UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS ... · Ao professor Dr. Enéas Gomes Filho pelo...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

CENTRO DE CIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

MARCELA CRISTINA RABELO

TERMOESTABILIDADE DE ENZIMAS DOS SUCOS DE GRAVIOLA E CAJU

FORTALEZA-CE

2012



Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-

Graduação em Bioquímica do Departamento de Bioquímica e

Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará como

requisito para a obtenção do título de Mestre em Bioquímica.

Área de Concentração: Bioquímica Vegetal.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Raquel Alcântara de Miranda.

FORTALEZA

2012



Dissertação submetida à Coordenação do Curso de Pós-

Graduação em Bioquímica da Universidade Federal do Ceará

como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em

Bioquímica com área de concentração em Bioquímica Vegetal.

Aprovada em _____/_____/_____

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Maria Raquel Alcântara de Miranda (Orientadora)

Universidade Federal do Ceará

Pesquisador Dr. Carlos Farley Herbster Moura

Embrapa Agroindústria Tropical

Pesquisador Dr. Edy Sousa de Brito


Pesquisadora Dra. Henriette Monteiro Cordeiro de Azeredo


AGRADECIMENTOS

À Deus pela saúde e paz.

À professora Dra. Maria Raquel Alcântara de Miranda pela orientação, compreensão e

confiança, fatores fundamentais para o desenvolvimento de trabalho.

Ao pesquisador Dr. Edy Sousa de Brito e seu orientando Jeferson pelo apoio na

elaboração e realização do delineamento experimental e fornecimento de suco.

Ao pesquisador Dr. Carlos Farley Herbster Moura pelo fornecimento de frutos

necessários para o desenvolvimento desse estudo.

Ao professor Dr. Enéas Gomes Filho pelo auxílio quanto ao cálculo e análise de dados

cinéticos.

À Thaís Andrade pela ajuda na bancada e aos demais colegas do Laboratório de

Bioquímica e Fisiologia de Frutos da UFC, Aurelice Barbosa, Luciana de Siqueira, Marília

Freiras, Roberta Lopes, Frederico, Mônica Lopes, Jessika Golçalves, Kellina Oliveira, Sérgio

Dantas e Ana Lívia Brasil pelo auxílio e agradável convivência durante o desenvolvimento

deste trabalho.

Ao programa de pós-graduação em Bioquímica do departamento de Bioquímica e

Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará pelo auxílio em minha formação.

À EMBRAPA Agroindústria Tropical.

Ao projeto Instituto Nacional de Frutos Tropicais e ao CNPq pelo apoio financeiro.

RESUMO

A industrialização de produtos alimentícios visa à obtenção de produtos com características

sensoriais e nutricionais próximas ao produto in natura e que sejam seguros sob o ponto de

vista microbiológico. Nas operações de processamento e durante o armazenamento de suco de

frutas ocorrem transformações que podem resultar em perdas ou aparecimento de sabor e

aroma desagradáveis devido a várias reações bioquímicas complexas entre seus constituintes.

Enzimas, como as peroxidases e as pectinases podem comprometer a qualidade e tempo de

vida útil dos sucos, devendo, portanto, ser inativadas durante as etapas do processamento.

Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito do tratamento térmico sobre a atividade de

enzimas nos sucos de caju e graviola. Polpas de graviola madura foram homogeneizadas em

aparelho liquidificador doméstico e diluídas em água destilada na proporção de 1:1, para a

obtenção do suco. Já o suco de caju foi preparado a partir da prensagem de pedúnculos

maduros. Os sucos foram tratados com diferentes temperaturas (55, 65, 75, 85 e 95 °C) por

diferentes tempos (1, 3, 5, 10, 15, 20 e 30 minutos) e então avaliados quanto à atividade das

enzimas dismutase do superóxido (SOD), catalase (CAT), peroxidases do ascorbato (APX) e

guaiacol (G-POD), pectinametilesterase (PME) e poligalacturonase (PG). Para o suco de caju,

observou-se que a SOD apresenta uma elevada resistência a altas temperaturas, de modo que a

exposição a 95 °C resultou em decréscimo em sua atividade residual no primeiro minuto e

depois, em uma recuperação e manutenção da atividade até os 30 min, quando houve então

um declínio para 74%. A atividade residual da APX sofreu um declínio no primeiro minuto de

todos os tratamentos aplicados, seguido de um aumento principalmente a 55 °C. A PME de

suco de caju mostrou-se termorresistente como pode ser observado pelo tratamento a 55 °C

que aumentou sua atividade em até 10 vezes e os demais tratamentos não provocaram grandes

alterações na atividade da PME em relação ao controle. Os resultados encontrados para a PG

se assemelham aos encontrados para a PME, quando as temperaturas mais baixas estimularam

a atividade e de modo geral, o aquecimento nas condições empregadas não reduziu sua

atividade. Para o suco de graviola, o tratamento a 85 e 95 °C resultou em total inativação da

SOD, após 3 min. A G-POD foi inativada em a partir de 1 min a 65 °C. A PME do suco de

graviola se apresentou susceptível ao aquecimento e o tratamento a 95 °C apresentou a maior

redução em sua atividade caindo para 39%, após 30 min. As temperaturas de 85 e 95 °C

resultaram na maior inativação da PG que apresentou atividade residual de 26 e 18% após 30

min, respectivamente. De um modo geral, as enzimas provenientes do suco de caju

mostraram-se mais termorresistentes do que aquelas provenientes do suco de graviola, o que

indica que a origem e as características da solução onde tais enzimas estão inseridas

influenciam em sua termoestabilidade. Como conclusão para o suco de caju, o tratamento a

75 °C por 30 min foi considerado o melhor, enquanto que para o suco de graviola, o

tratamento a 55 °C por 30 min mostrou-se já eficiente em reduzir a atividade residual de

enzimas que levariam a uma depreciação do suco sem comprometer a atividade de enzimas

desejáveis.

Palavras-chave: graviola, caju, enzimas, cinética, calor, inativação enzimática

ABSTRACT

The industrialization of fruit into juices aims to maintain its sensorial and nutritional

characteristics as similar as possible to in natura produce, besides ensuring the

microbiological safety. However, processing and storage of fruit juice triggers a range of

complex biochemical reactions that may lead to losses of desirable or development of

unpleasant flavors. Enzymes such as peroxidases and pectinases may compromise the quality

and shelf-life of juices and therefore should be inactivated. This work´s objective was to

evaluate the thermostability of enzymes from cashew apple and soursop juices. Juices were

prepared as ripe soursop pulp was homogenized with a domestic blender and diluted in water

distilled (1:1) meanwhile, ripe cashew apples were expeller-pressed. The juices were

submitted to different thermal treatments (55, 65, 75, 85 and 95 °C) for different periods of

times (1, 3, 5, 10, 15, 20 and 30 min) and then, evaluated for activity of enzymes: superoxide

dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbate (APX) and guaiacol (G-POD) peroxidases,

pectinamethylesterase (PME) and polygalacturonase (PG). For the cashew juice, SOD activity

was highly resistant to thermal treatments as the exposure to 95 °C initially decreased its

activity followed by a recovery and maintenance of 74% of residual activity, after 30 min.

APX residual activity initially declined under all temperatures tested, but then increased,

especially at 55 °C. PME from cashew juice was thermoresistant as the 55 °C treatment

increased its activity 10-fold and the greater temperatures did not differ from control. PG and

PME presented similar thermostability patterns as the lower tested temperatures stimulated

their activities and the higher temperatures did not alter them. For the soursop juice, the 85

and 95 °C treatments totally inactivated SOD, after 3 min. The G-POD was inactivated after 1

min, at 65 °C. The PME was thermolabile and treatment at 95 °C caused the greatest

reduction in activity, 39%, after 30 min. Treatments at 95 and 85 °C led to the greatest

inactivation of PG to 26 and 18%, respectively, after 30min. The enzymes from cashew apple

juice were more resistant to heating than those from soursop juice, indicating that

characteristics particular to each fruit species and the different preparation methods influenced

their thermostability. As a conclusion, the treatment at 75 °C for 30 min was considered

optimum for cashew juice enzyme inactivation, whereas 55 °C for 30 min was efficient for

the soursop juice in reducing significant amounts of the residual activity of enzymes that

would lead to quality loss without compromising the activity of desirable enzymes.

Keywords: soursop, cashew-apple, juice, kinetics, heat

LISTA DE FIGURAS

1. Atividade residual da SOD nos sucos de caju (A) e graviola (B) em relação ao tempo

sob diferentes temperaturas.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2. Atividade residual da APX no suco de caju (A) e G-POD no suco de graviola (B) em

relação ao tempo sob diferentes temperaturas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3. Atividade residual da CAT em suco de caju sob diferentes temperaturas, em relação ao

tempo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

4. Atividade residual da PME nos sucos de caju (A) e graviola (B) em relação ao tempo

sob diferentes temperaturas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .35

5. Atividade residual da PG nos sucos de caju (A) e graviola (B) em relação ao tempo

sob diferentes temperaturas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40

LISTA DE TABELAS

1. Atividade específica de enzimas do suco de caju e graviola não tratados termicamente.

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23

2. Parâmetros cinéticos estimados para a inativação térmica da SOD em suco de caju e

graviola. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3. Parâmetros cinéticos estimados para a inativação térmica da APX do suco de caju e

da G-POD do suco de graviola. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31

4. Parâmetros cinéticos estimados para a inativação térmica da CAT em suco de caju.. 33

5. Parâmetros cinéticos estimados para a inativação térmica da PME de sucos de caju e

graviola. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

6. Parâmetros cinéticos estimados para a inativação térmica da PG em sucos de caju e

graviola. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.1 Importância nutricional e econômica do suco de frutas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.2 Processamento de sucos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.3 Enzimas antioxidantes e responsáveis pelo escurecimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5

2.3.1 Dismutase do superóxido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.3.2 Peroxidases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6

2.3.3 Polifenoloxidase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.3.4 Catalase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8

2.4 Enzimas hidrolíticas de componentes da parede celular vegetal. . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.4.1 Pectinametilesterase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.4.2 Poligalacturonase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.5 Cajueiro (Anacardium occidentale L.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12

2.6 Gravioleira (Annona muricata L.) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13

3. OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15

4. METODOLOGIA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4.1 Preparo do suco. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4.2 Tratamento térmico. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4.3 Análise de proteínas totais. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

4.4 Análise de enzimas antioxidantes e responsáveis pleo escurecimento. . . . . . . . . . . . 17

4.4.1 Obtenção do extrato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

4.4.2 Atividade da dismutase do superóxido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

4.4.3 Atividade da peroxidase do ascorbato. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

4.4.4 Atividade da peroxidase do guaiacol. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

4.4.5 Atividade da catalase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

4.4.6 Atividade da polifenoloxidase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

4.5 Análise de enzimas hidrolíticas de componentes da parede celular vegetal. . . . . . . . 19

4.5.1 Atividade da pectinametilesterase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

4.5.2 Atividade da poligalacturonase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

4.6 Análise dos dados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

4.6.1 Cálculo da atividade residual. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

4.6.2 Cálculo de parâmetros cinéticos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

5. RESULTADOS E DISCUSSÕES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

5.1 Enzimas antioxidantes e responsáveis pelo escurecimento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

5.1.1 Dismutase do superóxido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

5.1.2 Peroxidases. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

5.1.3 Polifenoloxidase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

5.1.4 Catalase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

5.2 Enzimas hidrolíticas de componentes da parede celular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

5.2.1 Pectinametilesterase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34

5.2.2 Poligalacturonase. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39

6. CONCLUSÕES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45

1

1. INTRODUÇÃO

Uma dieta que é rica em frutos e vegetais tem sido associada com a proteção contra

doenças cardiovasculares (BAZZANO et al., 2002) e alguns tipos de câncer (VAN‟T VEER

et al., 2000). Por isso, a demanda por alimentos mais saudáveis tem aumentado

continuamente por parte dos consumidores, o que contribui para o crescente consumo de suco

de frutas observado nos últimos anos (SANCHO et al., 2007). Na última década, a indústria

brasileira de sucos mostrou um rápido e intenso crescimento, principalmente devido ao

aumento no interesse em sucos de frutas, uma vez que estes produtos foram fortemente

associados a benefícios para a saúde (NIELSEN, 2008).

O Brasil é pioneiro e líder no aproveitamento do pedúnculo de caju (Anacardium

occidentale L.), o qual é uma excelente fonte de vitamina C chegando a apresentar de quatro a

cinco vezes o conteúdo de vitamina C dos frutos cítricos (cerca de 50 mg/100 mL)

(MENEZES et al., 1995). O segmento de sucos é considerado da maior importância no

aproveitamento industrial do pedúnculo de caju com grande potencial no mercado nacional e

internacional (CAMPOS et al.,2002; COSTA et al.,2000; SKLIUTAS et al.,2000).

Assim como o cajueiro, a gravioleira (Annona muricata L.) representa um enorme

potencial agroeonômico para a região Nordeste do Brasil. A polpa de seu fruto é branca e

macia, de sabor doce e é também uma boa fonte de vitaminas do complexo B sendo

principalmente destinada a indústria de sucos (TEIXEIRA et al., 2006; LIMA, 2006).

A industrialização de produtos alimentícios visa à obtenção de produtos com

características sensoriais e nutricionais próximas ao produto in natura e que sejam seguros

sob o ponto de vista microbiológico. Nas operações de processamento e durante o

armazenamento de suco de frutas ocorrem transformações, que podem resultar em perdas no

sabor e/ou aparecimento de cor, sabor e aroma desagradáveis devido à várias reações

bioquímicas complexas entre seus constituintes (GAVA, 1985).

Os sucos naturais também podem apresentar atividade de algumas enzimas, como as

peroxidases e polifenoloxidase, as quais promovem alterações na cor (escurecimento

enzimático) e off-flavor, e as pectinases como a pectinametilesterase e a poligalacturonase , as

quais degradam compostos oriundos da matriz de pectina da parede celular das células

vegetais que comprometem a qualidade e tempo de vida útil desses sucos, devendo, portanto,

ser inativadas durante os processamentos pelos quais esses produtos passam.

O processamento térmico, apesar de poder promover a degradação de alguns

nutrientes e levar a perda de atributos de qualidade como cor e aroma, é o método mais

2

comum para aumentar a vida de prateleira de sucos, possibilitando inibição do crescimento de

microrganismos ou a inativação de enzimas (ELES-MARTÍNEZ et al., 2007). Porém,

dependendo da temperatura e do tempo de exposição, além da espécie vegetal utiliza para o

preparo do suco, algumas destas enzimas podem permanecer ativas mesmo após a aplicação

de calor.

Portanto, os objetivos desse trabalho foram avaliar os efeitos do tratamento térmico

sobre a atividade residual de enzimas antioxidantes e responsáveis pelo escurecimento e

hidrolíticas de componentes da parede celular vegetal presentes no suco de caju e graviola.

3

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Importância nutricional e econômica de suco de frutas

A demanda por alimentos mais saudáveis tem aumentado continuamente por parte dos

consumidores, o que contribui para o crescente consumo de suco de frutas observado nos

últimos anos (SANCHO et al., 2007). Uma dieta que é rica em frutos e vegetais tem sido

associada com a proteção contra doenças cardiovasculares (BAZZANO et al., 2002) e alguns

tipos de câncer (VAN‟T VEER et al., 2000). Essa propriedade está relacionada à presença de

fibras solúveis e compostos antioxidantes. No passado, os pesquisadores não conseguiam

definir a diferença entre os efeitos benéficos do consumo de frutas e seus respectivos sucos.

Dessa forma, a descoberta de que os sucos apresentam efeitos similares ao do fruto íntegro só

ocorreu nos últimos anos (RUXTON et al., 2006). Em recomendações sobre a prevenção

contra doenças cardiovasculares e câncer, a Organização Mundial de Saúde (2003) não faz

nenhuma distinção entre frutos e sucos. O consumo mundial de suco de frutas em 2010

chegou a 38,7 bilhões de litros, ficando à frente de bebidas como vinho e leite aromatizado,

com 27,4 e 14,5 bilhões de litros, respectivamente (CITRUSBR, 2012).

Na última década, a indústria brasileira de sucos mostrou um rápido e intenso

crescimento, principalmente devido ao aumento no interesse em sucos uma vez que estes

produtos foram fortemente associados a benefícios para a saúde. Segundo uma pesquisa do

Ibraf (2011), a exportação de sucos não fermentados do Brasil cresceu 7,72% entre 2009 e

2010. Os sucos são fontes de nutrientes como vitaminas, minerais e fibras solúveis.

Dependendo do fruto, fitoquímicos como polifenóis, especialmente os flavonóides, os quais

conferem proteção à saúde humana, podem também estar presentes (MINTEL, 2004).

2.2 Processamentos de sucos

A alta perecibilidade das frutas associada à ausência e/ou deficiência de técnicas

adequadas de manuseio, transporte e armazenamento têm gerado grandes perdas, as quais

podem ser reduzidas pelo processamento.

O processamento industrial de sucos promove o prolongamento da sua vida útil,

tornando-os mais atraentes ao paladar; entretanto, induz mudanças e interações entre os

constituintes do suco. Assim, o processamento pode ter um impacto positivo (destruição de

inibidores ou formação de complexos desejáveis entre os componentes dos alimentos e os

4

íons metálicos) ou um impacto negativo (perda de nutrientes). Durante o processamento, o

suco é exposto a diversos fatores que podem interferir na sua estrutura e composição

nutricional, sendo que temperatura, luz, oxigênio, umidade e pH do meio são os fatores que

mais contribuem para essa alteração (CORREIA et al., 2008).

Muitos são os processos empregados com o intuito de produzir alimentos estáveis e

seguros como a refrigeração, congelamento, desidratação, salga, adição de açúcar,

acidificação, fermentação, pasteurização, esterilização, utilização de pulsos elétricos,

tecnologia de barreiras ou métodos combinados, entre outros (SOUZA FILHO et al., 1999). O

processamento com emprego de calor, processamento térmico, é o método mais comum para

aumentar a vida de prateleira dos produtos, possibilitando a inativação ou inibição do

crescimento de microrganismos e enzimas (ELES-MARTÍNEZ et al., 2007). A aplicação de

calor como forma de processamento de alimentos pode ocorrer de diversas formas. Os

principais tratamentos térmicos utilizados na indústria de alimentos são: branqueamento,

esterilização e pasteurização.

O branqueamento consiste em um tratamento prévio que utiliza água em ebulição ou

vapor por um tempo e uma temperatura pré-estabelecidos, tendo como finalidade inativar

enzimas responsáveis por reações de deterioração, que causam alterações sensoriais e

nutricionais (PROCHASKA et al., 2000). Esse tratamento também reduz a carga microbiana

inicial do produto, promove o amaciamento de tecidos vegetais, facilitando o envase e

removendo o ar dos espaços intercelulares, no caso de vegetais enlatados (AZEREDO, 2004).

O branqueamento também é empregado no processo de esterilização comercial com o

objetivo de remover gases dos tecidos de alimentos e pré-aquecer o produto, diminuindo o

tempo de uso da autoclave (SILVA, 2007).

O processo de esterilização consiste em uma operação unitária, na qual os alimentos

são aquecidos a uma temperatura suficientemente elevada, durante minutos ou segundos,

visando à destruição total de microrganismos e inativação de enzimas capazes de deteriorar o

produto durante o armazenamento (FELLOWS, 1994). Para definir o tempo de tratamento

que deverá ser aplicado, faz-se necessário conhecer a resistência térmica, tanto dos

microrganismos como das enzimas presentes, a velocidade de penetração de calor no

alimento, o seu estado físico e as propriedades térmicas do alimento e do material de envase

(SILVA et al., 2000).

No processo de pasteurização, ocorre o extermínio parcial da flora deteriorante, a

eliminação total da flora microbiana patogênica e a inativação de enzimas prejudiciais. É um

tratamento térmico relativamente suave (temperaturas inferiores a 100 ºC) que promove o

5

prolongamento da vida útil dos alimentos durante vários dias ou meses (FELLOWS, 2000). A

temperatura de pasteurização e o tempo de duração utilizados dependem da carga de

contaminação do produto e das condições de transferência de calor através do mesmo. O

tratamento térmico pode ser feito de duas formas: pasteurização lenta (62-65 °C/ 30 min) e

pasteurização rápida (72-75 °C/ 15-20 s) (EVANGELISTA, 2001).

O tratamento térmico mostra-se eficiente na inativação de enzimas pelo fato de o calor

promover desnaturação de proteínas por modificação em sua estrutura conformacional, a qual

é fundamental para a atividade enzimática e evitar que o substrato atinja o sítio ativo de sua

respectiva enzima (MARTÍNEZ et al., 2006). Independente da técnica utilizada, o tratamento

térmico tem a finalidade de eliminar possíveis microrganismos que poderiam estar presentes

no produto final e inativar enzimas tais como peroxidases, pectinametilesterase e

poligalacturonase, que, quando ativas, depreciam o valor nutricional e qualidade sensorial de

produtos alimentícios à base de frutas, em especial os sucos. Porém, dependendo da

temperatura e do tempo de exposição, além da espécie vegetal utilizada no preparo do suco,

algumas destas enzimas podem permanecer ativas mesmo após a aplicação de calor.

2.3 Enzimas antioxidantes e responsáveis pelo escurecimento

O estresse oxidativo é um desequilíbrio entre a capacidade oxidativa e antioxidativa

nas células vegetais (ARORA et al., 2002) e desta forma, o estresse é definido como uma

condição biótica ou abiótica que interrompe, restringe ou acelera o processo metabólico

normal do organismo (HODGES, 2003). Assim, mudanças nas condições ambientais como

umidade, injúrias mecânicas, normalmente observadas durante a extração de suco de frutas, e

variações de temperatura, dentre outras, podem causar danos oxidativos nas células vegetais,

bem como em órgão como um todo, como o são os frutos e, consequentemente, em seus

derivados (ALSCHER et al.,1997).

2.3.1 Dismutase do superóxido

A dismutase do superóxido (SOD, EC, 1.15.1.1) é uma metaloenzima existente em

vegetais em três isoformas, manganês-SOD (Mn-SOD), Ferro-SOD (Fe-SOD) e cobre-zinco-

SOD (CuZn-SOD), as quais diferem entre si pelo tipo de metal utilizado como cofator

(SANTOS et al., 2000; MORAN et al., 2003). Essa enzima catalisa a dismutação do radical

superóxido (O2•−

) a peróxido de hidrogênio (H2O2). As plantas, normalmente, têm Cu/Zn-

6

SOD no citosol, Cu/Zn e/ou Fe- SOD no cloroplasto e Mn-SOD na mitocôndria. As SOD‟s

são consideradas importantes agentes antioxidantes, porém em elevadas concentrações nas

células animais e bacterianas podem induzir disfunções e morte celular (BAKER E

ORLANDI, 1995). Jiao e Wang (2000) determinaram a atividade de enzimas antioxidantes no

suco de seis diferentes cultivares de amoras pretas (Rubus sp) e evidenciaram a presença da

enzima SOD com atividade entre 8,62 a 13,98 UAE.mg de proteína-1

. Lacan e Baccou (1998)

analisaram a correlação entre enzimas antioxidantes e retardamento da senescência em duas

variedades de melão (Cuccumis melo L.) e observaram elevada atividade da enzima SOD na

variedade de vida útil longa quando comparada à variedade de vida útil curta. Portanto, tal

efeito dessa enzima antioxidante também poderia elevar a vida útil do suco dessa variedade.

2.3.2 Peroxidases

As peroxidases são enzimas antioxidantes essenciais para o sistema de detoxificação

celular que regula os níveis internos de peróxido de hidrogênio, reduzindo este às custas da

oxidação de outros compostos. Em vegetais, as peroxidases são encontradas na forma de

várias isoenzimas, variando no tipo de substrato doador de elétrons utilizado, estabilidade

térmica, peso molecular, ponto isoelétrico e propriedades imunológicas (ROBINSON, 1991).

A peroxidase do ascorbato (APX, EC, 1.11.1.1) é a mais importante na detoxificação

do H2O2 catalisando sua redução usando o poder redutor do ácido ascórbico ou vitamina C

(NOCTOR E FOYER, 1998).

Outra classe de peroxidases (G-POD, EC 1.11.1.7.) utiliza o poder redutor de

compostos fenólicos para degradar o peróxido de hidrogênio. Substratos fenólicos artificiais

como o guaiacol podem ser utilizados nas análises de peroxidases dessa classe, independente

de qual seja seu substrato natural (LOPEZ et al., 1994; MIKA E LUTHJE, 2003; PASSARDI

et al., 2005). A atividade dessas enzimas é indesejada em sucos por ser responsável pelo

desenvolvimento de off-flavor e off-colours, os quais correspondem à formação de sabor e

coloração, respectivamente, endesejáveis.

Essas enzimas promovem um grande número de reações e consequentemente possuem

uma versatilidade que não é excedida por nenhuma outra enzima. Existem naturalmente

vários compostos fenólicos que podem ser oxidados pelas peroxidases na presença de uma

pequena quantidade de peróxido de hidrogênio. Devido à diversidade dos compostos

suscetíveis à oxidação causada por essas enzimas, a variedade de produtos formados (os quais

7

promovem as características indesejáveis citadas) é muito extensa. As peroxidases utilizam

tanto um substrato oxidante, usualmente o H2O2, quanto um redutor (ROBINSON, 1991).

As peroxidases são geralmente as enzimas mais termoestáveis encontradas em frutos e

vegetais, o que faz com que ela seja utilizada como um indicador de inativação enzimática

após determinados tratamentos térmicos (ANTHON et al., 2002), sendo essa estabilidade

dependente do tecido e da espécie (ROBINSON, 1991). Estudos que avaliaram o

comportamento cinético da atividade de peroxidases de extratos de couve-flor (Brassica

oleracea var. Botrytis) submetidos a tratamento térmico mostraram que esta enzima mantém

100% de sua atividade inicial (atividade residual) mesmo após uma exposição por 30 min a 50

°C. Quando a temperatura aumenta para 85 °C, a atividade cai para 11,6%, restando apenas

2,1% a 100 °C (RAYAN et al., 2011). Anthon et al. (2002) observaram que a peroxidase de

suco de tomate da cultivar CXD 199 foi rapidamente inativada a 72 °C, apresentando menor

estabilidade térmica que PME e PG desse mesmo suco. Já a peroxidase de suco de cenoura

apresenta uma alta termoestabilidade, mantendo-se ativa mesmo após 150 min de exposição a

70 °C (JAKOB et al., 2010).

2.3.3 Polifenoloxidase

O escurecimento observado quando a maioria das frutas e dos vegetais é amassada,

cortada, triturada ou processada em suco, é oriunda de reações catalisadas pela enzima

polifenoloxidase (PPO). A ação dessa enzima em várias frutas e vegetais in natura acarreta

perdas econômicas consideráveis, além de diminuição da qualidade nutritiva e alteração do

sabor (ARAÚJO, 1999).

A polifenoloxidase (PPO, EC 1.14.18.1) é uma enzima que contém cobre e é capaz de

catalisar dois diferentes tipos de reação: a hidroxilação de monofenóis a o- difenóis e a de

hidrogenação de o- difenóis a o- quinonas. As quinonas produzidas conduzem

subsequentemente a uma série de reações não enzimáticas que produzem pigmentos e

melanina de cor marrom escura. Na maioria dos tecidos vegetais, essa enzima está localizada

nos plastídios, enquanto que seus substratos localizam-se no vacúolo celular. Dessa forma, a

atividade da PPO só ocorre quando há a ruptura desses tecidos e a liberação do conteúdo

desses compartimentos, o que proporciona o encontro da enzima com o substrato. A PPO é

geralmente considerada uma enzima de baixa termoestabilidade. Tratamentos térmicos de

duração relativamente curta a 70-90°C são suficientes para reduzir substancialmente ou

8

eliminar completamente a atividade dessa enzima em produtos de origem vegetal. No entanto,

a PPO é relativamente estável sob armazenamento a temperatura abaixo de zero (YORUK E

MARSHALL, 2006; ZAWISTOWSKI et al., 1991).

De acordo com Weemaes et al. (1998), a inativação da polifenoloxidase por

tratamento térmico é o método mais eficaz para controlar o escurecimento enzimático. Esses

autores estudaram a estabilidade térmica da PPO em extrato de maçã, abacate, uva, pêra e

ameixa e a inativação térmica dessa enzima foi descrita como cinética de primeira ordem. No

entanto, no caso da ameixa, uma queda na atividade enzimática foi observada nos primeiros

30 s. Como a PPO presente na ameixa é formada por pelo menos duas isoenzimas, é possível

que o decaimento inicial rápido causado pelo aquecimento seja devido à isoenzima com

menor estabilidade. O decréscimo mais lento foi decorrente da isoenzima mais termoestável.

2.3.4 Catalase

Como as peroxidases discutidas anteriormente, a catalase (CAT, EC 1.11.1.6) é uma

enzima que participa na remoção de peróxidos, mais especificamente convertendo o peróxido

de hidrogênio (H2O2) em água (H2O) e oxigênio molecular (O2). As plantas possuem várias

isoformas de catalase, as quais estão presentes nos peroxissomas e glioxissomas. São as

principais enzimas de detoxificação do H2O2 em plantas e podem dismutar diretamente o

H2O2 ou oxidar substratos, tais como metanol, etanol, formaldeído e ácido fórmico. As

catalases podem ser divididas em três classes: catalases da classe 1 removem o H2O2

produzido durante a fotorespiração em tecidos fotossintéticos; catalases da classe 2 são

produzidas em tecidos vasculares e podem exercer uma função de lignificação, mas sua exata

função biológica permanece desconhecida; e na classe 3 estão as catalases presentes

abundantemente em sementes e plantas jovens, e cuja atividade está relacionada à remoção do

H2O2 produzido durante a degradação dos ácidos graxos no glioxissoma. As catalases

funcionam então como canal de limpeza do H2O2 celular (BREUSEGEM et al., 2001). Dessa

forma, a atividade dessa enzima em sucos seria importante no sentido neutralizar a ação do

peróxido de hidrogênio, impedindo sua ação deteriorante sobre as biomoléculas presentes

nesse produto.

9

2.4 Enzimas hidrolíticas de componentes da parede celular vegetal

A estrutura da parede celular dos vegetais é formada por polissacarídeos, que podem

ser divididos de acordo com suas propriedades físico-químicas em: substâncias pécticas,

hemicelulose e celulose. As substâncias pécticas são a pectina e o ácido péctico. A pectina é

um polímero hidrofílico contendo blocos de ácido galacturônico parcialmente esterificados

com grupos metoxila e blocos com outros açúcares como a arabinogalactose, galactose e

arabinose em uma estrutura altamente ramificada. O ácido péctico ou ácido galacturônico é o

resultado da desmetoxilação da pectina (IPPA, 2011).

A pectina é classificada como um agente suspensor e funciona como um estabilizante

em sucos proporcionando a manutenção da sua turbidez (BABYLON, 2011). Além disso,

pectinas e polissacarídeos pécticos estão emergindo como ingredientes alimentares bioativos.

Pectina de toranja é usada industrialmente como estabilizante e suplemento alimentar, pois

melhora a nutrição e o desenvolvimento físico infantil. Esses oligogalacturonídeos e seus

produtos de degradação por enzimas pectinolíticas são classificados como “probióticos” por

serem não digeríveis, ou seja, não são hidrolisados na parte superior do trato gastrointestinal e

podem ser usados como promotores de saúde em nutrição humana e animal por estimularem

seletivamente o crescimento e/ou a atividade de bactérias do colo intestinal (LANG et al.,

2000).

A capacidade de produtos derivados de frutas como purês, polpas e sucos em manter

sua porção sólida em suspensão, ou seja, manter sua viscosidade por toda a sua vida útil

depende principalmente da quantidade e qualidade do material péctico presente em solução

(BEMILLER, 1986; CHOU et al., 1987). A perda de viscosidade e, consequentemente, da

qualidade e aceitação por parte dos consumidores de sucos de frutas é uma conseqüência

direta de alterações na estrutura da matriz de pectina da parede celular vegetal (VAN

BUREN, 1979).

Alterações na composição péctica de produtos derivados de vegetais podem ocorrer

devido à modificação química desses compostos como a -eliminação ou por ação de enzimas

hidrolíticas endógenas, as quais degradam pectina, como a pectinametilesterase e

poligalacturonase (VERLENT et al., 2004). Algumas das implicações destas enzimas nas

indústrias de alimentos incluem o amadurecimento de frutas, clarificação e redução de

viscosidade em sucos de frutas, tratamento preliminar do suco de uva para indústrias

vinícolas, extração de polpa de tomate, fermentação de chá e chocolate, tratamento de

10

resíduos vegetais, degomagem de fibras nas indústrias têxteis e de papel, nutrição animal,

enriquecimento protéico de alimentos infantis e extração de óleos (UENOJO et al., 2007).

2.4.1 Pectinametilesterase

A enzima pectinametilesterase (PME; EC 3.1.1.11) provoca redução na turbidez e

viscosidade de sucos comerciais (KIMBALL, 1991). É uma enzima que está presente

principalmente na lamela média e junções celulares e pode ser encontrada em diferentes

isoformas as quais variam com a espécie vegetal e, no caso de frutos, com o estádio de

maturação (TUCKER et al., 1982). Todas as isoformas compreendem apenas uma cadeia

polipeptídica com massa molecular variando de 10 a 60 kDa (ALONSO et al., 1997;

GIOVANE et al., 1990).

A PME catalisa a hidrólise de grupos metoxil da pectina formando ácidos pécticos

como produtos de sua reação. Essa enzima atua preferencialmente em um grupo metil-éster de

uma unidade de galacturonato próxima a uma unidade não esterificada de galacturonato. A

redução no grau de metoxilação da pectina, catalisada pela PME pode provocar diversas

alterações em relação à textura e firmeza de produtos vegetais (TIJSKENS et al., 1999).

A remoção dos grupos metoxil da cadeia de ácido poligalacturônico a qual forma a

matriz de pectina leva a um aumento no número de grupos carboxílicos livres, os quais podem

se ligar a cátions e gerar ligações cruzadas na cadeia de pectina. A formação dessas ligações

cruzadas é indesejável em sucos, pois faz com que haja a formação de agregados de pectina,

os quais podem precipitar e reduzir o aspecto homogêneo do suco (ANTHON et al., 2002).

Dessa forma, para a manutenção da qualidade de sucos, os processamentos industriais

objetivam a inativação da PME tornando-a uma das enzimas mais importantes na

industrialização e preservação de frutos, sucos e outros produtos industrializados que

envolvem a presença ou a ausência de pectina intacta (ALONSO et al., 1997 ). Além disso, a

PME também torna a pectina suscetível à ação catalítica da enzima poligalacturonase, a qual

atua somente em segmentos da cadeia de pectina que foram desmetiladas por ação da PME

(ANTHON et al., 2002).

Em um estudo com goiaba (Psidium guajava L., cv. Paluma), foi observado que a

temperatura ótima de atividade da PME em extrato concentrado foi entre 75 e 85 °C. Nesse

mesmo estudo, observou-se que essa enzima teve sua atividade aumentada após 30 min de

exposição do extrato a 75 °C, permanecendo com atividade significativa mesmo após 8 h a 90

°C. Segundo os autores desse trabalho, esse comportamento é possível devido à liberação de

11

enzimas que poderiam estar formando complexos com substâncias reguladoras e/ou

inibidoras. Além disso, a elevada atividade da PME sob altas temperaturas nessa espécie pode

estar sendo promovida pela associação dessa enzima a outras biomoléculas que lhe conferem

termoestabilidade (LEITE et al., 2006). Assis et al. (2000) estudaram a PME em acerola

(Malpighia emarginata DC.) e observaram uma redução de cerca de 90% na atividade dessa

enzima em 2 min de incubação a 106 °C. Cameron e Grohmann (1996) estudando isoenzimas

de suco cítrico observaram que uma das isoformas da PME era mais termoestável mantendo

49,2% de sua atividade inicial após 1 min de incubação a 95 °C. Javeri e Wicker (1991)

relataram que a PME em pêssego (Prunus pérsica (L.) Batsch) perde 77% de sua atividade

quando incubada por 5 min a 65 °C e é completamente inativada a 70 °C por 5 min. Seymour

et al. (1991) isolaram duas isformas de PME de toranja (Citrus paradis) e verificaram que

elas diferiam em relação à quantidade de carboidratos a elas associados. Com a remoção

desses carboidratos, houve uma diminuição da estabilidade térmica, sugerindo que essas

moléculas contribuem para a estabilidade térmica da PME.

Um estudo com a PME de cinco cultivares de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.)

(LARATA et al., 1995) mostrou que uma delas tinha elevada estabilidade térmica e isso

explicaria a perda de consistência de alguns produtos industriais derivados de tomate durante

o armazenamento. Macdonald et al. (1997) utilizando um ensaio de fluxo contínuo, isolaram

quatro isoformas de PME de limão (Citrus limonum) e observaram que uma delas mostrou

alta estabilidade térmica, mantendo a sua atividade mesmo após ser armazenada a 86 °C por 9

min. Os autores atribuíram a desestabilização do suco de limão à termoestabilidade desta

isoforma.

2.4.2 Poligalacturonase

A poligalacturonase (PG; EC 1.2.1.15) catalisa a clivagem hidrolítica das ligações -

1,4 da cadeia de ácido poligalacturônico da pectina, levando a uma redução na viscosidade e

uma precipitação de partículas sólidas durante o armazenamento de produtos derivados de

frutas e legumes. A ação dessa enzima depende diretamente da ação da PME, pois o substrato

ideal para a PG é a pectina desmetilada. Algumas espécies vegetais, tais como tomates

(Lycopersicon esculentum Mill.) apresentam três isoformas de PG: PG1, PG2A e PG2B, onde

PG2A e PG2B encontram-se normalmente agrupadas formando PG2. Nessas espécies, a

isoforma PG2 é termolábil e totalmente inativada em um tratamento de 5 minutos a 65 °C. A

PG1 é um dímero formado a partir de uma associação da PG2 com uma glicoproteína

12

termostável conhecida como -subunidade, a qual promove a termoestabilidade dessa

isoforma (FACHIN et al., 2003).

A atividade da PG já foi encontrada em vários sucos de frutos. Em produtos a base de

tomate, um aumento na solubilidade de constituintes da parede celular é devido a ação da

poligalacturonase, o que leva a uma redução na viscosidade do produto final (LOPEZ et al.,

1997). Para evitar danos relacionados à ação da PG, sua inativação é normalmente realizada

por processamento térmico, porém há poucos dados na literatura sobre a cinética de

inativação dessa enzima (GOULD, 1992). Fachin et al. (2003), analisaram a atividade da

poligalacturonase em suco de tomate (Lycopersicon esculentum Mill.) tratado por 5 minutos

com temperaturas variando de 40 a 90 °C e observaram duas fases de inativação, a primeira

em torno de 55 °C e a segunda a aproximadamente 65 °C, o que sugere a presença de duas

isoenzimas de PG com diferentes termoestabilidades. Anthon et al. (2002), estudando cinética

de inativação da PG em sucos de tomates da cultivar 199 CXD, observaram que a isoforma

termoestável PG1 mantinha-se ainda ativa com 15% da atividade inicial quando o suco era

exposto a 85 °C, enaquanto que a PG2 foi completamente inativada a 75 °C.

2.5 Cajueiro (Annacardium occidentade L.)

O cajueiro (Anacardium occidenlale L.) pertence à família Anacardiaceae, a qual

inclui árvores e arbustos tropicais e subtropicais. Esta família possui cerca de 60 gêneros e

400 espécies, englobando ainda a mangueira (Mangifera indica L.), os cajás e a cirigüela

pertencentes ao gênero Spondias (CRANE E CAMPBELL, 1990; JOHNSON, 1973). É uma

planta xerófila, rústica e típica de clima tropical. Originária do Brasil, do litoral nordestino, a

árvore espalhou-se para diversos países da África e para a Índia (PARENTE et al., 1991).

Planta de porte baixo é um caráter da maior importância em frutíferas perenes. No

cajueiro, clones comerciais do tipo anão-precoce possuem este caráter, que facilita práticas de

manejo (como poda e combate a pragas e doenças) de difícil execução ou inviáveis em

pomares de cajueiro do tipo comum. A uniformidade da copa é importante no arranjo e

manipulação das plantas, com reflexos positivos para o manejo do pomar e para a produção

(BARROS et al., 2000).

O fruto do cajueiro é a castanha, um aquênio reniforme (3g a 32g), com tegumento

liso, coriáceo, cinzento ou verde acinzentado; o mesocarpo é espesso, alveolado, cheio de um

líquido viscoso, vermelho, acre, cáustico e inflamável, comumente chamado LCC (líquido da

casca da castanha). Desenvolve-se por seis a oito semanas após a polinização, com o

13

pedúnculo (maçã ou pseudofruto) desenvolvendo-se mais intensamente durante as duas

últimas semanas. O fruto e o pedúnculo caem juntos e espontaneamente após sete a oito

semanas (WUNNACHIT E SEDGLEY, 1992).

O pedúnculo do cajueiro é carnoso, suculento e apresenta grande variação de tamanho

desde 3 cm até 20 cm de comprimento por 3 cm até 12 cm de largura, com peso entre 15 g a

200 g, formatos diversos e cor variando desde o amarelo-canário até o vermelho vinho

(BARROS et al., 1984).

O Brasil é pioneiro e líder no aproveitamento de pedúnculo de caju. Entretanto, a

adstringência decorrente da presença natural de taninos vem sendo tradicionalmente referida

como um dos principais obstáculos contra o aumento das exportações dos pedúnculos de caju

(AGOSTINI-COSTA et al., 2003). Os taninos são constituídos por compostos fenólicos com

peso molecular relativamente elevado, solúveis em água, que formam complexos

razoavelmente fortes com proteínas e outros polímeros (JOSLYN, 1964). Por causa da

concentração bastante elevada de taninos no pedúnculo do caju, esse grupo de compostos

desempenha importante papel na determinação do sabor. O pedúnculo do caju é uma

excelente fonte de vitamina C, chegando a apresentar quatro a cinco vezes o teor de vitamina

C dos frutos cítricos (MENEZES et al., 1995). De acordo com Garruti et al. (2002),

pseudofrutos do clone CCP 76 cultivado sob condições de sequeiro apresentaram coloração

do amarelo-alaranjado ao laranja e características sensoriais como elevada suculência e

maciez, sabor e aroma doce; já as amostras de clones BRS 189, cultivadas sob as mesmas

condições, apresentaram coloração vermelho-alaranjado, forte aroma doce e elevada

adstringência.

2.6 Gravioleira (Annona muricata L)

A gravioleira (Annona muricata L) é considerada a mais tropical das anonáceas,

família onde estão incluídas plantas como a ateira, pinha ou fruta-do-conde, condessa,

araticum, biribá e cherimóia. É uma espécie nativa da América Tropical, porém há

controvérsias quanto ao seu lugar de origem (STANDLEY, 1973).

São-José et al. (2000) citam que as áreas produtoras de graviola estão instaladas

principalmente nas regiões litorâneas e semiáridas do Nordeste do Brasil, onde predominam

as variedades „Nordestina‟ e „Crioula‟. A produção, que era totalmente destinada para a

agroindústria, já tem um volume significativo comercializado como fruto fresco

especialmente nos mercados de São Paulo, Rio de Janeiro, Recife, Salvador, Fortaleza e

14

Brasília. No entanto, a alta perecibilidade do fruto e o curto período de conservação após a

colheita respondem por altos índices de perdas (MOSCA et al., 1997).

O fruto da gravioleira é uma baga com inúmeros carpelos verdes vulgarmente

denominados de “acúleos” ou “espinhos”, com peso variando de 0,9 a 10 kg (LEÓN, 1987).

De acordo com Corrêa (1978), esse fruto tem forma irregular, elipsóide e pode medir 30 cm

de comprimento por 12 cm de largura, apresentando epiderme verde‐escuro, espessa e

areolada. A polpa é branca sucosa, macia, de sabor doce, um pouco fibrosa, com sementes de

cor castanha ou preta e, além disso, é também uma boa fonte de vitaminas do complexo B

(LIMA, 2006; TEIXEIRA et al., 2006).Durante o amadurecimento desses frutos há um

aumento no conteúdo de ácido ascórbico, sacarose, frutose e glicose, além de um aumento na

atividade das enzimas amilase, poligalacturonase e celulase (PAULL, 1982).

O fruto é normalmente consumido na forma in natura, mas apresenta-se como uma

fonte potencial para a produção comercial de polpa congelada, purê, geléia, fruto em pó e

sucos (ABBO et al., 2006). Apesar de poucos estudos feitos sobre os efeitos da Annona

muricata L. em seres humanos, Oberlies et al. (1997) relataram que a graviola pode ser um

medicamento eficaz no controle de células tumorais. Já Champy et al. (2004) afirmam que a

anonacina, um constituinte lipofílico isolado da graviola, é inibidor do complexo I

mitocondrial e induz a neurodegeneração estriatal e da substância nigra, uma disfunção

neuronal que pode acarretar a doença de Parkinson.

15

3 OBJETIVOS

Esse trabalho teve como objetivo geral avaliar o efeito do tratamento térmico sobre a

atividade das enzimas dismutase do superóxido, peroxidases, polifenoloxidase, catalase,

pectinametilesterase e poligalacturonase nos sucos de caju e graviola.

Objetivos específicos a serem avaliados são:

- Analisar qual tratamento seria o mais eficiente a fim de promover a inativação das

enzimas indesejadas sem afetar a qualidade do suco;

- Verificar quais são as enzimas mais e menos resistente às elevadas temperaturas

aplicadas aos sucos.

16

4 METODOLOGIA

4.1 Preparo dos sucos

Pedúnculos de Anacardium occidenlale L. do clone CCP76, no estádio maduro e com

coloração alaranjada foram utilizados para a obtenção do suco prensado, conforme descrito

por Abreu (2001). O preparo do suco consiste basicamente na prensagem do pedúnculo com

prensa do tipo EXPELLER da marca CEIL com uma força de 730 N.

Para a obtenção do suco de graviola, frutos maduros da variedade „Crioula‟ ou

„Nordestina‟ tiveram suas sementes e casca removidas para a obtenção de aproximadamente 4

kg de polpa, a qual foi homogeneizada em aparelho liquidificador doméstico da marca Walita

com água destilada, em uma proporção de 1:1.

4.2 Tratamento térmico

Para ambas as espécies analisadas, o suco foi distribuído em tubos de ensaio contendo

50 mL cada, e então transferidos para banho-Maria onde permaneceram por 1, 3, 5, 10, 15, 20

e 30 minutos nas temperaturas de 55, 65, 75, 85 e 95 °C. Ao término de cada período, o suco

foi imediatamente transferido para banho de gelo e em seguida acondicionado em frasco

devidamente etiquetado e armazenado a –80 °C, até o dia de análise. As amostras foram

separadas em três repetições as quais foram analisadas em duplicata quanto à atividade das

enzimas dismutase do superóxido, catalase, peroxidases do ascorbato e guaiacol,

poligalacturonase e pectinametilesterase.

4.3 Análise de proteínas totais

O conteúdo total de proteínas foi analisado segundo a metodologia proposta por

Bradford (1976) onde, 1000 µL de reagente de Bradford foi adicionado a 100 µL de extrato e

analisados em espectrofotômetro a 595 nm. A atividade de todas as enzimas foi baseada no

conteúdo de proteínas totais de cada extrato, representando sua atividade específica. Cada

amostra foi analisada em duplicata.

17

4.4 Análise de enzimas antioxidantes e responsáveis pelo escurecimento

4.4.1 Obtenção do extrato

Para a obtenção do extrato, 1 g de suco foi homogeneizada em vortex com 5 mL de

solução tampão contendo fosfato de potássio monobásico 0,1 M e EDTA 0,1 mM, pH 7,0, por

1 min. Em seguida, o homogeneizado foi centrifugado a 5000 rpm e 4 ºC por 40 min. O

material precipitado foi descartado e o sobrenadante foi recolhido e congelado a –18 ºC para

posterior utilização como extrato para a análise das enzimas dismutase do superóxido,

peroxidase do ascorbato e guaiacol e catalase.

4.4.2 Atividade da dismutase do superóxido

A enzima dismutase do superóxido (SOD, EC 1.15.1.1) foi analisada de forma

indireta, como foi descrito por Giannopolitis e Ries (1977), baseando-se no conteúdo de

formazana oriundo da reação entre o radical superóxido, proveniente da reação entre o

oxigênio atmosférico e a riboflavina na presença de luz, e o nitro blue tetrazolium (NBT). A

SOD presente nos extratos degradaria o radical superóxido e assim, impediria a formação de

formazana. Então, foram misturados 1000 µL de solução tampão com pH 7,8 contendo

fosfato de potássio monobásico 0,05 M, EDTA 0,1 mM e metionina 19,5 mM, 50 µL de

extrato, 150 µL de NBT 750 µM e 300 µL de riboflavina 10 µM. Para essa análise utilizaram-

se ainda dois tipos de controle, um claro e um escuro, onde o volume correspondente ao

extrato foi substituído por solução tampão. Os tubos contendo o branco claro e os diferentes

extratos a serem analisados foram colocados em uma caixa de madeira revestida com papel

alumínio contendo duas lâmpadas fluorescentes de 20 W por 15 min. O controle escuro

permaneceu no escuro durante os mesmos períodos de tempo. Ao final desse período,

seguiram-se as análises de conteúdo de formazana em espectrofotômetro a 560 nm, onde o

controle escuro foi utilizado para zerar o mesmo. Uma unidade de atividade (UA) foi definida

como a quantidade de enzima necessária para inibir em 50% a fotorredução do NBT

(BEAUCHAMP E FRIDOVICH, 1971). Cada extrato foi analisado em duplicata e a atividade

específica média expressa como UAE/ mg de proteína.

18

4.4.3 Atividade da peroxidase do ascorbato

Para a determinação da atividade da enzima peroxidase do ascorbato (APX, EC

1.11.1.1), 1350 µL de solução tampão fosfato de potássio monobásico 0,05 M e EDTA 0,05

mM pH 6,0 foram colocados em banho-Maria a 30 ºC e adicionados 50 µL de extrato, 50 µL

de solução de peróxido de hidrogênio 0,03 M e 50 µL de ácido ascórbico 0,015 M. A mistura

foi homogeneizada em vortex e analisada em espectrofotômetro a 290 nm em um intervalo de

5 min. As amostras foram analisadas em duplicata. Essa marcha analítica visa a análise da

atividade da APX presente nos extratos a partir da mensuração da decrescente concentração

de ácido ascórbico, o qual é oxidado durante a degradação de peróxido de hidrogênio, como

foi descrito por Nakano e Asada (1981). A atividade média foi expressa como µmol H2O2.mg

de proteína-1

.min, considerando que é necessário dois mols de ácido ascórbico para reduzir

um mol de H2O2 (AMANKO et al.,1994).

4.4.4 Atividade da peroxidase do guaiacol

O extrato enzimático utilizado na análise dessa enzima é o mesmo utilizado para a

análise das enzimas antioxidantes. Para essa análise, 950 µL de solução tampão de fosfato de

potássio monobásico 0,1 M e EDTA 0,1 mM, pH 7,0, foram mantidos a 30 °C por 10 min e,

em seguida, foram adicionados 500 µL de solução de guaiacol 0,2 M, 500 µL de solução de

H2O2 e 50 µL de extrato enzimático. A solução resultante foi homogeneizada em vortex e,

então, sua absorbância foi medida em espectrofotômetro a 470 nm em um intervalo de 5

minutos (AMANKO et al.,1994). A média dos resultados foi expressa em µmol de H2O2.min-

1. mg de proteína.

4.4.5 Atividade da catalase

A atividade da catalase (CAT, EC 1.11.1.6) foi mensurada a partir da análise de

degradação de peróxido de hidrogênio, composto cuja concentração foi medida em

espectrofotômetro a 240 nm. Para essa análise, 1390 µL de solução tampão fosfato de

potássio monobásico 0,1 M e EDTA 0,1 mM pH 7,0 foram colocados em banho-Maria a 30

ºC e em seguida adicionou-se 60 µL de solução de peróxido de hidrogênio 0,5 M e 50 µL de

extrato. O volume final foi homogeneizado em vortex e sua absorbância foi analisada em um

19

intervalo de 5 min de acordo com Beers e Sizer (1952). Essa análise foi realizada em triplicata

e a atividade média foi expressa como µmol H2O2.mg de proteína-1

.min.

4.4.6 Atividade da polifenoloxidase

Para a obtenção do extrato, 5 g de suco foi homogeneizada em vortex com 10 mL de

solução tampão contendo fosfato de potássio monobásico 50 mM e 1% de PVP, pH 7,0, por 1

min. Em seguida, o homogeneizado foi centrifugado a 5000 rpm e 4 ºC por 40 min. O

material precipitado foi descartado e o sobrenadante foi recolhido e congelado a –18 ºC para

posterior utilização como extrato para a análise das enzimas antioxidante.

Para essa analise, uma mistura de reação contendo 300 µL de extrato e 1,85 mL de

solução tampão fosfato de potássio 0,1 M com catecol 0,1 M, pH 6,0 (preparada no momento

da análise), foi acondicionada em banho-Maria a 30 °C por 30 min. Tal ensaio visa a

formação de quinonas e pigmentos de coloração escura resultantes da ação da PPO, presente

no extrato, sobre o substrato presente na solução tampão (catecol). Ao término do tempo de

acondicionamento, 800 µL de solução de ácido perclórico 0,2 N foram adicionados à mistura

para que a reação da PPO fosse paralisada. Essa mistura final foi centrifugada a 5000 rpm por

5 min e o sobrenadante submetido à leitura em espectrofotômetro a 395 nm (WISSEMANN et

al., 1980).

4.5 Análise de enzimas hidrolíticas de componentes da parede celular vegetal

4.5.1 Atividade da pectinametilesterase

O extrato para a análise da PME (PME; EC 3.1.1.11) foi obtido a partir de uma

adaptação do método proposto por Korner et al. (1980), onde o suco (5 g) foi homogeneizado

em 20 mL de solução de NaCl 0,2 M gelada e filtrado em papel de filtro. O filtrado foi

utilizado como extrato para a análise de atividade dessa enzima e o conteúdo total de

proteínas foi determinado segundo a metodologia de Bradford (1976).

A atividade da PME foi determinada a partir da mensuração por titulometria da

quantidade de grupos carboxílicos livres formados como resultado da ação dessa enzima

sobre a pectina (substrato), de acordo com o método proposto por Kertesz (1955). Já que, os

grupos carboxílicos liberados em solução reduzem o pH da mesma. Dessa forma, 5 mL de

extrato enzimático foram adicionados a 30 mL de solução de pectina cítrica 1% em NaCl 0,2

20

M, pH 7,0. A solução final foi titulada com NaOH 0,1 M até que o pH da mesma se

mantivesse em 7,0 ± 0,09 por 10 min. Uma unidade de atividade dessa enzima é definida

como a quantidade de enzima capaz de desmetilar pectina correspondendo ao consumo de 1

mol de NaOH.min-1

.g de massa fresca, sendo a média representada como UAE.mg de

proteína-1

.

4.5.2 Atividade da poligalacturonase

Inicialmente, 12,5 g de suco foram homogeneizados com 25 mL de água destilada

gelada e, em seguida, foram centrifugados a 5000 rpm por 10 min a 4 °C. O sobrenadante foi

descartado e o precipitado foi ressuspenso em 10 mL de água destilada e submetido a uma

nova centrifugação nas mesmas condições da primeira. Esse passo foi repetido ainda uma

terceira vez, até que o sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspenso em NaCl 1 M,

e teve seu pH aferido para 6,0 por meio de adição de solução de NaOH 1M, sendo então

mantido em repouso a 4 °C por 1 h. Ao final desse período, a solução foi submetida a uma

nova centrifugação a 5000 rpm e 4 °C por 20 min. O sobrenadante resultante desse processo

foi separado como o extrato. O conteúdo total de proteínas foi determinado segundo a

metodologia de Bradford (1976).

A análise de atividade da poligalacturonase (PG, EC 3.2.1.15) baseia-se na

determinação da quantidade de açúcar redutor liberado em solução devido à atividade desta

enzima quando em um meio contendo condições ótimas de temperatura, pH e concentração de

substrato. Dessa forma, foram preparados dois ensaios. No primeiro ensaio, 3 mL de extrato

enzimático foram adicionados a 3 mL de água destilada, gerando uma solução final da qual

foi retirada uma alíquota (AR-1) de 1,5 mL para a determinação da concentração de açúcares

redutores pelo método do DNS. No segundo ensaio, 3 mL de extrato enzimático foram

adicionados a 3 mL de solução de ácido poligalacturônico 0,25% em tampão acetato de sódio

37,5 mM, pH 5,0. Essa solução foi mantida em banho-Maria a 30 °C por 3 h (condições para

que a enzima atue sobre seu substrato e libere açúcar em solução). Ao final, a reação da PG

foi interrompida por exposição à água em ebulição (100 o

C). Então, foi retirada uma alíquota

(AR-2) de 1,5 mL para a determinação da concentração de açúcares redutores pelo método do

DNS. A subtração do valor de AR-1 por AR-2 foi utilizado nos cálculos para determinação da

atividade média da poligalacturonase, a qual foi expressa µmol de açúcares redutores. min-

1.mg de proteína.

21

A determinação de açúcares redutores (AR) é realizada em meio alcalino, no qual os

açúcares redutores reduzem o ácido 3,5 dinitro salicílico (DNS) à ácido 3-amino-5-

nitrossalicílico, enquanto que, o grupamento aldeído é oxidado a ácido aldônico. O ácido 3-

amino-5-nitrossalicílico é um produto de cor laranja, sendo a intensidade da coloração

correspondente a concentração de AR (MILLER, 1959).

Para quantificar o conteúdo de açúcares redutores, 1,5 mL da amostra e 1000 µL do

reagente DNS foram homogeneizados em vortex e depois submetidos à água fervente (100

oC) por 5 min. A água fervente é necessária para que haja a reação de redução do DNS, a qual

só ocorre sob elevadas temperatura. Após o tempo de reação, o tubo de ensaio é

imediatamente transferido para banho de gelo para que a reação seja interrompida. Após a

solução ter atingido a temperatura ambiente, adiciona-se água destilada à mesma até um

volume final de 10 mL e, então, procede-se a medição em espectrofotômetro a 540 nm. O

cálculo da concentração de AR é feito com o auxílio de uma curva padrão preparada com

concentrações previamente estabelecidas de glicose e é dado em µg de AR.g de massa fresca

-1.

4.6 Análise dos dados

4.6.1 Cálculo da atividade residual

Os resultados de atividade de todas as enzimas analisadas foram expressos como

porcentagem (%) da atividade residual média, a qual é calculada a partir da razão entre o valor

médio de atividade específica (A) encontrado no suco para um determinado tempo de

tratamento e a atividade média específica inicial (A0) que representa a atividade no suco não

tratado, multiplicado por 100.

4.6.2 Cálculo de parâmetros cinéticos

Além da atividade residual, também foram calculados alguns parâmetros cinéticos da

atividade enzimática. Segundo Terefe et al. (2009), para alimentos processados, reações

enzimáticas de primeira ordem são comumente expressas pelos valores de k e D, onde k

representa a constante de inativação enzimática de primeira ordem (expressa em min-1

) e D é

o tempo (min) necessário para que uma enzima perca 90% de sua atividade. Esses parâmetros

podem ser estimados partir do gráfico do log (A/A0) sob determinada temperatura versus

tempo de exposição, onde o k corresponde à tangente desse gráfico e o D é a razão entre 2,303

22

e k (D = 2,303 / k). Dessa forma, a inativação enzimática à medida que a temperatura do meio

se eleva é acompanhada por um aumento no valor de sua constante de inativação e uma

redução no valor D.

23

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

Os tratamentos térmicos são utilizados para manter a estabilidade de produtos

alimentícios a fim de remover microorganismos e inativar enzimas, tais como as peroxidases

e as pectinases que poderiam deteriorar o produto final, reduzindo assim seu tempo de vida

útil (CORREIA et al., 2008). O tratamento térmico mostra-se eficiente na inativação de

enzimas pelo fato do calor promover a desnaturação de proteínas por modificação de sua

estrutura conformacional, evitando que o substrato chegue até o sítio ativo de sua respectiva

enzima (MARTÍNEZ et al., 2006). Porém, esse tipo de processamento também pode acarretar

perdas nutricionais e levar à inativação de compostos que, quando presentes, aumentam os

índices de qualidade e aceitação desses produtos, como é o caso dos antioxidantes

enzimáticos e não enzimáticos que atuam na eliminação de espécies reativas de oxigênio

(EROs), as quais depreciam a qualidade e o tempo de prateleira de alimentos de origem

vegetal. Todavia, não há relatos na literatura sobre os efeitos do tratamento térmico na

atividade de enzimas antioxidantes.

A Tabela 1 mostra os valores de atividade específica das enzimas analisadas nos sucos

que não foram submetidos a tratamento térmico (suco controle ou tempo zero), a qual serviu

de referência para o cálculo da atividade residual.

Tabela 1. Atividade específica de enzimas do suco de caju e graviola não tratados termicamente

Enzima Suco Atividade Específica

SOD

(UA.mg proteína-1

)

Caju 7,14 ± 0,03

Graviola 10,72 ± 0,04

APX

(µmol H2O2.min-1

.mg proteína)

Caju 0,60 ± 0,00

G-POD

(µmol H2O2.min-1

.mg proteína)

Graviola 0,02 ± 0,00

PPO

(UAE.min-1

.mg proteína)

Caju

Grviola

-

-

CAT

(µmol H2O2.min-1

.mg proteína)

Caju 74,00 ± 0,06

Graviola -

PME

(UAE. min-1

.mg proteína)

Caju 501,84 ± 32,1

Graviola 7128,15 ± 45,3

PG

(mol AR.min-1

.mg protein)

Caju 50,42 ± 3,02

Graviola 42,85 ± 2,07

(-): atividade não determinada.

24

5.1 Enzimas antioxidantes e responsáveis pelo escurecimento

5.1.1 Dismutase do superóxido

Dismutase do superóxido são metaloenzimas que apresentam um papel chave na

proteção contra o estresse oxidativo (MORAN et al., 2003; SANTOS et al., 2000). As Figuras

1(A e B) mostram os resultados de atividade da dismutase do superóxido nos sucos de caju e

graviola submetidos a tratamento térmico, respectivamente. No suco de caju, a SOD mostrou

uma resistência ao tratamento térmico, de modo que em 55 °C a atividade dessa enzima pouco

foi alterada, mantendo-se sempre com mais de 80% de sua atividade residual até o fim do

tratamento. A exposição a 65 °C provocou uma redução na atividade dessa enzima após 5 min

de tratamento, que se manteve por todo o experimento chegando a 45% de redução na

atividade residual ao final dos 30 min de exposição. Aos 75 °C há uma queda quase linear na

atividade da SOD nos 15 min iniciais de tratamento chegando a atividade residual a 61,5%. O

tratamento a 85 °C provoca as maiores perdas na atividade dessa enzima logo no início do

tratamento com perda de 63% após 1 min e após essa queda inicial, o aumento no tempo de

exposição a essa temperatura provoca uma relativa manutenção na atividade residual da SOD,

mostrando que a enzima do suco de caju apresenta uma elevada resistência a altas

temperaturas. Para corroborar com essa afirmação, a exposição desse suco a 95 °C resultou

em um decréscimo no primeiro minuto e depois, em uma recuperação e manutenção da

atividade até os 30 min, quando atingiu 74%.

Quando o suco de graviola foi submetido a uma temperatura de 55 °C, a atividade da

SOD decaiu no primeiro minuto seguido por um pico atingido 150% de atividade residual aos

5 min, depois do qual decaiu para 67%. Aos 65 °C houve uma redução na atividade da SOD

seguida de aumento aos 10 min para depois decair continuamente até atingir 6,7%, aos 30

min. Já aos 75 °C, a SOD do suco de graviola apresentou apenas 11% de sua atividade inicial

aos 5 min e foi completamente inativada após 10 min. Quando o suco foi exposto a 85 e 95

°C, a enzima em questão só resistiu ao primeiro minuto de tratamento, sendo totalmente

inativada após 3 min.

25

Figura 1. Atividade residual da SOD nos sucos de caju (A) e graviola (B) em relação ao tempo sob diferentes

temperaturas.

26

A Tabela 2 mostra os valores de alguns parâmetros cinéticos calculados para a

atividade da SOD após o tratamento térmico. A constante de inativação k reflete a propriedade

de inativação das enzimas de modo que, quanto maior for o seu valor, maior será a inativação.

Os valores de k foram muito baixos para a enzima proveniente do suco de caju em todos os

tratamentos, refletindo sua elevada estabilidade térmica. A SOD do suco de graviola não foi

inativada pelo tratamento a 55 °C (Figura 1B), mas os elevados valores de k em temperaturas

a partir de 65 °C mostram sua sensibilidade a esses tratamentos.

Tabela 2. Parâmetros cinéticos estimados para a inativação térmica da SOD em suco de de caju e graviola.

Temperatura (°C) Suco k (min-1

) D (min)

55 Caju 0,003 767,66

Graviola 0,003 767,66

65 Caju 0,044 52,34

Graviola 0,118 19,51

75 Caju 0,023 100,13

Graviola 0,359 6,41

85 Caju 0,009 255,88

Graviola 0,287 8,02

95 Caju 0,006 383,83

Graviola 0,262 8,79

Já o parâmetro D está relacionado com o tempo necessário para reduzir em 90% a

atividade enzimática inicial de modo que, quanto maior for o seu valor, mais lentamente a

enzima está sendo inativada. O valor D (767,66) do suco de caju tratado a 55 °C pode ser

associado ao baixo valor k indicando que dificilmente será inativada nessas condições. Aos 95

°C, os valores de D mostram que a SOD do suco de caju demoraria 383,8 min, enquanto a de

graviola demoraria 8,7 min para reduzir em 90% sua atividade. Então, como pôde ser visto a

SOD proveniente do suco de caju mostrou-se muito mais resistente ao tratamento térmico do

que a do suco de graviola e essa diferença pode ser devido às diferenças próprias de cada

espécie vegetal e à forma de preparo de cada suco, prensagem e homogeneização,

respectivamente. O suco de caju apresentou uma maior quantidade de partículas em

suspensão, o que pode ter contribuído para uma maior estabilidade térmica de suas enzimas,

uma vez que estas são protegidas pela presença de outras biomoléculas, tais como proteínas,

carboidratos e pectinas (WHITAKER, 1972).

Scalzo et al. (2004) analisando os efeitos do processamento térmico sobre os

antioxidantes presentes em suco de Citrus sinensis (L.) observaram que um tratamento a 80

27

°C por 6 min é capaz de reduzir significativamente os conteúdos de antioxidantes não

enzimáticos como o ácido ascórbico e antocianinas, além de promover uma redução na

capacidade antioxidante total. Na literatura não há relatos sobre temperatura ótima,

estabilidade térmica e comportamento cinético da SOD para que sejam comparados aos dados

encontrados nesse trabalho.

5.1.2 Peroxidases

A peroxidase (POD) é do grupo das oxidoredutases, sendo capaz de catalisar um

grande número de reações oxidativas que resultam em alterações de sabor e coloração de

frutos e seus derivados (VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981). Para evitar essas reações indesejáveis,

tratamentos térmicos capazes de inativar essas enzimas são usualmente empregados para a

preservação desses produtos alimentícios (WILLIAMS et al.,1986). As peroxidases são

geralmente consideradas as enzimas mais termoestáveis em plantas (KHAN et al., 1993).

Como consequência dessa termoestabilidade, elas têm sido amplamente usadas como um

indicador de tratamentos térmicos em alimentos processados (KHAN et al., 1993;

CLEMENTE, 2002).

A APX é a peroxidase mais importante na degradação do H2O2, catalisando a redução

dessa espécie reativa à água usando o poder redutor do ascorbato (NOCTOR E FOYER,

1998). A G-POD é uma isoforma de peroxidases que utiliza um composto fenólico como

agente redutor, o guaiacol (o-metoxifenol), para promover a degradação do H2O2. A oxidação

de compostos fenólicos resulta na formação de compostos de coloração escura (TAYEFI-

NASRABADI et al., 2011). Os sucos de caju e graviola foram avaliados quanto à atividade

das duas formas de peroxidases, porém a única encontrada no suco de caju foi a APX e no

suco de graviola, foi a G-POD. Então, a Figura 2 (A e B) mostra a atividade residual da

peroxidase do ascorbato no suco de caju e da peroxidase do guaiacol no de graviola.

28

Figura 2. Atividade residual da APX no suco de caju (A) e G-POD no suco de graviola (B) em relação ao tempo

sob diferentes temperaturas.

29

No suco de caju, a atividade residual da peroxidase do ascorbato sofreu um declínio

em sua atividade residual logo no primeiro minuto de todos os tratamentos aplicados e depois

voltou a aumentar principalmente a 55 °C atingindo menos de 80% ao final dos 30 min. As

demais temperaturas testadas tenderam a reduzir atividade por até 20 min, então quando se

pôde observar um novo aumento. Esses resultados indicam que a temperatura mais baixa

utilizada estimulou a APX e que as demais temperaturas inicialmente a reduziram, porém ao

final, isoformas mais resistentes foram ativadas.

No suco de graviola, o tratamento a 55 °C promoveu uma redução lenta na atividade

residual da G-POD, a qual manteve apenas 54,1% de sua atividade residual após 30 min. As

temperaturas igual e acima de 65 °C provocaram uma drástica queda na atividade logo no

primeiro minuto de tratamento levando à inativação dessa enzima, apesar desta ser

considerada pela literatura como uma enzima termoresistente.

A atividade da G-POD não foi detectada em suco de caju, o que sugere que possíveis

alterações na coloração devido a reações que provocam escurecimento não se devem à ação

dessa enzima. Damasceno et al. (2008) concluíram que o escurecimento observado em suco

de caju durante seu armazenamento pós-tratamento térmico era devido à degradação da

vitamina C e não à ação enzimática.

Um outro estudo mostrou que diferentes temperaturas de pasteurização reduziram a

atividade de peroxidases na polpa de graviola (TEIXEIRA et al., 2006). Após um segundo a

70 °C, a atividade residual dessa enzima caiu para 57,4% chegando até 27,4%, após 5 min.

Nesse mesmo trabalho, a aplicação de temperaturas mais elevadas não resultou em menores

atividades e, apesar da pasteurização acima de 80 °C não ter inativado a peroxidase na polpa

de graviola, os autores consideraram o tratamento aplicado como bastante eficiente na

conservação desses produtos. Esses resultados mostram que a peroxidase na polpa de graviola

mostrou-se muito mais resistente a elevadas temperaturas do que as formas presentes no suco

aqui analisado. Essa diferença de resultados pode ser devido ao processamento que desintegra

a estrutura dos tecidos e/ou à ação de diferentes isoformas de peroxidases que podem

apresentar diferentes estabilidades térmicas. Há uma grande variedade de isoformas dessa

enzima em plantas superiores, onde mais de 40 genes são codificadores de isoperoxidases e

várias outras isoformas podem ser geradas por modificações pós-transcricionais e pós-

traducionais (DE MARCO et al., 1995; WELINDER et al., 1996).

Freitas et al. (2008) relataram que o tratamento térmico de sucos de uvas das

variedades „Benitaka‟ e „Rubi‟ resultou em decréscimo na atividade da POD, porém o

30

comportamento de inativação foi não linear. Assim, a maior inativação enzimática foi obtida

na temperatura de 85 °C e com tempo de exposição de 10 min. No entanto, observou-se que

os tratamentos térmicos utilizados não foram suficientes para a total inativação dessa enzima.

Valderrama et al. (2001) observaram um comportamento similar a esse quando estudaram

essa enzima em maçãs. A peroxidase de suco de cenoura apresentou uma alta

termoestabilidade mantendo-se ativa mesmo após 150 min de exposição a 70 °C (JAKOB et

al., 2010)

A atividade de peroxidases de extratos de couve-flor (Brassica oleracea var. Botrytis)

submetidos a tratamento térmico manteve-se em 100% mesmo após uma exposição por 30

min a 50 °C (RAYAN et al., 2011). Quando a temperatura aumenta para 85°C, a atividade cai

para 11,6% restando apenas 2,1%, a 100 °C. Um trabalho com suco de laranja mostrou que a

peroxidase era quase completamente inativada em temperaturas acima de 62 °C (HIRSCH et

al., 2008). Esses resultados se assemelham aos apresentados aqui com o suco de graviola.

Anthon et al. (2002) também observaram que a peroxidase de suco de tomate CXD 199 foi

rapidamente inativada a 72 °C, apresentando uma menor estabilidade térmica do que PME e

PG desse mesmo suco.

Publicações anteriores descreveram uma forte influência do pH do extrato enzimático,

além da temperatura, sobre a estabilidade térmica das peroxidases (MCLELLAN et al., 1995;

CLEMENTE et al., 1995; CLEMENTE, 2002). De modo que há uma inativação total das

POD quando em pH 3,5 e expostas a temperaturas acima de 76 °C por 30 s. Abbo et al.

(2006) observaram um aumento na acidez de sucos de graviola após um processo de

pasteurização. Isso pode explicar a baixa resistência térmica da G-POD encontrada aqui no

suco de graviola que resultaria do fato de o tratamento térmico promover uma redução no pH

do meio propiciando uma desestabilização de tais enzimas.

A Tabela 3 mostra os resultados encontrados para os parâmetros cinéticos avaliados da

APX do suco de caju e da G-POD do suco de graviola. Apesar da queda inicial na atividade

residual (Figura 2A) e de acordo com o valor de k inexistente, não houve inativação da APX

no suco de caju tratado a 55 °C. Os demais tratamentos também não chegaram a inativar essa

enzima durante o período de tempo utilizado nesse experimento, o que seria bom para a

preservação do suco de caju (NOCTOR E FOYER, 1998). Para o suco de graviola, os valores

de k aumentam com as temperaturas testadas e de modo que, a 95 oC, o valor de D indica que

a atividade inicial da G-POD é reduzida em 90% após 9,75 min, nessas condições.

31

Tabela 3. Parâmetros cinéticos estimados para a inativação térmica da APX do suco de caju e da G-POD do

suco de graviola.


) D (min)

55 Caju - -


65 Caju 0,014 164,50


75 Caju 0,021 109,66


85 Caju 0,073 31,54


95 Caju 0,037 62,24

Graviola 0,236 9,75

Os elevados valores de constante de inativação refletem a baixa estabilidade térmica

da G-POD no suco de graviola. Uma rápida inativação dessa enzima também foi observada

por Anthon et al. (2002) ao analisarem POD de suco de tomate das cultivares CXD 199 e

BOS 3155 tratados a 70 °C, onde encontraram valores para k de 0,026 e 0,032 s-1

e para D de

1,5 e 1,2 min, respectivamente. Segundo esses autores, os resultados observados foram

surpreendentes, uma vez que a POD é uma das enzimas mais termoestáveis encontradas em

frutas e legumes.

Os efeitos do tratamento térmico a 66 °C também já foram analisados sobre PODs

provenientes de suco de brócolis, cenoura e batata. Foi observado que há duas isoformas

dessa enzima em brócolis, as quais diferem quanto a sua constante de inativação (k 0,264 e

0,015 min -1

). Já o suco de cenoura apresentou quatro isoformas de POD, para as quais o k

sobre essa temperatura foi 3,48; 3,78; 0,0051 e 0,254 min -1

. No suco de batata também foram

observadas quatro isoformas dessa enzima com valores de k de 42,52; 12,68; 0,0064 e 8,29

min -1

. O conhecimento desse parâmetro cinético, o qual reflete a diferença na estabilidade

térmica dessas isoformas, pode ser útil na escolha de um tratamento térmico mais eficiente no

sentido de inativar completamente a POD (POLATA et al., 2009).

5.1.3 Polifenoloxidase

Não foi detectada atividade da polifenoloxidase nos sucos analisados neste trabalho, o

que pode ser devido à ausência dessa enzima em caju e graviola, à desnaturação decorrente do

preparo dos sucos ou ao método de análise empregado. De acordo com Murasaki (2005) a

32

determinação precisa da PPO é um desafio, o que pode ser constatado nos numerosos

métodos descritos na literatura. Isto devido as quinonas formadas durante o curso da reação

enzimática, proveniente de reações secundárias, substratos não reagentes, oxigênio e outros

constituintes da enzima. Estas reações levam à formação de moléculas poliméricas complexas

interferindo na análise. A existência de outras enzimas com propriedades similares, tais como

peroxidases, podem causar erro na medida da atividade da PPO.

A PPO pode funcionar como um mecanismo de defesa que é ativado quando vegetais

e seus derivados são submetidos a condições de estresse. Em um trabalho com suco de caju,

Queiroz et al. (2011) observaram que houve um aumento de cinco vezes na atividade da PPO

após um período de 24 h a 27 °C e um aumento de apenas duas vezes após 24 h a 40 ° C,

mostrando um efeito negativo da temperatura sobre a atividade dessa enzima. Já Zhao et al.

(2005) relataram um aumento na atividade de enzimas relacionadas a condições de estresse,

inclusive da PPO, em mudas de pepino (Cucumis sativus L.) após estresses simultâneos.

Aquino-Bolaños e Mercado-Silva (2004) observaram uma ativação da PPO em extratos de

(Pachyrizus erosus L. Urban) após danos mecânicos e armazenamento a 20 °C.

A estabilidade térmica e as propriedades térmicas da PPO têm sido citadas em

diversos trabalhos. O problema é que, em alguns são realizadas análises em condições

experimentais diferentes, para estudar características das enzimas, em outros, o estudo é sobre

diferentes procedimentos de extração e purificação e, portanto torna-se difícil uma

comparação direta entre os resultados obtidos (WEEMAES et al., 1998).

5.1.4 Catalase

A catalase é uma enzima que converte o H2O2 em H2O e O2 e é considerada umas das

enzimas antioxidantes mais ativas em produtos vegetais (BREUSEGEM et al., 2001). O suco

de graviola preparado nesse trabalho não apresentou atividade significativa dessa enzima,

portanto a Figura 3 mostra a atividade residual da CAT somente no suco de caju submetido a

diferentes temperaturas.

Houve uma grande variação na atividade residual da CAT no decorrer dos tratamentos

aplicados, ficando mais fácil explicar o comportamento dessa enzima através de seus

parâmetros cinéticos (Tabela 4). Os baixos valores de k observados indicam uma elevada

estabilidade térmica dessa enzima, apesar de quedas em sua atividade residual (Figura 3) e

como pode ser observado pelos valores de D que, aos 55 °C é 329 min e a 95 °C, cai para 95,9

min.

33

Figura 3. Atividade residual da CAT em suco de caju sob diferentes temperaturas, em relação ao tempo.

Os resultados sugerem que nesse suco há mais de uma isoforma de CAT com

diferentes resistências às temperaturas aplicadas, o que explicaria a variabilidade observada

na atividade residual. De acordo com Scandalios et al. (1997), catalases são homoproteínas

tetraméricas que existem como múltiplas isoenzimas codificadas por genes nucleares. Não há

relatos de estudos relacionados à atividade e/ou ao comportamento cinético da CAT sob

tratamento térmico para que sejam comparados aos obtidos nesse trabalho.

Tabela 4. Parâmetros cinéticos estimados para a inativação térmica da catalase em suco de caju.

Temperatura (°C) k (min-1

) D (min)

55 0,007 329,00

65 0,008 287,87

75 0,028 82,25

85 0,019 121,21

95 0,024 95,95

34

5.2 Enzimas hidrolíticas de componentes da parede celular

Uma das características físicas mais importantes em sucos de frutas é sua turbidez e,

portanto, é um dos principais alvos dos tratamentos de conservação como o tratamento

térmico que objetiva a inativação das enzimas hidrolíticas de componentes da parede celular

(RIVAS et al., 2006). Enquanto, a PME catalisa a desesterificação da pectina liberando ácido

péctico com menor grau de esterificação, a PG catalisa a clivagem hidrolítica das ligações 1-

4 do ácido péctico acarretando na perda de viscosidade e na separação de fases durante o

armazenamento de sucos. Assim, essas enzimas atuam em conjunto, uma vez que o produto

da reação da PME serve como substrato para a ação da PG (FACHIN et al., 2003).

5.2.1 Pectinametilesterase

A Figura 4 (A e B) mostra os resultados de atividade residual obtidos após os

tratamentos térmicos aplicados em sucos de caju e graviola para pectinametilesterase. A PME

de suco de caju mostrou-se termorresistente como pode ser observado pelo tratamento a 55 °C

que aumentou a atividade da PME em até 10 vezes. As temperaturas de 65 e 85 °C também

resultaram em aumento no primeiro minuto de exposição e então decaindo até o final do

experimento quando voltaram a aumentar. Os demais tratamentos não provocaram alterações

significativas na atividade da PME em relação a sua atividade no suco não tratado. Esses

resultados sugerem que a PME do suco de caju apresenta uma elevada temperatura ótima de

atividade. Em goiabas, a temperatura ótima de atividade dessa enzima varia de 75 a 85 °C

(LEITE et al., 2006).

35

Figura 4. Atividade residual da PME nos sucos de caju (A) e graviola (B) em relação ao tempo sob diferentes

temperaturas.

36

A PME proveniente do suco de graviola se apresentou pouco susceptível ao

aquecimento. Todas as temperaturas de tratamento reduziram a atividade da PME de graviola

no primeiro minuto e depois se seguiu uma estabilidade pelos 30 min de exposição.

Inicialmente, a 55 °C, a atividade residual dessa enzima decaiu em 15% enquanto a 85 e 95

°C, a atividade decaiu aproximadamente em 30%. O tratamento a 95 °C apresentou a maior

redução na atividade da PME em suco de graviola atingindo quase 39% após 30 min.

Resultados semelhantes aos observados para o suco de caju foram encontrados por

Leite et al. (2006) em um estudo com goiabas (Psidium guajava L., cv. Paluma), onde

observou-se que a atividade da PME aumentou após 30 min de exposição a 75 °C e

permaneceu significativamente alta mesmo após 8h a 90 °C. Segundo os autores, esse

comportamento é possível devido à liberação de enzimas que poderiam formar complexos

com substâncias reguladoras e/ou inibidoras. Além disso, a elevada atividade da PME sob

altas temperaturas nessa espécie pode estar sendo promovida pela associação dessa enzima a

outras biomoléculas que lhe conferem termoestabilidade.

Esses resultados mostram que a inativação da PME após o aquecimento dos sucos de

caju, e mesmo o de graviola, está muito aquém da necessária em termos de conservação e

manutenção de atributos de qualidade como viscosidade e turbidez esperados por esse tipo de

tratamento, sugerindo que temperaturas mais elevadas ou por períodos mais longos seriam

mais eficientes para esse intuito. Um estudo com a PME de cinco cultivares de tomate

mostrou que uma delas tinha elevada estabilidade térmica e isso explicaria a perda de

consistência de alguns produtos industriais derivados de tomate durante o armazenamento

(LARATA et al., 1995). Macdonald et al. (1997) isolaram quatro isoformas de PME de limão

e observaram que uma delas apresentava uma alta estabilidade térmica mantendo a sua

atividade mesmo após ser mantida a 86 °C por 9 min. Os autores atribuíram a desestabilização

do suco de limão à termoestabilidade desta isoforma. Já Cameron e Grohmann (1996),

estudando isoformas de PME de suco cítrico, observaram que uma das isoformas era mais

termoestável, mantendo 49,2% de sua atividade inicial após 1 min a 95 °C.

Outros resultados de atividade residual que se contrapõem aos encontrados nesse

estudo foram observados com a PME de acerola (Malpighia emarginata DC.) reduzida em

90% após 2 min, a 106 °C (ASSIS et al., 2000). Javeri e Wicker (1991) também relataram

que a PME de pêssego (Prunus pérsica L.) perde 77% de sua atividade quando incubada por 5

min a 65 °C e é completamente inativada após 5 min, a 70 °C. Rivas et al. (2006) observaram

que a atividade da PME em um suco preparado com laranja e cenoura (80% e 20%,

37

respectivamente) decaiu para 2% após um tratamento a 98 °C por 21 s. Seymour et al. (1991)

isolaram duas isoformas de PME de toranja (Citrus paradis) e verificaram que elas diferiam

em relação à quantidade de carboidratos a elas associados. Com a remoção desses

carboidratos, houve uma diminuição da estabilidade térmica, sugerindo que essas moléculas

contribuem para a estabilidade térmica da PME. Isso poderia explicar as diversas variações

citadas em relação à estabilidade térmica da PME.

Além das isoformas, outros fatores que podem fazer com que haja divergência de

resultados é o pH e o grau de purificação das amostras contendo a enzima. Sentandreu et al.

(2005) relataram atividade residual da PME de 1 a 4% em diversos sucos cítricos após um

aquecimento contínuo a 85 ou 90 °C por 10 s. Uma redução no pH dos sucos pode levar a um

aumento na sensibilidade térmica da PME, o que pode contribuir para uma variação em sua

atividade (ROUSE et al., 1952). Em um estudo com tomates, Fachin et al. (2002)

demonstraram que a PME purificada pode ser mais termoestável do que aquela proveniente de

um extrato bruto. Porém, o uso dessa enzima na indústria de alimentos como indicador de

tratamento térmico requer uma análise sem etapas prévias de purificação, uma vez que é o

comportamento desses extratos brutos provenientes do suco processado que possuem maior

relevância.

A Tabela 5 mostra os resultados obtidos para os parâmetros cinéticos da PME presente

nos sucos de caju e graviola. Como já foi dito anteriormente (Figura 4A), a PME oriunda do

suco de caju mostrou-se muito resistente ao tratamento térmico e isso também pôde ser

comprovado pelos valores dos dados cinéticos encontrados. De acordo com a constante de

inativação que foi inexistente, a PME não será inativada a 55 e 65 °C e a partir dessas

temperaturas, a inativação pode ocorrer, porém lentamente. Os parâmetros cinéticos do suco

de graviola também indicam que essa enzima foi pouco afetada pelo tratamento térmico

aplicado, sendo necessários 109,6 min a 90 °C para reduzir em 90% sua atividade.

38

Tabela 5. Parâmetros cinéticos estimados para a inativação térmica da pectinametilesterase de sucos de caju e

graviola.


) D (min)

55 Caju - -

Graviola 0,012 191,91

65 Caju - -

Graviola 0,013 177,15

75 Caju 0,018 127,94

Graviola 0,018 127,94

85 Caju 0,011 209,94

Graviola 0,016 143,93

95 Caju 0,019 106,84

Graviola 0,021 109,66

A cinética de inativação térmica da PME já foi bem estudada em produtos à base de

tomate, havendo uma variação significativa na literatura entre os valores encontrados para

esses parâmetros. Em análise de PME de suco de tomate submetido a tratamentos sob

diversas temperaturas, Terefe et al. (2009) encontraram valores de constante de inativação

entre 0,026 min-1

a 60 °C e 0,57 min-1

a 75 °C, os quais correspondem a valores D de 89 e

4,04 min, respectivamente. A inativação da PME alcançada para esse suco de tomate a 60 °C

só é conseguida para o suco de graviola a 95 °C (k = 0,021 min-1

), o que reflete a elevada

estabilidade térmica dessa enzima em graviola. Raviyan et al. (2005) encontraram valores D

que variaram de 1,5 a 36,4 min em estudos de inativação da PME a 70 °C, um valor muito

mais baixo do que foi encontrado neste trabalho para os sucos de caju e graviola, o que reflete

a alta estabilidade térmica dessa enzima nesses dois sucos. Anthon et al. (2002) relataram

valores D de 7,2 e 10,4 min para a inativação térmica a 70 °C de PME em suco de tomate para

as cultivares BOS 3155 e CXD-199, respectivamente. Nos sucos de caju e graviola aqui

analisados, os valores a 75 °C foram maiores indicando que seria necessário um tempo dez

vezes maior para atigir o mesmo nível de inativação.

Vários fatores podem ser responsáveis pelas discrepâncias observadas entre os valores

cinéticos citados. Alguns estudos trataram da inativação da PME em sucos ou purês de frutas,

enquanto que outros realizaram o experimento sob elevadas temperaturas utilizando extratos

enzimáticos ou suspensões dessa enzima em tampões com diferentes valores de pH.

Tajchakavit et al. (1997) constataram que a PME de suco de laranja é estabilizada contra a

desnaturação pelo calor por um aumento nos valores de pH e teor de sólidos solúveis totais.

Anthon et al. (2002) observaram que a redução do pH de suco de tomate de 4,36 para 4,

promove um aumento de 4 vezes na constante de inativação da PME a 71,8 °C, ou seja,

39

quanto menor o valor do pH da solução, menor é a estabilidade térmica dessa enzima. A

cinética de inativação da PME também já foi determinada em extratos purificados e

parcialmente purificados. Em geral, uma enzima é mais estável em tecido intacto ou em um

homogeneizado de tecido, onde é protegida pela presença de outros materiais, tais como

proteínas, carboidroatos e pectinas, do que em sua forma purificada (WHITAKER, 1972).

Lopez et al. (1997) mediram a inativação dessa enzima em uma preparação parcialmente

purificada em tampão citrato a pH 4 e encontraram um valor D a 70 °C de 1,53 min,

refletindo a alta sensibilidade térmica da PME nesse tipo de extrato.

5.2.2 Poligalacturonase

Os resultados do tratamento térmico sobre a atividade da poligalacturonase estão

apresentados nas Figuras 5A e 5B para os sucos caju e graviola, respectivamente.

No suco de caju, as temperaturas de 55 e 65 °C promoveram um aumento na atividade

da PG nos 3 e 1 min iniciais, respectivamente. Após esses picos as atividades decaíram

continuamente. Acima de 75 oC, observa-se uma queda gradual e lenta na atividade da PG

chegando a 40% após 30 min a 85 e 95 oC. Os resultados encontrados para a PG se

assemelham aos encontrados para a PME de suco de caju (Figura 4A), quando as

temperaturas mais baixas estimularam a atividade de modo geral.

40

Figura 5. Atividade residual da PG nos sucos de caju (A) e graviola (B) em relação ao tempo sob diferentes

temperaturas.

41

A PG do suco de graviola apresentou um decréscimo na atividade residual logo no

primeiro minuto de exposição a todas as temperaturas testadas, sendo esse efeito mais

acentuado a 75 °C quando a atividade residual chegou a 20% seguido por um aumento. Após

essa queda inicial, as atividades apresentavam uma constância na atividade até o final do

período de 30 min quando voltavam a cair, com excessão das temperaturas de 55 e 65 °C que

apresentavam oscilações. A 85 e 95 °C, a PG do suco de graviola mostrou uma maior

sensibilidade apresentando atividade residual de 26 e 18% após 30 min, respectivamente,.

Fachin et al. (2003) analisaram a atividade da poligalacturonase em suco de tomate

submetido a temperaturas entre 40 e 90 °C por 5 min e observaram duas fases de inativação, a

primeira em torno de 55 °C e a segunda aos 65 °C. Isso sugere a presença de isoenzimas de

PG com diferentes termoestabilidades. Segundo esses autores, entre 55 e 65 °C a atividade

residual dessa enzima manteve-se entre 60 e 80% devido a presença da PG1, a qual é

termoestável. Anthon et al. (2002) estudaram a cinética de inativação da PG em sucos de

tomates CXD199 e observaram que a isoforma termoestável, PG1, mantinha-se ativa com

15% da atividade inicial quando o suco era exposto a 85 °C, enquanto que a PG2 foi

completamente inativada a 75 °C. A presença dessas isoformas com diferentes estabilidades

térmicas poderia explicar o efeito dos tratamento acima de 65 °C sobre a PG do suco de

graviola, onde a queda na atividade da isoforma menos estável, PG2, seria responsável pela

redução na atividade residual observada no primeiro minuto de tratamento. A isoforma PG1,

mais resistente a elevadas temperaturas, seria responsável pela atividade remanescente até o

fim do tratamento.

Resultados contrários e que sugerem a existência de isoformas menos resistentes ao

calor foram encontrados por Hsu (2008) que analisou o efeito do processamento térmico em

suco de tomate e observou que a PG manteve apenas 12% de sua atividade após 2 min a 60

°C. Já Crelier et al. (2001) observaram uma completa inativação da PG após 3 min de

exposição a 93 °C.

A Tabela 6 mostra os resultados obtidos para os parâmetros cinéticos k e D da PG nos

sucos de caju e graviola tratados termicamente. Os resultados mostram a estabilidade térmica

da PG do suco de caju, a qual apresentou valores de constante de inativação baixos em todos

os tratamentos aplicados. Aos 55 °C, a atividade da PG do suco de caju apresentou um valor

de k de 0,010 min -1

e demoraria 230,3 min para reduzir em 90% sua atividade. Os valores de

k e D encontrados mostram que nenhum dos tratamentos aplicados foi capaz de inativar

42

completamente a PG em ambos os sucos, ratificando os resultados obtidos na análise da

atividade residual (Figura 5A e B).

Tabela 6. Parâmetros cinéticos estimados para a inativação térmica da PG em sucos de caju e graviola.


) D (min)

55 Caju 0,010 230,30


65 Caju 0,041 56,17


75 Caju 0,036 60,60


85 Caju 0,035 65,80


95 Caju 0,050 46,09


Há uma grande variação na literatura para os dados cinéticos de inativação térmica da

PG. Em relação àqueles encontrados para sucos de caju e graviola, valores de constante de

inativação mais elevados e que sugerem uma maior sensibilidade térmica dessa enzima foram

encontrados por Terefe et al. (2009). Esses autores avaliaram o suco de tomate da variedade

„Heinz 3402‟ e observaram que a constante de inativação da PG variou de 0,085 min-1

a 60 °C

para 0,57 min-1

a 75 °C com os valores de D variando de 11,7 a 1,75 min. Fachin et al.

(2002), também estudando produtos à base de tomate, encontraram um valor D de 3,99 min

em extrato parcialmente purificado em tampão acetato de sódio (pH 4,4) tratado a 70 °C,

enquanto que no suco sob a mesma temperatura o D encontrado foi 0,78 min. Em outro

estudo de inativação térmica da PG em suco de tomates da variedade Flandria Prince, Fachim

et al. (2003) observaram que a constante de inativação para essa enzima aumentava com o

aumento da temperatura, apresentando valores de 0,0003 min-1

a 55 °C e 0,0035 min-1

a 65

°C, chegando a 0,013 min-1

a 70 °C. Crelier et al. (2001), estudando a cinética de atividade da

PG em suco de tomate da variedade Nema 1401, também encontraram valores de k que

aumentaram com a temperatura de tratamento: 0,0004; 0,0012; 0,0019; 0,0031 e 0,0131 min-1

a 80, 85 90, 97 e 105 °C, respectivamente. A partir desses baixos valores de constante de

inativação, podemos observar que a PG proveniente do suco de tomate da variedade Nema

1401 mostrou-se mais resistente à elevadas temperaturas do que àquelas estudadas nos sucos

de graviola, caju e demais variedades de tomate citadas.

Esses resultados variáveis não são incomuns, uma vez que a estabilidade das enzimas

depende de vários fatores, tais como a fonte, pH e a composição da solução onde está

43

inserida. Pressey (1986), analisando a atividade da PG em purê de tomate, o qual apresenta

uma elevada quantidade de partículas sólidas em suspensão, encontrou uma constante de

inativação de 0,0031 min-1

após um tratamento a 90 °C, a qual é aproximadamente três vezes

menor que a observada por Lopez et al. (1997) (k = 0,009 min-1

) após tratar um extrato

parcialmente purificado em tampão citrato (pH 4) sob a mesma temperatura, indicando que a

PG foi mais estável quando em contato com substâncias oriundas do tecido vegetal do que

quando isolada.

44

6 CONCLUSÕES

De modo geral, as enzimas provenientes do suco de caju mostraram-se mais

termorresistentes do que aquelas provenientes do suco de graviola, o que indica que a

composição do suco influencia em sua termoestabilidade.

Em suco de caju, o tratamento a 75 °C por 30 min se mostrou como o melhor levando

em consideração apenas a atividade residual. Nessas condições, ocorreu a inativação da PME

em torno de 30% e da PG em 36%, todavia manteve a atividade residual das enzimas

antioxidantes SOD, APX e CAT. Nesse suco, a PME foi a enzima mais resistente a elevadas

temperaturas, apresentando mais de 100% de sua atividade residual após 30 min a 95 °C,

seguida pela CAT (74,14%), SOD (74%), APX (56,97%) e PG, 44%. Nenhum dos

tratamentos aplicados foi capaz de inativar completamente as enzimas citadas.

Para o suco de graviola, o tratamento a 55 °C por 30 min mostrou-se o mais eficiente

em reduzir a atividade residual das enzimas G-POD, PME e PG, sem causar fortes

depreciações na atividade da SOD. A PME foi a enzima com maior termoestabilidade

também no suco de graviola, permanecendo com 61% de sua atividade residual mesmo após

30 min de tratamento a 95 °C, seguida pela PG (18%). G-POD e SOD foram as menos

estáveis, sendo que a peroxidase foi a enzima mais sensível dentre as analisadas.

45

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