UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS · 2015. 4. 5. · Ao meu noivo Diego Fernandes Dornelas pela...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS

CAMPUS UNIVERSITÁRIO DE GURUPI

MESTRADO EM PRODUÇÃO VEGETAL

Aline Silvestre Pereira

Fungos associados e ação do imunossupressor ciclosporina A sobre formigas-

cortadeiras

GURUPI-TO

JANEIRO DE 2014

2




Aline Silvestre Pereira


cortadeiras

Dissertação apresentada a Universidade Federal do

Tocantins, como parte das exigências do Programa

de Pós-graduação em Produção Vegetal, para

obtenção do titulo de Mestre em Produção Vegetal

na área de concentração Fitossanidade.

.

Orientador: Prof. Dr. Renato de Almeida Sarmento

(Universidade Federal do Tocantins).

Co-Orientador: Prof. Dr. Danival José de Souza

(Universidade Federal do Tocantins).

GURUPI-TO

JANEIRO DE 2014

3





cortadeiras

Data da defesa: 29 de Janeiro de 2014

Banca Examinadora:

________________________________________

Prof. Dr. Renato de Almeida Sarmento

Universidade Federal do Tocantins (Orientador)

________________________________________

Prof. Dr. Danival José de Souza

Universidade Federal do Tocantins (Co-orientador)

________________________________________

Prof. Dr. Gil Rodrigues dos Santos

Universidade Federal do Tocantins (Examinador)

________________________________________

Prof. Dr. Marçal Pedro Neto

Universidade Federal do Tocantins (Examinador)

GURUPI-TO

JANEIRO DE 2014

4

A Deus pelo dom da vida e por estar presente em todos os momentos da minha vida me

dando sempre força para enfrentar qualquer dificuldade.

OFEREÇO

“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes

coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível.”

Charles Chaplin.

“Demore na dúvida. E descubra a sabedoria que insiste em se esconder na ausência de

palavras.”

Pe. Fábio de Melo.

5

Aos meus queridos pais Maria Elena da Silva Pereira e

Antônio Silvestre Pereira. Pelo amor e dedicação em

todos os momentos da minha vida.

DEDICO

Aos Professores Dr. Renato de Almeida

Sarmento e Dr. Danival José de Souza,

pelos ensinamentos, apoio, amizade e

incentivo durante o decorrer deste curso.

O MEU SINCERO RECONHECIMENTO

6

AGRADECIMENTOS

A Deus por ter me concedido a realização de mais um conquista na minha vida, por

iluminar o meu caminho e sempre estar presente em cada passo que dou.

Ao meu orientador Dr. Renato de Almeida Sarmento, pela orientação, o apoio e

incentivo, por tornar possível a realização desse trabalho, pela dedicação durante o

tempo de convivência, pela amizade e pelo exemplo de profissionalismo e ética.

Ao meu co-orientador Dr. Danival José de Souza, por quem tenho grande consideração e

admiração. Agradeço pela imensa dedicação nos ensinamentos, por ter se dedicado na

intensa tarefa de me ajudar em todo momento da dissertação, pelo apoio nas avaliações

dos experimentos e pela amizade.

Ao professor Gil Rodrigues Santos e André Rodrigues pela eficiência na identificação

dos fungos, pela boa vontade e competência.

Aos companheiros do Laboratório de Ecologia, pelo os momentos de alegria, pela

compreensão e pela ajuda: Althiéris Saraiva, Daniela Gonçalves, Laila Rezende, Renata

Vieira, Diogenis Fontenele, Marcos Carvalho, Emiliano Brandão, ao Bolsista PNPD Dr.

Marçal Pedro Neto; a doutoranda Marcela C.A.C. Silveira.

Aos meus pais Mariela Elena da Silva Pereira e Antônio Silvestre Pereira que tanto

amo. Pelo apoio, dedicação, confiança e amor constante. Sem os seus esforços e

dedicação, eu não teria conseguido alcançar os meus sonhos.

Aos meus irmãos Poliana Silvestre Pereira e Fabricio Silvestre Pereira, que sempre

estiveram ao meu lado e acreditaram na minha capacidade, dando muita força para

conquistar os meus objetivos.

Ao meu noivo Diego Fernandes Dornelas pela ajuda nos experimentos de campo, pelo

carinho, amor, compreensão e companheirismo.

À Universidade Federal do Tocantins pela minha formação acadêmica e pela

oportunidade de realização do curso de Mestrado e a todos os professores, pelos

ensinamentos.

Ao Programa de Pós-graduação em Produção Vegetal da UFT e a Capes, pela

oportunidade e suporte financeiro, possibilitando a realização deste estudo;

A todas as pessoas que de alguma forma, contribuíram para a realização deste estudo.

MUITO OBRIGADA!

7

SUMÁRIO

Resumo Geral.............................................................................................................12

Revisão Bibliográfica.....................................................................................................13

Formigas-cortadeiras.......................................................................................................13

Fundação e estabelecimento dos formigueiros................................................................15

Microrganismos associados às formigas-cortadeiras......................................................17

Sistema imune dos insetos...............................................................................................18

Controle das formigas-cortadeiras...................................................................................20

O fungo Beauveria bassiana...........................................................................................22

O fungo Metarhizium anisopliae.....................................................................................23

Referências Bibliográficas............................................................................................24

CAPÍTULO I

Fungos filamentosos associados às formigas-cortadeiras Atta sexdens e Atta

laevigata..........................................................................................................................33

Resumo...........................................................................................................................33

Abstract..........................................................................................................................34

Introdução......................................................................................................................34

Material e métodos........................................................................................................35

Área de estudo.................................................................................................................35

Coleta das operárias das colônias de Atta laevigata e Atta sexdens...............................36

Isolamento dos fungos....................................................................................................36

Identificação dos fungos.................................................................................................36

Infecção das operárias com os fungos Aspergillus flavus, Aspergillus niger e

Metarhizium sp.............................................................................................................37

Analise estatística............................................................................................................38

Resultados.......................................................................................................................38

Fungos associados às formigas-cortadeiras Atta sexdens e Atta laevigata.....................38

Sobrevivência das operárias Atta sexdens e Atta laevigata.............................................39

Discussão.........................................................................................................................39

Conclusões......................................................................................................................41

Lista de Tabelas e Figuras ...........................................................................................41

Referências Bibliográficas ...........................................................................................43

Apêndices....................................................................................................................46

8

CAPÍTULO II

Cyclosporine A enhances the activity of Metarhizium anisopliae in controlling the

leaf-cutting ant Atta sexdens………………………………………………………….53

Abstract………………………………………………………………………………..53

Introduction………………………………………………………………………...…54

Materials and Methods………………………………………………………….…....55

Maintenance of colonies…………………………………………………………….....55

Metarhizium anisopliae……………………………………………………………..….56

Immunosuppressor…………………………………………………..………………...56

Immunosuppression and infection of worker ants…………………………………....57

Hemocyte count…………………………………………………………………….…..57

Statistical analysis……………………………………………………………………...58

Results..……………………….……………………………………………………......58

Survival of A. sexdens worker ants………………………………………………........58

Hemocyte count……………………………………………………………………......59

Discussion…………………………………………………..………………………….59

Acknowledgments……………………………………………………….…………....62

References……..……………………………………………………….………….…..62

Figures and table……………………………………………………………………..64

Figure legends..........................................................................................................67

Table caption...........................................................................................................67

Capítulo II

O imunossupressor ciclosporina A (CsA; Sandimmun®) potencializa a ação do

fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae sobre operárias da formiga-

cortadeira Atta sexdens..................................................................................................68

Resumo...........................................................................................................................68

Introdução......................................................................................................................69

Material e métodos.......................................................................................................70

Manutenção de colônias..................................................................................................70

Metarhizium anisopliae...................................................................................................70

Imunossupressor..............................................................................................................71

Immunossupressão e infecção das operárias...................................................................71

Contagem dos Hemócitos...............................................................................................72

Análises estatísticas.........................................................................................................72

9

Resultados.......................................................................................................................72

Sobrevivência de operárias de Atta sexdens....................................................................72

Contagem dos hemócitos das formigas-cortadeiras Atta sexdens...................................73

Discussão........................................................................................................................73

Agradecimentos.............................................................................................................75

Referências bibliográficas.............................................................................................75

Figuras e tabelas............................................................................................................78

Lista de figuras e tabelas...............................................................................................80

Conclusões Gerais..........................................................................................................81

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO I

Tabela 1. Identificação de fungos associados às formigas-cortadeiras A. sexdens........42

Tabela 2. Identificação de fungos associados às formigas-cortadeiras A. laevigata......42

CAPÍTULO II

Table 1:P values for pairwise comparisons of the survival curves of distinct groups of

worker ants using the log-rank test………………………………………………..……66

CAPÍTULO II

Tabela 1. Valores P para a comparação 2 x 2 pelo teste de Log-Rank das curvas de

sobrevivência dos diferentes grupos de operárias...........................................................79

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO I

Fig. 1: Metarhiziumsp.,fungo isolado da Atta sexdens.............................................46

Fig. 2: Aspergillus flavus, fungo isolado da Atta sexdens.........................................46

Fig 3: Acromonium sp. 2, fungo isolado da Atta sexdens.........................................46

Fig. 4: Aspergilus sp. 1, fungo isolado da Atta sexdens............................................47

Fig. 5: Colletotrichum gloeosporioides, fungo isolado da Atta sexdens.....................47

Fig. 6: Acremonium sp. 1, fungo isolado da Atta sexdens.........................................47

Fig. 7: Mucor sp., fungo isolado da Atta laevigata...................................................48

Fig. 8: Aspergillus flavus, fungo isolado da Atta laevigata........................................48

10

Fig. 9: Fusarium solani, fungo isolado de Atta laevigata............................................48

Fig. 10: Aspergillus niger, fungo isolado de Atta laevigata.........................................49

Fig. 11: Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier de operárias de A. laevigata

submetidas aos tratamentos: linha azul, formigas que receberam o fungo Aspergillus

flavus; linha vermelha formigas que receberam água com solução de Tween-80

0,05%...........................................................................................................................49

Fig. 12: Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier de operárias de A. sexdens


flavus; linha vermelha formigas que receberam água com solução de Tween-80

0,05%..........................................................................................................................50



niger; linha vermelha formigas que receberam água com solução de Tween-80

0,05%..........................................................................................................................50


submetidas a os tratamentos: linha azul, formigas que receberam o fungo Aspergillus

niger; linha vermelha formigas que receberam água com solução de Tween-80

0,05%...........................................................................................................................51


submetidas aos tratamentos: linha azul, formigas que receberam o fungo Metarhizium

sp.; linha vermelha formigas que receberam água com solução de Tween-80

0,05%...........................................................................................................................51



sp.; linha vermelha formigas que receberam água com solução de Tween-80

0,05%...........................................................................................................................52

11

CAPÍTULO II

Fig. 1 - Kaplan–Meier survival curves of A. sexdens worker ants subjected to different

treatments. Blue lines and circles represent ants injected with cyclosporine A; red

squares and lines represent ants injected with the excipient, and black lines and triangles

represent ants injected with sterile distilled water. Dashed lines represent ants injected

with M. anisopliae, whereas solid lines represent ants injected with 0.05% Tween

80……………………………………………………………………………………….57

Fig. 2 - Mean total hemocyte count (n = 10) ± standard error for the three groups of A.

sexdens worker ants 24 h after treatment with sterile distilled water, the excipient, or

cyclosporine A. Columns with different letters indicate statistically different means by

the Tukey test at a significance level of 5%....................................................................58

CAPÍTULO II

Fig. 1 – Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier de operárias de A. sexdens

submetidas a diferentes tratamentos: linhas azuis e círculos, formigas tratadas

previamente o imunossupressor; linhas vermelhas e quadrados, formigas que receberam

o excipiente; linhas pretas e triângulos, formigas que receberam apenas água. As linhas

tracejadas representam as formigas que receberam o fungo M. anisopliae e as linhas

contínuas as formigas que receberam solução de Tween-80 0,05%...............................71

Fig. 2 – Contagem total de hemócitos média (n = 10 operárias) ± Erro padrão de três

grupos de operárias de A. sexdens: tratadas 24 h antes com água, excipiente ou o

imunossupressor. Barras com letras diferentes indicam médias estatisticamente

diferentes pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.........................................................71

12

RESUMO GERAL


cortadeiras

A demanda por controle biológico para as formigas-cortadeiras faz com que a utilização

de fungos entomopatogênicos seja considerado uma fonte alternativa de controle para o

uso em programas de Manejo Integrado de Pragas. Formigas dos gêneros Atta e

Acromyrmex são consideradas umas das principais pragas agrícolas. O conhecimento

dos fungos entomopatogênicos associados a elas é de grande importância para a

efetivação do controle microbiano, tendo em vista que esse método de controle causa

menos impacto ao meio ambiente. Diversos trabalhos da literatura científica têm

relatado que os fungos Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae são os

microrganismo mais utilizados por terem se destacado na eficiência do controle dessa

praga. Nesse contexto é importante estudar outros microrganismos que possivelmente

podem vim a ser fungo entomopatogênicos. No presente estudo foram isolados e

identificados, espécies de fungos associados às operárias de A. sexdens e A. laevigata,

com potencial para serem usados no controle biológico dessas pragas e também foi

estudar o efeito de uma substância imunossupressora, a ciclosporina A, sobre o sistema

imune de Atta sexdens e verificar se sua administração a torna mais vulnerabilidade ao

fungo M. anisopliae. Dentre os fungos isolados dos tecidos das operárias da A. sexdens,

ocorreu predomínio dos gêneros Metarhizium sp., Aspergillus flavus, Acromonium sp.1,

Aspergillus sp.1, Colletotrichum sp., Acremonium sp.2. Os fungos isolados da A.

laevigata foram Mucor sp., Aspergillus flavus, Fusarium solani, Aspergillus niger.

Sendo que destes o Aspergillus flavus, Aspergillus nigere Metarhizium sp. podem ser

considerados fungos entomopatogênicos para A. laevigata. O imunossupressor

ciclosporina provocou uma redução da resposta imune celular, verificada na redução

dos hemócitos circulando na hemolinfa. A imunossupressão da resposta celular pode ser

uma estratégia viável no controle de formigas-cortadeiras quando em combinação com

doses em baixas concentrações de fungos entomopatogênicos.

Palavras - chave: Controle biológico, hemócitos, fungos entomopatogênicos, Atta

sexdens, Atta laevigata.

13

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Formigas-cortadeiras

As formigas-cortadeiras, gêneros Atta e Acromyrmex, pertencem à tribo Attini,

são insetos eussociais que, dentre outras características, apresentam castas reprodutoras

e não reprodutoras e vivem em colônias permanentes. São insetos mastigadores e se

desenvolvem por holometabolia (ovo-larva-pupa-adulto) (Seraguzi e Maruyma, 2013).

O gênero Atta no Brasil possui dez espécies e três subespécies taxonômicas,

aceitas dentro do gênero Atta. Enquanto o gênero Acromyrmex é composto por vinte

espécies e nove subespécies (Della Lucia et al., 1993). No Brasil são consideradas

importantes, sob o ponto de vista econômico, somente cinco espécies de Attaque são A.

bisphaerica, A. capiguara, A. cephalotes, A. laevigata, A. sexdens piriventris, A.

sexdens rubropilosa, A. sexdenssexdens, A. vollenweiderie nove espécies de

Acromyrmexentre elas, Ac. aspersus, Ac. coronatus, Ac. heyeri, Ac. landolti balzani, Ac.

landolti fracticornis, Ac. landolti landolti, Ac. laticeps, Ac. niger, Ac. octospinosus, Ac.

rugosus, Ac. striatus, Ac. subterraneus molestans, Ac. subterraneus subterraneus,

(Zanettiet al., 2002).

Os gêneros Atta e Acromyrmex são conhecidos por formigas jardineiras,

formigas cultivadoras de fungos ou formigas-cortadeiras, uma vez que possuem a

capacidade de cultivar e se alimentar de fungos mutualistas, assim como as outras

espécies da tribo Attini (Weber, 1972).

A maioria dos fungos cultivados pelas formigas-cortadeiras pertence à família

Lepiotaceae (Basidiomycota: Agaricales), da tribo Leucocoprinae. Esta tribo é

composta por dois gêneros, Leucocoprinus e Leucoagaricus (Chapela et al., 1994).

Essa relação simbiótica mutualista entre as formigas-cortadeiras e seus fungos é

uma associação natural, baseada nas diferentes capacidades metabólicas

complementares (Diehl-Fleig e Valim-Labres, 1993). As formigas-cortadeiras levam

substratos orgânicos frescos, principalmente folhas, para o interior dos ninhos, que

servem como substrato para o desenvolvimento do fungo (De Fine Licht e Boomsma,

2010). Elas fazem a distribuição de enzimas proteolíticas, via fluidos fecais, nos seus

jardins (Mudd e Bateman, 1979); além de proverem um modo de dispersão para o fungo

(Hinkle et al., 1994; Mueller et al., 2001; Bot et al., 2002). Assim, estes fungos são

mantidos em um meio livre da competição com outros microrganismos.

14

Por outro lado o fungo cultivado é a única fonte de alimento para as larvas de

formigas e o principal item alimentar, embora algumas complementam sua dieta com

seiva vegetal (Barrer e Cherrett, 1972; Carreiro et al., 1997; Leal e Oliveira, 1998;

2000). Segundo Bass e Cherrett (1995) as operárias obtêm aproximadamente 90% de

suas necessidades nutricionais a partir da seiva das plantas.

Devido às formigas Atta e Acromyrmex cortarem parte frescas dos vegetais para

servir de substrato para o fungo simbionte, elas são consideradas pragas agrícolas e

florestais. Pois causam danos às florestas, pastagens, e várias culturas onde desfolham

as espécies vegetais, sendo responsável pelo impacto negativo na agricultura de vários

países (Fowler et al., 1990; Hölldobler e Wilson, 1990; Della Lucia e Fowler, 1993).

Nesse contexto as formigas-cortadeiras são avaliadas como umas das pragas de

maior importância econômica do mundo. Estas são consideradas as principais pragas da

Região Neotropical (Weber, 1972; Hölldobler e Wilson, 1990). Estão distribuídas nos

mais diversificados ecossistemas. No Brasil, as formigas-cortadeiras apresentam ampla

distribuição em todo território nacional, com intensa atividade durante todo ano,

atuando sobre muitas espécies vegetais (Cardoso, 2010).

No Brasil, os gêneros Atta e Acromyrmex são considerados as principais pragas

de plantios florestais, devido a ataques intensos e constantes às plantas em todas as fases

de desenvolvimento. Causam desfolha total, tanto de mudas como em plantas adultas,

no entanto, a idade das plantas influencia na vulnerabilidade aos prejuízos causados por

estas formigas. Na fase inicial do plantio, as perdas por esses insetos podem ser

irreversíveis, pela fragilidade das mudas (Della Lucia et al., 2011; Hölldobler e Wilson,

1990). Com o ataque desse inseto ocorre redução de produção das plantas, diminuição

da resistência, fazendo com que estas se tornem suscetíveis ao ataque de outros insetos e

doenças (Ferreira, 1989).

O gênero Atta, por serem de maior tamanho e com ninhos maiores, causam,

consequentemente, mais danos às plantações. No entanto, o gênero Acromyrmex

também podem provocar perdas consideráveis em plantações recentes e brotações,

sobretudo seus ninhos ocorrem em alta densidade (Anjos et al., 1998).

A espécie do gênero Atta com maior importância sob o ponto de vista

econômico no Brasil é Atta sexdens, por atacarem várias culturas florestais brasileiras.

Essa espécie tem uma ocorrência ampla no país, podendo ser considerada como a mais

comum, estando ausente somente na caatinga, em grande parte do Paraná, no litoral de

Santa Catarina e em parte do Nordeste e do Rio Grande do Sul (Della Lucia et al.,

15

2000).

A segunda espécie de saúva de importância econômica no Brasil é Atta

laevigata. De acordo com Della Lucia et al. (2000), sua ocorrência já foi registrada nos

estados do Amazonas, Paraíba, Pará, Tocantins, Ceará, Maranhão, Pernambuco,

Alagoas, Sergipe, Bahia, Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo, Goiás, Mato Grosso,

Mato Grosso do Sul e Rondônia.

Apesar das formigas-cortadeiras serem consideradas pragas de várias espécies

vegetais, estas podem também trazer benefícios ao ambiente, exercendo assim um

importante papel a nível ecossistêmico (Coutinho, 1984; Garretson et al., 1998), pois os

gêneros Atta e Acromyrmex ajudam no enriquecimento do solo, pela ciclagem de

nutrientes, devido às lixeiras das colônias e a transferência de nutrientes para as

camadas mais superficiais durante a construção e relocação dos ninhos, assim possuem

impactos positivos sobre a estrutura química e física do solo (Haines, 1975; Herz et al.,

1998; Farji-Brener e Ghermandi, 2008). Desse modo, elas beneficiam a vegetação,

favorecendo o seu crescimento, pois em áreas com ninhos, o solo é menos resistente à

penetração das raízes (Moutinho et al., 2003; Farji-Brener e Ghermandi, 2004). Todas

essas características tornam essas formigas-cortadeiras espécies chave dos ecossistemas

florestais e, portanto, excelentes organismos para avaliar respostas bióticas resultantes

de alterações ambientais (Della Lucia e Fowler, 1993; Perfecto e Vander Meer, 1993).

Fundação e estabelecimento dos formigueiros

As formigas-cortadeiras possuem ampla especialização na construção de ninhos,

no interior do qual são encontradas castas permanentes e temporárias. As fêmeas e os

machos alados pertencem às castas temporárias, os machos só aparecem na época do

voo nupcial e da fundação de novas colônias. Os machos alados não exercem nenhuma

função nos ninhos, eles apenas são alimentados pelas suas irmãs enquanto aguardam a

revoada, morrem após esse voo nupcial, por isso possuem um tempo de vida curto na

colônia. Após a cópula, as fêmeas aladas perdem suas asas e, são chamadas de rainhas,

pois elas desempenham a função de fundar novos ninhos e ovipositarem. As castas

permanentes são compostas pela rainha e inúmeras operárias ápteras que trabalham em

conjunto para a manutenção, crescimento e reprodução de suas colônias, e assim se

encarregam das diversas tarefas na colônia (Hölldobler e Wilson, 1990; 2011).

16

As formigas A. sexdens apresentam quatro subcastas de operárias, em que cada

uma desempenha um papel diferente dentro da colônia. A primeira subcasta

corresponde às jardineiras, cuja largura da cápsula cefálica é de 0,8-1,0 mm,

desempenham a função de cuidar do jardim de fungo, da prole e da rainha. A segunda

casta é composta pelas operárias generalistas, onde a largura da cápsula cefálica é de 1,4

mm e desempenham vários tipos de atividades, como fragmentação da vegetação antes

da incorporação no fungo, assistência à prole durante a ecdise, cuidados com a rainha e

descarte de lixo. A terceira casta é constituída das operárias forrageadoras, cuja largura

da cápsula cefálica é de 2,0-2,2 mm. Essas têm função de localização e de cortarem e

transportarem o material vegetal para o interior do formigueiro, além de escavarem as

câmaras e canais do ninho. A quarta casta é composta pelas operárias soldadas, que

possuem largura da cápsula cefálica de 3,0 mm, desempenham a função de defender a

colônia e podem auxiliar no corte de plantas (Wilson, 1980).

Segundo Hölldobler e Wilson (1990), para acontecer o voo nupcial, as fêmeas

aladas virgens saem do ninho de origem e são fecundadas por um ou mais machos

alados. Antes da revoada, a fêmea coleta um pedaço do fungo simbionte do ninho de

origem e armazena-o em sua cavidade infra-bucal. Logo após a inseminação, a rainha

desce ao solo e remove suas asas com o auxílio da musculatura do tórax e das pernas

medianas. Em seguida, procura o local mais apropriado para iniciar a construção do

novo ninho. As rainhas escavam seus ninhos a uma profundidade de 8,5 a 15 cm abaixo

da superfície do solo. Provavelmente, esta profundidade proporcionaria uma amplitude

térmica mínima e com uma temperatura quase constante, o que seria propício para o

desenvolvimento do fungo mutualista e da prole que ainda está por vir (Camargo,

2012).

O voo nupcial ocorre nas espécies do gênero Atta quando o formigueiro atinge

38 meses de idade, sendo que, após essa idade, essa revoada se repete uma vez por ano.

A partir do primeiro voo nupcial, o formigueiro já é considerado adulto (Autuori, 1941).

Para as espécies de A. sexdens e A. laevigata, a revoada ocorre durante o período da

tarde, entre os meses de setembro a novembro, quando ocorrem as primeiras chuvas que

rompem o período de estiagem. As fêmeas aladas de A. sexdens podem ser fecundadas

por até cinco machos (Fjerdingstad e Boomsma, 2000). As rainhas de Acromyrmex

octospinosus podem copular com dois a 10 machos (Boomsma et al., 1999). Porém, as

rainhas dos demais gêneros da tribo Attini são fecundadas por um único macho

(Murakami et al., 2000).

17

De acordo com Hughes et al. (2008), quando as rainhas copulam múltiplas

vezes, há uma diminuição no parentesco entre as operárias dentro da colônia e também

o aumento da diversidade genética, fatores que podem conferir maior resistência contra

doenças.

A longevidade máxima de uma operária das formigas-cortadeiras é de 120 dias e

390 dias para um soldado. A rainha do gênero Atta pode viver até 22 anos e a de

Acromyrmex até 10 anos (Seraguzi e Maruyma 2013).

A percentagem de sobrevivência das rainhas do gênero Atta durante os primeiros

15 meses após o voo nupcial é de apenas 0,05%. Dentre estes fatores, destaca-se a

predação por aves, sapos, lagartos, tatus, besouros como Canthon spp., inibição no

crescimento do fungo, chuvas fortes que podem inundar à colônia e assim afogar a

rainha, e o ataque de entomopatógenos ou antagonistas ao fungo simbionte e às rainhas

(Autuori, 1950; Fowler, 1992).

A erradicação definitiva das formigas-cortadeiras não é possível e nem

desejável, pois a cada ano há novas revoadas dos formigueiros ocasionando

reinfestações além do que as formigas são integrantes das cadeias e teias alimentares

(Casa, 2005).

Microrganismos associados às formigas-cortadeiras

Os jardins de fungos das formigas-cortadeiras estão sempre em contato com

diversos fungos filamentosos oriundos do material vegetal coletado pelas formigas e

adicionado no jardim dos fungos e do solo adjacente às colônias. Tais fungos são

conhecidos como “espécies daninhas”, pois alguns deles são capazes de se estabelecer e

atuarem como antagonistas do fungo simbionte (Rodrigues et al., 2008). Fungos dos

gêneros Cunninghamella, Fusarium e Trichoderma, presentes no solo, podem inibir o

crescimento do fungo simbionte in vitro (Silva et al., 2006).

Espécies dos gêneros Aspergillus e Fusarium são frequentemente encontradas

em solos tropicais ou subtropicais, onde atuam principalmente como decompositores

(Domsch et al., 1980). No entanto, algumas espécies como Aspergillus flavus e

Fusarium oxysporum, têm sido também isoladas de operárias vivas (Hughes e

Boomsma, 2004) ou moribundas (Rodrigues et al., 2005), do depósito de lixo (Hughes

et al., 2004a) e mesmo no jardim de fungo de formigas-cortadeiras (Rodrigues et al.,

2005).

18

O solo é um ambiente muito rico em microrganismos, os quais exercem

influências cruciais à sua diversidade biológica, assim, as rainhas podem se contaminar

com patógenos durante o processo de fundação de novas colônias no solo, sendo essa

fase a mais vulnerável do ciclo de vida de uma colônia (Ingham et al., 2000). Augustin

(2007) verificou que das 107 fundadoras de A. sexdens em início de processo de

fundação colonial em laboratório, 11,21% morreram durante este período, exibindo

sobre sua cutícula uma massa pulverulenta de conídios esbranquiçados, típica de

infecção por fungos do gênero Beauveria bassiana.

Os gêneros Atta e Acromyrmex apresentam estratégias para evitar a

contaminação da colônia com os microrganismos. Dentre essas estratégias, está o

comportamento de higiene que é uma prática muito frequente entre insetos sociais.

Nesse contexto, a limpeza (allogrooming) corresponde à remoção de partículas da

superfície do corpo de uma companheira ou o “autogrooming”, que é a sua auto limpeza

e a evitação de indivíduos infectados, assim, esses comportamentos de higiene, pode

prevenir infecções causadas por parasitas nesses insetos (Schmid-Hempel, 1998;

Bextine e Thorvilson 2002; Oi e Pereira, 1993).

Sistema imune dos insetos

Os insetos sofrem constantemente injúrias na parede do exoesqueleto, assim

ficam expostos ao ataque de inúmeros inimigos naturais, muitos dos quais são

patogênicos. Para sobreviver a esses ataques, os insetos desenvolveram um eficiente

sistema de defesa. A primeira barreira da defesa dos insetos é constituída pelo

tegumento, o sistema respiratório, composto pelos espiráculos e as traquéias, e o trato

digestivo, incluindo a membrana peritrófica e o epitélio (Dunn, 1986). A estrutura e a

composição química da cutícula representam as principais barreiras. Somente alguns

fungos e nematoides conseguem quebrar essa barreira. Na passagem da cutícula para a

hemocele (cavidade do corpo), esses microorganismos encontram vários componentes

antimicrobianos, como proteínas, lipídios, hidrocarbonetos, difenóis, carboidratos e

melanina, os quais inibem o crescimento e a penetração na hemocele (Dunn, 1986).

O sistema imune dos insetos não possui uma memória imunológica, não produz

linfócitos e nem sintetiza imunoglobinas (anticorpos) que são células e proteínas

especializadas da imunidade adquirida ou específica dos vertebrados (Rolff e Siva-

Jothy, 2003). Os insetos apresentam uma imunidade natural de defesa constituída de

19

uma série de mecanismos, tais como reações de reconhecimento, aglutinação, ativação

de enzimas proteolíticas, que leva à coagulação da hemolinfa e a produção de melanina,

reações celulares, e à síntese de peptídeos antimicrobianos e inibidores de proteases

(Wheeler et al., 1993; Soderhall e Cerenius, 1998; Wilson et al., 1999).

O sistema imune natural dos insetos é comumente dividido em dois tipos: as

defesas celulares e as respostas humorais. A resposta humoral resulta principalmente da

ação de proteínas que estão presentes ou são produzidas, sendo em geral associadas à

infecção de microrganismos. Entre as moléculas mais importantes do sistema humoral,

estão os peptídeos antimicrobianos, produzidos por diversos tecidos e normalmente

detectados na hemolinfa algumas horas após a infecção. Os insetos também liberam

oxigênio citotóxico e reativo, assim como várias outras moléculas de defesa, como

lisozimas (Hoffman 2003; Garcia et al., 2004; Büyükgüzel et al., 2007; Lopes 2008).

As reações celulares ocorrem na hemolinfa quando os hemócitos circulantes

entram em contato com o corpo estranho desencadeando o processo de fagocitose,

agregação, nodulação ou encapsulação (Gillespie et al., 1997, Lavine e Strand 2002).

Elas ocorrem em combinação com as defesas humorais (Dunn, 1986). Na hemocele

existem vários tipos de hemócitos, mas os granulócitos, os plasmócitos e os

coagulócitos são os que participam das defesas celulares e humorais na maioria dos

insetos. Os hemócitos também participam da eliminação de toxinas e de tecidos

anormais ou mortos.

Os hemócitos estão presentes na hemolinfa, com a entrada do patógeno no

exoesqueleto do inseto, os hemócitos vão para o local da infecção, logo após ocorre a

fagocitose e assim acabam com a infecção e os invasores (Silva et al., 2000; Russo et

al., 2001). Quando têm uma grande quantidade de patógenos na hemolinfa, os

hemocitos não fagocitam, estes formam nódulos para assim removerem os patógenos da

hemolinfa. E se os insetos são infectados por endoparasitóides, e estes depositam ovos e

larvas na hemocele, os insetos não fagocitam e nem os isolam em nódulos, eles se

defendem formando cápsulas (Strand e Pech, 1995).

Geralmente os granulócitos são os primeiros hemócitos que chegam ao local de

infecção. Após detectar a presença do parasitoide, essas células se agregam e

rapidamente liberam uma substância granular na hemolinfa, que atrai os plasmócitos.

Em seguida, os plasmócitos formam uma camada de células, que endurece por um

período de várias horas. Normalmente, a formação de capsulas é acompanhada pela

produção de melanina, moléculas citotóxicas intermediárias (quinonas) são produzidas e

20

inativam ou matam grande parte dos microrganismos (Silva et al., 2000). Existem

muitos fatores que atuam modulando a resposta imune do inseto como sexo, idade,

disponibilidade de recursos e interferência de parasitas (Schmid-Hempel 2003). Alguns

comportamentos ilustram um aspecto intrigante, pois alguns fatores estressantes como o

nutricional, em certas doses, aumentam a resposta imune do inseto em vez de diminuí-

la. Inseticidas podem interagir com o sistema imune dos insetos e seus efeitos são

variáveis, ora aumentando a capacidade de desencadear uma resposta imune, ora

diminuindo-a (Desneux et al., 2007). Essa variação da resposta imune dos insetos

esclarece a sua complexidade e a necessidade de maiores estudos para compreendê-la.

Dentre as substâncias químicas que afetam negativamente o sistema imune de

insetos, conhecem-se, os efeitos imunossupressores da actinomicina D, da

ciclohexamida, da hidrocortisona, da azadiractina e a Ciclosporina A (Kaaya et al.

1987; Azambuja et al. 1991; Jarosz 1993; 1994).

A ciclosporina A (CsA) tem sido utilizada desde 1980 como um

imunossupressor (Kunz e Hall, 1993). Ciclosporinas são peptídeos cíclicos,

hidrofóbicos, produzidos por várias espécies de fungos dos gêneros Beauveria (Bals.)

Vuill., Verticilium Nees e Tolyplocadium W. Gams. Também, a CsA tornou-se uma das

mais importantes drogas médicas, usada para suprimir a rejeição de órgãos

transplantados (Winkler 2000).

A atividade inseticida da ciclosporina A foi descrita pela primeira vez

por Weiser e Matha (1988), em larvas de mosquito. Após intoxicação de larvas de Culex

pipiens, alterações histopatológicas em todos os tecidos, caracterizada pela formação de

mitocôndrias e vacúolos inchados do retículo endoplasmático era evidente (Weiser et

al.,1989). Experimentos com o imunossupressor CsA mostraram que esta substância foi

capaz de reduzir a resistência de larvas do lepidóptero Galleria mellonella (Linnaeus)

(Lepidoptera: Pyralidae) a uma bactéria patogênica (Fiolka, 2008).

O estudo das respostas imunológicas que estão presentes na hemolinfa e na

cutícula dos insetos pode fornecer informações fundamentais para o delineamento de

novas formas de controle biológico.

Controle das formigas-cortadeiras

As formigas-cortadeiras estão incluídas entre os principais insetos-praga de

cultivos no Brasil, pois causam desfolhas em várias espécies vegetais (Cruz et al.,

1996).

http://translate.googleusercontent.com/translate_f#6




21

Os gêneros Atta e Acromyrmex possuem várias características biológicas e

comportamentais complexas que dificultam o seu controle, tais como arquitetura,

tamanho e localização dos ninhos, sistema de proteção à rainha, produção de

substâncias anti-microbianas e “grooming” (Marinho et al., 2006).

Dentre os métodos de controle das formigas-cortadeiras, o controle químico é o

mais utilizado e pode ser efetivado de diferentes formas e com diferentes produtos

(Barata, 2009). No entanto, esses produtos fitossanitários químicos além de serem caros,

comumente não são efetivos, pois levam ao superficial extermínio da colônia de

formigas ou a mudanças de seu sauveiro, e conduzem à seleção de populações cada vez

mais resistentes, causam também graves danos ao ambiente e à saúde humana, por

serem produtos altamente tóxicos (Silva e Diehl-Fleig, 1988; Diehl-Fleig et al., 1988,

1993).

Os métodos de controle químico de formigas-cortadeiras evoluíram com o

tempo e uma das principais preocupações sempre foi conciliar a eficiência, economia e

segurança. Dentre os métodos de controle químico estão a termonebulizacão (Couto et

al., 1978; Rizental et al., 2003; Mendonca et al., 2003), o pó seco e as iscas granuladas.

As iscas granuladas consistem no método mais utilizado pelas empresas de

reflorestamento de todo o país, por proporcionarem menor custo de combate e ser de

mais facilidade de aplicação que outros métodos de controle (Zanetti et al., 2003).

Porém as iscas tóxicas apresentam aspectos desfavoráveis como a deterioração

do meio ambiente, eliminação de inimigos naturais e proporciona uma resistência às

formigas-cortadeiras. Em função desses aspectos, existe a necessidade de se utilizar

outros métodos de controle como alternativa, para se ter produtos mais específicos e que

degradem menos o meio ambiente.

De acordo com Della Lucia et al. (1993), há várias outras táticas de controle

disponíveis para o manejo integrado de populações de formigas-cortadeiras. Uma dessas

táticas é o controle biológico. Este método visa à redução da população de uma praga a

um nível em que esta não cause prejuízos econômicos e ambientais, assegurando a

manutenção dos organismos controladores, causando assim um equilíbrio entre os

organismos (Silva, 2007). O controle biológico natural, através de predadores,

parasitoides e microrganismos patogênicos são um importante fator de regulação das

populações de insetos.

Alguns estudos têm sido desenvolvidos com o objetivo de se obter métodos

alternativos de controle para o uso em programas de Manejo Integrado de Pragas. O

22

controle biológico através da utilização de fungos entomopatogênicos pode ser utilizado

como um método alternativo, oferecendo um controle mais efetivo, específico,

econômico e duradouro das formigas-cortadeiras (Silva e Diehl-Fleig, 1988).

Os fungos são os patógenos que possuem o maior número de espécies e

linhagens, cerca de 1000 espécies atacam insetos e foram os primeiros a serem

utilizados no controle biológico, sendo que 80% das doenças de insetos são fúngicas

(Parra et al., 2002). Os principais gêneros são Metarhizium, Beauveria, Nomurea,

Aschersonia e Entomophtora, sendo que os dois primeiros gêneros possuem cerca de

1000 linhagens cada e atacam insetos aquáticos, terrestres e subterrâneos. Assim,

essesfungos são bastante estudados como agente de controle biológico de muitos insetos

pragas (Hughes et al., 2004a).

De acordo com Alves (1998); Azevedo (1998) e Tiago e Furlaneto (2003), o

processo de infecção de insetos por fungos entomapatogênicos pode ser descrito,

resumidamente se iniciando pelo contato dos conídios do fungo com a cutícula do

inseto. Posteriormente, ocorre a germinação dando origem ao tubo germinativo e os

apressórios, os quais possuem capacidade de penetrar a cutícula do inseto por meio de

pressão mecânica e química ou por meio de enzimas capazes de degradar os

componentes da cutícula. Atingindo a hemolinfa, o fungo se nutre e produz toxinas que

afetam as células do hospedeiro levando-o à morte.

A ação dos fungos entomopatogênicos sobre formigas-cortadeiras tem sido

estudada e comprovada por diversos autores (Machado et al. 1988; Diehl-Fleig et al.,

1992; Jaccoud et al., 1999; Lopez e Orduz, 2003; Hughes e Boomsma, 2004; Hughes et

al., 2004b; Busarello, 2008; Castilho et al., 2010).

O fungo Beauveria basiana

O gênero Beauveria pertence à classe mitospóricose é parasita de um grande

número de Artrópodes, incluindo mais de 200 espécies de insetos, ácaros e carrapatos

(Alves, 1998). Além disto, um estudo recente mostra que Beauveria bassiana não

possui especificidade quanto ao hospedeiro, mas atua como entomopatógeno generalista

de insetos (Meyling et al., 2009).

Beauveria bassiana é de ocorrência generalizada em todos os países, sendo a

mais freqüente sobre os insetos em amostras de solo. A infecção por esse fungo ocorre

geralmente por via tegumento, também pode haver a infecção oral para alguns insetos

23

como é o caso das formigas lavapés Solenopsis spp., sendo também possível a

penetração via sistema respiratório pelo espiráculo (Alves, 1998).

Segundo Alves (1986), de modo geral, a germinação dos conídios de B. bassiana

ocorre num período de 12 horas após a inoculação. O fungo penetra, freqüentemente via

tegumento, devido a uma ação mecânica e efeitos enzimáticos, o que leva cerca de 12

horas. A total colonização ocorre 72 horas após a inoculação. As condições favoráveis

para o desenvolvimento do fungo é umidade relativa de 90%, temperatura entre 23 a

28ºC, podendo variar de acordo com a espécie do inseto. No Brasil, o patógeno ocorre

em condições naturais, enzooticamente ou provocando epizootias em algumas espécies

de insetos pragas.

O fungo pode ocorrer como epibionte e endófito de plantas (Cherry et al.,

1999).Seus conídios são capazes de sobreviverem no solo de ambiente natural ou

agrícola (Meyling et al., 2009). Os hospedeiros atacados apresentam-se cobertos por

uma massa pulverulenta branca, o que confere o nome muscardine branca à doença

provocada por B. bassiana (Augustin, 2011).

O fungo Metarhizium anisopliae

O fungo mitospórico Metarhizium pertence à família Clavicipitaceae Clado A

dos Hypocreales (Sung et al., 2007) é considerado entomopatógeno facultativo, uma

vez que é facilmente isolado dos solos, que é capaz de sobreviver por longos períodos

(St. Leger, 2008). O fungo Metarhizium anisopliae é considerado um dos mais

importantes parasitas de insetos, possivelmente ocorrem naturalmente em mais de 300

espécies de hospedeiros de diferentes ordens, principalmente Coleoptera (Domsch et al.,

1980).

A espécie mais importante nas condições do Brasil é a anisopliae. Esta apresenta

uma grande variabilidade genética e atacam uma grande diversidade de insetos (Alves,

1986). Augustin (2011), afirma que M. anisopliae pode ser reconhecido pelos

anamórfos cilíndricos, uninucleados, fracamente coloridos, e por suas colônias em tons

de verde. Podendo variar do claro ao escuro ou esbranquiçadas com pontos verdes,

formando uma camada pulverulenta cobrindo o inseto morto. Assim a sua doença é

denominada de muscardine verde.

24

Referências Bibliográficas

ALVES S.B. 1986. Controle microbiano de insetos. São Paulo, Manole, 407 p.

ALVES, S. B. Controle microbiano de insetos. 2. Ed. Piracicaba: Biblioteca de Ciência

Agrária Luiz de Queiroz, p. 424, 1998.

ANJOS, N.; DELLA LUCIA, T. M. C; MAYHÉ-NUNES, A. J. Guia práticosobre

formigas cortadeiras em reflorestamentos. Ponte Nova - MG, p. 100, 1998.

AUGUSTIN, J. O. Sociometria e comportamento de rainhas de saúva (Atta sexdens

Linnaeus, 1758) (Hymenoptera: Formicidae) mantidas em laboratório. 2007. 75 f.

Dissertação (Mestrado em Biologia e Comportamento Animal), Instituto de Ciências

Biológicas – Universidade Federal de Juiz de Fora, 2007.

AUGUSTIN, J. O.; SANTOS, J. F. L.; ELLIOT, S. L. A behavioral repertoire of Atta

sexdens (Hymenoptera, Formicidae) queens during the claustral founding and

ergonomic stages. Insectes Sociaux, Paris, v. 58, p. 197–206, 2011.

AUTUORI, M. Contribuição para o conhecimento da saúva (Atta spp. – Hymenoptera -

Formicidae). I – Evolução do sauveiro (Atta sexdens rubropilosa, Forel, 1908).

Arquivos do Instituto Biológico, v. 12, p. 197-228, 1941.

AUTUORI, M. Contribuição para o conhecimento da saúva (Atta spp. Hymenoptera:

Formicidae). Número de formas aladas e redução dos sauveiros iniciais. Arquivos do

Instituto Biológico, v. 19, p. 325-331, 1950.

AZAMBUJA, P.; GARCIA, E.S.; RATCLIFFE, N.A.; WARTHEN JR, J. D.

Immunedepression in Rhodnius prolixus induced by the growth inhibitor, azadirachtin.

Journalof Insect Physiology, v. 37, p. 771-777. 1991.

AZEVEDO, J. L. Controle microbiano de insetos-pragas e seu melhoramento genético.

In: Melo, I. S.; Azevedo, J. L. Controle Biológico. Jaguariúna: EMBRAPA. v.1, p.69-

96, 1998.

BARATA, G. Avanços no conhecimento não impedem dificuldades no controle das

cortadeiras. Ciência e Cultura, v. 61, n. 3, 2009. Disponível em:

<http://cienciaecultura.bvs.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S00096725200900030

0003&lng=en&nrm=iso>.Acesso em: 30 setembro, 2013.

BARRER. P. M.; CHERRETT, J. M. Some factors affecting the site and pattern of leaf-

cutting in the ant Atta cephalotes L. Journal of Entomology, v. 47, p.15-27, 1972.

BASS, M.; CHERRETT, J. M. Fungal hyphae as a source of nutrients for the leaf-

cutting ant Atta sexdens. Physiological Entomology, v. 20, p. 1-6, 1995.

BEXTINE, B. R.; THORVILSON, H. G. Field applications of bait-formulated

Beauveria bassiana alginate pellets for biological control of the red imported fire ant

(Hymenoptera: Formicidae). Environmental Entomology, v. 31, p. 746-752. 2002

25

BOOMSMA, J. J.; FJERDINGSTAD, E. J.; FRYDENBERG, J. Multiple paternity,

relatedness and genetic diversily in Acromyrmex leaf-cutter ants. Proceedings of the

Royal Society of London B, v. 266, p. 249-254, 1999.

BOT, A. N. M., ORTIUS-LECHNER, D., FINSTER, K., MAILE, R.; BOOMSMA, J.

J. Variable sensitivity of fungi and bacteria to compounds produced by the metapleural

glands of leaf-cutting ants. Insectes Sociaux, v.49, p.363-370, 2002.

BUSARELLO, G. D. Patogenicidade de Beauveria bassiana (Bals) Vuil e

Metarhizium anisopliae (Metsch) Sorokin para o controle de Atta sexdens

rubropilosa Forel (1908) (Hymenoptera: Formicidae) em condições de laboratório.

2008. 69 f. Dissertação (Mestrado em Entomologia e Conservação da Biodiversidade)-

Universidade Federal da Grande Dourados, Dourados, 2008.

BÜYÜKGÜZEL, E.; TUNAZ, H.; STANLEY, D.; BÜYÜKGÜZEL, K. Eicosanoids

mediate Galleria mellonella cellular immune response to viral infection. JournalInsect

Physiol, v. 53, p. 99-105, 2007.

CAMARGO, R. S.; FUJIHARA, R. T.; FORTI, L. C. Nest Digging by Leaf-Cutting

Ants: Effect of Group Size and Functional Structures. Psyche, p. 1-4, 2012.

CARDOSO, S.R.S. Morfogênese de ninhos iniciais, mortalidade de Atta spp.

(Hymenoptera, Formicidae) em condições naturais e avaliação da ação de fungos

entomopatogênicos. Ph.D. Thesis, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, p. 149p,

2010.

CARREIRO, S. C.; PAGNOCCA, F. C.; BUENO, O. C.; BACCI Jr, M.; HEBLING, M.

J. A.; SILVA, O. A. Yeasts associated with nests of the leaf-cutting ant Atta sexdens

rubropilosa. Antonie van leeuwenhoek, v. 71, nº. 3, p. 243-248, 1997.

CASA, J. Manejo ecológico de pragas e doenças em vimeiros. 2005. 61p. Dissertação

(Mestrado em Produção Vegetal) – Curso em Pós-graduação em Ciências Agrárias.

Universidade do Estado de Santa Catarina, Lages. 2005.

CASTILHO, A. M. C.; FRAGA, M. E.; AGUIAR-MENEZES, E. L.; ROSA, C. A. R.

Seleção de isolados de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana patogênicos a

soldados de Atta bisphaerica e Atta sexdens rubropilosa em condições de laboratório.

Ciência Rural, Santa Maria, v. 40, n. 6, p. 1243-1249, 2010.

CHAPELA, I. H.; REHNER, S. A.; SCHULTZ, T. R.; MUELLER, U. G. Evolutionary

history of the symbiosis between fungus-growing ants and their fungi. Science, v. 266,

p. 1691-1695, 1994.

CHERRY, A. J.; LOMER, C. J.; DJEGUI, D.; SCHULTHESS, F. Pathogen incidence

and their potential as microbial control agents in IPM of maize stem borers in West

Africa. Biocontrol, v. 44, nº. 3, p. 301-327, 1999.

26

COUTINHO, L. M. Aspectos ecológicos da saúva no cerrado – a saúva, as queimadas e

sua possível relação na ciclagem de nutriente minerais. Boletim de Zoologia, v.8, p.1-9,

1984.

COUTO, L.; ZANUNCIO, J. C.; ALVES, J. E. M.; CAMPINHOS, E.; SORESINI, L.;

VARGAS, J. A. Avaliação da eficiência e custo do controle de Atta sexdens rubropilosa

através do sistema termo-nebulizador, na região de Aracruz, ES. Revista Árvore,

Viçosa, v. 2, n. 2, p. 8-16, 1978.

CRUZ, A. P.; ZANUNCIO, J. C.; ZANETTI, R. Eficiência de iscas formicidas à base

de sulfluramida e de clorpirifós no controle de Atta sexdens sexdens(Hymenoptera,

Formicidae), no trópico úmido. Acta Amazônica, v. 26, p. 145-150, 1996.

DE FINE LICHT, H. H.; BOOMSMA, J. J. Forage collection, substrate preparation,

and diet composition in fungus-growing ants. Ecological Entomology, v. 35, p. 259–

269, 2010.

DELLA LUCIA, T. M. C.; FOWLER, H. G. As formigas cortadeiras. In: DELLA

LUCIA, T. M. C. As formigas cortadeiras. Viçosa: Editora Folha de Viçosa, p. 1-3,

1993.

DELLA LUCIA, T. M. C.; VILELA, E. F.; ANJOS, N.; MOREIRA, D. D. O. Criação

de formigas cortadeiras em laboratório. In: Della Lucia, T. M. C.(Ed). Formigas

Cortadeiras. Folha de Viçosa. Viçosa, MG. Brasil, p. 151-162, 1993.

DELLA LUCIA, T. M. C.; ANJOS, N.; ZANUNCIO, J. C. Controle de formigas

cortadeiras. Viçosa, MG: CTP, p. 52, 2000.

DESNEUX, N., DECOURTYE, A.; DELPUECH, J. M.The sublethal effects of

pesticideson beneficial arthropods. Annual Review of Entomology, v.52, p. 82-106,

2007.

DIEHL-FLEIG, E.; SILVA, M. E.; VALIM-LABRES, M. E.; SPECHT, A. Ocorrência

natural de Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. No Rio Grande do sul. Acta Biologica

Leopoldensia, v. 14, p. 99-104, 1992.

DIEHL-FLEIG, E.; VALIM-LABRES, M. E. Fungi isolated from leaf-cutting ants Atta

sexdens piriventris and Acromyrmex heyeri (Hymenoptera-Formicidae): Mucor spp.

effects on Beauveria bassiana entomopathogen. Journal of the Brazilian Association

for the Advancement of Science, v.45, p. 142-144, 1993.

DIEHL-FLEIG, E.; SILVA, M. E.; PACHECO, M. R. M. Testes de patogenicidade dos

fungos entomopatogêncios Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae em Atta

sexdens piriventris (Santschi, 1919) em diferentes temperaturas. Ciência e Cultura,

São Paulo, v. 40, n. 11, p. 1103-1105, 1988.

DIEHL-FLEIG, E.; SILVA, M. E.; SPECHT, A.; LABRES, M. E. V. Efficiency of

Beauveria bassiana for Acromyrmex spp. Control (Hymenoptera: Formicidae). Anais

da Sociedade Entomológica do Brasil, v. 22, nº. 2, p. 281-285, 1993.

27

DOMSCH, K. H.; GAMS, W.; ANDERSON, T-H. Compendium of soil fungi.London:

Academic Press, v. 1 e 2, p. 859, 1980.

DUNN, P. E. Biochemical aspects of insect immunity. Annual. Review of Entomology,

v. 31, p. 321-339, 1986.

FARJI-BRENER, A. G.; GHERMANDI, L. Seedling recruitment in a semi-arid

Patagonian steppe: Facilitative effects of refuse dumps of leaf-cutting ants. Journal of

Vegetation Science, v. 15, nº.6, p. 823-830, 2004.

FARJI-BRENER, A. G.; GHERMANDI, L. Leaf-cutting ant nests near roads increase

fitness of exotic plant species in natural protected areas. Proceedings of the Royal

Society of London B, v. 275, p. 1431–1440, 2008.

FIOLKA, M. J. Immunosuppressive effect of cyclosporin A on insect humoral

immune response. Journal of Invertebrate Pathology, v. 98, p.287-292, 2008.

FJERDINGSTAD, E. J.; BOOMSMA, J. J. Queen mating frequency and relatedness in

young Atta sexdens colonies. Insectes Sociaux, Paris, v. 47, p. 354-356, 2000.

FOWLER, H. G.; BERNARDI, S. V. E.; DELABIE, J. H. C.; FORTI, L. C.; V. P.

SILVA, V. P. Major ant problems of South America, p. 3-14. In: R. K. Vandermeer, K.

Jaffé & A. Cedeño (Eds.). Applied Myrmecology: a world perspective. Boulde,

Westview Press, p.741, 1990.

FOWLER, H. G. Patterns of colonization and incipient nest survival in Acromyrmex

nigerand Acromyrmex balzani (Hymenoptera: Formicidae). Insectes Sociaux, Paris, v.

39, p. 347-350, 1992.

GARCIA, E. S., MACHADO, E. M. M.; AZAMBUJA, P. Effects of eicosanoid

biosynthesis inhibitors on the prophenoloxidase-activating system and microaggregation

reactions in the hemolymph of Rhodnius prolixus infected with Trypanosoma rangeli.

JournalInsect Physiol. V.50, p. 157-165, 2004.

GARRETTSON, M., STETZEL, J. F., HALPERN, B. S., HEARN, D. J., LUCEY, B.

T.; MCKONE, M. J. Diversity and abundance of understorey plants on active and

abandoned nests of leaf-cutting ants (Atta cephalotes) in a Costa Rican rain forest.

Journal of Tropical Ecology, v.14, p. 17-26, 1998.

GILLESPIE, J.A., KANOST, M. R.; TRENZCEK, T. Biological mediators of insect

immunity. Annu Rev. Entomol, v 47, p. 611-643, 1997.

HAINES, B. Impact of leaf-cutting ants on vegetation development at Barro Colorado

Island. In: Tropical Ecological Systems (ed. F. G. Golley & E. Medina), p. 99-111,

1975.

HERZ, H., WIRTH, R., HÖLLDOBLER, B.; BEYSCHLAG, W. High rate of leaf-

cutter ant colony movements in a tropical forest.In Kurzbeiträge zur Tropenökologie

(ed. H. Dalitz, M. Haverkamp, J. Homeier & S. W. Breckle). Bielefelder Ökologische

Beiträge, GTÖ, 1998.

28

HINKLE, G., WETTERER, J. K., SCHULTZ, T. R.; SOGIN, M. L. Phylogeny of the

Attine ant fungi based on analysis of small subunit ribosomal RNA gene sequences.

Science, v. 266, p.1695-1697, 1994.

HOFFMAN, J. A. The immune response of Drosophila.Nature, v. 426, p. 33–38, 2003.

HÖLLDOBLER, B.; WILSON, E. O.The ants. Cambridge: Harvard University

Press, 1990. 732 p.

HÖLLDOBLER, B.; WILSON, E. O. The leafcutter ants: civilization by instinct. New

York: Norton, 2011. 160 p.

HUGHES, W. O. H.; BOOMSMA, J. Let your enemy do the work: within-host

interactions between two fungal parasites of leaf-cutting ants. Proceedings of the

Royal Society B, London, v. 271, p. 104-106, 2004.

HUGHES, W. O. H.; THOMSEN, L.; EILENBERG, J.; BOOMSMA, J. J. Density-

dependence and within-host competition in a semelparous parasite of leaf-cutting ants.

BMC Evolutionary Biology, New York, v. 4, n. 45, p. 1-12, 2004a.

HUGHES, W. O. H.; THOMSEN, L.; EILENBERG, J.; BOOMSMA, J. J. Diversity of

entomopathogenic fingi near leaf-cutting ant nest in a neotropical forest, with particular

reference to Metarhizium anisopliae var. anisopliae. Journal of Invertebrate

Pathology, San Diego, v. 85, p. 46-53, 2004b.

HUGHES, W. O. H.; PAGLIARINI, R.; MADSEN, H. B.; DIJKSTRA, M. B.;

BOOMSMA, J. J. Antimicrobial defense shows an abrupt evolutionary transition in the

fungus growing ants. Evolution, v. 62, p. 1252-1257, 2008.

INGHAM, E. R.; MOLDENKE, A. R.; EDWARDS, C. A. 2000. Soil Biology

Primer.Disponível: http: //www.soils.usda.gov/sqi/concepts/soil_biology/biology.html.

Acessado em: 30 setembro 2013.

JACCOUD, D. B.; HUGHES, W. O. H.; JACKSON, C. W. The epizootiology of a

Metarhizium infection in mini-nests of the leaf-cutting ant Atta sexdens rubropilosa.

Entomologia Experimentalis et Applicata, v. 93, p. 51-61, 1999.

JAROSZ, J. Induction kinetics of immune antibacterial proteins in pupae of

Galleriamellonela and Pieris brassicae. Comparative Biochemistry and Physiology

B,v.106, p. 415-421, 1993.

JAROSZ, J. Hydrocortisone, a suppressive agent of inducible antibacterial immunity in

Galleria melllonella (Insecta: Lepidoptera). Cytobios, v.80, p. 243-248, 1994.

KAAYA, G. P.; FLYG, C.; BOMAN, H.G. Induction of cecropin and attacin-

likeantibacterial factors in the haemolymph of Glossina morsitans morsitans. Insect

Biochemistry, v.17,p. 309–315, 1987.

29

KUNZ, J.; HALL, M. N.Cyclosporin A, FK506 and rapamycin: more than just

immunosuppression. Department of Biochemistry, University of Basel,

Switzerland.Trends Biochem Sci.Sep; 18(9):334-8, 1993.

LAVINE, M.D.; STRAND, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect

Biochem Mol. Biol. v. 32, p. 1295-309, 2002.

LEAL, I.R.; OLIVEIRA, P.S. Interactions between fungus-growing ants (Attini), fruits

and seeds in cerrado vegetation in Southeast Brazil. Biotropica, v. 30, p. 170-178,

1998.

LEAL, I. R.; OLIVEIRA, P. S. Foraging ecology of attine ants in a Neotropical

savanna: seasonal use of fungal substrate in the cerrado vegetation of Brazil. Insectes

sociaux, v. 47, p. 376-382, 2000.

LOPES, E.; ORDUZ, S. Metarhizium anisopliae and Trichoderma viride for controlof

nests of the fungus-growing ant, Atta cephalotes. Biological Control, v. 27, nº 2, p.

194-200, 2003.

LOPES, C. S. 2008. Regulação do desenvolvimento e resposta imune de lagartas de

Diatraea saccharalis (Fabricius) (Lepidoptera: Crambidae) por Cotesia flavipes

(Cameron) (Hymenoptera: Braconidae). 73 f. Dissertação de Mestrado,

ESALQ/USP, Piracicaba, 2008.

MACHADO, V.; DIEHL-FLEIG, E.; SILVA, M. E.; LUCCHESE, M. E. P. Reações

observadas em colônias de algumas espécies de Acromyrmex (Hymenoptera -

Formicidae) quando inoculadas com fungos entomopatogênicos. Ciência e Cultura, v.

40, nº. 11, p. 1106-1108, 1988.

MARINHO, C. G. S.; DELLA LUCIA, T. M. C.; PICANÇO, M. C. Fatores que

dificultam o controle das formigas cortadeiras. Bahia Agricola, v. 7, p. 18-21, 2006.

MENDONCA L. A.; ZANETTI R.; SOUZA-SILVA A. Eficiencia e analiseeconomica

de combate a Atta spp. com termonebulizaçao. In: SIMPOSIO DE MIRMECOLOGIA,

16., 2003, Florianópolis. Anais... Florianópolis: CCB/UFSC, p. 525-526, 2003.

MEYLING, N. V.; LUBECK, M.; BUCKLEY, E. P.; EILENBERG, J.; REHNER, S. A.

Community composition, host range and genetic structure of the fungal

entomopathogen Beauveria in adjoining agricultural and seminatural habitats.

Molecular Ecology, v. 18, nº 6, p. 1282-1293, 2009.

MOUTINHO, P.; NEPSTAD, D.; DAVIDSON, E. Influence of leaf-cutting ant nests on

secondary forest growth and soil properties in Amazonia. Ecology, v. 84, p. 1265-1276,

2003.

MUDD, A.; BATEMAN, G. L. Rates of growth of the food fungus of the leaf-cutting

ant Atta cephalotes (L.)(Hymenoptera: Formicidae) on different substrates gathered by

the ants. Bull. Entomol. Res., v. 69, p. 141-8, 1979.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kunz%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7694398

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Hall%20MN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=7694398

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7694398

30

MULLER, U. G.; SCHULTZ, T. R.; CURRIE, C. R.; ADAMS, R. M. M.; MALLOCH,

D. The origin of the attine ant-fungus mutualism. The Quartely Review of Biology, v.

76, p. 169-197, 2001.

MURAKAMI, T.; HIGASHI, S.; WINDSOR, D. Mating frequency, colony size,

polyethism and sex ratio in fungus growing ants (Attini). Behavioral Ecology and

Sociobiology, New York, v. 48, p. 276-284, 2000.

OI, D. H.; PEREIRA, R. M. Ant behavior and microbial pathogens (Hymenoptera:

Formicidae) Ant behavior and microbial pathogens (Hymenoptera: Formicidae).

Florida Entomologist, Gainesville, v. 76, p. 63-74, 1993.

PARRA, J. R. P.; BPTELHO, P. S. M.; CORRÊA-FERREIRA, B. S.; BENTO, J. M. S.

(Ed). Controle biológico no Brasil: parasitóides e predadores. São Paulo: Ed.

Manole, p. 635, 2002.

PERFECTO, I.; VANDERMEER, J. Distribution and turnover rate of a population of

Atta cephalotes in a tropical rain forest in Costa Rica. Biotropica, v. 25, p. 316-321,

1993.

PIKART, T. G.; SOUZA, G. K.; ZANUNCIO, T. V., ZANETTI, R.; POLANCZYK, R.

A.; SERRÃO, J. C.; ZANUNCIO, J. C. Dispersion of seeds of tree species by the leaf-

cutting ant Acromyrmex subterraneus molestans (Hymenoptera: Formicidae) in Viçosa,

Minas Gerais State, Brazil. Sociobiology, v. 56, p. 645-652, 2010.

RIZENTAL, M. S.; ZANETTI, R.; SOUZA-SILVA, A. Eficiencia de produtos

termonebuligenos no controle de Atta laevigata em reflorestamento. In: SIMPOSIO DE

MIRMECOLOGIA, 16., 2003, Florianopolis. Anais... Florianopolis: CCB/UFSC, 2003.

p.523-524.

RODRIGUES, A.; PAGNOCCA, F. C.; BUENO, O. C.; PFENNING, L. H.; BACCI Jr.,

M. Assessment of microfungi in fungus gardens free of the leaf-cutting ant Atta sexdens

rubropilosa (Hymenoptera: Formicidae). Sociobiology, v. 46, nº.2, p. 329-334, 2005.

RODRIGUES, A.; BACCI Jr., M.; MUELLER, U. G.; ORTIZ, A.; PAGNOCCA, F. C.

Microfungal “weeds” in the leafcutter ant symbiosis. Microbial Ecology, v. 56, nº 4, p.

604-614, 2008.

ROLFF, J.; SIVA-JOTHY, M. T. Invertebrate ecological mmunology. Science, v.301,

p. 472-475, 2003.

RUSSO, J.; BREHÉLIN, M.; CARTON, Y. Haemocyte changes in reistant and

susceptible strains of D. melanogaster caused by virulent and avirulent strains of the

parasitic wasp Leptopilina boulardi. Journal of Insect Physiology, v. 47, p. 167-172,

2001.

SCHMID-HEMPEL, P. Parasites in social insects – monographs in behavior and

ecology. Princeton University Press, p. 409, 1998.

31

SCHMID-HEMPEL, P. Variation in immune defence as a question of

evolutionaryecology. Proceedings of the Royal Society of London B, v. 270, p. 357-

366, 2003.

SERAGUZI, E. F; MARUYMA, W. I. Manejo de formigas cortadeiras no município

de Cassilândia. Unidade Universitária de Cassilândia. Cassilândia - Mato Grosso do

Sul, p. 9, 2013.

SILVA, M. E.; DIEHL-FLEIG, E. Avaliação de diferentes linhagens de fungos

entomopatogênicos para controle da formiga Atta sexdens piriventris (Santschi, 1919)

(Hymenoptera: formicidae). Anais da Sociedade Entomológica do Brasil, v. 17, p.

263-269, 1988.

SILVA, C.; GARY, B. D.; RAU, M. E. Interaction of hemocytes and prophenoloxidase

system of fifth instar nymphs of Acheta domesticus with bacteria. Developmental and

Comparative Immunology, v. 24, p. 367-379, 2000.

SILVA, A.; RODRIGUES, A.; BACCI, M. Jr.; PAGNOCCA, F. C.; BUENO, O. C.

Susceptibility of ant-cultivated fungus Leucoagaricus gongylophorus (Agaricales:

Basidiomycota) towards microfungi. Mycopathologia, v. 132, p. 115-119, 2006.

SILVA, R. G. X. Controle biológico – produção massal de Beauveria bassiana

(Bals.) Vuill. e Metarhizium anisopliae (Metsch.) Sorok. E seus usos no controle

biológico de Cosmopolites sordidus (Coleoptera: Curculionidae) (Germar). 69 f.

Monografia (Curso de Engenharia Florestal). Centro de Ciências Tecnológicas,

Universidade Regionalde Blumenau – FURB. Blumenau. 2007.

SODERHALL, K.; CERENIUS, L. Role of the prophenoloxidase-activating system in

invertebrate immunity. Current Opinion Immunology, v. 10, nº.1, p. 23-28, 1998.

ST. LEGER, R. J. Studies on adaptations of Metarhizium anisopliae to life in the soil.

Journal of Invertebrate Pathology, v. 98, nº 3, p. 271-276, 2008.

STRAND, M. R.; PECH, L. L. Immunological basis for compatibility in parasitoid-host

relationships.Annual Review Entomology, v. 40, p. 31-56, 1995.

SUNG, G. H.; HYWEL-JONES, N. L.; SUNG, J. M.; LUANGSA-ARD, J. J.;

SHRESTHA, B.; SPATAFORA, J. W. Phylogenetic classification of Cordyceps and the

clavicipitaceous fungi. Studies in Mycology, v. 57, nº. 1, p. 5-59, 2007.

TIAGO, PV.; Furlaneto, M. C. O papel de proteases degradadoras de cutícula

produzidas por fungos entomopatogênicos. Revista do Programa de Ciências Agro-

Ambientais, vol. 2, nº. 1, p. 40-51, 2003.

ZANETTI, R.; CARVALHO, G. A.; SANTOS, A.; SILVA, A S.; GODOY, M. S.

Manejointegrado de formigas cortadeiras. Lavras: UFLA, 2002. 16p.

ZANETTI, R.; ZANUNCIO, J. C.; VILELA, E. F.; LEITE, H. G.; JAFFÉ, K.;

OLIVEIRA, A. C. Level of economic damage for leaf-cutting ants in Eucalyptus

plantations in Brazil. Sociobiology, v. 42, p. 433-442, 2003.

32

WEBER, N. A. Gardening-ants: the attines. Philadelphia: American Philosophical

Society, 1972. 146 p.

WEISER, J.; MATHA, V.The insecticidal activity of cyclosporins on mosquito larvae.

J. Invertebr. Pathol, v. 51, p. 92-93, 1988.

WEISER, J.; MATHA, V.; ZIZKA, Z.; JEGOROV, A. Pathology of cyclosporin A in

mosquito larvae. Cytobios, v. 59, p. 143-150, 1989.

WHEELER, M. B.; STUART, G.; HAPNER, K. D. Agglutinin mediated opsonization

of fungal blastospores in Melanoplus differentialis (Insecta). Journal Insect

Physiology, v. 39,nº. 6, p. 477-483, 1993.

WILSON, E. O. Caste and division of labor in leafcutter ants (Hymenoptera:

Formicidae: Atta) I. The overall pattern in A. sexdens. Behavioral Ecology and

Sociobiology, New York, v. 7, p. 143-156, 1980.

WILSON, R.; CHEN, C.; RATCLIFFE, N. A. Innate immunity in insects – the role of

multiple endogenous serum lectin in the recogtion of foreign invaders in the cockroach

Blaberus discoidalis. Journal of Immunology, v. 162, p. 1590-1596, 1999.

WINKLER, M. Cyclosporin as baseline immunosuppression in solid

organtransplantation. Biodrugs, v. 14, p. 185-193, 2000.

33

___________________________________________________________CAPÍTULO I

Fungos filamentosos associados às formigas-cortadeiras Atta sexdens e Atta

laevigata

RESUMO

As formigas-cortadeiras do gênero Atta e Acromyrmex, são consideradas as principais

pragas no sistema florestal e agrícola. Isso porque cortam o material vegetal, em todo o

ciclo da planta, que servirá de alimento ao fungo simbionte cultivado por elas. Diversos

fungos filamentosos que ocorrem em condições naturais no solo podem ser encontrados

associados às formigas-cortadeiras, sendo que algumas espécies têm sido isoladas em

formigas do gênero Atta. Nesse sentido, o objetivo deste estudo foi isolar e identificar

fungos filamentosos associados às operárias das formigas-cortadeiras A. sexdens e A.

laevigata. Foi coletado um total de 180 operárias em seis colônias, sendo 90 de A.

sexdens (coletadas em três colônias) e 90 operárias de A. laevigada (coletadas também

em três colônias). O experimento foi conduzido no laboratório de Ecologia de

Ecossistemas da Universidade Federal do Tocantins. Dentre os fungos isolados das

operárias de A. sexdens foram identificados Metarhizium sp., Aspergillus flavus,

Acremonium sp. 1, Aspergillus sp. 1, Colletotrichum sp. e Acremonium sp. 2. Os fungos

encontrados em associação com as operárias da A. laevigata foram Mucor sp.,

Aspergillus flavus, Fusarium solani, Aspergillus niger. Tendo em vista que muitos

desses fungos são encontrados no solo ou são fitopatógenos, sugere-se que as operárias

se contaminaram com os mesmos no momento do forrageamento. Salienta-se ainda a

possibilidade das operárias terem sido contaminadas quando coletavam os substratos

para levarem para o fungo simbionte, pois os mesmos podem abrigar muitos

microrganismos. Esses fungos associados ao gênero Atta apresentaram elevado

percentual de esporulação, mostrando alta viabilidade. Assim, os mesmos possuem um

provável potêncial para serem usados no controle biológico. Desse modo é

recomendável para teste de patogenicidade em formigas-cortadeiras.

Palavras-chave: Controle biológico, fungos entomopatogênicos, Atta sexdens, Atta

laevigata, contaminação, simbiose.

34

ABSTRACT

The leaf-cutting ants of the genus Atta and Acromyrmex, are considered major pests in

forest and agricultural system. This is because the cut plant material, in any age of the

plant, which will serve as food for symbiotic fungus cultivated by them. Several

filamentous fungi that occur in natural conditions in the soil can be found associated

with leaf-cutting ants, and some species have been isolated in ants of the genus Atta.

Accordingly, the aim of this study was to isolate and identify filamentous fungi

associated with workers of leaf-cutting ants A. sexdens and A. laevigata. A total of 180

workers were collected in six colonies , 90 in A. sexdens (collected from three colonies)

and 90 workers of A. laevigata (also collected from three colonies) . The experiment

was conducted in the laboratory of Ecosystem Ecology, Federal University of

Tocantins. Among the fungi isolated from workers of A. sexdens fungi were identified

Metharizium sp., Aspergillus flavus, Acremonium sp.1, Aspergillus sp. 1,

Colletotrichum gloeosporioides and Acremonium sp. 2. The fungi found in association

with the workers of A. laevigata were Mucor sp., Aspergillus flavus, Fusarium solani,

Aspergillus niger. Considering that many of these fungi are found in soil or plant

pathogens are, it is suggested that the workers were contaminated with the same at the

time of foraging. Note also the possibility of workers being contaminated when

contacted with the dump of the colony, as the same is decaying organic matter, which

can harbor many microorganisms. These fungi associated with the genus Atta showed a

high percentage of sporulation, showing high viability, so they have a high potential for

use in biological control, thus it is recommended to test for pathogenicity in leaf-cutting

ants.

Keywords: biological control, entomopathogenic fungi, Atta sexdens, Atta laevigata,

contamination, symbiosis.

INTRODUÇÃO

As formigas-cortadeiras pertencem à tribo Attini, a qual compreende 13 gêneros

de formigas e aproximadamente 210 espécies descritas (Schultz e Meier, 1995; Brandão

e Mathe-Nunes, 2002). Essas formigas se especializaram em uma dieta essencialmente

fungívora, ou seja, cultivam fungo do qual se alimentam.

35

As formigas dos gêneros Atta e Acromyrmex são conhecidas popularmente como

saúvas e quenquéns, respectivamente. Elas são chamadas de formigas-cortadeiras por

cortarem e carregarem para o interior dos ninhos partes frescas de plantas. E assim

desfolharem várias espécies tanto na fase de brotação como na fase adulta dos vegetais,

onde esses fragmentos vegetais servem como substrato para o desenvolvimento do

fungo simbionte Leucoagaricus gongylophorus (Lepiotaceae: Agaricales:

Basidiomycota) do qual se alimentam (De Fine Licht e Boomsma, 2010).

Devido as formigas do gênero Atta e Acromyrmex serem consideradas uma das

principais pragas agrícolas e florestais, existe uma preocupação constante com o

controle destas em vários agroecossistemas. Contudo, a forma mais frequentemente

utilizada para o combate desses insetos é através do método químico com

predominância do uso de iscas tóxicas, devido ao baixo custo.

Questões econômicas e ambientais têm obrigado as empresas a melhorarem o

rendimento das técnicas de controle químico e incentivado a experimentação de novas

tecnologias, adotando métodos de controle que não venham a degradar o meio

ambiente. Nesse contexto, as pesquisas científicas tem buscado desenvolvimento de

alternativas para o controle de formigas-cortadeiras, a exemplo de microrganismos,

merecendo destaque os fungos entomopatogênicos.

Visando obter informações para um melhor entendimento dos microrganismos

encontrados nos ninhos das formigas-cortadeiras A. laevigata e A. sexdens, no

município de Gurupi – TO realizou-se esta pesquisa com o objetivo geral de isolar e

identificar as espécies de fungos associados às operárias das formigas-cortadeiras, com

potencial para serem usados no controle biológico dessas pragas.

MATERIAL E MÉTODOS

Área de Estudo

O experimento foi conduzido no laboratório de Ecologia de Ecossistemas da

Universidade Federal do Tocantins (UFT), Campus Universitário de Gurupi, localizado

na região sul do Estado do Tocantins. Os experimentos em campo foram realizados em

áreas cobertas com plantações de manguezal, bananeiras e florestas nativas. Gurupi se

encontra à uma altitude de 287 metros e com as seguintes coordenadas geográficas:

latitude 11º43’45” Sul e longitude 49º04'07" Oeste. A vegetação do município é

predominante do tipo campos, cerrados e pequenas florestas (Diretoria de Tecnologia

36

Educacionais, 2010). A temperatura média anual varia de 22 ºC a 32 ºC, com umidade

relativa média do ar em torno de 76%, precipitação anual média de 1.400 mm e solo do

tipo Latossolo Vermelho Amarelo Distrófico (EMBRAPA, 1999).

Coleta das operárias das colônias de Atta laevigata e Atta sexdens

Foram coletadas formigas-cortadeiras Atta sexdens e Atta laevigata, a fim de

identificar fungos considerados microrganismos invasores associados a tais pragas. A

coleta ocorreu em fevereiro de 2013, quando foram selecionados três ninhos de cada

espécie, totalizando seis colônias.

Em cada colônia foram coletadas trinta operárias, com o auxílio de pinça e

acondicionados em recipientes esterilizados. As coletas corresponderam a 90 operárias

de A. sexdens e 90 operárias de A. laevigata, perfazendo assim um total de 180

formigas-cortadeiras avaliadas.

As operárias foram levadas ao laboratório onde foram colocadas

individualmente em placas de Petri de 9 cm de diâmetro. As formigas foram

identificadas e foram supridas diariamente com água e mel. Vistorias diárias foram

realizadas até a morte das operárias. As operárias mortas foram lavadas com soluções de

álcool 70%, hipoclorito de sódio 4% e água destilada autoclavada. Posteriormente

foram transferias para tubos do tipo Eppendorf, estéreis, contendo algodão umidificado

e mantidas em sala com temperatura de 25 ± 1° C de temperatura, 70 ± 10% de umidade

relativa e fotofase de 12 horas até tais formigas apresentassem extrusão do patógeno.

Isolamento dos Fungos

Após a esporulação dos fungos nas formigas-cortadeiras realizou-se repicagens

até a obtenção do isolado puro. A repicagem foi feita em ambiente controlado,

utilizando-se capela defluxo vertical, onde os fungos repicados foram acondicionados

em placas de Petri em meio de cultura BDA (Batata, Dextrose, Ágar pH = 6,2). Para o

crescimento dos fungos as placas foram mantidas em sala com temperatura de 25 ± 1°

C, umidade relativa 70 ± 10% e fotofase de 12 horas.

Identificação dos Fungos

O processo de identificação dos isolados foi feito em duas etapas. Na primeira

etapa, parte dos fungos foram identificados no laboratório de Fitopatologia da

37

Universidade Federal do Tocantins, Campus de Gurupi. Outra parte dos fungos foram

enviadas para identificação no Laboratório de Ecologia e Sistemática de Fungos,

Departamento de Bioquímica e Microbiologia da Universidade Estadual Paulista –

UNESP - São Paulo. A identificação dos fungos foi realizada segundo caracteres

morfológicos principalmente conídios e conidióforos, encontrados em tratados

taxonômicos clássicos e com o auxílio de microscopia ótica (Domsch et al., 1980;

Samson et al., 2000). Adicionalmente, literaturas específicas foram utilizadas para a

identificação dos fungos (Barnett e Hunter, 1998; Alexopoulos et al., 1996).

Infecção das operárias com os fungos Aspergillus flavus, Aspergillus niger e

Metarhizium sp.

Foram utilizadas operárias médias de A. sexdens e A. laevigata de colônia de

laboratório, estas foram retiradas do interior da colônia de forma e evitar variações

ligadas às mesmas. Primeiramente, foram aplicados os fungos (1µl de suspensão de

conídios de Aspergillus flavus, Aspergillus niger e Metarhizium sp. 1x107 conídios/ml

aplicados no tórax). Os controles para os tratamentos com os fungos consistiram da

aplicação de água destilada autoclavada e 0,05% de Tween-80 aplicados no tórax das

operárias. Foram estabelecidos três tratamentos: (1) inoculação nas operárias com

suspensão do fungo Aspergillus flavus, (2) inoculação nas operárias com suspensão do

fungo Aspergillus niger, (3) inoculação nas operárias com suspensão do fungo

Metarhizium sp.. Foram utilizadas 20 operárias de cada espécie para cada tratamento e

controle.

Após as aplicações, as operárias foram transferidas individualmente para placas

de Petri de 9 cm de diâmetro e supridas com água e mel. Elas foram mantidas em sala

climatizada (26 °C ± 1, 70 ± 10% de U. R., e 12 horas de fotofase). As formigas

sobreviventes foram recenseadas até o décimo dia após o início do experimento.

Para a confirmação da mortalidade pelos fungos, as operárias mortas foram

desinfetadas em uma série de soluções (álcool 70%, hipoclorito de sódio 4% e água

destilada estéril) durante 10 segundos em cada uma delas. Em seguida, elas eram secas

em papel de filtro em capela de fluxo laminar e colocadas em tubos tipo Eppendorf com

algodão úmido esterilizado, e mantidas em câmara de incubação a 28 ± 1 °C, até

apresentarem extrusão dos fungos.

38

Análises estatísticas

Curvas de sobrevivência foram geradas como uma função do tempo de

observação da morte através o método de Kaplan-Meier. A curva de sobrevivência foi

feita no programa Statistica 7.0.

RESULTADOS

Fungos associados às formigas-cortadeiras Atta sexdens e Atta laevigata

Das 90 formigas-cortadeiras da espécie A. sexdens coletadas das colônias, 23

apresentaram esporulação do fungo após a sua morte a qual foi verificada até o decimo

quinto dia. Da primeira colônia, quatro formigas apresentaram esporulação de fungos,

sendo que uma dessas operárias apresentaram dois tipos de fungos esporulados na

mesma formiga. Na segunda colônia, nove operárias exibiram no seu exoesqueleto a

esporulação de fungos e uma dessas operárias esporulou dois fungos diferentes. Já à

terceira colônia foi a que apresentou maior número de esporulação de fungo, com um

total de dez operárias.

Dentre os fungos isolados nas operárias, foram identificadas seis espécies de

fungos associados às formigas-cortadeiras A. sexdens (Tabela 1).

Os fungos isolados dos tecidos das operárias da A. sexdens, ocorreu predomínio

dos gêneros Metarhizium sp.(Fig. 1), Aspergillus flavus (Fig. 2), Acromonium sp.1 (Fig.

3), Aspergillus sp.1 (Fig. 4), Colletotrichum sp.(Fig. 5), Acremonium sp.2 (Fig. 6).

Nas formigas-cortadeiras A. laevigata, os resultados da presença de fungos,

obtidos através da esporulação e inoculação em BDA mostraram que 20 formigas

tiveram a presença de fungos em seu exoesqueleto. A primeira colônia apresentou três

esporulações nas operárias de apenas um fungo. Na segunda colônia, onze formigas

apresentaram fungos, sendo que destas uma operária apresentou a esporulação de dois

fungos no seu exoesqueleto. Na terceira colônia as operárias presentaram a esporulação

de apenas um tipo de fungo. No isolamento dos fungos nas operárias foram

identificadas quatro espécies de fungos associados a estas formigas-cortadeiras A.

laevigata (Tabela 2).

Os fungos isolados da A. laevigata foram Mucor sp. (Fig. 7), Aspergillus flavus

(Fig. 8), Fusarium solani (Fig. 9), Aspergillus niger (Fig. 10).

Houve maior ocorrência do fungo Metarhizium sp., pois foi o que contaminou

um maior número de formigas. Porem esse fungo foi encontrado associado apenas à

39

espécie Atta sexdens. O fungo Aspergillus flavus, foi encontrado infectando as duas

espécies de formigas-cortadeiras, porém em menor quantidade. Nas formigas Atta

laevigata dois fungos, Mucor sp. e Aspergillus niger infectaram o mesmo número de

operárias.

Sobrevivência das operárias de Atta sexdens e Atta laevigata

A aplicação do fungo Aspergillus flavus sobre as operárias de A. laevigata

apresentaram um TL50 = 7 dias, já as operárias do controle não obtiveram o TL50 até o

décimo dia de avaliação (Fig. 11). Enquanto que o mesmo tratamento realizado nas

operárias de A. sexdens obtiveram um TL50 = 10 dias e o controle até o 10 dia de

avaliação morreram 3 operárias (Fig. 12).

A suspensão 10x107 do fungo Aspergillus Niger em A. laevigata apresentaram

um TL50 = 6 dias, onde apresentaram uma mortalidade de 70% até o décimo dia de

avaliação e o controle apresentou um TL50 = 10 dias (Fig. 13). Enquanto que nas

operárias de A. sexdens com o mesmo tratamento até o décimo dia, tiveram 40% da

mortalidade e o controle 30% de mortalidade até o décimo dia (Fig. 14).

As operárias de Atta laevigata que receberam o tratamento com o fungo

Metarhizium sp. apresentaram um TL50 = 8 dias, onde obtiveram até o décimo dia 65%

da mortalidade enquanto o controle teve 25% de mortalidade das operárias até o décimo

dia (Fig. 15), nas operárias de Atta sexdens com o mesmo tratamento apresentaram um

TL50 = 10 dia (50% da mortalidade), enquanto o controle apresentou 45% de

mortalidade no décimo dia de avaliação (Fig. 16).

DISCUSSÃO

As formigas-cortadeiras estão constantemente em contato com diversos fungos

filamentosos em suas colônias. Esses fungos são provenientes dos substratos coletados

por estas formigas para alimentarem o fungo simbionte cultivado por elas. Além disso,

podem vir do contato com o solo no depósito de lixo, pois o mesmo é composto por

jardim de fungos velhos, os quais já não possuem nutrientes e diversos materiais

orgânicos em decomposição (Lacerda, 2008). O mesmo pode abrigar patógenos

prejudiciais tanto para o jardim de fungo quanto para as próprias formigas-cortadeiras, e

40

também do solo adjacente aos ninhos destas. Logo, sugere-se que a A. sexdens e A.

laevigata podem ter sido infectadas pelos fungos em estudo.

Alguns desses fungos filamentosos encontrados associados as formigas-

cortadeiras são capazes de se formarem e atuarem como competidores do fungo

simbionte que as formigas cultivam. Um desses fungos é o Fusarium, pois de acordo

com Silva et al. (2006), o gênero Fusarium pode inibir o crescimento do fungo

simbionte Leugoagaricus gongylophorus, in vitro. Desta maneira, esse fungo pode ser

considerado um agente entomopatogênico, pois se ele consegue inibir o crescimento do

fungo que serve de alimento para as formigas, haverá assim uma redução destas e, por

consequência, poderá causar a mortalidade da colônia.

Estudos desenvolvidos por Hughes et al. (2004), mostram que de 20 ninhos

amostrados de Acromyrmex echinatior, Acromyrmex octospinosus, Atta cephalotes e

Atta colombica, em torno de 18 desses ninhos havia contaminação com o fungo

Metarhizium anisopliae, nos próximos 5 cm de terra ao redor de cada ninho. Porém,

poucas operárias se encontravam infectadas. Isto indica que as estratégias de defesa

empregadas pelas formigas mostram-se eficientes contra esse fungo, e também que é

muito difícil encontrar M. anisopliae associado às formigas-cortadeiras.

Dentre os fungos isolados das formigas-cortadeiras a maioria são fungos de solo

(Acremonium, Metarhizium, Aspergillus) (Silva et al., 2006).

Nosso estudo mostra que os fungos Aspergillus flavus, Aspergillus niger e

Metarhizium sp., pode ser um caminho viável na busca de novos fungos

entomopatogênicos, pois de acordo com os experimentos feitos o estes fungos, o

Aspergillus niger foi o fungo que se mostrou mais eficaz na mortalidade das formigas-

cortadeiras ocorrendo 50% de mortalidade no sexto dia de avaliação na espécie de A.

laevigata, o segundo fungo com maior eficiência foi o Aspergillus flavus, sendo que

ocorreu mortalidade de 50% das operárias de Atta laevigata no sétimo dia, e por ultimo

ficou o Metarhizium sp. que 50% da mortalidade em A. laevigata ocorreu no oitavo dia.

Esse fungos foram mais eficaz na espécie de Atta laevigata, pois ocorreu a

mortalidade mais rápido do que nas espécies de Atta sexdens. Sendo assim é possível

afirmar que esses fungos são eficientes no controle de formigas-cortadeiras da espécie

Atta laevigata, e podem ser recomendados em programas de controle biológico, atuando

como entomopatogênicos.

41

De acordo com Silva et al., (2006) Os fungos de solo podem ser possíveis

patógenos, pois estes podem ser tão agressivos às formigas-cortadeiras quanto ao

parasita especializado (Silva et al., 2006). Contudo, os fungos mais estudados e

caracterizados como entomopatogênicos são o Beauveria e o Metarhizium. Assim é de

fundamental importância identificar outros fungos entomopatogênicos, para haver mais

opções para o controle microbiano e facilitar o controle das formigas-cortadeiras, sem

que ocorra à degradação do meio ambiente. São poucos os estudos de microrganismos

associados às formigas-cortadeiras do gênero Atta, por isso é importante a realização de

mais estudos para a confirmação desses fungos serem entomopatogênicos.

CONCLUSÕES

Todos os fungos encontrados apresentaram elevado percentual de esporulação,

tendo portanto potencial como antagonistas em formigas do gênero Atta.

Os fungos Aspergillus flavus, Aspergillus niger e Metarhizium sp. podem ser

possivelmente considerados fungos entomopatogênicos para a espécie de Atta laevigata.

LISTA DE TABELAS E FIGURAS

Tabela 1: Identificação de fungos associados às formigas-cortadeiras A. sexdens.

Tabela 2: Identificação de fungos associados às formigas-cortadeiras A. laevigata.

Figura 1: Metarhizium sp., fungo isolado de Atta sexdens.

Figura 2: Aspergillus flavus, fungo isolado de Atta sexdens.

Figura 3: Acromonium sp. 2, fungo isolado de Atta sexdens.

Figura 4: Aspergilus sp. 1, fungo isolado de Atta sexdens.

Figura 5: Colletotrichum sp., fungo isolado de Atta sexdens.

Figura 6: Acremonium sp. 1, fungo isolado de Atta sexdens.

Figura 7: Mucor sp., fungo isolado de Atta laevigata.

Figura 8: Aspergillus flavus, fungo isolado de Atta laevigata.

Figura 9: Fusarium solani, fungo isolado da Atta laevigata.

Figura 10: Aspergillus niger, fungo isolado da Atta laevigata.

42

Figura 11: Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier de operárias de A. laevigata


flavus; linha vermelha formigas que receberam água com solução de Tween-80 0,05%.

Figura 12: Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier de operárias de A. sexdens





niger; linha vermelha formigas que receberam água com solução de Tween-80 0,05%.






sp.; linha vermelha formigas que receberam água com solução de Tween-80 0,05%.




Tabela 1: Identificação de fungos associados às formigas-cortadeiras A. sexdens

Atta sexdens

Fungo Nº de Operárias Infectadas

Metarhizium sp.

Aspergillus flavus

Acremonium sp.1

Aspergillus sp. 1

Colletotrichum sp.

Acremonium sp. 2

15

3

1

2

1

1

43

Tabela 2: Identificação de fungos associados às formigas-cortadeiras A. laevigata

Atta laevigata

Fungo Nº de Operárias Infectadas

Mucor sp.

Aspergillus flavus

Fusarium solani

Aspergillus niger

8

1

3

8

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ALEXOPOULOS, C.J.; MIMS, C.W.; BLACKWELL, M. Introductory Mycology. 4.

Ed. John Wiley & Sons, Inc.New York, 865p. 1996.

BARNETT, H. L.; HUNTER, B. B. Illustrated genera of imperfect fungi. 4. Ed. St.

Paul, MN. Am. Phytopatol. Soc. Press, 218p. 1998.

BOT, A. N. M.; CURRIE, C. R.; HART, A. G.; BOOMSMA, J. J. Waste management

in leaf-cutting ants. Ethology, Ecology & Evolution, Florence, v. 13, n. 3, p. 225-237,

2001.

BOT, A. N. M.; ORTIUS-LECHNER, D.;FINSTER, K.; MAILE, R.; BOOMSMA, J. J.

Variable sensitivity of fungi and bacteria to compounds produced by the metapleural

glands of leaf-cutting ants. Insectessociaux, v. 49, p.363-370, 2002.

BRANDÃO, C. R. F.; MAYHÉ-NUNES, A. J. A new fungus-growing ant genus,

Mycetagroicus gen. n., with the description of three new species and comments on the

monophyly of the Attini (Hymenoptera: Formicidae). Sociobiology, Chico, v. 38, n. 3B,

p.639-665, 2002.

DE FINE LICHT, H. H.; SCHIOTT, M.; MUELLER, U. G.; BOOMSMA, J. J.

Evolutionary transitions in enzyme activity of ant fungus gardens. Evolution, v. 64, p.

2055-2069, 2010.

DIEHL-FLEIG, E.; VALIM-LABRES, M. E. Fungi isolated from leaf-cutting ants Atta

sexdens piriventris and Acromyrmex heyeri(Hymenoptera-Formicidae): Mucor spp.

effects on Beauveria bassiana entomopathogen. Journal of the Brazilian Association

for the Advancement of Science, v. 45, p. 142-144, 1993.

DIRETORIA DE TECNOLOGIA EDUCACIONAIS - DTE, Apresentação da Cidade.

Disponível em:

2010.http://www.uft.edu.br/dte/index.php?option=com_content&view=article&id=287

&Itemid=31, acessado em, 31 de agosto de 2013.

http://www.uft.edu.br/dte/index.php?option=com_content&view=article&id=287&Itemid=31

http://www.uft.edu.br/dte/index.php?option=com_content&view=article&id=287&Itemid=31

44

DOMSCH, K. H.; GAMS, W.; ANDERSON, T-H. Compendium of soil fungi.

London: Academic, 1980.

EMBRAPA (EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA). (1999),

Centro Nacional de Pesquisa de Solos. Sistema brasileiro de classificação de solos,

Brasília.

FISHER, P. J.; STRADLING, D. J.; SUTTON, B. C.; PETRINI, L. E. Microfungi in the

fungus gardens of the leaf-cutting ant Atta cephalotes: a preliminary study. Mycological

Research, v.100, p.541-6, 1996.

HINKLE, G.; WETTERER, J. K.; SCHULTZ, T. R.; SOGIN, M. L. Phylogeny of the

Attine ant fungi based on analysis of small subunit ribosomal RNA gene sequences.

Science, v. 266, p. 1695-1697, 1994.

HUGHES, W. O. H.; THOMSEN, L.; EILENBERG, J.; BOOMSMA, J. J. Density-

dependence and within-hosp competition in a semelparous parasite of leaf-cutting ants.

BMC Evolutionary Biology, New York, v. 4, n. 45, p. 1-12, 2004.

LACERDA, F. G. Comportamento e morfologia das operárias de Atta sexdens

rubropilosa (Hymenoptera: formicidae) envolvidas na manipulação de lixo das

colônias. 2008. 90f. Tese (Doutorado em Entomologia) Universidade Federal de

Viçosa. Viçosa – MG, 2008.

LOPEZ, E.; ORDUZ, S. Metarhizium anisopliae e Trichoderma viride for control of

nests of the fungus-growing ant, Atta cephalotes. Biological Control, v. 27, p.194-200,

2003.

MEHDIABADI, N. J.; SCHULTZ, T. R. Natural history and phylogeny of the fungus-

farming ants (Hymenoptera: Formicidae: Myrmicinae: Attini). Myrmecological News,

v. 13, p. 37-55, 2009.

NICHOLS-ORIANS, C. Differential effects of condensed and hydrolyzable tannin on

polyphenol oxidase activity of attine symbiotic fungus. Journal of Chemical Ecology,

v. 17, p. 1811-1819, 1991.

NORTH, R. D.; JACKSON, C. W.; HOWSE, P. E. Evolutionary aspects of ant-fungus

interactions in leaf-cutting ants. Trends in Ecologyand Evolution, v. 12, p. 386-389,

1997.

SALES, F. J. M. Saúvas: Comportamento, domesticação e aleloquímicos. Edi Atta,

Fortaleza. 1998.

SAMSON R. A.; HOEKSTRA E. S.; FRISVAD J.C. Introduction to food-airborne

fungi, 6th edn. Centraalbureau Voor Schimmelcultures, Baarn, 2000.

SILVA, A., BACCI, M., PAGNOCCA, F. C., BUENO, O. C., HEBLING M. J.

A.Production of polysaccharidases in different carbon sources by Leucoagaricus

gongylophorusMoller (Singer), the symbiotic fungus of the leaf-cutting ant Atta sexdens

Linnaeus. Current Microbiology, v. 53, p. 68–71, 2006.

45

SIQUEIRA, C. G.; BACCI JR., M.; PAGNOCCA, F. C.; BUENO, O. C.; HEBLING,

M. J. A.Metabolism of plant polysaccharides by Leucoagaricus gongylophorus, the

symbiotic fungus of the leaf-cutting ant Atta sexdens L. Applied and Environmental

Microbiology, v. 64, p. 4820-4822, 1998.

SCHULTZ, T. R.; R. MEIER. A phylogenetic analysis of the fungus-growing ants

(Hymenoptera: Formicidae: Attini) based on morphological characters of the larvae.

Systematic Entomology, v. 20, p. 337–370, 1995.

SCHULTZ, T. R.; BRADY, S. G. Major evolutionary transitions in ant agriculture.

Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 105, p. 5435–5440, 2008.

46

APÊNDICES

Fig.1: Metarhizium sp.,fungo isolado da Atta sexdens

Fig. 2: Aspergillus flavus, fungo isolado da Atta sexdens

Fig. 3: Acremonium sp.2, fungo isolado da Atta sexdens

47

Fig. 4: Aspergilus sp.1, fungo isolado da Atta sexdens

Fig.5: Colletotrichum gloeosporioides, fungo isolado da Atta sexdens

Fig. 6: Acremonium sp.1, fungo isolado da Atta sexdens

48

Fig. 7: Mucor sp., fungo isolado da Atta laevigata

Fig.8: Aspergillus flavus, fungo isolado da Atta laevigata

Fig. 9: Fusarium solani, fungo isolado da Atta laevigata

49

Fig. 10: Aspergillus niger, fungo isolado da Atta laevigata




50







51







52




53

__________________________________________________________CHAPTER II

Cyclosporine A enhances the activity of Metarhizium anisopliae in controlling the leaf-

cutting ant Atta sexdens

Aline Silvestre Pereira,a Renato de Almeida Sarmento,

a Gil Rodrigues dos Santos,

a

Mariela Otoni do Nascimentoa and Danival José de Souza

a*

1Federal University of Tocantins, Gurupi Campus, Gurupi, Tocantins State, Brazil

77402-970.

*Author correspondence: [email protected]

ABSTRACT

BACKGROUND: Leaf-cutting ants are the most important pests in agriculture and

forestry, and to date, the main method of controlling them involves the use of chemical

insecticides, which may negatively impact the environment. Entomopathogenic fungi

can be a suitable alternative for biologically controlling this pest; however, their

application in field conditions does not match the success achieved in the laboratory.

One strategy to potentiate the activity of entomopathogenic fungi is to use them in

conjunction with immunosuppressor agents. Therefore, the aim of the present study was

to evaluate the effects of cyclosporine A on innate immunity of workers of the leaf-

cutting ant Atta sexdens and to determine whether the immunosuppressed worker ants,

in comparison with the non-immunosuppressed ones, exhibited higher mortality rates on

coming in contact with Metarhizium anisopliae, an entomopathogenic fungus. The

effects of cyclosporine A on the innate immune system was assessed by comparing the

total hemocyte count of worker ants subjected to treatment with that of controls.

Vulnerability to pathogens was evaluated by comparing the mortality rate of worker

ants subjected to the following treatments: cyclosporine A/control, cyclosporine A/M.

mailto:[email protected]

54

anisopliae, excipient/control, excipient/M. anisopliae, control/M. anisopliae, and

control/control.

RESULTS: Worker ants treated with cyclosporine A and M. anisopliae exhibited a

higher mortality rate in comparison with all other treatments. Further, in comparison

with controls, the total hemocyte count in this group decreased.

CONCLUSION: Our results suggest that the use of immunosuppressive agents in

conjunction with entomopathogenic fungi can be a viable alternative for controlling

leaf-cutting ants.

Keywords: Biological control; innate immunity; hemocytes; Formicidae; leaf-cutting

ants.

1 INTRODUCTION

Leaf-cutting ants belonging to the genera Atta and Acromyrmex are dominant

herbivores in the Neotropical region1; they are important pests of cultivated plants. In

the past few years, there has been an intensified search for natural control agents,

including fungi 2 and parasitoids,

3, 4 for controlling these pests. However, such control

strategies can be ineffective mainly because of the prophylactic mechanisms exhibited

by ant societies. In fact, until now, no biological control method has been effective

against these pests. In this regard, some behavior mechanisms in ants, such as

trophallaxis, allogrooming, self-grooming, and avoidance of infected individuals, may

reduce the effectiveness of natural control methods.5, 6

Entomopathogenic fungi, such as

Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin and Beauveria bassiana (Bals.–Criv.)

Vuill., have been found to be present in large quantities in close proximity to nests of

leaf-cutting ants in tropical forests; however, worker ants generally are uninfected by

these fungi,7 which can be explained by behavioral and physiological mechanisms. In

55

addition, the complex association of ants with bacteria and actinomycetes could provide

them with further protection through the production of antimicrobial compounds.8-10

Research on the immunity of leaf-cutting ants could help elucidate their

resistance mechanisms and warrant practical benefits through the development of novel

control strategies. Moreover, understanding the immune responses triggered by fungi

may help in the identification of defense mechanisms employed by insects and

pathogenicity determinants of the fungus that could overcome these defense

mechanisms. This may warrant the manipulation of fungal virulence factors with the

aim of increasing host mortality rates in a biological control scenario. Another strategy

that could be used to improve the efficacy of entomopathogenic fungi in the control of

leaf-cutting ants is the concomitant use of immunosuppressor agents.

In this sense, previous studies have indicated that cyclosporine A, an

immunosuppressor, is able to decrease the resistance of Galleria mellonella (Linnaeus)

larvae (Lepidoptera: Pyralidae) to pathogenic bacteria.11

Cyclosporine A is a cyclic,

hydrophobic peptide produced by several fungal species of the genera Beauveria (Bals.)

Vuill., Verticillium Nees, and Tolypocladium W. Gams, and it has become one of the

most important immunosuppressants in allogeneic organ transplantations.12

Here we aimed to study the effects of the immunosuppressor cyclosporine A on

the immune system of the leaf-cutting ant species Atta sexdens (Linnaeus) and to

investigate whether its use could increase their vulnerability to the entomopathogenic

fungus M. anisopliae.

2 MATERIALS and METHODS

2.1 Maintenance of colonies

A 1-year-old A. sexdens colony was collected on April 2011 in the town of

Gurupi, Tocantins State, Brazil, and transferred to an acclimatized room with a

56

temperature of 25°C ± 2°C, relative humidity of 75% ± 5 %, and a 12-h photoperiod.

The colony was fed on leaves and flowers of Tecoma stans (Bignoniaceae), leaves of

Mangifera indica (Anacardiaceae), fruits of Citrus spp. (Rutaceae), and oat flakes. At

the time of the experiments, the colony was three years old, contained 1.0 L of M.

anisopliae, and had a population of approximately 10,000 worker ants.

2.2 Metarhizium anisopliae

Pure spores of M. anisopliae were purchased from Agromilena Biological

Control (www.agromilena.com.br); the fungus was isolated from the soils of the

Atlantic Forest. We established subcultures from the isolate and inoculated them on

PDA medium containing antibiotics, and the spores produced were inoculated in A.

sexdens worker ants. After the death of worker ants, the fungus was isolated again, and

this process was repeated twice. At this stage, we verified that inoculation of 1 μL

suspension containing 1 × 107 conidia/mL caused the death of approximately 30% of

worker ants within 10 days. For our experiments, the conidial suspension was prepared

in a solution of 0.05% Tween 80 as a surfactant, using colonies that had sporulated in

<3 days and that had a spore viability of >90%. Conidia were quantified by counting in

a Neubauer chamber, and the suspension was diluted until the desired concentration.

2.3 Immunosuppressor

We used the pharmaceutical formulation Sandimmune Neoral® containing 100

mg of cyclosporine A/mL in this study. The excipient was prepared in 12.5% ethanol

dissolved in corn oil.

2.4 Immunosuppression and infection of worker ants

http://www.agromilena.com.br/

57

All A. sexdens medium worker ants were removed from the interior of the

colony to prevent age-related variations. First, 1 μL of cyclosporine A was applied

between the mandibles of each worker ant, and 1 h later, 1 μL of a conidial suspension

of M. anisopliae (1 × 107 conidia/mL) was applied to the abdomen. One of the controls

for cyclosporine A treatment consisted of ants treated with an excipient composed of a

mixture of corn oil and ethanol, whereas the second control consisted of ants injected

with sterile distilled water. The control for fungal treatment consisted of ants injected

with autoclaved 0.05% Tween 80 in distilled water. The following treatment groups

were established: (1) cyclosporine A + M. anisopliae; (2) cyclosporine A + 0.05%

Tween 80; (3) corn oil/ethanol + M. anisopliae; (4) corn oil/ethanol + 0.05% Tween 80;

(5) water + M. anisopliae, and (6) water only.

After treatments, worker ants were individually transferred to petri dishes

(diameter = 9 cm) and supplied with honey and water under controlled conditions

(temperature, 26°C ± 1.70°C; relative humidity, 10%; and a 12-h photoperiod).

Surviving ants were examined by the tenth day after the initiation of the experiment.

For confirmation of mortality caused by the fungi, dead worker ants were

disinfected in a series of solutions (70% ethanol, 4% sodium hypochlorite, and sterile

distilled water), for 10 s in each solution, after which they were dried on filter paper in a

laminar flow hood, placed in centrifuge tubes containing a moist sterile cotton, and kept

in an incubator at 28°C ± 1°C until extrusion of the fungus was observed.

2.5 Hemocyte count

The influence of cyclosporine A on innate immunity was measured by assessing

the total hemocyte count in the hemolymph of the following groups: (1) worker ants

58

injected with 1 µL of cyclosporine A, (2) those injected with 1 µL of the excipient, and

(3) those injected with 1 µL of sterile distilled water.

After 24 h of treatment, 1 µL of hemolymph was withdrawn from each worker

ant. For this purpose, worker ants were decapitated and hemolymph was collected in a

capillary tube by applying slight pressure of the abdomen. The collected hemolymph

was diluted in 9 µL of an anticoagulant solution for insects (Leonard, Söderhäll et al.,

1985). For cell staining, 1 µL of Giemsa stain was added to the suspension, and

hemocytes were quantified via light microscopy (magnification, 40×) using a Neubauer

chamber.

2.6 Statistical analysis

Survival curves were calculated by determining the time of death using the

Kaplan–Meier method. First, we compared multiple groups and then we compared

survival curves between each of the groups and applied the nonparametric log-rank test

at a significance level of 5%.

To assess the effects of cyclosporine A treatment on the total hemocyte count,

we compared the mean number of hemocytes from 10 worker ants using the ANOVA

test, followed by the Tukey test at a significance level of 5%. All analyses were

performed using Statistica software version 7.0.

3 RESULTS

3.1 Survival of A. sexdens worker ants

Treatment with cyclosporine A enhanced the pathogenic activity of M.

anisopliae on A. sexdens worker ants. Worker ants first treated with cyclosporine A and

with M. anisopliae 24 h later showed a TL50 of 3 days, whereas those who received the

59

excipient alone and then M. anisopliae had a TL50 of 6 days. The mortality rate of ants

injected with water and the fungus was at most 30% by the tenth day of the experiment

(Fig. 1). Table 1 shows that the survival curves between the groups treated with

cyclosporine A/M. anisopliae and control/M. anisopliae were significantly different

using the log-rank test (P< 0.0001). With regard to the cyclosporine A/control and

control/control treatment groups, the log-rank test (P = 0.003) showed that treatment

with cyclosporine A/control caused mortality; however, this mortality may have been

caused by the excipient because there were no statistical differences in mortality

between the cyclosporine A/control and control/control treatment groups (P = 0.66).

3.2 Hemocyte count

Figure 2 shows that the total hemocyte count of worker ants treated with either

cyclosporine A or the excipient was lower than that of worker ants in the control group

(ANOVA: F2, 27 = 18.47, P< 0.0001). However, in comparison with the control group,

cyclosporine A resulted in a more pronounced decrease in the hemocyte count

(approximately 40%) than the excipient alone (approximately 18%). The mean

hemocyte number per microliter of hemolymph was 261,000 in the control group,

213,950 in the excipient group, and 152,450 in the cyclosporine A group; all three

groups significantly differed using the Tukey test at a significance level of 5% (Fig. 2).

4 DISCUSSION

Our results indicate that exposing worker ants to cyclosporine A resulted in

suppression of the cellular immune response by decreasing circulating hemocytes in the

hemolymph; this decrease was observed within 24 h of treatment. According to

Fiolka11

, cyclosporine A is effective in the initial phase of the insect immune response

60

but loses its immunosuppressive effect after a certain period of time. Moreover, immune

suppression in worker ants compromised their defense systems against the

entomopathogenic fungus and led to a mortality rate of 80% within six days; this was

observed on using a spore load that would otherwise result in low mortality in the

absence of immunosuppression.

Our study also indicates that immunosuppression in leaf-cutting ants can be a

viable alternative in the search for novel methods to control these important agricultural

pests in the Neotropical region. Several fungal species have been found to be associated

with leaf-cutting worker ants, either in close proximity to or inside their nests.7, 13-16

However, in natural environments, these fungal species rarely infect worker ants or their

fungus garden because leaf-cutting ants exhibit a broad spectrum of antifungal defenses,

which makes them less susceptible to fungal pathogens. The interruption of these

defense mechanisms is a prerequisite for the effective use of fungi as control agents

against these pests.

Cyclosporine A is a cyclic, hydrophobic peptide produced by several fungal

species of the genera Beauveria (Bals.) Vuill., Verticillium Nees, and Tolypocladium W.

Gams.17

It is essential to understand the potential of these fungal species in order to

suppress the immune responses of ants and to devise strategies to make leaf-cutting ants

more susceptible to fungi that normally do not cause epizootic events.

Aspergillusochraceus is an example of a fungus with widespread distribution, found in

40% of forager worker ants of Atta bisphaerica. Under laboratory conditions, A.

ochraceus has been reported to be highly virulent, but there is no evidence that it can

control ant populations in field conditions.15

In combination with an

immunosuppression strategy, several of these opportunistic species could become

natural control agents for leaf-cutting ants. Further, considering that the cellular immune

61

response is associated with resistance mechanisms against parasitic insects,18

immunosuppression could also favor the attack of leaf-cutting ants by several fly

species of the Phoridae family.19

Other compounds could also suppress the immune responses of insects by

making them more susceptible to the attack by entomopathogens. In this respect, some

pesticides at sublethal doses have been reported to make insects more vulnerable to

pathogens. For example, neonicotinoid insecticides are able to suppress the immune

defense of bees and may be responsible for the decline in bee populations worldwide.20

In leaf-cutting ants, low concentrations of the neonicotinoid imidacloprid have been

reported to alter their defense behavior by decreasing self-grooming and hence

increasing their vulnerability to the entomopathogenic fungus B. bassiana.21

Imidacloprid has further been reported to have a synergistic effect with M. anisopliae

when lower fungal concentrations were used.22

If we consider their immunosuppressive

potential, then neonicotinoids should be avoided because of their systemic action and

persistence in the environment in addition to potential harmful effects on the immune

system of beneficial insects. Therefore, the search for natural immunosuppressors, such

as cyclosporine A and azadirachtin, which is present in neem seeds,23

must be

intensified, considering their lower persistence in the environment and reduced negative

effects on non-target organisms.

Our results indicate that immunosuppression of the cellular immune response

may be a viable strategy to control leaf-cutting ants when combined with low

concentrations of entomopathogenic fungi. Increased susceptibility of ant colonies to

opportunistic fungi should be further investigated, because fungi that are found inside

ant nests may serve as natural control agents.

62

ACKNOWLEDGMENTS

We thank the financial support from the Coordination for Improvement of

Higher Education Personnel (CAPES), who awarded a research grant to the first author,

and from The National Council for Scientific and Technological Development (CNPq),

who funded this research project (Process N. 478091/2011-7).

REFERENCES

1. Hölldolber B and Wilson EO. The ants. Belknap Press, Cambridge, MA, United

States of America, (1990).

2. Castilho AMC, Fraga ME, Aguiar-Menezes EdL and Rosa CAdR, Seleção de

isolados de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana patogênicos a

soldados de Atta bisphaerica e Atta sexdens rubropilosa em condições de

laboratório. Ciência Rural; 40 (1243-1249 DOI Electronic Resource Number

(2010).

3. Erthal M and Tonhasca A, Biology and oviposition behavior of the phorid

Apocephalus attophilus and the response of its host, the leaf-cutting ant Atta

laevigata. Entomologia Experimentalis et Applicata; 95 (1): 71-75 DOI

Electronic Resource Number (2000).

4. Bragança MAL and Medeiros ZCS, Ocorrência e características biológicas de

forídeos parasitóides (Diptera: Phoridae) da saúva Atta laevigata (Smith)

(Hymenoptera: Formicidae) em Porto Nacional, TO. Neotropical Entomology;

35(408-411 DOI Electronic Resource Number (2006).

5. Bextine BR and Thorvilson HG, Field applications of bait-formulated Beauveria

bassiana alginate pellets for biological control of the red imported fire ant

(Hymenoptera: Formicidae). Environmental Entomology; 31(4): 746-752 DOI


6. Oi DH and Pereira RM, Ant behavior and microbial pathogens (Hymenoptera:

Formicidae). Florida Entomologist; 76(1): 63-74 DOI Electronic Resource

Number (1993).

7. Hughes WOH, Thomsen L, Eilenberg J and Boomsma JJ, Diversity of

entomopathogenic fungi near leaf-cutting ant nests in a neotropical forest, with

particular reference to Metarhizium anisopliae var. anisopliae. Journal of

Invertebrate Pathology; 85(1): 46-53 DOI Electronic Resource Number (2004).

63

8. Currie CR, Bot ANM and Boomsma JJ, Experimental evidence of a tripartite

mutualism: bacteria protect ant fungus gardens from specialized parasites.

Oikos; 101(1): 91-102 DOI Electronic Resource Number (2003).

9. de Souza DJ, Lenoir A, Kasuya MCM, Ribeiro MMR, Devers S, Couceiro JdC

and Della Lucia TMC, Ectosymbionts and immunity in the leaf-cutting ant

Acromyrmex subterraneus subterraneus. Brain, Behavior, and Immunity; 28(0):

182-187 DOI Electronic Resource Number (2013).

10. Mattoso TC, Moreira DDO and Samuels RI, Symbiotic bacteria on the cuticle of

the leaf-cutting ant Acromyrmex subterraneus subterraneus protect workers

from attack by entomopathogenic fungi. Biology Letters; 8(3): 461-464 DOI


11. Fiolka MJ, Immunosuppressive effect of cyclosporin A on insect humoral

immune response. Journal of Invertebrate Pathology; 98(3): 287-292 DOI


12. Winkler M, Cyclosporin as baseline immunosuppression in solid organ

transplantation. BioDrugs; 14(3): 185-193 DOI Electronic Resource Number

(2000).

13. Fisher PJ, Stradling DJ, Sutton BC and Petrini LE, Microfungi in the fungus

gardens of the leaf-cutting ant Atta cephalotes: a preliminary study. Mycological

Research; 100(5): 541-546 DOI Electronic Resource Number (1996).

14. Hughes DP, Evans HC, Hywel-Jones N, Boomsma JJ and Armitage SAO, Novel

fungal disease in complex leaf-cutting ant societies. Ecological Entomology;

34(2): 214-220 DOI Electronic Resource Number (2009).

15. Ribeiro MMR, Amaral KD, Seide VE, Souza BMR, Della Lucia TMC, Kasuya

MCM and de Souza DJ, Diversity of fungi associated with Atta bisphaerica

(Hymenoptera: Formicidae): the activity of Aspergillus ochraceus and

Beauveria bassiana. Psyche; 2012(2012).

16. Rodrigues A, Cable R, Mueller U, Bacci M, Jr. and Pagnocca F, Antagonistic

interactions between garden yeasts and microfungal garden pathogens of leaf-

cutting ants. Antonie van Leeuwenhoek; 96(3): 331-342 DOI Electronic

Resource Number (2009).

17. Traber R and Dreyfuss MM, Occurrence of cyclosporins and cyclosporin-like

peptolides in fungi. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology; 17(5-

6): 397-401 DOI Electronic Resource Number (1996).

18. Kacsoh BZ and Schlenke TA, High hemocyte load is associated with increased

resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D.

melanogaster. PLoS ONE; 7(4): e34721 DOI Electronic Resource Number

(2012).

19. Folgarait PJ, Leaf-cutter ant parasitoids: current knowledge. Psyche; 2013(10

DOI Electronic Resource Number (2013).

64

20. Pettis JS, van Engelsdorp D, Johnson J and Dively G, Pesticide exposure in

honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema.

Naturwissenschaften; 99(2): 153-158 DOI Electronic Resource Number (2012).

21. Galvanho JP, Carrera MP, Moreira DDO, Erthal Jr. M, Silva CP and Samuels

RI, Imidacloprid inhibits behavioral defences of the leaf-cutting ant Acromyrmex

subterraneus subterraneus (Hymenoptera:Formicidae). J Insect Behav; 26(1): 1-

13 DOI Electronic Resource Number (2013).

22. Santos AV, Oliveira BL and Samuels RI, Selection of entomopathogenic fungi

for use in combination with sub-lethal doses of imidacloprid: perspectives for

the control of the leaf-cutting ant Atta sexdens rubropilosa Forel (Hymenoptera:

Formicidae). Mycopathologia; 163(4): 233-240 DOI Electronic Resource

Number (2007).

23. Azambuja Pd and Garcia ES, Effects of azadirachtin on Rhodnius prolixus:

immunity and Trypanosoma interaction. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz;

87(69-72 DOI Electronic Resource Number (1992).

FIGURES AND TABLE

Fig. 1

Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier)

Cyclosporine A/M. anisopliae

Cyclosporine A/Control

Excipient/M. anisopliae

Excipient/Control

Control/M. anisopliae

Control/Control0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Time in days

-0.1

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Cu

mu

lative

Pro

po

rtio

n S

urv

ivin

g

65

Fig. 2

66

Table 1

Control/Control Control/M.anisopliae Excipient/Control Excipient/M.

anisopliae

Cyclosporine A/Control Cyclosporine A/M.

anisopliae

Control/Control - 0.21 0.004 0.004 0.003 0.00000

Control/M. anisopliae 0.21 - 0.08 0.05 0.05 0.00002

Excipient/Control 0.004 0.08 - 0.58 0.66 0.0003

Excipient/M.

anisopliae

0.004 0.05 0.58 - 0.78 0.006

Cyclosporine

A/Control

0.003 0.05 0.66 0.78 - 0.002

Cyclosporine A/M.

anisopliae

0.00000 0.00002 0.0003 0.006 0.002 -

67

FIGURE LEGENDS

Figure 1. Kaplan–Meier survival curves of A. sexdens worker ants subjected to different

treatments. Blue lines and circles represent ants injected with cyclosporine A; red

squares and lines represent ants injected with the excipient, and black lines and triangles

represent ants injected with sterile distilled water. Dashed lines represent ants injected

with M. anisopliae, whereas solid lines represent ants injected with 0.05% Tween 80.

Figure 2. Mean total hemocyte count (n = 10) ± standard error for the three groups of A.

sexdens worker ants 24 h after treatment with sterile distilled water, the excipient, or

cyclosporine A. Columns with different letters indicate statistically different means by

the Tukey test at a significance level of 5%.

TABLE CAPTION

Table 1: P values for pairwise comparisons of the survival curves of distinct groups of

worker ants using the log-rank test.

68

__________________________________________________________CAPÍTULO II

O imunossupressor ciclosporina A (CsA; Sandimmun®) potencializa a ação do

fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae sobre operárias da formiga-

cortadeira Atta sexdens

Aline Silvestre Pereira1, Renato de Almeida Sarmento

1, Gil Rodrigues dos Santos

1,

Mariela Otoni do Nascimento1, Danival José de Souza

1*

1Universidade Federal do Tocantins, Campus de Gurupi, Gurupi - TO, Brazil 77402-

970. *Autor correspondente: [email protected]

RESUMO

As formigas-cortadeiras são as principais pragas nas culturas florestais e agrícolas,

sendo o seu principal método de controle o uso de inseticidas químicos, os quais

impactam negativamente o meio ambiente. Fungos entomopatogênicos poderia ser uma

alternativa de controle biológico dessas pragas, porém o seu uso no campo não repete o

sucesso dos experimentos feitos em laboratório. Uma forma de viabilizar o seu uso seria

a combinação de fungos entomopatogênicos com agentes imunossupressores que

diminuíssem a imunidade dos insetos, tornando mais eficiente a ação do fungo. Nesse

contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da Ciclosporina A sobre o

sistema imune inato de operárias da formiga Atta sexdens e determinar se formigas

submetidas a esse imunossupressor apresentam maior taxa de mortalidade quando em

contato com o fungo entomopatogênio Metarhizium anisopliae do que operárias que

não receberam o imunossupressor. O efeito do medicamento sobre o sistema imune

inato foi determinado pela comparação do número total de hemócitos de operárias

submetidas ou não ao medicamento. A vulnerabilidade ao entomopatógeno foi avaliada

pela comparação das taxas de mortalidade dos seguintes tratamentos:

Ciclosporina/Controle, Ciclosporina/Metarhizium, Excipiente/Controle,

Excipiente/Metarhizium, Controle/Controle e Controle/Metarhizium. Formigas tratadas

com o imunossupressor e o fungo tiveram uma taxa de mortalidade maior do que todos

os demais tratamentos e verificou-se que essas formigas apresentavam uma grande

redução do número de hemócitos quando comparadas com os grupos controle. Esses

resultados mostram que a utilização de imunossupressores aliados a fungos

69

entomopatogênicos pode constituir uma alternativa viável no controle de formigas-

cortadeiras.

Palavras-chave: Controle biológico, imunidade inata, hemócitos, Formicidae.

INTRODUÇÃO

As formigas-cortadeiras (gêneros Atta e Acromyrmex) são consideradas

herbívoros dominantes na região Neotropical (Hölldolber and Wilson 1990) e pragas

severas quando atacam plantas cultivadas. Tem havido uma procura por agentes de

controle natural para essas formigas, sejam fungos (Castilho, Fraga et al., 2010) ou

parasitoides (Erthal and Tonhasca 2000, Bragança and Medeiros 2006). No entanto, tais

estratégias de controle podem se mostrar ineficazes, principalmente devido aos

mecanismos profiláticos encontrados nas sociedades das formigas. Isto é evidenciado

pelo fato de que, até o presente, nenhum programa de controle biológico conseguiu ser

efetivo contra as formigas-pragas. Simplesmente os mecanismos comportamentais

encontrados nas formigas - como trofalaxia, “allogrooming”, “autogrooming” e evitação

de indivíduos infectados – podem reduzir o sucesso de tal tipo de controle (Oi and

Pereira 1993, Bextine and Thorvilson 2002). Fungos entomopatogênicos, como

Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin e Beauveria bassiana (Bals.-Criv.)

Vuill., podem ser encontrados, em alta abundância, próximos a ninhos de formigas-

cortadeiras, em uma área de floresta tropical, no entanto, a despeito do contato das

operárias com esses patógenos, elas não se encontram normalmente infectadas (Hughes,

Thomsen et al. 2004). Mecanismos comportamentais e fisiológicos poderiam explicar a

imunidade dessas formigas a esses dois importantes entomopatogênicos. Acrescenta-se

a isso a complexa associação dessas formigas com bactérias actinomicetos, que podem

lhes fornecer proteção adicional por meio da produção de substâncias antibióticas

(Currie, Bot et al. 2003, Mattoso, Moreira et al. 2012, de Souza, Lenoir et al. 2013).

Entender a variação da resposta imune das formigas-cortadeiras poderia ajudar a

melhor compreender os mecanismos de resistência desses insetos, o que poderia ter

efeitos práticos, uma vez que novas estratégias de controle levariam em conta essas

diferenças. Um entendimento da resposta imune induzida por fungos identificaria as

defesas do inseto e os determinantes da patogenicidade do fungo que poderiam superar

70

essas defesas. Isto ajudaria a identificar os fatores de virulência do fungo que poderiam

ser manipulados a fim de aumentar a taxa de mortalidade do hospedeiro num cenário de

controle biológico. Uma estratégia que poderia ser utilizada, por exemplo, para

aumentar a eficácia de fungos entomopatogênicos no controle de formigas-cortadeiras

seria a utilização, concomitante, de substâncias que diminuíssem a resposta imune das

formigas.

Experimentos com o imunossupressor Ciclosporina A mostraram que esta

substância foi capaz de reduzir a resistência de larvas do lepidóptero Galleria

mellonella (Linnaeus) (Lepidoptera: Pyralidae) a uma bactéria patogênica (Fiolka

2008). Ciclosporinas são peptídeos cíclicos, hidrofóbicos, produzidos por várias

espécies de fungos dos gêneros Beauveria (Bals.) Vuill., Verticilium Nees e

Tolyplocadium W. Gams. Também, a ciclosporina A tornou-se uma das mais

importantes drogas médicas, usada para suprimir a rejeição de órgãos transplantados

(Winkler 2000).

O objetivo principal deste trabalho foi estudar o efeito de uma substância

imunossupressora, a ciclosporina A, sobre o sistema imune de uma formiga-cortadeira –

Atta sexdens (Linnaeus) - e verificar se sua administração a torna mais vulnerabilidade

ao fungo entomopatogênico M. anisopliae.

MATERIAIS E MÉTODOS

Manutenção de colônias

Uma colônia de A. sexdens de um ano de idade foi coletada em abril de 2011 na

cidade de Gurupi, TO, Brasil e mantida em sala climatizada com temperatura de 25 ± 2

°C, 75 ± 5 % de umidade relativa e fotoperíodo de12 h. A colônia foi alimentada com

folhas e flores de Tecoma stans (Bignoniaceae), folhas de Mangifera indica

(Anacardiaceae), frutos de Citrus spp. (Rutaceae) e aveia em flocos. À época dos

experimentos, a colônia tinha idade de três anos, 1 L de jardim de fungo e população

aproximada de 10.000 operárias.

Metarhizium anisopliae

Esporos puros de Metarhizium anisopliae foram adquiridos da empresa

Agromilena Controle Biológico (www.agromilena.com.br), sendo que o fungo foi

isolado de solos da Mata Atlântica. A partir desse isolado, nós efetuamos repicagens e

http://www.agromilena.com.br/

71

inoculação em meio BDA acrescido de antibióticos, sendo os esporos produzidos

inoculados em operárias de A. sexdens. Após a morte dessas operárias, o fungo foi

isolado novamente. Esse processo foi repetido duas vezes. Nessa fase, determinou-se

que a aplicação de 1 μL de uma dose 1 x 107 conídios/mL provocava a morte de apenas

~30% das operárias num período de 10 dias. Para os experimentos, foram preparadas

suspensões de conídios a partir de colônias que esporulavam (menos de três dias e

viabilidade de esporos superior a 90%) em soluções 0,05% de Tween-80 como agente

surfactante. As suspensões foram quantificadas através da contagem de conídios em

câmara de Neubauer e diluídas para se obter a concentração desejada.

Imunossupressor

Nós usamos a formulação farmacêutica da ciclosporina Sandimmun Neoral®

que contem 100 mg de ciclosporina por mL da solução. O excipiente foi preparado com

etanol (12,5%) dissolvido em óleo de milho.

Immunossupressão e infecção das operárias

Todas as operárias médias de A. sexdens foram retiradas do interior da colônia

de forma a evitar variações ligadas à idade das mesmas. Primeiramente, foi aplicada a

dose do imunossupressor (1µL de ciclosporina aplicado entre as mandíbulas) e após 1

hora a aplicação do fungo entomopatogênico (1µL de suspensão de conídios de M.

anisopliae 1 x 107 conídios/mL aplicados no tórax). Os controles para o tratamento com

ciclosporina consistiram da aplicação do excipiente do medicamento, constituído de

uma mistura de álcool e óleo de milho, além de um segundo controle constituído de

água destilada estéril. O controle para o tratamento com fungo consistia na aplicação de

uma solução de água destilada autoclavada e 0,05% de Tween-80. Foram estabelecidos

os seguintes grupos tratamento: (1) Ciclosporina + M. anisopliae, (2) Ciclosporina +

Solução 0,05% Tween-80, Excipiente do imunossupressor + M. anisopliae, Excipiente

+ Solução 0,05% Tween-80, Água + M. anisopliae e apenas aplicação de água.

Após as aplicações, as operárias foram transferidas individualmente para placas

de Petri de 9 cm de diâmetro e supridas com água e mel. Elas foram mantidas em sala

climatizada (26 °C ± 1, 70 ± 10% de U. R., e 12 horas de fotofase). As formigas

sobreviventes foram recenseadas até o décimo dia após o início do experimento.

Para a confirmação da mortalidade pelos fungos, as operárias mortas foram

desinfetadas em uma série de soluções (álcool 70%, hipoclorito de sódio 4% e água

72

destilada estéril) durante 10 segundos em cada uma delas. Em seguida, elas eram secas

em papel de filtro em capela de fluxo laminar e colocadas em tubos tipo Eppendorf com

algodão úmido esterilizado, e mantidas em câmara de incubação a 28 ± 1 °C, até

apresentarem extrusão do fungo M. anisopliae.

Contagem dos Hemócitos

Para medir a influência do imunossupressor na imunidade inata das formigas,

realizou-se a contagem dos hemócitos totais presentes na hemolinfa de três grupos de

operárias: (1) operárias que receberam aplicação entre as mandíbulas de 1µL do

imunussupressor Ciclosporina A, (2) operárias que receberam 1µL do excipiente e (3) e

operárias que receberam apenas 1 µL de água destilada.

Após 24 horas da aplicação, retirou-se 1µL da hemolinfa de cada operária. Para isso, as

operárias tinham suas cabeças decepadas e uma leve pressão do tórax com os dedos

fazia escorrer a hemolinfa que era coletada com um capilar graduado. A hemolinfa

coletada foi diluída em 9 µL de solução anticoagulante para inseto (Leonard, Söderhäll

et al. 1985) mais 1 µL de corante de Giemsa e quantificados em microscópio de luz (40

x de aumento) com câmara de Neubauer.

Análises estatísticas

Curvas de sobrevivência foram geradas como uma função do tempo de

observação da morte através o método de Kaplan-Meier. Primeiramente, nós realizamos

uma comparação dos múltiplos grupos e, após, nós comparamos as curvas de

sobrevivência de dois grupos (tomados dois a dois) e aplicamos o teste não paramétrico

de Log Rank a 5% de significância.

Para comparar os efeitos do tratamento sobre a CTH, nós comparamos a média

de hemócitos de 10 operárias através de uma ANOVA seguida de um teste a posteriori

(Teste Tukey) a 5% de significância. Todas as análises foram feitas no programa

Statistica 7.0.

RESULTADOS

Sobrevivência de operárias de Atta sexdens

A aplicação de ciclosporina potencializou a ação patogênica do fungo M.

anisopliae sobre as operárias de A. sexdens. Operárias que receberam uma aplicação

73

prévia de ciclosporina e 24 h após o fungo M. anisopliae apresentaram um TL50 = 3

dias, enquanto que as que receberam apenas o excipiente e em seguida o fungo

apresentaram um TL50 = 6 dias.

A mortalidade máxima das formigas que receberam apenas água e em seguida o

fungo foi de no máximo 30% até o 10º dia de experimento (Fig. 1).

A comparação das curvas de sobrevivência entre os grupos

Ciclosporina/Metarhizium e Control/Metarhizium mostra uma diferença estatística

altamente significativa (P < 0,0001; teste de Log-Rank, Tabela 1). Quando se compara

os grupos Ciclosporina/Control e Control/Control, verifica-se que o tratamento com

Ciclosporina/Controle provocou mortalidade das operárias (P = 0,003; teste de Log-

Rank, Tabela 1), mas isto pode ser devido apenas a efeito do excipiente, uma vez que

não existe diferença estatística entre os grupos Ciclosporina/Controle e

Excipiente/Controle (P = 0,66).

Contagem dos hemócitos das formigas-cortadeiras Atta sexdens

A contagem de hemócitos totais da hemolinfa de operárias sob influência da

ciclosporina ou excipiente foi inferior ao do grupo controle (ANOVA: F2, 27=18,47, P <

0,0001, Fig. 2). No entanto, a ciclosporina provocou uma redução mais acentuada no

número de hemócitos (~40%) do que apenas o excipiente (~18%) em relação ao grupo

controle. O número médio dos hemócitos por microlitro de hemolinfa foi de 261.000 no

grupo controle, 213.950 para o tratamento com o excipiente e 152.450 nas operárias

tratadas com ciclosporina. Todos os três grupos diferiram estatisticamente pelo teste

Tukey a 5% de probabilidade (Fig. 2).

DISCUSSÃO

Nossos resultados indicam que a ciclosporina provocou uma redução da resposta

imune celular, verificada na redução dos hemócitos circulando na hemolinfa. A

exposição ao imunossupressor provocou uma rápida redução na população de

hemócitos que foi verificada num período de 24 horas. Segundo Fiolka (Fiolka 2008), a

ciclosporina tem ação eficaz na fase inicial da resposta imune do inseto, perdendo esse

efeito imunossupressor após algum tempo. A redução na resposta imune das operárias

comprometeu o seu sistema de defesa contra um fungo entomopatogênico, levando a

74

uma mortalidade de 80% num período de seis dias com uma dose de esporos que, sem

imunossupressão, provoca baixa mortalidade.

Nosso estudo mostra que a imunossupressão da imunidade inata de formigas-

cortadeiras pode ser um caminho viável na busca de novos métodos de controle dessas

importantes pragas agrícolas da região Neotropical. Várias espécies de fungos são

encontradas associadas às operárias, próximas aos ninhos ou no interior dos ninhos das

formigas-cortadeiras (Fisher, Stradling et al. 1996, Hughes, Thomsen et al. 2004,

Hughes, Evans et al. 2009, Rodrigues, Cable et al. 2009, Ribeiro, Amaral et al. 2012),

mas, em condições naturais, operárias ou jardim de fungo raramente são infectados por

esses agentes. Atribui-se isto ao amplo espectro de defesas antifúngicas que as

formigas-cortadeiras possuem, o que as tornaram menos susceptíveis aos

micopatógenos. Quebrar essa fortaleza é uma pré-condição se se pretende usar fungos

como agentes de controle de formigas-cortadeiras.

Ciclosporinas são peptídeos cíclicos, hidrofóbicos, produzidos por várias

espécies de fungos dos gêneros Beauveria (Bals.) Vuill., Verticilium Nees e

Tolyplocadium W. Gams, dentre outros (Traber and Dreyfuss 1996). Sendo assim, é

importante conhecer o potencial dessas várias espécies fúngicas em provocar redução da

resposta imune das formigas, o que as tornariam susceptíveis a fungos que,

normalmente, não causam eventos de epizootias em formigas-cortadeiras. Aspergillus

ochraceus é um exemplo de fungo com ampla distribuição e foi encontrado em 40% das

operárias forrageadoras de Atta bisphaerica. Em condições de laboratório, ele se

mostrou altamente virulento, mas não existe nenhuma evidência que ele controle

populações das formigas em condições de campo (Ribeiro, Amaral et al. 2012). Em

combinação com uma estratégia de imunossupressão, várias dessas espécies

oportunistas poderiam se tornar agentes de controle natural das formigas-cortadeiras.

Além disso, uma vez que a resposta imune celular está associada aos mecanismos de

resistência contra parasitoides em insetos (Kacsoh and Schlenke 2012), a

imunossupressão poderia favorecer o ataque das várias espécies de moscas da família

Phoridae que são associadas às formigas-cortadeiras(Folgarait 2013).

Outras substâncias podem reduzir a resposta imune dos insetos tornando-os mais

suscetíveis ao ataque de entomopatógenos. Notadamente, alguns pesticidas em doses

subletais tornam os insetos vulneráveis a patógenos. Neonicotinoides podem reduzir a

defesa imune de abelhas e ser um dos responsáveis pelo declínio de suas populações no

mundo (Pettis, van Engelsdorp et al. 2012). Em formigas-cortadeiras, baixas

75

concentrações do neonicotinoide imidaclopride alteram o comportamento de defesa das

formigas – diminuição do self-grooming – fato que aumenta sua vulnerabilidade ao

fungo entomopatogênico Beauveria bassiana (Galvanho, Carrera et al. 2013) ou pode

ter ação sinérgica com doses em baixa concentração de M. anisopliae (Santos, Oliveira

et al. 2007). Enquanto mostram sua potencialidade como imunossupressores,

neonicotinoides deveriam ser evitados por terem ação sistêmica e persistência no

ambiente, além dos efeitos negativos no sistema imune de insetos benéficos. Por isso, a

procura por imunossupressores naturais, incluindo os produzidos por fungos como as

ciclosporinas ou por vegetais como a azadiractina (Azambuja and Garcia 1992), deve

ser intensificada, pois eles podem apresentar menor persistência no ambiente e serem

menos nocivos a organismos não-alvo.

A imunossupressão da resposta celular pode ser uma estratégia viável no

controle de formigas-cortadeiras quando em combinação com doses em baixas

concentrações de fungos entomopatogênicos. O aumento da susceptibilidade da colônia

a fungos oportunistas deve ser investigado, pois muitas espécies ocorrendo no interior

do ninho poderão constituir agentes de controle natural.

AGRADECIMENTOS

Este trabalho recebeu financiamento da CAPES-Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior que concedeu bolsa de estudos ao

primeiro autor e do CNPq - Conselho Nacional de Pesquisa que financiou essa pesquisa,

Processo 478091/2011-7.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Azambuja, P. d. and E. S. Garcia (1992). "Effects of azadirachtin on Rhodnius prolixus:

immunity and Trypanosoma interaction." Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 87: 69-

72.

Bextine, B. R. and H. G. Thorvilson (2002). "Field applications of bait-formulated

Beauveria bassiana alginate pellets for biological control of the red imported fire ant

(Hymenoptera: Formicidae)." Environmental Entomology 31(4): 746-752.

Bragança, M. A. L. and Z. C. S. Medeiros (2006). "Ocorrência e características

biológicas de forídeos parasitóides (Diptera: Phoridae) da saúva Atta laevigata (Smith)

76

(Hymenoptera: Formicidae) em Porto Nacional, TO." Neotropical Entomology 35: 408-

411.

Castilho, A. M. C., M. E. Fraga, E. d. L. Aguiar-Menezes and C. A. d. R. Rosa (2010).

"Seleção de isolados de Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana patogênicos a

soldados de Atta bisphaerica e Atta sexdens rubropilosa em condições de laboratório."

Ciência Rural 40: 1243-1249.

Currie, C. R., A. N. M. Bot and J. J. Boomsma (2003). "Experimental evidence of a

tripartite mutualism: bacteria protect ant fungus gardens from specialized parasites."

Oikos 101(1): 91-102.

De Souza, D. J., A. Lenoir, M. C. M. Kasuya, M. M. R. Ribeiro, S. Devers, J. d. C.

Couceiro and T. M. C. Della Lucia (2013). "Ectosymbionts and immunity in the leaf-

cutting ant Acromyrmex subterraneus subterraneus." Brain, Behavior, and Immunity

28(0): 182-187.

Erthal, M. and A. Tonhasca (2000). "Biology and oviposition behavior of the phorid

Apocephalus attophilus and the response of its host, the leaf-cutting ant Atta laevigata."

Entomologia Experimentalis et Applicata 95(1): 71-75.

Fiolka, M. J. (2008). "Immunosuppressive effect of cyclosporin A on insect humoral

immune response." Journal of Invertebrate Pathology 98(3): 287-292.

Fisher, P. J., D. J. Stradling, B. C. Sutton and L. E. Petrini (1996). "Microfungi in the

fungus gardens of the leaf-cutting ant Atta cephalotes: a preliminary study."

Mycological Research 100(5): 541-546.

Folgarait, P. J. (2013). "Leaf-cutter ant parasitoids: current knowledge." Psyche 2013:

10.

Galvanho, J. P., M. P. Carrera, D. D. O. Moreira, M. Erthal Jr., C. P. Silva and R. I.

Samuels (2013). "Imidacloprid inhibits behavioral defences of the leaf-cutting ant

Acromyrmex subterraneus subterraneus (Hymenoptera:Formicidae)." Journal of Insect

Behavior 26(1): 1-13.

Hölldolber, B. and E. O. Wilson (1990). The ants. Cambridge, MA, United States of

America, Belknap Press.

Hughes, D. P., H. C. Evans, N. Hywel-Jones, J. J. Boomsma and S. A. O. Armitage

(2009). "Novel fungal disease in complex leaf-cutting ant societies." Ecological

Entomology 34(2): 214-220.

Hughes, W. O. H., L. Thomsen, J. Eilenberg and J. J. Boomsma (2004). "Diversity of

entomopathogenic fungi near leaf-cutting ant nests in a neotropical forest, with

particular reference to Metarhizium anisopliae var. anisopliae." Journal of Invertebrate

Pathology 85(1): 46-53.

77

Kacsoh, B. Z. and T. A. Schlenke (2012). "High hemocyte load is associated with

increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D.

melanogaster." PLoS ONE7(4): e 34721.

Leonard, C., K. Söderhäll and N. A. Ratcliffe (1985). "Studies on prophenoloxidase and

protease activity of Blaberus craniifer haemocytes." Insect Biochemistry 15(6): 803-

810.

Mattoso, T. C., D. D. O. Moreira and R. I. Samuels (2012). "Symbiotic bacteria on the

cuticle of the leaf-cutting ant Acromyrmex subterraneus subterraneus protect workers

from attack by entomopathogenic fungi." Biology Letters 8(3): 461-464.

Oi, D. H. and R. M. Pereira (1993). "Ant behavior and microbial pathogens

(Hymenoptera: Formicidae)." Florida Entomologist76(1): 63-74.

Pettis, J. S., D. van Engelsdorp, J. Johnson and G. Dively (2012). "Pesticide exposure in

honey bees results in increased levels of the gut pathogen Nosema."

Naturwissenschaften 99(2): 153-158.

Ribeiro, M. M. R., K. D. Amaral, V. E. Seide, B. M. R. Souza, T. M. C. Della Lucia, M.

C. M. Kasuya and D. J. de Souza (2012). "Diversity of fungi associated with Atta

bisphaerica (Hymenoptera: Formicidae): the activity of Aspergillus ochraceus and

Beauveria bassiana." Psyche 2012.

Rodrigues, A., R. Cable, U. Mueller, M. Bacci, Jr. and F. Pagnocca (2009).

"Antagonistic interactions between garden yeasts and microfungal garden pathogens of

leaf-cutting ants." Antonie van Leeuwenhoek 96(3): 331-342.

Santos, A. V., B. L. Oliveira and R. I. Samuels (2007). "Selection of entomopathogenic

fungi for use in combination with sub-lethal doses of imidacloprid: perspectives for the

control of the leaf-cutting ant Atta sexdens rubropilosa Forel (Hymenoptera:

Formicidae)." Mycopathologia 163(4): 233-240.

Traber, R. and M. M. Dreyfuss (1996). "Occurrence of cyclosporins and cyclosporin-

like peptolides in fungi." Journal of Industrial Microbiology 17(5-6): 397-401.

Winkler, M. (2000). "Cyclosporin as baseline immunosuppression in solid organ

transplantation." BioDrugs 14(3): 185-193.

78

FIGURAS E TABELAS

Fig. 1

Fig. 2

Cumulative Proportion Surviving (Kaplan-Meier)

Complete Censored

Cyclosporin/Metarhizium

Cyclosporin/Control

Excipient/Metarhizium

Excipient/Control

Control/Metarhizium

Control/Control0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Time in days

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

Cum

ulat

ive

Pro

porti

on S

urvi

ving

a

b

c

79

Table 1

Control/Control Control/Metarhizium Excipient/Control Excipient/Metarhizium Cyclosporin/Control Cyclosporin/Metarhizium

Control/Control - 0,21 0,004 0,004 0,003 0,00000

Control/Metarhizium 0,21 - 0,08 0,05 0,05 0,00002

Excipient/Control 0,004 0,08 - 0,58 0,66 0,0003

Excipient/Metarhizium 0,004 0,05 0,58 - 0,78 0,006

Cyclosporin/Control 0,003 0,05 0,66 0,78 - 0,002

Cyclosporin/Metarhizium 0,00000 0,00002 0,0003 0,006 0,002 -

80

LISTA DE FIGURAS E TABELAS

Fig. 1 – Curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier de operárias de A. sexdens

submetidas a diferentes tratamentos: linhas azuis e círculos, formigas tratadas

previamente o imunossupressor; linhas vermelhas e quadrados, formigas que receberam

o excipiente; linhas pretas e triângulos, formigas que receberam apenas água. As linhas

tracejadas representam as formigas que receberam o fungo M. anisopliae e as linhas

contínuas as formigas que receberam solução de Tween-80 0,05%.

Fig. 2 – Contagem total de hemócitos média (n = 10 operárias) ± Erro padrão de três

grupos de operárias de A. sexdens: tratadas 24 h antes com água, excipiente ou o

imunossupressor. Barras com letras diferentes indicam médias estatisticamente

diferentes pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.

Tabela 1 – Valores P para a comparação 2 x 2 pelo teste de Log-Rank das curvas de

sobrevivência dos diferentes grupos de operárias.

81

CONCLUSÕES GERAIS

As formigas-cortadeiras Atta sexdens e Atta laevigata apresentaram um grande

percentual de contaminação por microrganismos, sendo alguns desses fungos

entomopatogênicos como o Metarhizium sp. e outros com potencial patogênico

como Aspergillus flavus, Acremonium sp., Aspergillus niger, Colletotrichum

gloeosporioides, Mucor sp., Fusarium solani.

Os fungos Aspergillus flavus, Aspergillus niger e Metarhizium sp, possuem

potencial patogênico para as formigas Atta laevigata.

Atta sexdens quando foi submetida a suspensão 107 conídios/ml de Metarhizium

anisopliae juntamente com o imunossupressor Ciclosporina A causaram alta

porcentagem de mortalidade, apresentando potencial para utilização como

agente de controle biológico das formigas-cortadeiras.

Date post:	31-Oct-2020
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