UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ DEPARTAMENTO DE … · Aos amigos Felipe, Matheus, Claudinha, Geo e...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

TICIANE CAVALCANTE DE SOUZA

USO DE BAGAÇO DE CAJU COMO SUPORTE PARA A IMOBILIZAÇÃO DE

LIPASE DO TIPO B DE Candida antarctica: APLICAÇÃO NA SÍNTESE DE R-

INDANOL

FORTALEZA – CE

2016

TICIANE CAVALCANTE DE SOUZA

USO DE BAGAÇO DE CAJU COMO SUPORTE PARA A IMOBILIZAÇÃO DE

LIPASE DO TIPO B DE Candida antarctica: APLICAÇÃO NA SÍNTESE DE R-

INDANOL

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Engenharia Química, do Centro de

Tecnologia da Universidade Federal do

Ceará, como requisito parcial para

obtenção do grau de Mestre em

Engenharia Química.

Orientadora: Profª. Drª. Luciana Rocha

Barros Gonçalves

Co-orientador: Prof. Dr. José Cleiton

Sousa dos Santos

FORTALEZA – CE

2016

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

Universidade Federal do Ceará

Biblioteca de Pós-Graduação em Engenharia - BPGE

S719u Souza, Ticiane Cavalcante de. Uso de bagaço de caju como suporte para a imobilização de lipase do tipo B de Candida

antarctica: aplicação na síntese de R-indanol / Ticiane Cavalcante de Souza. – 2016.

159 f. : il. color. enc. ; 30 cm.

Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Ceará, Centro de Tecnologia, Departamento de

Engenharia Química, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Fortaleza, 2016.

Área de Concentração: Processos Químicos e Bioquímicos.

Orientação: Profa. Dra. Luciana Rocha Barros Gonçalves.

Coorientação: Prof. Dr. José Cleiton Sousa dos Santos.

1. Engenharia química. 2. Enzimas. 3. Biocatalisadores. 4. Síntese orgânica. I. Título.

CDD 660

A minha mãe, Maria Auxiliadora.

AGRADECIMENTOS

É difícil agradecer a todas as pessoas que nos momentos mais calmos e ou

receosos, fizeram- se presentes colaborando direta ou indiretamente para que tudo desse

certo, à todos vocês sou grata de coração.

Agradeço à Deus por me ajudar em todos os momentos, pela força e fé de que no

final tudo daria certo e por mostrar que caminhos difíceis nos reservam boas

recompensas.

À minha mãe, Maria Auxiliadora, pelo exemplo de mulher. Por sempre estar ao

meu lado, pelos conselhos, por todo incentivo nas horas de cansaço, pela dedicação e

amor. Por estar sempre presente e compartilhar dos momentos de dúvida e insegurança.

A você mãe, todo o meu amor e admiração, sem a senhora eu não saberia seguir!

À minha avó, Maria Tereza, pela dedicação, carinho, atenção, por entender

minha ausência, pelo amor lindo que recebo e por ser essa mulher importante e única

para mim.

À minha irmã Camila Cavalcante, em que me espelhei vendo- a exausta nos

estudos e firme no propósito em ser melhor no que faz, das incabíveis noites sem

dormir, na mulher forte em que é mesmo não sabendo disso... Você me orgulha!

Ao meu Pai, Agricio Almeida, por sempre ter acreditado que eu seria capaz e

por ter me mostrado do seu jeito que eu poderia ir aonde desejasse.

Ao amigo Erivan, pela palavra amiga sempre!

Aos amigos Felipe, Matheus, Claudinha, Geo e Nay Lacerda, pelos conselhos,

apoio, atenção, força, sabedoria, pelo encorajamento e por todos os fins de semana em

que compartilhamos de muitas conversas, risos e conhecimentos. Obrigada por sempre,

sempre, sempre estarem comigo e sempre entender minha ausência em muitos

momentos.

À professora Luciana Rocha Barros Gonçalves, em especial, agradeço a

orientação, oportunidade, confiança, por acreditar no meu trabalho e pelo crescimento

profissional. Muitíssimo obrigada professora!

À profª Valderez Ponte Rocha, pelos conselhos, atenção, pelas experiências

compartilhadas e confiança no meu trabalho.

À Kênia Franco, uma grande amiga e profissional, que ensinou com tanto zelo,

compartilhando suas experiências, conhecimentos e amizade.

Ao Cleiton Sousa, pela co-orientação, pelo conhecimento partilhado, pelo

esforço, paciência, confiança e por sempre me dizer: não te preocupas, vai dá certo!

Aos amigos que conquistei no GPBio, Nathália, Maísa, Andro, Brena, Bruna,

Carlinha, Cris Rabelo, Cris, Ed, Fátima, Italo, Joucy, Tiago, Ju Rabelo, Juh Serpa,

Manel, Kimberly, Márcia, Rayanne, Lucas e todos que fazem o GPBio uma grande

família, muitíssimo obrigada!

Em especial agradeço amigas Camis, Mary, Kamys, Jeca e Joça, obrigada de

verdade. Vocês foram exemplos diários dados a mim. Obrigada pela amizade, pelos

momentos de descontração, ajuda, pelas altas horas juntas no laboratório, pelas dúvidas,

conselhos, amizade, pelo zelo. Vocês fizeram a diferença todos os dias!

Ao Bruno Sousa e Thiago Fonseca, pela disposição em ajudar sempre.

Aos funcionários do Departamento, mas não poderia deixar de mencionar, ao

Seu Luíz, Danilo e Jorjão, sempre muito atenciosos.

À Universidade Federal do Ceará e ao Departamento de Engenharia Química por

possibilitar a realização deste trabalho e pelo Título de Mestre.

À CAPES, pelo apoio financeiro.

“A ciência nunca resolve um problema sem criar pelo menos

outros dez.”

George Bernard Shaw

“É tudo uma questão do quanto você deseja e o que está

disposto a fazer para conseguir”

Rafael Magalhães

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RESUMO

O bagaço de caju (CAB), um resíduo agroindustrial, foi utilizado como suporte para o

processo de imobilização da lipase do tipo B de Candida antarctica (CALB). Após

tratamento com peróxido de hidrogênio em meio alcalino (AHP), o CAB - AHP foi

funcionalizado com glicidol (GLI), epicloridrina (EPI), glicidol – etilenodiamina-

glutaraldeído (GEG) 5% e 10%, e em seguida, caracterizados através das análises de

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e Infra Vermelho com Transformadas de

Fourier (FTIR). Os biocatalisadores produzidos a pH 10 (25 mM, 25 °C, 0,5% de

Triton® X-100) e pH 7 (5 mM, 100 mM, 25 °C, 0,5% de Triton® X-100), foram

caracterizados quanto a estabilidade térmica, estabilidade na presença de solventes

orgânicos, relação pH e atividade hidrolítica. Os derivados foram aplicados na resolução

cinética enzimática do rac- acetato de indanila (30 °C, 24h, 250 rpm). Os

biocatalisadores produzidos a pH 10,0, CAB- GLI e CAB- EPI apresentaram elevado

intumescimento e baixa atividade catalítica (0,22 ± 0,19 U/g e 0,21 ± 0,22 U/g),

respectivamente. O CAB- GEG 5% (na presença e ausência de 0,5% de Triton® X-100)

apresentou elevadas atividades catalíticas (21,8 ± 0,52 U/g e 38,8 ± 0,37 U/g) e

rendimentos de imobilização (95,1% e 97,1%), respectivamente. Os maiores tempos de

meia- vida (t1/2) foram obtidos nas condições de ensaio a 60 °C e pH 5,0, em 32,9

minutos para o imobilizado preparado na ausência de Triton® X-100 e 29,8 minutos

com adição de detergente. A estabilidade na presença do solvente tetrahidrofurano

(THF) foi melhor atingida quando o derivado foi preparado com adição de 0,5% de

Triton® X-100, apresentando t1/2 de 60 minutos. Para os derivados produzidos a pH 7,0,

o CAB- GEG 10% (5 mM) na presença de detergente, a atividade enzimática foi de

29,62 ± 0,74 U/g, sendo este o derivado que apresentou melhores parâmetros de

imobilização nos ensaios a pH 7,0. O derivado mais estável a 60 °C apresentou t1/2 de

100,7 minutos (CAB- GEG 10%, 5 mM a pH 5,0). Para as estabilidades a solventes

orgânicos na presença de tetrahidrofurano, o biocatalisador obtido na condição de maior

força iônica (100 mM) e presença de detergente foi o mais estável, t1/2 de 129,7

minutos. Os derivados foram aplicados na resolução cinética enzimática do rac- acetato

de indanol apresentando elevados valores de conversão (50%), podendo ser aplicados na

produção de intermediários utilizados nas formulações de medicamentos, como o

Mesilato de Rasagilina indicado para o controle do Mal de Parkinson (MP).

Palavras- chave: Bagaço de caju. CALB. Imobilização. Biocatalisadores. Resolução

Cinética Enzimática.

ABSTRACT

The cashew apple bagasse (CAB), an agroindustrial wastes, was used as a support for

the immobilizing of lipase kind B de Candida antarctica (CALB). After treatment with

alkaline hydrogen peroxide (AHP), CAB-AHP was functionalized with glycidol (GLY),

epichlorohydrin (EPI), glycidol – ethylenediamine- glutaraldehyde (GEG) 5% and 10%

and then, characterized through analysis of the Scanning Electron microscopy (MEV)

and Red Infra Fourier Transform (FTIR). The biocatalysts produced at pH 10 (25 mM,

25 °C, 0.5% Triton® X-100) and at pH 7 (5 mM, 100 mM, 25 °C, 0.5% Triton® X-

100), were characterized with respect to thermal stability, stability in the presence of

organic solvents, pH relationship and hydrolytic activity. The derivatives were applied

in the enzymatic kinetic resolution of rac-acetate indanila (30 °C, 24h, 250 rpm). The

biocatalyst produced at pH 10.0, CAB-GLI and CAB-EPI showed high swelling and

low catalytic activity (0.22 ± 0.19 U/g and 0.21 ± 0.22 U/g) respectively. The CAB-

GEG 5%, in the presence and in the absence of 0.5% Triton® X-100, showed high

catalytic activities (21.8 ± 0.52 U/g 38.8 ± 0.37 U/g) and high immobilization yields

(95.1% and 97.1%), respectively. The longest times of half-life t1/2 were obtained under

assay conditions at 60 °C and pH 5.0, 32.9 minutes for the immobilized prepared in the

absence of Triton® X-100 and 29.8 minutes with addition of detergent. The stability in

the presence of tetrahydrofuran solvent (THF) was best achieved when the derivative

was prepared with addition of 0.5% Triton® X-100, showing t1/2 of 60 minutes. For the

derivatives produced at pH 7.0, CAB- GEG 10% (5 mM) in the presence of detergent

showed enzymatic activity of 29.62 ± 0 74 U/g. This derivative showed the best

immobilization parameters in assays at pH 7.0. The most stable derivative at 60 °C

showed t1/2 of 100.7 minutes (CAB- GEG 10%, 5 mM at pH 5.0). For the stabilities to

organic solvents in the presence of tetrahydrofuran, the biocatalyst obtained in higher

ionic strength conditions (100 mM) and in the presence of detergent was the most

stable, t1/2 129.7 minutes. The derivatives were applied in the enzymatic kinetic

resolution of rac-acetate indanol, showing high conversion values (50%). They can be

applied in the production of intermediates used in drug formulations, such as Rasagiline

Mesylate, indicated for the management of Parkinson's disease.

Key-words: Cashew apple bagasse (CAB). Immobilization. Biocatalysts. Resolution

Enzyme Kinetics.

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 2.1: Figura 2.1: Sítio ativo da enzima CALB, dividida em uma porção para

ligações acila e outra para alcoóis...................................................................................32

Figura 2.2: Métodos de imobilização para enzimas.......................................................35

Figura 2.3: Suporte funcionalizado e ligação entre os grupos ligantes do suporte com os

da enzima de interesse; Imobilização do tipo covalente..................................................36

Figura 2.4: Composição da biomassa lignocelulósica. Lignina recobre a matriz

protegendo quanto ao acesso de ataques químicos e enzimáticos...................................39

Figura 3.1: Fluxograma dos processos de imobilização e aplicação dos biocatalisadores

formados..........................................................................................................................49

Figura 3.2: Esquema das etapas de preparação do biocatalisador..................................55

Figura 3.3: Ativação com glicidol ou epicloridrina, formação de CAB- GLI/EPI e etapa

de imobilização/ redução das bases de Schiff’................................................................57

Figura 3.4: Ativação com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído, formação de CAB-

GEG 5% ou GEG 10% e etapa de imobilização/ redução das bases de Schiff’s............58

Figura 4.1: Perfil das bandas de vibrações observadas em CAB sem tratamento,

tratados com peróxido de hidrogênio alcalino e funcionalizados com agentes de

ativação...........................................................................................................................69

Figura 4.2: Microscopia Eletrônica de Varreduras, amostras (A) Superfície do CAB- In

natura (sem tratamento) (300x); (B) CAB - AHP (300x); (C) CAB - GLI (5301x); (D)

CAB - EPI (8010x), (E) CAB - GEG 5% (500x) e (F) CAB - GEG 10% (3400x).........73

Figura 4. 3 (A e B): (A) CAB- AHP ativado com glicidol; (B) CAB- AHP ativado com

epicloridrina.....................................................................................................................75

Figura 4.4: Perfil de imobilização utilizando bagaço de caju ativado com glicidol-

etilenodiamina- glutaraldeído 5%....................................................................................77

Figura 4.5: Perfil de desativação da lipase do tipo B de Candida antarctica imobilizada

em bagaço de caju tratado e ativado com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 5% (A)

sem adição de Triton® X-100, (■) biocatalisador a pH 5,0, (●) biocatalisador a pH 7,0 e

(▲) biocatalisador a pH 9,0. (B) com Triton® X-100 (■) biocatalisador a pH 5,0, (●)

biocatalisador a pH 7,0 e (▲) biocatalisador a pH 9,0, a 60 °C......................................80

Figura 4.6: Perfil de inativação na presença do solvente THF 80% para (■) enzima

solúvel, (●) biocatalisador CAB- GEG 5% e (▲) biocatalisador CAB- GEG 5% com

adição de detergente.......................................................................................................83

Figura 4.7: Perfil de desativação da enzima solúvel na presença do solvente ACN 80%

em tampão Tris HCl 100 mM, pH 7,0.........................................................................84

Figura 4.8: Perfil do pH em relação a atividade enzimática usando p- NPB como

substrato. A atividade foi realizada a 25 °C. (■), Enzima solúvel; (●): Biocatalisador

imobilizado CAB- GEG 5%, (▲): Biocatalisador imobilizado CAB- GEG 5% na

presença de 0,5% de Triton® X-100 na solução de

imobilização....................................................................................................................85

Figura 4.9: Estabilidade à estocagem sob refrigeração de lipase tipo B de Candida

antarctica imobilizada por ligação covalente multipontual em CAB-GEG

5%....................................................................................................................................87

Fig 4.10: Perfis de inativação térmica para os derivados (A) CAB- GEG 10% (5 mM)

sob diferentes condições de pH: (■) pH 5,0, (●) pH 7,0 e (▲) pH 9,0 e (B) CAB- GEG

10% (5 mM + Triton® X-100) sob diferentes condições de pH: (■) pH 5,0, (●) pH 7,0 e

(▲) pH 9,0.......................................................................................................................90

Fig 4.11: Ajuste do modelo proposto por SADANA E HENLEY (1987) para os ensaios

de estabilidade térmica do derivado (A) CAB- GEG 10% (100 mM) sob diferentes

condições de pH: (■) pH 5,0, (●) pH 7,0 e (▲) pH 9,0 e (B) CAB- GEG 10% (100 mM

+ Triton® X-100) sob diferentes condições de pH: (■) pH 5,0, (●) pH 7,0 e (▲) pH

9,0....................................................................................................................................91

Figura 4.12: Perfis de desativação dos biocatalisadores na presença de THF 80% (v/v),

com determinação dos tempos de meia - vida para (■) enzima solúvel, (●) 5 mM e (▲)

5 mM + Triton X-100......................................................................................................94

Fig 4.13: Perfis de desativação seguindo o modelo proposto por Sadana e Henley

(1987), com determinação dos tempos de meia- vida para (■) Enzima solúvel, (●) CAB-

GEG 10% (100 mM) e (▲) CAB- GEG 10% (100 mM) na presença de 0,5% de

Triton® X-100 no tampão de imobilização a THF 80%.................................................95

Figura 4.14: Desativação do imobilizado (5 mM + 0,5% de Triton® X-100) na

presença de solvente acetonitrila a 80% (v/v).................................................................97

Figura 4. 15: Efeito do pH na atividade hidrolítica, (■) Enzima solúvel, (●) imobilizado

em tampão fosfato 5 mM, na ausência de detergente e (▲) na presença de detergente

anfifílico...........................................................................................................................97

Figura 4. 16: Efeito do pH na atividade da (■) enzima solúvel, (●) lipase imobilizada

em CAB – GEG 100 mM e (▲) e lipase imobilizada em CAB – GEG 100 mM com

adição de detergente.......................................................................................................98

Figura 4.17: Estabilidade a estocagem (4 °C) de diferentes preparações de imobilizado.

Derivado (5 mM) CAB- GEG 10% (▲), derivado 5 mM na presença de Triton® X-100

(▼), derivado 100 mM (■), derivado 100 mM na presença de Triton® X-100

(●)....................................................................................................................................99

Figura 4.18: Análise em SDS- PAGE de diferentes preparações: Fração 1: marcadores

moleculares, Fração 2: enzima solúvel, Fração 3: CAB- GEG 5%, Fração 4: CAB- GEG

5% + 0,5% Triton® X-100, Fração 5: CAB – GLI, Fração 6: CAB- EPI, Fração 7:

CAB- GEG 10% (100 mM), Fração 8: CAB – GEG 10% (100 mM + Triton® X-100),

Fração 9: CAB- GEG 10% ( 5 mM), Fração 10: CAB- GEG 10% ( 5 mM + Triton® X-

100)................................................................................................................................100

Figura 4.19: Sínte se de rac- indanol e acetato de rac- indanil....................................102

Figura 4.20: Cromatogramas GC de rac-acetato indanila, tR32,68 min. (S) tR33,17 min.

(R) e rac-indanol, tR37,95 min. (S) tR38, 98 min...........................................................102

Figura 4.21: Reação de hidrólise de rac- acetato de indanila usando lipase de CALB

imobilizada em bagaço de caju......................................................................................103

INDICE DE TABELAS

Tabela 2.1: Classificação das enzimas e os tipos de reações em que catalisam.............28

Tabela 3.1: Estratégias de imobilização.........................................................................50

Tabela 4.1: Parâmetros de imobilização para os derivados formados com uso dos

suportes CAB-GLI e CAB-EPI, após 24h de imobilização.............................................74

Tabela 4.2: Parâmetros de imobilização para os derivados formados por ligações do

tipo covalente multipontual ativados com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 5%,

após 2h de imobilização .................................................................................................78

Tabela 4.3: Parâmetros de Inativação em diferentes condições para o CAB- GEG 5% e

CAB- GEG 5% com 0,5% Triton® X-100....................................................................81

Tabela 4.4 - Parâmetros de inativação dos biocatalisadores produzidos na presença do

solvente tetrahidrofurano (THF), a 25 °C........................................................................83

Tabela 4.5: Parâmetros de imobilização para os derivados produzidos a pH 7,0 em

diferentes condições de ensaio........................................................................................89

Tabela 4.6: Parâmetros de inativação térmica (60 °C) dos biocatalisadores produzidos a

pH 7,0..............................................................................................................................92

Tabela 4.7: Estabilidade de diferentes preparações de enzima com tempo de meia- vida

definido em minutos. Condições: THF 80%, 25 °C........................................................96

Tabela 4.8: Resolução cinética através de hidrólise de rac-acetato de indanila usando

biocatalisador CAB-GEGa 5%.......................................................................................103


biocatalisadores CAB-GEG 10%................................................................................104

Tabela 4.10: Resultados de reuso para o biocatalisador CAB- GEGa 5%...................105

Tabela 4.11: Resultados de reuso para o biocatalisador CAB- GEGa 10%..................106

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

[α]D: Rotação

ACN: Acetonitrila

AHP: Peróxido de Hidrogênio Alcalino (do inglês Alkaline Hydrogen Peroxide).

Atd: Atividade do derivado, U.g-1

AR: Atividade Recuperada, %

Ar: Atividade Relativa, %

Atof: Atividade oferecida, U.g-1

At: Atividade Hidrolítica, U.mL-1

C: Concentração de Proteínas, mg.mL-1

c: Conversão, %

CAB: Bagaço de caju (do inglês Cashew Apple Bagasse)

CAB- IN: Bagaço de caju sem tratamento (In Natura)

CAB-AHP: Bagaço de caju tratado com peróxido de hidrogênio alcalino

CAB-GLI: Derivado produzido a partir do bagaço de caju tratado e ativado com

glicidol

CAB-EPI: Derivado produzido a partir do bagaço de caju tratado e ativado com

epicloridrina

CAB- GEG 5%: Derivado produzido a partir do bagaço de caju tratado e ativado com

glicidol-etilenodiamina-glutaraldeído 5%

CAB –GEG 10%: Derivado produzido a partir do bagaço de caju tratado e ativado com

glicidol-etilenodiamina-glutaraldeído 10%

CALB- Lipase do tipo B de Candida antarctica (CALB).

CG: Cromatografia gasosa

Co: Carga oferecida, mg P. g-1 suporte

D: Diluição

E: Razão Enantiomérica

e.e: Excesso enantiomérico,%

e.e.s: Excesso enantiomérico do substrato, %

e.e.p: Excesso enantiomérico do produto, %

EDA: Etilenodiamina

EPI: Epicloridrina

fc : fator da curva de calibração do pnp (µmoL/(mLabs))

FE: Fator de Estabilização

FTIR: Infra Vermelho por Transformadas de Fourier

GEG: Glioxil- etilenodiamina- glutaraldeído

GLI: Glicidol

Mb: Massa do biocatalisador imobilizado, g

MEV: Microscopia Eletrônica de Varredura

p- NPB: p- nitrofenil butirato

RI: Rendimento de Imobilização, %

THF: Tetrahidrofurano

t(1/2): Tempo de meia vida, min ou h

Ve: Volume da solução de enzima, mL

Vr: Volume reacional, mL

Vs: Volume total da suspensão enzimática

Vse: Volume da amostra da suspensão enzimática

α: slope, abs.min-1

Att: Atividade teórica

αt: Relação entre atividade no estado final (após o efeito da temperatura a 60 °C) e

estado inicial.

Kd: Constante de desativação térmica (t-1).

EtOAC: Acetato de etila

Et3N: Trietilamina

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................ 23

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................................ 27

2.1 Enzimas............................................................................................................. 27

2.1.1 Enzimas como Biocatalisadores...................................................................... 29

2.1.2 Lipase................................................................................................................ 30

2.1.2.1 Lipase do Tipo B de Candida antarctica........................................................ 31

2.1.3 Estabilização de Enzimas................................................................................ 33

2.1.4 Imobilização de Enzimas................................................................................. 34

2.1.4.1 Métodos de Imobilização de Enzimas............................................................ 34

2.1.5 Suportes............................................................................................................ 37

2.1.5.1 Resíduos Agroindustriais................................................................................ 38

2.1.5.2 Materiais Lignocelulosicos.............................................................................. 39

2.1.5.2.1 Bagaço de caju.................................................................................................. 41

2.1.5.3 Tipos de Tratamento........................................................................................ 41

2.1.6 Aplicação dos Biocatalisadores....................................................................... 45

3 MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................... 47

3.1 Materiais........................................................................................................... 47

3.1.1 Suportes e Reagentes de ativação................................................................... 47

3.1.2 Enzima.............................................................................................................. 47

3.1.3 Substrato........................................................................................................... 47

3.1.4 Reagentes para Eletroforese........................................................................... 47

3.2 Métodos............................................................................................................. 48

3.2.1 Etapas Experimentais...................................................................................... 49

3.2.2 Estratégias de Imobilização............................................................................. 50

3.2.3 Preparação do Suporte.................................................................................... 51

3.2.3.1 Tratamento Alcalino........................................................................................ 51

3.2.3.2 Ativação do Suporte......................................................................................... 51

3.2.3.2.1 Ativação do Suporte com glicidol................................................................... 52

3.2.3.2.2 Ativação do Suporte com epicloridrina......................................................... 52

3.2.3.2.3 Ativação do Suporte com glicidol-etilenodiamina-glutaraldeído

5%...................................................................................................................... 53

3.2.3.2.4 Ativação do Suporte com glicidol-etilenodiamina-glutaraldeído

10%.................................................................................................................... 53

3.2.4 Quantificação dos grupos aldeídos................................................................. 53

3.2.5 Caracterizações do Suporte Bagaço de Caju................................................. 54

3.2.5.1 Analise por Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de

Fourier (FTIR)................................................................................................. 54

3.2.5.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)............................................. 54

3.2.6 Processo de Imobilização................................................................................. 55

3.2.6.1 Imobilização do tipo covalente multipontual................................................. 56

3.2.6.2 Imobilização do tipo covalente unipontual.................................................... 56

3.2.7 Determinação da Concentração de Proteínas e Atividade Enzimática..... 59

3.2.8 Redução das Bases de Schiff’s......................................................................... 60

3.2.9 Redução dos parâmetros de Imobilização.................................................... 60

3.2.10 Caracterização dos Biocatalisadores Imobilizados....................................... 62

3.2.10.1 Estabilidade Térmica a diferentes valores de pH......................................... 62

3.2.10.2 Estabilidade frente a diferentes solventes orgânicos.................................... 63

3.2.10.3 Efeito do pH na Atividade contra p-NPB...................................................... 63

3.2.10.4 Determinação da Estabilidade de Estocagem................................................ 63

3.2.11 Ensaio de SDS- PAGE..................................................................................... 64

3.2.12 Aplicação do biocatalisador produzido em bagaço de caju ativado por

glicidol-etilenodiamina-glutaraldeído............................................................ 64

3.2.12.1 Síntese de rac-indanol...................................................................................... 64

3.2.12.2 Síntese de rac- acetato de indanila.................................................................. 65

3.2.12.3 Procedimento geral para a hidrólise catalisada por lipase em rac- acetato

de indanila............................................................................................. 65

3.2.12.4 Métodos Analíticos de Acompanhamento da Reação................................... 66

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES................................................................... 68

4.1 Caracterizações do Suporte............................................................................. 68

4.1.1 Infra Vermelho com Transformada de Fourier (FTIR)............................... 68

4.1.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV).............................................. 72

4.1.2.1 Microscopia Eletrônica de Varredura dos suportes: in natura, tratado,

ativados com glicidol, epicloridrina, glicidol- etilenodiamina-

glutaraldeído 5% e glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído

10%................................................................................................................... 72

4.2 Imobilização Covalente Multipontual............................................................ 74

4.2.1 Parâmetros de imobilização da enzima CALB utilizando bagaço de caju

tratado e ativado com glicidol e epicloridrina............................................... 74


tratado com peróxido de hidrogênio em meio alcalino e ativado com

glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 5%................................................... 76

4.2.2.1 Imobilização de CAB- GEG 5% (25 mM, pH 10,0) e CAB- GEG 5% (25

mM + 0,5% Triton® X-100, pH 10,0)............................................................ 76

4.2.3 Caracterização dos Biocatalisadores produzidos....................................... 79

4.2.3.1 Estabilidade térmica em diferentes condições............................................... 79

4.2.3.2 Estabilidade na presença de solventes orgânicos.......................................... 82

4.2.3.3 Efeito do pH na atividade enzimática............................................................ 85

4.2.3.4 Estabilidade de Estocagem.............................................................................. 86

4.3 Imobilização covalente Unipontual........................................................ 88


tratado e ativado com glicidol-etilenodiamina- glutaraldeído 10%............ 88

4.3.3.1 Condições de Imobilização: CAB- GEG 10% (5 mM, pH 7,0); CAB-

GEG 10% (5 mM + 0,5% triton, pH 7,0); CAB- GEG 10% (100 mM, pH

7,0); CAB- GEG 10% (100 mM + 0,5% triton, pH 7,0)........................... 88

4.3.2 Caracterização dos Biocatalisadores produzidos.......................................... 90

4.3.2.1 Estabilidade Térmica em diferentes condições............................................. 90

4.3.2.2 Estabilidade na presença de solventes orgânicos.......................................... 94

4.3.2.3 Efeito do pH na atividade enzimática............................................................ 97

4.3.2.4 Estabilidade de Estocagem.............................................................................. 99

4.4 SDS PAGE......................................................................................................... 100

4.5 Aplicação em Síntese Quimioenzimática....................................................... 101

4.5.1 Síntese de rac- indanol e rac- acetato de indanila........................................ 101

4.5.2 Reação de hidrólise de acetato de rac – indanila utilizando

Biocatalisadores ............................................................................................. 102

4.5.3 Reuso da enzima imobilizada.......................................................................... 105

5 CONCLUSÕES................................................................................................ 109

6 SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS............................................... 112

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................... 114

Anexo A............................................................................................................. 123

Anexo B............................................................................................................. 159

CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO

23

Capítulo 1 – Introdução Souza, T.C.

1. INTRODUÇÃO

Biomassa pode ser considerada como uma massa de material orgânico de

qualquer material biológico. Uma vasta variedade de recursos de biomassa está

disponível para conversão em bioprodutos (BORTOLAZZO, 2011, p.23).

Grande quantidade de resíduos gerados tem origem nos processos desenvolvidos

nas agroindústrias, que contribuem para o acúmulo de compostos prejudiciais ao meio

ambiente. Estes resíduos são considerados fontes renováveis, apresentam baixo custo e

elevada disponibilidade para uso, podendo passar por tratamentos e serem aplicados em

reações que agregam valor ao produto final.

O Brasil é um país caracterizado pela economia agroindustrial e com

potencialidades de se tornar um dos maiores produtores de fibras vegetais

(MESQUITA, 2013, p. 16). São exemplos de resíduos de agricultura: bagaço de cana,

palha de milho, palha de trigo, palha e casca de arroz, palha de cevada, bagaço de sorgo,

caroços de azeitona e celulose (BARCELOS, 2012, p. 56).

Alguns destes resíduos foram aplicados nos trabalhos envolvendo o uso de casca

de coco como suporte para imobilizar enzimas, podendo ser aplicadas em reações para a

obtenção de biodiesel (BRÍGIDA, 2010). Bagaço de caju, utilizado em reações de

hidrólise enzimática para a produção de etanol (CORREIA, 2013) ou nos processos

envolvendo a imobilização de enzimas, aplicados como suporte para produção de

biocatalisadores imobilizados visando à obtenção de bioetanol (GONDIM, 2009).

Palha de feijão, colheita de mamona e beneficiamento do café, empregados na

formulação de rações para aves (OLIVEIRA, 2009).

Estes materiais considerados lignocelulósicos apresentam basicamente três

componentes em sua estrutura: celulose, hemicelulose e lignina, que formam uma

estrutura rígida, pouco reativa e quando interligados atuam como uma barreira para a

ação de enzimas, sendo necessário passar por tratamentos para posterior aplicação.

Assim, para promover a solubilização da lignina e o rompimento das estruturas

cristalinas destes materiais, são realizados tratamentos que podem ser físico, químicos,

físico-químicos e biológicos.

24


Visando o aproveitamento de um resíduo muito disponível na região Nordeste,

foi utilizado neste trabalho bagaço de caju como suporte para imobilização de enzima.

Enzimas quando imobilizadas, apresentam elevadas atividades em comparação

com os catalisadores convencionais. Por atuarem em condições brandas, podem sofrer

inativações por fatores físicos, químicos ou biológicos, podendo ocorrer quando

estocadas ou durante o uso (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO, 2004). Para tornar

estes biocatalisadores estáveis a determinadas condições, utilizam-se técnicas de

imobilização que produzem derivados reutilizáveis, com manutenção da atividade

catalítica e de fácil recuperação.

O principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um biocatalisador com

atividade e estabilidade que não sejam afetadas durante o processo, em comparação à

sua forma livre. O imobilizado deve apresentar velocidades catalíticas superiores a

enzima na sua forma solúvel, não provocando alterações estruturais nem modificações

no sítio ativo (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO, 2004, v. 27, p. 624).

Os derivados produzidos por imobilização podem ser aplicados nos processos de

biocatálise. A biocatálise consiste em utilizar um catalisador ambientalmente

compatível (enzima) para a conversão de um substrato (composto orgânico),

desenvolvendo transformações orgânicas para a produção de substâncias bioativas com

elevado grau de pureza (FONSECA, 2013, p. 25). Uma das aplicações da biocatálise é a

produção de composto opticamente ativos.

Neste contexto, o objetivo geral deste estudo foi a produção de biocatalisadores

enzimáticos utilizando um resíduo agroindustrial, bagaço de caju tratado com peróxido

de hidrogênio em meio alcalino, como suporte para imobilização da lipase do tipo B de

Candida antarctica e aplicação destes biocatalisadores em síntese quimioenzimática.

Para tal fim, foram propostos os seguintes objetivos específicos:

Caracterização do suporte (bagaço de caju) quanto à morfologia e

composição química;

Desenvolvimento de protocolos de ativação de suporte;

Desenvolvimento de protocolos de imobilização do tipo covalente;

Imobilização empregando bagaço de caju tratado com peróxido de

hidrogênio em meio alcalino e ativação com glicidol, epicloridrina, glicidol –

etilenodiamina - glutaraldeído 5% e glicidol - etilenodiamina - glutaraldeído

10%;

25


Produção de biocatalisadores por imobilização do tipo ligação covalente

unipontual e multipontual;

Caracterização dos biocatalisadores produzidos: estabilidade térmica,

estabilidade a solventes orgânicos, relação pH x ensaio de atividade, estabilidade

de estocagem;

Avaliação do potencial de aplicação dos derivados em sínteses químio-

enzimática de rac -acetato de indanila.

O bagaço de caju utilizado nos ensaios foi tratado com peróxido de hidrogênio

em meio alcalino para promover a deslignificação, facilitando as possíveis ligações

entre enzima e suporte.

Os resultados dos ensaios estão disponíveis no Capítulo 4, divididos em:

caracterização dos suportes ativados, visando o discernimento entre os possíveis grupos

formados entre as ativações (MEV, FTIR), produção e caracterização dos derivados por

imobilização covalente unipontual e multipontual, através dos resultados obtidos por

ensaios de estabilidade térmica, estabilidade na presença de solventes orgânicos,

estocagem e avaliação do melhor pH na atividade enzimática. O Capítulo 5 apresenta a

conclusão dos ensaios realizados neste estudo.

CAPÍTULO 2

REVISÃO

BIBLIOGRÁFICA

27

Capítulo 2 – Revisão Bibliográfica Souza, T.C.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Neste capítulo será exposta uma breve revisão a cerca dos processos de imobilização

de enzimas, com ênfase nos objetivos propostos ao estudo, em especial o uso de

resíduos agroindustriais aplicados como suporte para a imobilização da lipase do tipo

B de Candida antarctica, métodos de imobilização e aplicação em sínteses

químioenzimáticas.

2.1 Enzimas

Enzimas são caracterizadas como catalisadores biológicos ou biocatalisadores,

em sistemas “in vivo” e “in vitro”, de natureza protéica, altamente específica e com

grande poder catalítico (WISEMAN, 1995). São consideradas proteínas que apresentam

atividades catalíticas com exceção a um pequeno grupo com moléculas de RNA

(ribozimas) (TARDIOLI et al., 2003). Além de acelerarem as reações bioquímicas,

diminuem a energia de ativação sem causar alteração no equilíbrio da reação (VIEIRA,

2009, p.4).

As enzimas atuam em condições brandas de reação (pH e temperatura), em sua

maioria em soluções aquosas o que as diferenciam das reações com o uso de

catalisadores químicos (VIEIRA, 2009). Apresentam elevado nível de eficiência

catalítica e especificidade, que permite diferenciar não apenas as reações, mas os

substratos, sendo ainda régio e estereoespecíficas (SANTOS, 2015). Sua elevada

seletividade faz com que as enzimas se destaquem nos processos envolvendo oxidações,

condensação ou hidrólises, principalmente se o produto final for destinado a fins

alimentícios (VIEIRA, 2009, p. 4) ou farmacêuticos, quando utilizados em resolução

cinética para a produção de compostos enatiomericamente puros.

O uso de enzimas nos setores industriais tem se tornado proveitoso uma vez que

diminuem os subprodutos indesejáveis gerados e são necessários pequenos volumes

para catalisar reações específicas decorrentes da sua elevada eficiência (VIEIRA, 2009).

28


Suas fontes de obtenção podem ser a partir de vegetais, animais ou

microrganismos. As mais utilizadas a nível industrial são originadas por processos

fermentativos a partir de culturas microbianas (CARNEIRO, 2003, p.6).

As enzimas são nomeadas e classificadas com base em uma comissão, Comitê de

Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular (NC-

IUBMB), divididas em seis grupos ou classes baseadas nas reações de catálise. São

reconhecidas por quatro dígitos (EC) para diferenciá-las entre uma mesma classe. O

primeiro dígito refere-se à classe da enzima, o segundo a sub-classe, terceiro dígito aos

grupamentos químicos em que participam da reação e o último dígito a enzima

propriamente dita (SANTOS, 2015).

A Tabela 2.1 apresenta a classificação das enzimas segundo a International

Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB).

Tabela 2.1: Classificação das enzimas e os tipos de reações em que catalisam.

Classe da Enzima Tipos de reação catalisada

Classe 1 Oxiredutases Reações de Oxidação-redução

Classe 2 Transferases Transferência de grupos funcionais

Classe 3 Hidrolases Reações de Hidrólise

Classe 4 Liases Remoção de grupos para formar ligações

duplas (não sendo por hidrólise)

Classe 5 Isomerases Reações de Isomerização

Classe 6 Ligases Catalisam reações de formação e novas

moléculas a partir da ligação entre duas

moléculas já existentes, sempre às custas

de energia (ATP)

Fonte: (VIEIRA, 2013, p. 4).

As lipases, enzima utilizada neste estudo, são classificadas como hidrolases e

catalisam a clivagem de substratos em meio contendo água.

As lipases participam de diversas reações, podendo ser aplicadas tanto a nível

laboratorial como industrial e possuem boa estabilidade em diferentes meios reacionais

(MANOEL et al., 2015). Possuem um mecanismo de ação conhecido como ativação

interfacial. Em geral, estas enzimas apresentam duas conformações, podendo ter a

tampa aberta ou podendo o centro ativo estar isolado por cadeias polipeptídicas,

29


considerando assim a forma fechada (RODRIGUES; FERNANDEZ-LAFUENTE,

2010). Esse mecanismo pode ser modulado sem que haja inativação da enzima.

As propriedades da lipase podem ser alteradas por mudanças nas condições de

reação, promovendo alterações na conformação da enzima através de protocolos de

imobilização, melhorando o desempenho e proporcionando condições ótimas de reação

(RODRIGUES; FERNANDEZ-LAFUENTE, 2010).

2.1.1 Enzimas como biocatalisadores

As enzimas são utilizadas por apresentarem excelentes propriedades funcionais

(atividade, seletividade, especificidade) catalisando processos químicos sob condições

experimentais e ambientais brandos sendo excelentes catalisadores industriais em várias

áreas da indústria química (GUISAN, 2006).

O uso de enzimas tem se tornado interessante quando permite que pequenas

quantidades sejam suficientes para catalisar reações específicas decorrentes da sua

elevada eficiência em condições suaves e elevado grau de especificidade ao substrato

(VIEIRA, 2009).

Este interesse surgiu na década de noventa com investigações direcionadas a

procura de novas alternativas para a engenharia genética a fim de desenvolver melhores

biocatalisadores, com produção de enzimas recombinantes (GUISAN, 2006).

O poder de catálise e o grau de seletividade da enzima dependem da manutenção

da estrutura (terciária ou quaternária), podendo sofrer alterações decorrentes de

condições como pH, temperatura e uso de solventes que provocariam a inativação da

enzima ou superativação (VIEIRA, 2009). Assim, o uso da tecnologia enzimática

agrega benefícios uma vez que são utilizadas reações biológicas com alta especificidade

e baixas energias de ativação (CARNEIRO, 2003).

Atualmente o principal objetivo da tecnologia enzimática é solucionar possíveis

problemas que possam interferir na aplicação de enzimas nos processos industriais,

agregando melhorias genéticas nas enzimas de interesse.

30


2.1.2 Lipases

Lipases (glicerol éster hidrolases, E.C. 3.1.1.3) são enzimas classificadas como

hidrolases e atuam na fase orgânica- aquosa, catalisam a hidrólise de ligações éster-

carboxílicas de acilgliceróis liberando ácidos graxos e glicerol, causando a síntese em

ambientes com baixas concentrações de água (CASTRO et al., 2004).

Dependendo da fonte, podem ter massa molecular variando entre 20 a 75 kDa,

atividade em pH na faixa entre 4 a 9 e em temperaturas variando desde a ambiente até

70 °C, mas com atividade ótima na faixa entre 30 ºC e 40 °C, variando sua termo

estabilidade consideravelmente em função da origem, sendo as lipases microbianas as

de melhor estabilidade térmica (CASTRO et al., 2004). Segundo Brígida (2010), é

possível encontrar lipases ativas numa ampla faixa de pH, sendo o pH ótimo da maioria

das lipases entre 7 e 9.

Essas enzimas são muito utilizadas em síntese orgânica por apresentar grande

disponibilidade e baixo custo, não necessitam de cofatores, são atuantes em faixas de

pH relativamente grandes, como citado anteriormente, e apresentam elevada

regiosseletividade, quimiosseletividade e enantiosseletividade. Realizam a catálise em

reações de esterificações, transesterificações aminólise e tiotransesterificação em

solvente orgânico anidro, sistema bifásico e em solução micelar. A hidrólise e síntese

das reações são controladas pela quantidade de água no meio reacional (DALLA-

VECCHIA; NASCIMENTO, 2004).

A aplicação de biocatalisadores na indústria foi investigada devido à sua alta

atividade catalítica em comparação com os catalisadores convencionais, e ao fato de

atuarem com alta eficiência em condições reacionais bastante suaves (DALLA-

VECCHIA; NASCIMENTO, 2004).

A diversidade de ação das lipases torna esse grupo capaz de catalisar uma série

de diferentes reações, é possível existir lipases com uma capacidade catalítica para

diversos substratos como também lipases que catalisam reações muito específicas

(MATOS, 2014).

A atividade da lipase pode ser determinada por alguns substratos como óleo de

oliva, trioleína e p- nitrofenil palmitato sendo as reações acompanhadas por técnicas de

31


titulação, uso de espectros ou por cromatografia líquida de alta eficiência (BRÍGIDA,

2010).

Nas reações de hidrólise podem ser aplicadas nas áreas de alimentos, na

hidrólise de gordura do leite, produzindo flavor para queijos e derivados; Participam das

reações de hidrólise de óleos e gorduras com produção de emulsificantes; e na química

de detergentes, sendo aplicado na remoção de manchas de óleo. Nas reações envolvendo

esterificação são aplicáveis a indústria fina, de alimentos e farmacêutica. Nas reações

envolvendo transesterificação são utilizadas em óleos vegetais para produção de

biodiesel (ARAUJO, 2009).

Essas enzimas são as mais utilizadas em síntese orgânica e mais de 20% das

biotransformações também ocorrem com a sua ajuda por apresentarem especificidade

por um grande número de substratos, mas principalmente devido a sua elevada

enantioseletividade (PEREIRA, 2014, p. 11).

2.1.2.1 Lipase do Tipo B de Candida antarctica

Lipase do tipo B de Candida antarctica possui elevada aplicação nos processos

industriais (ARROYO; SÁNCHEZ MONTERO; SINISTERRA, 1999), pela sua

elevada atividade catalítica e estabilidade, sendo aplicada a síntese de diferentes ésteres

em meios orgânicos (LOZANO et al., 2002). São comercializadas por empresas como a

Novozymes, sendo o microrganismo capaz de produzir duas lipases que podem ser

diferenciadas como tipo A e tipo B. Esses tipos diferem quanto ao ponto isoelétrico,

massa molecular e seletividades (BRÍGIDA, 2010). A lipase do tipo A tem sido

explorada ainda, apresentando massa molar de 45 kDa. A lipase do tipo B tem massa

molar de 33 kDa, ponto isoelétrico de 6 e pH ótimo na faixa entre 7 e 8 (BRÍGIDA,

2010) e é constituída por 317 aminoácidos.

Essa enzima pode ser encontrada na sua forma solúvel ou imobilizada (ligada

química ou fisicamente a um suporte). Apesar de possuíram tríade similar de catálise

(Ser, His, Asp/ Glu) as fontes de obtenção da lipase podem influenciar no conjunto de

aminoácidos pertencentes à estrutura da enzima, sendo ainda possível encontrar

diferenças entres enzimas obtidas de uma mesma fonte (BRÍGIDA, 2010).

32


A CALB apresenta uma conformação interfacial com tampa pequena e simples,

que não isola totalmente o centro ativo do meio reacional (GALVIS et al., 2012).

Alguns autores consideram que o mecanismo de ativação interfacial não funcione para

está enzima.

De acordo com Uppenberg (1995) a CALB apresenta cavidade ligante do

substrato em formato elíptico, como representado na Figura 2.1, com paredes

hidrofóbicas, com um lado acila e um lado álcool e ajuste das partes correspondentes do

substrato durante a catálise.

Figura 2.1: Sítio ativo da enzima CALB, dividida em uma porção para ligações acila e

outra para alcoóis.

Fonte: Uppenberg (1995).

Essa divisão do sítio ativo apresenta uma conformação com tampa simples,

como mencionado anteriormente, não impedindo que haja entrada de substratos e

formação de produtos (UPPENBERG, 1995).

CAL B é uma das enzimas mais utilizadas tanto na forma livre como na forma

imobilizada, e embora já possua imobilizado comercial muito estável, estudos sobre

imobilizações ainda são realizados com a mesma. Alguns destes estudos são

apresentados na literatura, como nas imobilizações em suportes com divinilsulfona

(SANTOS et al., 2015); Imobilização em nanopartículas para aplicação na catálise de

33


ésteres e produção de biodiesel (SOUZA, 2013); Produção de CLEA (Cross Linked

enzyme aggregates) para aplicação em síntese de biodiesel (RIOS, 2013); Na bio-

resolução cinética dos Adutos de Morita Baylis Hillman (AMBH) (XAVIER, 2013) ou

na reação de epoxidação químio-enzimática (MOREIRA, 2008).

1.1.3. Estabilização de enzimas

O crescente interesse na aplicação de enzimas em processos industriais tem

levado ao desenvolvimento de biocatalisadores com suas propriedades melhoradas.

Infelizmente, enzimas naturalmente disponíveis não são indicadas para aplicações

industriais, por incompatibilidade em relação a estabilidade das enzimas às condições de

processo (EIJSINK et al., 2005).

A estabilização enzimática pode ser alcançada por diferentes métodos:

engenharia de proteínas, modificação química, uso de aditivos, uso de solventes

orgânicos, isolamento a partir de organismos que vivem em ambientes extremos e

imobilização (ASSIS, 2010).

A estabilidade das enzimas pode ser afetada por fatores como temperatura, pH,

estresse oxidativo, presença de solvente, uso de cofatores e adição de surfactantes

(EIJSINK et al., 2005).

Quando ocorre o desdobramento da cadeia polipeptídica de uma enzima, inicia-

se o processo de desnaturação. Esta etapa é reversível. Porém, a etapa seguinte de

inativação é irreversível, estando relacionado a uma série de fatores, como: instabilidade

das ligações dissulfeto, clivagem das ligações peptídicas, racemização dos resíduos de

aminoácidos. A perda da sua estrutura terciária dá-se também por fatores como calor,

elevados valores de pH e altas concentrações de sal (TARDIOLI et al., 2003).

Visando a utilização de enzimas nas aplicações industriais serão avaliadas

técnicas de imobilização e discutidos a importância de se estudar a estabilização dos

biocatalisadores produzidos para que haja a manutenção do potencial catalítico e seu

reuso de forma eficiente frente às condições de aplicação, como variações no pH e

temperatura.

34


2.1.4 Imobilização de Enzimas

Diversas enzimas são imobilizadas em diferentes naturezas de suportes, com uso

de técnicas variadas e seus produtos são visados para aplicação em indústrias de

alimentos, na produção de fármacos, na síntese de biodiesel, dentre outros.

Visando a utilização de enzimas como catalisadores industriais, podendo

submetê-las a condições adversas, foram desenvolvidas estratégias para estabilizá-las.

Enzimas imobilizadas são descritas como enzimas fisicamente confinadas ou

localizadas em uma determinada região do espaço, com retenção da sua atividade

catalítica, podendo ser usadas repetidas e continuas vezes (IUPAC, 1995). A

imobilização de enzimas promove inúmeras vantagens (VIEIRA et al., 2009): A

reutilização do biocatalisador; Redução do volume de reação, pois enzimas imobilizadas

podem estar em elevadas concentrações em um menor volume de reator; Facilidade no

controle operacional; Fácil purificação do produto sem contaminação pelo catalisador,

visto que a enzima imobilizada não é solúvel no meio reacional.

Dentre os diversos métodos de imobilização, podemos citar: ligação cruzada

intermolecular, que não utiliza suporte, são ligações entre enzimas; ligações por

adsorção, ligação do tipo iônica, covalente ou metálica.

2.1.4.1 Métodos de imobilização de Enzimas

Como mencionado anteriormente, existem diversos métodos de imobilização

para enzimas insolúveis, seja por ligações (a um suporte ou intermolecular) ou por

oclusão (géis, fibras ou macrocápsulas) (BRÍGIDA, 2006). A escolha do método

dependerá da condição química, física e biológica do suporte, visando à aplicação dos

derivados formados.

35


É importante analisar a tríade que envolve o tipo de suporte, as propriedades da

enzima e o método de imobilização e ativação do suporte quando se questionar sobre os

processos de imobilização, de acordo com a IUPAC (1995).

Segundo IUPAC (1995) os métodos de imobilização podem ser classificados

em:

Ligações covalentes da enzima a uma matriz insolúvel;

Ligação cruzada intermolecular, utilizando reagentes funcionais;

Adsorção a uma matriz insolúvel em água;

Aprisionamento dentro de uma estrutura insolúvel em água ou

membranas semipermeáveis.

A Figura 2.2 apresenta as diversas técnicas aplicadas a imobilizações de

enzimas.

Figura 2.2: Métodos de imobilização para enzimas.

Fonte: DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO (2004).

A imobilização por adsorção consiste em promover a ligação entre enzima e

suporte sólido por interações iônicas, adsorção física, ligações hidrofóbicas e forças de

van de Waals. Esse método apesar de simples e de baixo custo tem como desvantagem a

baixa energia de ligação nas interações entre enzima e suporte, podendo ocorrer

dessorção da enzima quando submetidas a variações de temperatura, pH, força iônica

(BRÍGIDA, 2010).

No método de ligação cruzada intermolecular não há uso de suportes. As

enzimas ligam-se através da adição de reagente bi ou multifuncionais que provocarão a

ligação. Consiste em um método simples, envolvendo precipitação a partir de tampão

36


aquoso seguido de ligação cruzada dos agregados físicos resultantes de moléculas de

enzima. Utilizam-se reagentes de precipitação, como PEG (polietilenoglicol) e agentes

reticulantes, como glutaraldeído (GUISAN, 2006).

Nas ligações do tipo covalente, os grupamentos ativos disponíveis no suporte

ligam-se aos grupos funcionais disponíveis na enzima como grupos aminos ou resíduos

de lisinas, carboxílicos, tirosinas, grupo sulfidrílico da cisteína, hidroxílico da serina,

imidazol da histidina, tirosina e grupo indol do triptofano. Esse tipo de ligação é

considerado forte, tornando o derivado formado mais estável quando comparado com o

obtido pelo uso da técnica de adsorção (BRÍGIDA, 2006).

Esse método em geral requer uma preparação prévia do suporte de interesse,

uma vez que nem todos os suportes apresentam grupamentos químicos disponíveis para

interação com a enzima. Sendo assim, é comum ocorrer uma etapa inicial, conhecida

como funcionalização do suporte, onde são adicionais reagentes de ativação que irão

promover a disponibilidade de grupamentos de interesse, facilitando a ocorrência da

ligação enzima- suporte.

A Figura 2.3 apresenta o modelo de ligação entre os grupos químicos

disponíveis no suporte ligados a enzima.

Figura 2.3: Suporte funcionalizado e ligação entre os grupos ligantes do suporte com os

da enzima de interesse; Imobilização do tipo covalente.

Fonte: TARDIOLI (2003).

Esses tipos de ligações envolvem ainda uma série de parâmetros moldáveis o

que exige tempo de análise. Pode-se submeter a interações a pH alcalinos obtendo

resultados distintos. Quando expostos a pH 7,0 tem-se a imobilização do tipo

unipontual e a pH 10, a imobilização é do tipo multipontual, havendo diversas ligações

dos grupamentos do suporte na enzima.

37


Outra técnica de imobilização é o encapsulamento, aprisionamento ou oclusão.

Esse método, como o próprio nome sugere, aprisiona o catalisador no interior de uma

matriz, sem que ocorram ligações químicas, geralmente materiais na forma de géis,

membranas, filmes.

A vantagem da utilização desta técnica é que a enzima não interage

quimicamente com o polímero, evitando assim, a desnaturação. Porém, pode ocorrer

difusão do substrato e do produto formado através da membrana. As enzimas

encapsuladas apresentam atividade mais elevada em substratos de baixa massa molar,

pois estes se difundem pela membrana e se aproximam com mais facilidade do sítio

ativo do biocatalisador (DALLA-VECCHIA; NASCIMENTO, 2004).

2.1.5 Suportes

A escolha do suporte para o processo de imobilização deve ser avaliada por

algumas propriedades.

Segundo Vieira (2009) o suporte de escolha deve ser quimicamente resistente às

condições em que será ativada, a etapa de imobilização e as condições em que se

processam as reações. Deve ainda possuir grupos químicos que não causem

desnaturação na etapa de ligação com a enzima. Os suportes devem, ainda, ser

resistentes à degradação por microrganismos, insolúveis, não permitindo a liberação da

enzima do suporte, avaliando a possibilidade de reutilização do material.

Estudos indicam como promissor para a aplicação em processos industriais o uso

de suportes inorgânicos por apresentarem alta resistência mecânica, estabilidade

térmica, resistência ao ataque microbiano, e fácil regenerabilidade, porém muitas

enzimas imobilizadas comercialmente estão disponíveis em suportes orgânicos por

apresentarem grupos funcionais reativos. Além disso, a superfície dos suportes

orgânicos apresenta grupos hidroxilas que interagem apenas com grupamentos aminos

ou carboxílicos por adsorção física ou ligação iônica. Para que ocorram ligações do tipo

covalente são necessários ativações ao suporte e por poucas técnicas (TARDIOLI,

2003).

38


2.1.5.1 Resíduos Agroindustriais

A crescente preocupação com o meio ambiente vem mobilizando vários

segmentos do mercado. Inúmeros órgãos governamentais e indústrias estão se

preparando para aplicar uma política ambiental que diminua os impactos negativos à

natureza. O resíduo industrial, depois de gerado, necessita de destino adequado, pois,

além de criar potenciais problemas ambientais, representam perdas de matérias-primas e

energia, exigindo investimentos significativos em tratamentos para controlar a poluição

(PELIZER, 2007).

A economia brasileira está fortemente baseada na produção agrícola, com

produtos como soja, milho, algodão, cana de açúcar, café, mandioca, e vários frutos.

Esta elevada produção resulta em grandes quantidades de resíduos agroindustriais

(GRAMINHA, 2008).

O Brasil é um dos maiores produtores de caju do mundo, tanto da castanha (fruto

verdadeiro) quanto do pedúnculo (falso fruto). A área ocupada com essa plantação no

País é estimada em 700.000 ha, estando mais de 90% localizados na região Nordeste. A

produção de pedúnculos de caju no Brasil é estimada em torno de 1,8 milhões de

toneladas por ano. Porém, o aproveitamento deste pedúnculo é em torno de 15% do

total, gerando um desperdício de frutos (EMBRAPA, 2011, p. 9). Os produtos

industrializados são a principal forma de consumo da fruta dentro e fora do País.

No processo de beneficiamento do caju há a geração de rejeitos, particularmente

no processamento do pedúnculo há a geração de um resíduo orgânico, denominado

bagaço do caju, na proporção de cerca de 15% da massa total de pedúnculos

processados (QUEIROZ, 2010).

Este resíduo foi aplicado na produção de etanol (CORREIA, 2013), em

processos fermentativos como fonte de carbono para a produção de enzimas

(ALCÂNTARA, 2007), como adsorvente de baixo custo para a remoção de metais

potencialmente tóxicos em solução aquosa (MOREIRA, 2009), como suporte para

imobilização de enzimas (SOUZA, 2015) ou emprego do bagaço de caju desidratado na

ração para codornas japonesas (ARAÚJO, 2012).

39


2.1.5.2 Materiais Lignocelulósicos

Biomassas lignocelulósicas são formadas basicamente por celulose,

hemicelulose e lignina. A organização e interações desses componentes contribuem para

a formação de uma barreira natural que reduz o acesso de enzimas hidrolíticas a cadeias

de carbono desses materiais (CORREIA, 2013, p. 23). A Figura 2.4 apresenta a

estrutura da matriz lignocelulósica.

Figura 2.4: Composição da biomassa lignocelulósica. Lignina recobre a matriz

protegendo quanto ao acesso de ataques químicos e enzimáticos.

Fonte: Aguiar (2010).

Esses materiais podem ser divididos com base nos recursos de origem: resíduos

florestais, resíduos urbanos, resíduos de papel e resíduos de culturas (BALAT, 2011).

São exemplos de materiais lignocelulósicos madeira, palha, bagaço de caju, dentre

outros. Sua composição química e estrutural varia de acordo com a natureza genética e

o ambiente em que interagem (BALAT, 2011).

A matriz de um material lignocelulósico possui um arranjo onde as cadeias de

celulose e hemicelulose estão fixadas pela lignina. A celulose promove a rigidez da

estrutura através de ligações de hidrogênio e a lignina atua nos espaços entre as fibrilas

dessa rede agindo como uma barreira física de elevada proteção à estrutura celulósica,

dificultando o ataque enzimático (RABELO, 2010, p. 19).

A celulose responde isoladamente por aproximadamente 40% de toda reserva de

carbono disponível na biosfera, é a fonte mais abundante deste elemento base dos

componentes orgânicos. Está presente em todas as plantas, desde árvores altamente

desenvolvidas até em organismos mais primitivos e seu conteúdo nestas espécies varia

de 20 a 99% (RABELO, 2007).

40


A celulose possui uma estrutura linear ou fibrosa devido à presença sua cadeia

linear dos grupos hidroxila (OH). Esses grupos formam ligações do tipo pontes de

hidrogênio em função do seu posicionamento na unidade glicosídica. As pontes de

hidrogênio entre grupos OH de unidades glicosídicas adjacentes da mesma molécula de

celulose são ligações intramoleculares, responsáveis por certa rigidez das cadeias

unitárias formando a fibra vegetal, já as pontes de hidrogênio entre grupos OH de

moléculas adjacentes de celulose, são as ligações intermoleculares, responsáveis pela

formação das estruturas supramoleculares (FENGEL; WEGENER, 1989).

As fibras de celulose quando em contato com a água e determinados solventes

orgânicos, sofrem intumescimento, podendo ser nas regiões intercristalino ou

intracristalino. Quando ocorre na região intercristalina, o agente invade as regiões

amorfas e os espaços entre elas. Já no intracristalino, os agentes que causam

intumescimento transportam-se para as regiões das microfibrilas (D’ALMEIDA, 1988).

A hemicelulose é o segundo polissacarídeo mais abundante da natureza, sendo

facilmente hidrolisado, quando comparado a celulose, por apresentar uma estrutura

ramificada e amorfa (CORREIA, 2013). Esta estrutura pode conter diversos tipos de

carboidratos, como xilose, arabinose, manose, galactose, glicose, ácidos urônicos

(BARCELOS, 2012, p. 60).

A lignina é outro importante componente dos materiais lignocelulósicos por

proporcionar a sustentação da estrutura. Assim como a hemicelulose, a lignina possui

características amorfas, hidrofóbica e apresenta ramificação complexa (BARCELOS,

2012, p. 61). Atua, inclusive, proporcionando o aumento a resistência da estrutura a

ataques químicos e enzimáticos (TONELOTTO, 2012, p. 38).

A lignificação é uma das etapas finais da diferenciação de células do xilema,

onde a lignina é depositada juntamente com os carboidratos, formando ligações

covalentes com unidades monossacarídicas das hemiceluloses (CARVALHO, 2011, p.

22).

O caju é um exemplo de material lignocelulósico, além de ser um resíduo de

pouco valor comercial. Este material é rico em carbono e pode ser aplicado em

diferentes campos. Como descrito anteriormente, por conter em sua composição lignina,

o que torna a estrutura do bagaço mais resistente a ataques enzimáticos, faz-se

necessário um tratamento do material (CAB) para posterior aplicação, no caso em

estudo, como suporte para os processos de imobilização de enzimas.

41


2.1.5.2.1 Bagaço de caju

O Brasil é um dos maiores produtores de caju do mundo e, os produtos

industrializados são a principal forma de consumo da fruta dentro e fora do país. No

processo de beneficiamento do caju há a geração de rejeitos, particularmente no

processamento do pedúnculo com geração de um resíduo orgânico, denominado bagaço

do caju, que é gerado a partir do processamento provenientes das indústrias de suco de

caju (QUEIROZ et al., 2010).

O cajueiro (Anacardium occidentale L.) é uma planta tropical, originária do

Brasil, dispersa em quase todo o seu território. A Região Nordeste, concentra a maior

área de produção nacional, sendo os estados do Ceará, Piauí e Rio Grande do Norte os

principais produtores (CAJUCULTURA, 2011).

O caju, pseudofruto do cajueiro (Anacardium occidentale L.) gera grande

economia para a região nordeste com fabricação de sucos e doces, e com isso a geração

de resíduos.

O bagaço de caju é pouco aproveitado, com exceção do uso em rações animais,

o restante do resíduo é descartado, ou seja, geram acúmulo de materiais no ambiente e

não apresentam valor comercial. Visando o aproveitamento desse material, estudos em

diversas áreas vêm desenvolvendo pesquisas de incentivo a utilização desse resíduo.

Podemos encontrar na literatura bagaço de caju aplicado como suportes em processos

envolvendo imobilizações de enzimas; Na produção de etanol e na indústria de

alimentos como carne de hambúrguer rico em fibras.

2.1.5.3 Tipos de Tratamentos

A taxa e a extensão da degradação enzimática da celulose estão relacionadas

inversamente ao índice de lignina. Existem vários tipos de tratamento que podem ser

usados para aumentar a susceptibilidade da associação celulose-lignina e assim

melhorar a hidrólise enzimática. Um tratamento é considerado bom se a acessibilidade

ao ataque biológico, isto é, enzimas e microrganismos, é maximizada, e a formação dos

42


co-produtos inibidores é minimizada. A realização destes requerimentos é necessária

para tornar um processo economicamente viável (RABELO, 2007, p. 18).

O tratamento adequado para a matéria-prima em uso será determinado

considerando a aplicação do material, os possíveis rendimentos obtidos em cada

processo e o tipo de matéria-prima empregada (MORO, 2015, p. 17). Vários métodos

para tratamentos têm sido propostos na literatura para separação e aproveitamento de

materiais lignocelulósicos. Tais técnicas são baseadas em processos físicos, químicos,

biológicos ou na combinação destes (CARVALHO, 2011, p 24).

Os tipos de tratamento alteram a estrutura final dos materiais. Tratamentos

físicos, como a moagem e a extrusão não alteram a composição da biomassa, mas

alteram a sua estrutura por meio do aumento da área superficial e redução da

cristalinidade. Os tratamentos alcalinos, oxidativos, biológicos e o AFEX (Ammonia

fiber explosion) removem, principalmente, a fração da lignina, logo a biomassa será

composta predominantemente por hemicelulose e celulose ao final do processo. O

tratamento ácido, explosão a vapor e LHW (Liquid Hot Water) removem a hemicelulose

para a corrente líquida e forma uma corrente sólida rica em celulose e lignina (MORO,

2015, p. 17).

Segue abaixo a descrição de alguns tratamentos utilizados em materiais

lignocelulósicos.

Tratamento Biológico: O objetivo do tratamento biológico é a degradação da

lignina por microrganismos, através da ação de enzimas como as peroxidases e lacases.

Este processo exige longo tempo de residência quando comparado a outras técnicas,

apresentando baixas taxas reacionais. Além disso, a maioria dos microrganismos

consomem parte do substrato diminuindo o rendimento de açúcar

no final do processo (SILVA, 2013, p. 71).

Tratamentos Físico- Químicos podem ser por explosão a vapor quando se utiliza

altas pressões a vapor com faixa de temperatura de ensaio entre 150 a 270 °C, levando

apenas alguns minutos de análise. Há degradação da hemicelulose e pouca remoção de

lignina, incluindo a formação de compostos inibidores da hidrólise; Explosão de vapor

catalisado por SO2 e CO2; Explosão de fibra com amônia, onde a biomassa é adicionada

a solução contendo amônia anidro submetido à elevada temperatura e pressão, sendo a

reação parada causando ruptura física por descompressão. Este método é indicado para

tratamentos que utilizam materiais com baixas concentrações de lignina.

43


Os tratamentos físicos compreendem (GUPTA, 2008, p. 37): fragmentação

mecânica, técnica que reduz o tamanho do material, e requer tempo e energia. E

irradiação, como feixes de elétrons e radiações que necessitam de elevadas taxas

energéticas. Em geral, estes métodos são lentos e de elevado custo.

Os tratamentos físicos facilitam o acesso da enzima à celulose, sem alterar a

composição química do material. Aumentam a área superficial reduzindo a

cristalização.

Os tratamentos químicos podem ocorrer por uso de:

Ácidos, com a utilização de uma gama de reagentes na sua forma concentrada ou

diluída. A forma concentrada requer um determinado cuidado, uma vez que podem

apresentar diversos problemas como formação de inibidores, toxicidade, corrosão,

necessidade de equipamentos resistentes e alto custo de operação e manutenção

(MORO, 2015). Quando diluído podem ser empregados ácido clorídrico, ácido nítrico,

ácido sulfúrico. O tratamento com uso de ácido sulfúrico tem sido muito usado visando

à hidrólise da celulose e por ser um método eficaz com uma ampla diversidade de

materiais lignocelulósicos (GUPTA, 2008). Este tratamento remove aproximadamente

90% da fração de hemicelulose do material, tornando a fração de celulose mais

acessível à ação de enzimas. Porém, o uso de ácido traz como desvantagem a

necessidade de se adicionar uma etapa de neutralização do produto final além de gerar

problemas ambientais com o acúmulo de resíduos recorrentes do tratamento (SILVA,

2013).

Básicos, utilizam reagentes para o tratamento alcalino como o hidróxido de sódio,

amônia, etilenodiamina e hidróxido de cálcio. Este tratamento provoca a remoção da

lignina , aumento da área superficial e diminuição do grau de polimerização (GUPTA,

2008).

Os processos alcalinos tendem a promover maior dissolução da lignina e menor

solubilização/fragmentação das hemiceluloses. Tais processos geralmente utilizam

condições moderadas de operação, em termos de temperaturas e pressões, em

comparação aos sistemas ácidos. O principal efeito desse tipo de tratamento consiste na

remoção da lignina da biomassa, promovendo maior reatividade da fibra (AGUIAR,

2010, p. 42).

A deslignificação oxidativa consiste em um método de dissociação dos

componentes da matriz lignocelulósica que aceleram a hidrólise enzimática e a

44


biodegradação. Esse processo utiliza peróxido de hidrogênio (H2O2) alcalino. O

tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino em resíduos lignocelulósicos aumenta

enormemente a susceptibilidade para a hidrólise enzimática. Várias condições do

processo têm sido estudadas para otimizar a efetividade enzimática (AGUIAR, 2010, p.

43).

No estudo desenvolvido por Correia (2013) foram realizados ensaios com

bagaço de caju para a produção de etanol, utilizando peróxido de hidrogênio em meio

alcalino como método de tratamento da deslignificação do material. Após tratamento,

observou-se que 80,2 % da lignina foi solubilizada, sendo, portanto adequado para uso

na etapa de hidrólise.

O principal efeito dos tratamentos alcalinos é a remoção da lignina e parcial

remoção de hemicelulose, celulose e cristalização parcial de celulose. Durante o

processo a biomassa é embebecida na solução alcalina com controle de temperatura e

tempo. Isso provoca uma menor degradação do açúcar do que a tratamentos ácidos. O

passo de neutralização é necessário, antes da hidrólise enzimática. Além da remoção de

lignina do material lavado também são removidos inibidores, sais, ácidos fenólicos e

furfural (SILVA, 2013).

Uso de solvente orgânicos como metanol, etanol, acetona, etilenoglicol,

trietilenoglicol têm sido aplicados para dissolver a lignina da biomassa, auxiliando a

etapa de hidrólise enzimática. Neste tratamento deve haver uma atenção a reciclagem do

solvente, avaliando a redução do custo final do processo e o cuidado em não causar

danos aos processos fermentativos (GUPTA, 2008, p. 42).

O tratamento líquido com água quente assemelha-se ao vapor de explosão,

provocando a etapa de hidrólise da hemicelulose (GUPTA, 2008, p. 42). O processo

consiste na adição de água à biomassa a alta temperatura e pressão, para manter a água

no estado líquido. A água pressurizada penetra na estrutura da biomassa, desintegra a

matriz lignocelulósica e, devido à acidez da água a elevadas temperaturas, solubiliza e

remove grande parte da hemicelulose. A acidez da água se dá em parte em decorrência

dos ácidos orgânicos, principalmente ácido acético, que são liberados da estrutura da

biomassa nas elevadas temperaturas e agem como catalisadores na hidrólise da

hemicelulose (MORO, 2015, p. 22).

Diante dos tratamentos apresentados, o uso do peróxido de hidrogênio em

condições alcalinas, apresentou-se como um tratamento adequado a ser empregado

45


neste estudo, visando a solubilização da lignina que tornará a matriz de celulose

exposta, auxiliando o ataque enzimático. Esse método é realizado em condições brandas

de pressão e temperatura, não acumula rejeitos, além de eliminar elevados percentuais

de lignina, que poderão ser aplicados em outos processos.

2.1.6 Aplicação dos biocatalisadores

Álcoois quirais são importantes blocos de construção para a síntese de variados

produtos farmacêuticos e químicos de valor acrescentado (L, 2008; BOUZEMI, 2006).

Particularmente, indanol oticamente ativo pode ter o seu grupo hidroxilo facilmente

trocado por um grupo amino que conduz a precursores de drogas, tais como (+) -,

sertralina, (+) - Indatraline, indinavir, Mesilato de Rasagilina (LEE, 2011). Este último é

usado no tratamento da Doença de Parkinson (DP), podendo ser eficaz tanto como

monoterapia na DP precoce e como adjuvante em doentes com o avanço da DP e com

flutuações motoras (KAPUBALU, 2012; FERNÁNDEZ, 2011; HOY, 2012). Este

composto é um potente quiral farmacóforo propargilamina de segunda geração e inibe

irreversivelmente a forma B da enzima monoamina-oxidase (MAO-B) ao longo do tipo

A por um fator de quatorze (CHEN, 2007; PEREZ-LLORET, 2011; FERNÁNDEZ,

2012). Poucos trabalhos tentam a resolução enzimática de uma mistura racêmica do

presente composto (L et al., 2008; YUN et al., 2006; ANILKUMAR et al., 1999; Kajiro

1998, Mitrochkine et al., 1995).

São exemplos de resolução cinética enzimática de indanol racêmico por meio de

acilação, utilizando como catalisadores a lipase de Thermomyces lanuginosus

imobilizada sobre immobead-150 (Fonseca, 2015; Kim, 2015). Seleção de N-acetilação

de (1S, 2R) -1-amino -2-indanol por imobilização da lipase B de CALB foi também

conseguida com um elevado excesso enantiomérico (Kim, 2015).

CAPÍTULO 3

MATERIAIS

E

MÉTODOS

47

Capítulo 3 – Materiais e Métodos Souza, T.C.

3.1- MATERIAIS

3.1.1 Suporte e reagentes de ativação

Bagaço caju – CAB (Anacardium occidentalis L.) foi gentilmente doado pela

indústria Jandaia (Ceará, Brasil) e utilizado como suporte para a imobilização de

enzimas. Glicidol (2,3- epóxi-1-propanol), epicloridrina, etilenodiamina (EDA) e

solução de glutaraldeído 25% foram adquiridos da Sigma Aldrich e utilizados para

ativação do suporte bagaço de caju. Triton® X-100, periodato de sódio, butirato de

paranitrofenila (p-NPB) foram adquiridos da Sigma Aldrich. Todos os outros produtos

químicos utilizados eram de grau analítico.

3.1.2 Enzima

Lipase do tipo B de Candida antarctica – CAL B (6,0 mg. mL-1) foi adquirida

da marca Sigma Aldrich.

3.1.3 Substrato

Butirato de paranitrofenila (p- NPB) foi utilizado para os ensaios de atividade

hidrolítica da enzima.

3.1.4 Reagentes para Eletroforese

Acrilamida, bis- acrilamida, mercaptoetanol, albumina de soro bovino (BSA), N,

N, N’, N’ tetra- etilenodiamina (TEMED), persulfato de amônio 1%, SDS

(dodecilsulfato de sódio), tris básico, comassie blue, glicerol.

48


Marcador de baixo peso molecular com as proteínas: fosforilase (97 000 Da),

albumina (66 000 Da), ovalbumina (45 000 Da), anidrase carbônica (30 000 Da),

inibidor tripsina (20 100 Da), α lactoalbumina (14 400 Da). Marcador de peso molecular

adquirido por GE Healthcare (EUA).

3.2 MÉTODOS

Nesta etapa serão descritas as metodologias empregadas nos ensaios realizados

para a caracterização dos suportes (in natura, tratado com peróxido de hidrogênio em

meio alcalino e funcionalizados), produção de biocatalizadores sob diferentes

condições de imobilização (força iônica e efeito da adição de detergente),

caracterização dos imobilizados produzidos (estabilidade térmica, estabilidade

solvente, estabilidade a estocagem, pH em relação a atividade hidrolítica) e aplicação

na produção de reações em síntese quimioenzimática.

Todas as experiências foram realizadas em triplicata e os resultados são

apresentados como a média destes valores e com desvio padrão (geralmente abaixo de

10%).

49


3.2.1 Etapas Experimentais

O trabalho desenvolvido foi dividido em etapas. Inicialmente, o suporte (CAB-

AHP) foi funcionalizado por diferentes agentes de ativação, avaliando as condições de

imobilização, caracterização dos suportes, derivados formados e aplicação em síntese de

rac- acetato de indanol.

Figura 3.1: Fluxograma dos processos de imobilização e aplicação dos biocatalisadores

formados.

Funcionalização do suporte

Epicloridrina

pHs 5,0; 7,0; 9,0

60 °C

THF 80%

ACN 80%

60°C

Glicidol GEG 5% GEG 10%

Imobilização

Parâmetros de Imobilização

Imob. Multipontual

Imob. Unipontual

Rendimento (%)

Ativ. Derivado

(U/g)

Ativ. Recuperada

Ativ. Teórica (%)

Caracterização do Biocatalisador

Estab. Térmica

pH x Ativ (p- NPB)

Estab. Estocagem

Estab. Solventes

Resolução Cinética Enzimática

CAB-AHP

Fonte: Elaborado pelo autor.

50


3.2.2 Estratégias de Imobilização

Os processos de imobilização foram realizados a partir de protocolos para

ligações covalentes do tipo unipontual e multipontual, e as condições descritas na

Tabela 3.1.

Tabela 3.1: Estratégias de imobilização.

Preparação Estratégias de Imobilização

I Ativação com glicidol + Imobilização Multipontual (25 mM, pH 10,0)

II Ativação com epicloridrina + Imobilização Multipontual (25 mM, pH

10,0)

III Ativação com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 5% + Imobilização

Multipontual (25 mM, pH 10,0)

IV Ativação com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 5%+ Imobilização

Multipontual (0,5% Triton® X-100, 25 mM, pH 10,0)

V Ativação com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 10% +

Imobilização Unipontual (5 mM, pH 7,0)

VI Ativação com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 10% +

Imobilização Unipontual (0,5% Triton® X-100, 5 mM, pH 7,0)

VII Ativação com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 10% +

Imobilização Unipontual (100 mM, pH 7,0)

VIII Ativação com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 10% +

Imobilização Unipontual (0,5% Triton® X-100, 100 mM, pH 7,0)

Fonte: Elaborada pelo autor

51


3.2.3 Preparação do Suporte

3.2.3.1 Tratamento alcalino

O bagaço de caju (CAB) foi tratado com peróxido de hidrogênio em meio

alcalino (AHP) de acordo com as melhores condições obtidas no estudo realizado por

Correia (2013), utilizando uma concentração de sólidos de 5 % (m/v) suspensos em

peróxido de hidrogênio H2O2 (4,3% v/v) a pH 11,5. O tratamento foi realizado em

agitador orbital a 35 oC e 250 rpm por 6 horas. Após o tratamento, a fração sólida e

líquida foi separada por filtração. O objetivo do tratamento foi provocar a

deslignificação do bagaço de caju, proporcionando o aumento da porosidade do

material. A fração sólida foi lavada três vezes com água destilada, seca a vácuo e

armazenada a 4 °C para posterior aplicação como suporte para imobilização de

enzimas.

O teor de lignina no bagaço de caju foi determinado antes e após o tratamento

para verificar a eficiência do processo de deslignificação do material. A metodologia foi

desenvolvida com base no trabalho de Jackson (2009) determinando o teor de lignina

nas frações sólida e líquida.

3.2.3.2 Ativação do suporte

O bagaço de caju (CAB) tratado foi utilizado como suporte para imobilização de

enzimas. A funcionalização do material foi realizada através da adição de agentes como

glicidol, epicloridrina, glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 5% e glicidol-

etilenodiamina- glutaraldeído 10%.

52


3.2.3.2.1 Ativação do suporte com glicidol

A metodologia de ativação usando glicidol foi modificada a partir de Guisán

(1988). Uma massa de 3,0 g de bagaço de caju (CAB) tratados com peróxido de

hidrogênio foram suspensos em 33,8 mL de água, seguidos de adição lenta de 11,3 mL

de hidróxido de sódio (NaOH) 1,7M contendo 2,4 g de borohidreto de sódio (NaBH4),

preparados em banho de gelo. Foram adicionados gota a gota 8,0 mL de glicidol (GLI).

A suspensão foi mantida sob agitação suave durante 18h a 25 °C. Em seguida,

lavou-se o suporte com 30 mL de água destilada e filtrou-se à vácuo. O gliceril- CAB

foi ressuspenso em 30 mL de água e 4,39 mL de periodato de sódio (NaIO4) 100 mM,

para oxidação dos grupos gliceril a produção de grupos glioxil. A mistura foi mantida

sob agitação por 2h, seguidos de lavagem, filtração e armazenamento sob refrigeração.

O consumo de periodato foi determinado retirando-se alíquotas do sobrenadante

no processo de oxidação e a quantificação dos grupos aldeídos formado foi realizada

por iodometria como desenvolvido por Tardioli (2003).

3.2.3.2.2 Ativação do suporte com epicloridrina

Para a ativação com epicloridrina, foram utilizados 5g de bagaço de caju tratado.

A essa massa foram adicionados: 50 mL de solução hidróxido de sódio (NaOH) 2M

contendo 0,3 g de borohidreto de sódio (NaBH4) e 5,0 mL de epicloridrina foram

adicionados lentamente. A mistura foi mantida sob suave agitação, a 4 °C por 15h

(BEPPU et al., 2004). Gliceril- CAB foram lavados, secos a vácuo e suspensos em 30

mL de água Mili-Q e 15 mL de periodato de sódio (NaIO4) 100mM, por 2 horas, a

temperatura ambiente, para a formação dos grupos glioxil (GUISÁN, 1988). Em

seguida, foram recolhidas alíquotas do sobrenadante para a quantificação dos grupos

aldeídos presentes no suporte.

53


3.2.3.2.3 Ativação do suporte com glicidol-etilenodiamina- glutaraldeído 5%

Para a preparação do suporte bagaço de caju ativado com glioxil-

etilenodiamina- glutaraldeído 5%, foram utilizados 13g do suporte CAB-GLI, suspensos

em 52 mL de solução de etilenodiamina 2M, pH 10,0. A solução foi mantida sob suave

agitação por 2h. Em seguida, foram adicionados 0,74 g de borohidreto de sódio

(NaBH4). A reação ocorreu em banho de gelo durante 2h. Em seguida, o suporte foi

seco a vácuo e a massa de suporte foi adicionado uma solução de glutaraldeído 5% em

tampão bicarbonato de sódio 100 mM, pH 10,0, na proporção 1:10 (m/v). A mistura foi

mantida sob agitação por 18h a temperatura ambiente. Em seguida, o suporte foi lavado

e seco a vácuo como desenvolvido por Silva (2012).

3.2.3.2.4 Ativação do suporte com glicidol-etilenodiamina-glutaraldeído 10%

A partir de 13g de suporte bagaço de caju tratado e ativado com glicidol foram

adicionados 52 mL de solução de etilenodiamina 2M, pH 10,0. A mistura foi mantida

sob suave agitação por 2h. Em seguida, foram acrescentados 0,74 g de borohidreto de

sódio (NaBH4), em banho de gelo por 2h. O suporte foi seco a vácuo e a essa massa

foram adicionados uma solução de glutaraldeído 10% em tampão fosfato de sódio 100

mM, pH 7,0, na proporção 1:10 (m/v). A mistura foi mantida sob agitação por 18h a

temperatura ambiente. Em seguida, o suporte foi lavado e seco a vácuo (FERNANDEZ-

LAFUENTE et al., 1993).

3.2.4 Quantificação dos grupos aldeídos

A quantificação dos grupos aldeídos presentes nos suportes ativados com glioxil

e epicloridrina deu-se por iodometria. Após a etapa de oxidação, as amostras do

sobrenadante foram avaliadas para se determinar o grau de oxidação dos grupos OH

54


presentes nos suportes. O periodato não consumido na reação dos grupamentos gliceril

reage com iodeto em excesso formando tri-iodeto, que é quantificado por colorimetria.

As amostras foram analisadas por espectrofotômetro com comprimento de onda de 405

nm.

Os valores de absorbância para a solução padrão correspondiam a 100% de

periodato não consumido. Os valores de absorbância encontrados nos sobrenadantes

quando subtraídos aos padrões correspondiam aos grupos aldeídos formados no suporte,

como descrito por Tardioli (2003).

3.2.5 Caracterizações do Suporte Bagaço de Caju

3.2.5.1 Análise por Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier

(FTIR)

A fim de investigarmos as mudanças provocadas com tratamentos e ativações no

suporte bagaço de caju, foram analisadas as possíveis alterações dos constituintes do

material através da análise por espectroscopia no infravermelho. As amostras foram

secas em estufa a 50 °C, triturados e analisadas em espectrômetro de Transformada de

Fourier VERTEX 70 da Bruker Optics, através de um acessório de Refletância Total

Atenuada (FTIR-ATR), sob um cristal de ZnSe.

3.2.5.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Amostras do suporte foram submetidas a análises em Microscopia Eletrônica de

Varredura para observar as mudanças nas microestruturas entre os materiais. As

amostras foram preparadas para a análise passando pelo processo de secagem (50 °C

por 24h), seguidos de montagem (disposição em stubs), metalização (revestimento com

ouro) usando pulverização catódica e observadas com o auxilio do equipamento

INSPECT S50 FEI.

55


3.2.6 Processo de Imobilização

Após preparação e ativação do suporte, realizou-se o processo de imobilização

da lipase do tipo B de Candida antarctica, como apresentado no esquema 3.2.

Figura 3.2: Esquema das etapas de preparação do biocatalisador.

Fonte: Elaborada pelo autor.

Para o processo de imobilização, 1g de bagaço de caju tratado com peróxido de

hidrogênio em meio alcalino e ativado foi adicionado a 10 mL de solução enzimática

(concentração de proteína de 0,5 mg. mL-1) preparado em tampão. A mistura foi

mantida sob agitação suave a temperatura ambiente. Em determinados tempos, foram

retirados alíquotas que após centrifugação, tiveram seus sobrenadantes analisados.

Depois de imobilizados, os biocatalisadores produzidos passaram pela etapa de redução

das bases de Schiff’s através da adição de 1 mg. mL-1 de solução utilizando borohidreto

de sódio, mantidas sob suave agitação a temperatura ambiente. Os derivados foram

lavados com água destilada abundante para a eliminação do boro residual e tiveram suas

atividades analisadas. A concentração de proteínas da preparação comercial da lipase foi

determinada pelo método de Bradford (1976), como sendo 6,02 mg de proteína.mL-1.

Solução

Enzimática

(0,5 mg. mL-1)

Imobilização

(solução de enzima +

suporte)

Biocatalisador

1 g suporte

CAB AHP

(GLI, EPI, GEG 5%,

GEG 10%)

56


3.2.6.1 Imobilização do tipo covalente multipontual

Para as ligações do tipo covalente multipontual, os suportes ativados com

glicidol, epicloridrina e glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 5% foram utilizados. 1 g

de suporte foi suspenso em 10 mL de preparação enzimática em tampão bicarbonato de

sódio 25 mM, contendo 0,5 mg.mL-1 de proteínas, podendo ou não, ter a adição de 0,5%

de Triton® X-100.

A suspensão de imobilização foi realizada com auxílio de um agitador orbital.

As amostras eram coletadas em determinados tempos, dependendo do processo de

imobilização para cada suporte, e os sobrenadantes avaliados quanto a sua atividade

hidrolítica até que se observasse o decaimento da atividade do sobrenadante. Em

seguida, reduziu-se os derivados com a adição de 1 mg.mL-1 de borohidreto de sódio

por 30 minutos sob agitação suave. Após esta etapa os derivados foram lavados

abundantemente com água destilada, secos a vácuo e caracterizados.

3.2.6.2 Imobilização do tipo covalente unipontual

A imobilização covalente unipontual foi realizada utilizando o suporte glicidol-

etilenodiamina- glutaraldeído 10%. Em 1g de suporte foram adicionados soluções

enzimáticas contendo 0,5 mg.mL-1 de proteínas. Nessa etapa, foram utilizados tampões

fosfato de sódio pH 7,0 alterando a força iônica e a presença ou ausência de 0,5% de

Triton® X-100. As atividades dos derivados foram verificadas por suspensão e

reduzidos com adição de borohidreto, nas condições descritas anteriormente.

Os esquemas 3.3 e 3.4 apontam as etapas de ativação do suporte bagaço de caju

tratado para imobilização de CALB. Para o esquema 3.3 ativação se deu com uso de

glicidol ou epicloridrina nas ligações covalentes do tipo multipontual. Para o esquema

3.4, partindo do bagaço ativado com glicidol, a ativação pode ser do tipo covalente

multipontual (pH 10,0) ou covalente unipontual (pH 7,0), como explanados abaixo.

57


Figura 3.3: Ativação com glicidol ou epicloridrina, formação de CAB- GLI/EPI e etapa

de imobilização/ redução das bases de Schiff’s.


Enzima + Suporte

Suporte

(CAB- AHP)

Glioxil - Suporte Gliceril - Suporte

R=Cl (epicloridrina)

R= OH (glicidol)

Covalente Multipontual

pH 10

58


Figura 3.4: Ativação com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído, formação de CAB-

GEG 5% ou GEG 10% e etapa de imobilização/ redução das bases de Schiff’s


O esquema 3.4 representa as etapas de funcionalização do suporte em bagaço de

caju tratadas com peróxido de hidrogênio em meio alcalino, imobilizadas e, seguidas de

redução das bases de Schiff’s. No esquema utilizou-se a ligação covalente multipontual,

Suporte

(CAB- AHP)

Glutaraldeído Glioxil-amino-suporte

Glioxil-suporte Gliceril-suporte

Glicidol

Lig. Covalente Mutipontual

Suporte glioxil- amino-glutaraldeído

Enzima

59


como explanado, porém, para as ligações realizadas a pH 7,0 as ativações do suporte

também foram propostas a pH 7,0 ao invés de pH 10,0, como apresentado.

3.2.7 Determinação da Concentração de Proteínas e Atividade Enzimática

A concentração de proteína das preparações enzimáticas foi determinada

utilizando o método de Bradford (1976), com curva de calibração padrão utilizando

albumina de soro bovino como referência.

A atividade hidrolítica da lipase do tipo B de Candida antarctica na sua forma

solúvel e imobilizada foi determinada de acordo com a metodologia previamente

descrita por Silva (2012).

Os ensaios foram realizados em espectrofotômetro com comprimento de onda de

400 nm, controle de temperatura (25 °C) e agitação magnética contínua. Foram

adicionados 2,5 mL de tampão fosfato de sódio 25 mM a pH 7,0 e 30 µL de p-NPB (50

mM) em acetonitrila. Uma unidade (Up-NPB) é definida como sendo a quantidade de

enzima capaz de hidrolisar 1μmol de p-NPB por minuto a pH 7,0, 25 mM a 25 oC. As

equações para a medida de atividade descrita para a enzima na sua forma solúvel ou

biocatalisador são apresentadas a seguir:

Atividade para a enzima solúvel:

𝐴𝑡 = ((𝛼. cf .Vr.D)

(Ve))

Sendo:

At= Atividade enzimática (U.mL-1)

α = (slope solução enzima – slope branco) (abs.min-1)

fc= Fator da curva de calibração do pnp (µmoL/(mLabs))

Vr = Volume de reação (mL)

D = Diluição da amostra

Ve = Volume da solução de enzima (mL)

(1)

60


Para a determinação da atividade da enzima na sua forma imobilizada,

apresentamos:

At =𝛼. 𝑓𝑐. (𝑉𝑟

𝑉𝑠𝑒). (

𝑉𝑠

𝑀𝑏)

α = (slope solução enzima – slope branco) (abs.min-1)

fc = fator da curva de calibração do pnp (µmoL/(mLabs))

Vr = Volume de reação (mL)

Vse = Volume de amostra da suspensão enzimática (mL)

Vs = Volume total da suspensão enzimática (mL)

Mb = Massa de biocatalisador (g)

3.2.8 Redução das bases de Schiff’s

A redução para aminas secundárias estáveis e grupos hidroxílicos inertes pode

ser obtida através da adição de borohidreto de sódio (BLANCO; GUISÁN, 1989).

Depois de ocorrido o processo de imobilização, foram adicionados a suspensão 1

mg.mL-1 de borohidreto de sódio, mantidos sob suave agitação por 30 minutos, a

temperatura ambiente. Em seguida, o biocatalisador foi lavado abundantemente, seco a

vácuo, avaliando sua atividade catalítica, seguidos de armazenamento sob refrigeração.

3.2.9 Determinação dos parâmetros de imobilização

Os parâmetros de imobilização foram definidos durante o curso de imobilização.

Durante a imobilização foram retiradas alíquotas da solução enzimática do branco

(solução sem adição de suporte), sobrenadantes de imobilização, e ao final do curso de

imobilização, para verificação da atividade hidrolítica e atividade do biocatalisador,

realizadas por suspensão. Os parâmetros foram definidos através do rendimento de

imobilização (%), atividade recuperada e atividade teórica (U.g-1).

(2)

61


O rendimento de imobilização RI (%), foi definido através da diferença entre a

atividade hidrolítica do sobrenadante (enzima solúvel) inicialmente oferecida (Atof) em

relação à atividade hidrolítica no final do processo de imobilização (Atf), de acordo com

a equação (3):

RI (%) = 𝐴𝑡𝑜𝑓𝑖−𝐴𝑡𝑓

𝐴𝑡𝑜𝑓𝑖. 100 (3)

Sendo:

Atofi = Atividade oferecida no início do curso de imobilização;

Atf = Atividade após o processo de imobilização;

RI = Rendimento de imobilização,%

A atividade recuperada consiste na relação entre atividade do biocatalisador

imobilizado, medida por suspensão (Atd) e atividade teórica (Att) do processo de

imobilização, como na equação 4.

𝐴𝑅(%) = 𝐴𝑡𝑑

𝐴𝑡𝑡. 100 (4)

Sendo

Atd = Atividade do derivado;

Att = Atividade teórica;

AR = Atividade recuperada, %

A atividade teórica foi definida como:

𝐴𝑡𝑡 (𝑈

𝑔) =

𝑅𝐼

100. 𝐴𝑡𝑜𝑓 (5)

Att = Atividade teórica, U.g-1

RI = Rendimento de Imobilização, %

Atof = Atividade oferecida no inicio da imobilização, diluída em tampão.

62


3.2.10 Caracterização dos Biocatalisadores Imobilizados

3.2.10.1 Estabilidade Térmica a diferentes valores de pH

Foram preparados soluções de enzima solúvel e suspensões na sua forma

imobilizada em tampão citrato de sódio 25 mM a pH 5,0, fosfato de sódio 25 mM a pH

7,0 e bicarbonato de sódio 25 mM a pH 9,0. As soluções e suspensões foram incubadas

em frascos fechados e submetidas à temperatura de incubação de 60 °C, com uso de

banho seco com temporizador. Foram coletadas amostras em determinados intervalos

de tempo e avaliados as velocidades das reações, imediatamente, a 25 °C. Seguiu-se o

modelo proposto por Sadana e Henley (1987) ajustando os dados experimentais para

inativação térmica.

Os parâmetros que definem o tempo de meia vida são descritos pela equação (6),

através do ajuste exponencial de decaimento da atividade.

𝐴𝑟 = (1 − αt) 𝑥 𝑒−𝑘𝑑 𝑡 + 𝛼 (6)

Sendo:

Ar = Atividade relativa;

αt = Relação entre atividade no estado final (após o efeito da temperatura a 60 °C) e

estado inicial.

Kd = Constante de desativação térmica (t-1).

A meia- vida (tempo necessário para que a enzima tenha sua atividade reduzida

em 50% em relação à atividade inicial) foi calculada a partir da equação (7).

𝑡 12⁄ =

1

−𝑘𝑑 𝑥 ln

(0,5−𝛼𝑡)

(1−𝛼𝑡)

O fator de estabilidade (FE) foi determinado como a relação entre o tempo de

meia- vida do biocatalisador imobilizado e o tempo de meia- vida da enzima solúvel,

analisadas nas mesmas condições.

(7)

63


3.2.10.2 Estabilidade frente a diferentes solventes orgânicos

CALB na sua forma solúvel e imobilizada foi incubada na presença de misturas

de tetrahidrofurano (THF) / Tampão Tris 100 mM a pH 7,0 (80%/ 20%) e acetonitrila

(ACN)/ Tampão Tris 100 mM a pH 7,0 (80%/ 20%), ambos a 25 °C, sob suave

agitação. Para o controle da solução, foram realizados ensaios sem a presença dos

solventes avaliados. Amostras eram coletadas em determinados tempos, avaliando sua

atividade residual. Os tempos de meia - vida foram calculados segundo modelo

proposto por Sadana e Henley (1987), usando o software Origin 8.1 para a análise e

construção de gráficos.

3.2.10.3 Efeito do pH na Atividade contra p- NPB

Preparações de enzimas na sua forma solúvel e imobilizada (0,1g/1,5 mL) foram

submetidas a diferentes pH’s frente ao ensaio de atividade hidrolítica, utilizando p- NPB

como substrato. Foram utilizados tampão citrato de sódio 25 mM a pH 5,0 e pH 6,0,

tampão fosfato de sódio 25 mM a pH 7,0 e pH 8,0 e tampão bicarbonato de sódio 25

mM a pH 9,0 e pH 10,0.

3.2.10.4 Determinação da estabilidade de estocagem

A estabilidade dos derivados produzidos por ligação covalente foi avaliada

através do acompanhamento da atividade hidrolítica de p- NPB a 25 °C. Após o

processo de imobilização (0,5 mg.g-1 de proteínas oferecidos em relação ao suporte), os

derivados foram lavados, secos e distribuídos em eppendorfs contendo 0,1 g cada. Os

derivados foram estocados sob refrigeração e em determinados dias, avaliaram-se a

atividade residual, descartando- os em seguida.

64


3.2.11 Ensaio de SDS- PAGE

Eletroforese em gel poliacrilamida (SDS- PAGE) foi realizada de acordo com

Laemmli (1970) e utilizada para identificar a pureza das frações enzimáticas de CALB

na sua forma solúvel (solução contendo 0,5 mg de proteína .mL-1) e 0,035 g de

biocatalisador imobilizado com a mesma carga de proteína da enzima solúvel.

Enzima solúvel e imobilizada foi submetida a 100 °C durante 7 minutos e

alíquotas contendo 10 µL de solução foram distribuídas nos poços do gel. O gel de

corrida, 12% de separação em uma zona de 9 cm x 6 cm, com 5% de concentração de

poliacrilamida, foi submetido à voltagem de 150 V, tempo de corrida, aproximadamente

1h e 30 minutos.

A revelação dos géis foi com azul brilhante de Comassie. Os marcadores de

baixo peso molecular (GE Healthcare Life Sciences) utilizados eram compreendidos

entre 14 – 97 KDa.

3.2.12 Aplicação do biocatalisador produzido em bagaço de caju ativado por glicidol-

etilenodiamina- glutaraldeído.

3.2.12.1 Síntese rac- indanol

Foram adicionados 284 mg de borohidreto de sódio NaBH4 (7,5 mmol), gota a

gota a uma solução contendo 500 mg de indanona (3,75 mmol) em 38 mL de metanol a

4 ºC. A mistura da reação foi agitada sob refrigeração durante 30 min e em seguida por

1,5h à temperatura ambiente. Depois dessa etapa o solvente foi evaporado sob pressão

reduzida. A suspensão resultante foi adicionada a 10 mL de água e extraída com acetato

de etila (EtOAc) (3 × 50 mL). As fases orgânicas foram combinadas e secas sobre

sulfato de sódio anidrido (Na2SO4), filtradas e o solvente foi evaporado sob pressão

reduzida, resultando em uma purificação bruta por cromatografia para se obter rac-

indanol com rendimentode 93 %.

65


3.2.12.2 Síntese de rac- acetato de indanila

Foram utilizados 310 µL de trietilamina (Et3N) (2,23 mmol), 143,8 mg de 4-

dimetilaminopiridina (DMAP) (1,25 mol), e 635,5 µL de anidrido acético (6,7 mmol)

em 20 mL de diclorometano contendo 300 mg de cloridrato de rac-indanol (2,23

mmol). A reação ocorreu sob agitação constante durante 2h a temperatura ambiente. Em

seguida, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. Posteriormente foram

adicionados 10 mL de água e extraindo-se com EtOAc (3 × 50 mL). As fases orgânicas

foram combinadas e secas sobre sulfato de sódio anidro (Na2SO4), filtradas e o solvente

foi evaporado sob pressão reduzida. O produto resultante foi purificado por

cromatografia sobre gel de sílica para se obter o rac-indanila desejado com rendimento

de 87%.

3.2.12.3 Procedimento geral para a hidrólise catalisada por lipase em rac-acetato de

indanila

60 mg de lipase do tipo B de Candida antarctica imobilizada em bagaço de caju

ativado com glicidol- etilenodiamina-glutaraldeído foi adicionado a uma solução

contendo 30 mg de acetato de rac-indanila (0,17 mmol) em fosfato de sódio a pH 7,0, e

submetidos a agitação de 250 rpm a 30 ° C. Após 24 h, a reação foi parada por filtração.

Em seguida, os produtos foram extraídos com EtOAc (3 x 10 mL). Subsequentemente, a

fase orgânica foi filtrada e o solvente foi evaporado sob pressão reduzida. O produto

reacional foi finalmente purificado por cromatografia sobre gel de sílica (5-95% de

EtOAc / hexano).

A eficiência da resolução cinética foi avaliada com base na pureza óptica dos

compostos, expressa em termos de excesso enantiomérico do substrato e produto,

usando as equação (8) e (9), sendo A representado pelo enantiômero maioritário e B o

enantiômero minoritário, através das áreas dos picos cromatográficos:

e.e.s = BA

BA

X 100 (8)

66


e.p =

BA

BA

X 100

rac-indanol: Sólido. Rf (10% EtOAc/hexane): 0.25. m.p. 52–55 ºC. 1H NMR (500

MHz, CD3OD) δ (ppm): 1.9 (m, 1H), 2.4 (m, 1H), 2.8 (m, 1H), 3.0 (m, 1H), 5.1 (t,1H, J

= 6.2 Hz), 7.2 (m, 3H) and 7.4 (dd, 1H, J = 6.0 Hz and 2.6 Hz). 13C NMR (125 MHz,

CD3OD) δ (ppm): 29.9 (CH2), 35.9 (CH2), 76.4 (CH), 124.3 (CH), 125.0 (CH), 126.8

(CH), 128.4 (CH), 143.4 (C) and 145.1 (C).

rac-acetato de indanila: Líquido. Rf (5% EtOAc/hexane): 0.53. 1H NMR (300 MHz,

CDCl3) δ (ppm): 2.0 (s, 3H), 2.1 (m, 1H), 2.5 (m, 1H), 2.9 (m, 1H), 3.1 (m, 1H), 6.2 (t,

1H, J = 6.8 Hz), 7.2 (m, 3H) and 7.4 (dd, 1H, J = 7.9 and 2.3 Hz). 13C NMR (75 MHz,

CDCl3) δ (ppm): 21.5 (CH3), 30.4 (CH2), 32.5 (CH2), 78.6 (CH), 125.0 (CH), 125.7

(CH), 126.9 (CH), 129.1 (CH), 141.3 (C), 144.6 (C) and 171.3 (C).

3.2.12.4 Métodos Analíticos de Acompanhamento da reação

Análise dos pontos de fusão do rac-indanol foi conduzida em tubos capilares

abertos Mettler Toledo modelo FP62. 1H, 13C, e DEPT (Distortion less Enhancement

by Polarization Transfer) que identifica a estrutura dos compostos, foram obtidos

utilizando o modelo Espectrômetro Bruker Avance DPX 300 e Avance DRX-500,

operando a frequências de 300 e 500 MHz para o hidrogênio e frequências de 75 e 125

MHz para o carbono, respectivamente. Os desvios químicos são indicados em delta (δ) e

os valores das constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz). A medição da rotação ótica

foi realizada em um espectrofotômetro Perkin-Elmer 241. Análises em cromatografia

em fase gasosa (GC) foram realizadas utilizando o equipamento de modelo Shimadzu

GC 2010 com detector de ionização, utilizando uma coluna quiral CP-Chirasil-DEX (25

m × 0,25 mm × 0,25 mm, 0,5 bar N2). Para o acompanhamento dos cursos de reação:

110 ºC; 0,5 ºC / min 130 ºC (aguardar 15 min); 5.0 ºC / min 140 ºC (aguardar 5 min). Os

tempos de retenção foram os seguintes: (S) -acetato de 32,68 min; (R) -acetato de 33,17

min; (S) -álcool 37,95 min; (R) -álcool 38,98 min.

(9)

CAPÍTULO 4

RESULTADOS E

DISCUSSÕES

68

Capítulo 4 – Resultados e Discussões Souza, T.C.

CAPITULO 4- RESULTADOS E DISCUSSÕES

4. Resultados e Discussões

O capitulo 4 descreve o suporte utilizado nos estudos de imobilização,

caracterizando-os quanto a morfologia, resistência térmica, componentes químicos e

estabilidades. Contém, ainda, os tipos de imobilização envolvidos no estudo, a

produção de biocatalisadores imobilizados em diferentes condições (forca iônica, pH,

uso de Triton® X-100 nos estudos de imobilização) e caracterização dos derivados

produzidos em relação as estabilidades térmica e solventes, relação pH e atividade

hidrolítica e avaliação da estabilidade de estocagem a 4 °C, para aplicação em síntese

quimio- enzimática.

4.1 Caracterizações do Suporte

4.1.1 Infra Vermelho com Transformada de Fourier (FTIR)

Nesse estudo foram avaliadas as possíveis modificações químicas entre os

suportes sem tratamento, tratado com peróxido de hidrogênio em meio alcalino e

funcionalizados com glicidol, epicloridrina, glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 5% e

glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 10%, identificando os grupos para cada suporte

em estudo. As bandas vibracionais obtidas através do FTIR estão explanadas na Figura

4.1, e tem seus espectros baseados em materiais naturais discutidos na literatura.

69


Figura 4.1: Perfil das bandas de vibrações observadas em CAB sem tratamento,

tratados com peróxido de hidrogênio em meio alcalino e funcionalizados com agentes

de ativação.


Materiais lignocelulósicos apresentam, em geral, vibrações referentes à celulose,

hemicelulose e lignina. No gráfico apresentado, todos os espectros possuem picos largos

e intensos referentes a hidroxilas de celulose (OH), ou seja, mesmo após tratamento e

ativação, estes componentes não foram alterados. Para CAB- GEG 10% este pico foi

observado em 3375 cm-1, para CAB- GEG 5% em 3365 cm-1, CAB- EPI em

aproximadamente 3340 cm-1, CAB- GLI em 3336 cm-1, bagaço sem tratamento

apresentou número de onda de 3315 cm-1 e para o bagaço tratado com peróxido de

hidrogênio alcalino, este pico foi apresentado em 3334 cm-1. Nos estudos realizados por

BRÍGIDA (2010), esse grupamento foi determinado em 3344 cm-1 para fibras de coco,

assim como bagaço de cana-de-açúcar (MIRANDA, 2009). Para fibras de açaí e fibras

de curauá, as ligações de hidrogênio da celulose foram identificadas em 3350 cm-1 e 330

cm-1, respectivamente (GEHLEN, 2014). Estes picos também foram identificados em

quitosana e quitosana ativada com glicidol e glutaraldeído, nos estudos de SILVA

(2012), justificando o aparecimento em todos os espectros como uma possível falha na

etapa de oxidação dos grupos gliceril a glioxil.

70


Foram observadas bandas próximas presentes em todos os suportes, referentes

aos grupamentos alifáticos metil (CH3) distribuídas na região de 2943 cm-1 para o CAB-

GEG 10%, em 2925 cm-1 para CAB- GEG 5%, 2922 cm-1 para o bagaço funcionalizado

com epicloridrina e glicidol, 2920 cm-1 e 2918 cm-1 para CAB sem tratamento e tratado

com peróxido de hidrogênio em meio alcalino, respectivamente. Para os grupamentos

correspondentes ao metileno (CH2), foram identificados em: CAB- GEG 10% e 5%, em

2859 cm-1 e 2860 cm-1, CAB- EPI e CAB- GLI, 2852 cm-1, CAB- IN e CAB- AHP,

2850 cm-1, respectivamente. Nos estudos com fibra de açaí e fibra de curauá, Gehlen

(2014) identificou estes grupamentos nas fibras em 2920 cm-1, 2846 cm-1 e 2853 cm-1.

Bandas entre 1705 cm-1 e 1737 cm-1 foram encontradas em todos os suportes

analisados, sendo estes números de onda referentes à deformação axial de C=O

(GEHLEN et al., 2014). Para fibras de coco verde, este grupo encontra-se em 1728 cm-1

(Brígida et al., 2010) e em 1723 cm-1 para cana de açúcar, como no estudo de ALVES

(2011).

As vibrações em 1649 cm-1 estão associadas aos grupamentos carboxílicos

presentes na lignina (C=O). Vibrações próximas a está foram encontradas em todos os

suportes analisados neste trabalho.

Apenas as amostras de CAB- GEG 10% e CAB- GEG 5%, apresentaram

vibrações em 1606 cm-1e 1608 cm-1, respectivamente. Dados da literatura apontam que

em 1604 cm-1 estão disponíveis os aromáticos e alifáticos referentes aos grupos (C=C),

(HAACK, 2010).

Entre 1500 cm-1 e 500 cm-1 os picos mostraram perfis bem próximos, sendo

estes explanados a seguir.

Em torno de 1512 cm-1 encontram-se os grupamentos referentes a vibrações de

lignina dos anéis de benzeno do tipo guaiacílicos (ABREU et al., 2011). Para o CAB-

GEG 10% este grupo foi encontrado em, aproximadamente, 1505 cm-1, CAB-GEG 5%

em 1496 cm-1, CAB-EPI e CAB-GLI apresentaram, respectivamente número de onda de

1508 cm-1 e 1506 cm-1, CAB- IN em 1489 cm-1e CAB-AHP em 1510 cm-1. Através da

Figura 4.1, podemos observar que houve uma diminuição da banda nos suportes

funcionalizados. Isso pode ser decorrente a remoção parcial da lignina e das ativações

sucessivas em que os suportes foram submetidos após tratamento com peróxido de

hidrogênio alcalino, alterando as propriedades do material, como esperado.

71


Picos próximos foram identificados em todas as amostras, estando entre 1402

cm-1 e 1438 cm-1. Estes picos podem estar relacionados a deformações assimétricas dos

grupos metila da celulose. No estudo realizado por SILVA (2012) com amostras de

agarose, os picos foram deslocados em 1439 cm-1 e podem estar associados a grupos

OH e NH referentes à adição de glutaraldeído no suporte.

Os suportes CAB- GEG 5% E CAB-AHP apresentaram vibrações em torno de

1365 cm-1. Para CAB- EPI e CAB-GLI, as vibrações foram determinadas em 1363 cm-1.

O bagaço tratado e funcionalizado com GEG 10% teve o pico em torno de 1349 cm-1 e

podem ser associados aos picos de 1366 cm-1 e 1370 cm-1 referentes aos grupos

alifáticos metil e OH em fenol, encontrados no estudo de ALVES (2011) para cana de

açúcar e eucalipto, respectivamente.

O bagaço funcionalizado com epicloridrina apresentou vibração em 1319 cm-1

decorrente de deformação angular da hidroxila (OH) presentes nos anéis aromáticos da

lignina. Estas vibrações foram ainda identificas em amostras de fibras lignocelulósicas,

açaí e curauá, no trabalho desenvolvido por Gehlen (2014) ou em 1318 cm-1para cana

de açúcar e eucalipto (ALVES et al., 2011).

CAB-GEG 10% e CAB-GEG 5% exibiram vibrações em 1231 cm-1, referentes a

grupos acetil (-COR) decorrentes da hemicelulose (ALVES, 2011; GEHLEN, 2014;

BRÍGIDA, 2010).

Finalizando este estudo, picos entre 1026 cm-1 e 1031 cm-1, de alta intensidade

foram identificados em todos os suportes avaliados. Estas vibrações são típicas de

alterações simétricas C – O – C para grupos metoxilas e C – O para celulose,

hemicelulose, e em poucas quantidades para lignina como nos estudos realizados com

fibra de coco (BRÍGIDA, 2010).

A variação da intensidade de determinadas bandas são características da

eliminação de parte dos constituintes através do tratamento alcalino no material e

surgimento de grupamentos decorrentes da funcionalização do suporte.

72


4.1.2 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

4.1.2.1 Microscopia Eletrônica de Varredura dos suportes: in natura, tratado com

peróxido de hidrogênio em meio alcalino, tratados e funcionalizados com glicidol,

epicloridrina, glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 5% e glicidol- etilenodiamina-

glutaraldeído 10%

As análises em microscopia eletrônica foram realizadas a fim de

compreendermos as mudanças morfológicas ocorridas nas superfícies dos suportes com

tratamentos e ativações em comparação com o bagaço sem tratamento. A Figura 4.2 A

corresponde ao bagaço de caju in natura – CAB IN (sem tratamento). É possível

verificar que a superfície do material é irregular e apresenta estruturas em diferentes

tamanhos e formas, impedindo possíveis ligações entre suporte e enzima. Essas

estruturas, classificadas como gotículas e ceras, também foram identificadas no trabalho

de Correia (2013). Com o tratamento usando peróxido de hidrogênio em meio alcalino

CAB – AHP (Fig 4.2 B) ocorreu à deslignificação do suporte, aumentando as

concentrações de celulose e hemicelulose, proporcionando melhores condições para

utilização com enzimas. A superfície do material se apresenta uniforme em relação ao

do bagaço sem tratamento, auxiliando possíveis ativações do material. Assim, com base

nas características morfológicas apresentadas após tratamento com peróxido de

hidrogênio alcalino, o suporte mostrou-se promissor para as etapas de funcionalização.

No trabalho de Brígida (2010) estudou-se a utilização da fibra de coco verde. O

tratamento da fibra com peróxido de hidrogênio foi o de melhor eficiência para a

remoção das gotículas de ceras, como podemos confirmar, também, nos estudos

realizados nesse tópico.

O CAB- GLI (Fig 4.2 C) e CAB – EPI (Fig 4.2 D) apresentam uma superfície

densa e rugosa, com pequenos espaços. Esses suportes quando utilizados no processo de

imobilização apresentaram intumescimento, dificultando a imobilização e a aplicação

do derivado. O suporte CAB- GEG 5% (Fig 4.2 E) apresentou uma superfície irregular

com muitos espaços no material, como se o suporte tivesse sido “triturado”. Isto indica

que o suporte mostra-se como vantajoso quando aplicados nos cursos de imobilização e

73


tendem a apresentar biocatalisadores imobilizados com elevadas atividades catalíticas,

uma vez que houve a remoção da lignina, através do tratamento com uso de peróxido de

hidrogênio em meio alcalino e a adição de compostos, na etapa de funcionalização, que

tornam as ligações entre o material e enzima possíveis. O CAB-GEG 10% (Fig 4.2 F)

apresentou uma superfície densa, supondo que as ligações entre enzima e suporte nos

processos de imobilização serão efetivas.

O bagaço de caju tratado e funcionalizado com glicidol e epicloridrina não

apresentou características favoráveis à utilização para as etapas de imobilização, como

será mostrado no tópico 4.2.1. Os suportes CAB- GEG 5% e CAB- GEG 10% (Fig 4.2

E e F) mostraram-se como promissores para aplicação em imobilização de enzimas.

Figura 4.2: Microscopia Eletrônica de Varreduras, amostras (A) Superfície do CAB- In

natura (sem tratamento) (300x); (B) CAB - AHP (300x); (C) CAB - GLI (5301x); (D)

CAB - EPI (8010x), (E) CAB - GEG 5% (500x) e (F) CAB - GEG 10% (3400x).

(A) (B)

(C) (D)

74



4.2 Imobilização Covalente Multipontual

4.2.1 Parâmetros de imobilização da enzima CALB utilizando bagaço de caju tratado

e ativado com glicidol e epicloridrina

Os resultados referentes aos ensaios de imobilização multipontual para os

biocatalisadores produzidos a partir dos suportes ativados com glicidol e epicloridrina

estão explanados na Tabela 4.1.

Tabela 4.1: Parâmetros de imobilização para os derivados formados com uso dos

suportes CAB-GLI e CAB-EPI, após 24h de imobilização.

Biocatalisador Atividade do derivado

(U.g-1)

RI (%) AR (%)

CAB-GLI 0,22 ± 0,19 39,6 1,25

CAB-EPI 0,21 ± 0,22 68,1 1,17


Dos parâmetros apresentados na Tabela 4.1, observa-se que ambos os

biocatalisadores produzidos, CAB-GLI e CAB-EPI não obtiveram consideráveis

(E) (F)

75


atividades catalíticas (0,22 ± 0,19 e 0,21 ± 0,22 U.g-1) respectivamente, apresentando

ainda baixa atividade recuperada (1,25% para CAB-GLI e 1,17% CAB-EPI), apesar do

tempo de incubação de 24h. Contudo, para o derivado ativado com epicloridrina, o

rendimento de imobilização foi aproximadamente 1,7 vezes maior do que o derivado

com CAB- GLI.

A baixa porosidade do material e a pouca disponibilidade de grupamentos

aldeídos podem ter colaborado para esses baixos valores de rendimentos, atividade

recuperada e atividade do derivado, além do fato do material sofrer intumescimento

durante o processo. As Figuras 4.2 (C e D) mostram a morfologia dos suportes CAB-

GLI e CAB-EPI, com superfícies de aspecto encorpado, rugoso e aparente tumidez.

Utilizando bagaço de caju como suporte nos cursos de imobilização, Bezerra (2012)

evidenciou o fato de o material utilizado ter pouca área superficial e baixa porosidade,

justificando o baixo rendimento de imobilização (38,7%) e a baixa atividade recuperada

(2,9%), alcançadas.

Os suportes ativados com glicidol e epicloridrina durante as etapas de ativação e

curso de imobilização mostraram certa instabilidade, apresentando-se hidrofílicos,

podendo ter alterado a exposição dos grupamentos na superfície do suporte,

provavelmente dificultando o processo de ativação, apresentando baixas atividades

catalíticas e intumescimento, desde o processo de ativação ao de imobilização, o que

dificultou, inclusive, a realização do experimento, como explanados na Fig 4.3 (A e B).

Figura 4. 3 (A e B): (A) CAB- AHP ativado com glicidol; (B) CAB- AHP ativado com

epicloridrina.


(A) (B)

76


Durante o processo de oxidação para a formação dos grupos aldeídos ocorrida na

etapa de funcionalização do suporte ativado por glicidol e epicloridrina, foram

realizadas análises para verificar a quantidade de grupos aldeídos disponíveis no

suporte. Para os suportes ativados com glicidol, 97% dos grupos aldeídos foram

ativados e disponíveis no suporte. Porém, para oxidação do suporte ativado com

epicloridrina, foram identificados, aproximadamente, 32% dos grupos aldeídos

oferecidos durante esta etapa. As baixas atividades encontradas nos derivados

produzidos a partir do CAB- EPI podem ser justificadas, ainda, por uma falha na etapa

de oxidação dos grupamentos, uma vez que o percentual de grupos disponíveis no

suporte foi baixo. Para o caso do suporte CAB- GLI, este apresentou um aumento de

absorção de água, como mencionado anteriormente, o que dificultou a etapa de

imobilização e realização das análises subseqüentes.

Como os derivados apresentaram instabilidades e baixos valores de atividade

catalítica, estes biocatalisadores não foram selecionados para os estudos de

caracterização dos derivados, uma vez que seriam inviáveis nos processos.

4.2.2 Parâmetros de imobilização da enzima CALB utilizando bagaço de caju tratado

com peróxido de hidrogênio em meio alcalino e ativado com glicidol –


4.2.2.1 Imobilização de CAB- GEG 5% (25 mM, pH 10,0) e CAB- GEG 5% (25 mM +

0,5% Triton® X-100, pH 10,0)

Este tópico propõe uma nova metodologia de ativação para o suporte bagaço de

caju, uma vez que os suportes ativados com glicidol e epicloridrina apresentaram baixas

atividades e tumidez. Assim, o suporte ativado com glicidol- etilenodiamina-

glutaraldeído 5% foi utilizado para as imobilizações da lipase de CALB.

A Fig 4.4 mostra o perfil de imobilização com decréscimo de atividade

enzimática do sobrenadante de imobilização em um período de 2h.

77


Figura 4.4: Perfil de imobilização utilizando bagaço de caju ativado com glicidol-



Foi possível observar que em 1h, a atividade oferecida no ensaio de imobilização

decresceu rapidamente, indicando a imobilização da enzima no suporte.

A partir das atividades oferecidas inicialmente e atividades residuais, foram

calculados os parâmetros de imobilização: rendimento de imobilização, atividade do

derivado, atividade recuperada. Com 2h de ensaio, o rendimento de imobilização foi de

99%.

Um segundo ensaio foi realizado, porém agora com adição de 0,5% de Triton®

X-100, um surfactante não iônico, na solução enzimática. As imobilizações tiveram a

mesma carga de proteínas oferecidas: 0,5 mg.g-1 suporte. Para a imobilização com

adição de Triton® X-100 em duas horas de ensaio a enzima foi imobilizada quase que

totalmente, apresentando rendimento de 97, 1%.

A Tabela 4.2 mostra os parâmetros de imobilização encontrados nos ensaios

com e sem a adição de 0,5% de Triton® X-100.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

0

20

40

60

80

100

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%

)

Tempo (h)

78


Tabela 4.2: Parâmetros de imobilização para os derivados formados por ligações do

tipo covalente multipontual ativados com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 5%,

após 2h de imobilização.

Biocatalisador Atividade do derivado

(U.g-1)

RI (%) AR (%)

CAB-GEG 5% 22, 5 ± 0, 59

99,0 111,7

CAB-GEG 5% +

Triton® X-100

38,8 ± 0,37 97,1 195,8


Observa-se na Tabela 4.2 que tanto a imobilização na presença como ausência

de Triton® X-100 resultou em derivados com elevadas atividades catalíticas e atividade

recuperada. No caso da adição do detergente, a atividade do derivado foi

aproximadamente 1,7 vezes maior quando relacionado ao biocatalisador sem detergente,

ou seja, o uso do detergente favoreceu a imobilização da enzima estabilizando a

conformação aberta, expondo seu sítio ativo ao meio reacional e favorecendo o processo

de hiperativação, como observado pelos valores encontrados na atividade recuperada,

para os derivados CAB – GEG 5% e CAB- GEG 5% na presença de detergente.

Ressalta-se que o uso de detergentes em imobilizações de enzimas esta relacionado ao

efeito que o mesmo causa no processo, rompendo os dímeros das enzimas, melhorando

as velocidades das reações (MANOEL et al., 2015). A escolha do Triton® X-100 foi

por se tratar de um detergente muito aplicado nos processos de imobilização desta

enzima (CALB).

O efeito positivo do uso de detergentes também foi observado nos estudos de

Sousa (2015), utilizando glutaraldeído como agente funcional na ativação dos suportes.

Neste estudo, Sousa (2015) imobilizou CALB em agarose sob diferentes condições,

apresentando os melhores resultados a pH 10,0 com uso de Triton® X-100 e leituras

realizadas com p-nitrofenil butirato com 3h de imobilização.

O uso do glutaraldeído nas ativações dos suportes tem se apresentado como um

método simples e que pode promover melhorias na estabilidade enzimática decorrentes

das interações entre o agente e a enzima (VIEIRA et al., 2009), além do curto período

de imobilização devido a elevada reatividade do reagente, como observado neste estudo.

79


Outro fator importante foi o braço espaçador formado por esse suporte quando

utilizamos três agentes de ativação. A adição de EDA ao suporte tornou o braço

espaçador maior o que pode ter melhorado o acesso da enzima ao suporte, favorecendo

as etapas de imobilização (SILVA et al., 2012), tornando o processo mais rápido. Esses

agentes, quando interligados na matriz, resultaram em um suporte promissor para a

imobilização de enzimas.

Todos os ensaios foram realizados durante 2h. As imobilizações foram

realizadas em suportes superativados e a enzima submetida a condições de pH alcalino.

4.2.3 Caracterização dos Biocatalisadores produzidos

4.2.3.1 Estabilidade Térmica em diferentes condições

Foram realizados ensaios de estabilidade térmica para a enzima na sua forma

solúvel (tempo de meia-vida em minutos à pH 5,0 = 6,02, pH 7,0 = 1,99 e pH 9,0 = 5) e

para os biocatalisadores ativados com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 5%. Os

resultados estão explanados na Tabela 4.3. As imobilizações ocorreram na presença e

ausência de 0,5% de Triton® X-100. O detergente foi adicionado nos ensaios para

favorecer a estabilização enzima- suporte na etapa de produção dos biocatalisadores,

além de auxiliar na conformação aberta da lipase. As estabilidades foram realizadas sob

as condições: 25 mM, pHs 5,0, 7,0 e 9,0 a 60 °C em banho seco. A partir dos dados

experimentais apresentados na Fig 4.5 (A e B), os parâmetros de inativação térmica

foram estimados pelo método proposto por Sadana e Henley (1987) e apresentados na

Tabela 4.3.

80


Figura 4.5: Perfil de desativação da lipase do tipo B de Candida antarctica imobilizada

em bagaço de caju tratado e ativado com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 5% (A)

sem adição de Triton® X-100, (■) biocatalisador a pH 5,0, (●) biocatalisador a pH 7,0 e

(▲) biocatalisador a pH 9,0. (B) com Triton® X-100 (■) biocatalisador a pH 5,0, (●)

biocatalisador a pH 7,0 e (▲) biocatalisador a pH 9,0, a 60 °C.


Através da Figura 4.5 (A e B) referentes a atividade relativa em função do

tempo, para as várias condições de pH em que os biocatalisadores foram submetidos,

podemos observar que para ambos os casos (na presença e ausência de detergente) os

biocatalisadores que apresentaram maiores tempos de meia-vida foram os ensaiados a

pH 5,0 (■).

Foram utilizadas três diferentes pHs para simular as possíveis condições em que

o biocatalisador pode ser utilizado, avaliando um pH com caráter mais ácido, um neutro

e um pH alcalino.

Sabemos que as mudanças de pH podem alterar a zona do centro ativo, causado

mudanças. Este fator pode promover a exposição ou não dos aminoácidos relacionados

à atividade catalítica, alterando a conformação da tríade catalítica. Com base na Figura

4.5 (A e B) e na Tabela 4.3, o pH que apresenta maior estabilidade para os

biocatalisadores testados foi a pH 5,0.

A Tabela 4.3 apresenta os tempos de meia- vida dos biocatalisadores em estudo

neste tópico assim como as condições de ensaio.

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

0

20

40

60

80

100

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%

)

Tempo (min)

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%)

Tempo (min)

(B) (A)

81


Tabela 4.3: Parâmetros de Inativação em diferentes condições para o CAB- GEG 5% e

CAB- GEG 5% com 0,5% Triton® X-100.

Condições de Inativação, 60 °C

Biocatalisadores pH t1/2(min) Kd (min-1) R2 FE

CAB- GEG 5%

5,0 32, 9 0, 0300 0, 90 5, 46

7,0 13, 00 0, 0718 0, 97 6,53

9,0 7, 50 0, 1525 0, 99 1,5

CAB- GEG 5%

+

0,5% Triton® X-

100

5,0 29, 8 0, 0179 0, 97 4,95

7,0 20, 5 0, 0444 0, 99 9,23

9,0 7, 23 0, 1256 0, 99 1,45


Avaliando inicialmente o biocatalisador imobilizado em CAB- GEG 5%

submetido a ensaios de estabilidade térmica (60 °C) nos pHs 5,0, 7,0 e 9,0 a melhor

condição alcançada foi encontrada quando o imobilizado foi analisado a pH 5,0, tendo

seu tempo de meia-vida, aproximadamente, 2,5 vezes maior do que o mesmo derivado a

pH 7,0 e 4,4 vezes maior quando comparado ao submetido a pH 9,0.

O CAB-GEG 5% na presença de detergente também apresentou maior tempo de

meia-vida na condição de ensaio a pH 5,0 e menor tempo de meia-vida a pH 9,0, tendo

este apresentado um perfil de decaimento, aproximadamente 4 vezes menor, como

aconteceu com o biocatalisador sem adição de detergente.

Ambos os derivados submetidos a pH 9,0, apresentaram tempos de meia-vida

bem próximos.

Quanto ao fator de estabilização, ambos os derivados produzidos e submetidos a

pH 7,0 foram mais termoestáveis do que os de pH 5,0 e pH 9,0 e em relação a enzima

na sua forma solúvel, nas mesmas condições. A enzima na sua forma solúvel quando

exposta a condições extremas de temperatura, apresenta certa instabilidade, podendo

sofrer alterações conformacionais em seu sítio ativo, provocando danos irreversíveis

(SILVA et al., 2012).

Nos estudos de Brígida (2010) foi utilizado fibra de coco para imobilizar CALB

submetendo os derivados a estabilidade térmica a 60 °C, pH 7,0. A estabilidade térmica

82


em fibra de coco tratada com peróxido de hidrogênio apresentou tempo de meia-vida de

11,4 minutos, ou seja, menor do que os valores obtidos neste estudo com o suporte

bagaço de caju tratado com peróxido de hidrogênio e ativados com glicidol-

etilenodiamina- glutaraldeído 5%. A funcionalização do suporte com o uso de agentes

de ativação torna as estruturas dos biocatalisadores mais rígidas, sendo mais resistente a

inativação por elevadas temperaturas, uso de solventes orgânicos ou outros agentes

desnaturantes (GUISÁN, 1988). Além disso, estudos apontam a elevada estabilidade

formada entre os grupos amino – glutaraldeído (BETANCOR et al., 2006), o que

justificaria os derivados produzidos com suportes ativados com glutaraldeído estarem

mais estáveis quando comparados aos sem ativação.

Assim, os derivados produzidos foram mais estáveis termicamente (60 °C) do

que a enzima na sua forma solúvel, apesar das possíveis falhas nas interações entre os

grupamentos causadas pelo uso de pH alcalino (pH 10,0) na etapa de funcionalização

do suporte com glutaraldeído, podendo ter ocasionado uma diminuição da reatividade

dos grupos aldeídos formados.

4.2.3.2 Estabilidade na presença de solventes orgânicos

Foram realizados ensaios de estabilidade frente a solventes orgânicos. Os

biocatalisadores foram incubados na presença de tetrahidrofurano (THF) 80% e

acetonitrila (ACN) 80% em tampão Tris HCl 100 mM, pH 7,0 a 25 °C. O THF foi

utilizado por ser o co- solvente que participa da fase orgânica das aplicações dos

biocatalisadores, frequentemente utilizado em reações com lipases uma vez que não

inibi a ação da enzima e possui alta solubilidade em diversos substratos. Os parâmetros

de inativação foram alcançados através do modelo proposto por Sadana e Henley

(1870).

A Figura 4.6 mostra o perfil de inativação na presença do solvente THF

(80%/20%) em Tris HCl (v/v) para os biocatalisadores formados e enzima solúvel (25

°C).

83


0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%

)

Tempo (min)

Figura 4.6: Perfil de inativação na presença do solvente THF 80% para (■) enzima

solúvel, (●) biocatalisador CAB- GEG 5% e (▲) biocatalisador CAB- GEG 5% com

adição de detergente.


Com base na Figura 4.6, podemos observar que o biocatalisador preparado com

adição de detergente foi mais estável quando comparado ao biocatalisador sem adição

de 0,5% de Triton® X-100 e a enzima solúvel.

A Tabela 4.4 apresenta os tempos de meia-vida para os imobilizados submetidos

ao contato com o solvente tetrahidrofurano (THF).

Tabela 4.4 - Parâmetros de inativação dos biocatalisadores produzidos na presença do

solvente tetrahidrofurano (THF), a 25 °C.

Biocatalisadores t1/2(min) Kd (min-1) R2 FE

CAB- GEG 5%

15, 52

0, 1031

0, 91

4, 81

CAB- GEG 5%

+ 0,5% Triton® X-

100

60

0, 0278

0, 95

18, 6


O biocatalisador (CAB-GEG 5%) imobilizado na presença de 0,5% de Triton®

X-100 (v/v) apresentou elevada estabilidade quando em contato com o solvente THF

84


80% (v/v), sendo 18,6 vezes mais estável que a enzima livre e 3,8 vezes mais estável

que o biocatalisador preparado na ausência de Triton® X-100, submetido às mesmas

condições.

Estudos com lipases e a adição de Triton® X-100 nos processos de imobilização

confirmam o efeito de hiperativação no processo. Partes hidrofóbicas da molécula de

detergente interagem com a enzima, expondo os resíduos hidrofóbicos dos centros

ativos da enzima, melhorando as etapas de imobilização, proporcionando derivados

mais estáveis (MATOS et al., 2014), o que pode ter acontecido para estes imobilizados

na presença de detergente.

Para as estabilidades utilizando acetonitrila (ACN) 80% em tampão Tris HCl

100 mM a pH 7,0, a enzima solúvel apresentou tempo de meia- vida de 0,53 minutos,

como representado na Fig 4.7. Para os biocatalisadores imobilizados na ausência e

presença de Triton® X-100 os tempos de meia-vida foram superiores à 96h. A enzima

imobilizada em bagaço de caju ativado com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 5%,

em 96h de ensaio, apresentou 52% da atividade inicial. Para o mesmo suporte

imobilizado na presença do detergente na solução enzimática, em 96h, o derivado

manteve 75% da sua atividade catalítica em relação ao início do ensaio, confirmando,

mais uma vez, a melhora na estabilidade provocada pela presença de detergentes. É

necessário a realização de mais ensaios para se determinar o tempo de meia-vida dos

derivados na presença de acetonitrila.

Figura 4.7: Perfil de desativação da enzima solúvel na presença do solvente ACN 80%

em tampão Tris HCl 100 mM, pH 7,0.


0 2 4 6 8 10 12 14 16

0

20

40

60

80

100

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%

)

Tempo (min)

85


4.2.3.3 Efeito do pH na atividade enzimática (p- NPB)

Mudanças de pH podem alterar a conformação das enzimas, seja na sua forma

solúvel ou imobilizada. Visando a obtenção do pH ótimo ou de uma faixa de pHs em

que as enzimas apresentam elevadas atividades catalíticas, foram realizados ensaios

alterando o pH (5, 6, 7, 8, 9, 10) em função a atividade hidrolítica.

A Figura 4.8 mostra o perfil da atividade hidrolítica em função dos diferentes

pHs para a enzima na sua forma solúvel e para os biocatalisadores ativados com

glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 5% na ausência e presença de Triton® X-100.

Figura 4.8: Perfil do pH em relação a atividade enzimática usando p- NPB como

substrato. A atividade foi realizada a 25 °C. (■), Enzima solúvel; (●): Biocatalisador

imobilizado CAB- GEG 5%, (▲): Biocatalisador imobilizado CAB- GEG 5% na

presença de 0,5% de Triton® X-100 na solução de imobilização.


Através da Figura 4.8, observamos que da ampla faixa de pH em que os

derivados e enzima livre foram ensaiados, enzima solúvel (■), imobilizada (●) e

imobilizada na presença de Triton® X-100 (▲) apresentaram melhores valores de

atividade hidrolítica a pH 8,0. Essa lipase é considerada alcalina exatamente pela faixa

de pH em que a mesma apresenta maiores atividades catalíticas. No estudo realizado por

Brígida (2010), a lipase CALB, apresentou maior atividade a pH 9,2, utilizando pNFL.

5 6 7 8 9 10

0

20

40

60

80

100

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%

)

pH

86


A enzima na sua forma solúvel obteve elevados valores de atividade na faixa de

pH 7,0 – 9,0, o que também pôde ser observado para o biocatalisador preparado com

adição de detergente. Ambos apresentaram máxima atividade a pH 8,0. A pH 10,0, o

biocatalisador preparado na presença de detergente apresentou um decaimento da

atividade em torno de 35%. A enzima solúvel nesta condição apresentou um decréscimo

da sua atividade em relação à máxima atividade do ensaio (pH 8,0) em

aproximadamente, 70%.

Para o biocatalisador imobilizado CAB- GEG 5%, na condição submetida a pH

9,0 sua atividade foi consideravelmente menor quando comparado ao CAB- GEG 5%

com detergente e em relação a enzima solúvel. Sua máxima atividade foi a pH 8,0,

tendo um decréscimo de 95% a pH 10,0. Das três condições testadas, o derivado

preparado na presença de detergente foi o que apresentou maiores valores de atividade

para pH 9,0 e 10,0.

A variação de atividade em relação ao pH pode estar relacionada ao

comportamento do arranjo referente a tríade catalítica em relação ao pH de ensaio. Pode

ainda estar associado às pequenas distorções ou diminuição da mobilidade da tampa que

provocam modificações nas características da enzima, e que dependendo das

preparações, pode existir um equilíbrio entre a forma aberta/fechada (SOUSA et al.,

2015).

4.2.3.4 Estabilidade de Estocagem

Um parâmetro relevante para a caracterização do biocatalisador produzido é a

estabilidade à estocagem que pode variar em relação ao tipo de imobilização, pH e

suporte (BRÍGIDA, 2006). A estabilidade de armazenamento permite determinar a vida

útil de uma enzima imobilizada, considerando um período de estocagem a que ela é

submetida (SILVA, 2012, p.102).

Neste estudo foi avaliado o biocatalisador produzido utilizando bagaço de caju

tratado e ativado com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 5%, sem a adição de

87


Triton® X-100, estocado sob refrigeração (4 °C). Os sistemas foram submetidos a

reações de hidrólise utilizando p-NPB com substrato.

Abaixo (Fig 4.9) segue o perfil da atividade relativa dos imobilizados estudados

durante 212 dias. Em determinados dias, os biocatalisadores imobilizados armazenados

em eppendorfs contendo 0,1g foram avaliados sendo descartados após ensaio.

Figura 4.9: Estabilidade à estocagem sob refrigeração de lipase tipo B de Candida

antarctica imobilizada por ligação covalente multipontual em CAB-GEG 5%.


Através da Fig 4.9, podemos observar que durante 73 dias, não houve mudanças

consideráveis nos ensaios de atividade do biocatalisador imobilizado. Em 107 dias de

armazenamento, foi observado um decréscimo em torno de 23,5%. Em 134 dias, o

biocatalisador apresentou uma diminuição de atividade em torno de 50,2%, seguido de

53,8% em 212 dias.

Nos estudos envolvendo cursos de imobilização e avaliação de estocagem dos

biocatalisadores produzidos, Brigida (2006) utilizou fibra de coco como suporte e

imobilizou a lipase CALB a pH 10,0. Em aproximadamente 100h de estocagem sob

refrigeração o derivado apresentou um decréscimo de, aproximadamente, 50% da sua

atividade relativa. Isso, provavelmente, aconteceu em decorrência da ausência da etapa

de redução das bases de Schiff, o que tornaria as ligações covalentes estáveis e os

derivados com elevada retenção da atividade, como sugerido no trabalho, sendo,

portanto, esta uma etapa importante para a estabilização do biocatalisador produzido.

Nos estudos realizados por Gomes (2006), lipase (Candida rugosa) imobilizada

em celulignina manteve-se estável por aproximadamente 30 dias, apresentando

0 50 100 150 200 250

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%)

Dias

88


decréscimo da atividade de 58,5% em 90 dias, sendo menos estável do que o

biocatalisador CAB-GEG 5%.

4.3 Imobilização Covalente Unipontual


tratado e ativado com glicidol – etilenodiamina- glutaraldeído 10%.

4.3.3.1 Condições de Imobilização: CAB- GEG 10% (5 mM, pH 7,0); CAB- GEG

10% (5 mM + 0,5% Triton® X-100, pH 7,0); CAB- GEG 10% (100 mM, pH 7,0);

CAB- GEG 10% (100 mM + 0,5% Triton® X-100, pH 7,0)

Neste tópico serão apresentados os cursos de imobilização e seus parâmetros a

partir da produção de quatro biocatalisadores com mudanças na força iônica e influência

da adição de Triton® X-100 nas soluções enzimáticas, utilizando bagaço de caju

ativado com glicidol- etilenodiamina- glutaraldeído 10%, visando o aprimoramento do

suporte para a obtenção de derivados estáveis.

As imobilizações foram realizadas utilizando soluções contendo baixa carga

enzimática (0,5 mg proteína.g-1 de suporte) preparadas em tampão fosfato de sódio a 5

mM, 5 mM com adição de 0,5 % de Triton® X-100, 100 mM e 100 mM com adição de

0,5 % de Triton® X-100, todos a 25 °C. Em imobilizações covalentes a força iônica

pode altera o processo de imobilização, sendo assim, avaliamos as condições de ensaio

variando a força iônica (alta e baixa) para verificarmos o comportamento das

imobilizações frente a está variação.

No trabalho desenvolvido por Tardioli (2003) foi discutida a importância de se

adicionar reagentes que modifiquem de forma parcial os grupos epóxidos pertencentes

aos suportes, causando uma melhora na reatividade, como realizado neste estudo com

adição de etilenodiamina, o que proporcionou imobilizações rápidas (30 a 60 minutos).

A Tabela 4.5 apresenta os parâmetros de imobilização para os derivados em

estudo.

89


Tabela 4.5: Parâmetros de imobilização para os derivados produzidos a pH 7,0 em

diferentes condições de ensaio.


Avaliando a Tabela 4.5, observamos inicialmente os parâmetros de imobilização

nas condições de baixa força iônica, podemos mencionar que a produção do derivado na

ausência de detergente apresentou maior atividade hidrolítica. O derivado formado na

presença de alta força iônica e adição de 0,5% de Triton® X-100 na solução de enzima,

apresentou atividade catalítica próxima aos das condições 5mM. Quando comparamos

os biocatalisadores imobilizados à elevada força iônica (100 mM), o biocatalisador

imobilizado (CAB- GEG 10%) na presença de detergente apresentou atividade catalítica

2,2 vezes maior que o derivado preparado sem adição de detergente.

Em geral, os derivados na presença de Triton® X-100 apresentaram valores

relativamente próximos de atividade e o imobilizado na condição 5 mM na ausência de

detergente apresentou atividade duas vezes maior que o mesmo na condição de elevada

força iônica (100 mM). O derivado que apresentou maior atividade catalítica foi

utilizando maior força iônica (100 mM) na presença de detergente, com trinta minutos

de imobilização. Todas as condições estudadas apresentaram rendimentos de

imobilização elevados, acima de 98%.

Biocatalisador Atividade derivado

(U.g-1)

RI (%) AR (%)

GEG 10%

(5 mM)

12,7 ± 0,15 99, 2 84, 1

GEG 10% +

5 mM, Triton® X-100

10,6 ± 0,19

98,7

35,9

GEG 10%

(100 mM)

6,2 ± 0,32

100 46,4

GEG 10% +

100 mM, Triton® X-

100

14,0 ± 0,77

98, 8

60

90


0 20 40 60 80 100 120 140 160

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%)

Tempo (min)

Avaliando os parâmetros de imobilização a pH 7,0, o derivado que apresentou

menor atividade recuperada foi o realizado a baixa força iônica, com atividade

recuperada menor que 50%. Nos estudos realizados por Mendes (2009) foi observado

que o uso de grupamentos epóxido a pH neutro e baixa força iônica geram fracas

interações entre enzima e suporte.

4.3.2 Caracterização dos Biocatalisadores produzidos

4.3.2.1 Estabilidade Térmica em diferentes condições

Depois de definidos os parâmetros de imobilização, avaliou-se as estabilidades

dos quatro derivados, iniciando pela análise de inativação térmica a 60 °C sob três

diferentes pHs: 5,0 (tampão citrato de sódio 25 mM), pH 7,0 (tampão fosfato de sódio

25 mM) e pH 9,0 (tampão bicarbonato de sódio 25 mM).

O perfil de desativação térmica para os biocatalisadores com baixa força iônica

foi apresentado na Fig 4.10 (A e B).

Fig 4.10: Perfis de inativação térmica para os derivados (A) CAB- GEG 10% (5 mM)

sob diferentes condições de pH: (■) pH 5,0, (●) pH 7,0 e (▲) pH 9,0 e (B) CAB- GEG

10% (5 mM + Triton® X-100) sob diferentes condições de pH: (■) pH 5,0, (●) pH 7,0 e

(▲) pH 9,0.


0 20 40 60 80 100 120 140 160

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%)

Tempo (min)

(B) (A)

91


0 20 40 60 80 100 120 140 160 180

0

20

40

60

80

100

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%

)

Tempo (min)

Para os ensaios realizados com baixa força iônica, os maiores tempos de meia-

vida para os casos tanto na presença quanto ausência de detergente foram em pH 5,0.

Para os ensaios realizados a pH 7,0, os perfis para as duas inativações apresentaram

meia-vida bem próximos, porém a pH 9,0, na presença de detergente a meia-vida foi 7,6

vezes maior.

Como discutidos anteriormente, o pH pode alterar a conformação da tríade

catalítica, por isso avaliamos diferentes pHs para identificarmos o comportamento dos

biocatalisadores em relação ao pH de ensaio.

Para os ensaios realizados com alta força iônica, os perfis de desativação seguem

como na Figura 4.11 (A e B).

Fig 4.11: Ajuste do modelo proposto por SADANA E HENLEY (1987) para os ensaios

de estabilidade térmica do derivado (A) CAB- GEG 10% (100 mM) sob diferentes

condições de pH: (■) pH 5,0, (●) pH 7,0 e (▲) pH 9,0 e (B) CAB- GEG 10% (100 mM

+ Triton® X-100) sob diferentes condições de pH: (■) pH 5,0, (●) pH 7,0 e (▲) pH 9,0.

O maior tempo de meia- vida encontrado para o biocatalisador imobilizado com

alta força iônica foi a pH 7,0 na ausência de detergente. Para os ensaios realizados nos

pH 5,0 e 9,0, o perfil de desativação aconteceu em tempos próximos, como observado

na Figura 4.12 (A). Os parâmetros estão explanados na Tabela 4.6. Para o biocatalisador

imobilizado com adição de detergente e alta força iônica (Fig. 4.12 B), este apresentou

um maior tempo de meia- vida a pH 5,0, com perfis de desativação próximo ao de pH

7,0. Para pH 9,0, em ambos os casos, foi encontrado menores tempos de meia-vida. Os

parâmetros estão apresentados na Tabela 4.6.

(A)

0 20 40 60 80 100 120 140 160

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%

)

Tempo (min)

(B)


92


Tabela 4.6: Parâmetros de inativação térmica (60 °C) dos biocatalisadores produzidos a

pH 7,0.

Condições de Inativação, 60°C

Biocatalisadores pH t1/2 (min) Kd (min-1) R2 FE

CAB- GEG 10%

(5 mM)

5,0 45,9 0,0238 0,95 7,62

7,0 16,8 0,0673 0,89 7,56

9,0 8,11 0,1500 0,96 1,62

CAB- GEG 10%

(5 mM)

+

0,5% Triton® X-100

5,0 100,7 0,0035 0,89 16,72

7,0 18,6 0,0658 0,94 8,37

9,0 62,1 0,0148 0,97 12,42

CAB- GEG 10%

(100 mM)

5,0

7,0

9,0

34,55

90,19

31,00

0,0316

0,0113

0,0529

0,94

0,93

5,73

40,62

CAB- GEG 10%

(100 mM)

+

0,5% Triton® X-100

5,0

7,0

9,0

63,00

59,6

0,0150

0,0183

0,95

0,89

20,86


Como discutido anteriormente, se avaliarmos os quatro derivados presentes na

Tabela 4.6, apenas nas condições a pH 5,0, observamos que os submetidos a análise na

presença de Triton® X-100, mostraram-se mais estáveis, sendo o de menor força iônica

o que apresentou maior tempo de meia - vida (100 minutos). O maior fator de

estabilidade foi encontrado para o biocatalisador CAB- GEG 10% (100 mM) a pH 7,0,

com estabilidade cerca de 40,6 vezes maior que a enzima na sua forma solúvel.

Para ensaios a pH 7,0, os melhores tempos de meia-vida foram encontrados para

alta força iônica. O biocatalisador imobilizado, na ausência de Triton® X-100, foi o de

0,94 6,2

26,8

28,2 0,0375 0,97 5,54

93


maior fator de estabilidade em relação a todos as condições submetidas de todos os

derivados.

A pH 9,0 e alta força iônica, tanto na ausência de Triton® X-100 como com

adição de detergente, os tempos de meia-vida apresentaram valores próximos. O que

não ocorreu quando ensaiados a baixa força iônica e na possível influência da adição de

Triton® X-100. A 5 mM e na presença de detergente, o tempo de meia –vida foi de 62

minutos. Nas mesmas condições, sem adição de detergente na solução para

imobilização, o derivado alcançou seu tempo de meia-vida em 8 minutos.

Se fizermos um breve paralelo entre as inativações envolvendo os

biocatalisadores imobilizados produzidos a pH 10, para o caso do tópico discutido

anteriormente ou pH 7,0, para este tópico em discussão, podemos destacar alguns

pontos em relação ao pH de imobilização e diferentes forças iônicas (100 mM, 25 mM e

5 mM), na presença e ausência de Triton® X-100. A pH 10,0, 25 mM (imobilização) os

derivados submetidos a 60 °C e pH 7,0, apresentaram tempos de meia- vida próximos

aos de baixa força iônica (5 mM). Para o derivado a pH 5,0 (25 mM, sem Triton® X-

100) foi bem próximo ao de alta força iônica (100 mM). Já, quando foi adicionado

Triton® X-100 na solução de preparação do derivado e submeteu-o a pH 5,0, 60 °C, os

derivados produzidos por imobilizações a pH 7,0 foram melhores, assim como os

mesmo derivados quando ensaiados a pH 9,0.

Em geral, os imobilizados preparados pH 5,0 e submetidos as condições de

inativação descritos apresentaram maiores estabilidades a temperatura extrema, 60 °C,

com exceção do CAB- GEG 10% (100 mM). Esperávamos que os derivados produzidos

por ligações do tipo multipontual apresentassem maiores estabilidades, uma vez que a

enzima liga-se a diferentes grupamentos presentes no suporte, tornando a enzima menos

flexível, o que não ocorreu.

Durante a etapa de ativação do suporte CAB – GEG 5%, foi utilizado solução de

glutaraldeído a pH alcalino (pH 10,0). Segundo estudos, a reatividade do glutaraldeído

estar relacionada ao uso de solução neutra (pH 7,0) (BARBOSA, 2013). Com isso,

provavelmente, nem todos os grupamentos foram reativos, justificando o fato do suporte

preparado a pH 7,0 ter apresentado biocatalisadores mais estáveis em relação aos

biocatalisadores imobilizados por ligações multipontuais.

94


4.3.2.2 Estabilidade na presença de solventes orgânicos

Os derivados produzidos por imobilizações a pH 7,0 foram submetidos a ensaios

em condições de desnaturação, afim de caracterizarmos sua estabilidade a diferentes

solventes em elevadas concentrações. Assim como realizado nos ensaios a pH 10,0, os

imobilizados foram expostos ao solvente orgânico THF e ACN, ambos a 80% em

tampão Tris HCl 100 mM, pH 7,0. O perfil de desativação para os biocatalisadores

imobilizados com baixa força iônica expostas a THF 80% em tampão Tris HCl (v/v) são

apresentados na Fig 4.12

Figura 4.12: Perfis de desativação dos biocatalisadores na presença de THF 80% (v/v),

com determinação dos tempos de meia - vida para (■) enzima solúvel, (●) 5 mM e (▲)

5 mM + Triton X-100.


Neste caso a baixa força iônica associada ao uso de Triton® X-100 não

favoreceu, apresentando uma meia-vida para esse derivado menor quando comparado

ao derivado sem a adição de detergente e em relação à enzima solúvel que apresentou

meia-vida em torno de 3,22 minutos.

Para os ensaios utilizando derivados preparados com alta força iônica nas

mesmas condições de análise para os de baixa força iônica, com THF 80% a 25 °C

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%)

Tempo (min)

95


foram obtidos perfis de inativação para dois biocatalisadores, na ausência e presença de

detergente.

Fig 4.13: Perfis de desativação seguindo o modelo proposto por Sadana e Henley

(1987), com determinação dos tempos de meia- vida para (■) Enzima solúvel, (●) CAB-

GEG 10% (100 mM) e (▲) CAB- GEG 10% (100 mM) na presença de 0,5% de

Triton® X-100 no tampão de imobilização a THF 80%.


Através da Figura 4.13, podemos avaliar que houve uma inativação mais rápida

para o biocatalisador sem adição de detergente no meio de solução. Os detergentes,

dependendo da concentração, podem intensificar a estabilidade do binômio enzima-

suporte segundo Matias (2014) como observado neste caso. Assim, quatro preparações

com o suporte bagaço de caju ativado com glicidol- amina-glutaraldeído 10% foram

comparadas. Os parâmetros de desativação estão descritos na Tabela abaixo (4.7).

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%

)

Tempo (min)

96


Tabela 4.7: Estabilidade de diferentes preparações de enzima com tempo de meia- vida

definido em minutos. Condições: THF 80%, 25 °C.

Biocatalisadores t 1/2 (min) Kd (min-1) R2 FE

CAB- GEG 10%

(5 mM)

72, 2

0, 0212

0, 96

22, 4

CAB- GEG 10%

(5 mM)

+

0,5% Triton® X-

100

2, 64

0, 2900

0, 97

0, 81

CAB- GEG 10%

(100 mM)

76, 88

0, 0252

0,88

23, 8

CAB- GEG 10%

(100 mM)

+

0,5% Triton® X-

100

129,7

0, 0089

0, 98

40, 2


Com base nos parâmetros acima, podemos confirmar que os derivados

preparados sem adição de detergente apresentaram tempos de meia-vida próximos.

Porém, na presença de Triton® X-100 houve uma discrepância de tempos, uma vez que

o maior tempo de desativação foi encontrado na presença de detergente e alta força

iônica, divergindo do resultado para o imobilizado de baixa força iônica que apresentou

um perfil de inativação menor do que a enzima na sua forma solúvel. Em geral, os

melhores perfis foram atingidos nos imobilizados preparado em tampão 100 mM.

Para os ensaios de estabilidade na presença do solvente acetonitrila 80% (v/v)

em tampão Tris HCl 100 mM a pH 7,0, os derivados de elevada força iônica

apresentaram meia-vida superior a 360 horas, não sendo possível em estudos de 360h

definir sua inativação em 50%. Para os derivados formados com baixa força iônica, na

ausência de detergente, com 144h não foi possível definir sua inativação em 50%. Para

o derivado nas condições de imobilização em tampão fosfato 5 mM e pH 7,0 na

presença de detergente, não foi possível definir o tempo de meia-vida, sendo o perfil de

desativação como apresentado abaixo (Fig 4.14).

97


Figura 4.14: Desativação do imobilizado (5 mM + 0,5% de Triton® X-100) na

presença de solvente acetonitrila a 80% (v/v).


4.3.2.3 Efeito do pH na atividade enzimática (p- NPB)

Para biocatalisadores imobilizados com baixa força iônica (5 mM), o

acompanhamento das velocidades descreverem o perfil abaixo (Fig 4.15).

Figura 4. 15: Efeito do pH na atividade hidrolítica, (■) Enzima solúvel, (●) imobilizado

em tampão fosfato 5 mM, na ausência de detergente e (▲) na presença de detergente

anfifílico.

Para a enzima solúvel, a menor atividade apresentada foi quando a mesma foi

submetida a pH 5,0. Para os biocatalisadores imobilizados, estes apresentaram perfis

semelhantes a pH 5,0 (tampão citrato de sódio 25 mM). Tanto a enzima na sua forma

0 50 100 150 200 250 300 350 400

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%

)

Tempo (h)


5 6 7 8 9 10

0

20

40

60

80

100

120

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%)

pH

98


solúvel como os derivados apresentaram mesma atividade hidrolítica a pH 8,0. O

biocatalisador na ausência de detergente apresentou uma faixa de máxima atividade a

pH 7-8, a pH 9,0 houve um decréscimo e a pH 10 a atividade foi em torno de 3% em

relação a atividade inicial. A linha azul descreve o perfil de atividade do derivado

preparado com detergente. Para este caso, o Triton® X-100 pode ter interferido

positivamente, tornando as velocidades hidrolíticas a pH mais alcalino (faixa de 9,0 e

10,0) mais altas. De modo geral, como discutido anteriormente, lipases apresentam

perfis de atividade máxima em pHs alcalinos.

De acordo com a Figura 4.16, podemos verificar que a tanto a enzima solúvel

(■) como o derivado produzido na presença de detergente (▲) apresentaram máxima

atividade quando submetidos a pH 8,0. A máxima atividade alcançada para o

biocatalisador de maior força iônica na ausência de Triton® X-100 (●) foi a pH 7,0 e

pH 9,0, havendo um decréscimo considerável da atividade a pH 10,0.

Figura 4. 16: Efeito do pH na atividade da (■) enzima solúvel, (●) lipase imobilizada

em CAB – GEG 100 mM e (▲) e lipase imobilizada em CAB – GEG 100 mM com

adição de detergente.


5 6 7 8 9 10

0

20

40

60

80

100

120

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%

)

pH

99


4.3.2.4 Estabilidade de Estocagem

A Figura 4.17 descreve o perfil dos ensaios de quatro biocatalisadores avaliados

quanto a sua estabilidade a estocagem (4 °C).

Figura 4.17: Estabilidade a estocagem (4 °C) de diferentes preparações de imobilizado.

Derivado (5 mM) CAB- GEG 10% (▲), derivado 5 mM na presença de Triton® X-100

(▼), derivado 100 mM (■), derivado 100 mM na presença de Triton® X-100 (●).


Os derivados produzidos por diferentes condições (força iônica, adição de

detergente) foram avaliados quanto à estabilidade de armazenamento durante 96 dias,

sob refrigeração depois de reduzidos as bases de Schiff’s.

O derivado com baixa força iônica, 5 mM (▲) em 37 dias sob refrigeração

apresentou um decréscimo de 53% da sua atividade, porém nos 38 dias decorridos de

estocagem não houve consideráveis perdas de atividade.

O imobilizado (5 mM) preparado com adição de detergente (▼) foi o que

apresentou uma maior queda de velocidade, mostrando uma diminuição em 50,4% da

sua atividade em apenas 37 dias, finalizando as análises com aproximadamente 11% da

atividade inicial.

O derivado obtido em elevada força iônica (100 mM) (■) em 37 dias teve sua

atividade mantida, porém em 58 dias houve um decréscimo, com perda de 46,6% da sua

atividade inicial. Concluindo em 96 dias uma queda de 60% em relação a atividade no

0 20 40 60 80 100

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Ativid

ad

e R

ela

tiva

(%

)

Dias

100


início dos ensaios e sendo este, o derivado que apresentou melhor estabilidade sob

refrigeração (4 °C).

Para o imobilizado (100 mM) na presença de Triton® X-100 (●) nos meios de

solução enzimática, em 37 dias de estocagem houve uma diminuição da atividade em

aproximadamente 58%, apresentando 83% de perda referente a sua atividade inicial

quando analisado com 96 dias.

Em geral, os biocatalisadores preparados com adição de Triton® X-100

apresentaram uma menor estabilidade à estocagem (4 °C) em 96 dias quando

comparados ao derivados preparados sem detergente. Tanto o biocatalisador de alta

como baixa força iônica, concluíram os ensaios com percentuais de 17% e 11% da sua

atividade em relação inicio do estudo, respectivamente.

4.4 SDS PAGE

Os biocatalisadores produzidos e a enzima na sua forma solúvel utilizada neste

estudo foram submetidos ao ensaio de eletroforese (SDS Page) tendo como objetivo

confirmar o tipo de ligação envolvida entre enzima e suporte. As amostras

apresentavam a mesma concentração de proteínas, 0,5 mg de proteína.g-1 de suporte. A

Figura 4.18 mostra o perfil eletroforético dos biocatalisadores e da enzima solúvel.

Figura 4.18: Análise em SDS- PAGE de diferentes preparações: Fração 1: marcadores

moleculares, Fração 2: enzima solúvel, Fração 3: CAB- GEG 5%, Fração 4: CAB- GEG

5% + 0,5% Triton® X-100, Fração 5: CAB – GLI, Fração 6: CAB- EPI, Fração 7:

CAB- GEG 10% (100 mM), Fração 8: CAB – GEG 10% (100 mM + Triton® X-100),

Fração 9: CAB- GEG 10% ( 5 mM), Fração 10: CAB- GEG 10% ( 5 mM + Triton® X-

100).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

KDa

97

66

45

30

20, 1

14.4


101


Através da Figura 4.18, identificamos o perfil eletroforético dos biocatalisadores

produzidos e enzima solúvel, que se apresentaram em aproximadamente 37 kDa.

Proteínas não apareceram nas frações do gel, indicando que houve uma eficiente

imobilização e que os derivados estão estabilizados. Apenas o biocatalisador

imobilizado CAB- GEG 5% na presença de detergente apresentou-se no gel de

eletroforese (fração 4), indicando uma possível instabilidade das ligações, provocado

provavelmente por um processo de dessorção da enzima no suporte.

4.5 Aplicações em Síntese Quimioenzimática

4.5.1 Síntese rac-indanol e acetato de rac-indanila

Como não utilizamos substratos sintéticos, para se obter o rac- acetato de

indanila e darmos início a etapa de resolução cinética enzimática, partimos de uma

cetona (indanona) que através de uma redução química com obtenção de álcool

racêmico e etapa de esterificação, foi formado o éster (rac- acetato de indanila) que dá

inicio a bioconversão. As etapas seguem descritas abaixo.

Inicialmente, a redução de indanona (cetona) foi realizada usando borohidreto

de sódio em metanol (MeOH), para se obter o rendimento de 93% de rac-indanona após

cromatografia. Em seguida, a acetilação química de cloridrato de rac-indanol usando

anidrido acético (Ac2O), 4-dimetilaminopiridina (DMAP) como catalisador,

trietilamina (Et 3 N) em diclorometano (CH2Cl2) à temperatura ambiente, permitiram a

preparação do correspondente acetato de rac-indanil com 87% de rendimento isolado

depois de cromatografia, como apresentado pela Figura 4.19.

102


Figura 4.19: Sínte se de rac- indanol e acetato de rac- indanila


As análises GC quirais foram desenvolvidos tanto para p rac-indanol como para

o rac-acetato de indanila, a fim de atingir um método de confiança para medir os

valores de excesso enantiomérico de ambos os substratos, remanescentes e o produto

final a partir da resolução catalizada por lipase, como apresentado nos cromatgramas da

Fig 4.20.

Figura 4.20: Cromatogramas GC de rac-acetato indanila, tR32,68 min. (S) tR33,17 min.

(R) e rac-indanol, tR37,95 min. (S) tR38, 98 min.


4.5.2 Reação de hidrólise de acetato de rac-indanilo utilizando Biocatalisadores

Inicialmente, a reação de hidrólise de rac-acetato de indanila foi realizada em

tampão fosfato (pH 7,0), utilizando tetrahidrofurano (THF) como solvente, lipase de

CALB imobilizados no CAB- GEG 5% e CAB- GEG 10%, como biocatalisador, a 30

°C por 24h (Figura 4.21) . A reação também foi avaliada em sistema aquoso, sem a

Indanona 93%

Rendimento

NaBH4; MeOH

0 °C r.t

2h

Ac2O; DMAP

Et3N; CH2Cl2

r.t,; 2h

87% Rendimento

rac - acetato

de indanila

103


presença de THF. Os compostos foram analisados por GC-FID utilizando uma coluna

quiral. Os resultados são mostrados na Tabela 4.8.

Figura 4.21: Reação de hidrólise de rac- acetato de indanila usando lipase de CALB

imobilizada em bagaço de caju.


As configurações dos estereocentros resultantes dos produtos seguem a regra

empírica de Kazlauskas que considera que, em reações de hidrólise utilizando lipases,

obtêm-se um álcool com a configuração (R) e um ester com configuração (S)

(Kazlauskas et al., 1991).

Os estereocentros do indanol e acetato de indanila foram determinados por

rotação óptica utilizando um polarímetro e os valores obtidos foram comparados com a

literatura. O valor de rotação óptica (R) -indanol específica foi [α] D20 = -30,1 (c 1,0,

CHCI3) EE = 98%, enquanto que o valor dado na literatura é [α] D25 -30,6 (c 1,0,

CHCI3) ee> 99% (Lee et al., 2011). Para o (S) -acetato de indanila o valor obtido foi de

[α] D20 = -86,8 (c 1,0, CHCI3) ee> 99%; e relatado na literatura foi [α] D26 = - 87,6 (c

1,0, CHCI3) e ee> 99% (Kim, 2004, p 473).


biocatalisador CAB-GEGa 5%.

Presença de Co-Solvente e.e.s(%)b e.e.p(%)b c (%)c Ed

1 Sim 98 98 50 458

2 Não 97 97 50 278

Fonte: Elaborada pelo autor. aCondições: 30 ºC, 24 h lipase : acetato de indanila (2:1) a 250 r.p.m. bDeterminado por GC. cConversão, c = e.e.s/(e.e.s+ e.e.p).

EdTaxa enantiomerica, E = ln[1 − c(1 + e.e.p)]/ln[1 − c(1 − e.e.p)].

Derivado

Derivado

104


Nesta primeira etapa foi avaliada a ausência e presença do solvente no meio

reacional com uso do biocatalisador CAB- GEG 5%. Com base nos dados obtidos nos

ensaios descritos na Tabela 4.8, observamos que mesmo com a ausência do solvente na

reação, a resolução ocorreu de forma efetiva, sugerindo que o solvente durante a reação

permaneceu na interface do sistema, não interferindo no processo. Com base neste

ensaio inicial, as hidrólises dos biocatalisadores produzidos por imobilização covalente

unipontual foram realizadas sem a adição do solvente tetrahidrofurano e os resultados

encontram-se na Tabela 4.9.

Ainda de acordo com a Tabela 4.8, foi possível observar que o biocatalisador

CAB-GEG 5% foi eficiente em relação à resolução cinética enzimática do rac- acetato

de indanila, uma vez que apresentaram valores de excesso enantiomérico de substrato e

produto satisfatórios, máxima conversão e razão enantiomérica maiores que 200.


biocatalisadores CAB-GEG 10%.

Biocatalisadores e.e.s(%)b e.e.p(%)b c (%)c Ed

CAB- GEG 5 mM

97

97

50

278

CAB- GEG 5 mM + Triton® X-100

70

97

42

138

CAB- GEG 100 mM

94

95

50

139

CAB- GEG 100 mM + Triton® X-

100

90

96

48

151


aCondições: 30 ºC, 24 h lipase : acetato de indanila (2:1) a 250 r.p.m. bDeterminado por GC. cConversão, c = e.e.s/(e.e.s+ e.e.p).

EdTaxa enantiomerica, E = ln[1 − c(1 + e.e.p)]/ln[1 − c(1 − e.e.p)].

O biocatalisador CAB-GEG 10% (5 mM) apresentou máxima conversão,

excesso enantiomérico acima de 90% e elevada taxa enantiomérica, sendo este

biocatalisador indicado para os ensaios de reuso, com cinco ciclos de 24h cada.

105


No estudo realizado por Fonseca (2015) utilizando CALB imobilizada em resina

acrílica na reação de hidrolítica do rac-acetato de indanila nas mesmas condições em

que empregamos para a lipase CALB imobilizada em bagaço de caju tratado com

peróxido de hidrogênio e ativado com GEG 5% e 10%, a resolução resultou em uma

conversão de 18%, bem abaixo do esperado, e excessos enantioméricos de substrato em

torno de 3% e produto em torno de 14%. Silva (2011) utilizou CALB (Novozym 435)

nas resoluções cinéticas (30 °C, 24h) utilizando hexano como co-solvente e obteve

valores de excessos de substrato e produto de 25 e > 99%, respectivamente, além de

conversão em torno de 20% e razão enantiomerica acima de 200.

Para o estudo desenvolvido neste trabalho de mestrado, o biocatalisador foi

preparado com uso de resíduos agroindustriais que apresentam baixo valor comercial e a

aplicação destes derivados resultou em elevadas conversões (50%) sem a necessidade

do uso de solventes orgânicos, como tolueno, dioxano, hexano ou tetrahidrofurano, o

que tornou o processo ambientalmente favorável. Além das reações ocorrerem em

condições brandas de pH e temperatura.

4.5.3 Reuso da enzima imobilizada

O próximo passo foi o estudo do reuso do biocatalisador CAB-GEG 5% e 10%

(5 mM, pH 7,0) , realizando a hidrólise de rac-acetato de indanila em tampão fosfato

(pH 7,0) à 30 °C por 24h e utilizando uma razão de 2: 1(enzima/ substrato).

Tabela 4.10: Resultados de reuso para o biocatalisador CAB- GEGa 5%.

Ciclo e.e.sb (%) e.e.pb(%) cc(%) Ed

1º 98 99 50 922

2º 96 94 50 127

3º 96 93 51 108

4º 97 94 51 136

5º 97 95 51 164

106


A Tabela 4.10 apresenta os resultados obtidos nos ensaios de reuso para o

derivado CAB- GEG 5%, preparados na ausência de detergente. O derivado foi filtrado

a vácuo utilizando funil de Buchner e lavou-se cuidadosamente com acetato de etila, no

final de cada ciclo de reação. De acordo com os resultados do estudo de reutilização do

biocatalisador imobilizado, observou-se que os valores de conversão são iguais ou

próximos a 50% até o quinto ciclo. Apresentando ainda valores das razões

enantioméricas maiores do que 100 até o quinto ciclo, indicando boas taxa que estão

relacionadas aos excessos enantioméricos dos produtos.

Tabela 4.11: Resultados de reuso para o biocatalisador CAB- GEGa 10%.

Ciclo e.e.sb (%) e.e.pb(%) cc(%) Ed

1º 97 98 50 419

2º 97 92 51 101

3º 98 90 52 87

4º 97 88 52 65

5º 99 87 53 75

Fonte: Elaborada pelo autor. aCondições: 30 ºC, 24 h lipase : acetato de indanila (2:1) a 250 r.p.m. bDeterminado por GC. cConversão, c = e.e.s/(e.e.s+ e.e.p).

EdTaxa enantiomérica, E = ln[1 − c(1 + e.e.p)]/ln[1 − c(1 − e.e.p)].

Com base nos dados da Tabela 4.11, os resultados do estudo de reutilização da

enzima mostram que os valores de conversão são iguais ou próximos a 50% durante os

cinco ciclos, ou seja, o biocatalisador atingiu o máximo rendimento químico.

Para o primeiro ciclo, observamos que a conversão foi muito boa (50%) e os

valores de excesso enantiomérico de substrato e produto foram maiores que 90%, com

alto valor de razão enantiomérica (419). Com o decorrer dos ciclos, os excessos

enantioméricos dos substratos oscilaram, porém continuaram acima de 90% e os

excessos enantioméricos do produto seguiram com decréscimo, finalizando o quinto

ciclo com 87%. Isso está relacionado à atividade da enzima no decorrer dos reusos.

Podemos observar que a partir do segundo ciclo, a conversão aumentou um pouco,

apesar de ter se mantido até o final do ensaio com valores próximos a 50%, o que

significa que as reações ocorreram um pouco mais rápidas, levando ao excesso da

formação de um enantiômero. Observamos ainda que a taxa enantiomerica diminuiu

107


com o decorrer dos ciclos, estando estes valores relacionados as conversões e aos

excessos enantioméricos do produto.

Com base nos resultados apresentados, os biocatalisadores produzidos a partir da

imobilização de CALB em bagaço de caju foram eficientes na reação de hidrólise do

rac-acetato de indanila , formando enantiômeros puros e ativos que através de reações

químicas, podem produzir fármacos de grande interesse, como a produção de Mesilato

de Rasagilina usado em tratamentos contra o Mal de Parkinson.

CAPÍTULO 5

CONCLUSÕES

109

Capítulo 5 – Conclusões Souza, T.C.

5. CONCLUSÕES

O bagaço de caju tratado com peróxido de hidrogênio alcalino se apresentou

como um suporte promissor para a imobilização de enzimas, apresentando derivados

com elevadas atividades catalíticas, estáveis e aplicáveis a resolução cinética para a

produção de compostos ativos na industria farmacêutica.

Neste estudo foram aplicados diferentes protocolos de ativação do suporte

bagaço de caju e imobilização por ligações do tipo covalente unipontual e multipontual.

Observou-se que os suportes ativados com glicidol e epicloridrina não foram

adequados para o processo de imobilização da lipase do tipo B de Candida antarctica,

uma vez que os mesmos apresentaram biocatalisadores com baixas atividades catalíticas

e intumescimento, dificultando a realização dos ensaios.

O melhor tempo de meia- vida foi encontrado em 32,9 minutos para o CAB-

GEG 5% a pH 5,0. Para os derivados produzidos por ligação covalente unipontual, o

biocatalisador que obteve melhor tempo de meia-vida em 100, 7 minutos foi o CAB-

GEG 10% (5 mM + 0,5% de Triton® X-100).

Para as estabilidade ao solvente tetrahidrofurano, os biocatalisadores que

apresentam melhores tempos de meia-vida foram CAG- GEG 5% (Triton® X-100) com

meia-vida em torno de 60 minutos e CAB-GEG 10% 100 mM (Triton® X-100), com

meia-vida em torno de 129,7 minutos.

Os derivados produzidos neste estudo tanto na ausência como na presença de

detergente, apresentaram elevadas estabilidades ao solvente acetonitrila (80%/20%

Tampão Tris HCl, pH 7,0) não sendo possível definir a meia-vida dos biocatalisadores.

As melhores atividades encontradas para todos os biocatalisadores nos ensaios

de pH em relação a atividade hidrolítica foi na faixa compreendida entre pH 7,0 a pH

9,0.

Os imobilizados CAB- GEG 5% e CAB- GEG 10% foram utilizados nos ensaios

de síntese de rac- indanol. Ambos apresentaram elevadas conversões (50%). O CAB-

GEG 5% e 10% (na ausência de Triton® X-100) com baixa força iônica (5 mM) foram

submetidos a ensaios de reuso dos biocatalisaores nas reações de resolução cinética

enzimática. Dos cinco reciclos realizados através da hidrólise de rac- acetato de

indanila, estes alcançaram conversões em torno de 50%, e razões enantioméricas

110

Capítulo 5 – Conclusões Souza, T.C.

variando, na sua maioria, acima de 100, sendo eficientes em síntese orgânica, além de

utilizarem condições brandas de reação.

Desta forma, esta dissertação de mestrado apresentou a síntese e caracterização

de biocatalisadores imobilizados produzidos a partir de um resíduo agroindustrial

(bagaço de caju), material de pouco valor comercial, que se apresentou como um

suporte promissor para os processos de imobilização de enzimas, com produção de

biocatalisadores eficientes na resolução cinética enzimática de rac- acetato de indanila,

gerando compostos enantiomericamente ativos que poderão, através de reações

químicas, formarem compostos utilizados na formulação de medicamentos.

Os resultados alcançados com esse estudo resultaram em um artigo cientifico

escrito e finalizado para submissão como pode ser visualizado no Anexo A. Os

resultados são suficientes para a elaboração de um segundo artigo que está em

elaboração na fase de escrita. As demais produções científicas publicadas estão

disponíveis no Anexo B.

CAPÍTULO 6

SUGESTÕES

112

Capítulo 6 – Sugestões de Trabalhos Futuros Souza, T.C.

6. SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS

Uso de diferentes concentrações de enzima na imobilização;

Avaliar maiores tempos de contato enzima-suporte nas etapas de imobilização;

Estudo do pH de imobilização (8 e 9);

Uso do pH 7,0 na solução de ativação com glutaraldeído 5%;

Uso de agarose ativada com solução glutaraldeído nas condições a pH 10,0 e

concentração 5% e comparar com os biocatalisadores produzidos CAB-GEG

5%;

Estudo dos tempos de imobilização para possíveis melhorias das ligações

formadas;

Estudo das diferentes concentrações de Triton® X-100 em ensaios de

imobilização;

Estudo da imobilização usando bagaço de caju e diferentes enzimas;

Estudo da estabilidade ao solvente acetonitrila utilizando temperaturas acima de

25 °C;

Verificar o potencial de reuso de todos os derivados produzidos;

Continuação das etapas químicas para resolução de fármacos.

CAPÍTULO 7

REFERÊNCIAS

BIBLIOGRÁFICAS

114

Capítulo 7 – Referências Bibliográficas Souza, T.C.

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Anexo A

Produções Científicas

(Artigo)

123

Anexo A – Produções Científicas Souza, T.C.

ANEXO A (PRODUÇÕES CIENTÍFICAS)

ARTIGO

Cashew apple bagasse as a support for the immobilization of lipase B from

Candida Antarctica: Application to the chemoenzymatic production of (R)-Indanol

Ticiane C. de Souzaa, Thiago de S. Fonsecab, Jose C. S. dos Santosc, Jessyca A. da Costaa,

Maria Valderez Ponte Rochaa, Marcos Carlos de Mattosb, Roberto Fernandez-Lafuented,

Luciana R. B. Gonçalvesa*

aDepartamento de Engenharia Química, Universidade Federal do Ceará, Campus do

Pici, CEP 60455-760, Fortaleza, CE, Brazil.

bDepartamento de Química Orgânica e Inorgânica, Laboratório de Biotecnologia e

Síntese Orgânica (LABS), Universidade Federal do Ceará, Campus do Pici,Caixa Postal

6044, 60455-970 Fortaleza, CE, Brazil.

cInstituto de Engenharias e Desenvolvimento Sustentável, Universidade da Integração

Internacional da Lusofonia Afro-Brasileira, CEP 62785-000, Acarape, CE, Brazil.

dICP-CSIC. Campus UAM-CSIC. Cantoblanco. 28049 Madrid. Spain.

*Corresponding author:

Luciana Rocha Barros Gonçalves

Departamento de Engenharia Química

Universidade Federal do Ceará, Campus do Pici

CEP 60455-760, Fortaleza, CE, Brazil.

Phone: +55-85-3366-9611; fax: + 55-85-3366-9610.

e-mail: [email protected]

Abstract

mailto:[email protected]

124


Lipase B from Candida antarctica lipase expressed in Aspergillus niger has been

covalently immobilized on cashew apple bagasse, and it stability and performance in the

chemoenzymatic synthesis of (R)-Indano has been evaluated. The cashew apple bagasse

(CAB) has been treated with alkaline hydrogen peroxide and activated with glycidol

(GLY) to obtain glyoxyl groups or glicidol, plus ethylenediamine and further activation

withglutaraldehyde (GEG).The maximum loading of the support was 10 mg protein/g

support, and its thermal and solvent stability was much higher than that of the soluble

enzyme. The CAB-GEG preparation (with 95% yield of immobilization and 124%

activity recovery) was used in the hydrolysis of ethyl rac-indanyl acetate using an

enzyme / substrate ratio of 2: 1 and a pH value of 7.0 at 30 °C for 24h. The conversion

attained was 50% of conversion and e.e. of 99%. The reusability studies showed

maintenance of conversion and e.e. during three cycles.

Key words: cashew apple bagasse, lipase immobilization–stabilization,

chemoenzymatic, (R)-Indanol.

125


1- Introduction

The use of enzymes as industrial biocatalysts pursues the utilization of the high

selectivity and specificity under mild conditions of these biological catalysts [1–5].

However, enzymes have some drawbacks as industrial catalyst, like poor stability and

the fact of their high solubility in aqueous solutions that makes difficult the enzyme

recovering and reuse. A proper immobilization system may solve both enzyme

limitations, mainly if a multipoint attachment is achieved between the enzyme and the

support [1,6,7].

Thus, the choice of a proper support, active group and immobilization protocol

for immobilization of proteins is a key to the production of biocatalysts [8].

The use of natural supports, cheaper and more sustainable than the synthetic

ones, may contribute to the reduction of the costs of the enzyme biocatalysts and

facilitate their implementation on an industrial scale [7-8]. In this context, some

agricultural residues can be used as supports for immobilization since they are low cost

materials, minimize the impacts to the environment and add value to this previously

discarded wasted materials, that will be not disposed in nature [7-8]. Moreover, these

residues as a cashew apple bagasse (CAB), consisting of lignocellulose material have

good mechanical and physical properties.

CAB is composed of cellulose, hemicellulose and lignin [11]. It is a by-product of the

cashew apple juice industry and represents approximately 20% of the total peduncle

weight. In the industrial process for juice production, around 15% (w/w) of bagasse is

generated, which has essentially no commercial value and is usually discarded by local

industries [9-10]. Thus, in order to produce a low-cost immobilized enzyme, the

objective of this research was to evaluate the immobilization of lipase on cashew apple

bagasse. Several chemical reagents will be used to activate the support, we have

selected those that have been reported to present good properties to permit a certain

multipoint covalent attachment between the enzyme and the support e.g. epoxides[14],

glyoxyl[15]or glutaraldehyde[16] groups. Epoxides may react with very different

aminoacids located on the enzyme surface (Lys, terminal amino group, His, Tyr, Cys,

Asp or Glu) [17], but due to their low reactivity require the previous adsorption of the

enzyme on the support [14]. Glutaraldehyde is a versatile immobilization methodology,

126


as it is usually a heterofunctional anion exchanger (the glutaraldehyde moieties are

introduced on a primary amino group), covalently reacting mainly with primary amino

groups [16]. Glyoxyl groups only react with primary amino groups [15]. Using this

support, it is necessary that several enzyme-supports bonds are established to fix the

enzyme to the support, usually making compulsory to immobilize the enzyme at pH 10

[18].

Lipases are the most commonly used enzymes in biocatalysis because of their

wide substrate specificity coupled to a high regio or enantioselectivity or specificity.

Moreover, they present a high stability under a range broad of conditions and reaction

media (aqueous solvent, organic solvents, neoteric solvents) [19] and a capability to

catalyze a wide variety of reactions (hydrolysis, esterifications, aminations, acydolysis,

transesterifications [19–23], as well as other promiscuous reactions, such as C-C bond

synthesis) [24–26]. Lipases properties such as selectivity, specificity can be easily

modulated by genetic modification [27,28], changes in the reaction medium [29,30],

and by immobilization [6,30,31] or chemical modification [32–34].

They have a very flexible active site, conformational changes involve the

movement of an oligopeptide chain that cover the active center and secluded it from the

medium in many instances [35–37]. The open form of the lipase is able to become

adsorbed on hydrophobic materials, from a drop of oil to the open form of other lipase

molecule [38–43]. The enzyme used in this study was the lipase B from Candida sp

expressed in Aspergillus niger (CALB) [44,45].

As model reaction to evaluate the performance of the new biocatalyst, we have

selected the production of enantiomerically pure chiral alcohols. Chiral alcohols are

important building blocks for the synthesis of many pharmaceuticals and value-added

chemicals[46,47]. Particularly, optically active indanol may have its hydroxyl group

easily exchanged by an amino group leading to precursors of drugs such as (+)-

Sertraline, (+)-Indatraline, Indinavir, Irindalone or Rasagiline mesilate [48]. This latter

is used in the treatment of Parkinson’s disease (PD) being effective both as

monotherapy in early PD and as adjunctive in patients with advancing PD and motor

fluctuations [49–52]. This chiral compound is a potent second-generation

propargylamine pharmacophore that selectively and irreversibly inhibits the B-form of

the monoamine oxidase enzyme (MAO-B) over type A by a factor of fourteen [52–54].

127


There are few researches developed in the enzymatic resolution of the racemic mixture

of this compound or some derivatives [46,55–59]. For example, it was prepared from

the enzymatic kinetic resolution of racemic indanol via acylation, using as catalyst the

lipase from Thermomyces lanuginosus immobilized on immobead-150 [60,61].

Selective N-acetylation of (1S,2R)-1-amino-2-indanol by immobilized CALB was also

achieved with high enantiomeric excess [61].

In this research, the possibility of using activated cashew apple bagasse as

support for the immobilization of lipase B from Candida sp (CALB) expressed in

Aspergillus niger and the application this biocatalyst in the resolution of indanol

derivaties by hydrolytic routes have been explored.

128


2. Materials and methods

2.1. Materials

Cashew apple bagasse (from Anacardium occidentale L specie) was kindly

donated by Jandaia Juice Industry (Ceará, Brazil). Solution of CALB (6.0 mg of protein

per mL) and p-nitrophenyl butyrate (p-NPB) were purchased from Sigma Chemical Co.

(St. Louis, MO, USA). All other used chemicals reagents were of analytical grade.

2.2. Methods

2.2.1 Determination of enzyme activity and protein concentration

The hydrolytic activity of soluble and immobilized CALB was determined

according to a methodology previously described by (Bhatnagar et al., 2005) [62] with

slight modifications pointed below.

Assays were performed in a spectrophotometer (Thermo Scientific - Analytics)

at 400 nm with temperature and agitation control. Activity measurements were

performed in 25 mM sodium phosphate at pH 7.0 and 25 °C, determiningthe released

p-nitrophenol in the hydrolysis of p-NPB (0.4 mM (ε = 10.052 M−1cm−1 under these

conditions). To start the reaction, 30–200 µL of lipase solution or suspension was added

to 2.5 mL of substrate solution. One international unit of activity (U) was defined as the

amount of enzyme that hydrolyzes 1 μmol of p-NPB per minute under the conditions

described previously. Protein concentration was determined using Bradford's method

[63] and bovine serum albumin was used as the reference.

2.3. Preparation and characterization of the support

The initial treatment of cashew apple bagasse (CAB) was conducted according

to Correia et al., (2013) [13]. CAB was washed three times with water, dried at 60 °C

for 24 h and milled in a hammer mill in order to obtain an average particle size of 0.177

to 0.841mm. The milled cashew apple bagasse was pretreated by alkaline hydrogen

peroxide (4.3% v/v H2O2 at pH 11.5).This step was conducted to solubilize the lignin

129


fraction of the CAB, to obtain a support with higher porosity and way to increase the

accessibility of the enzyme to the cellulose [13].

This treatment was conducted in an orbital shaker (Tecnal – TE 422, SP, Brazil)

at 35 °C for 6 h and 250 rpm. After the treatment, the solid fraction was collected by

filtration, washed with distilled water, vacuum filtered and stored under refrigeration

[11]. This solid was used as support for immobilization of CALB, and named in this

work of CAB-AHP. The compositional analysis from untreated and treated CAB were

determined according to the protocol proposed by the National Renewable Energy

Laboratory (NREL) [64] in terms of extractives, glucan, xylan, lignin and ash.

2.4. Activation of the support cashew apple bagasse

2.4.1- GlyoxylCAB-AHP

The activation of CAB-AHP was performed as previously described [15]. A

mass of 3 g of CAB-AHP was suspended in 33.8 mL of water, followed by the slow

addition of 11.3 mL of 1.7 M NaOH containing 2.4 g of sodium borohydride. The

mixture was placed in ice bath, and 8 mL of glycidol was added drop by drop to prevent

overheating. This suspension was kept under mild agitation for 18 h at 25 oC. After

filtration, the support was washed with 30 mL of water. After, 3 g sample of glyceryl-

CAB was resuspended in 30 mL of water and 4.5 mL of 100 mM NaIO4 solution was

added to oxidize the glyceryl groups and produce the glyoxyl groups [65]. The mixture

was shaken for 2 h, and the support was then washed with water. The periodate

consumption was quantified through iodometry [66]. Glyoxyl-CAB (Gly-CAB) was

washed with Milli-Q water and dried at vacuum.

2.4.2 Glutaraldehyde-BAG

Thirteen grams of glyoxyl-CAB was added to 52 mL of a 2M ethylenediamine

(EDA) at pH 10 for 2 h. After, 700 mg of sodium borohydride was added and the

suspension was left to react for two additional hours[67]. Then, the support was washed

using a sintered funnel and vacuum dried. Thirteen grams of aminated CAB were

resuspended in 130 mL of 0.1 M sodium bicarbonate buffer at pH 10.0 [68] containing

5% glutaraldehyde [68], 1:10 (support:solution). This suspension was kept under gentle

stirring for 16 h at 25 oC to produce glyoxyl-amine-glutaraldehyde-CAB (GEG-CAB)

130


[69]. Finally, the activated glutaraldehyde –CAB (GEG-CAB) was washed with Milli-Q

water and dried at.

2.5 Immobilization of the enzyme

The immobilization was performed using 0.5 mg of protein per g of wet support

with glyoxyl or glutaraldehyde active groups. Enzyme samples were diluted in 25 mM

sodium bicarbonate buffer at pH 10 [68]. Then, the support was suspended in the

enzyme solution under gentle stirring. Periodically, samples of the supernatant and

suspension were withdrawn, and the enzymatic activity was measured.

2.6 Reduction with sodium borohydride.

To end the enzyme-support covalent reaction, solid sodium borohydride was added to a

concentration of 1 mg.mL-1 to the CALB-CAB immobilization suspensions and were

submitted to gentle stirring for 30 min.[70]. Finally the reduced derivatives were filtered

washed with abundant distilled water and stored at 4oC.

2.7 Thermal inactivation of different enzyme immobilized preparations

One g of immobilized enzyme was suspended in 15 mL of 25 mM sodium

acetate at pH 5, sodium phosphate at pH 7 or sodium bicarbonate at pH 9 at 60 °C.

Periodically, samples were withdrawn and the remaining activity was measured using

the p-NPB assay described above. The deactivation constant and half-life time (t1/2) for

each immobilized derivative was calculated according to the Sadana and Henley model

[71] using Microcal Origin version 8.1. With the exponential nonlinear decay model

and its parameters, it was possible to determine the inactivation constant (kd) and the

half-lives time (t1/2) of the derivatives. Stabilization factors were obtained as the ratio

between half-lives of the derivatives and the soluble enzyme.

2.8 Inactivation of different preparations in the presence of organic co-solvents

Enzyme preparations were incubated in mixtures of acetonitrile or 1,4-

tetrahydrofuran / 100 mM Tris–HCl at pH 7 and 25 oC. Periodically, samples were

131


withdrawn and the activity was measured using p-NPB. Half-lives were calculated from

the observed inactivation courses according to Sadana and Henley model [71] using

Microcal Origin version 8.1, as described above

2.9 Support CALB loading capacity

The loading capacity of the support was investigated by offering different

amounts of protein per g of support. The amount of protein ranged from 0.5 to 30 mg

protein / g support.

2.10 Storage stability of immobilized lipases

The storage stability of the biocatalysts was analyzed using dried immobilized

enzymes stored at 4 oC. The remaining activity was determined periodically as stated

above. In this study, we were offered 0.5 mg protein / g of support, and enzymatic

activity assays performed at an interval of 107 days. 0.1 g of biocatalyst was distributed

in eppendorfs and they kept refrigerated until analysis. In 0.1 g of derivative were added

1.5 mL of 25 mM sodium phosphate buffer at pH 7.0 at the time of analysis, and its

activity assessed.

2.11 Support Characterization

2.11.1 Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) analysis

FT-IR analysis of the different supports was conducted to investigate the

activation of the support. Analyses were performed in Fourier transforms

spectrophotometer (VERTEX 70-Bruker Optics), attenuated total reflectance with

(FTIR- ATR) under ZnSe crystal use. The analyses were performed at the Physics

Department at the Federal University of Ceara.

2.11.2 Thermogravimetric Analysis (TGA)

132


To assess the thermal degradation of the untreated, treated and activated CAB

with different reagents; supports were subjected to thermogravimetric analysis. The

thermal stability of the samples was analyzed using Netzsch Jupiter 449 STA equipment

(Simultaneous Thermal Analysis). The samples were measured in the range between 30

- 200 °C at a heating rate of 10 °C / min in a nitrogen atmosphere (purge of 50 mL / min

for each sample to 20 mL / min). Aluminum crucibles were used with resistance to 600

°C with piercing the lid.

2.11.3 Scanning electron microscopy

Photomicrographs of surface of the supports were obtained by scanning electron

microscopy (MEV) using the INSPECT S50 EIF equipment. The samples were dried(50

°C, 24 hours), followed by coating with gold using a sputter.

2.12 SDS-PAGE experiments

The immobilizations used in these experiments were performed at pH 10.0 with

a load of 10 mg of protein. SDS- polyacrylamide gel electrophoresis was performed

according to Laemmli, (1970) [72] using a Miniprotean tetra-cell (Biorad), 12% running

gel in a separation zone of 9 cm × 6 cm, and a concentration zone of 5%

polyacrylamide. Ten hundred milligrams of the immobilized biocatalysts samples was

resuspended in 1 mL of rupture buffer (2% SDS and 10% mercaptoethanol), boiled for

5 min and a 20 µL aliquot of the supernatant was used in the experiments. Gels were

stained with Coomassie brilliant blue. Low molecular weight markers from Fermentas

were used (10–200 kDa).

2.13.1 Synthesis of rac- indanol

A mass of 284 mg of sodium borohydride NaBH4 (7.5 mmol) was slowly added

to a solution containing 500 mg of indanone (3.75 mmol) in 38 mL methanol at 4 ºC.

The reaction mixture was stirred at 4 ºC for 30 min and then for 1.5 h at room

133


temperature, after which the solvent was evaporated under reduced pressure. The

resulting suspension was added to 10 mL of H2O and extracted with EtOAc (3 × 50

mL). Organic phases were combined and dried over sodium sulfate (Na2SO4) anhydride,

filtered and the solvent was evaporated under reduced pressure, and the resulting crude

purified after flash chromatography (10–90% EtOAc/hexane) to afford rac-indanol as a

yellow solid in 93% yield.

2.13.2 Synthesis of rac-indanyl acetate

A volume of 310 µL of triethylamine (Et3N) (2.23 mmol), 143.8 mg 4-

dimethylaminopiridine (DMAP) (1.25 mmol), and 635.5 µL acetic anhydride (6.7

mmol) were added to 20 mL dichloromethane containing 300 mg of rac-indanol (2.23

mmol). The solution reaction was stirred at room temperature during 2 h and after that

time, the solvent was evaporated under reduced pressure. Posteriorly was added to 10

mL of H2O and extracted with EtOAc (3 × 50 mL). The organic phases were combined

and dried over anhydrous sodium sulfate (Na2SO4), filtered and the solvent was

evaporated under reduced pressure. The resulting crude was purified by flash

chromatography on silica gel (5–95% EtOAc/hexane) to afford the desired rac-indanyl

acetate as a yellow liquid in 87% yield.

2.13.3 Hydrolysis of rac-indanyl acetate catalyzed by CALB

A mass of 60 mg of immobilized lipase was added to a solution of 30 mg rac-

indanyl acetate (0.17 mmol) in 100mM sodium phosphate bat pH 7.0, and submitted to

stirring at 250 rpm and 30 ºC. After 24 h, the reaction was stopped by filtration. Then,

the products were extracted with EtOAc (3 x 10 mL) and the organic phases were

combined and dried with anhydrous sodium sulfate. Subsequently, the organic phase

was filtered and the solvent was evaporated under reduced pressure. The reaction crude

was finally purified by flash chromatography on silica gel (5-95% EtOAc/hexane).

The efficiency of kinetic resolution was evaluated based on the optical purity of

the compounds, expressed in terms of enantiomeric excess of the substrate (e.e.s) and

product (e.e.p), using the following Eq. (1) and (2), respectively:

134


e.e.s =

BA

BA

X 100 (1)

e.e.p =

BA

BA

X 100 (2)

A denote the majority enantiomer and B denote the minority enantiomer represented by

the chromatographic peak areas.

The conversion (c) and enantioselectivity (E) were determined using the Equations (3)

and (4), respectively.

c = ps

s

eeee

ee

....

..

(3)

E = )]..1(1ln[

)]..1(1ln[

p

p

eec

eec

(4)

rac-indanol: Solid. Rf (10% EtOAc/hexane): 0.25. m.p. 52–55 ºC. 1H NMR (500

MHz, CD3OD) δ (ppm): 1.9 (m, 1H), 2.4 (m, 1H), 2.8 (m, 1H), 3.0 (m, 1H), 5.1 (t, 1H,

J = 6.2 Hz), 7.2 (m, 3H) and 7.4 (dd, 1H, J = 6.0 Hz and 2.6 Hz). 13C NMR (125 MHz,

CD3OD) δ (ppm): 29.9 (CH2), 35.9 (CH2), 76.4 (CH), 124.3 (CH), 125.0 (CH), 126.8

(CH), 128.4 (CH), 143.4 (C) and 145.1 (C).

rac-indanyl acetate: Liquid. Rf (5% EtOAc/hexane): 0.53. 1H NMR (300 MHz,

CDCl3) δ (ppm): 2.0 (s, 3H), 2.1 (m, 1H), 2.5 (m, 1H), 2.9 (m, 1H), 3.1 (m, 1H), 6.2 (t,

1H, J = 6.8 Hz), 7.2 (m, 3H) and 7.4 (dd, 1H, J = 7.9 and 2.3 Hz). 13C NMR (75 MHz,

CDCl3) δ (ppm): 21.5 (CH3), 30.4 (CH2), 32.5 (CH2), 78.6 (CH), 125.0 (CH), 125.7

(CH), 126.9 (CH), 129.1 (CH), 141.3 (C), 144.6 (C) and 171.3 (C).

2.14 Determination of melting points of the rac-indanol

The melting points of the rac-indanol were determined in open capillary tube

Mettler Toledo model FP62 and are uncorrected. 1H, 13C NMR, and DEPT were

obtained using Bruker Spectrometers, model Avance DPX 300 and Avance DRX-500,

respectively, operating at frequencies of 300 MHz and 500 MHz for hydrogen and

frequencies of 75 MHz and 125 MHz for carbon, respectively. The chemical shifts are

135


given in delta (δ) values and the coupling constants (J) in Hertz (Hz). Measurement of

the optical rotation was done in a Perkin-Elmer 241 polarimeter. Gas chromatograph

(GC) analysis were carried out in a Shimadzu chromatograph model GC 2010 with a

flame ionization detector using a chiral column CP-chirasil-dex (25 m × 0.25 mm ×

0.25 µm, 0.5 bar N2) for the following of the reaction time courses: 110 ºC; 0.5 ºC/min

130 ºC (hold 15 min); 5.0 ºC/min 140 ºC (hold 5 min). Retention times were: (S)-acetate

32.68 min; (R)-acetate 33.17 min; (S)-alcohol 37.95 min; (R)-alcohol 38.98 min. The

enzymatic hydrolyses were performed in a bench shaker with a chilled incubation of the

mark Cientec CT-712 model.

136


3. Results and discussion

3.1 Characterization of cashew apple bagasse support

3.1.1 Composition

The cashew apple bagasse used in this investigation contained 20.6 ± 2.2%

glucan, 10.2% ± 0.9% xylan, 35.3% ± 0.9% lignin, 7.8% ± 0.6% (extracted compounds

by ethanol at 80 oC/ 8 h, i.e, waxes, proteins and fatty acids), and 1.6 ± 0.1% ashes.

After the treatment using alkaline hydrogen peroxide (4.3% H2O2, pH 11.5, conducted

at 35 °C for 6 h), the treated cashew apple bagasse contained 44.2% ± 0.3% glucan,

18.3% ± 0.9% xylan, 2.9% ± 0.1% lignin, 4.9% ± 0.3% extractives and 5.3 ± 0.9%

ashes. The percentage of solids recovered was 34% due the alkaline treatment removed

most t of the lignin from CAB, and this fact resulted in an increase in the percentage of

glucan. This modification in chemical composition improved the support structure,

facilitating the activation (greater access to the cellulose groups) and after the

immobilization processes[13].

3.1.2 MEV

The physical structures of the CAB, CAB-AHP, Gly-CAB-AHP and GEG-CAB-

AHP were observed by scanning electron microscopy (Fig. 1). As shown in Figure 1A,

the texture of in nature CAB appeared irregular and it is probably covered with a layer

of wax and/or fatty acids commonly found in biomass [73,74]. After H2O2 treatment,

occurred a removal of the wax and fatty acids residues, and the treated CAB (CAB-

AHP) presented smoother surfaces due to the removal of lignin and the low

solubilization of hemicellulose (Figure 1B). Scanning electron microscopy showed that

the surface of CAB-AHP activated with glycidol (Fig 1C) was identical to the surface of

CAB-AHP (Fig 1B). However, the activation with GEG (glycidol – ethylenediamine –

glutaraldehyde) promoted a strongr change in the surface of CAB-AHP; the fibers

appeared to be deformed, with a smother surface (Fig. 1D).

Then, the AHP treatment and the activation with GEG disrupted the structure of

the CAB fibers and increased the reactive area, which ultimately may enhance the

enzyme accessibility at support.

(A) (B)

137


Figure 1: Scanning electron microscopy images (A) Cashew apple bagasse no

treatment; (B) Cashew apple bagasse cashew apple bagasse treated with peroxide

hydrogen; (C) Cashew apple bagasse activated with glycidol; (D) Cashew apple bagasse

activated with glycidol- ethylenediamine – glutaraldehyde.

3.1.3 FTIR

In this study, FTIR analysis was used to characterize untreated cashew apple

bagasse and to evaluate the chemical modification after treatment and activation

(identify groups modified by the treatments). The spectra of the untreated CAB, treated

CAB (CAB-AHP), activated and treated CAB (Gly-CAB-AHP and GEG-CAB-AHP)

are presented in Figure 2.

Initially evaluated the unmodified cashew apple bagasse spectrum (Figure 2A),

the absorption bands at 1376 cm-1, 1161 cm-1, 1107 cm-1, 1049 cm-1 and 898 cm-1 were

attributed to carbohydrates in biomass. The band at 1376 cm-1 corresponds to a bending

of C–H group in cellulose, C–O asymmetric band was observed at 1161 cm-1 and the

band at 898 cm-1 corresponds to the vibration of β-glycosidic C–H deformation with a

ring vibration contribution (hexoses/pentoses) characteristic of glycosidic bonds in

carbohydrates [75,76]. The characteristic bands of lignin are at 1508 cm-1, 1458 cm-1

and 1420 cm-1 and they are associated with aromatic skeletal vibrations. The symmetric

bending vibrations of C–H bonds in methoxyl groups of syringyl and guaiacyl units

correspond to the 1420 cm-1 band. The strong absorption at 1251 cm-1 is originated by

the C–O stretching of acetyl groups present in hemicellulose molecular chains (Fig.

2A).

Cellulose characteristic bands in the region of 1250–850 cm-1 can be mainly observed in

an FTIR spectrum of treated CAB (CAB-AHP), which these bands are related at

(C) (D)

138


vibrations of pyranosyl rings, characteristic of cellulose (Fig. 2B). The peak at 1046 cm-

1 is attributed to hemicellulose absorptions explicitly to C–O stretching in C–O–C

linkages. The absorbance of the lignin bands at 1508 cm-1, 1458 cm-1 and 1420 cm-1

showed a decrease demonstrating a lower lignin content regarding the original content

in nature cashew apple bagasse. These results agree to those previously reproted[13].

Lignocellulosic materials, such as cashew apple bagasse, can be activated by

inserting functional groups owing to the presence of hydroxyl and carbonyl groups on

its surface [77]. Then, the spectra obtained were compared (of CAB-AHP with Gly-

CAB-AHP and/or GEG-CAB-AHP).

The peak related at OH groups (around 3450 cm−1) remained approximately with

the same intensity in the spectrum of Gly-CAB-AHP (Figure 2C), probably due to the

incomplete oxidation of glyceryl groups generated after the step of etherification with

glycidol [68]. However, the spectrum shows a decrease in the intensity of peaks of

1150-1750 cm-1, indicating that there was a change in structure, possibly the reaction of

glycidol with some –OH groups present in the structure of cellulose and hemicellulose

from CAB-AHP, promoted a steric hindrance in the groups C–O, C–O–C and C–H

group in cellulose and hemicellulose (groups identified in this range of wavelength),

and this fact changes the intensity of bands these groups (C-O, C-O-C and C-H).

In the spectrum of GEG-CAB-AHP occurred a peak characteristic of amine

groups around 1560 cm-1,due the presence of NH groups from reaction of

ethylenediamine with CAB-AHP after the reaction with glyoxyl. The peak related at

OH groups (around 3450 cm−1) decreased in the spectrum of GEG-CAB-AHP (Figure

2D), due probably the glutaraldehyde molecules react with hydroxyl groups that did not

reacted in the previous step of activation from CAB-AHP with glycidol

The results of the FTIR analysis are corroborated with physical structures

surface analysis (MEV), which there has been a major change in the cashew apple

bagasse structure after activation with GEG (glycidol – ethylenediamine –

glutaraldehyde).

(A) (B)

139


Figure 2: Infra (A) CAB- IN; (B) CAB – AHP; (C) CAB – GLY; (D) CAB- GEG

3.1.4 TG

The data obtained from the thermograms of natural, treated and activated-treated

cashew apple bagasse (TG curves) are summarized in Figure 3. The analyses were made

until 200 °C because the biocatalysts studied will not be applied to high temperatures.

The weight decay is related to moisture loss with a peak observed at 50 °C for all

samples, except for the activated-treated GEG-CAB-AHP.

The treatment of cashew apple bagasse with H2O2 promoted a decrease in thermal

stability, due the higher cellulose exposure and higher water content of this fiber. The

activation of treated CAB with glycidol or glycidol–ethylenediamine–glutaraldehyde

promoted an increase in the stability. Thus, the groups added to the polymers (cellulose

and hemicellulose) structures may turn it into a more hydrophobic structure, which

caused a lower weight loss (Gly-CAB-AHP) or none (GEG-CAB-AHP). The GEG-

CAB-AHP showed the higher stability thermal,perhaps some crosslinkings may be

established inter or intra fiber.

The high thermal stability of CAB-AHP derivatives at temperatures below 100 °C

confirm that this support can be used for immobilization of enzymes, which act

generally below this temperature.

(C) (D)

140


Figure 3: Thermogravimetric Analysis (TG). TGA curves for the support were

performed using Jupiter an apparatus Netzsch STA 409 in a temperature range 30 to

200 ° C and heating rate of 10°C min−1 under N2.

3.2 Determination of the immobilization parameters

Supports activated with glutaraldehyde or glyoxyl were compared and assessed

in their immobilization parameters as shown in Table 1.

Table1: Immobilization parameters for lipase from Candida sp through different

protocols offering protein loading of 0.5mg g−1 of support.

Biocatalyst TI (h) Ativd (U/g) R (%) AtivR (%)

BAG- GLY 24 0.22±0.19 39.6 1.25

BAG- GEG 1 21.8±0.52 95.1 124.8

TI: Immobilization time; Ativd: derived activity; R: Immobilization Yield; AtivR:

Recovered activity.

As shown in Figure 4, the CalB-CAB- GEG had the highest percentage of

immobilization, presenting a biocatalyst with catalytic activity approximately 90 times

higher than the derived activated with glycidol, with an immobilization yield of 95%

with 1h of immobilization. The immobilization involving activation with glycidol

derivatives showed low activity, difficult to read, once the support has suffered a

swelling during assay of activity. The preparation CAB-GEG (Fig 4B) was set for

further studies as it showed good catalytic activity, high yield immobilization without

mass losses in thermogravimetric tests, not occurring swelling,

(B) (A)

(B)

(A)

141


Figure 4: (A) Cashew apple bagasse activated with glycidol; (B) Cashew apple bagasse

activated with glycidol- ethylenediamine – glutaraldehyde

3.3 Loading capacity of glutaraldehyde cashew apple bagasse

In the Figure 5 shows the profile of immobilization yield trials against offered

load. Using 0.5 mg protein/g of support, the immobilization yield was 96%, when

offering 15 mg protein/g of support, immobilization yield was 76%. And using 30 mg,

the yield was around 31.2%. From these data, the maximum loading capacity of the

support was around 10 to 11 mg / g of support. This maximum loading observed could

be associated with the support (lignocellulosic with few pores presents) should also be

related to the complete coating of enzyme molecules on the support surface with the

linking groups.

Figure 5: Loading capacity of cashew apple bagasse activated with glycidol-

ethylenediamine – glutaraldehyde.

0

25

50

75

100

0 5 10 15 20 25 30 35

Imm

ob

iliz

ed

Yie

ld, (%

)

mg Protein offered/ g support

(B)

(B)

(A)

142


3.4 Storage stability of the immobilized CAG- GEG

The storage stability test was conducted in order to verify that the biocatalyst keeps its

catalytic activity along time. Figure 6 shows the evolution of the enzyme activity during

107 days, with a negligible loss of 9% of the activity.

Figure 6: Storage stability of the immobilized BAG- GEG per Candida sp during 107

days

3.5 Thermal stability and Stability in organic solvents

The data obtained are shown in Table 2 with half-life and stabilization factor

calculated according to the model proposed by Sadana and Henley (1987)[71]. For the

assay conducted at pH 7.0, the immobilized derivative showed 10 times higher stability

compared to the free enzyme, at pH 5 only a factor of 5 could be detected and at pH 9.0,

the stabilization factor was only 1.45. This suggested a certain degree of multipoint

covalent immobilization, that can induce some enzyme rigidity, and that the ionization

of the amino groups under the enzyme may also play some role.

For stability against THF or can, the immobilized preparations were more stable than

the soluble enzyme. For stability in 80% (v/v) THF the preparations immobilized

enzyme was about 5 times more stable than the free enzyme and the stability using 80%

acetonitrile, was 10,000 times more stable using the immobilized enzyme than the free

enzyme, taking about 96 hours to achieved half-life. Table 2 presents the data obtained

in the thermal stability tests and organic solvents. This high stabilization may be related

0

25

50

75

100

125

0 20 40 60 80 100

Imm

ob

iliz

ed

Yie

ld (

%)

Days

143


to the prevention of enzyme precipitation, a very likely phenomenon using free enzyme

in organic solvents.

Table 2: Half-lives (minutes) and stabilizing factor in different conditions.

Preparations pH 5.0 pH 7.0 pH 9.0 THF 80% ACN 80%

Soluble

Enzyme

6.02 1.99 5.0 3.22 0.53

BAG-GEG 29.85 20.58 7.23 15.51 > 5760

Stabilization

Factor

4.95 10.34 1.45 4.81 10867

3.6 SDS-PAGE analysis

The analysis was realized to confirmation of covalent bond between enzyme and

the support, samples immobilized and free CALB were subjected to SDS-PAGE

analysis (Figure 7) and the appearance of bands not meant binding covalent occurred

efficiently. Samples were denatured in disruption buffer (diluted 1: 1) in a water bath at

100 °C for seven minutes a methods. Lane 2 show the band obtained using an

equivalent amount of CALB, it is a quite pure enzyme of around 30 kDa. Lanes 3

(BAG- GEG) and 4 (BAG- GLY) showed no bands, suggesting that all enzyme

presented in this support was covalently immobilized.

Figure 7: SDS-PAGE analysis of different biocatalysts preparations. Lane 1: molecular

weight marker, Lane 2:soluble enzymes, Lane 3: derivated CAB-GEG, Lane

4:derivated- CAB-GLY.

1 2 3 4

144


3.7 Chemoenzymatic synthesis of rac-indanyl

3.7.1 Synthesis of rac-indanol and rac-indanyl acetate

Indanone was reduced using sodium borohydride in methanol (MeOH) to yield

the rac-indanol (93% yield after flash chromatography). Next, the chemical acetylation

of rac-indanol using acetic anhydride (Ac2O), 4-dimethylaminopyridine (DMAP) as

catalyst, triethylamine (Et3N) in dichloromethane (CH2Cl2) at room temperature allowed

the preparation of the corresponding rac-indanyl acetate with 87% isolated yield after

flash chromatography (Fig 8):

Figure 8: Chemical synthesis of rac - indanyl acetate

Adequate chiral GC analyses were developed for both rac-indanol and rac-

indanyl acetate in order to achieve a reliable method to measure the enantiomeric excess

values of both remaining substrate and the final product from the lipase-catalyzed

resolution, Fig 9.

Figure 9: GC chromatograms of rac - indanyl acetate tR32.68 min. (S) tR33.17 min. (R)

and rac - indanoltR37.95 min. (S) tR38.98 min. (R).

145


3.7.2 Hydrolysis reaction of rac-indanyl acetate using lipase

The hydrolysis reaction of rac-indanyl acetate was performed using, CALB

immobilized on cashew apple bagasse as biocatalyst. The stereo centers of the indanol

and indanyl acetate were determined by optical rotation using a polarimeter and the

values obtained were compared with the literature. The value of specific optical rotation

(R)-indanol was [α]D20 = -30.1 (c 1.0, CHCl3) e.e. = 98% while the value given in the

literature is [α]D25 -30.6 (c 1.0, CHCl3) e.e.> 99% (Lee et al., 2011)[48]. For the (S)-

acetate indanyl the value obtained was [α]D20 = -86.8 (c 1.0, CHCl3) e.e.> 99%; and the

value reported in the literature was [α]D26 = - 87.6 (c 1.0, CHCl3) and e.e.> 99% (Kim et

al., 2004, p. 473) [78]. The configurations of the stereo centers of the products followed

the empirical rule of Kazlauskas considers that, in hydrolysis reactions using lipases, to

obtain the alcohol with configuration R and the remaining acetylated substance with

configuration S (Kazlauskas et al., 1991)[79] (Table 3).

Table 3: Kinetic resolution via hydrolysis of rac - indanyl acetate using lipase.a

Entry Presence Co

solvent

e.e.s (%) e.e.p (%) c(%) Ed

1 Yes 98 98 50 458

2 No 97 97 50 278

aConditions: 30 ºC, 24 h and lipase:indanyl acetate (2:1) at 250 r.p.m.

bDetermined by GC.

cConversion, c = e.e.s/(e.e.s+ e.e.p).

dEnantiomeric ratio, E = ln[1 − c(1 + e.e.p)]/ln[1 − c(1 − e.e.p)].

Some enzymatic kinetic resolution methods of racemic indanyl acetate for the

formation of (S)-indanyl acetate and (R)-indanol using a commercial CALB

immobilized on acrylic resin are found recently in the literature.

Some of these methods presented conversion values lower than 50% (18-43%),

also the enantiomeric excess values of the (S)-indanyl acetate ranged between 3-77%

146


[60,80,81]. Other methods present conversion values equal to 50%, enantiomeric excess

of substrate and product ≥98% and the enantiomeric ratio values greater than 200.

However, the temperatures of reactions and / or reaction times were greater than 30°C

and 24 h[80,82,83]. In addition, all methods make use of organic co-solvents, such as

toluene and diisopropyl ether, and we have got results in fully aqueous media. Thus, the

results obtained from the hydrolytic reaction of the racemic indanyl acetate using CALB

immobilized on cashew apple bagasse as biocatalyst are satisfactory, since present

values of conversion equal to 50%, enantiomeric excess of the (S)-indanyl acetate and

(R)-indanol equal to 98% and the enantiomeric ratio values greater than 200.

Furthermore, to obtain these values are not was required the presence of an organic co-

solvent, using only water as solvent.

The e.e. could be increased to more than 99% using THF, but that was not a

fully strict requirement.

Thus, this methodology can be environmentally friendly since it does not use

organic solvents and use a biocatalyst immobilized on a natural [11].

3.7.3 Reuse of the immobilized enzyme

It is observed that the conversion values are equal or close to 50% until the third

cycle (Table 4). However, the enantiomeric ratio values decrease drastically in the

second cycle.

Table 4. Reuse of the immobilized enzyme results.a

Entry Cicle e.e.s(%) e.e.p(%) c(%) Ed

1 1 98 97 50 303

2 2 80 84 49 28

3 3 73 82 47 22

4 4 40 82 33 15

5 5 26 80 24 12

aConditions: 30 ºC, 24 h and lipase:indanyl acetate (2:1) at 250 r.p.m. bDetermined by GC. cConversion, c = e.e.s/(e.e.s+ e.e.p). dEnantiomeric ratio, E = ln[1 − c(1 + e.e.p)]/ln[1 − c(1 − e.e.p)].

147


4. Conclusions

The support Cashew apple bagasse has shown to be very useful to immobilize CALB.

The enzyme becomes immobilized on this support via covalent immobilization on its

activated surface, and produces a catalyst that is more thermostable and stable in the

presence of organic solvents than the soluble CALB. The new biocatalyst showed the

maximum loading (30 mg protein/g support). The conversion attained in the synthesis

of ethyl rac-indanol was 50% of conversion and e.e. of 99% after 24 h, and the

reusability of the new biocatalyst showed maintenance of conversion and e.e. during

three cycles. This new strategy to obtain (R)-Indanol using a new biocatalyst from

renewable polymeric matrixes can be considered environmentally benign, low cost,

commercially available, stable, reusable for multiple reaction cycles and highly

enantioselective biocatalyst was used.

Acknowledgments

We gratefully acknowledge the financial support of Brazilian Agencies for Scientific

and Technological Development, Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (FUNCAP), Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Ensino Superior

(CAPES) and Central Analitica UFC. The authors wish to thank the help and comments

from Dr. Alejandro Pedro Ayala (Departamento de Física, Universidade Federal do

Ceará) are kindly acknowledged.

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[73] T.H.S. Rodrigues, E.M. de Barros, J. de Sá Brígido, W.M. da Silva, M.V.P.

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Bagasse into Ethanol by SHF and SSF Processes, Appl. Biochem. Biotechnol.

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[74] a. I.S. Brígida, V.M. a Calado, L.R.B. Gonçalves, M. a Z. Coelho, Effect of

chemical treatments on properties of green coconut fiber, Carbohydr. Polym. 79

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[75] A.M. da Costa Lopes, K.G. João, D.F. Rubik, E. Bogel-Łukasik, L.C. Duarte, J.

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[76] K.G.G. Satyanarayana, J.L.L. Guimarães, F. Wypych, Studies on lignocellulosic

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applications, Compos. Part A Appl. Sci. Manuf. 38 (2007) 1694–1709.

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[77] A.I.S. Brígida, A.D.T. Pinheiro, A.L.O. Ferreira, G. a S. Pinto, L.R.B.

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to green coconut fiber., Appl. Biochem. Biotechnol. 137-140 (2007) 67–80.

doi:10.1007/s12010-007-9040-8.

[78] M.-J. Kim, H.M. Kim, D. Kim, Y. Ahn, J. Park, Dynamic kinetic resolution of

secondary alcohols by enzyme?metal combinations in ionic liquid, Green Chem.

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[79] R.J. Kazlauskas, A.N.E. Weissfloch, A.T. Rappaport, L.A. Cuccia, A rule to

predict which enantiomer of a secondary alcohol reacts faster in reactions

catalyzed by cholesterol esterase, lipase from Pseudomonas cepacia, and lipase

from Candida rugosa, J. Org. Chem. 56 (1991) 2656–2665.

doi:10.1021/jo00008a016.

[80] Z. Houiene, M. Merabet-Khelassi, N. Bouzemi, O. Riant, L. Aribi-Zouioueche, A

157


green route to enantioenriched (S)-arylalkyl carbinols by deracemization via

combined lipase alkaline-hydrolysis/Mitsunobu esterification, Tetrahedron:

Asymmetry. 24 (2013) 290–296.

doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.tetasy.2013.01.020.

[81] A. Zaïdi, M. Merabet-Khelassi, L. Aribi-Zouioueche, CAL-B-Catalyzed

Enantioselective Deacetylation of Some Benzylic Acetate Derivatives Via

Alcoholysis in Non-aqueous Media, Catal. Letters. 145 (2015) 1054–1061.

doi:10.1007/s10562-014-1470-7.

[82] N. Bouzemi, I. Grib, Z. Houiene, L. Aribi-Zouioueche, Enantiocomplementary

Preparation of (S)- and (R)-Arylalkylcarbinols by Lipase-Catalysed Resolution

and Mitsunobu Inversion: Impact of Lipase Amount, Catalysts. 4 (2014) 215–

225. doi:10.3390/catal4030215.

[83] M. Merabet-Khelassi, Z. Houiene, L. Aribi-Zouioueche, O. Riant, Green

methodology for enzymatic hydrolysis of acetates in non-aqueous media via

carbonate salts, Tetrahedron: Asymmetry. 23 (2012) 828–833.

doi:10.1016/j.tetasy.2012.06.001.

Anexo B

Trabalhos Completos Publicados em

Anais De Congressos

159

Anexo B – Trabalhos Completos Publicados em Anais de Congressos Souza, T.C.

ANEXO B (PRODUÇÕES CIENTÍFICAS)

1. Souza, T. C; Santos, J. C. S; Silva, J. S; Correia, J. A. C; Rocha, M. V. P;

Gonçalves, L. R. B. IMOBILIZAÇÃO DE LIPASE DE Aspergillus niger EM

BAGAÇO DE CAJU PRÉ-TRATADO COM PERÓXIDO DE HIDROGÊNIO

ALCALINO. In: XX Simpósio Nacional de Bioprocessos; XI Simpósio de

Hidrólise Enzimática de Biomassa. 2015. Fortaleza/Ceará.

2. Santos, J. C. S; Souza, T. C; Silva, J. S; Correia, J. A. C; Rocha, M. V. P;

Gonçalves, L. R. B. CARACTERIZAÇÃO DO BAGAÇO DE CAJU USADO

COMO SUPORTE PARA IMOBILIZAÇÃO DA ENZIMA Candida sp

EXPRESSA EM Aspergillus niger. XXI Congresso Brasileiro de Engenharia

Química. 2016. Fortaleza/ Ceará (SUBMETIDO).

3. Souza, T. C; Santos, J. C. S; Silva, J. S; Correia, J. A. C; Rocha, M. V. P;

Gonçalves, L. R. B. BAGAÇO DE CAJU: UM SUPORTE DE BAIXO CUSTO

PARA A PRODUÇÃO DE BIOCATALISADORES ENZIMÁTICOS. XXI

Congresso Brasileiro de Engenharia Química. 2016. Fortaleza/ Ceará

(SUBMETIDO).

4. Souza, T. C; Fonseca, T. S; Rocha, M. V. P; Santos, J. C. S; Gonçalves, L. R. B;

Mattos, M. C. IMOBILIZAÇÃO DE LIPASE DE Candida sp EXPRESSA EM

Aspergillus niger EM BAGAÇO DE CAJU PARA APLICAÇÃO EM SÍNTESE

QUIMIO-ENZIMÁTICA. XXI Congresso Brasileiro de Engenharia Química. 2016.

Fortaleza/ Ceará (SUBMETIDO).

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