e a solução de substrato da enzima/cromógeno (H2O2/
ortophenylenodiamine) em tampão citrato-fosfato pH 5,0 foi adicionada. A reação
ocorreu no escuro por 10 min e a densidade óptica foi lida a 450 nm em um leitor de
ELISA automatizado (TP-Reader, USA)
3.4.2. Real-time Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR em tempo real)
Para a análise da expressão da proteína InlA através de RT-PCR em tempo
real, 1 mL de cada cultivo foi centrifugado (7.500 x g, 10 min) e o RNA total extraído
com TRIzol® Reagent (Invitrogen, USA) de acordo com protocolo do fabricante com
algumas modificações. A fim de facilitar o rompimento da membrana bacteriana,
antes da adição do Trizol, os pellets foram suspensos em 100 µl de tampão Tris-
EDTA contendo 5 mg.mL-1 de lisozima (Sigma Aldrich, USA) e 13 mg.mL-1 de
proteinase K (Sigma Aldrich, USA), e as soluções incubadas por 15 min a 37 °C.
Concentrações finais de RNA foram determinadas utilizando o kit QuBit®
fluorometer (Invitrogen, USA). Duas microgramas dos RNAs foram utilizadas para a
síntese de cDNA através de transcrição reversa utilizando o kit High Capacity
cDNA® (Applied Biosystems) de acordo com o protocolo do fabricante.
46
Primers para amplificar o gene inlA e para o gene tufA (tab. 1), utilizado
como controle interno em todos os experimentos, foram desenhados com o auxílio
do software Vector NTI e sintetizados pela Eurofins MWG Operon. Os primers foram
desenhados a partir das seqüências dos genes inlA (número de acesso DQ132795)
e tufA (número de acesso (7702763), depositadas no banco de dados de genomas
GenBank.
A PCR em tempo real foi realizada de acordo com as recomendações de
Livak e Schmittgen (2001), sendo executada no Stratagene® Mx3005P™ Real-Time
PCR System (Agilent Technologies) utilizando-se SYBR® Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems). Experimentos de validação iniciais foram realizados
para garantir que os dois pares de primers apresentassem eficiências equivalentes
durante a PCR. A amplificação foi realizada utilizando um ciclo de 95 °C por 10 min
e 40 ciclos a 95 °C por 15 segundos e 60 °C por 1 min. Todas as reações de PCR
foram efetuadas em duplicatas e os dados analisados usando o método 2–ΔΔCt,
segundo Pfaffl (35).
3.5. Análise estatística
Dados quantitativos provenientes das reações da PCR em tempo real e do
ELISA indireto foram analisados através de testes estatísticos, utilizando-se para tal
análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Tukey, no software Statistix 9.0.
Para as análises, o nível de significância considerado foi de 5% (p < 0,05). Teste de
correlação entre os métodos de análise foi realizado utilizando Microsoft Excel 2007.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
47
Nesse trabalho pesquisou-se a interferência das condições de cultivo sobre
a expressão da proteína InlA, devido ao seu potencial para utilização em
imunoensaios de detecção de L. monocytogenes (26). A avaliação dos níveis de
expressão de InlA foi realizada através de dois métodos, ELISA indireto e RT-PCR
em tempo real.
Para a avaliação da expressão da InlA nativa através de ELISA indireto, a
utilização de anticorpos anti-InlA se fez necessária. E, para a produção desses
anticorpos em camundongos, foi necessário expressar a proteína recombinante
rInlA. Assim, E. coli BL21(DE3) pLysS foi transformada com o vetor de expressão
pAE/inlA obtido por Mendonça et. al. (27) e a proteína recombinante rInlA, de
aproximadamente 83 kDa, foi expressa. Após a purificação, obteve-se um
rendimento de 5 mL da proteína recombinante na concentração de 1,2 mg.mL-1.
Anticorpos anti-rInlA foram produzidos através da imunização de
camundongos com a proteína rInlA, purificados, quantificados e titulados através de
ELISA indireto. A concentração do soro policlonal obtido foi de 4,92 mg.mL-1. Após
padronização do ELISA indireto, verificou-se que a diluição de uso ideal do soro
policlonal para avaliação da expressão de InlA era de 1:1000 (dados não
demonstrados).
O soro policlonal obtido demonstrou sensibilidade necessária para a
realização do ELISA na avaliação da expressão de InlA, pois foi capaz de
reconhecer a proteína InlA de L. monocytogenes na forma nativa tanto com a célula
íntegra quanto com a célula lisada. Além disso, mostrou-se altamente específico,
visto que não reagiu com as cepas de L. innocua e Salmonella enterica avaliadas
(dados não demonstrados).
48
Estudos têm evidenciado que as condições de crescimento e a
disponibilidade de nutrientes influenciam, consideravelmente, a regulação e a
expressão de genes de virulência de L. monocytogenes (28, 20,14, 29, 22, 25).
Entretanto, não foram encontrados relatos da influência desses fatores sobre a
expressão de InlA.
Tendo isso em vista, para avaliar a interferência da associação entre meios,
temperaturas e origem das cepas sobre a expressão da proteína InlA de
L.monocytogenes utilizou-se duas cepas pertencentes ao sorotipo 4b de origens
diferentes, seis meios de enriquecimento (seletivos e não seletivos) e duas
temperaturas de incubação (29 e 37 °C). A escolha dos meios e temperaturas se
deu em virtude da diferença em suas composições e da ampla disponibilidade de
obtenção destas condições, visto que são as comumente utilizadas nas rotinas
laboratoriais de pesquisa bacteriológica.
Os dados quantitativos obtidos por ELISA foram submetidos à análise
estatística. A partir dos resultados da análise estatística foi possível inferir que houve
baixa correlação entre temperatura e meios; temperatura e origem das cepas (clínica
e não-clínica); e temperatura, meios e origem. Diferenças significativas somente
foram encontradas entre a origem das cepas e os meios. Essas diferenças são
apresentadas na Fig. 1.
A interferência da temperatura sobre a expressão dos genes inlA, internalina
B (inlB) e internalina C (inlC) em cepas do sorotipo 1/2a de L. monocytogenes foi
estudada por McGann et al. (25) através de microarray e RT-PCR. Eles observaram
que não ocorreu diferença significativa na expressão dessas proteínas quando as
cepas foram cultivadas a 30 °C e 37 °C, resultados que corroboram com os obtidos
no presente estudo.
49
Na Fig. 1, pode-se visualizar que a cepa de L. monocytogenes não-clínica
apresentou maiores níveis de expressão de InlA do que a cepa clínica, fato
evidenciado pela diferença estatisticamente significativa (p<0,05) representada pelas
letras diferentes. Os resultados obtidos são corroborados com os do estudo de
Werbrouck et al. (43), que, ao analisarem fenotipicamente cepas de vários sorotipos
de L. monocytogenes de diferentes origens, verificaram, através de RT-PCR, que
cepas não-clínicas obtiveram valores mais elevados de expressão de InlA do que as
cepas clínicas por eles analisadas. Segundo esses autores, uma possível explicação
para o fato de cepas clínicas expressarem menores níveis de transcritos de InlA e
internalina B (InlB) seria que, assim, essas cepas virulentas apresentariam um
menor grau de invasão celular, o qual seria utilizado como uma estratégia de evasão
imune, para prevenir o bloqueio da infecção na fase inicial pelo sistema imune não
específico. Essa hipótese é suportada pela observação de que cepas clínicas
estimulam uma menor produção de interleucina 8 (IL-8) nas células hepáticas, que
atrai neutrófilos para o foco da inflamação, levando ao controle da infecção. Já
Alessandria (1), pesquisando a expressão de genes de virulência deste patógeno,
observou que a expressão dos genes de L. monocytogenes está mais relacionada
às condições de crescimento das cepas do que a sua origem.
A expressão de InlA variou de acordo com o meio utilizado. Uma maior
densidade óptica foi obtida quando a cepa não clínica foi cultivada em caldo BHI,
seguida, consecutivamente, pelo cultivo nos caldos TSB, LEB e FRA. Ou seja, a
cepa não-clínica expressa maiores níveis de InlA quando cultivada em meios de
cultura não seletivos. Resultado semelhante foi verificado por Lathrop et al. (22),
que, pesquisando a interferência dos meios de cultivo sobre a expressão das
proteínas InlB e de polimerização da actina (ActA) de L. monocytogenes,
50
observaram que a maioria das cepas apresentaram uma maior expressão de InlB
quando cultivadas em meios não seletivos (caldos BHI e LB) do que quando
cultivadas em meios seletivos (LEB, UVM, FRA). Segundo os autores, essa
diferença de expressão entre as duas proteínas provavelmente se deva à
necessidade de utilização delas pelo microrganismo, em diferentes momentos
durante a infecção, sendo diferencialmente reguladas pelas condições ambientais.
Essas informações tornam-se relevantes a medida que sabe-se da correlação entre
InlA e InlB no mecanismo de internalização durante uma infecção e que a expressão
dessas duas internalinas é regulada pelo mesmo gene (prfA, fator regulador positivo
A) (25). Entretanto, no presente estudo, a diferença na expressão de InlA entre os
quatro caldos (BHI, TSB, LEB e FRA) não foi significativa. Somente foi obtido um
maior nível de expressão (p<0,05) quando a cepa não-clínica foi cultivada nos
caldos BHI, TSB, LEB e FRA em relação ao caldo LB e entre os três primeiros
caldos em relação ao caldo UVM.
Já com relação à proteína ActA, a maioria das cepas do estudo de Lathrop
et al. (22) apresentaram uma maior expressão quando cultivadas em meios seletivos
(LEB, UVM e FRA). Ao verificar a expressão diferencial entre InlB e ActA, os autores
sugerem que isso se deva às quantidades de glicose, sais, tampões ou uso de
antimicrobianos nos meios de cultivo utilizados, porém, citam a necessidade de
maiores estudos para compreender os mecanismos de regulação que influenciaram
a heterogeneidade de expressão observada entre as cepas. Resultado semelhante
foi observado por Gracieux et al. (14), que, ao testarem os efeitos de quatro meios
de cultivo seletivos sobre o crescimento das cepas virulentas e não virulentas de L.
monocytogenes e sobre a expressão dos genes de virulência, verificaram que tanto
51
o crescimento das cepas virulentas quanto a expressão de alguns genes eram
favorecidos nesses meios.
A importância da pesquisa das condições ideais de crescimento, visando à
otimização da expressão da proteína alvo e o conseqüente êxito dos métodos
imunológicos, foi evidenciada também por Geng et al. (13) que, ao pesquisar a
expressão de diversas proteínas envolvidas na patogenicidade de L.
monocytogenes, observaram que elas são diferencialmente expressas na superfície
das células quando cultivadas em caldos de enriquecimento seletivos (LRB – Listeria
rapair broth, FRA, LEB, UVM). Esses autores verificaram que todas as proteínas
investigadas obtinham um nível mais elevado de expressão quando cultivadas em
LRB e LEB, e havia redução ou ausência de expressão quando cultivadas em UVM
e FRA. Nannapaneni et al. (31) também observaram uma grande variabilidade na
detecção de espécies de Listeria por anticorpos monoclonais em função do meio de
cultura utilizado para o enriquecimento das células bacterianas. Ainda Navas et al.
(32), avaliando o potencial de detecção utilizando diferentes meios de
enriquecimento seletivo de Listeria, observaram que existe discrepância de
resultados entre a utilização dos meios seletivos de enriquecimento primários e
secundários, tanto nos métodos clássicos de detecção quanto nos utilizando PCR.
Segundo os autores, as possíveis causas para esses resultados seriam, não só o
crescimento limitado de L.monocytogenes, gerando resultados falso-negativos na
PCR (enriquecimento secundário), mas também a presença de elevadas
concentrações de populações de Listeria spp. não-patogênicas, ocasionando
resultados falso-negativos nos métodos clássicos (enriquecimento primário).
Com relação à cepa clínica, maiores valores de densidade óptica foram
obtidos quando ela foi cultivada nos caldos FRA, TSB, LEB e UVM, nesta ordem.
52
Entretanto, a expressão de InlA por essa cepa só foi superior (p<0,05) quando
cultivada em caldo FRA em relação aos caldos UVM, BHI e LB, e inferior (p<0,05) a
obtida nos caldos FRA, TSB e LEB quando foi cultivada em caldo LB. Esses
resultados sugerem que há diferença de expressão de InlA entre as cepas, ou seja,
a variação na expressão de InlA é cepa-específica, e que, além da origem da cepa,
o meio de crescimento pode interferir diretamente nessa expressão. Além disso,
sugerem que, independentemente da origem da cepa, os meios de enriquecimento
mais indicados para uso em métodos de detecção de InlA são FRA, TSB e LEB e os
menos indicados, LB e UVM.
Segundo Jacquet et al. (19), cepas clínicas de L. monocytogenes expressam
internalina A de forma íntegra com muito mais freqüência (96% das cepas em
estudo) do que cepas isoladas de alimentos (65%). Resultado semelhante foi
observado por Van Stelten et. al (42) que, entre outros fatores, investigaram
mutações nos genótipos de cepas de L. monocytogenes, e verificaram que entre as
cepas isoladas de alimentos, 45% apresentaram mutações que geravam prematuros
stop-códons em InlA. Uma proporção considerável em comparação aos isolados
clínicos, que obtiveram apenas 5,1% de suas amostras com a mesma mutação. Isso
é um dado importante, pois Nightingale et al. (33) demonstraram que isolados
contendo prematuros stop-códons em InlA podem ser até 10 mil vezes menos
virulentos que aqueles cuja internalina é expressa de forma íntegra.
Estudos têm demonstrado que a expressão de InlA de forma íntegra ou
truncada está diretamente relacionada à origem e ao sorotipo da cepa (43, 19, 42)
Grande parte dos surtos de listeriose humana está relacionada ao sorotipo 4b,
sendo este o mais isolado de casos clínicos. Isso pode ocorrer devido ao fato de que
todas as cepas desse sorotipo expressam a proteína InlA na sua forma íntegra (19),
53
sendo assim, mais propensas a invasão. Como as duas amostras utilizadas nesse
estudo são do sorotipo 4b, conclui-se que a diferença verificada na expressão entre
elas deve-se exclusivamente, às condições de cultivo e não à forma a qual a
proteína foi expressa.
A expressão das cepas nas mesmas condições avaliadas por ELISA indireto
foram aferidas através de RT-PCR em tempo real e os dados obtidos foram
analisados estatisticamente. Os resultados dessa análise podem ser visualizados na
Fig. 2. Nessa figura, pode-se observar que existe diferença nos níveis de expressão
entre as amostras. Entretanto, a análise estatística não verificou significância na
diferença entre nenhuma das avaliações. Acredita-se que isso se deve a grande
variação do desvio padrão. Uma possível causa para essa variação é o número
limitado de cepas utilizadas no estudo. Outra explicação plausível seria a escolha do
gene normalizador tufA, que pode ter interferido nos resultados não apresentando
uma expressão linear satisfatória. Autores citam que alguns genes housekeeping de
L. monocytogenes sofrem influência da temperatura e de outras condições de
crescimento, alterando seus níveis de transcrição (10, 41, 25). Por isso, para tornar
a metodologia mais precisa e confiável, seria necessária a utilização conjunta de
dois genes housekeeping.
Foram realizadas análises de correlação entre as metodologias, a fim de
verificar correspondência entre os resultados obtidos e traçar perfis de
comportamento entre as amostras, no que se refere a níveis de expressão. Os
valores do teste de correlação entre os dois métodos de ensaio podem ser
observados na tab. 2.
Analisando os resultados da correlação entre os métodos para a cepa clínica
(Fig. 3), verificou-se uma correlação moderada para os meios FRA e LEB, uma
54
correlação fraca para o meio UVM, e nenhuma correlação para os meios TSB, LB e
BHI. Já com relação à expressão na cepa não-clínica (Fig.4), foi possível detectar
correlação em todos os meios de enriquecimento avaliados. Os meios UVM e TSB
apresentaram correlação forte, FRA e LB apresentaram correlação moderada e LEB
e BHI uma correlação fraca.
Mesmo que uma análise seja fenotípica e a outra genotípica, as correlações
fracas e moderadas podem ter sido oriundas do número limitado de cepas utilizadas
no estudo, o que será verificado em estudos posteriores. Essa também é uma
possível explicação para a falta de significância nas analises estatísticas do RT-
PCR.
Foram verificadas outras limitações durante esse estudo, as quais também
serão resolvidas futuramente com a realização de mais ensaios utilizando, para
tanto, um número maior de cepas e cepas de diferentes origens. Além disso, serão
utilizados outros genes constitutivos como normalizadores no RT-PCR em tempo
real, a fim de subtrair possíveis interferentes e aumentar a sensibilidade do teste
estatístico aplicado. Não obstante, também serão utilizados anticorpos monoclonais
anti-rInlA no ELISA indireto, para tentar aumentar a sensibilidade do teste.
Entretanto, apesar das limitações, os resultados do ELISA indireto sugerem
que existem interferências da origem da cepa e das condições de cultivo, mais
especificamente do meio de enriquecimento, sobre a expressão da InlA de L.
monocytogenes. Assim, métodos imunológicos ou RT-PCR baseados na detecção
desse fator de virulência podem produzir resultados falso-negativos ou apresentar
menor sensibilidade se um meio de enriquecimento apropriado não for utilizado.
Em conclusão, os resultados desse estudo sugerem que a expressão de InlA
foi influenciada pela origem do isolado, pois a cepa de L. monocytogenes não-clínica
55
apresentou maiores níveis de expressão de InlA do que a cepa clínica. Além disso,
com relação às condições de cultivo, observou-se que não ocorreu diferença
significativa na expressão de InlA quando as cepas foram cultivadas sob as
temperaturas de 29 e 37°C. Porém, verificou-se a interferência dos meios na
expressão do fator de virulência InlA, sendo os meios de enriquecimento mais
indicados para uso em métodos de detecção desse antígeno, independentemente
da origem da cepa, o FRA, TSB e LEB e os menos indicados, LB e UVM. Esses
resultados sugerem que a utilização de meios de cultivo adequados poderia diminuir
a probabilidade de obtenção de resultados falso-negativos em testes imunológicos
ou RT-PCR baseados na detecção desse antígeno (InlA), aumentando a
sensibilidade do teste aplicado.
5 REFERÊNCIAS
(1) ALESSANDRIA, V. Virulence gene expression in Listeria monocytogenes strains isolated from different sources. 14th Workshop on the Developments in the Italian PhD Research on Food Science Technology and Biotechnology - University of Sassari, 2009.
(2) BIERNE, H.; SABET, C.; PERSONNIC, N., COSSART, P. Internalins: a complex
family of leucine-rich repeat-containing proteins in Listeria monocytogenes. Microbes Infect., 9:1156-1166, 2007.
(3) BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive for the quantification of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem.,72:248-254, 1976.
(4) BYUNA, S.K, JUNGA, S.C. & YOOB, H.S. Random amplification of polymorphic
DNA typing of Listeria monocytogenes isolated from meat. Int. J. Food Microbiol., 69:.227-235, 2001.
(5) CABANES, D.; DEHOUX, P.; DUSSURGET, O.; FRANGEUL, L.; COSSART, P.
Surface proteins and the pathogenic potential of Listeria monocytogenes. Trends Microbiol., 10:238-245, 2002.
(6) CABRITA, P., CORREIA, S., FERREIRA-DIAS, S., BRITO, L. Genetic
characterization of Listeria monocytogenes food isolates and pathogenic potential within serovars 1/2a and 1/2b. System. Applied Microbiol., 27:454-461, 2004.
56
(7) CALLEJO, R.; PRIETO, M.; MARTÍNEZ, C.; AGUERRE, L.; ROCCA, F.; MARTÍNEZ, G.; PALMIERI, O. Estudio mediante PCR múltiple de serotipos de Listeria monocytogenes aislados en Argentina. Rev. Argent. Microbiol., 40: 89-92, 2008.
(8) CHASSEIGNAUX, E.; GERAULT, P.; TOQUIN, M.T.; SALVAT, G.; COLIN, P.;
ERMEL, G. Ecology of Listeria monocytogenes in the environment of raw poultry meat and raw pork meat processing plants. FEMS Microbiology Letters, 210:271-275, 2002.
(9) CEVENINI, R.; SAMBRI, V.; PILERI, S.; RATTI, G.; LA PLACA, M. Development
of transplantable ascites tumours which continuously produce polyclonal antibodies in pristane primed BALB/c mice immunized with bacterial antigens and complete Freund's adjuvant. J. Immunol. Methods, 140: 111-118, 1991.
(10) CHATURONGAKUL, S., & BOOR, K. J. RsbT and RsbV contribute to σ
B –
Dependent survival under environmental, energy, and intracellular stress conditions in Listeria monocytogenes. Appl. Environ. Microbiol., 70:5349–5356, 2004.
(11) DONNELLY, C.W. Listeria monocytogenes: a continuing challenge. Nutri. Rev.,
59:183–194, 2001. (12) FARBER, J. M.; PETERKIN, P. I. Listeria monocytogenes, a Food-Borne
Pathogen. Microbiol.l Rev., 55: 476–511, 1991. (13) GENG, T., HAHM, B.K. AND BHUNIA, A.K. Selective enrichment media affect the
antibody-based detection of stress-exposed Listeria monocytogenes due to differential expression of antibody-reactive antigens identified by protein sequencing. J. Food Prot., 69: 1879–1886, 2006.
(14) GRACIEUX, P.; ROCHE, S. M.; PARDON, P. ;VELGE, P. Hypovirulent Listeria
monocytogenes strains are less frequently recovered than virulent strains on PALCAM and Rapid' L. mono media. Int. J. Food Microbiol., 83:133-145, 2003.
(15) HAHM, B.K. BHUNIA, A.K. Effect of environmental stresses on antibody-based
detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella enterica serotype Enteritidis and Listeria monocytogenes. J. Appl. Microbiol., 100:1017–1027, 2006.
(16) HARLOW, E.; LANE, D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1988, 726 p. (17) HOBBS, B.C. & ROBERTS, S. Toxinfecções e controle higiênico-sanitário de
alimentos. São Paulo, 1998, 376p. (18) HOLKO, I.; URBANOVA, J.; KANTIKOVA, M.; PASTOROVA, K.; KMET, V. PCR
detection in milk and milk products and differentiation of suspect isolates. Acta Vet. Brno, 71:125-131, 2002.
(19) JACQUET, C.; DOUMITH, M.; GORDON, J.I.; MARTIN, P.M; COSSART, P.;
LECUIT, M. A molecular marker for evaluating the pathogenic potential of foodborne Listeria monocytogenes. J. Infect. Dis., 189: 2094-2100, 2004.
57
(20) JARADAT, Z.W.; SCHUTZE, G.E.; BHUNIA, A.K. Genetic homogeneity among
Listeria monocytogenes strains from infected patients and meta products from two geographic locations determined by phenotyping, ribotyping and PCR analysis of virulence genes. Int. J. Food Microbiol., 76:1-10, 2001.
(21) LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head
of bacteriophage T4. Nature, 227:680-685, 1970. (22) LATHROP, A.A.; BANADA, P.P.; BHUNIA, A.K. Differential expression of InlB and
ActA in Listeria monocytogenes in selective and nonselective enrichment broths. J. Appl. Microbiol., 104:627–639, 2008.
(23) LIANOU, A., STOPFORTH, J. D., YOON, Y., WIEDMANN, M., SOFOS, J. Growth
and stress resistance variation in culture broth among Listeria monocytogenes strains of various serotypes and origins. J. Food Prot., 69:2640-2647, 2006.
(24) LIVAK K.J., SCHMITTGEN T.D. Analysis of relative gene expression data using
real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods, 25: 402-408, 2001.
(25) MCGANN, P.; IVANEK, R.; WIEDMANN, M.; BOOR, K.J. Temperature-dependent
expression of Listeria monocytogenes internalin and internalin-like genes suggests functional diversity of these proteins among the Listeriae. Appli. Environ. Microbiol., 73:2806–2814, 2007.
(26) MENDONÇA, M.; BUENO, F. M.; COUTINHO, M. L.; SENH, C.P.; CONCEIÇÃO,
F. R.; CERQUEIRA, G. M.; DELLAGOSTIN, O. A.; MOREIRA, A. N.; ALEIXO, J.A. G.; SILVA, W. P. Produção e caracterização de anticorpos monoclonais contra Internalina A de Listeria monocytogenes. XVI Congresso de Iniciação Científica e IX Encontro de Pós-Graduação. Pelotas, 2007.
(27) MENDONÇA, M.; CONRAD, N. L.; FRANÇA, R.C.; CONCEIÇÃO, F.R;
MOREIRA, A.N; SILVA, W.P; ALEIXO, J.A.G . Produção da proteína InlA de Listeria monocytogenes em Escherichia coli visando à obtenção de anticorpos monoclonais. XVII Congresso de Iniciação Científica e X Encontro de Pós-Graduação. Pelotas, 2008.
(28) MILENBACHS, A.A., BROWN, D.P., MOORS, M. AND YOUNGMAN, P. Carbon
source regulation of virulence gene expression in Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol., 23:1075– 1085, 1998.
(29) MILOHANIC, E., GLASER, P., COPPEE, J.-Y., FRANGEUL, L., VEGA, Y.,
VAZQUEZ-BOLAND, J.A., KUNST, F., COSSART, P. BUCHRIESER, C. Transcriptome analysis of Listeria monocytogenes identifies three groups of genes differently regulated by PrfA. Mol. Microbiol., 47:1613–1625, 2003.
(30) MURRAY, P.R. et al. Listeria, Erysipelothrix e outros bacilos Gram-positivos. In:
Microbiologia Médica. 3ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. cap. 27, p. 181-184.
58
(31) NANNAPANENI, R.; STORY, R.; BHUNIA, A. K..; JOHNSON, M.G. Reactivities of Genus-Specific Monoclonal Antibody EM-6E11 against Listeria Species and Serotypes of Listeria monocytogenes Grown in Nonselective and Selective Enrichment Broth Media. J. Food Prot., 61:1195-1198, 1998.
(32) NAVAS J, ORTIZ S, LOPEZ P, JANTZEN MM, LOPEZ V, MARTINEZ-SUAREZ JV.Evaluation of effects of primary and secondary enrichment for the detection of Listeria monocytogenes by real-time PCR in retail ground chicken meat. Foodborne Pathog Dis. 3:347-354, 2006
(33) NIGHTINGALE, K. K.; IVY, R. A.; HO, A. J.; FORTES, E. D.; NJAA, B. L.;
PETERS, R. M.; WIEDMANN, M. inlA premature stop codons are common among Listeria monocytogenes isolated from foods and yield virulence-attenuated strains that confer protection against fully virulent strains. Appl. Environ. Microbiol., 74:6570–6583, 2008.
(34) NORTON, D.M.; BATT, C.A. Detection of viable Listeria monocytogenes with a
5„nuclease PCR assay. Appl. Environ. Microbiol., 65:2122-2127, 1999. (35) PFAFFL, M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time
RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29:45, 2001. (36) POYART, C., TRIEU-CUOT, P.; BERCHE, P. The inlA gene required for cell
invasion is conserved and specific to Listeria monocytogenes. Microbiology, 142:173-180, 2003.
(37) SAMBROOK J., FRITSCH E. & MANIATIS T. Molecular cloning: A Laboratory
Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001 (38) SCHUBERT, W.D.; URBANKE, C.; ZIEHM T.; HEINZ D.W. Structure of internalin,
a major invasion protein of Listeria monocytogenes, in complex with Its Human Receptor E-Cadherin. Cell, 111:825–836, 2002.
(39) SEELIGER, H.P.R.; JONES, D. Genus Listeria. In: SNEATH, P.H.A.; MAIR,
N.S.SHAPE, M.E. Bergey’s Manual of Sistematic Bacteriology. 9 ed. Baltimore: Willians e Wilkins, 1996, v. 2, p. 1235-1245.
(40) SILVA, N. da; JUNQUEIRA, V.C.A; SILVEIRA, N.F.A. Manual de Métodos de
Análise Microbiológica de Alimentos. 7ed. São Paulo: Livraria Varela, 1997, 295p. (41) SUE, D.; FINK, D.; WIEDMANN, M.; BOOR, K. J. σ
B -Dependent gene induction
and expression in Listeria monocytogenes during osmotic and acid stress conditions simulating the intestinal environment. Microbiology, 150:3843-3855, 2004.
(42) VAN STELTEN, A.; SIMPSON, J.M.; WARD, T.J.; NIGHTINGALE, K.K.
Revelation by single-nucleotide polymorphism genotyping that mutations leading to a premature stop codon in inlA are common among Listeria monocytogenes isolates from ready-to-eat foods but not human listeriosis cases. Appl. Environ. Microbiol., 76: 2783–2790, 2010.
59
(43) WERBROUCK, H. GRIJSPEERDT, K.; BOTTELDOORN, N.; PAMEL, E.V.; RIJPENS, N.; DAMME, J.V.; UYTTENDAELE, M.; HERMAN, L.; COILLIE, E.V. Differential inlA and inlB Expression and Interaction with Human Intestinal and Liver Cells by Listeria monocytogenes Strains of Different Origins. Appl. Environ.
Microbiol., 72:3862-3871, 2006.
60
Tabela 1 – Primers utilizados na RT-PCR em tempo real para avaliação do nível de expressão da proteína InlA sob diferentes condições de crescimento de L. monocytogenes
Gene Sequências dos primers 5‟ - 3‟
Forward Reverse
inlA* GAACCAGCTAAGCCIGTAAAAG** CGCCIGTTTGGGCATCA***
tufA GCTGAAGCTGGCGACAACA CTTGACCACGTTGGATATCTTCAC
* Amplicon de 64pb; **TM: 50°C; *** TM :58°C
Tabela 2 – Correlação entre os métodos ELISA e RT-PCR para avaliação do nível
de expressão da proteína InlA sob diferentes condições de crescimento de L.
monocytogenes.
Meios Amostras Clínicas Amostras Não Clínicas
UVM -0,2 -0,7
LEB -0,6 0,4
FRA -0,6 0,3
TSB -0,1 0,7
LB 0,0 -0,4
BHI 0,1 0,2
61
29°C
37°C
29°C
37°C
29°C
37°C
29°C
37°C
29°C
37°C
29°C
37°C
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Clínica
Não-clinica
UVM
abc
BC
DA
BC
FRA LEB TSB LB BHI
AFG
cde
EFG
G
EFG
G
AB
DEF
AB
DEF
AB
DEF
AB
DEF
AB
CB
CD
CD
E
EFG
CD
E
FG
A
EFG
De
nsid
ad
e Ó
ptica
a 4
92
nm
Figura 1 – Análise da expressão de InlA em cepas clínica e não-clínica do
sorotipo 4b de L. monocytogenes em diferentes meios de enriquecimento seletivos e não-seletivos, a 29 e 37 ºC, por ELISA indireto. UVM: Listeria Enrichment - University of Vermont Medium; FRA: Fraser Broth; LEB: Listeria Enrichment Broth; TSB: Tryptic Soy Broth; LB: Luria-Bertani Broth; BHI: Brain Heart Infusion Broth. Os resultados são expressos como a média ± desvio padrão. Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre as médias.
62
29°C
37°C
29°C
37°C
29°C
37°C
29°C
37°C
29°C
37°C
29°C
37°C
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Ambiente
UVM FRA LEB TSB LB BHI
Clínica
Exp
ressã
o R
ela
tiva
de
In
lA
Figura 2 – Análise da expressão de InlA em cepas clínica e não-clínica do
sorotipo 4b de L. monocytogenes em diferentes meios de enriquecimento seletivos e não-seletivos, a 29 e 37 ºC, por RT-PCR em tempo real. UVM: Listeria Enrichment - University of Vermont Medium; FRA: Fraser Broth; LEB: Listeria Enrichment Broth; TSB: Tryptic Soy Broth; LB: Luria-Bertani Broth; BHI: Brain Heart Infusion Broth. Os resultados são expressos como a média ± desvio padrão.
Não-clínica
63
37°C
37°C
37°C
37°C
37°C
37°C
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Cepa Clínica
UVM FRA LEB TSB LB BHI
De
nsid
ad
e Ó
ptica
a 4
92
nm
37°C
37°C
37°C
37°C
37°C
37°C
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
UVM FRA LEB TSB LB BHI
Cepa Clínica
Exp
ressã
o R
ela
tiva
de
In
lA
Figura 3 – Análise da expressão de InlA em cepa clínica do sorotipo 4b de L.
monocytogenes em diferentes meios de enriquecimento seletivos e não-seletivos a 37 ºC (a) por ELISA indireto ou (b) por RT-PCR em tempo real. UVM: Listeria Enrichment - University of Vermont Medium; FRA: Fraser Broth; LEB: Listeria Enrichment Broth; TSB: Tryptic Soy Broth; LB: Luria-Bertani Broth; BHI: Brain Heart Infusion Broth.
a)
b)
64
37°C
37°C
37°C
37°C
37°C
37°C
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
Cepa Não-clinica
UVM FRA LEB TSB LB BHI
De
nsid
ad
e Ó
ptica
a 4
92
nm
37°C
37°C
37°C
37°C
37°C
37°C
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
UVM FRA LEB TSB LB BHI
Cepa Não-clínica
Exp
ressã
o R
ela
tiva
de
In
lA
Figura 4 – Análise da expressão de InlA em cepa não-clínica do sorotipo 4b
de L. monocytogenes em diferentes meios de enriquecimento seletivos e não-seletivos a 37 ºC (a) por ELISA indireto ou (b) por RT-PCR em tempo real. UVM: Listeria Enrichment - University of Vermont Medium; FRA: Fraser Broth; LEB: Listeria Enrichment Broth; TSB: Tryptic Soy Broth; LB: Luria-Bertani Broth; BHI: Brain Heart Infusion Broth.
a)
b)
65
CONCLUSÕES
- A expressão de InlA foi influenciada pela origem da cepa, pois a L.
monocytogenes cepa não-clínica apresentou maiores níveis de expressão de InlA do
que a cepa clínica;
- Com relação às condições de cultivo, observou-se que os meios interferem
diretamente na expressão do fator de virulência InlA e que não ocorreu diferença
significativa na expressão de InlA quando as cepas foram cultivadas a 29 e 37 °C;
- Os meios de enriquecimento mais indicados para uso em métodos de
detecção desse antígeno, independentemente da origem da cepa, são: FRA, TSB e
LEB; e os menos indicados: LB e UVM.
66
REFERÊNCIAS
ALESSANDRIA, V. Virulence gene expression in Listeria monocytogenes strains isolated from different sources. 14th Workshop on the Developments in the Italian PhD Research on Food Science Technology and Biotechnology - University of Sassari, 2009.
BIERNE, H.; SABET, C.; PERSONNIC, N., COSSART, P. Internalins: a complex
family of leucine-rich repeat-containing proteins in Listeria monocytogenes. Microbes and Infection n. 9, p.1156-1166, 2007.
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive for the quantification of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, v. 72, p.248-254, 1976.
BYUNA, S.K, JUNGA, S.C. & YOOB, H.S. Random amplification of polymorphic DNA
typing of Listeria monocytogenes isolated from meat. International Journal of Food Microbiology, v. 69, n.3, p.227-235, 2001.
CABANES, D.; DEHOUX, P.; DUSSURGET, O.; FRANGEUL, L.; COSSART, P.
Surface proteins and the pathogenic potential of Listeria monocytogenes. Trends in Microbiology, 10:5. p. 238-245, 2002.
CABRITA, P., CORREIA, S., FERREIRA-DIAS, S., BRITO, L. Genetic
characterization of Listeria monocytogenes food isolates and pathogenic potential within serovars 1/2a and 1/2b. System. Applied Microbiol. n. 27, p.454-461,
2004. CALLEJO, R.; PRIETO, M.; MARTÍNEZ, C.; AGUERRE, L.; ROCCA, F.; MARTÍNEZ,
G.; PALMIERI, O. Estudio mediante PCR múltiple de serotipos de Listeria monocytogenes aislados en Argentina. Revista Argentina de Microbiología, v.40, n.2, p. 89-92, 2008.
CEVENINI, R.; SAMBRI, V.; PILERI, S.; RATTI, G.; LA PLACA, M. Development of
transplantable ascites tumours which continuously produce polyclonal antibodies in pristane primed BALB/c mice immunized with bacterial antigens and complete Freund's adjuvant. Journal of Immunological Methods, v.140, n.1, p. 111-118, 1991.
CHASSEIGNAUX, E.; GERAULT, P.; TOQUIN, M.T.; SALVAT, G.; COLIN, P.;
ERMEL, G. Ecology of Listeria monocytogenes in the environment of raw poultry meat and raw pork meat processing plants. FEMS Microbiology Letters,
v. 210, n. 2, p.271-275, 2002. CHATURONGAKUL, S., & BOOR, K. J. RsbT and RsbV contribute to σB –Dependent
survival under environmental, energy, and intracellular stress conditions in Listeria monocytogenes. Applied and Environmental Microbiology. v. 70, n. 9. p. 5349–5356, 2004.
67
DONNELLY, C.W. Listeria monocytogenes: a continuing challenge. Nutrition Review, v. 59, n.6, p. 183–194, 2001.
FARBER, J. M.; PETERKIN, P. I. Listeria monocytogenes, a Food-Borne Pathogen.
Microbiological Reviews, v. 55, n. 3, p. 476–511, 1991.
GENG, T., HAHM, B.K. AND BHUNIA, A.K. Selective enrichment media affect the
antibody-based detection of stress-exposed Listeria monocytogenes due to differential expression of antibody-reactive antigens identified by protein sequencing. Journal of Food Protection, v. 69, n. 8 p. 1879–1886, 2006.
GRACIEUX, P.; ROCHE, S. M.; PARDON, P. ;VELGE, P. Hypovirulent Listeria
monocytogenes strains are less frequently recovered than virulent strains on PALCAM and Rapid' L. mono media. International Journal of Food Microbiology, v. 83, p. 133-145, 2003.
HAHM, B.K. BHUNIA, A.K. Effect of environmental stresses on antibody-based
detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella enterica serotype Enteritidis and Listeria monocytogenes. Journal of Applied Microbiology, v.100, n.5
p.1017–1027, 2006. HARLOW, E.; LANE, D. Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1988, 726 p.
HOBBS, B.C. & ROBERTS, S. Toxinfecções e controle higiênico-sanitário de
alimentos. São Paulo: Varela. 1998. 6ªed. 376p. HOLKO, I.; URBANOVA, J.; KANTIKOVA, M.; PASTOROVA, K.; KMET, V. PCR
detection in milk and milk products and differentiation of suspect isolates. Acta Veterinary Brno, v. 71, n. 1, p.125-131, 2002.
JACQUET, C.; DOUMITH, M.; GORDON, J.I.; MARTIN, P.M; COSSART, P.;
LECUIT, M. A molecular marker for evaluating the pathogenic potential of foodborne Listeria monocytogenes. Journal of Infectious Diseases, v.189, n.11, p. 2094-2100, 2004.
JARADAT, Z.W.; SCHUTZE, G.E.; BHUNIA, A.K. Genetic homogeneity among
Listeria monocytogenes strains from infected patients and meta products from two geographic locations determined by phenotyping, ribotyping and PCR analysis of virulence genes. International Journal of Food Microbiology, v. 76, n.1-2, p.1-10, 2001.
LAEMMLI, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature, v. 227, p. 680-685, 1970. LATHROP, A.A.; BANADA, P.P.; BHUNIA, A.K. Differential expression of InlB and
ActA in Listeria monocytogenes in selective and nonselective enrichment broths. Journal of Applied Microbiology, v.104, n.3, p.627–639, 2008.
68
LIANOU, A., STOPFORTH, J. D., YOON, Y., WIEDMANN, M., SOFOS, J. Growth and stress resistance variation in culture broth among Listeria monocytogenes strains of various serotypes and origins. Journal of Food Protection. v. 69, n. 11,
p. 2640-2647, 2006. LIVAK K.J., SCHMITTGEN T.D. Analysis of relative gene expression data using real-
time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods v.25, n.4, p.
402-408, 2001. MCGANN, P.; IVANEK, R.; WIEDMANN, M.; BOOR, K.J. Temperature-dependent
expression of Listeria monocytogenes internalin and internalin-like genes suggests functional diversity of these proteins among the Listeriae. Applied and Environmental Microbiology, v. 73, n. 9, p. 2806–2814, 2007.
MENDONÇA, M.; BUENO, F. M.; COUTINHO, M. L.; SENH, C.P.; CONCEIÇÃO, F.
R.; CERQUEIRA, G. M.; DELLAGOSTIN, O. A.; MOREIRA, A. N.; ALEIXO, J.A. G.; SILVA, W. P. Produção e caracterização de anticorpos monoclonais contra Internalina A de Listeria monocytogenes. In: XVI Congresso de Iniciação Científica e IX Encontro de Pós-Graduação, 2007, Pelotas. Anais do XVI Congresso de Iniciação Científica e IX Encontro de Pós-Graduação. Pelotas: Editora Universitária UFPel, 2007.
MENDONÇA, M.; CONRAD, N. L.; FRANÇA, R.C.; CONCEIÇÃO, F.R; MOREIRA,
A.N; SILVA, W.P; ALEIXO, J.A.G . Produção da proteína InlA de Listeria monocytogenes em Escherichia coli visando à obtenção de anticorpos monoclonais. In: XVII Congresso de Iniciação Científica e X Encontro de Pós-Graduação, 2008, Pelotas. Anais do XVII Congresso de Iniciação Científica e X Encontro de Pós-Graduação. Pelotas: Editora Universitária UFPel, 2008.
MILENBACHS, A.A., BROWN, D.P., MOORS, M. AND YOUNGMAN, P. Carbon
source regulation of virulence gene expression in Listeria monocytogenes. Molecular Microbiology, v.23, n. 5, p. 1075– 1085, 1998.
MILOHANIC, E., GLASER, P., COPPEE, J.-Y., FRANGEUL, L., VEGA, Y.,
VAZQUEZ-BOLAND, J.A., KUNST, F., COSSART, P. BUCHRIESER, C. Transcriptome analysis of Listeria monocytogenes identifies three groups of genes differently regulated by PrfA. Molecular Microbiology, v.47, n. 6, p. 1613–1625,
2003. MURRAY, P.R. et al. Listeria, Erysipelothrix e outros bacilos Gram-positivos. In:
Microbiologia Médica. 3ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2000. cap. 27, p. 181-184.
NANNAPANENI, R.; STORY, R.; BHUNIA, A. K..; JOHNSON, M.G. Reactivities of
Genus-Specific Monoclonal Antibody EM-6E11 against Listeria Species and Serotypes of Listeria monocytogenes Grown in Nonselective and Selective Enrichment Broth Media. Journal of Food Protection, v. 61, n. 9, p. 1195-1198,
1998.
69
NIGHTINGALE, K. K.; IVY, R. A.; HO, A. J.; FORTES, E. D.; NJAA, B. L.; PETERS, R. M.; WIEDMANN, M. inlA premature stop codons are common among Listeria monocytogenes isolated from foods and yield virulence-attenuated strains that confer protection against fully virulent strains. Applied and Environmental Microbiology, v. 74, n. 21, p. 6570–6583, 2008.
NORTON, D.M.; BATT, C.A. Detection of viable Listeria monocytogenes with a
5„nuclease PCR assay. Applied and Environmental Microbiology, v. 65, n. 5, p.2122-2127, 1999.
PFAFFL, M.W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-
PCR. Nucleic Acids Research 29:e45, 2001. DOI: 10.1093/nar/29.9.e45. POYART, C., TRIEU-CUOT, P.; BERCHE, P. The inlA gene required for cell invasion
is conserved and specific to Listeria monocytogenes. Microbiology, v.142, n.1,
p.173-180, 2003. SAMBROOK J., FRITSCH E. & MANIATIS T. Molecular cloning: A Laboratory
Manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001
SCHUBERT, W.D.; URBANKE, C.; ZIEHM T.; HEINZ D.W. Structure of internalin, a
major invasion protein of Listeria monocytogenes, in complex with Its Human Receptor E-Cadherin. Cell, v.111, n.13, p. 825–836, 2002.
SEELIGER, H.P.R.; JONES, D. Genus Listeria. In: SNEATH, P.H.A.; MAIR,
N.S.SHAPE, M.E. Bergey‟s Manual of Sistematic Bacteriology. 9 ed. Baltimore: Willians e Wilkins, 1996, v. 2, p. 1235-1245.
SILVA, N. da; JUNQUEIRA, V.C.A; SILVEIRA, N.F.A. Manual de Métodos de
Análise Microbiológica de Alimentos. 7ed. São Paulo: Livraria Varela, 1997, 295p.
SUE, D.; FINK, D.; WIEDMANN, M.; BOOR, K. J. σB -Dependent gene induction and
expression in Listeria monocytogenes during osmotic and acid stress conditions simulating the intestinal environment. Microbiology, v.150, n. 11, p.3843-3855,
2004.
VAN STELTEN, A.; SIMPSON, J.M.; WARD, T.J.; NIGHTINGALE, K.K. Revelation by single-nucleotide polymorphism genotyping that mutations leading to a premature stop codon in inlA are common among Listeria monocytogenes isolates from ready-to-eat foods but not human listeriosis cases. Applied and Environmental Microbiology, v.76, n. 9, p. 2783–2790, 2010.
WERBROUCK, H. GRIJSPEERDT, K.; BOTTELDOORN, N.; PAMEL, E.V.;
RIJPENS, N.; DAMME, J.V.; UYTTENDAELE, M.; HERMAN, L.; COILLIE, E.V. Differential inlA and inlB Expression and Interaction with Human Intestinal and Liver Cells by Listeria monocytogenes Strains of Different Origins. Applied and Environmental Microbiology. v. 72, n. 6, p.3862-3871, 2006.
