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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁPRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DIRETORIA DE PESQUISA

PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA – PIBIC : CNPq, CNPq/AF, UFPA, UFPA/AF, PIBIC/INTERIOR, PRODOUTOR, PIBIT E FAPESPA

RELATÓRIO TÉCNICO - CIENTÍFICO

Período : Agosto /2016 (X) PARCIAL( ) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO

a Agosto / 2017

Título do Projeto de Pesquisa: Estudo do interatoma e exossoma para pesquisa de novos alvos

terapêuticos em Corynebacterium pseudotuberculosis.

Nome do Orientador: Diego Assis das Graças

Titulação do Orientador: Professor Doutor

Faculdade: Biotecnologia

Instituto/Núcleo: Instituto de Ciências Biológicas (ICB)

Laboratório: Laboratório de Genômica e Bioinformática

Título do Plano de Trabalho: Identificação e caracterização de genes e vias metabólicas

envolvidas na degradação de hidrocarbonetos a partir de dados metagenômicos

Nome do Bolsista: Cássia Maués Cuóco

Tipo de Bolsa : ( ) PIBIC/ CNPq( ) PIBIC/CNPq – AF( ) PIBIC /CNPq- Cota do pesquisador (X) PIBIC/UFPA( ) PIBIC/UFPA – AF ( ) PIBIC/ INTERIOR( ) PIBIC/PRODOUTOR( ) PIBIC/PE-INTERDISCIPLINAR ( ) PIBIC/FAPESPA

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( ) PIBIC/PIBIT

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1. INTRODUÇÃO

O petróleo, ou óleo cru, há anos possui expressiva importância na economia mundial como matéria prima de diversos produtos presentes no cotidiano da humanidade, seu consumo cresceu cerca de 1,9 milhões de barris por dia (b/d) e sua produção cerca de 2,8 milhões b/d no ano de 2015 [1], tal taxa de crescimento teve continuidade em 2016, sendo assim o segundo ano de crescimento consecutivo na taxa de produção mundial do mesmo. Tal exploração localizada tanto em solo (onshore) quanto ao mar (offshore) tende a aumentar nos próximos anos nas plataformas presentes no território brasileiro [2] e, com o aumento da frequência da extração do mesmo – em particular das plataformas predominantes, as offshore – problemáticas advindas da cadeia de produção deste commoditie apresentam uma probabilidade maior de ocorrerem; a contaminação de ambientes por petróleo, em particular dos mangues, tornam-se extremamente provável.

A nível mundial, estima-se que os manguezais compõem cerca de 137,760 km² localizados em zonas costeiras distribuídas por diversos territórios [3], no Brasil tal área é mais presente ao norte do país [4]. Definido como ecótono – áreas de transição entre dois diferentes ecossistemas – o mangue, por essa definição, possui a existência da confluência de componentes bióticos de dois diferentes ecossistemas, resultando assim em uma maior variedade de espécies na região [5]. Além de possuir importância ambiental, os mangues são fonte econômica tanto para extrativismo sustentável de nativos quanto para aquicultura local [6]; fatos estes que vem a ratificar a ênfase em preservar as áreas em questão, uma vez que se encontram sob a plausível situação prejudicial advindas de atos antropológicos, em particular, a poluição por petróleo bruto e seus derivados.

No caso de poluição por compostos xenobióticos [7], como no caso do óleo cru, a remoção se faz necessária de modo imediato para fins de menor dano ao ambiente poluído. Entretanto, essa remoção não ocorre do modo desejado e para alcançar esta finalidade, um preparo prévio é necessário. Fora descrito, a partir da junção de resultados de estudos diversos, o modo de maior remoção do petróleo quando derramado em ambientes, que consiste em remoção por intermédio de microrganismos [8]. Pesquisas voltadas para a identificação e o uso de materiais biológicos para finalidades comerciais – ou seja, bioprospecção [9] – são alternativas para resolução dessa adversidade. Estudos são estimulados com o intuito de identificar de sequências (Open Reading Frame – ORFs) potencialmente codificadoras de genes com propriedades singulares e possíveis aplicações comerciais, como no caso dos genes alkB e alfa-ARHD, para a remoção de petróleo no ambiente por microrganismos.

Abordagens microbiológicas são frequentemente utilizadas para identificação de um potencial de biorremediação [10-19], cuja designação se reduz à remoção ou imobilização de poluentes por intermédio de organismos vivos [20]. Porém, a maioria absoluta dos microrganismos não são cultiváveis [21], ou seja, técnicas para a análise dependente de cultivo não irão obter um resultado verídico em relação a diversidade total local. Análises independentes de cultivo apresentam-se como uma alternativa para esta situação, como a exemplo de pesquisas com metagenômica ambiental, que consiste em analisar o DNA total de uma amostra sem processos selecionadores [22]. Diversos trabalhos foram desenvolvidos quanto à métodos para remoção de locais contaminados com óleo cru em áreas costeiras [23-24], no entanto poucos com uma abordagem metagenômica ao norte do território brasileiro.

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2. JUSTIFICATIVA

Na 11ª rodada de licitações da Agência Nacional do Petróleo (ANP), que ocorreu no mês de maio de 2013, o consórcio formado pelas empresas Queiroz-Galvão e Pacific Brasil arremataram dois blocos da bacia Pará-Maranhão, chamados de PAMA-M-265 e PAMA-M-337 (www.anp.gov.br). Esses blocos estão situados cerca de 200 quilômetros do litoral do Pará e do Maranhão, e a exploração do petróleo dessas áreas certamente causará impactos ambientais pela liberação de hidrocarbonetos, seja por pequenos vazamentos no transporte, na perfuração, ou mesmo pela própria atividade antropogênica na região. Isto é de particular importância, uma vez que a região é rica em manguezais e zonas prístinas.

Figura 1: Bacia Pará-Maranhão – Setor SPAMA-AP1Localização dos blocos PAMA-M-265 e PAMA-M-337 arrematados ao nordeste do estado do

Pará.

A liberação de hidrocarbonetos no ambiente é uma das piores formas de poluição que existem para água, solo, flora e fauna. Isto porque são compostos em geral muito hidrofóbicos capazes de penetrar as membranas celulares causando mutações, e nos humanos podem causar inclusive câncer [26]. Esses hidrocarbonetos também se acumulam na cadeia trófica, tornando sua concentração ainda maior para os seres humanos. Várias estratégias para remoção de hidrocarbonetos são utilizadas, porém a biorremediação apresenta-se como a mais adequada e economicamente viável.

A biorremediação do petróleo é um processo complexo e que envolve basicamente dois tipos de estratégia: (1) bioaumentação, na qual bactérias de capazes de degradar o petróleo são adicionadas ao ambiente para ajudar a comunidade natural no processo, e a (2) bioestimulação, na qual o crescimento desse tipo de bactéria é estimulado pela adição de nutrientes e outros compostos químicos considerados limitantes de crescimento. Para definir qual estratégia é mais adequada, uma caracterização da biodiversidade e do ambiente é previamente necessária.

O principal objetivo do projeto é identificar vias metabólicas e micro-organismos envolvidos nas transformações biológicas pela degradação do petróleo em ambientes amazônicos para fins de biorremediação.

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3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GERAL:Bioprospecção de genes e vias metabólicas envolvidas na degradação de hidrocarbonetos a partir de dados metagenômicos

3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS:- Realizar a caracterização funcional e taxonômica das sequências com o auxílio do programa MEGAN CE.- Selecionar as sequências que apresentem fragmentos de matrizes abertas de leituras, sequências ORFs codificantes para enzimas capazes de degradar diferentes classes de hidrocarbonetos com a plataforma MG-RAST.- Determinar a diversidade de genes alkB (AlkB) nos dados metagenômicos.- Determinar a diversidade de genes de alfa ARHD capazes de degradas hidrocarbonetos policíclicos aromáticos.- Análise de vias metabólicas capazes de degradar hidrocarbonetos com a plataforma MG-RAST e o programa Metapath.

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4. MATERIAIS E MÉTODOS

A amostragem fora realizada na cidade costeira de Salinópolis, ao nordeste do estado do Pará (Brasil), em um ponto existente na área de manguezal (0°37'00.4"S 47°20'09.8"W) cujo contato com a costa marinha é permanente. A localidade apresenta constante intervenção antropológica, havia presença de moradias ao redor e de ponto de ancoragem de barcos pesqueiros. Tal amostragem ocorrerá durante o período de maré baixa, 8:00h, no dia 12/11/2016. Duas réplicas foram obtidas com no máximo de 1m de profundidade a partir da superfície da lâmina de água, armazenadas em garrafas estéreis e transportadas em recipientes isolantes térmicos com gelo.

Figura 2: Local de Amostragem.Ponto correspondente a localização geográfica 0°37'00.4"S 47°20'09.8"W em banco de dados de

imagens por satélite

Amostras obtidas do manguezal amazônicos tiveram seu DNA total isolado com o UltraClean® Microbial DNA Isolation Kit (MoBio Laboratories) com duas modificações no protocolo do fabricante – a primeira e segunda etapas de centrifugação ocorreram do seguinte modo: 13.000 x g por 2 minutos – e serão aleatoriamente sequenciados na plataforma Ion Torrent PGM, com uso do Ion 318™ Chip Kit v2 (ThermoFisher Scientific). Esses dados serão analisados quanto a qualidade a partir do arquivo .fastq obtido do sequenciador. Bases e leituras muito pequenas (< 100 pb, pares de base) e de baixa qualidade (QV< 20, quality value) serão analisadas e eliminadas respectivamente com o uso dos programas FastQC e FastX [27], pois não possuem confiabilidade ou permitem caracterização.

Após a análise de qualidade, as leituras serão submetidas ao pipeline de Anotação Rápida de Metagenôma usando Tecnologia de Subsistemas (Metagenomic Rapid Annotations using Subsystems Technology – MG-RAST) [28] e ao programa MEGAN Community Edition (MEGAN CE) [29] para identificação taxonômica e funcional com os parâmetros: Top Percent = 10, Min Score = 25, Min Support = 5, Win Score = 0 e Weighted LCA Algorithm = 80.

O alinhamento das sequências para uso no MEGAN CE será feito com o script Diamond [30] com base no banco de dados não redundantes de proteínas do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (National Center for Biotechnology Information – NCBI) com os seguintes parâmetros: Blastx, --query-gencode Standart Code, --matrix BLOSUM62, --evalue 0.001, --gapopen 11, --gapextended 1 e --sensitive. Como resultado, um arquivo no formato Diamond alignment archive (.daa) será submetido a identificação taxonômica e funcional metagenômica no MEGAN CE com o intermédio da ferramenta Meganizer, encontrada no referido programa de análise.

Análises de mapas metabólicos dos dados metagenômicos, após a análise de qualidade, serão realizadas o com pipeline MG-RAST e com o script MetaPath [31] para avaliação da abundância das mesmas. Análises de binning taxonômico e viés de códon também serão realizadas para determinar a qual táxon bacteriano os genes de degradação pertencem.

Após a análise das vias metabólicas, as leituras que possuem genes relacionados à degradação de hidrocarbonetos, como alkB para hidrocarbonetos simples e alfa-ARHD para os policíclicos aromáticos serão selecionadas para análise de diversidade e se possível, modelagem molecular. A determinação de mutações será feita através de software Bioedit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). As sequencias serão clusterizadas com cutoff de 3% de dissimilaridade permitida dentro do grupo.

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5. RESULTADOS PRELIMINARES

Análise de quantitativa do DNA extraído foi realizada em dois diferentes dispositivos, Qubit® Fluorometric Quantitation (Invitrogen) e NanoDrop™ Lite Spectrophotometer (Thermo Scientific). Os valores obtidos de concentração são, respectivamente para cada um dos aparelhos, de 3,6ng/µL e 5,0ng/µL. O coeficiente de absorbância, obtido com o aparelho Qubit, foi de 2,4.

A padronização dos parâmetros para alinhamento com o script Diamond e para análises no programa MEGAN CE fora feita com base em testes com sequências obtidas a partir do sequenciamento de amostras advindas do lago represado da hidrelétrica de Tucuruí, cujo DNA foi extraído com o mesmo kit comercial UltraClean (MoBio) e as mesmas mudanças em seu protocolo.

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6. ATIVIDADES A SEREM DESENVOLVIDAS NOS PRÓXIMOS MESES

6.1 – Sequenciamento das amostras na plataforma Ion Torrent PGM.

6.2 – Análise de qualidade das sequencias e submissão dos dados aos pipelines metagenômicos.

– Obtenção dos dados do sequenciador, análise em softwares fastQC e FastX. – Submissão ao portal MG-RAST. – Alinhamento dos dados com o script Diamond e meganização das sequências.

6.3 – Obtenção das classificações das sequencias em ORFs identificadas funcionalmente – Realizar a caracterização funcional das sequências através da plataforma MG-RAST e no programa MEGAN CE.

6.4 – Selecionar as sequências que apresentem fragmentos de ORFs codificantes para enzimas capazes de degradar diferentes classes de hidrocarbonetos.

– Seleção das sequencias que apresentam genes de alkB e alfa-ARHDs para caracterização da diversidade e determinação de mutações.

6.5 – Determinar a diversidade de genes alkB nos dados metagenômicos.– Clusterização e determinação da diversidade de genes alkB.

6.6 – Determinar a diversidade de genes de alfa-ARHD capazes de degradas hidrocarbonetos policíclicos aromáticos.

– Clusterização e determinação da diversidade dos genes de alfa-ARHD.

6.7 – Análise dos mapas do KEGG obtidos na plataforma MG-RAST.– Análise de vias metabólicas capazes de degradar hidrocarbonetos.

6.8 – Produção e entrega do relatório final e preparação do seminário PIBIC.– Confecção e entrega do relatório técnico com os resultados finais da pesquisa e preparação do seminário PIBIC

ATIVIDADESMESES

7 8 9 10 11 12Sequenciamento das amostras na plataforma Ion Torrent PGM X

Análise de qualidade das sequencias e submissão dos dados aos pipelines metagenômicos X

Obtenção das classificações das sequencias em ORFs identificadas funcionalmente X X

Selecionar as sequências que apresentem fragmentos de ORFs codificantes para enzimas capazes de degradar diferentes classes de hidrocarbonetos

X X

Determinar a diversidade de genes alkB nos dados metagenômicos X X

Determinar a diversidade de genes de alfa-ARHD capazes de degradas hidrocarbonetos policíclicos aromáticos. X X

Análise de vias metabólicas capazes de degradar hidrocarbonetos X X X

Produção e entrega do relatório final e preparação do seminário PIBIC X

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7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] BP GLOBAL, BP Statistical Review of World Energy 2016. Disponível em: www.bp.com/ (Acesso em Dezembro de 2016)

[2] MINISTÉRIO DE MINAS E ENERGIA (2015) – Plano Decenal de Expansão de Energia 2024. Secretaria de Planejamento e Desenvolvimento Energético

[3] GIRI et al. (2010) – Status and distribution of mangrove forests of the world using earth observation satellite data. Global Ecology and Biogeography, 20, 154–159.

[4] MINISTÉRIO DE MEIO AMBIENTE. Disponível em: http://www.mma.gov.br/ (Acesso em Dezembro 2016)

[5] S. KARK e BERNDT RENSBURG (2006) – Ecotones: Marginal or central areas of transition? Israel Journal of Ecology & Evolution, 52, 29–53.

[6] G.S. TENÓRIO et al (2015) – Mangrove shrimp farm mapping and productivity on the Brazilian Amazon coast: Environmental and economic reasons for coastal conservation. Ocean & Coastal Management, 104, 65-77.

[7] MADIGAN, M. T. et al. Unidade 4 – Ecologia microbiana e microbiologia ambiental: Capítulo 21 – Microbiologia dos ambientes Construídos. Microbiologia de Brock (14ª edição). Porto Alegre: Artmed, 2016. Página 654.

[8] DAS e CHANDRAN (2010) – Microbial Degradation of Petroleum Hydrocarbon Contaminants: An Overview. Biotechnology Research International; doi:10.4061/2011/941810

[9] MATEO et al. (2001) – Bioprospecting. Encyclopedia of Biodiversity, volume 1, 471-488.

[10] TAN et al. (2013) – Metagenomic analysis of an anaerobic alkane-degrading microbial culture: potential hydrocarbon-activating pathways and inferred roles of community members. NRC Research Press: Genome, 56, 599–611.

[11] S. JECHALKE et al. (2012) – Analysis of structure, function, and activity of a benzene-degrading microbial community. FEMS Microbiol Ecology, 85, 14–26.[12] NIE, Y. et al. (2014) – Diverse alkane hydroxylase genes in microorganisms and environments. Nature Scientific Reports, 4, 4968; doi:10.1038/srep04968

[13] STAUFFERT M., CRAVO-LAUREAU C., JÉZÉQUEL R., BARANTAL S., CUNY P. et al. (2013) – Impact of Oil on Bacterial Community Structure in Bioturbated Sediments. PloS ONE 8(6): e65347; doi:10.1371/journal.pone.0065347

[14] D. JURELEVICIUS et al. (2012) – Distribution of alkane-degrading bacterial communities in soils from King George Island, Maritime Antarctic. European Journal of Soil Biology, 51, 37-44.

[15] JURELEVICIUS et al. (2013) – Bacterial Community Response to Petroleum Hydrocarbon Amendments in Freshwater, Marine, and Hypersaline Water-Containing Microcosms. Applied and Environmental Microbiology, p. 5927–5935.

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[17] JANI M. SALMINEN, PIRJO M. TUOMI e KIRSTEN S. JØRGENSEN (2008) – Functional Gene Abundances (nahAc, alkB, xylE) in the Assessment of the Efficacy of Bioremediation. Applied Biochemistry Biotechnology, 151, 638–652; doi 10.1007/s12010-008-8275-3

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[18] ALVAREZ et al. (2008) – Bioremediation Potential of a Tropical Soil Contaminated with a Mixture of Crude Oil and Production Water. Journal of Microbiology and Biotechnology, 18 (12), 1966–1974.

[19] S. PAISSÉ et al. (2012) – Ring-hydroxylating dioxygenase (RHD) expression in a microbial community during the early response to oil pollution. FEMS Microbiology Ecology, 80, 77–86.

[20] MADIGAN, M. T. et al. Unidade 4 – Ecologia Microbiana e Microbiologia Ambiental: Capítulo 21 – Microbiologia dos Ambientes Construídos. Microbiologia de Brock (14ª edição). Porto Alegre: Artmed, 2016. Página 653.

[21] MADIGAN, M. T. et al. Unidade 4 – Ecologia microbiana e microbiologia ambiental: Capítulo 18 – Métodos em ecologia microbiana. Microbiologia de Brock (14ª Edição). Artmed. Página 567.

[22] MADIGAN, M. T. et al. Unidade 2 – Genômica, genética e virologia. Capítulo 6 – Genômica microbiana. Microbiologia de Brock (14ª Edição). Artmed. Página 204.

[23] ANDREOTE FD, JIMÉNEZ DJ, CHAVES D, DIAS ACF, LUVIZOTTO DM, et al. (2012) The Microbiome of Brazilian Mangrove Sediments as Revealed by Metagenomics. PLoS ONE 7(6): e38600. doi:10.1371/journal.pone.0038600

[24] DOS SANTOS HF, CURY JC, DO CARMO FL, DOS SANTOS AL e TIEDJE J et al. (2011) – Mangrove Bacterial Diversity and the Impact of Oil Contamination Revealed by Pyrosequencing: Bacterial Proxies for Oil Pollution. PLoS ONE, 6(3), e16943. doi:10.1371/journal.pone.0016943

[25] LIMA, D. (2012) – Análise da diversidade, abundância e estrutura funcional da comunidade microbiana de três manguezais do estado de São Paulo, Brasil. 05/12/2012, São Paulo. 210 páginas - Instituto de Ciências Biomédicas, USP. doi: 10.11606/T.42.2012.tde-19042013-105207

[26] YU H (2002) Environmental carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons: photochemistry and phototoxicity. Journal of environmental science and health. Part C, Environmental carcinogenesis & ecotoxicology reviews, 20: 149–183.

[27] RAVI K. PATEL e MUKESH JAIN (2012) – NGS QC Toolkit: A Toolkit for Quality Control of Next Generation Sequencing Data. PLoS ONE, 7(2): e30619. doi:10.1371/journal.pone.0030619.

[28] MEYER F, PAARMANN D, D’SOUZA M, OLSON R, GLASS EM, KUBAL M, PACZIAN T, RODRIGUEZ A, STEVENS R, WILKE A, WILKENING J e EDWARDS RA (2008) – The Metagenomics RAST server — A public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics, 9:386.

[29] HUSON DH, BEIER S, FLADE I, GÓRSKA A, EL-HADIDI M, MITRA S, RUSCHEWEYH HJ e TAPPU R. (2016) – MEGAN Community Edition-Interactive Exploration and Analysis of Large-Scale Microbiome Sequencing Data. PLoS Comput Biology, 12(6):e1004957. doi: 10.1371/journal.pcbi.1004957

[30] BUCHFINK B, XIE C e HUSON DH (2014) – Fast and sensitive protein alignment using DIAMOND. Nature Methods, 12. doi:10.1038/nmeth.3176

[31] LIU e POP (2011) – MetaPath: identifying differentially abundant metabolic pathways in metagenomic datasets. BMC Proceedings, 5 (Suppl 2):S9.

FIGURA 1: Superintendência de Promoção de Licitações (SPL). Bacia Pará-Maranhão – Setor SPAMA-AP1. Disponível em: http://www.brasil-rounds.gov.br/ (Acesso em Fevereiro de 2017)

FIGURA 2: GOOGLE. Google Earth. Version X. 2017. Local de Amostragem. Disponível em: https://www.google.com.br/ (Acesso em Fevereiro de 2017)

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8. DIFICULDADES

Segundo o planejamento inicial, as coletas seriam feitas no início do plano de trabalho, porém, o projeto só teve recursos liberados para a coleta por volta de outubro de 2016, e o sequenciamento só será realizado em Março. Entretanto, com a utilização de outros dados metagenômicos produzidos no grupo, a padronização das análises já está em curso, o que facilitará a produção dos resultados esperados.

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PARECER DO ORIENTADOR:

A discente Cássia Maués Cuóco demonstra grande interesse e empenho nas atividades laboratoriais e acadêmicas. Durante o estágio de iniciação científica, vem demonstrando capacidade intelectual e motivação pela atividade científica na área de seu plano de pesquisa. Não tenho dúvidas de que os objetivos propostos serão cumpridos e os resultados gerados representarão uma contribuição original dentro da pesquisa sobre metagenômica

DATA: 22 / 02 / 2017

ASSINATURA DO ORIENTADOR

ASSINATURA DO ALUNO

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FICHA DE AVALIAÇÃO DE RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA

O AVALIADOR DEVE COMENTAR, DE FORMA RESUMIDA, OS SEGUINTES ASPECTOS DO RELATÓRIO :

1. O projeto vem se desenvolvendo segundo a proposta aprovada? Se ocorreram mudanças significativas, elas foram justificadas?

2. A metodologia está de acordo com o Plano de Trabalho ?

3. Os resultados obtidos até o presente são relevantes e estão de acordo com os objetivos propostos?

4. O plano de atividades originou publicações com a participação do bolsista? Comentar sobre a qualidade e a quantidade da publicação. Caso não tenha sido gerada nenhuma, os resultados obtidos são recomendados para publicação? Em que tipo de veículo?

5. Comente outros aspectos que considera relevantes no relatório

6. Parecer Final: Aprovado ( )Aprovado com restrições ( ) (especificar se são mandatórias ou recomendações) Reprovado ( )

7. Qualidade do relatório apresentado: (nota 0 a 5) Atribuir conceito ao relatório do bolsista considerando a proposta de plano, o desenvolvimento das atividades, os resultados obtidos e a apresentação do relatório.

Data : / / .

Assinatura do(a) Avaliador(a)