UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE …...A banca de qualificação do doutorado: Carlos...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA

LEANDRO SILVA COSTA

BIOPROSPECÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE

MACROALGAS MARINHAS DO LITORAL DO RIO GRANDE DO

NORTE: CARACTERIZAÇÃO DE UMA HETEROFUCANA EXTRAÍDA

DA ALGA MARRON Sargassum filipendula QUE INDUZ APOPTOSE

EM CÉLULAS HeLa.

NATAL 2012

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LEANDRO SILVA COSTA

BIOPROSPECÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE

MACROALGAS MARINHAS DO LITORAL DO RIO GRANDE DO

NORTE: CARACTERIZAÇÃO DE UMA HETEROFUCANA EXTRAÍDA

DA ALGA MARRON Sargassum filipendula QUE INDUZ APOPTOSE

EM CÉLULAS HeLa.

Tese apresentada ao

Departamento de Bioquímica da

Universidade Federal do Rio Grande do

Norte como requisito parcial para

obtenção do título de Doutor em

Bioquímica.

Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.

NATAL 2012

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A minha esposa Janielle, obrigado por tudo, você entrou em minha vida para me fazer um homem realizado. Ter você ao meu lado me dá forças para conquistar sonhos impossíveis. Como eu sempre digo, agradeço a

Deus por me dar a missão de lhe fazer feliz. Eu te amo eternamente. Ao meu filho Lucas, que me ensinou o que é amar incondicionalmente. Cada sorriso seu enche o meu coração de alegria e orgulho. Eu te amo muito, e sempre estarei por perto para estender o braço nos momentos em que

você mais precisar.

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Aos meus pais, Zonilio e Teresa, por todo amor a mim dedicado. Essa conquista começou a ser construída há muitos anos atrás, ainda quando estava dando os meus primeiros passos, e vocês, com todos os ensinamentos

sobre a vida, me transformaram nessa pessoa que hoje sou. Se eu conseguir repassar uma pequena parte desses ensinamentos ao meu filho, tenho a certeza que serei um grande pai. Amo vocês.

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Ao grande amigo/professor/orientador Hugo, que sempre me guiou durante toda a vida acadêmica. Em 2012

completa-se nove anos de convivência, e durante todo esse tempo pude contar com a sua amizade, cumplicidade, paciência e confiança. Dizem que nossa maneira de agir e pensar são semelhantes, não é para

menos, eu procurei sempre aprender cada ensinamento seu, e hoje procuro colocá-los em prática. Obrigado por todos esses anos de ensinamentos, que transformam essa tese em algo maior do que um título acadêmico.

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Ao grande Deus que sempre esteve presente em todos os momentos de minha vida.

À minha esposa Janielle, meu eterno amor, minha amiga e companheira. Eu te amei desde a primeira vez que

a vi, e pode ter certeza que amarei cada vez mais, em toda nossa vida.

Ao meu filho Lucas, que Deus continue lhe abençoando, e lhe dê muita saúde e sabedoria para superar todos

os obstáculos que a vida nos apresenta. Sempre que precisar estarei ao seu lado. Papai te ama muito.

Aos meus pais, por sempre estarem presentes e compartilharem comigo todos os momentos, especialmente os

mais difíceis. Vocês são meus espelhos para a vida.

Ao meu irmão, minha cunhada Carla e meus sobrinhos Cauã e Enzo. Apesar de distantes, sei que estão torcendo e vibrando muito com cada conquista minha. Amo todos vocês, em especial o meu irmão, um

exemplo de pessoa que eu, como irmão mais novo, sempre fiz questão de seguir.

A toda família Freire, em especial à tia Ana e ao Freire, obrigado pelo carinho e principalmente por ter

trazido ao mundo o meu grande amor.

As grandes amizades que construí ao longo da vida, em especial à Jean (Zacarias), Wallace e Ério.

Aos amigos da velha guarda do laboratório, que foram responsáveis pelos meus primeiros e talvez os mais

importantes conhecimentos científicos: Ivan, Cybelle e Eduardo (Duda).

A banca de qualificação do doutorado: Carlos Eduardo (Cadu), Naisandra e Eduardo (Duda), a

contribuição de vocês foi fundamental na conclusão deste documento.

À toda família Biopol: Sara e Mariana (grandes e velhas amigas, que apesar de toda chatice, eu guardo um

carinho muito especial pelas duas), Diego (vulgo Popó, que tem o coração compatível com o tamanho),

Nednaldo (outro velho amigo de laboratório, torço muito pelo seu sucesso), Rafael (e aí? Um grande amigo

que fiz, e esta amizade levo para a vida), Ruth (a minha engenheira, depois da convivência com você, sei que

tenho um lugar garantido no céu), Leonardo (A covinha mais linda de Natal e uma das pessoas mais

divertida que conheci), Cinthia (agora faz parte da familia), Dayanne (Sempre passou a limpo o protocolo de

Nednaldo) Raniere (você me ensinou a ser mais sutil com as pessoas), Gabriel (uma grande pessoa, a qual

tive o prazer em co-orientar, um pouco mais de juízo e você vai longe) Arthur (o único defeito é o time que

torce), Jailma (você é super especial, é o anjo que Hugo trouxe para nos acompanhar e encher os nossos dias

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de paz e alegria). As nutricionistas Joana e Letícia (Coincidência ou não, depois que vocês chegaram todo

mundo engordou), Karol (apesar de ter me excluído do Biopol em sua monografia, eu a incluo nesta família

em minha tese), e a todos os integrantes mais novos do laboratório.

Aos vários amigos de departamento, por todos os momentos compartilhados nos corredores da Bioquímica.

Aos professores do Departamento de Bioquímica pelos conhecimentos passados e por sempre depositarem

enorme confiança em meu trabalho.

A professora Edda, que me recebeu como uma mãe e me ensinou muita coisa valiosa. A senhora faz parte

desta conquista.

À CAPES e CNPq, pelo financiamento que permitiu a conclusão deste trabalho.

Ao meu pai científico Hugo, obrigado pela confiança em mim depositada, e por todos os ensinamentos, a

minha gratidão e carinho são inestimáveis.

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RESUMO O litoral do Rio Grande do Norte apresenta mais de 100 espécies de macroalgas marinhas, a maioria delas ainda não explorada quanto ao seu potencial farmacológico. Os polissacarídeos sulfatados (PS) são de longe os compostos de macroalgas marinhas mais estudados, sendo atribuída a estes uma gama de propriedades biológicas, como: atividade anticoagulante, antiinflamatória, antitumoral e antioxidante. Neste trabalho, obteve-se extratos ricos em polissacarídeos de onze algas do litoral do Rio Grande do Norte (Dictyota cervicornis; Dictiopterys delicatula; Dictyota menstruallis; Dictyota mertensis; Sargassum filipendula; Spatoglossum schröederi; Gracilaria caudata; Caulerpa cupresoides; Caulerpa prolifera; Caulerpa sertularioides e Codium isthmocladum), e estas foram avaliadas quanto ao seu potencial anticoagulante, antioxidante e antiproliferativo frente à linhagem celular tumoral HeLa. Todos os extratos polissacarídicos apresentaram atividades anticoagulante, antioxidante e/ou antiproliferativa, com destaque para os das algas D. delicatula e S. filipendula, que apresentaram os maiores índices de potencial farmacológico, sendo, portanto, escolhidas para serem submetidos a passos posteriores de purificação de seus polissacarídeos sulfatados. Através do fracionamento com volumes crescentes de acetona foram obtidas seis frações ricas em polissacarídeos sulfatados da alga D. delicatula (DD-0,5v, DD-0,7v, DD-1,0v, DD-1,3v, DD-1,5v e DD-2,0v) e cinco frações da alga S. filipendula (SF-0,5v, SF-0,7v, SF-1,0v, SF-1,5v e SF-2,0v). Análises físico-químicas mostraram que estas são ricas em heterofucanas sulfatadas. Apenas as frações da alga D. delicatula apresentaram atividade anticoagulante, com destaque para DD-1,5v que apresentou a atividade mais proeminente com razão de APTT semelhante à clexane®, fármaco anticoagulante comercial. Quando avaliadas com relação ao potencial antioxidante todas as frações apresentaram atividade em todos os testes realizados (Capacidade antioxidante total, sequestro de radicais superóxido e hidroxila, quelação férrica e atividade redutora), entretanto, a capacidade de quelação de íons ferro aparece como o principal mecanismo antioxidante dos polissacarídeos sulfatados dessas macroalgas marinhas. No ensaio antiproliferativo, todas as heterofucanas apresentaram atividades dose-dependente para a inibição da proliferação celular de HeLa, entretanto, as frações SF-0,7v, SF-1,0v e SF-1,5v apresentaram atividade específica para esta linhagem celular, não inibindo a proliferação da linhagem celular normal MC3T3, sendo a heterofucana SF-1,5v escolhida para ter seu mecanismo de ação antiproliferativo determinado. SF-1,5v induz a apoptose em células HeLa principalmente através de uma via independente da ativação das caspases, promovendo a liberação do Fator Indutor da Apoptose (AIF) no citosol, que por sua vez induz a condensação da cromatina e fragmentação do DNA em fragmentos de 50Kb. Este trabalho é o primeiro relato mostrando uma heterofucana cujo principal mecanismo antiproliferativo é a liberação de AIF mitocondrial para o citosol, o que torna SF-1,5v um promissor fármaco na terapia antitumoral, possibilitando uma alternativa aos quimioterápicos tradicionais. Palavras-chave: Atividade antiproliferativa, atividade anticoagulante, atividade antioxidante, fator indutor de apoptose.

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ABSTRACT The coast of Rio Grande do Norte has more than 100 species of seaweed, mostly unexplored regarding their pharmacological potential. The sulfated polysaccharides (PS) are by far the more seaweed compounds studied, these present a range of biological properties, such as anticoagulant activity, anti-inflammatory, antitumor and antioxidant properties. In this study, we extract sulfated polysaccharide rich-extracts of eleven algae from the coast of Rio Grande do Norte (Dictyota cervicornis; Dictiopterys delicatula; Dictyota menstruallis; Dictyota mertensis; Sargassum filipendula; Spatoglossum schröederi; Gracilaria caudata; Caulerpa cupresoides; Caulerpa prolifera; Caulerpa sertularioides e Codim isthmocladum), and these were evaluated for the potential anticoagulant, antioxidant and antiproliferative. All polysaccharide extracts showed activity for anticoagulant, antioxidant and/or antiproliferative activity, especially D. delicatula and S. filipendula, which showed the most prominent pharmacological potential, thereby being chosen to have their sulfated polysaccharides extracted. By fractionating method were obtained six fractions rich in sulfated polysaccharides to the algae D. delicatula (DD-0,5V, DD-0, 7V, DD-1,0v, DD-1,3v, DD-1,5v and DD-2,0) and five fractions to the alga S. filipendula (SF-0,5V, SF-0,7V, SF-1,0v, SF-1,5v and SF-2,0v). For the anticoagulant assay only the fractions of D. delicatula showed activity, with emphasis on DD-1, 5v that presented the most prominent activity, with APTT ratio similar to clexane® at 0.1 mg/mL. When evaluated the antioxidant potential, all fractions showed potential in all tests (total antioxidant capacity, hydroxyl and superoxide radicals scavenging, ferrous chelation and reducing power), however, the ability to chelate iron ions appears as the main mechanism antioxidant of sulfated polysaccharides from seaweed. In antiproliferative assay, all heterofucanas showed dose-dependent activity for the inhibition of cell proliferation of HeLa, however, with the exception of SF-0,7V, SF-1,0v and SF-1,5v, all fractions showed antiproliferative activity against MC3T3, a normal cell line. The heterofucana SF-1,5V had its antiproliferative mechanism of action evaluated. This heterofucan induces apoptosis in HeLa cells by a pathway caspase independent, promoting the release of apoptosis Inducing Factor (AIF) in the cytosol, which in turn induces chromatin condensation and DNA fragmentation into 50Kb fragments. These results are significant in that they provide a mechanistic framework for further exploring the use of SF-1.5v as a novel chemotherapeutics against human cervical cancer. Keywords: antiproliferative activity, anticoagulant activity, antioxidant activity, apoptosis inductor factor.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Modelo clássico da cascata de coagulação. .............................................. 27

Figura 2. Representação esquemática dos complexos procoagulantes. .................. 28

Figura 3. Mecanismos de ação anticoagulate dos polissacarideos sulfatados de algas marinhas. ......................................................................................................... 31

Figura 4. Via extrínseca da apoptose ........................................................................ 35

Figura 5. Via intrínseca da apoptose. ........................................................................ 36

Figura 6. Metodologia de extração e caracterização físico-química e farmacológica dos extratos polissacarídicos e das frações polissacarídicas das algas D. delicatula e S. filipendula. ............................................................................................................. 46

Figura 7. Rendimento dos extratos polissacarídicos extraídos das algas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte ................................................................................... 56

Figura 8. Perfil eletroforético dos extratos polissacarídicos obtidos das algas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte .............................................................. 57

Figura 9. Capacidade antioxidante total dos extratos polissacarídicos ..................... 60

Figura 10. Atividade de Quelação férrica dos extratos polissacarídicos.................... 63

Figura 11. Atividade redutora equivalente de extratos polissacarídicos .................... 65

Figura 12. Atividade antiproliferativa dos extratos polissacarídicos frente a linhagem cellular HeLa após 72h de incubação ....................................................................... 66

Figura 13. Rendimento percentual dos polissacarídeos sulfatados obtidos por precipitação com acetona, da alga marinha D. delicatula. ........................................ 68

Figura 14. Perfil eletroforético dos polissacarídeos sulfatados de D. delicatula ........ 70

Figura 15. Atividade anticoagulante das heterofucanas de D. delicatula .................. 71

Figura 16. Capacidade antioxidante total de heterofucanas extraídas da alga D. delicatula. .................................................................................................................. 72

Figura 17. Atividade de Quelação férrica de heterofucanas da alga D. delicatula .... 74

Figura 18. Atividade redutora equivalente de heterofucanas da alga D. delicatula. .. 75

Figura 19. Atividade antiproliferativa de heterofucanas da alga D. delicatula. .......... 77

Figura 20. Rendimento percentual dos polissacarídeos sulfatados obtidos por precipitação com acetona, da alga marinha D. delicatula. ........................................ 78

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Figura 21. Perfil eletroforético dos polissacarídeos sulfatados de S. filipendula ....... 80

Figura 22. Capacidade antioxidante total de heterofucanas extraídas da alga S. filipendula. ................................................................................................................. 82

Figura 23. Atividade de Quelação férrica de heterofucanas da alga S. filipendula. ... 84

Figura 24. Atividade redutora equivalente de heterofucanas da alga S. filipendula .. 85

Figura 25. Atividade antiproliferativa das heterofucanas da alga Sargassum filipendula. ................................................................................................................. 87

Figura 26. Proliferação celular de células HeLa incubadas com SF-1,5v.................. 88

Figura 27. Heterofucana SF-1,5v induz apoptose de células HeLa .......................... 89

Figura 28. Apoptose de células hela induzida pelo polissacarídeo sulfatado SF-1,5v não requer ativação de caspases. ............................................................................. 90

Figura 29. Análise da sinalização intracelular da heterofucana SF-1,5v por western blot ............................................................................................................................ 91

Figura 30. Ativação de GSK não é essencial para apoptose induzida pela heterofucana SF-1.5v. ............................................................................................... 92

Figura 31. Análise da expressão de AIF, Bax and Bcl-2 na presença de SF-1.5v .... 93

Figura 32. Mecanismo de ação antiproliferativo de SF-1,5v frente a linhagem celular tumoral HeLa. .......................................................................................................... 112

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LISTA DE TABELAS

Tabela I. Principais características das macroalgas .................................................. 18

Tabela II. Algumas das atividades farmacológicas atribuídas as fucanas. ................ 21

Tabela III. Atividades farmacológicas atribuídas aos polissacarídeos sulfatados de algas verdes .............................................................................................................. 23

Tabela IV. Local de coletas das macroalgas marinhas ............................................ 42

Tabela V. Composição química dos extratos polissacarídicos. ................................. 58

Tabela VI. Atividade anticoagulante dos extratos polissacarídicos. .......................... 59

Tabela VII. Sequestro de radicais superóxido e hidroxila pelos extratos polissacarídicos. ........................................................................................................ 61

Tabela VIII. Índice de potencial farmacológico dos polissacarídeos extraídos das macroalgas marinhas coletadas no litoral do Rio Grande do Norte. ........................ 67

Tabela IX. Composição química de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga Dictyopteris delicatula................................................................................................ 69

Tabela X. Sequestro de radicais hidroxila e superóxido de heterofucanas da alga Dictyopteris delicatula................................................................................................ 73

Tabela XI. Composição química dos polissacarídeos sulfatados extraídos da alga Sargassum filipendula. .............................................................................................. 79

Tabela XII. Tempo de coagulação das frações polissacarídicas da alga S. filipendula .................................................................................................................................. 81

Tabela XIII. Atividade sequestradora de radicais superóxido e hidroxila dos polissacarídeos sulfatados extraídos da alga Sargassum filipendula. ....................... 83

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LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS

ÁC. GLU Ácido glucurônico

AIF Fator indutor de apoptose

AKt Proteina quinase B

aPTT Tempo de tromboplastina parcial ativada

AT Antitrombina

CAT Capacidade antioxidante total

DD-0,5v Fração precipitada da alga D. delicatula com 0,5 volumes de acetona






DPPH 2,2-difenil-1-picrilidrazil

EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético

ERK Quinase regulada por sinais extracelulares

FITC Fitocromo C

FUC Fucose

GAL Galactose

GLI Glicose

GSK-3β Glicogênio sintase quinase 3

HCII Cofator II da heparina

HEP Heparina não-fracionada

IC50 Concentração requerida para inibir 50% de uma atividade farmacológica

MAN Manose

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MAPK Proteína quinase ativada por mitógenos

MTT 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-y1)2,5-difenil tetrazolio brometo)

NBT Azul de tetrazolium

NF-kB Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

PT Tempo de Tromboplastina

RAF Rafinose

RPM Rotações por minuto

SF-0,5v Fração precipitada da alga S. filipendula com 0,5 volumes de acetona


SF-1,0v Fração precipitada da alga S. filipendula com 1,0 volume de acetona



TCA Ácido Tricloroacético

TT Tempo de trombina

v/v Volume/Volume

XIL Xilose

Z-VAD (carbobenzóxi-valil-alanil-aspartil-[O-metil]-fluorometilcetona)

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SUMÁRIO

1 – INTRODUÇÃO ................................................................................................. 18

1.2- Polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas...................................... 19

1.2.1- POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONS. ................ 20

1.2.2- POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS VERDES ..................... 22

1.2.3- POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS VERMELHAS .............. 24

1.3- Atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas. ................................................................................................................ 25

1.3.1. DOENÇAS CARDIOVASCULARES E CASCATA DA COAGULAÇÃO. ... 25

1.3.2. POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE MACROALGAS MARINHAS COM ATIVIDADE ANTICOAGULANTE .............................................................. 28

1.4- Atividade antioxidante de polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas. ............................................................................................................................... 31

1.5- Atividade antiproliferativa de polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas. ................................................................................................................ 33

1.5.1. MORTE CELULAR PROGRAMADA (APOPTOSE) dependente de caspases. ............................................................................................................ 33

1.5.3. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE MACROALGAS MARINHAS................................................. 38

2 – OBJETIVOS ........................................................................................................ 41

2.1- Objetivos gerais............................................................................................... 41

2.1- Objetivos específicos ...................................................................................... 41

3 – MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 42

3.1. Material biológico............................................................................................. 42

3.2. Outros materiais .............................................................................................. 43

3.2.1 – KITS E REAGENTES .............................................................................. 43

3.2.2 – PADRÕES ............................................................................................... 44

3.2.3 – APARELHOS ........................................................................................... 44

3.2.4 – PLASMA HUMANO ................................................................................. 45

3.2.5. CÉLULAS .................................................................................................. 45

3.3 – Obtenção dos polissacarídeos sulfatados ..................................................... 45

3.3.1- OBTENÇÃO DO “PÓ CETÔNICO” ........................................................... 47

3.3.2 – Obtenção do extrato polissacarídico (proteólise)..................................... 47

3.3.2 – Fracionamento com concentrações crescentes de acetona .................... 47

3.5 – Análises químicas.......................................................................................... 49

3.5.1 – DOSAGEM DE AÇÚCARES TOTAIS ..................................................... 49

3.5.2 – DOSAGEM DE SULFATO ....................................................................... 49

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3.5.3 – DOSAGEM DE PROTEÍNAS ................................................................... 49

3.5.4 – DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA ................ 49

3.6 – Atividade anticoagulante ............................................................................... 50

3.7. Atividade antioxidante ..................................................................................... 50

3.7.1. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL ........................................................ 50

3.7.2. SEQUESTRO DE RADICAIS HIDROXILAS .............................................. 51

3.7.3. SEQUESTRO DE RADICAIS SUPERÓXIDO ........................................... 51

3.7.4. QUELAÇÃO FÉRRICA .............................................................................. 51

3.7.5. PODER REDUTOR ................................................................................... 52

3.8. Atividade antiproliferativa ................................................................................ 52

3.9. Seleção das algas para extração dos polissacarídeos sulfatados .................. 52

3.10. Determinação dos mecanismos de ação antiproliferativo de SF-1,5v ........... 53

3.10.1. MARCAÇÃO COM ANEXINA V-FITC .................................................... 53

3.10.2. WESTERN BLOTTING ............................................................................ 53

3.10.3. DETERMINAÇÃO DA ATIVAÇÃO DE GSK ............................................ 54

3.11. Análise estatística.......................................................................................... 54

4 – RESULTADOS .................................................................................................... 55

4.1. Prospecção de polissacarídeos sulfatados bioativos extraídos de macroalgas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte ........................................................... 55

4.1.1. EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DAS MACROALGAS MARINHAS DO LITORAL DO RIO GRANDE DO NORTE ....... 55

4.1.2. ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS ......................................................................................... 56

4.1.3. COMPOSIÇÃO QUÍMICA DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS ........ 57

4.1.4. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS ............................................................................................................................ 58

4.1.5. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS ... 59

4.1.6. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS. ........................................................................................ 66

4.1.7. SELEÇÃO DAS ALGAS PARA EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS..................................................................................................... 67

4.2. Caracterização química e atividades biológicas de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marrom D. delicatula. ................................................................. 68

4.2.1. EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA D. delicatula. .............................................................. 68

4.2.2. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA D. delicatula. .............................................................. 69

4.2.3. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA D. delicatula. .............................................................. 71

17

4.2.4. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA D. delicatula. ....................................................................................... 72

4.2.5. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA D. delicatula. .............................................................. 76

4.3. Caracterização química e atividades biológicas de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marrom S. filipendula. ................................................................ 78

4.3.1. EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA S. filipendula. .............................................................. 78

4.3.2. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA S. filipendula. .............................................................. 79

4.3.3. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA S. filipendula. .............................................................. 81

4.3.4. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA S. filipendula. ...................................................................................... 82

4.3.5. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA ALGA S. filipendula. .............................................................. 86

4.4. Mecanismo de ação antiproliferativo da heterofucana SF-1,5v ....................... 88

4.4.1. SF-1,5v INDUZ APOPTOSE EM CÉLULAS HELA. .................................. 88

4.4.2.INDUÇÃO DA APOPTOSE PELA HETEROFUCANA SF-1,5v EM CELULAS HeLa É INDEPENDENTE DA ATIVAÇÃO DE CASPASES. .............. 89

4.4.3.DETERMINAÇÃO DO PAPEL DE GSK NA INDUÇÃO DA APOPTOSE POR SF-1,5v. ...................................................................................................... 91

4.4.4. SF-1,5v INDUZ A LIBERAÇÃO DE NÍVEIS ELEVADOS DE FATOR INDUTOR DE APOPTOSE (AIF) NO CITOPLASMA. ......................................... 92

5 – DISCUSSÃO ....................................................................................................... 94

5.1. Bioprospecção de polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas marinhas. ................................................................................................................ 94

5.2. Extração e caracterização de polissacarídeos sulfatados da alga D. delicatula e S. filipendula. ..................................................................................................... 101

5.3. Determinação do mecanismo de ação antiproliferativo de SF-1,5v frente à linhagem celular tumoral HeLa. ............................................................................ 108

6 – CONCLUSÕES ................................................................................................. 114

7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 115

8 - APÊNDICES ...................................................................................................... 133

INTRODUÇÃO

Costa, L. S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN

18

1 – INTRODUÇÃO

1.1 – Macroalgas marinhas

As macroalgas marinhas são organismos fotossintéticos aquáticos, que apesar

de não formarem uma categoria taxonômica monofilética (não apresentam um

ancestral comum) são agrupadas segundo uma característica única: a ausência de

tecido constituído por células estéreis que envolvam os órgãos de reprodução.

(OLIVEIRA FILHO & BERCHEZ, 1978; BICUDO et al. 1998).

Segundo a classificação adotada por Raven et al (2001), as macroalgas

marinhas podem ser divididas de acordo com a presença de pigmentos acessórios à

clorofila a, o principal pigmento fotossintético (Tabela I). As três divisões de algas,

inteira ou parcialmente multicelulares compreendem as algas vermelhas (divisão

Rhodophyta), as algas pardas (divisão Phaeophyta) e as algas verdes (divisão

Chlorophyta).

Tabela I. Principais características das macroalgas

As macroalgas marinhas apresentam um alto valor nutritivo, sendo ricas em

carotenóides, proteínas, fibras dietéticas, ácidos graxos essenciais, vitaminas e

minerais. Existem relatos que as algas já eram utilizadas como fonte alimentícia há

pelo menos dez mil anos no Japão. Nos países asiáticos, as macroalgas marinhas

Ordem Tipo de

clorofila Outros pigmentos

Substâncias

de reservas

Constituição

da parede

celular

Chlorophyta a, b Carotenos Amido Celulose,

pectinas

Phaeophyta a, c Luteina e fucoxantina Laminarina e

manitol

Celulose,

alginato

Rhodophyta a, d

Carotenos, xantofilas,

ficocianina e

ficoeritrina

Amido das

florideas

Celulose,

pectinas

Fonte: Adaptado de Raven et al., 2001

INTRODUÇÃO


19

chegam a constituir cerca de 25% da dieta humana, sendo encontradas em

alimentos como o sushi, sopas, biscoitos, aperitivos e saladas (MCHUGH, 2003).

Além de sua utilização como fonte de alimentos, as macroalgas marinhas são

fontes de um amplo espectro de compostos de interesse comercial e são utilizadas

nas indústrias alimentícias, farmacêuticas, de cosméticos, e na agricultura. Dentre

esses compostos podemos destacar os alginatos, que são polímeros constituídos de

monossacarídeos ácidos (ácido gulurônico e ácido manurônico), de caráter viscoso,

produzidos por certas espécies de algas pardas. Eles são utilizados na fabricação de

papel e como estabilizadores de creme dental e sorvete (KOBAYASHI, 1986,

MINHAS et al., 2002); agar e carragenanas, que são polissacarídeos sulfatados ricos

em galactose, encontradas em algumas espécies de algas vermelhas e usadas em

diversas finalidades como na fabricação de cosméticos, gelatina e meios de cultura

(TRIUS & SEBRANEK, 1996, RASMUSSEN & MORRISSEY, 2007).

As macroalgas marinhas ainda produzem outros metabólitos com potencial

econômico importante como ácidos graxos, esteróides, carotenóides, lectinas,

aminoácidos tipo-micosporinas, compostos halogenados, policetídeos, toxinas, e

principalmente outros polissacarídeos sulfatados, que fazem destes organismos foco

das mais diversas pesquisas biomédicas ((ROCHA et al., 2005b, ROCHA et al.,

2006, MANDAL et al., 2008, LUO et al., 2009, MAKARENKOVA et al., 2009, POMIN,

2009, CIANCIA et al., 2010, JIN et al., 2010, KIM et al., 2010a, CAMARA et al., 2011,

CARDOZO et al., 2011, COURA et al., 2011, ERMAKOVA et al., 2011, JIAO et al.,

2011, VISHCHUK et al., 2011, YANG et al., 2011)CARDOZO et al., 2007;

O’SULLIVAN et al., 2010)

1.2- Polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas

Dentre os diferentes compostos bioativos extraídos das algas, destacam-se

os polissacarídeos sulfatados. Eles se localizam na matriz mucilagenosa das algas e

sua função biológica parece estar relacionada com a proteção contra desidratação

solar em períodos de baixa maré, além de oferecer uma maior flexibilidade à alga,

permitindo assim, o seu crescimento em ambiente aquático, e uma rigidez suficiente

para permanecer estendida e assim captar a luz e os nutrientes com mais eficácia

(MICHEL et al., 2010)

INTRODUÇÃO


20

Pesquisas realizadas com polissacarídeos sulfatados de algas têm

demonstrado que tanto a composição quanto a estrutura desses compostos variam

de espécies para espécies e, às vezes, em diferentes partes do mesmo espécime

(FARIAS, 1992; DIETRICH et al., 1995; ALVES, 2000; HAROUN-BOUHEDJA et al.,

2000). A complexidade na estrutura desses compostos é devido às muitas

possibilidades de ligações entre os monossacarídeos e a distribuição de

grupamentos sulfato. Portanto, cada polissacarídeo pode possuir conformação

estrutural única, e, conseqüentemente apresentar atividades farmacológicas

diferentes e/ou mais potentes de que outros polissacarídeos ou outros compostos já

descritos (ROCHA et al., 2005b, CIANCIA et al., 2010, ERMAKOVA et al., 2011,

JIAO et al., 2011).

1.2.1- POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS MARRONS

As Phaeophyceas possuem na sua constituição apenas um único grupo de

polissacarídeos sulfatados: As fucanas (QUILLET, 1961). Esses polímeros têm como

característica principal à presença da L-fucose sulfatada na sua estrutura (LEITE et

al., 1998b, ALMEIDA-LIMA et al., 2010).

A nomenclatura dos polissacarídeos sulfatados de algas marrons ainda é

controversa, entretanto a definição da IUPAC é a mais utilizada. Para os

polissacarídeos de algas marrons que apresentam em sua constituição mais de 90%

de L-fucose é recomendado o uso do termo fucana, enquanto que para aqueles com

menos de 90% de fucose utiliza-se a denominação fucoidan (BERTEAU & MULLOY,

2003). Porém, é comum a utilização de outros critérios na nomenclatura destes

polissacarídeos. Utilizando a constituição monossacarídica como principal critério de

classificação, Medeiros (2008) organizou as fucanas em quatro grupos de

polissacarídeos: Fucoidan, polímeros constituídos totalmente ou quase totalmente

por fucose; xilofucoglucuronanas, que possuem uma estrutura central formada por

um poliglucoronideo, a qual esta ligada cadeias laterais formadas por açúcares

neutros (LEITE et al., 1998a); glucuronogalactofucanas ou glucuronofucogalactanas

(GRAUFFEL et al., 1989); e galactofucanas (ROCHA et al., 2005a). O grupo de

pesquisa no qual este trabalho está inserido utiliza preferencialmente a classificação

da IUPAC para definição destes polímeros (ALBUQUERQUE et al., 2004,

INTRODUÇÃO


21

BARROSO et al., 2008, ALMEIDA-LIMA et al., 2010), o que torna conveniente a

adoção desta classificação no decorrer do trabalho.

As fucanas vêm sendo descritas como possuidores das mais diversas

atividades farmacológicas, resumidas na Tabela II.

Tabela II. Algumas das atividades farmacológicas atribuídas as fucanas.

Atividade Alga Referências

Angiogênica Fucus vesiculosus, Sargassum stenophyllum

(SOEDA et al., 2000, DIAS et al., 2005, MATSUBARA et al., 2005)

Anti complemento Laminaria cichorioide, L. japonica, Fucus evanescens Ascophyllum nodosum

(BLONDIN et al., 1994, ZVYAGINTSEVA et al., 2000, BOISSON-VIDAL et al., 2007)

Anti migratória F. vesiculosus, A. nodosum. (GIRAUX et al., 1998, SOEDA et al., 2000)

Antiadesiva A. nodosum, Laminaria brasiliensis, Spatoglossum schröederi, S. stenophyllum

(LIU et al., 2000, ROCHA et al., 2001)

Anticoagulante

Saccharina latíssima, Lessonia vadosa, Dictyota menstruallis, L. cichorioides, Padyna gymnospora

(ALBUQUERQUE et al., 2004, SILVA et al., 2005, CUMASHI et al., 2007, YOON et al., 2007, CHANDIA & MATSUHIRO, 2008, CROCI et al., 2011)

Antiinflamatória

Lobophora variegata, Sargassum hemiphyllum, F. vesiculosus

(HWANG et al., 2011, PAIVA et al., 2011, PARK et al., 2011)

Antilipidêmica

F. vesiculosus (YOKOTA et al., 2009)

Antioxidante

L. japônica, Sargassum palidum, Undaria pinnatifida

(WANG et al., 2008, YE et al., 2008, HU et al., 2010, JIAO et al., 2011)

Antiproliferativa

A. nodosum, Laminaria setchellii, Macrocystis integrifolia, Nereocystis leutkeana, Ecklonia cava

(ELLOUALI et al., 1993, ELLOUALI et al., 1994, ATHUKORALA et al., 2006, YUAN & WALSH, 2006, ALMEIDA-LIMA et al., 2010)

Antitrombótico A. nodosum, S. schröederi (MAURAY et al., 1998, ROCHA et al., 2005c,

INTRODUÇÃO


22

BARROSO et al., 2008, JIAO et al., 2011)

Antitumoral U. Saccharina japônica, Sargassum hornery, E. cava

(CROCI et al., 2011, ERMAKOVA et al., 2011, VISHCHUK et al., 2011)

Anti-úlcera C. okamuranus (NAGAOKA et al., 2000, SHIBATA et al., 2000, SHIBATA et al., 2001)

Antiviral S. horneri, C. indica

(HOSHINO et al., 1998, MANDAL et al., 2007, HAYASHI, 2008, CARDOZO et al., 2011, JIAO et al., 2011)

Bloqueio de ligação espermatozoide-epitélio do oviduto

F. vesiculosus (SUAREZ et al., 1998)

Estímulo de síntese de heparan antitrombótico

S. schröederi (ROCHA et al., 2005a, BARROSO et al., 2008)

Fibrinolítica

E. kurome, F. vesiculosus (DOCTOR et al., 1995, NISHINO et al., 2000)

Hepato-protetora

F. vesiculosus, C. okamuramus

(NAKAZATO et al., 2010, HONG et al., 2011)

Adaptado de ROCHA et al., 2006

1.2.2- POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS VERDES

Os polissacarídeos sulfatados de algas verdes são de longe os menos

estudados quanto as suas atividades biológicas, entretanto, o número de

polissacarídeos que tiveram sua caracterização estrutural definida vem crescendo

consideravelmente nos últimos anos, principalmente para os polissacarídeos

sulfatados das algas dos gêneros Codium (CIANCIA et al., 2007, FARIAS et al.,

2008, ESTEVEZ et al., 2009, OHTA et al., 2009, LEE et al., 2010, SABRY, 2010).

Os trabalhos de elucidação estrutural dos polissacarídeos sulfatados das espécies

do gênero Codium têm mostrado uma grande quantidade de polissacarídeos

compostos de galactose em sua parede celular, juntamente com outros

heteropolissacarídeos (FARIAS, 2006, BILAN et al., 2007, FARIAS et al., 2008,

ESTEVEZ et al., 2009).

Além das galactanas, comumente encontradas nas espécies do gênero

Codium (FARIAS et al, 2008; BILAN et al, 2007), uma variedade de outros

polissacarídeos são sintetizados pelas algas verdes. Já foram descritas arabinanas

INTRODUÇÃO


23

(SIDDHANTA et al., 1999, HAYAKAWA et al., 2000), uma heteroglicomanana da

alga Enteromorpha compressa (RAY, 2006), uma ramnana da alga Monostroma

nitidum (KARNJANAPRATUM & YOU, 2011), bem como diversos outros

polissacarídeos heterogêneos ricos em galactose, manose, xilose, arabinose e/ou

ácidos urônicos (CIANCIA et al., 2010).

Estes dados permitem inferir que os polissacarídeos sulfatados sintetizados

pelas algas verdes apresentam uma maior heterogeneneicidade do que aqueles

encontrados nas outras algas, dificultando o entendimento da relação do

polissacarídeo com sua atividade farmacológica.

A importância farmacológica destes polissacarídeos sulfatados de algas

verdes foi evidenciada ao se verificar uma gama de atividades farmacológicas

(Tabela III). Entretanto, o número de trabalhos realizados com estes polissacarídeos

ainda é pequeno quando comparado com as fucanas. Ultimamente, vários trabalhos

têm relatado a estrutura molecular de polissacarídeos de algas verdes, o que poderá

facilitar a elucidação dos mecanismos de ação destes compostos, bem como a

relação atividade/estrutura (BILAN et al., 2007, LAHAYE & ROBIC, 2007, FARIAS et

al., 2008, CIANCIA et al., 2010).

Tabela III. Atividades farmacológicas atribuídas aos polissacarídeos sulfatados de algas verdes

Atividade Alga Referências

Anticoagulante Codium fragile; C. vermilara

C. isthmocladum (FARIAS, 2006, CIANCIA

et al., 2007)

Antiviral Caulerpa recemosa; Ulva

lactuta; Codium latum

(GHOSH et al., 2004, LEE et al., 2004, OHTA

et al., 2009)

Antitumoral Ulva lactuta (KAEFFER et al., 1999)

hiperlipidemica. Ulva pertusa (PENGZHAN et al., 2003)

Anti-angiogênica Codium cillindricum (MATSUBARA et al.,

2003)

Anti-hepatotóxica Ulva reticulata (RAO et al., 2004)

Imuno-estimulatória

C. fragile (LEE et al., 2010)

INTRODUÇÃO


24

1.2.3- POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE ALGAS VERMELHAS

As algas vermelhas apresentam as galactanas sulfatadas como grupo

polissacarídico característico (Souza et al., 2007). No entanto, relatos de uma

xilomanana sulfatada extraída da alga Scinaia hatei (MANDAL et al., 2008) e um

heteropolissacarídeo extraído da alga Gloiopeltis tenax contendo alguns resíduos de

fucose sulfatados (LIM & RYU, 2009) foram recentemente descritos.

Galactanas de algas vermelhas são polissacarídeos ramificadas com

unidades alternantes de (1�3)-�-D-galactopiranose (Unidade A) e (1�4)-3,6-

anidrogalactopiranose ou α-galactopiranose (Unidade B), apresentando diferentes

graus e posições de sulfatação. De acordo com a estereoquímica da unidade B, as

galactanas podem ser classificadas como: agaranas, quando esta unidade pertence

à série L (MARINHO-SORIANO & BOURRET, 2005); e carragenanas quando

pertence à série D (NAIK et al., 1980, ESTEVEZ et al., 2004).

Existem vários relatos na literatura sobre atividades farmacológicas/biológicas

atribuídas aos polissacarídeos sulfatados de algas vermelhas (SILVA et al, 2009).

Uma das mais estudadas é a antivíral. Xilomananas e derivados purificados da alga

Sebdenia polydactyla apresentaram atividade significante contra Herpes Simplex

vírus tipo-1 (HSV-1) (GHOSH et al., 2009). Esta mesma cepa viral foi fortemente

inibida por galactanas de Gigartina skottsbergii e Porphyridium sp. (CARLUCCI et

al., 1999, HUHEIHEL et al., 2002). A atividade anti-HIV também vem sendo relatada

para diversas algas, como por exemplo: Schizymenia pacifica, Eucheuma cottoni

(WITVROUW & DE CLERCQ, 1997) e Nothogenia fastigiata (DAMONTE et al., 1994,

WITVROUW & DE CLERCQ, 1997). Em um estudo mais detalhado foi demonstrado

que a atividade antiviral de galactanas de Chondrus ocellatus estava relacionada

com as suas massas moleculares, aquelas de menor tamanho apresentavam maior

atividade (ZHOU et al., 2004). Contudo, são necessários mais estudos semelhantes

com polissacarídeos de outras algas para que se possa afirmar que a menor massa

molecular é importante para que uma galactana desempenhe essa atividade de

forma considerável.

Recentemente, polissacarídeos sulfatados comerciais extraídos das Outra

atividade biológica atribuída aos polissacarídeos sulfatados de algas vermelhas é a

atividade antiparasitária, especificamente a inibição da proliferação de Plasmodium

sp., causador da malária. Essa atividade foi relatada para três carragenanas com

INTRODUÇÃO


25

diferentes padrões de sulfatação, que inibiram “in vitro” o crescimento de

Plasmodium falciparum, assim como, a adesão dessas a glicoproteína humana

CD36 (ADAMS et al., 2005).

A medicina veterinária também busca nos polissacarídeos sulfatados um

fármaco potencial e entre estes tem-se carragenanas que mostraram entre 89-100%

de atividade inibitória de ligação entre Escherichia coli e fibras de colágeno de

tecidos bovinos (MEDINA, 2001).

Entre outras atividades relacionadas aos polissacarídeos sulfatados de algas

vermelhas temos: Efeito hipolipidêmico, atribuído a porphyran, um polissacarídeo

sulfatado extraído da alga Porphyra haitensis (INOUE et al., 2009); Atividade de

inibição do sistema complemento por uma λ-carragenana de Chondrus armatus

(ZVYAGINTSEVA et al., 2000); atividade anti-inflamatória e antinociceptiva de

galactanas extraídas de Gracilaria córnea (COURA et al., 2011) e atividade

antitumoral (LINS et al., 2009).

1.3- Atividade anticoagulante de polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas.

1.3.1. DOENÇAS CARDIOVASCULARES E CASCATA DA COAGULAÇÃO.

O aumento da incidência de doenças cardiovasculares vem impondo uma

maior demanda por fármacos anticoagulantes, o que leva a um aumento na procura

por novos fármacos. A heparina é o único polissacarídeo sulfatado atualmente

utilizado como anticoagulante, entretanto, ela pode apresentar algumas reações

adversas indesejáveis, como o aparecimento de trombocitopenia em alguns

pacientes, decorrente do seu uso prolongado (Fabris et al., 2000), como também, ela

pode apresentar o risco existente de contaminação viral, uma vez que é obtida de

tecidos animais (NADER et al., 2001, NADER et al., 2004). Outro agravante é o

aparecimento de contaminações em lotes de heparinas comerciais. Recentemente,

um condroitin supersulfatado foi isolado de preparações contaminadas de heparina,

e este tem sido associado a uma gama de efeitos adversos (GUERRINI et al., 2008,

LIMA et al., 2011, RUDD et al., 2011). Ainda, um outro contaminante foi identificado,

TBEP (tris(2-n-butoxietil fosfato), e este está associado a eventos de toxicidade no

sistema nervoso e no fígado, entre outros (SASSAKI et al., 2011). Por outro lado,

INTRODUÇÃO


26

problemas tromboembólicos se apresentam em diferentes condições clinicas que

variam para cada paciente, e a tendência atual do mercado farmacológico é buscar

um fármaco especifico para cada terapia.

O processo de coagulação, alvo da maioria dos fármacos utilizados na terapia

anticoagulante, é um mecanismo fisiológico complexo que envolve diversos

elementos: paredes vasculares, plaquetas e proteínas solúveis nas imediações de

lesões traumáticas (VINE, 2009, RAO & MACKMAN, 2010, BAKER & BRASSARD,

2011).

Em meados dos anos 60, numa tentativa de explicar os mecanismos da

coagulação, Macfarlane, Davie e Ratnoff propuseram uma hipótese que continha a

seqüência de eventos responsáveis pela fisiologia da coagulação (Macfarlane, 1964;

Davie and Ratnoff, 1964). Tal hipótese acabou se tornando um modelo clássico da

coagulação sangüínea. Nele a coagulação ocorre por meio da ativação proteolítica

seqüencial de zimógenos, por proteases presentes no plasma, resultando na

formação da trombina que por sua vez converte a molécula de fibrinogênio em

fibrina. Este modelo (figura 04) divide o mecanismo da coagulação em três vias:

extrínseca (que envolve componentes do próprio sangue e outros que usualmente

não o compõe) e intrínseca (contém somente componentes do próprio sangue) e a

via comum (o ponto de convergência das vias extrínseca e intrínseca que leva a

ativação da fibrina).

A via extrínseca é desencadeada pela formação do complexo Fator Tecidual

(CHARGAFF et al, 1936): Fator VIIa (FVIIa) que ativa o fator X (RAO & MACKMAN,

2010, BAKER & BRASSARD, 2011). O fator tecidual é uma molécula

transmembrana de diversas células localizadas fora dos vasos sanguíneos, e é uma

das principais moléculas responsáveis pela fase inicial da coagulação (MANLY et al.,

2011). FT é exposto na coagulação sanguínea logo após uma injuria vascular, e

possui uma alta afinidade com o FVII que favorece a formação do complexo

(Dahlbäch, 2000).

A via intrínseca envolve somente componentes que estão presentes no meio

intravascular, e é iniciada pela ativação do fator XII (FXII) dado pelo seu contato com

o sangue e/ou qualquer superfície contendo cargas negativas, que desencadeia uma

serie de ativação protéica ativando diretamente o fator X (VINE, 2009).

O ponto de convergência das vias extrínseca e intrínseca é conhecida como

via comum da coagulação, e é caracterizada pela ativação de fibrinogênio à fibrina

INTRODUÇÃO


27

pela trombina, formando uma malha de fibrina que vai ser estabilizada pelo fator

XIIIa. (Franco, 2001). A Figura 1 sumariza a seqüência de ativação proteolítica

existente na cascata de coagulação.

Um novo modelo da cascata de coagulação que envolve complexos pró-

coagulantes de forma semelhantes da que ocorre no modelo clássico foi proposto.

São relacionados três complexos enzimáticos pró-coagulantes que vão culminar na

ativação da trombina: Complexo “tenase” extrínseco (fator tecidual (FT) + VIIa),

complexo “tenase” intrínseco (IXa + VIIIa) e complexo “protrombinase” (Va + Xa).

Nesse modelo o inicio da coagulação se faz mediante ligação do fator VIIa ao fator

tecidual (CHARGAFF et al.), também conhecido como fator III, com subseqüente

ativação dos fatores IX e X. O fator IX ativo irá se associar ao fator VIII, ativá-lo e

juntos formarão o complexo “tenase” intrínseco, esse ativa o fator X com eficiência

ainda maior. O fator Xa forma um complexo com o fator Va (complexo

“protrombinase”) convertendo o fator II (protrombina) em fator IIa (trombina). Esse

mecanismo pode ser visualizado na Figura 02.

Figura 1. Modelo clássico da cascata de coagulação. (Figura adaptada de Franco, 2001)

INTRODUÇÃO


28

Simultaneamente a esses processos de formação do trombo,

independentemente da via utilizada, existe a ação de fatores anticoagulantes

(fisiológicos) que impedem a propagação desse trombo tais como: proteína C e S,

antitrombina (AT) e cofator II da heparina (HCII).

Assim, quando se evidencia um desequilíbrio entre os processos de formação

do coágulo (coagulação) e dissolução do mesmo (fibrinólise), a chance de se

adquirir uma doença cardiovascular torna-se bastante elevada.

1.3.2. POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DE MACROALGAS MARINHAS COM

ATIVIDADE ANTICOAGULANTE

Os polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas apresentam-se como

um dos principais grupos de compostos com potencial anticoagulante/antitrombótico.

Eles apresentam-se como promissores fármacos para a substituição da heparina,

devido principalmente, a grande diversidade estrutural, o que fornece a possibilidade

Figura 2. Representação esquemática dos complexos procoagulantes. (a) O Fator VII encontra-se ativado em concentrações muito baixas no sangue. (b) O Fator VIIa tem alta afinidade pelo FT. O complexo FT/VIIa é capaz de converter uma quantidade significativamente maior de Fator VII, gerando o Fator VIIa. (c) No entanto o principal papel de FT/VIIa é formar um complexo com os Fatores X e IX (Complexo tenase extrínseco), levando a formação dos Fatores Xa e IXa. O Fator Xa, por sua vez, leva a formação de pequenas concentrações de trombina, que por sua vez ativam os cofatores V e VIII. (d) Os Fatores IXa e VIIIa se complexam ao Fator X (Complexo tenase intrínseco) ativando mais moléculas de trombina. (e) Os Fatores Va e Xa se complexam ao Fator II (Complexo protrombinase) aumentando consideravelmente sua conversão em trombina (a formação de trombina por este complexo é 50 vezes maior do que pelos demais). FT: Fator tecidual. (CÂMARA, 2010).

INTRODUÇÃO


29

deles apresentarem mecanismo de ação diferente da heparina (ROCHA et al.,

2006).

Desde quando foi descrita pela primeira vez (CHARGAFF et al., 1936), a

atividade anticoagulante associada com polissacarídeos de algas vermelhas vem

sendo estudada. Esses polissacarídeos têm propensão a formar complexos solúveis

com proteínas plasmáticas, tal como o fibrinogênio e o seu mecanismo de ação se

dá principalmente por via de inibição da trombina (SHANMUGAM et al., 2001).

Três galactanas foram purificadas da alga Botryocladia occidentalis e

denominadas F1, F2 e F3 de acordo com suas eluições em NaCl de uma coluna

troca iônica. Somente as frações F2 e F3 mostraram potente ação anticoagulante

em testes de aPTT. Suas estruturas são formadas por unidades dissacarídicas

repetidas de (1�4)-α-D-Gal-1�3-β-D-Gal com variáveis padrões de sulfatação,

sendo que um terço das α-Gal são 2-3-dissulfatadas e os demais 1/3 são 2-O-

sulfatadas. Nos testes de aPTT, as frações F2 e F3 apresentaram respectivamente

150 unidades internacionais (UI)/mg e 130 UI/mg e ambas potencializaram a inibição

de trombina e fator Xa por AT (Antitrombina) e/ou HCII (Cofator II da heparina)

(FARIAS et al., 2000).

Em trabalho posterior foi purificada uma galactana da alga Gelidium crinale

composta de uma α-Gal e D-Gal ligados na posição 1�3, com 15% das unidades α

sendo 2-3-dissulfatadas e outros 55% sendo 2-sulfatadas. Quando desafiada ao

teste de aPTT, a galactana apresentou 60 UI/mg, sendo sua ação dada pela

potencialização da inibição da trombina pela AT e do fator Xa pelo HCII (PEREIRA et

al., 2005).

Os polissacarídeos de algas marrons são de longe os mais estudados quanto

ao potencial anticoagulante desde 1941, quando foi descoberto tal potencial em

extratos de algas do gênero Laminaria (KIMURA, 1941). Como destaques têm-se as

algas Fucus vesiculosus e Ascophyllum nodosum (NISHINO et al., 1991b,

CHEVOLOT et al., 2000, HAROUN-BOUHEDJA et al., 2000). A ação inibitória

desses compostos sobre a formação do coágulo de fibrina ocorre principalmente

através da potencialização de anticoagulantes naturais: antitrombina e cofator II da

heparina (NISHINO et al., 1991a, MINIX & DOCTOR, 1997). Contudo, inibição do

fator Xa também pode ocorrer em menor escala (DROZD et al., 2006, YOON et al.,

2007)

INTRODUÇÃO


30

Muitas fucanas podem agir também de forma indireta na alteração do

processo de coagulação, como promovendo a liberação do TFPI (inibidor do fator

tecidual) ou de heparan sulfato, um glicosaminoglicano sulfatado produzido pelas

células endoteliais que apresenta ação antitrombótica (GIRAUX et al., 1998, ROCHA

et al., 2005a). Nesse último caso, foram extraídas da alga Spatoglossum schröederi

três fucanas denominadas A, B e C que quando submetidas a testes anticoagulantes

“in vitro” (Tempo de tromboplastina parcialmente ativada- aPTT; Tempo de

protrombina- PT; Tempo de trombina- TT) não apresentaram nenhuma atividade

considerável (LEITE et al., 2008). Contudo, as fucanas A e B apresentaram atividade

antitrombótica “in vivo” e foi atribuído essa atividade ao fato dessas fucanas

estimularem a síntese do heparan sulfato endotelial antitrombótico (ROCHA et al.,

2005a, BARROSO et al., 2008).

Os polissacarídeos de algas verdes são os menos explorados, e dentre essas

o gênero Codium é o que mais vem sendo estudado. O primeiro relato de

polissacarídeos anticoagulantes de Codium foi feito por Deacon-Smith (DEACON-

SMITH et al., 1985a). Esses autores trabalharam com quarenta e cinco espécies de

Codium e verificaram que os polissacarídeos dessas algas, na maioria galactanas,

apresentaram atividade anticoagulante nos testes de aPTT, PT e TT (DEACON-

SMITH et al., 1985b). Posteriormente, foi extraído e purificado da Codium fragile um

anticoagulante composto de xilose, arabinose e galactose que teve sua ação na

potencialização do Cofator II da Heparina (HC II) e Antitrombina (AT) (JURD et al.,

1995). Um homopolissacarídeo sulfatado constituído de arabinose foi extraído de

Codium dwarkense e mostrou potencial anticoagulante para o teste de TT (tempo de

trombina) similar ao da heparina (140,3 UI/mg), além de dobrar o tempo de

coagulação em relação ao tempo controle para os testes de PT e aPTT a partir das

concentrações de 100 µg/mL e 20 µg/mL, respectivamente (SIDDHANTA et al.,

1999).

Os mecanismos de ação anticoagulante dos polissacarídeos sulfatados de

macroalgas marinhas relatados na literatura são sumarizados na Figura 3.

INTRODUÇÃO


31

1.4- Atividade antioxidante de polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas.

Em anos recentes, estudos com polissacarídeos sulfatados de macroalgas

marinhas têm demonstrado que esses polímeros também apresentam um papel

importante na neutralização de radicais livres. Radicais livres são definidos como

átomos ou moléculas que apresentam elétrons despareados (FERREIRA &

MATSUBARA, 1997). Estes são responsáveis por uma gama de desordens, como

doenças cardiovasculares, isquemia, mal de Alzheimer, além de estarem

diretamente envolvidos com inflamação, envelhecimento e a formação de câncer (CIOBICA et al., 2011, JOMOVA & VALKO, 2011, WHALEY-CONNELL et al., 2011).

Estudos recentes mostraram que fucanas apresentam um potencial

antioxidante mediado principalmente através da inibição de radicais superóxido e

sequestro de peróxido de hidrogênio (ZHANG et al., 2003b, HEO et al., 2005, WANG

et al., 2008)

Em acordo com este dado, extratos polissacarídicos de sete algas marrons

apresentaram atividade antioxidante, principalmente através do ensaio de sequestro

de radical superóxido, inclusive com resultados superiores aqueles vistos para

Figura 3. Mecanismos de ação anticoagulate dos polissacarideos sulfatados de algas marinhas. PS- polissacarídeo sulfatado; X- fator X inativo; Xa- fator X ativado; Va- fator V ativado; AT-antitrombina; HCII- Cofator II da heparina; TFPI- inibidor da via do fator tecidual. HS-heparan sulfato.

INTRODUÇÃO


32

antioxidantes comerciais (HEO et al., 2005). Já F3, uma fucana purificada da alga

Laminaria japonica, apresentou excelente atividade antioxidante para o ensaio de

sequestro de radical superóxido, e de forma interessante inibiu cerca de 80% dos

radicais hidroxila formados, sendo o primeiro polissacarídeo sulfatado demonstrado

por apresentar atividade antioxidante através deste mecanismo (WANG et al., 2008).

Diferente desses resultados, uma fucana da alga Fucus vesiculosus mostrou

atividade antioxidante através do ensaio de poder antioxidante pela redução do íon

férrico (RUPEREZ et al., 2002).

Recentemente, fucanas tem sido relatadas por apresentar atividade

antioxidante através de uma variedade de mecanismos de ação. Cinco

heterofucanas isoladas da alga Canistrocarpus cervicornis apresentaram atividade

antioxidante através dos seguintes mecanismos: Sequestro de radicais superóxido e

hidroxila, capacidade redutora e principalmente capacidade quelante de íons ferro

(CÂMARA et al., 2011). Em outro estudo, uma fucana extraída da alga Lobophora

variegata, denominada F1, apresentou resultados similares, seqüestrando radicais

hidroxila e superóxido e mostrando excelente atividade redutora (SOUZA et al.,

2007).

Poucos estudos têm sido realizados com atividade antioxidante de

polissacarídeos sulfatados de algas vermelhas e algas verdes. Contudo, a literatura

mostra que as espécies desses grupos são fontes de potenciais compostos

utilizados em terapias antioxidantes. Três polissacarídeos sulfatados da alga

vermelha Phorphyra haitensis apresentaram atividade antioxidante através da

inibição dos radicais superóxidos, além de inibir de forma significativa a peroxidação

lipídica, e inibir parcialmente a hemólise de eritrócitos de ratos induzidas por

peróxido de hidrogênio (ZHANG et al., 2003b).

Ulvana, um polissacarídeo sulfatado extraído da alga verde Ulva lactuta,

apresentou baixo poder antioxidante, entretanto, quando modificada pela adição de

grupamentos benzoil e acetil passou a mostrar excelente atividade antioxidante,

principalmente para o ensaio de radicais superóxido, que inclusive foi superior

aquela vista para a vitamina C (QI et al., 2006).

A atividade antioxidante mediada através de vários mecanismos não é

exclusividade de polissacarídeos sulfatados de algas marrons. F1 e F2, duas

xilogalactanas isoladas da alga vermelha Corallina officinalis apresentaram

considerável atividade antioxidante quando submetidas aos testes de sequestro de

INTRODUÇÃO


33

radicais superóxido e hidroxila, atividade redutora e atividade total no ensaio de

radical DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Ainda, F1 e F2, quando desulfatadas

diminuíram drasticamente o seu potencial antioxidante, confirmando a importância

do sulfato para a atividade antioxidante de polissacarídeos sulfatados (YANG et al.,

2011).

1.5- Atividade antiproliferativa de polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas

1.5.1. MORTE CELULAR PROGRAMADA (APOPTOSE) DEPENDENTE DE

CASPASES

Apoptose, ou morte celular programada, é um processo essencial para a

manutenção do desenvolvimento dos seres vivos, sendo descrito como um processo

fisiológico de eliminação celular (WYLLIE et al., 1981). O termo apoptose foi

originalmente usado referindo-se a um padrão de morte celular com características

morfológicas distintas da necrose (DESAGHER & MARTINOU, 2000).

A necrose pode ser definida como uma forma violenta de morte celular

iniciada por estímulos ambientais que resultam em rápida desregulação da

homeostasia (BRAS et al., 2005). Os eventos que ocorrem durante a necrose podem

ser descritos da seguinte forma: condensação da cromatina e aumento do volume

celular, dilatação mitocondrial e desagregação dos ribossomos (UCHIYAMA, 1995),

alteração na permeabilidade da membrana por diminuição nos níveis de ATP, que

tem como conseqüência comprometimento da bomba de Na+/K+ e de outros

fenômenos que são ATP-dependentes (TRUMP et al., 1997), rompimento de

organelas e da membrana plasmática e liberação de componentes intracelulares,

ocasionando uma reação inflamatória local (BOUJRAD et al.,2007, KERR et al.,

1995).

Por sua vez, o processo apoptótico se configura como um processo fisiológico

altamente regulado de morte celular programada e desempenha um papel relevante

na homeostase de diferentes tecidos em resposta a numerosos estímulos. É

caracterizada por alterações no citoesqueleto que induzem contração celular,

fragmentação do DNA, condensação da cromatina levando a aparência de núcleos

INTRODUÇÃO


34

picnóticos, formação de vesículas sem perda de integridade da membrana e sem

resposta inflamatória (LAVIN, 1993; LIAO et. al., 2005; YASUHARA et al., 2003).

Existem múltiplas vias celulares que desencadeiam a apoptose (JEONG ;

SEOL, 2008). Duas vias apoptóticas são bem conhecidas em células de mamíferos:

A via extrínseca e a via intrínseca. A via extrínseca é iniciada pela ativação de

receptores de morte na superfície da membrana plasmática (JEONG ; SEOL, 2008;

BAO ; SHI, 2007). A via intrínseca é desencadeada através de sinais de estresse

celular, como danos no DNA (BAO ; SHI, 2007; CHIPUK et al., 2006), danos ao cito-

esqueleto, estresse ao retículo endoplamático, perda de adesão, ausência de fatores

de crescimento, inibição de síntese de macromoléculas e outros (CHIPUK et al.,

2006).

Ambas as vias são reguladas por caspases “(cysteine-dependent aspartate-

specific proteases)”, moléculas que pertencem à família das cisteínas proteases

(possuem uma cisteína no sítio ativo) que têm a capacidade de reconhecer e clivar

substratos que possuam resíduos de aspartato. As caspases, que estão presentes

constitutivamente na maioria das células de mamíferos, se localizam no citosol como

proenzimas e quando ativadas sofrem clivagem em cisteínas localizadas próximas

aos resíduos de ácido aspártico (GARRIDO e KROEMER, 2004; LAUNA et al., 2005;

HAIL et al., 2006).

A via extrínseca, ilustrada na Figura 4, é iniciada por associação de

monômeros de diferentes receptores de morte na membrana plasmática e, ao se

agruparem, promovem o recrutamento de proteínas adaptadoras (COHEN, 1997;

HAIL et al., 2006).

INTRODUÇÃO


35

Dentre os receptores na membrana plasmática, o receptor fas/CD95 recruta

procaspase 8 e/ou procaspase 10, e a conseqüente elevação de seus níveis nas

proximidades da membrana garantem interação dessas caspases inativas com

proteínas adaptadoras associadas a fas/CD95. A interação desse complexo protéico

promove a autocatálise das procaspases que se tornam nesse momento em

caspases iniciadoras ativadas. A ativação proteolítica seqüencial de outras

caspases, culmina na ativação de caspases efetoras 3, 6 e 7 que estão no

citoplasma (HAJRA e LIU, 2004).

A via intrínseca ou mitocondrial é ativada predominantemente, com

envolvimento de alterações de permeabilidade de membrana mitocondrial e

liberação do Citocromo C para o citoplasma, que se liga ao Apaf-1 e pró-caspase-9,

formando o complexo apoptossomo (Figura 5). A caspase-9 ativa (iniciadora) pode

então clivar as caspases efetoras subsequentes (-2, -3, -6, -7, -8, -9, e -10).

Portanto, a ativação da caspase-9 mediada pelo Citocromo C serve como um

mecanismo de amplificação de sinais durante o processo apoptótico.

Fonte: GRIVICICH, 2007 Figura 4. Via extrínseca da apoptose. FasL- Fas Ligante. O recrutamento de receptores de morte (Fasl/Faz) recruta a pro-caspase 8 e pró-caspase 10. Estas últimas ativam a caspase 3, que induz a apoptose.(Fonte: GRIVICICH, 2007)

INTRODUÇÃO


36

Membros pró-apoptóticos e antiapoptóticos da família Bcl-2 regulam a

liberação de Citocromo C a partir da membrana mitocondrial interna. A via

mitocondrial é frequentemente, ativada em resposta a danos no DNA, envolvendo a

ativação de um membro pró-apoptótico da família Bcl-2 (Bax, Bid). Por outro lado, os

membros antiapoptóticos da família Bcl-2 inibem a morte celular por apoptose

impedindo a formação de poros na membrana mitocondrial, com consequente

inibição da libertação do Citocromo C para o citoplasma (KO et al., 2011,

PUPYSHEV, 2011).

1.5.2. INDUÇÃO DA MORTE CELULAR INDEPENDENTE DE CASPASES

ATRAVÉS DA LIBERAÇÃO DO FATOR INDUTOR DE APOPTOSE NO CITOSOL.

A mitocôndria também está diretamente envolvida em eventos de morte

celular independentes da ativação das caspases, através da liberação de fatores

solúveis no citoplasma após sinais pró-apoptóticos específicos. O fator indutor de

apoptose (AIF), uma flavoproteína liberada no citosol a partir da mitocôndria, vêm

sendo considerada uma molécula chave na regulação da morte celular (KROEMER,

Figura 5. Via intrínseca da apoptose. Bax e bcl-2 controlam a liberação do citocromo Cque se liga ao Apaf-1 e pró-caspase-9, formando o complexo apoptossomo, ativando a caspase 3 e induzindo a apoptose.

Fonte: GRIVICICH, 2007

INTRODUÇÃO


37

2001, HANGEN et al., 2010, NORBERG et al., 2010). Esta proteína quando no

citosol, migra para o núcleo e induz a condensação da cromatina e fragmentação do

DNA em fragmentos de 50Kb, em um mecanismo independente da ativação das

caspases (SEVRIOUKOVA, 2011).

A primeira descrição de AIF foi no ano de 1996, e o nome da proteína deve-se

ao fato da manutenção da habilidade apoptogênica mesmo na presença de z-VAD,

um inibidor específico de pan-caspase (SUSIN et al., 1999). AIF é codificada como

uma proteína de 67 Kda, e encontra-se ancorada na membrana interna mitocondrial

pela sua região N-terminal, que contêm um sinal de localização celular, bem como

domínios ligantes para FAD (flavina adenina dinucleotídeo) e NADH (nicotinamida

adenina dinucleotídeo reduzida), e sua função fisiológica está associada a regulação

de processos oxidativos (HANGEN et al., 2010, NORBERG et al., 2010,

SEVRIOUKOVA, 2011).

Após estímulos específicos, como a hiperpolarização da membrana

plasmática e consequente influxo de Ca++ através de canais denominados HCN2, a

peptidase mitocondrial calpaina-1 (uma cisteíno-protease não lisossomal

dependente de cálcio) é ativada, cliva a região N-terminal de AIF, liberando a

proteína solúvel no espaço intermembrana da mitocôndria na sua forma madura, que

contêm um peso molecular de 52 Kda. Posteriormente, AIF maduro migra para o

citosol e transloca-se ao núcleo, contribuindo com o processo de fragmentação e

condensação da cromatina, por mecanismos ainda desconhecidos (NORBERG et

al., 2010). A liberação de AIF no citoplasma é regulada principalmente pelas

proteínas Bcl-2 e Bax. Na ausência de sinalização pró-apoptótica, Bcl-2 inibe a

abertura de poros na membrana interna mitocondrial, controlando o potencial

transmembrana mitocondrial, impedindo desta forma a translocação de AIF para o

citosol (TSUJIMOTO, 1998, SMITH et al., 2008, OZAKI et al., 2009). Por outro lado,

na presença de sinais pró-apoptóticos a proteína Bax interage com VDAC (canal

aniônico voltagem dependente), uma proteína de membrana mitocondrial externa,

promovendo a abertura de poros de transição de permeabilidade mitocondrial, que

são poros protéicos não seletivos localizados na membrana mitocondrial interna, que

por sua vez aumentam o influxo de cálcio e aceleram a liberação de AIF no citosol

(SHIMIZU et al., 2000, KIM et al., 2005, OZAKI et al., 2009, SCHARSTUHL et al.,

2009).

INTRODUÇÃO


38

1.5.3. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS

DE MACROALGAS MARINHAS.

Atualmente o câncer é uma das maiores ameaças para saúde pública tanto

nos países desenvolvidos como nos países em desenvolvimento. No Brasil, o câncer

é a segunda principal causa de morte por doença, superada apenas pelas doenças

cardiovasculares. Somente para o biênio 2010/2011, as estimativas apontavam para

a ocorrência de 489.270 casos novos de câncer somente no Brasil (INCA, 2010).

Tendo em vista que a maioria dos tratamentos atualmente disponíveis, como

radioterapia e quimioterapia, utilizadas como primeira escolha para o tratamento do

câncer, apresentam sérios efeitos adversos como inibição da resposta imunológica,

visto que não apresentam toxicidade seletiva, se faz necessário buscar novos

fármacos com efeitos mais específicos e menor toxicidade (ROCHA et al., 2011).

Nesse sentido, diversos trabalhos foram realizados com polissacarídeos

sulfatados de macroalgas marinhas. Os mecanismos pelos quais os polissacarídeos

sulfatados desempenham suas atividades antiproliferativa frente a linhagens

tumorais são os mais diversos:

� Bloqueio do ciclo celular impedindo a proliferação das células tumorais (RIOU et

al., 1996, JI et al., 2004);

� Estimulo do sistema imunológico potencializando a ativação de linfócitos T,

macrófagos, neutrófilos e células NK (natural killers) e aumentando a produção

de óxido nítrico e interleucinas (MARUYAMA et al., 2006);

� Inibição da adesão celular à matriz extracelular (ROCHA et al., 2001);

� Potencialização do efeito antitumoral de quimioterápicos comerciais (ZHOU et al.,

2006).

� Inibição da angiogênese (formação de vasos sanguíneos) (LEE et al., 2008).

Entretanto, a ativação de diferentes vias de morte celular, especialmente a via

da ativação das caspases (AISA et al., 2005, TERUYA et al., 2007) parece ser o

principal mecanismo antitumoral dos polissacarídeos sulfatados de macroalgas

marinhas. Na ultima década, é possível acompanhar a caracterização de uma gama

de polissacarídeos sulfatados com capacidade de induzir apoptose em diferentes

linhagens celulares (AISA et al., 2005, HANEJI et al., 2005, MARUYAMA et al.,

2006, TERUYA et al., 2007, HYUN et al., 2009b, JIN et al., 2010).

INTRODUÇÃO


39

Os polissacarídeos sulfatados mais bem caracterizados quanto à indução de

apoptose são aqueles extraídos de algas marrons. A fucana mais estudada com

relação ao seu mecanismo de ação antiproliferativo é a fucana de F. vesiculosus

conhecida como fucoidan. Este PS promove a ativação de caspase-3, o que

consequentemente induz apoptose de células de linfoma humano (HS-sultan cells).

Contudo, quando estas células foram incubadas com fucoidan e um inibidor de

caspases concomitantemente, observou-se que o efeito do fucoidan foi parcialmente

anulado. Os autores mostraram que o fucoidan não afetava a via da p38 quinase e

da AKT, mas diminuía a fosforilação de ERK (Extracellular Regulated-Kinase) e que

este efeito também levava as células entrarem em apoptose (AISA et al., 2005).

Quando este fucoidan de F. vesiculosus foi avaliado com células de carcinoma de

colo humano (HCT-15), observou-se que também estimulava apoptose nas HCT-15

por ativar caspases. Contudo, nestas células o fucoidan, ao contrario do visto

anteriormente, aumentava a fosforilação de ERK e de p38 quinase e bloqueava a via

da PI3K/AKT. Os dados mostraram que este efeito era responsável pela atividade

antiproliferativa do fucoidan (HYUN et al., 2009a). Já quando o mecanismo

antiproliferativo deste mesmo fucoidan foi avaliado em células pro-mielocíticas

humanas (HL60), verificou-se que além de ativar as caspases e aumentar os níveis

de fosforilação de ERK, o efeito antiproliferativo do fucoidan também era dependente

do aumento da produção de Óxido Nítrico (ON) e da diminuição dos níveis de

glutationa citoplasmáticos (Jin et al., 2010). Por outro lado, em células de câncer de

colo humano (HT-29), o fucoidan não modificou os níveis de fosforilação de ERK,

porém verificou-se que o fucoidan ativava caspases, promovia a liberação de fatores

mitocondriais pró-apoptóticos (citocromo C e Smac/Diablo) para o citoplasma e

aumentava os níveis de “death receptor 5 proteins”. Em suma, o mecanismo

antiproliferativo do fucoidan nas células HT-29 é mediado por duas vias: a via

mitocondrial (intrínseca) e a via ativada por receptores de morte (extrínseca) (KIM et

al., 2010b).

Estes resultados mostram que a via pela qual fucoidan da alga Fucus

vesiculosus promove apoptose varia de acordo com a linhagem celular.

Provavelmente esse achado é característico para todos os polissacarídeos

sulfatados de macroalgas marinhas, entretanto existe uma necessidade de estudos

mais aprofundados, com o objetivo de determinar os mecanismos de ação

INTRODUÇÃO


40

antiproliferativo de cada composto e elucidar a sua relação com a estrutura

molecular destes polissacarídeos.

OBJETIVOS


41

2 – OBJETIVOS 2.1- Objetivos gerais

Este presente estudo tem como objetivo geral realizar uma bioprospecção de

polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas marinhas coletadas no litoral do

Rio Grande do Norte, selecionando aqueles com maiores potenciais anticoagulante,

antioxidante e/ou antiproliferativo, e caracterizá-los físico-quimicamente e

determinando o(s) seu(s) possível(is) mecanismo(s) de ação.

2.1- Objetivos específicos Este trabalho apresenta como objetivos específicos:

� Coletar macroalgas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte para extração de

extratos brutos ricos em polissacarídeos sulfatados;

� Determinar a composição química dos extratos polissacarídicos;

� Avaliar os extratos polissacarídicos quanto ao potencial anticoagulante, utilizando

kits comerciais de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) e tempo de

protrombina (PT);

� Analisar o potencial antioxidante desses extratos através de diferentes ensaios in

vitro;

� Verificar a existência de atividade antiproliferativa dos extratos frente a linhagem

celular tumoral de cólon uterino, HeLa;

� Selecionar aquelas algas com maiores potenciais farmacológicos para posterior

isolamento de seus polissacarídeos sulfatados;

� Determinar o potencial farmacológico (anticoagulante, antioxidante e

antiproliferativo) e caracterizar físico-quimicamente os polissacarídeos sulfatados

isolados das algas selecionadas;

� Selecionar um polissacarídeo sulfatado a fim de determinar o mecanismo de

ação de pelo menos uma atividade biológica.

MATERIAISEMÉTODOS

Costa,L. S.. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN

42

3 – MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Material biológico

As algas utilizadas neste trabalho foram coletadas nas praias do litoral do Rio

Grande do Norte (Praia de Búzios, Praia de Maracajaú e praia de Macau) em marés

baixas (entre 0,0 e 0,2 metros), em diferentes períodos durante os anos de 2008 a

2010. As algas selecionadas e seus devidos locais de coleta são mostrados abaixo

(Tabela IV).

Tabela IV. Local de coletas das macroalgas marinhas

Divisão Espécie Local de coleta

Phaeophyta

Dyctiota cervicornis Praia de Camapum, Macau/RN

Dyctiopteris delicatula Praia de Pirambúzios, Nízia Floresta/RN

Dyctiota menstruallis Praia de Pirambúzios, Nízia Floresta/RN

Dyctiota mertensis Praia de Maracajaú, Maxaranguape/RN

Sargassum filipendula Praia de Maracajaú, Maxaranguape/RN

Spatoglossum schröederi Praia de Pirambúzios, Nízia

Floresta/RN

Rhodophyta Gracilaria caudata Praia de Camapum, Macau/RN

Chlorophyta

Caulerpa cupresoides Praia de Pirambúzios, Nízia Floresta/RN

Caulerpa prolifera Praia de Pirambúzios, Nízia

Floresta/RN

Caulerpa sertularioides Praia de Camapum, Macau/RN

Codium isthmocladum Praia de Pirambúzios, Nízia Floresta/RN

Após serem coletadas, as algas foram levadas ao laboratório (BIOPOL –

Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais), onde foram lavadas e retiradas

as epífitas e inclusões calcárias. Em seguida foram secadas em estufa a 45ºC,

trituradas e guardadas em recipientes apropriados..

MATERIAISEMÉTODOS


43

3.2. Outros materiais

3.2.1 – KITS E REAGENTES

� 1,3 diamino propano, Aldrich Chemical Co. Inc. (Milwake, WI, EUA). Acetona,

metanol, etanol, da Merck (São Paulo – SP);

� Acetona, metanol, etanol, da Merck (São Paulo – SP);

� Ácido sulfúrico, álcool etílico, álcool metílico, coomasie brilliant blue R 250, fosfato

de sódio dibásico, fosfato de sódio monobásico, glicina, hidróxido de sódio,

peróxido de hidrogênio e sulfato de ferro heptahidratado da CRQ (Diadema, SP,

Brasil);

� Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) da VETEC (Duque de Caxias, RJ, Brasil);

� Ácido clorídrico e metionina da Synth (Diadema, SP, Brasil);

� Ácido gálico da CAQ Casa da Química Ind. e Com. (Diadema, SP, Brasil);

� Ácido ascórbico, ferrozina, nitroblue tetrazolium (NBT) e riboflavina da Sigma-

Aldrich Brasil (São Paulo, SP, Brasil);

� Azul de toluidina, vermelho de cresol, coomasie blue R 250, oriundos da Sigma

Chemical Company (St. Louis, MO, EUA).

� Cloreto de ferro e reagente de Folin-Ciocalteau da Merck (Darmstadt, Alemanha);

� Estreptomicina/Penicilina, Gibco Invitrogen (California, Estados Unidos).

� Fenol e molibidato de amônia da Reagen Quimibrás Indústrias Químicas S.A. (Rio

de Janeiro, RJ, Brasil);

� Kit de aumento de quimioluminescência (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.)

� Kit de tempo de tromboplastina parcial ativada e Kit de tempo protrombina da

Labtest (Lagoa Santa, MG, Brasil);

� Anticorpos para determinação do mecanismo de ação antiproliferativo de SF-1,5v

foram obtidos da Cell Signaling Technology (Beverly, MA) e Santa Cruz

Biotechnology (Santa Cruz, CA);

� DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) e RPMI 1640 da Cultilab, SP;

� Maxatase (protease alcalina P 126), da BIOCON do Brasil industrial Ltda. (Rio de

Janeiro, RJ, Brasil).

� Membrana de PVDF (Millipore, Bedford, MA, USA).

MATERIAISEMÉTODOS


44

3.2.2 – PADRÕES

� L-fucose, D-xilose, D-galactose, D-manose, D-glucose, D-arabinose, D-ramnose,

ácido D-glucurônico, ácido D-galacturônico, foram adquiridos da Sigma Chemical

Co. (St. Louis, MO, EUA ).

3.2.3 – APARELHOS

� Agitador de tubos mod. AP 56 da Phoenix Ltda. (Araraquara, SP, Brasil);

� Balanças analítica e de precisão da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);

� Banho maria de temperatura constante da FANEM Ltda (São Paulo, SP, Brasil);

� Bomba de Vácuo da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil)

� Centrífuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co. Ltda (Tóquio, Japão);

� Citometro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, USA);

� Coagulômetro da Drake (SãoPaulo,SP, Brasil);

� Destilador de água MA-270 da Marconi Ltda (Piracicaba, SP, Brasil);

� Espectrofotômetro da FEMTO Ltda (São Paulo, SP, Brasil);

� Estufa da Odontobrás Ltda. (Ribeirão Preto, SP, Brasil);

� Fontes de corrente contínua da BioAgency Biotecnologia Ltda. (São Paulo, SP,

Brasil);

� Medidor de pH da PHS-3B da PHTEK (Japão);

� Purificador de água Milli-Q® Water System da Millipore Corp. (Bedford, MA,

USA);

� Para western blot: PowerPacTM Power Supply; MiniPROTEAN®Tetra Caell; Mini

Trans-blot Cell ®, todos da BIO-RAD (SP, Brasil);

� Bancada de Fluxo Laminar – Pachane Pa300, Piracicaba – São Paulo;

� Incubadora Thermoforma Serie II Water CO2 Incubator HEPA Filter Model 3110 –

USA;

� Microscópio NIKON CFI60, Spectrum – Spectrum Bioengenharia médica

hospitalar LTDA. São Paulo – São Paulo – Brasil;

� Centrífuga para tubos – QUIMIS C Lab. Comércio para laboratório LTDA. Natal –

RN – Brasil;

� Banho-Maria TCM144 – Tecnal Equipamentos para Laboratório LTDA – São

Paulo – SP – Brasil.

MATERIAISEMÉTODOS


45

3.2.4 – PLASMA HUMANO

O sangue humano foi coletado sobre citrato de sódio (concentração final

0,82%), sob agitação leve, em frasco de polietileno esterilizado. O plasma foi

separado por centrifugação e alíquotas de 10 mL foram estocadas a -20°C em

frascos de vidro esterilizados.

3.2.5. CÉLULAS

A linhagem celular HeLa foi gentilmente doada pelo Departamento de

Genética da UFRN. A linhagem celular MC3T3 foi gentilmente doada pelo

Departamento de Bioquímica da UNICAMP. As células foram cultivadas em meio

DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium) suplementado com 10% de soro fetal

bovino. Ao meio DMEM foram adicionados Estreptomicina (5000 �g/mL)/Penicilina

(5000 UI). As células foram mantidas em ambiente estéril com 5% de CO2.

3.3 – Obtenção dos polissacarídeos sulfatados Os procedimentos aplicados para extração dos polissacarídeos sulfatados e

caracterização farmacológica dos mesmos são sumarizados na Figura 6.

MATERIAISEMÉTODOS


46

Figura 6. Metodologia de extração e caracterização físico-química e farmacológica dos extratos polissacarídicos e das frações polissacarídicas das algas D. delicatula e S. filipendula. Cada macroalga marinha foi submetida ao processo de delipidação e despigmentação para a obtenção do pó cetônico. O pó cetônico de cada alga foi submetida a extração do extrato polissacarídico, enquanto o pó cetônico obtidos das algas D. delicatula e S. filipendula foram submetidos a extração das frações polissacarídicas. Os extratos polissacarídicos e as frações polissacarídicas foram posteriormente submetidos a caracterização físico-química, química e farmacológica. *metodologia aplicada apenas para as algas D. delicatula e S. filipendula. **Metodologia não utilizada para os extratos polissacarídicos.

MATERIAISEMÉTODOS


47

3.3.1- OBTENÇÃO DO “PÓ CETÔNICO”

As algas utilizadas neste trabalho foram separadamente submetidas à

despigmentação e delipidação, com a adição de quatro volumes de acetona PA. As

soluções ficaram à temperatura ambiente durante o período de 24 horas.

Posteriormente, todas as soluções passaram por um processo de decantação e

foram colocados para secar. O resíduo resultante deste processo foi denominado de

“Pó Cetônico” e armazenado para posterior utilização na etapa de proteólise.

3.3.2 – PROTEÓLISE E OBTENÇÃO DO EXTRATO POLISSACARÍDICO

Para a realização desta etapa, foram adicionados dois volumes de NaCl 0,25

M ao “Pó cetônico” obtido para cada macroalga, tendo essas soluções seu pH

ajustado para as condições ideais da enzima maxatase (pH 8.0). Cada recipiente

com esse material foi colocado em banho-maria a 60ºC durante um período de 16

horas. Depois, as soluções resultantes foram filtradas e os sobrenadantes

submetidos à centrifugação (10.000 g, durante 10 minutos à 4º C). Após a

centrifugação, foram adicionados a cada sobrenadante dois volumes de metanol

para precipitação dos polissacarídeos existentes neste extrato. As soluções foram

deixadas à temperatura ambiente durante 24 horas. Após esse período, as soluções

foram novamente centrifugadas (10.000 g, durante 10 minutos a 4º C). Os

sobrenadantes resultantes para cada alga marinha foram descartados e os

precipitados foram secos à pressão reduzida, triturados, pesados e devidamente

armazenados. O material obtido para cada alga foi denominado de extrato

polissacarídico.

3.3.2 – OBTENÇÃO DAS FRAÇÕES POLISSACARÍDICAS DAS MACROALGAS

MARINHAS S. filipendula e D. delicatula

Os polissacarídeos sulfatados das algas Sargassum filipendula e Dictyopteris

delicatula foram submetidos a fracionamento com concentrações crescentes de

acetona. Ao pó cetônico obtido para cada alga foram adicionados dois volumes de

NaCl 0,25 M, tendo, essas soluções, o pH ajustado para as condições ideais da

enzima maxatase (pH 8.0). Cada recipiente com essas soluções foi colocado em

banho-maria a 60ºC durante um período de 16 horas. Depois, as soluções

MATERIAISEMÉTODOS


48

resultantes foram filtradas e os sobrenadantes submetidos à centrifugação (10.000

g, durante 10 minutos à 4º C). Aos sobrenadantes foram adicionados volumes

crescentes de acetona, até o aparecimento de turvação. Na presença de turvação,

cada solução foi mantida na temperatura de 4º C por um período de 18 horas.

Posteriormente, as soluções turvadas de cada alga foram centrifugadas (10.000 g,

durante 10 minutos a 4º C) e secas à pressão reduzida. Este processo repetiu-se até

não ser mais verificado o aparecimento de turvação. A partir desta metodologia

foram obtidos as seguintes frações de polissacarídeos sulfatados: SF-0,5v, SF-0,7v,

SF-1,0v, SF-1,5v e SF-2,0v para a alga Sargassum filipendula e DD-0,5v, DD-0,7v,

DD-1,0v, DD-1,3v, DD-1,5v e DD-2,0v para a alga Dictyopteris delicatula. Após

secas, as frações polissacarídicas foram pesadas, e posteriormente foi determinada

a contribuição percentual de cada fração com relação à soma do peso seco total das

frações polissacarídicas.

3.4 – Eletroforese em gel de agarose

O gel de agarose foi preparado na concentração 0,6% no tampão 1,3 diamino

propano acetato (PDA) e colocado sobre lâminas de vidro (7,5 X 7,5 cm X 1,5 mm,

ou 5,0 X 7,5 cm X 1,5 mm). Cinco microlitros de cada extrato polissacarídico e de

cada fração polissacarídica obtida, na concentração de 10 mg/mL, foram aplicadas

em canaletas no gel e submetidos à eletroforese em cuba resfriada a 4�C pelo

período de uma hora e meia. Após a corrida eletroforética (a 100 Volts), cada

composto foi precipitado com CETAVLON 0,1% por no mínimo 2 horas, a

temperatura ambiente. Depois, os géis obtidos foram submetidos a uma corrente

contínua de ar quente para serem secados e corados com azul de toluidina 0,6%. O

excesso de corante foi removido por uma solução de ácido acético 1% em etanol

50% (solução descorante). Após remoção do corante em excesso, as lâminas

reveladas foram secadas à temperatura ambiente e analisadas (DIETRICH &

DIETRICH, 1976).

MATERIAISEMÉTODOS


49

3.5 – Análises químicas 3.5.1 – DOSAGEM DE AÇÚCARES TOTAIS

Açúcares totais de cada extrato polissacarídico e de cada fração

polissacarídica obtida foram determinados pelo método do fenol/ácido sulfúrico,

utilizando-se como padrão galactose, sendo as leituras realizadas a 490 nm

(DUBOIS et al., 1956).

3.5.2 – DOSAGEM DE SULFATO

O teor de sulfato total de cada extrato polissacarídico e de cada fração

polissacarídica obtida foi quantificado, após uma hidrólise ácida com 4N de HCl por

6 horas à temperatura de 100°C, por turbidimetria pelo método da gelatina-bário,

tendo-se como padrão o sulfato de sódio (DODGSON & PRICE, 1962).

3.5.3 – DOSAGEM DE PROTEÍNAS

O teor de proteína correspondente de cada extrato polissacarídico e de cada

fração polissacarídica obtida foi determinado com o reagente de comassie blue R

250 e a leitura realizada a 595 nm (SPECTOR, 1978).

3.5.4 – DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO MONOSSACARÍDICA

A composição monossacarídica dos polissacarídeos sulfatados das algas

Sargassum filipendula e Dyctiopteris delicatula foi determinada através de

cromatografia liquida de alta performance (HPLC) contendo um detector de índice

refrativo modelo L-2490. Utilizou-se uma coluna LichroCART® 250-4 (250 mm × 40

mm) contendo resina Lichrospher® 100 NH2 (5 μm). Os polímeros foram hidrolisados

(2 M HCl, 100 °C, 2 h) e posteriormente os seus monossacarídeos foram analisados.

Como referências, os seguintes açucares foram utilizados como padrões: arabinose,

galactose, glicose, fucose, manose, ramnose, ácido glucurônico, ácido manurônico,

N-acetil glicosamina e xilose. A fase móvel consistiu de uma mistura de 0,1 mol/l de

KH2PO4 (pH 10)-acetonitrila (80:20). O fluxo foi de 1.0 mL/min e a temperatura da

coluna foi de 80 °C.

MATERIAISEMÉTODOS


50

3.6 – Atividade anticoagulante Os ensaios de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) e tempo de

protrombina (PT) foram realizados para cada extrato polissacarídico e cada fração

polissacarídica obtida seguindo o protocolo fornecido pelos “kits” comerciais

adquiridos (Labtest, Minas Gerais/Brasil). O “pool” de plasma citratado utilizado

nestes ensaios foi obtido após a centrifugação de sangue humano retirado de

indivíduos adultos, sadios e de ambos os sexos. Foi verificada, através desses

ensaios, a massa de cada composto necessária para prolongar em duas vezes o

tempo normal de coagulação. Foram utilizadas como meio de comparação da

atividade anticoagulante, a heparina e clexane (heparina de baixo peso molecular),

polissacarídeos sulfatados de origem animal utilizados comercialmente como

ferramenta anticoagulante. O tempo de coagulação foi determinado utilizando-se um

coagulômetro automático da marca Drake (São Paulo, Brasil).

3.7. Atividade antioxidante

3.7.1. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE TOTAL

O ensaio é baseado na redução de Molibdênio+6 para Molibdênio+5 pelo

polissacarídeo sulfatado e subseqüente formação de um complexo esverdeado

Fosfato/Molibdênio+5 em pH ácido (PRIETO et al., 1999). Aos tubos contendo cada

extrato polissacarídico e cada fração polissacarídica foram adicionados os reagentes

(0.6 M ácido sulfurico, 28 mM fosfato de sódio e 4 mM molibdato de amônia), e

posteriormente as soluções foram incubados à 95º C por 90 min. Posteriormente, a

absorbância de cada solução foi medida a 695 nm contra um branco, contendo

apenas reagentes e água Mili Q. Os resultados tomam como base a atividade do

ácido ascórbico, um composto com atividade antioxidante conhecida. A capacidade

antioxidante total é expressa em equivalentes de acido ascórbico, sendo calculado a

partir da massa de ácido ascórbico necessária para apresentar uma atividade

antioxidante equivalente a 1000 mg do extrato polissacarídico ou da fração

polissacarídica analisada.

MATERIAISEMÉTODOS


51

3.7.2. SEQUESTRO DE RADICAIS HIDROXILAS

A atividade seqüestradora dos radicais hidroxilas de cada extrato

polissacarídico e de cada fração polissacarídica obtida foi investigada usando a

reação de Fenton (Fe2+ + H2O � Fe3+ + OH- + OH.). Esses resultados são

expressos como porcentagem de inibição dos radicais hidroxilas. Radicais hidroxila

foram gerados usando o método de previamente descrito (SMIRNOFF & CUMBES,

1989) com pequenas modificações. Em 3 mL de tampão fostato (150 mM, pH 7,4),

foi adicionado 10 mM FeSO4. 7H2O, 10 mM EDTA, 2 mM salicilato de sódio, 30%

H2O2 (200 µL) e variadas concentrações dos compostos testes (10, 50, 100, 500 e

1000 µg/mL). No controle, tampão fosfato substitui H2O2. As soluções foram

incubadas a 37º C por 1h, e a presença dos radicais hidroxilas foi monitorada a 510

nm.

3.7.3. SEQUESTRO DE RADICAIS SUPERÓXIDO

O ensaio é baseado na capacidade de cada extrato polissacarídico e de cada

fração polissacarídica obtida em inibir a redução fotoquímica do nitroblue tetrazolium

(NBT) no sistema riboflavina-luz-NBT (BEAUCHAMP & FRIDOVICH, 1971,

DASGUPTAA & DE, 2007). Cada 3 mL da reação contém 50 nM de tampão fosfato

(pH 7.8), 13 mM de metionina, 2 μM riboflavina, 100 μM EDTA, NBT (75 μM), e 1 mL

de solução contendo os compostos testes (1, 5, 10, 25 e 50 µg/mL). A produção do

azul de formazan foi monitorada pelo aumento da absorbância a 560 nm após

iluminação com lâmpada fluorescente por 10 min. A reação foi realizada em câmara

dissipadora de luz. Tubos idênticos com os reagentes foram colocados no escuro e

utilizados como branco.

3.7.4. QUELAÇÃO FÉRRICA

A habilidade quelante de íons ferrosos de cada extrato polissacarídico e de

cada fração polissacarídica obtida foi investigada de acordo método descrito

anteriormente (DECKER & WELCH, 1990) e com posteriores modificações (WANG

et al., 2008). A reação contendo FeCl2 (0.05 mL, 2 mM), e ferrozina (0.2 mL, 5 mM) e

os compostos testes em diferentes concentrações, foi agitada e incubada por 10

min à temperatura ambiente. A absorbância da reação é medida a 562 nm contra um

branco.

MATERIAISEMÉTODOS


52

3.7.5. PODER REDUTOR

O poder redutor das amostras foi quantificado de acordo com metodologia

previamente descrita (ATHUKORALA et al., 2006, WANG et al., 2008). 4 mL da

reação contendo diferentes concentrações dos polissacarídeos sulfatados em

tampão fosfato (0.2 M, pH 6.6) e ferricianeto de potássio (1%) foram incubados por

20 min. à 50ºC. A reação foi terminada pela adição da solução de ácido

tricloroacético (TCA) a 10%, e posteriormente misturada com água destilada e

cloreto de ferro (0,1%). A absorbância foi medida a 700 nm.

3.8. Atividade antiproliferativa A viabilidade celular das linhagens celulares HeLa (células tumorais de cólon

uterino humano) e MC3T3 (células pré-osteoblásticas murinas) foram tratadas com

as diferentes concentrações dos extratos polissacaridicos e dos polissacarídeos

sulfatados de S. filipendula e D. delicatula e avaliadas pelo método colorimétrico do

MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) (MOSMANN., 1983).

Este método é baseado na redução do MTT a formazan pelas células vivas. 5 X 103

células foram colocadas em placas de Elisa estéril de 96 poços para um volume

final de 100 µL de meio DMEM 10% de soro fetal bovino. Posteriormente, as células

foram incubadas com diferentes concentrações das amostras (0.1; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0

mg/mL). Após 24, 48 e/ou 72 horas, MTT (5 mg/mL) foi adicionado ás células, e

incubados por mais 4 horas. Após este período, o meio foi aspirado, e adicionou-se

100 µL de HCl 0,04N em álcool isopropílico para dissolver os cristais de formazan

formados e precipitados. A quantificação da absorbância foi feita em leitor de Elisa

em comprimento de onda de 562 nm. O ensaio foi realizado em quintuplicata. O

cálculo de inibição da proliferação celular foi realizado em comparação com o

controle contendo células não tratadas com os polissacarídeos sulfatados.

3.9. Seleção das algas para extração dos polissacarídeos sulfatados

Para as escolha das macroalgas marinhas que tiveram seus polissacarídeos

sulfatados, após o termino do processo de bioprospecção dos extratos

polissacarídicos, foi desenvolvida uma ferramenta para avaliação dos resultados

encontrados neste trabalho levando-se em consideração os seguintes fatores:

Rendimento dos polissacarídeos, potencial farmacológico apresentado nos ensaios

MATERIAISEMÉTODOS


53

anticoagulante, antioxidante e antiproliferativo e a facilidade de obtenção das algas

em todos os períodos do ano no litoral potiguar. Para todos os fatores citados foram

definidos valores que variaram de 1 a 3, sendo: 1, um resultado considerado ruim; 2,

resultado considerado bom; e 3, resultado considerado ótimo. Por fim, a pontuação

geral obtida por cada alga foi calculada. A pontuação final foi denominada índice de

potencial farmacológico.

3.10. Determinação dos mecanismos de ação antiproliferativo de SF-1,5v

3.10.1. MARCAÇÃO COM ANEXINA V-FITC

As células HeLa (2,5 x 105 células/poço) foram cultivadas em placas de 12

poços por 24 horas e tratadas com concentrações pré-estabelecidas da amostra SF-

1,5v, obtida da alga S. filipendula. Após o tratamento e período de recuperação as

células foram tripsinizadas, transferidas para microtubos de centrífuga estéreis e

centrifugadas por 10 minutos à temperatura ambiente na velocidade de 2.400 RPM.

As células foram lavadas com meio DMEM F10 com soro e centrifugadas

novamente. Para o ensaio da anexina V foi utilizado o kit de detecção de apoptose

por Anexina-V marcada com FITC (Alexis, Lausen, Switzerland). A seguir, as células

foram ressuspendidas com 500 μL de tampão de ligação, 5 μl de anexina V

conjugada com FITC, e 5 μl de iodeto de propídio. A reação foi incubada por 5

minutos, a temperatura ambiente, sob abrigo da luz. A intensidade de fluorescência

(FITC e iodeto de propidio) foi avaliada utilizando o equipamento FACSCalibur

(Becton Dickinson, USA). Para cada ensaio, foram incluídos controle positivo (15

μg/mL de doxorrubicina), controle negativo (células não tratadas).

Para o ensaio de bloqueio da apoptose com o inibidor especifico de caspases

Z-vad, as células HeLa tratadas com SF-1,5v foram pré-incubadas com 50 mM de Z-

Vad(O-Me)-FMK por 45 minutos. A medição da apoptose foi feita de através da

análise da citometria de fluxo, de acordo com os procedimentos supracitados.

3.10.2. WESTERN BLOTTING

Células HeLa foram incubadas com SF-1,5v e após 24 h foram lavadas em

PBS e tratadas em 200 mL de tampão de lise [50 mM Tris-HCl (pH 7,4), Tween 20

MATERIAISEMÉTODOS


54

1%, desoxicolato de sódio 0,25%, NaCl 150 mM , 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 1 mM

NaF, e os inibidores da protease (1 mg / mL de aprotinina, 10 mg / mL e 1 mM

leupeptina 4-.(2-aminoetil) flúor benzenesulfonil] durante 2h no gelo. As

concentrações de proteínas foram determinados utilizando kit de ensaio de proteína

BCA (Pierce, EUA), com albumina de soro bovino como padrão. Aproximadamente

50 mg de proteínas foram misturadas com tampão de amostra 5 vezes concentrado

(Tris-HCl 150 mM, pH 6,8, contendo: β-mercaptoetanol 15%, SDS 6%, azul de

bromofenol 0,3%), fervidas por 5 min e separadas por eletroforese em gel de

poliacrilamida a 10%. Em seguida, as proteínas presentes no gel foram

eletrotransferidas para membranas de polivinilidenodifluorido (PVDF). Para bloquear

sítios de ligação inespecífica do anticorpo, as membranas foram incubadas

“overnight” em solução de TBS-T, contendo leite desnatado (5%) a 4 °C, lavadas em

tampão TBS-T e então incubadas overnight com os anticorpos primários adequados

à diluição de 1:1000 ou b-actina (controle). A visualização das proteínas foi realizada

utilizando anticorpo secundário específico conjugado a peroxidase e as bandas

imunorreativas foram visualizadas usando-se kit de aumento de

quimioluminescência (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.) e filme radiográfico,

segundo recomendações do fabricante.

3.10.3. DETERMINAÇÃO DA ATIVAÇÃO DE GSK

Para este ensaio, células HeLa (2,5 x 105 células/poço) foram cultivadas em

placas de 12 poços por 24 horas e foram previamente tratadas com cloreto de litium

(LiCl) por 1 h, seguida de incubação com 1,5 mg/mL of SF-1,5v por 24 h. Em

seguida, utilizou-se os mesmos procedimentos usados no ensaio de marcação com

anexina V-FITC,mostrado no item 3.10.1.

3.11. Análise estatística Todos os dados dos experimentos realizados são expressos como média ±

desvio padrão. Para testar diferenças entre frações, bem como diferentes

tratamentos da mesma fração, foi utilizado o teste de análise paramétrica de análise

de variância (ANOVA; SPSS 20.0.0 para Windows, 2011; SPSS Inc., Chicago, IL). O

teste de Student–Newman–Keuls (Nível de significância de p<0,01) foi aplicado para

se comprovar algumas similaridades encontradas pela ANOVA.

55

RESULTADOS


4 – RESULTADOS 4.1. Bioprospecção de polissacarídeos sulfatados ativos extraídos de

macroalgas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte

4.1.1. EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DAS MACROALGAS

MARINHAS DO LITORAL DO RIO GRANDE DO NORTE

As macroalgas marinhas utilizadas neste estudo foram coletadas de acordo

com o descrito em Materiais e métodos. Após o processo de proteólise, os extratos

polissacarídicos foram obtidos através de precipitação com dois volumes de

acetona. Após secos, os extratos foram pesados e o rendimento percentual

individual foi obtido (Figura 7).

Os extratos obtidos das algas C. cupresoides, C. prolifera, C. sertularioides e

D. cervicornis apresentaram um rendimento muito baixo, com destaque para a

massa obtida para o extrato de C. sertularioides com apenas 2,4% de

polissacarídeos em relação ao peso seco da alga. Por outro lado, pode-se

destacar o rendimento obtido para os extratos das algas G. caudata, D. delicatula, D.

mertensiis, S. filipendula e S. schröederi, que variou de 16,7% (S. schröederi) a

24,2% (G. caudata).

56

RESULTADOS


4.1.2. ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE DOS EXTRATOS

POLISSACARÍDICOS

Para confirmar a presença de polissacarídeos sulfatados nos extratos obtidos,

estes foram submetidos à eletroforese em gel de agarose com Tampão PDA. Após

coloração com azul de toluidina, o qual interage com compostos sulfatados e passa

a apresentar coloração violácea, tornou-se possível visualizar o perfil eletroforético

de cada extrato polissacarídico (Figura 8). Todos os extratos apresentaram uma

coloração violácea, indicando a presença de polissacarídeos sulfatados em todas as

amostras. Percebe-se ainda, um perfil eletroforético polidisperso para a maioria dos

extratos, destacando-se uma ou mais banda eletroforética. A exceção é o extrato

polissacarídico obtido da alga vermelha G. caudata, que apresenta apenas uma

única banda eletroforética bem definida.

Figura 7. Rendimento dos extratos polissacarídicos extraídos das algas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte. O rendimento foi calculado a partir da razão da massa do extrato polissacarídico pela massa da alga seca. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=3).

57

RESULTADOS


4.1.3. COMPOSIÇÃO QUÍMICA DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS

Para se determinar à quantidade de polissacarídeos e sulfato existentes nos

extratos obtidos das algas foram feitas dosagens químicas de açucares totais e

sulfato. A Tabela V sumariza os resultados obtidos. As algas verdes C. prolifera, C.

sertularioides e C. isthmocladum apresentaram o menor percentual de açúcares

totais (15,6%, 17,2% e 19,2%, respectivamente). Por outro lado, a chlorophyta C.

cupresoides apresentou o maior rendimento de açucares dentre todos os extratos

analisados, com 54,7%, seguida de D. menstruallis (42,4). Com relação ao teor de

sulfato, o extrato de G. caudata apresentou apenas 5,3%, enquanto as algas S.

filipendula e C. prolifera mostraram o maior percentual de sulfato com 18,4% e

17,4%, respectivamente. No que diz respeito a contaminação protéica, os extratos

polissacarídicos apresentaram um percentual extremamente baixo, variando entre

0% (C. cupresoides) a 2,7% (D. cervicornis).

Ori

Figura 8. Perfil eletroforético dos extratos polissacarídicos obtidos das algas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte. A- Perfil eletroforético dos extratos polissacarídicos das algas D. cervicornis (Dc),D. delicatula (Dd), D. menstruallis (Dms) e D. mertensis (Dmi). B- Perfil eletroforético dos extratos polissacarídicos das algas S. filipendula (Sf),S. schröederi (Ss), G. caudata (Gc) e C. cupresoides (Cc). C- Perfil eletroforético dos extratos polissacarídicos das algas C. prolifera (Cp), C. sertularioides (Cs) e C. isthmocladum (Ci). Alíquotas de 5�l (50�g) dos extratos foram aplicadas em lâminas de agarose em tampão PDA 0,05 M, pH 9,0. Após precipitação com CETAVLON as lâminas foram coradas com azul de toluidina. Ori - Origem

A B C

58

RESULTADOS


Tabela V. Composição química dos extratos polissacarídicos.

Alga Açúcares totais

(%) Sulfato (%) Proteinas (%)

D. cervicornis 21,4 13,2 2,7

D. delicatula 32,5 12,1 0,4

D. menstruallis 42,4 9,8 0,6

D. mertensis 28,7 10,4 1,7

S. filipendula 37,8 18,4 0,3

S. schröederi 35,4 8,1 1,2

G. caudata 27,2 5,3 1,8

C. cupresoides 54,7 17,0 nd

C. prolifera 15,6 17,4 0,5

C. sertularioides 17,2 15,4 1,9

C. isthmocladum 19,2 14,4 0,7

nd- não detectado

4.1.4. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS

Após análises químicas, os extratos polissacarídicos foram submetidos a

testes de atividade anticoagulante como descrito em Materiais e Métodos, utilizando-

se de “kits” comerciais de aPTT (via intrínseca da coagulação) e de PT (via

extrínseca da coagulação) (Tabela VI). Os extratos polissacarídicos das algas G.

caudata e S. filipendula não apresentaram atividade anticoagulante em nenhumas

das condições testadas. No teste de PT, apenas o extrato polissacarídico de C.

cupresoides mostrou atividade, dobrando o tempo de coagulação em relação ao

controle com a massa de 0,2 mg/mL

. No teste de aPTT, sete extratos polissacarídicos apresentaram atividade: D.

cervicornis, D. mertensis, D. delicatula, C. isthmocladum, C. prolifera, C.

sertularioides e C. cupresoides. O extrato polissacarídico da alga D. cervicornis

apresentou a maior atividade anticoagulante para o teste de aPTT, dobrando o

59

RESULTADOS


tempo de coagulação com a concentração de 0,1 mg/mL, cerca de apenas 1,4 vezes

superior aquela encontrada pela Clexane®, uma heparina de baixo peso molecular.

Tabela VI. Atividade anticoagulante dos extratos polissacarídicos.

Dados são mostrados como a concentração (mg/mL de plasma sanguíneo) requerida para dobrar o tempo de coagulação comparado ao controle salino (n=3). aPTT = Tempo de tromboplastina parcialmente ativada; PT = Tempo de protrombina; nd = Atividade anticoagulante não detectada nas concentrações testadas; *Atividade anticoagulante não avaliada.

4.1.5. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS

A atividade antioxidante dos extratos polissacarídicos foi avaliada em cinco

diferentes ensaios: Capacidade antioxidante total (CAT), sequestro de radicais

hidroxila, sequestro de radicais superóxido, quelação férrica e poder redutor.

No ensaio de Capacidade antioxidante total (expresso como equivalentes de

ácido ascórbico) todos os extratos polissacarídicos mostraram atividade antioxidante

(Figura 9).

Alga APTT PT

D.cervicornis 0,10 nd

D.delicatula 0,40 nd

D.menstruallis * *

D.mertensis 0,40 nd

S.filipendula nd nd

S.schröederi * *

G.caudata nd nd

C.cupresoides 0,50 0,20

C.prolifera 0,40 nd

C.sertularioides 1,00 nd

C.isthmocladum 0,40 nd

Heparina 0,01 0,02

Clexane® 0,07 *

60

RESULTADOS


Os extratos obtidos da alga verde C. isthmocladum e da alga marrom S.

schröederi apresentaram a menor atividade antioxidante com 9,2 e 14,4

equivalentes de ácido ascórbico, respectivamente. Por outro lado, o extrato

polissacarídico da alga vermelha G. caudata e da alga parda S. filipendula

apresentaram as atividades mais consideráveis com 53,9 e 33,9 equivalentes de

acido ascórbico, respectivamente.

A Tabela VII tem-se a sumarização dos resultados encontrados para os

extratos polissacarídicos nos ensaios de sequestro de radicais superóxido e

hidroxila. Apenas os extratos polissacarídicos das algas D. mertensis, D.

menstruallis, G. caudata e C. sertularioides apresentaram capacidade de seqüestrar

radicais hidroxilas nas condições testadas. O extrato polissacarídico da alga C.

sertularioides mostrou atividade de 11,8% na concentração de 0,5 mg/mL, enquanto

os extratos de D. mertensis, D. menstruallis e G. caudata apresentaram atividades

de 8,7%, 7,5% e 8,0%, respectivamente. Ácido gálico, composto comercial utilizado

como controle positivo neste ensaio, na mesma concentração (0,5 mg/mL)

Figura 9. Capacidade antioxidante total dos extratos polissacarídicos. Os resultados são expressos como equivalentes de ácido ascórbico. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre os extratos polissacarídicos.

61

RESULTADOS


apresentou atividade muito superior àquela encontrada para os extratos

polissacaridicos (93,7%).

No teste de sequestro de radicais superóxido, o extrato obtido da alga

vermelha G. caudata e das algas marrons S. filipendula e S. schröederi não

apresentaram atividade detectável. Dentre as algas verdes, apenas o extrato obtido

de C. sertularioides apresentou capacidade de sequestro de radicais superóxidos,

com atividade de 23,3% na concentração de 0.5 mg/mL. Destaca-se ainda, os

extratos polissacarídicos das algas marrons D. cervicornis e D. delicatula que

apresentaram a atividade antioxidante apenas 2,6 e 2,9 vezes inferior aquela

encontrada para o ácido gálico, respectivamente, na concentração de 0,5 mg/mL.

Tabela VII. Sequestro de radicais superóxido e hidroxila pelos extratos

polissacarídicos.

Alga Concentração Atividade (%) (mg/mL) OH. O2

- 0.05 0 ± 0 2.2 ± 3.8

D. cervicornis 0.1 0 ± 0 22.1 ± 3.1 0.25 0 ± 0 30.7 ± 2.1 0.5 0 ± 0 29.4 ± 0.8 0.05 0 ± 0 0 ± 0

D. delicatula 0.1 0 ± 0 13.3 ± 3.7 0.25 0 ± 0 23.1 ± 1.8 0.5 0 ± 0 32.5 ± 2.4 0.05 3.6 ± 0.7 0 ± 0

D. menstruallis 0.1 4.3 ± 2.4 0 ± 0 0.25 4.7 ± 1.2 5.2 ± 2.5 0.5 8.7 ± 3.1 16.8 ± 3,1 0.05 2.4 ± 0.8 2.8 ± 0.4

D. mertensis 0.1 2.6 ± 0.7 4.1 ± 0.8 0.25 3.6 ± 0.4 7.7 ± 1.0 0.5 7.5 ± 1.2 9.0 ± 0.7 0.05 0 ± 0 0 ± 0

S. filipendula 0.1 0 ± 0 0 ± 0 0.25 0 ± 0 0 ± 0 0.5 0 ± 0 0 ± 0 0.05 0 ± 0 0 ± 0

S. schröederi 0.1 0 ± 0 0 ± 0 0.25 0 ± 0 0 ± 0 0.5 0 ± 0 0 ± 0 0.05 1.4 ± 1.1 0 ± 0

G. caudata 0.1 2.4 ± 2.2 0 ± 0

62

RESULTADOS


0.25 3.8 ± 1.3 0 ± 0 0.5 8.0 ± 3.1 0 ± 0 0.05 0 ± 0 0 ± 0

C. cupressoides 0.1 0 ± 0 0 ± 0 0.25 0 ± 0 0 ± 0 0.5 0 ± 0 0 ± 0 0.05 0 ± 0 0 ± 0

C. prolifera 0.1 0 ± 0 0 ± 0 0.25 0 ± 0 0 ± 0 0.5 0 ± 0 0 ± 0 0.05 4.5 ± 2.4 13.8 ± 1.0

C. sertularioides 0.1 8.4 ± 9.0 17.8 ± 0.3 0.25 9.0 ± 1.8 21.0 ± 2.7 0.5 11.8 ± 0.5 23.3 ± 0.5 0.05 0 ± 0 0 ± 0

C. isthmocladum 0.1 0 ± 0 0 ± 0 0.25 0 ± 0 0 ± 0 0.5 0 ± 0 0 ± 0 0.05 11.6 ± 1,7 28,9 ± 3,8

Ácido gálico 0.1 43.6 ± 2.4 41.8 ± 4.7 0.25 64.3 ± 3.0 72.1 ± 2.9 0.5 93.7 ± 3.7 86.3 ± 3.1

Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5)

Os extratos polissacarídicos obtidos das macroalgas marinhas coletadas no

litoral do Rio Grande do Norte foram avaliados quanto à capacidade de quelar íons

ferro (Figura 10). Os resultados revelaram que neste ensaio, apenas os extratos

polissacarídicos das algas S. filipendula, S. schröederi e C. isthmocladum não

apresentaram capacidade quelante significante. Todos os outros extratos

apresentaram atividade de forma dose dependente. O extrato da rodophyta G.

caudata apresentou atividade de 40,2% a 1,5 mg/mL. Dentre as algas marrons

destacam-se os extratos de D. cervicornis e D. mertensis que apresentaram

atividades quelantes de 46,1% e 43,3% (concentração de 2,0 mg/mL). Por fim, os

extratos polissacarídicos das chlorophytas C. prolifera e C. sertularioides

apresentaram as mais significantes atividades (69,9% e 57,8%, respectivamente, na

concentração de 2,0 mg/mL).

63

RESULTADOS


Figura 10. Atividade de Quelação férrica dos extratos polissacarídicos. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). a,b,c,d

Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre variadas concentrações de extrato polissacarídico individual.

64

RESULTADOS


O teste de poder redutor é expresso como atividade redutora equivalente,

calculado a partir da razão da atividade redutora encontrada para os compostos e

aquela encontrada para o ácido ascórbico na concentração de 0,2 mg/mL (Figura

11). A partir dos resultados podemos classificar a atividade dos extratos

polissacarídicos em três grupos claramente distintos: o primeiro grupo, com maior

potencial antioxidante, que inclui os extratos da alga C. sertularioides e todos os

extratos das algas marrons, com exceção de S. schröederi; o segundo grupo

incluindo extratos das algas S. schröederi, G. caudata e de todas as algas verdes

com moderada atividade redutora; e um terceiro grupo, composto pelo extrato de C.

isthmocladum, que não apresentou atividade significante. O extrato polissacaridico

da alga S. filipendula mostrou a mais potente atividade redutora equivalente, sendo

inclusive superior à atividade da vitamina C.

65

RESULTADOS


Figura 11. Atividade redutora equivalente de extratos polissacarídicos. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). O poder redutor é expresso como um percentual da atividade redutora de ácido ascórbico (0,2 mg/mL). a,b,c,d Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre concentrações de um mesmo extrato polissacarídico.

66

RESULTADOS


4.1.6. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DOS EXTRATOS POLISSACARÍDICOS

Outra atividade biológica avaliada dos extratos polissacarídicos foi seu efeito

frente a células tumorais HeLa. Os dados mostraram que todos os extratos

apresentaram atividade antiproliferativa dose-dependente (Figura 12) bem como

apresentaram excelente potencial antiproliferativo, já que a inibição da proliferação

variou de 36,4% (C. sertularioides) a 67,5% (S. filipendula). Quatro extratos

polissacarídicos (D. delicatula, D. menstruallis, S. filipendula e C. prolifera)

apresentaram atividade antiproliferativa superior a 50% nas concentrações testadas,

o que permitiu a determinação do IC50 para estas amostras: Os extratos de S.

filipendula e C. prolifera possuem o menor IC50 com valores de 0,23 e 0,25 mg/mL,

respectivamente. Por outro lado, os extratos de D. delicatula e D. menstruallis

apresentaram IC50 de 1,0 mg/mL

Figura 12. Atividade antiproliferativa dos extratos polissacarídicos frente a linhagem cellular HeLa após 72h de incubação. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=7). a,b,c,d Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre concentrações de um mesmo extrato polissacarídico.

67

RESULTADOS


4.1.7. SELEÇÃO DAS ALGAS PARA EXTRAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS

SULFATADOS.

O índice de potencial farmacológico das macroalgas marinhas coletadas no

litoral do Rio Grande do Norte é ilustrado na Tabela VIII. Dentre todas as algas

avaliadas neste trabalho destacam-se duas espécies de Phaeophyta, D. delicatula

(21 pontos) e S. filipendula (19 pontos), sendo estas escolhidas para terem os seus

polissacarídeos sulfatados avaliados nas demais etapas do trabalho.

Tabela VIII. Índice de potencial farmacológico dos polissacarídeos extraídos das macroalgas marinhas coletadas no litoral do Rio Grande do Norte

Rend- rendimento; Fac. Obtenção – facilidade de obtenção da alga; Antic.-atividade anticoagulante; CAT- capacidade antioxidante total; OH.- sequestro de radicais hidroxila; O-- sequestro de radicais superóxido; Quel. Fer.- quelação férrica; redut.- atividade redutora; antip.- atividade antiproliferativa; *- atividade anticoagulante não determinada. 1= resultado ruim; 2= resultado bom; 3= resultado ótimo.

Espécie Rend Fac.

obtenção Antic. CAT OH. O-

Quel. Fer.

Redut. Antip. TOTAL

D. cervicornis 1 1 3 2 1 2 2 3 2 17

D. delicatula 3 3 2 2 1 2 2 3 3 21

D. menstruallis 2 2 * 2 1 2 2 2 3 16

D. mertensis 3 2 1 2 1 1 2 2 2 16

S.filipendula 3 3 1 3 1 1 1 3 3 19

S. schröederi 3 2 * 1 1 1 1 1 2 12

G. caudata 3 2 1 3 1 1 2 1 2 16

C. cupresoides 1 3 2 2 1 1 2 1 2 15

C. prolifera 1 2 2 2 1 1 3 1 3 16

C. sertularioides 1 1 2 2 1 2 3 2 2 16

C. isthmocladum 2 2 2 1 1 1 1 1 2 13

68

RESULTADOS


4.2. Caracterização química e atividades biológicas de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marrom D. delicatula.

4.2.1. EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS

DA ALGA D. delicatula.

Utilizando uma metodologia que combina proteólise e fracionamento com

volumes crescentes de acetona foram obtidas seis frações ricas em polissacarídeos

sulfatados da alga D. delicatula denominados: DD-0,5v, DD-0,7v, DD-1,0v, DD-1,3v,

DD-1,5v e DD-2,0v.

Os polissacarídeos sulfatados foram secados e pesados para obtenção do

rendimento percentual individual (Figura 13). DD-0,5v apresentou o maior

rendimento representando 44% do total da soma do peso de todos os extratos

polissacarídicos. A contribuição percentual dos demais polissacarídeos, DD-0,7v,

DD-1,0v, DD-1,3v, DD-1,5v e DD-2,0v, representaram 28%, 11%, 7%, 5% e 5%,

respectivamente.

Figura 13. Rendimento percentual dos polissacarídeos sulfatados obtidos por precipitação com acetona, da alga marinha D. delicatula.

69

RESULTADOS


4.2.2. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS POLISSACARÍDEOS

SULFATADOS DA ALGA D. delicatula.

A determinação dos teores de açúcares totais e sulfato, bem como o grau de

contaminação por proteínas foram determinados por dosagens químicas. Com base

na Tabela IX é possível notar que todas as amostras são constituídas por

polissacarídeos sulfatados, confirmando o resultado obtido através da eletroforese

em gel de agarose. Com relação à dosagem de açúcares totais os polissacarídeos

sulfatados DD-0,5v e DD-0,7v apresentaram o maior percentual (69,1% e 70,0%,

respectivamente), ao passo que DD-1,5v apresentou somente 61,3% de açúcares

totais. Como já era esperado, todas as frações apresentaram sulfato em sua

composição, sendo DD-1,0v, o polissacarídeo com o maior teor de sulfato (19,0%).

O teor de contaminação protéica foi baixo para todas as frações

polissacarídicas, atingindo o máximo de 0,7% no polissacarídeo DD-2,0v e o mínimo

de 0,1% nos polissacarídeos DD-0.5v, DD-1.3v e DD-1.5v.

Tabela IX. Composição química de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga Dictyopteris delicatula

Frações polissacarídicas

Açúcares totais (%)

Sulfato (%)

Proteínas (%)

Razão molar

Fuc Gal Glc Man Xil Ac. glu

DD-0.5v 69,1 14,1 0,1 1,0 2,0 0,3 0,5 0,7 0,9

DD-0.7v 70,0 17,8 0,3 1,0 3,0 0,4 0,6 1,5 2,2

DD-1.0v 65,0 19,0 0,5 1,0 1,9 0,2 0,5 0,8 1,5

DD-1.3v 68,2 14,5 0,1 1,0 2,4 0,3 0,2 0,6 0,5

DD-1.5v 61,3 15,4 0,1 1,0 1,6 0,2 0,4 1,3 1,9

DD-2.0v 64,3 16,0 0,7 1,0 1,8 0,2 0,4 1,6 2,2

70

RESULTADOS


A Tabela IX também mostra a composição monossacarídica dos

polissacarídeos sulfatados de D. delicatula obtidos através de análise em HPLC. Por

se tratar de polissacarídeos sulfatados de algas marrons, a fucose foi utilizada como

referência para a determinação da razão molar. Todos os polissacarídeos são

constituídos por: fucose, galactose, glicose, manose, xilose e ácido glucurônico em

diferentes razões molares, mostrando que os polissacarídeos sulfatados da alga D.

delicatula são heterofucanas.

Os polissacarídeos sulfatados da alga D. delicatula foram submetidos a

eletroforese em gel de agarose, tampão PDA, visando uma caracterização preliminar

destes compostos (Figura 14). Com base no perfil eletroforético, pode-se observar a

presença de polissacarídeos sulfatados em todos os compostos, porém estes

apresentam uma distribuição não uniforme, com no mínimo três populações bem

definidas: uma de menor mobilidade, uma de mobilidade intermediária e uma de

maior mobilidade (Fucanas A, B e C, respectivamente). DD-0,5v e DD-0,7v são

constituídas por fucanas A, ao passo que DD-1,0v apresenta fucana A e fucana B.

DD-1,3v e DD-1,5v são constituídas por fucanas B e C enquanto DD-2,0v por fucana

C.

Figura 14. Perfil eletroforético dos polissacarídeos sulfatados de D. delicatula. Alíquotas de 5�l (50�g) dos polissacarídeos sulfatados foram aplicadas em lâminas de agarose em tampão PDA 0,05 M, pH 9,0. Após precipitação com CETAVLON as lâminas foram coradas com azul de toluidina. EXT- extrato polissacarídico de D. delicatula; 0,5-DD-0,5v; 0,7- DD-0,7v; 1,0- DD-1,0V; 1,3- DD-1,3V; 1,5- DD-1,5V; 2,0- DD-2,0V.

Fuc C

Fuc B

Fuc A

71

RESULTADOS


4.2.3. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS

DA ALGA D. delicatula.

A atividade anticoagulante das heterofucanas de D. delicatula foram avaliadas

através dos testes de PT e aPTT. Não foi observada inibição da formação de

coagulo no teste de PT para todas as heterofucanas nas condições testadas. Por

outro lado, aPTT foi prolongado por todos os polissacarídeos sulfatados de forma

dose dependente (Figura 15). DD-0,7v e DD-1,0v mostraram baixa atividade

anticoagulante enquanto DD-1,5v apresentou a atividade anticoagulante mais

potente com uma razão de aPTT de 3,8 na concentração de 0,4 mg/mL de plasma

sanguíneo. Quando comparada com a clexane®, nas mesmas condições, DD-1,5v

apresentou atividade anticoagulante similar (p>0,01)

Figura 15. Atividade anticoagulante das heterofucanas de D. delicatula. Dados são

expressos como média ± desvio padrão (n=3). A atividade anticoagulante é mostrada como a razão de aPTT, dada pela razão do tempo de coagulação da amostra teste pelo tempo de coagulação da amostra controle (solução salina). Hep- Heparina; Cle- Clexane® (Enoxaparina). aindica diferença significativa quando comparado com Clexane®; bindica razão de aPTT semelhante quando comparado com Clexane®.

72

RESULTADOS


4.2.4. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA

ALGA D. delicatula.

As heterofucanas da alga D. delicatula foram avaliadas quanto ao seu

potencial antioxidante nos cinco sistemas utilizados neste trabalho: Capacidade

antioxidante total, sequestro de radicais superóxido, sequestro de radicais hidroxila,

quelação férrica e poder redutor.

No ensaio de capacidade antioxidante total, que avalia a capacidade da

amostra de doar elétrons, todas as heterofucanas apresentaram atividade. Com

exceção de DD-2,0v, todas as outras heterofucanas apresentaram atividade

significativamente semelhantes, entre 30,0 (DD-0,7v) a 37,3 (DD-1,0v) equivalentes

de acido ascórbico (Figura 16).

Os resultados dos ensaios de sequestro de radicais hidroxila e superóxido

para as heterofucanas da alga D. delicatula são mostrados na tabela X. No teste de

sequestro de radicais superóxido, as heterofucanas DD-1,0v, DD-1,3v e DD-2,0v não

apresentaram atividade antioxidante, enquanto DD-0,5v e DD-0,7v apresentaram

baixa capacidade de sequestro destes radicais com atividade de 5,7% e 4,8%,

Figura 16. Capacidade antioxidante total de heterofucanas extraídas da alga D. delicatula. Os resultados são expressos como equivalentes de ácido ascórbico. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). *Única heterofucana a apresentar atividade significativamente distinta.

73

RESULTADOS


respectivamente, a 0,5 mg/mL. Por outro lado, DD-1,5v foi o único polissacarídeo a

apresentar uma moderada capacidade de sequestrar radicais superóxido (13,4% de

atividade na concentração de 0,5 mg/mL.

Para o ensaio de sequestro de radicais hidroxila, apenas as heterofucanas

DD-0,5v, DD-0,7v e DD-1,0v mostraram atividade antioxidante. Entretanto, estas

heterofucanas apresentaram uma capacidade relativamente baixa de sequestrar

radicais hidroxila, com atividades de 14,4%, 15,6% e 17,0%, respectivamente (0,5

mg/mL). O ácido gálico, nesta mesma concentração, apresentou atividade muito

superior, sequestrando 93,7% dos radicais superóxido.

Tabela X. Sequestro de radicais hidroxila e superóxido de heterofucanas da alga Dictyopteris delicatula.


Concentração Atividade (%)

(mg/mL) OH. O2-

0.05 6,1 ± 0.7 2,8 ± 2,1

DD-0.5v 0.1 9,6 ± 0.4 4,9 ± 3,1

0.25 11,0 ± 0.9 5,1 ± 3,4

0.5 14,4 ± 2.1 5,7 ± 4,0

0.05 0,5 ± 0.7 3,9 ± 0,3

DD-0.7v 0.1 12,4 ± 3.5 6,1 ± 0,9

0.25 13,4 ± 4.7 6,7 ± 3,1

0.5 15,6 ± 3.8 4,8 ± 2,4

0.05 6,6 ± 3.1 0 ± 0

DD-1.0v 0.1 12,7 ± 2.9 0 ± 0

0.25 16,9 ± 2.2 0 ± 0

0.5 17,0 ± 3.4 0 ± 0

0.05 0 ± 0 0 ± 0

DD-1.3v 0.1 0 ± 0 0 ± 0

0.25 0 ± 0 0 ± 0

0.5 0 ± 0 0 ± 0

0.05 0 ± 0 3,9 ± 2,1

DD-1.5v 0.1 0 ± 0 4,9 ± 3,1

0.25 0 ± 0 9,6 ± 3,4

0.5 0 ± 0 13,4 ± 2,1

0.05 0 ± 0 0 ± 0

DD-2.0v 0.1 0 ± 0 0 ± 0

74

RESULTADOS


0.25 0 ± 0 0 ± 0

0.5 0 ± 0 0 ± 0

0.05 11,6 ± 1,7 28,9 ± 3,8

Àcido gálico 0.1 43,6 ± 2,4 41,8 ± 4,7

0.25 64,3 ± 3,0 72,1 ± 2,9

0.5 93,7 ± 3,7 86,3 ± 3,1 Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5)

As heterofucanas da alga D. delicatula também foram avaliadas quanto a

capacidade de quelar íons ferro (Figura 17). Os resultados mostram que DD-1,3v

não apresentou atividade significativa, enquanto as heterofucanas DD-1,5v e DD-

2,0v apresentaram baixo potencial quelante. A heterofucana mais ativa foi DD-0,5v

com atividade quelante de 45,5% na concentração de 1,5 mg/mL. Esta atividade foi

apenas 1,8 vezes menor que o composto de referência, o EDTA, nas mesmas

condições testadas.

Figura 17. Atividade de Quelação férrica de heterofucanas da alga D. delicatula. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). a,b,c,d Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre concentrações semelhantes de diferentes heterofucanas.

75

RESULTADOS


O poder redutor das heterofucanas está expresso como atividade redutora

equivalente. Os resultados são mostrados na Figura 18. As heterofucanas DD-0,5v,

DD-0,7v e DD-2,0v mostraram uma atividade antioxidante extremamente baixa. Por

outro lado, DD-1,0v, DD-1,3v e DD-1,5v apresentaram atividade redutora

considerável, com destaque para a heterofucana DD-1,3v com atividade redutora

equivalente de 0,53 (0,5 mg/mL).

Figura 18. Atividade redutora equivalente de heterofucanas da alga D. delicatula. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). O poder redutor é expresso como um percentual da atividade redutora de ácido ascórbico (0,2 mg/mL). a,b,c,d Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre concentrações de uma heterofucana individual.

76

RESULTADOS


4.2.5. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS

DA ALGA D. delicatula

A viabilidade de células HeLa incubadas por 72 h com as heterofucanas de D.

delicatula foi determinada (Figura 19A). A partir dos resultados, podemos dividir as

heterofucanas em três grupos quanto o potencial antiproliferativo frente às células

HeLa: DD-0,5v e DD-2,0v com baixo potencial antiproliferativo (28,4% e 20,3%,

respectivamente); DD-1,0v e DD-1,5v com potencial antiproliferativo moderado

(50,5% e 47,5%, respectivamente); DD-0,7v e DD-1,3v com alto potencial

antiproliferativo. Estas últimas heterofucanas, classificadas dentro do grupo com alto

potencial antiproliferativo, apresentam curvas de atividade distintas. Pode-se

perceber que DD-0,7v apresenta alta inibição da proliferação de células HeLa em

baixas concentrações (0,1 e 0,5 mg/mL) atingindo rapidamente um platô de

atividade. Por outro lado, DD-1,3v apresenta baixa atividade em baixas

concentrações e alta atividade em concentrações maiores, chegando a matar cerca

de 90% das células tumorais na concentração de 2,0 mg/mL.

Entretanto, quando desafiados frente à linhagem celular não tumoral murina

pré-osteoblástica (MC3T3), os polissacarídeos sulfatados de D. delicatula

apresentam alto potencial antiproliferativo, especialmente DD-1,3v e DD-1,5v, que

chegaram a inibir a proliferação de 92,3% e 99,2% das células MC3T3 na

concentração de 2,0 mg/mL (Figura 19B).

77

RESULTADOS


Figura 19. Atividade antiproliferativa de heterofucanas da alga D. delicatula. (A) Heterofucanas X HeLa (B) Heterofucanas X MC3T3. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=7). a,b,c, Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre concentrações semelhantes de diferentes heterofucanas; *Não apresenta atividade antiproliferativa significante quando comparado com o controle sem tratamento (p<0,01).

78

RESULTADOS


4.3. Caracterização química e atividades biológicas de polissacarídeos sulfatados extraídos da alga marrom S. filipendula

4.3.1. EXTRAÇÃO E FRACIONAMENTO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS

DA ALGA S. filipendula

Seguindo a metodologia de extração e fracionamento descrita em Materiais e

métodos, foram obtidas cinco frações ricas em polissacarídeos sulfatados da alga S.

filipendula denominados: SF-0,5v, SF-0,7v, SF-1,0v, SF-1,5v, SF-2,0v. A Figura 20

mostra o rendimento percentual de cada polissacarídeo individual com relação a

massa total dos polissacarídeos. Os maiores rendimentos foram obtidos para os

polissacarídeos sulfatados SF-0,5v e SF-1,5v, com 33% e 34% da massa total. Em

seguida podemos destacar que SF-0,7v, SF-1,0v e SF-2,0v apresentaram

rendimentos semelhantes com 15%, 15% e 13%, respectivamente.

Figura 20. Rendimento percentual dos polissacarídeos sulfatados obtidos por precipitação com acetona, da alga marinha D. delicatula.

79

RESULTADOS


4.3.2. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DOS POLISSACARÍDEOS

SULFATADOS DA ALGA S. filipendula

A composição química dos polissacarídeos sulfatados da alga S. filipendula é

sumarizada na Tabela XI. O percentual de açucares totais e sulfato aumentou de

acordo com o aumento do volume de acetona utilizado para precipitar os diferentes

polissacarídeos sulfatados. Logo, SF-2,0v apresentou o maior percentual de

açúcares totais (66,0%) e sulfato (17,7%) e SF-0,5v apresentou os menores

percentuais (41,4% de açúcares totais e 10,2% de sulfato) dentre todos os

polissacarídeos obtidos. Ainda, destacamos que o percentual de contaminação

protéica foi baixo, variando de 0,2 (SF-1.5v) a 0,6% (SF-1.5v).

No que diz respeito à composição monossacarídica, os polissacarídeos

sulfatados de S. filipendula apresentaram fucose, galactose, glicose, manose, xilose

e acido glucurônico em diferentes proporções, com exceção de manose e acido

glucurônico que não foram encontrados nos polissacarídeos SF-1,5v e SF-2,0v,

respectivamente. Esses dados mostram que todos os polissacarídeos sulfatados de

S. filipendula são heterofucanas, especificamente galactofucanas, já que estes

monossacarídeos (galactose e fucose) estão presentes em maior quantidade.

Tabela XI. Composição química dos polissacarídeos sulfatados extraídos da alga Sargassum filipendula


Açúcares Totais

(%)

Sulfato (%)

Proteína (%)

Razão molar

Fuc Gal Gli Man Xil Ac. gluc

SF-0.5v 41.4 10.2 0.6 1.0 1.5 0.5 0.4 1.0 1.1

SF-0.7v 46.2 10.8 0.5 1.0 1.2 0.7 0.2 0.7 0.7

SF-1.0v 59.1 12.6 0.3 1.0 1.3 0.5 0.1 0.3 0.7

SF-1.5v 64.9 12.3 0.2 1.0 1.1 0.3 - 0.1 0.5

SF-2.0v 66.0 17.7 0.4 1.0 2.2 0.5 0.6 0.2 -

Fuc: fucose; ac. gluc: ácido glucurônico; Gal: galactose; Xil: xilose; Man: manose; Gli: glicose; - traços; n.d - não detectado.

80

RESULTADOS


A caracterização físico-química dos polissacarídeos sulfatados da alga S.

filipendula foi determinada através de eletroforese em gel de agarose (tampão PDA),

dosagens químicas de açúcares totais, sulfato e proteínas e quantificação

monossacarídica.

O perfil eletroforético dos polissacarídeos sulfatados de S. filipendula é

mostrado na Figura 21. Podemos observar, que com exceção de SF-2,0v, todos os

outros polissacarídeos mostraram-se polidispersos, não foi possível identificar

bandas como observado com D. delicatula, com exceção da banda referente a

fucana C encontrada em SF-2,0v.

Figura 21. Perfil eletroforético dos polissacarídeos sulfatados de S. filipendula. Alíquotas de 5�l (50�g) dos polissacarídeos sulfatados foram aplicadas em lâminas de agarose em tampão PDA 0,05 M, pH 9,0. Após precipitação com CETAVLON as lâminas foram coradas com azul de toluidina. EXT- extrato polissacarídico de D. delicatula; 0,5v- SF-0,5v; 0,7v- SF-0,7v; 1,0v- SF-1,0V; 1,5v- SF-1,5V; 2,0v- SF-2,0V.

Fuc C

81

RESULTADOS


4.3.3. ATIVIDADE ANTICOAGULANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS

DA ALGA S. filipendula

Os polissacarídeos sulfatados da alga S. filipendula foram submetidas aos

testes de aPTT e PT. Em todas as concentrações testadas (0,1; 0,5; 2 mg/mL),

nenhum polissacarídeo alterou o tempo de coagulação em comparação ao controle

salino, tanto para o teste de aPTT quanto para o teste de PT (tabela XII). Esse

resultado mostra a ausência de potencial anticoagulante dos polissacarídeos

sulfatados da alga S. filipendula.

Tabela XII. Tempo de coagulação das frações polissacarídicas da alga S. filipendula


Concentração

(mg/mL)

Ensaios

aPTT (s) PT (s)

Controle 28,8 ± 3,2 10,9 ± 1,0

SF-0,5v

0,1 mg/mL 29,3 ± 3,2 11,4 ± 0,5

1,0 mg/mL 27,8 ± 0,4 10,8 ± 1,8

2,0 mg/mL 27,4 ± 3,8 10,3 ± 1,9

SF-0,7v

0,1 mg/mL 29,5 ±1,7 11,4 ± 0,4

1,0 mg/mL 27,8 ± 2,5 12,7± 2,1

2,0 mg/mL 28,4 ± 2,1 10,5 ± 2,3

SF-1,0v

0,1 mg/mL 29,5 ±1,7 11,4 ± 0,4

1,0 mg/mL 27,8 ± 2,5 12,7± 2,1

2,0 mg/mL 28,4 ± 2,1 10,5 ± 2,3

SF-1,5v

0,1 mg/mL 26,4 ±1,8 10,8 ± 0,4

1,0 mg/mL 29,8 ± 2,1 11,4± 2,1

2,0 mg/mL 24,4 ± 4,0 11,6 ± 2,3

SF-2,0v

0,1 mg/mL 25,9± 4,1 13,8 ± 3,0

1,0 mg/mL 29,0± 3,5 12,5 ± 4,1

2,0 mg/mL 25,8 ± 2,8 12,4 ± 1,9

Heparina não fracionada 0,1 mg/mL >240 >120

Clexane® 0,1 mg/mL 66,2 ± 2,5 39,9 ± 0,7

82

RESULTADOS


4.3.4. ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS DA

ALGA S. filipendula

Os polissacarídeos sulfatados da alga S. filipendula foram submetidas aos

ensaios antioxidantes: Capacidade antioxidante total, Sequestro de radicais

superóxido e hidroxila, quelação férrica e poder redutor.

Todas as heterofucanas aqui avaliadas apresentaram atividade para o teste

de capacidade antioxidante total (Figura 22). SF-2,0v mostrou o menor potencial

com 9,6 equivalentes de ácido ascórbico. Entretanto, todas as outras amostras

apresentaram atividades significantes, com destaque para as heterofucanas SF-0,7v

(77,3 equivalentes de ácido ascórbico) e SF-1,0v (90,7 equivalentes de ácido

ascórbico).

Os resultados encontrados para a inibição dos radicais superóxido e hidroxila

pelas heterofucanas de S. filipendula estão sumarizados na Tabela XIII. As

heterofucanas SF-0.7v, SF-1.0v, and SF-1.5v apresentaram atividade no ensaio de

sequestro de radicais hidroxila, com percentual de inibição de 23,0%, 26,7%, e

Figura 22. Capacidade antioxidante total de heterofucanas extraídas da alga S.filipendula. Os resultados são expressos como equivalentes de ácido ascórbico. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). Todos as heterofucanas apresentaram atividades significantemente diferentes entre si (p<0,01).

83

RESULTADOS


12,7%, respectivamente, enquanto o resultado encontrado para o ácido gálico foi de

93,7% para a concentração de 0,5 mg/mL. Já para o sequestro de radicais

superóxido, novamente SF-0,7v apresentou a mais potente atividade antioxidante

(19,3%) seguida apenas por SF-2,0v (16,9%) na concentração de 0,5 mg/mL.

Tabela XIII. Atividade sequestradora de radicais superóxido e hidroxila dos polissacarídeos sulfatados extraídos da alga Sargassum filipendula.

Frações

polissacarídicas Concentração

(mg/mL)

Atividade (%)

OH˙ O2-

SF-0.5v

0,05 0 ± 0 0 ± 0 0,10 0 ± 0 0 ± 0 0,25 0 ± 0 0 ± 0 0,50 0 ± 0 0 ± 0

SF-0.7v

0,05 5,3 ± 3,5a 11,1 ± 0,4a 0,10 15,8 ± 2,9b 14,2 ± 0,4b 0,25 23,0 ± 1,5c 16,3 ± 0,6b 0,50 26,2 ± 1,8c 19,3 ± 0,7b

SF-1.0v

0,05 10,8 ± 2,2a 0 ± 0 0,10 17,1 ± 2,9b 0 ± 0 0,25 22,5 ± 1,5c 0 ± 0 0,50 26,7 ± 1,8c 0 ± 0

SF-1.5v

0,05 4,9 ± 0,9a 0 ± 0 0,10 9,2 ± 0,7b 0 ± 0 0,25 12,4 ± 1,5b 0 ± 0 0,50 12,7 ± 4,8b 0 ± 0

SF-2.0v

0,05 0 ± 0 0 ± 0 0,10 0 ± 0 5,0 ± 0,7a 0,25 0 ± 0 9,0 ± 1,1b 0,50 0 ± 0 12,2 ± 1,2b

Ácido gálico

0,05 11,6 ± 1,7a 28,9 ± 3,8a 0,10 43,6 ± 2,4b 41,8 ± 4,7b 0,25 64,3 ± 3,0c 72,1 ± 2,9c 0,50 93,7 ± 3,7d 86,3 ± 3,1d

a,b,c,d Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre cada concentração do mesmo polissacarídeo sulfatado. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5)

No ensaio de quelação férrica, todas as heterofucanas apresentaram

atividade antioxidante (Figura 23). Destaque para SF-2,0v, que apresentou o maior

potencial para este ensaio, enquanto todos os demais polissacarídeos sulfatados

84

RESULTADOS


obtiveram atividades significativamente similares (p<0,01). A atividade observada

para SF-2,0v (54,8% à 2,0 mg/mL) é apenas 1,7 vezes menor do que a do controle

positivo, o EDTA, que mostrou atividade de 93,2% em condições semelhantes.

Figura 23. Atividade de Quelação férrica de heterofucanas da alga S. filipendula. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). *Diferença significativa (p < 0.01) quando comparada as mesma concentração de heterofucanas distintas.

85

RESULTADOS


O poder redutor das heterofucanas de S. filipendula é expresso como

atividade redutora equivalente (Figura 24). As heterofucanas mostraram

considerável potencial antioxidante neste ensaio, com atividades variando de 0,55

(SF-0,7v) a 0,93 (SF-2,0v) equivalentes, sendo esta última, significantemente similar

(p<0,01) à atividade encontrada para o ácido ascórbico (0,2 mg/mL).

Figura 24. Atividade redutora equivalente de heterofucanas da alga S. filipendula. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=5). O poder redutor é expresso como um percentual da atividade redutora de ácido ascórbico (0,2 mg/mL). a,b,c,d Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre concentrações semelhantes de diferentes heterofucanas.

86

RESULTADOS


4.3.5. ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS

DA ALGA S. filipendula.

As heterofucanas da alga S. filipendula foram avaliadas quanto ao potencial

antiproliferativo frente a linhagem tumoral HeLa (células tumorais de colon uterino

humano) e a linhagem normal pré-osteoblástica (MC3T3). As linhagens celulares

foram incubadas durante um período de 72h com as heterofucanas, e os resultados

são mostrados na Figura 25.

Pode-se observar que as células HeLa, foram foram inibidas de forma dose-

dependente por todas as frações polissacarídicas. SF-0,5v e SF-0,7v apresentaram

baixa atividade antiproliferativa com apenas 22,0% e 26,9% de inibição,

respectivamente. Por outro lado, as demais heterofucanas apresentaram excelente

potencial, com destaque para SF-1,5v, que apresentou a mais potente atividade

(p<0,01) inibindo 53,5% das células HeLa.

É interessante destacar, que apenas SF-0,5v e SF-2,0v inibiram o

crescimento da linhagem celular normal MC-3T3, enquanto os polissacarídeos

sulfatados SF0,7v, SF-1,0v e SF-1,5v não apresentaram inibição significativa quando

comparados com o controle sem tratamento.

87

RESULTADOS


Figura 25. Atividade antiproliferativa das heterofucanas da alga Sargassum filipendula. (A) Heterofucanas X HeLa. (B) Heterofucanas X MC3T3. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=7). a,b,c, Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre concentrações semelhantes de diferentes heterofucanas; *Não apresenta atividade antiproliferativa significante quando comparado com o controle sem tratamento (p<0,01).

88

RESULTADOS


4.4. Mecanismo de ação antiproliferativo da heterofucana SF-1,5v

4.4.1. SF-1,5v INDUZ APOPTOSE EM CÉLULAS HELA

Para dar continuidade a este estudo, o polissacarídeo sulfatado SF-1,5v foi

selecionado para determinação do(s) seu(s) possível(is) mecanismo(s) de ação

antitumoral frente a linhagem celular tumoral HeLa.

A atividade antiproliferativa da fração polissacarídica SF-1,5v frente à células

HeLa foi avaliada com o tempo de incubação de 24h, 48h e 72h (Figura 26). SF-1,5v

mostrou efeito dose e tempo dependente. A capacidade de SF-1,5v diminuir a

proliferação celular já foi observada no tempo de 24h (47,3% de inibição da

proliferação celular à 2,0 mg/mL), entretanto esta inibição foi potencializada após o

período de incubação de 72h (72,5% de inibição da proliferação celular).

Figura 26. Proliferação celular de células HeLa incubadas com SF-1,5v. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=7). a,b,c, Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0.01) entre diferentes tempos de uma concentração individual.

89

RESULTADOS


Após incubação de células HeLa com SF-1,5v por um período de 24h, a

presença de células apoptóticas foi quantificada através da técnica de citometria de

fluxo, logo após tratamento com anexina V-FITC (Figura 27). Após análise dos

resultados, podemos observar que o tratamento com SF-1,5v aumenta o percentual

de células Anexina+/PI-, que indica fase inicial de apoptose (19,8%) quando

comparadas ao controle sem tratamento (0,8% de células Anexina+/PI-).

4.4.2.INDUÇÃO DA APOPTOSE PELA HETEROFUCANA SF-1,5v EM CELULAS

HeLa É INDEPENDENTE DA ATIVAÇÃO DE CASPASES

As caspases (cysteine-dependent aspartate-specific proteases) apresentam

um papel chave na indução da apoptose, o que nos levou a avaliar se a indução da

apoptose por SF-1,5v é resultado da ativação de caspases, especificamente

caspase-3 e caspase-9, proteínas iniciadoras da via apoptótica dependente de

caspases. A ativação das caspases foi avaliada através da análise de Western blot

Figura 27. Heterofucana SF-1,5v induz apoptose de células HeLa. Células HeLa foram tratadas com 1,5 mg/mL de SF-1.5v. Anexina-/PI- (IE), células viáveis; Anexina+/PI- (ID), células em apoptose; Anexina+/PI+ (SD), células em estágio final de apoptoose. IE, quadrante inferior esquerdo; ID, Quadrante inferior direito; SD, Quadrante superior direito. Este FACS é representativo de três ensaios independentes.

90

RESULTADOS


(Figura 28A). Em resposta ao tratamento celular com SF-1,5v, não foi possível

observar alterações no conteúdo de pro-caspase-9 e pro-caspase-3, indicando desta

forma, ausência de ativação das pro-caspases analisadas.

Para excluir definitivamente a participação das caspases na indução da

apoptose pela heterofucana SF-1,5v, as células foram incubadas com SF-1,5v na

presença de z-VAD (50 mM), um inibidor específico de caspase. Em todas as

condições testadas, z-VAD+SF1,5v não influenciou na atividade antiproliferativa de

Sf-1,5v, indicando que ativação de caspase não é essencial para SF-1,5v induzir a

apoptose em células HeLa (Figura 28B).

Levando em consideração os resultados anteriores, que ativação de caspase

não é essencial para SF-1,5v induzir a apoptose em células HeLa, decidiu-se avaliar

outras proteínas envolvidas na indução da apoptose em vias independentes de

caspases: ERK, p38, p53, NFkB, pAKT e GSK. A Figura 29 mostra a análise da

sinalização celular induzida por SF-1,5v (24h de incubação) avaliada através de

western blot. Os resultados nos mostram que SF-1,5v não alterou a fosforilação das

proteínas ERK, p38, p53, pAKT e NF�B. Entretanto, podemos observar uma

Figura 28. Apoptose de células hela induzida pelo polissacarídeo sulfatado SF-1,5v não requer ativação de caspases. Western blot representativo de 3 experimentos independentes. (A) Efeito de SF-1.5v na regulação da caspase-9 e caspase-3. (B) Inibidor de Caspase z-VAD (50mM) não inibe a atividade antiproliferativa de SF-1,5v. Dados são expressos como média ± desvio padrão (n=7).

91

RESULTADOS


diminuição do conteúdo da proteína GSK fosforilada (glycogen synthase kinase-

beta) mostrando provavelmente que esta foi desfosforilada após tratamento com SF-

1,5v.

4.4.3.DETERMINAÇÃO DO PAPEL DE GSK NA INDUÇÃO DA APOPTOSE POR

SF-1,5v.

Para determinar o papel de GSK na indução da apoptose pela heterofucana

SF-1,5v, células HeLa foram tratadas com cloreto de litium (10mM), um inibidor

especifico de GSK. Em seguida, as células foram incubadas com SF-1,5v por 24h, e

a análise dos resultados foi feita através de citometria de fluxo (Figura 30).

Os resultados mostram que células tratadas com SF-1,5v e cloreto de lítio

apresentaram o percentual de células apoptóticas (24,0%) similar ao das células

tratadas apenas com a heterofucana (22,2%), indicando que o cloreto de litium não

alterou a apoptose induzida por SF-1,5v.

Figura 29. Análise da sinalização intracelular da heterofucana SF-1,5v por western blot.Células HeLa foram tratadas com 1,5 mg/mL de SF-1.5v por 24h. Fosforilação de ERK, p38, p53, NF�B, Akt, and GSK foi analisada através de anticorpos específicos. Western blot representativo de 3 experimentos independentes..

92

RESULTADOS


4.4.4. SF-1,5v INDUZ A LIBERAÇÃO DE NÍVEIS ELEVADOS DE FATOR INDUTOR

DE APOPTOSE (AIF) NO CITOPLASMA

A influência de SF-1,5v na concentração de AIF citosólico avaliada através de

western blot é mostrada na Figura 31. É possível observar que os níveis citosólicos

de AIF são aumentados após o tratamento com a heterofucana, indicando que a

liberação mitocondrial de AIF no citoplasma é o principal mecanismo de morte

celular para o composto estudado.

Como as proteínas Bcl-2 e Bax, apresentam papel chave na liberação de AIF,

estas também foram avaliadas quanto a influencia de SF-1,5v em suas

concentrações. A análise dos resultados mostra, que de forma tempo dependente,

ocorre a supressão da expressão de Bcl-2, ao passo que os níveis de Bax

aumentaram em células tratadas, confirmando a ativação da via mitocondrial de

apoptose pela heterofucana SF-1,5v.

Figura 30. Ativação de GSK não é essencial para apoptose induzida pela heterofucana SF-1.5v. Células HeLa foram previamente tratadas com Cloreto de litium (LiCl) por 1h, seguida de incubação com 1.5 mg/mL of SF-1,5v por 24 hr. Annexin-/PI- (IE), células viáveis; Annexin+/PI- (ID), células em apoptose; Annexin+/PI+ (SD), células em estágio final de apoptose. IE, quadrante inferior esquerdo; ID, Quadrante inferior direito; SD, Quadrante superior direito. Este FACS é representativo de três ensaios independentes.

93

RESULTADOS


Figura 31. Análise da expressão de AIF, Bax and Bcl-2 na presença de SF-1.5v. Células HeLa foram tratadas com 1.5 mg/mL de SF-1.5v por 0, 6, 12, 18 e 24 hr. Níveis de AIF, Bax e Bcl-2 liberados no citosol foi analisado por western blot usando anticorpos anti-AIF, anti-Bax ou anti-Bcl-2 como descrito em materiais e métodos. *tempo de incubação; **razão da massa de proteínas totais em cada tempo de incubação com relação a massa protéica no tempo de incubação de 0h.

*

**

**

**

DISCUSSÃO

Costa, L.S. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica/UFRN

94

5 – DISCUSSÃO 5.1. Bioprospecção de polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas

marinhas.

Diversos trabalhos vêm relatando a extração e caracterização de

polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas marinhas com atividades

anticoagulante, antioxidante e/ou antiproliferativa (HAYAKAWA et al., 2000,

BERTEAU & MULLOY, 2003, ZHANG et al., 2003a, ALBUQUERQUE et al., 2004,

ALEKSEYENKO et al., 2007, CIANCIA et al., 2007, SOUZA et al., 2007, LINS et al.,

2009, CIANCIA et al., 2010, HU et al., 2010). No estado do Rio Grande do Norte há

registro de mais de cem diferentes espécies de macroalgas marinhas, entretanto,

poucas algas tiveram seus polissacarídeos avaliados no que diz respeito à

descoberta de polímeros com atividades biológicas, o que não se justifica, pois cada

alga apresenta pelo menos um polissacarídeo sulfatado inerente a sua espécie, não

encontrado em outras espécies, e, portanto, pode possuis atividades farmacológicas

diferentes e/ou mais potentes do que outros compostos. Então, o isolamento de um

novo polissacarídeo sulfatado de macroalgas marinhas traz sempre novas

perspectivas de descoberta de um novo fármaco, bem como um maior

desenvolvimento econômico para aquelas comunidades que já cultivam algas, por

inserir uma maior diversidade de produtos, e por inserir, possivelmente, um produto

de maior valor agregado.

Diante deste contexto, foram coletadas onze diferentes espécies de

macroalgas marinhas do litoral do Rio Grande do Norte (Tabela IV) entre os anos de

2008 a 2011, tendo como critério de escolha a abundância da alga no local da coleta

e a facilidade de obtenção da mesma. Extratos ricos em polissacarídeos sulfatados

foram extraídos de cada alga e estes foram avaliados quanto ao potencial

anticoagulante, antioxidante e antiproliferativo.

Após a obtenção dos extratos ricos em polissacarídeos sulfatados, o

rendimento percentual em relação ao peso seco da alga foi calculado. Verificou-se

que a alga vermelha G. caudata apresentou o maior rendimento dentre todas as

algas. Entretanto, é interessante destacar que, com exceção da alga D. cervicornis,

todas as algas marrons apresentaram um rendimento maior quando comparadas às

algas verdes (Figura 7). A princípio, este resultado (algas marrons rendem mais

polissacarídeos sulfatados do que algas verdes) parece ser representativo para os

DISCUSSÃO


95

polissacarídeos sulfatados extraídos de macroalgas marinhas, entretanto são

necessários mais dados que sustentem esta afirmativa, já que a grande maioria dos

trabalhos encontrados na literatura não apresenta os resultados sobre o rendimento

dos polissacarídeos sulfatados com relação ao peso seco da alga. O alto

rendimento de polissacarídeos sulfatados encontrado aqui para G. caudata e para

as algas marrons facilita o desenvolvimento de estudos que requerem uma grande

quantidade de material, como a caracterização química e a análise de atividades

biológicas e/ou futuramente o uso em larga escala nas indústrias.

Para verificar e confirmar a presença de polissacarídeos sulfatados, os

extratos foram submetidos à técnica de eletroforese em gel de agarose em tampão

PDA (Figura 8). Neste sistema, os polissacarídeos interagem com a diamina em

função da conformação e distribuição dos grupamentos sulfatos, sendo que, aqueles

polissacarídeos que mais interagem com a diamina, passam a apresentar uma

menor mobilidade eletroforética, e aqueles que apresentam menor interação

mostram maior mobilidade. (DIETRICH & DIETRICH, 1976).

A partir do perfil eletroforético dos extratos verificou-se a existência de

polissacarídeos sulfatados em todas as algas analisadas. Quanto a distribuição,

esse perfil se mostrou polidisperso para maioria das algas estudadas, destacando-se

uma ou mais banda eletroforética, com exceção do extrato polissacarídico de G.

caudata, que apresenta apenas uma única banda eletroforética. Este perfil

polidisperso pode ser explicado pela presença de mais de uma população de

polissacarídeos sulfatados encontrados nos extratos, o que está de acordo com a

literatura. Estudos que utilizaram a metodologia aplicada nesse trabalho

demonstraram que cada espécie de alga marinha avaliada apresenta em sua

constituição pelo menos duas populações de polissacarídeos sulfatados observadas

através da técnica de eletroforese em gel de agarose (DIETRICH et al., 1995, LEITE

et al., 1998a, ALVES, 2000, ALBUQUERQUE et al., 2004, FARIAS, 2005, FARIAS,

2006, COSTA, 2008).

Depois de confirmada a presença de polissacarídeos sulfatados em todos os

extratos, estes foram avaliados quanto ao potencial farmacológico. A atividade

anticoagulante é a atividade mais bem caracterizada para os polissacarídeos de

macroalgas marinhas (NIKAPITIYA et al., 2007, CHANDIA & MATSUHIRO, 2008,

MEDEIROS et al., 2008, CIANCIA et al., 2010, JIAO et al., 2011). Esta atividade é

mensurada principalmente através da utilização de kits comercias de aPTT e PT que

DISCUSSÃO


96

avaliam a via intrínseca e extrínseca da coagulação, respectivamente. Os extratos

ricos em polissacarídeos sulfatados das algas S. schröederi e D. menstruallis não

tiveram suas atividades anticoagulantes avaliadas neste trabalho, já que estes já

tinham sido avaliados em trabalhos anteriores do grupo (LEITE et al., 1998,

ALBUQUERQUE et al., 2004, ROCHA et al., 2005c).

O extrato rico em polissacarídeo sulfatado obtido de D. cervicornis foi o mais

potente anticoagulante, seguido por D. delicatula, D. mertensis, C. prolifera e C.

Isthmocladum (Tabela VI). Esta ordem de atividade anticoagulante não apresenta

nenhuma correlação com a razão sulfato/açucares totais (R2= 0,059) mostrada na

tabela V. Corroborando com nossos resultados, diversos trabalhos encontrados na

literatura mostram que a atividade anticoagulante não é meramente uma

consequência de densidade de cargas, mas provavelmente, este efeito depende da

presença de regiões com variáveis padrões de sulfatação nos polissacarídeos

sulfatados (CHEVOLOT et al., 1999, FARIAS et al., 2000, PEREIRA et al., 2002,

PEREIRA et al., 2005, ROCHA et al., 2006). Por sua vez, os extratos de S.

filipendula e G. caudata não apresentaram atividade anticoagulante em nenhuma

das condições testadas. A ausência de atividade anticoagulante pelos

polissacarídeos sulfatados leva a hipótese de que apesar destes apresentarem

sulfato em sua constituição, provavelmente não apresentam uma estrutura favorável

á interação destes com proteínas envolvidas no processo de coagulação e, portanto

não apresentam atividade anticoagulante.

Recentemente, vários polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas

têm sido descritos como possuidores de atividade antioxidante (CHANDINI et al.,

2008, WANG et al., 2008, LIM & RYU, 2009, HU et al., 2010, JIAO et al., 2011).

Neste trabalho, o potencial antioxidante dos polissacarídeos sulfatados de

macroalgas marinhas foi avaliado através de cinco ensaios específicos já bem

estabelecidos pelo grupo de pesquisa em que se insere este trabalho: Capacidade

antioxidante total (CAT), sequestro de radicais superóxido, sequestro de radicais

hidroxila, quelação férrica e poder redutor.

O CAT avalia o potencial antioxidante através da formação do complexo

fosfato-molibidato observado pela mudança de coloração de amarelo para roxo-

azulado (PRIETO et al., 1999). CAT é expressa como o número de equivalentes de

ácido ascórbico (mg por cada grama de polissacarídeo sulfatado). Todos os extratos

ricos em polissacarídeos sulfatados apresentaram atividade antioxidante para o

DISCUSSÃO


97

ensaio de CAT, que variou de 9,2 (C. isthmocladum) a 53,9 mg/g de acido ascórbico

equivalentes (G. Caudata) (Figura 9). Estudos mostram que moléculas bioativas que

apresentam potencial antioxidante no ensaio de CAT, provavelmente possuem

atividade antioxidante através de uma gama de mecanismos diferentes,

especialmente sequestrando radicais superóxido e hidroxila, espécies reativas do

metabolismo do oxigênio (ZHANG et al., 2004, CAMARA et al., 2011). Ainda, os

resultados apresentados pelos extratos avaliados podem ser considerados

significativos, já que o valor de 9,2 equivalentes de ácido ascórbico encontrado para

o extrato menos potente, é considerado alto por alguns autores. Como exemplo

disso, Kumar et al (2008) obteve extratos das algas Padina tetrastomatica e

Turbinaria conoides com atividade antioxidante alta, apresentando 9,79 e 9,65

equivalentes de ácido ascórbico (KUMAR et al., 2008).

A partir da Tabela VII, pode-se analisar os resultados da capacidade de

sequestro de radicais hidroxila e superóxido pelos extratos ricos em polissacarídeos

sulfatados. Neste estudo, apenas cinco extratos apresentaram atividade antioxidante

através do sequestro de radicais superóxido, com destaque para D. delicatula, com

uma atividade de 32,5% à 0,5 mg/mL. Alguns trabalhos mostram polissacarídeos

sulfatados de macroalgas marinhas agindo através do sequestro de radicais

superóxido. Um extrato obtido de Eklonia kava apresentou alta capacidade de

sequestro de superóxido (65%) na mesma concentração citada para D. delicatula

(ATHUKORALA et al., 2006) e fucoidans extraídas de Laminaria japonica e ulvanas

extraídas da alga verde Ulva pertusa, mostraram potencial sequestrador superior ao

encontrado para a vitamina C, um composto utilizado como referência neste ensaio

(QI et al., 2005, WANG et al., 2008). Fica claro, a partir destes resultados, que os

extratos aqui analisados desempenham atividade antioxidante através de outros

mecanismos diferentes do sequestro de radicais superóxido.

Adicionalmente, alguns trabalhos mostram que o sequestro de radicais

superóxido pelos polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas é dependente

do teor de sulfato, ou seja, quanto mais sulfatado o polissacarídeo maior é a sua

capacidade de sequestro de radicais superóxido (ZHANG et al., 2003b, SOUZA et

al., 2007, WANG et al., 2008). Os resultados encontrados neste trabalho não

mostram nenhuma correlação entre sulfato e sequestro de radicais, indicando que o

potencial antioxidante do polissacarídeo sulfatado é dependente de um padrão de

DISCUSSÃO


98

distribuição de grupamentos sulfato no polissacarídeo sulfatado, e não apenas um

efeito da densidade de carga.

O radical hidroxila necessita de poucos milissegundos para reagir com

moléculas biológicas, o que torna quase inviável o combate deste após sua

formação pelo organismo (FERREIRA & MATSUBARA, 1997). Portanto, tem sido

dada muito mais atenção a compostos que impedem a formação do radical hidroxila

do que aqueles que promovem o seu sequestro, e dentre estes se destaca o íon

ferro, que reagindo com o peróxido de hidrogênio (H2O2), numa reação conhecida

como reação de Fenton, é responsável pela maior parte do radical hidroxila formado

nos sistemas biológicos (HALLIWELL B & GUTTERIDGE, 1986, AUST & MILLER,

1991). Neste estudo, todos os extratos apresentaram atividade sequestradora de

radicais hidroxila insignificante (Tabela VII), entretanto, oito extratos mostraram

excelente potencial antioxidante no ensaio de quelação férrica (Figura 10). Esse

achado é extremamente interessante, já que alguns trabalhos mostram que, para

compostos que são utilizados na terapia antioxidante, dentre os vários mecanismos

de ação considerados essenciais, destaca-se o mecanismo de quelação de traços

de íons ferro que catalisam a reação de formação de radical hidroxila (FERREIRA &

MATSUBARA, 1997, CUZZOCREA et al., 2001). Desta forma, estes polissacarídeos

sulfatados, com destaque para G. caudata, aparecem como promissores compostos

na terapia antioxidante, tanto para uso farmacológico, bem como para a utilização

em indústrias de cosméticos e alimentos.

O ensaio de poder redutor é também considerado um teste de avaliação

antioxidante na medida em que avalia a capacidade da amostrar em doar elétrons,

estabilizando os radicais livres formados. O resultado é expresso como atividade

redutora equivalente, calculado como um percentual da atividade redutora

encontrada para os extratos polissacarídicos em relação à atividade do ácido

ascórbico na concentração de 0,2 mg/mL (Figura 11). Os resultados mostraram que

apenas o extrato de C. isthmocladum não apresentou atividade significante. Por

outro lado, os polissacarídeos sulfatados mais potentes como agentes redutores

concentram-se nas algas marrons, com potencial redutor similar ao composto de

referência utilizado neste ensaio, o ácido ascórbico. Existem poucos relatos de

atividades redutoras de polissacarídeos sulfatados, e, além disso, não existe uma

padronização quanto à forma de expressar os resultados, já que alguns autores

expressam os resultados apenas como valor da absorbância e outros autores como

DISCUSSÃO


99

percentual da atividade de um composto referência, na maioria das vezes o ácido

ascórbico. Apenas dois trabalhos permitem uma comparação com os resultados

encontrados neste estudo, e nestes, fucanas de L. japônica e ulvanas de U. pertusa

têm mostrado atividade redutora, entretanto estas foram menos potentes do que o

ácido ascórbico (QI et al., 2005; WANG et al., 2008), o que mostra que os resultados

encontrados neste trabalho podem ser considerados bastante significativos,

especialmente aqueles encontrados para os extratos polissacarídicos das algas

marrons.

Os resultados quanto ao papel antioxidante das algas estudadas aqui

relatados foram bastante interessantes, pois indicam que as macroalgas marinhas

sintetizam polissacarídeos sulfatados com diferentes mecanismos antioxidantes.

Apesar de sua potência antioxidante não ter sido tão alta em alguns ensaios, deve

ser a somatória dos efeitos individuais desses polímeros que é utilizada como uma

estratégia de defesa da alga. Esta proporcionaria uma defesa mais eficiente frente

aos radicais livres em detrimento da síntese de polissacarídeos com alta atividade

antioxidante, mas que agiram apenas via um mecanismo.

Atividade antiproliferativa de polissacarídeos sulfatados tem sido

extensivamente reportada nos últimos anos. Ulvanas, polissacarídeos sulfatados

extraídos da alga verde U. lactuta inibe proliferação da linhagem celular CACO-2

(Adenocarcinoma de epitélio colo-retal humano) (KAEFFER et al., 1999). Fucanas

mostraram-se eficientes frente a varias linhagens tumorais, tais como HL60, uma

linhagem leucêmica humana (USUI et al., 1980), CT-26, linhagem tumoral de cólon

murino e células de sarcoma 180, uma linhagem tumoral de tecido conectivo de

camundongos (ATHUKORALA et al., 2006).

Neste trabalho todos os extratos mostraram potencial antiproliferativo frente a

células HeLa, uma linhagem celular tumoral de cólon de útero humano (Figura 12).

Novamente, nenhuma correlação foi encontrada entre a atividade antiproliferativa e

o teor de sulfato das amostras. Entretanto, quando para esta correlação leva-se

apenas em consideração aqueles extratos que apresentaram as maiores atividades

(C. prolifera, S. filipendula, D. delicatula e D. menstruallis) uma forte correlação pôde

ser encontrada (R2= 0.934). Esses dados indicam que o sulfato, por si só, não é o

principal fator responsável pela atividade antiproliferativa dos polissacarídeos

sulfatados, ou seja, nem sempre o polissacarídeo mais sulfatado apresenta a maior

atividade. A literatura mostra que a presença de sulfato é um requisito essencial para

DISCUSSÃO


100

o polissacarídeo sulfatado apresentar atividade biológica, entretanto outros fatores

também contribuem para uma melhor relação estrutura/atividades biológicas, como o

peso molecular, tipo de açúcar, tipo de ligação e padrão de ramificação do

polissacarídeo (HAROUN-BOUHEDJA et al., 2000, COSTA, 2005, ROCHA et al.,

2006, POMIN, 2009).

Ao fim de todo o processo de obtenção, caracterização química e avaliação

das atividades farmacológicas dos extratos ricos em polissacarídeo sulfatado

extraídos de algas coletadas no litoral do Rio Grande do Norte foi possível

desenvolver um banco de dados contendo informações relevantes acerca destas

biomoléculas. Essas informações estão resumidas na Tabela VIII. A fim de

classificar as algas quanto ao seu potencial de exploração cientifica foram levados

em consideração o rendimento dos polissacarídeos com relação ao peso seco da

alga, o potencial farmacológico apresentado nos ensaios anticoagulante,

antioxidante e antiproliferativo e a facilidade de obtenção das algas em todos os

períodos do ano no litoral potiguar.

A princípio, este banco de dados permitiu selecionar as duas algas mais bem

classificadas para dar continuidade a este trabalho: D. delicatula (21 pontos) e S.

filipendula (19 pontos). Trabalhos posteriores podem também fazer uso desta

ferramenta para selecionar macroalgas marinhas, inclusive permitindo fazer uma

seleção mais especifica, como por exemplo, a escolha das algas que apresentaram

o melhor potencial anticoagulante ou antiproliferativo, sem levar em consideração

fatores como rendimento e/ou facilidade de obtenção.

Ainda, percebe-se que não existe nenhuma relação entre a divisão da alga e

a eficiência de seus polissacarídeos sulfatados nas atividades biológicas testadas,

mostrando que o potencial farmacológico é independente de características

inererentes a cada grupo de algas, o que justifica o desenvolvimento de trabalhos de

prospecção visando buscar e selecionar espécimes promissoras à indústria

farmacêutica.

DISCUSSÃO


101

5.2. Extração e caracterização de polissacarídeos sulfatados da alga D. delicatula e S. filipendula.

Para a obtenção de polissacarídeos sulfatados da alga D. delicatula e S.

filipendula utilizou-se uma metodologia de extração já estabelecida pelo grupo de

pesquisa em que está inserido este trabalho. Essa metodologia permite a separação

de diferentes populações de polissacarídeos sulfatados de acordo com a interação

destes com solventes polares. Assim obteve-se seis frações polissacarídicas para a

alga D. delicatula (DD-0,5v, DD-0,7v, DD-1,0v, DD-1,3v, DD-1,5v e DD-2,0v), e cinco

frações para a alga S. filipendula (SF-0,5v, SF-0,7v, SF-1,0v, SF-1,5v, SF-2,0v),

denominadas de acordo com o volume de acetona adicionado no processo de

fracionamento.

Um estudo realizado com três algas marrons da ordem Dictyotales (Padina

gymnospora, Dictyota mertensis e Sargassum vulgare) demonstrou a existência em

cada uma delas de três famílias de polissacarídeos sulfatados que se diferenciavam

pela sua mobilidade eletroforética no gel de agarose em tampão PDA: Banda A

(menor migração), Banda B (migração intermediaria) e Banda C (maior migração)

(DIETRICH et al., 1995). Diversos estudos posteriores confirmaram a presença

destas três populações polissacarídicas em outras espécies de Dictyotales (LEITE et

al., 1998a, ALBUQUERQUE et al., 2004, ROCHA et al., 2005a, SILVA et al., 2005),

e, um estudo realizado com a alga S. schröederi confirmou que as bandas

eletroforéticas A, B e C, eram constituídas de polissacarídeos sulfatados distintos,

que passaram a receber a nomenclatura de fucanas A, B e C.

Neste trabalho, as duas espécies de algas selecionadas para terem seus

polissacarídeos sulfatados estudados pertencem à ordem Dictyotales, o que não

torna surpreendente a visualização destas três populações de polissacarídeos

sulfatados através da eletroforese em gel de agarose (Figuras 15 e 22). Para a alga

D. delicatula, a fucana A pode ser visualizada nas frações DD-0,5v, DD-0,7v e DD-

1,0v, A fucana B nas frações DD-1,0v, DD-1,3v e DD-1,5v, ao passo que a fucana C

é encontrada em DD-1,5v e DD-2,0v. Por sua vez, os polissacarídeos sulfatados de

S. filipendula apresentam um perfil eletroforético mais polidisperso, o que dificulta o

processo de visualização das bandas eletroforéticas correspondentes a fucana A e

B, porém é possível observar claramente a presença da fucana C na fração SF-2,0v.

DISCUSSÃO


102

As análises químicas dos polissacarídeos obtidos, resumidas na Tabela IX e

na Tabela IX confirmam a presença de fucose e sulfato na constituição de todos os

polissacarídeos sulfatados das algas D. delicatula e S. filipendula, além de outros

açúcares neutros como componentes destes polímeros, como galactose, glicose,

manose e xilose, indicando que as duas algas marrons estudadas sintetizam um

complexo sistema de heterofucanas.

Os resultados mostram também que o principal monossacarídeo encontrado

em todas as frações da alga S. filipendula, bem como DD-0,5v e DD-1,3v extraídas

de D. delicatula foi a galactose. Algas marrons, em sua maioria, sintetizam

polissacarídeos sulfatados consistindo principalmente de L-fucose sulfatada com o

conteúdo de fucose variando entre 30-45%, seguido de pequenas quantidades de

galactose, manose, glicose, xilose e ácido glucurônico (BILAN et al., 2007).

Entretanto, alguns trabalhos relatam macroalgas marinhas que sintetizam fucanas

contendo galactose como principal componente monossacarídico, denominadas

galactofucanas: Saccharina longicruris (RIOUX et al., 2010), Lobophora variegata

(MEDEIROS et al., 2008), Spatoglossum schröederi (ROCHA et al., 2005c),

Adenocystis utricularis (PONCE et al., 2003) e Sargassum stenophyllum (DUARTE

et al., 2001).

Para os demais polissacarídeos de S. filipendula, encontrou-se grandes

quantidades de ácido glucurônico, e no caso de SF-1,5v e SF-2,0v este açúcar

aparece como o principal constituinte monossacarídico. Em trabalhos anteriores, a

presença de ácido glucurônico com principal constituinte de fucanas foi relatada.

Leite et al. (1998) purificou e caracterizou uma heterofucana com um grande

conteúdo de ácidos glucurônico, alem de fucose e xilose. Após caracterização

estrutural, foi confirmado que esta fucana apresenta uma estrutura central de (1�3)-

D-ácido glucurônico, substituídas por L-fucose e D-xilose sulfatadas. Em outro

estudo, uma fucana da alga C. okamuranus foi descrita como sendo formada por

uma cadeia central linear de fucose, substituídas por ácido glucurônico nas ligações

α(1�2) (NAGAOKA et al., 1999).

São necessários estudos mais aprofundados para a caracterização estrutural

dos polissacarídeos sulfatados aqui analisados, o que ajudaria a compreensão

acerca da relação entre a estrutura química e a atividade biológica desempenhada

por estes polímeros. Estudos estão sendo desenvolvidos a fim de alcançar estes

objetivos, entretanto, heterofucanas ricas em galactose e/ou ácidos glucurônicos não

DISCUSSÃO


103

são frequentemente descritas, o que levou a priorizar a avaliação do potencial

farmacológico destas onze frações polissacarídicas extraídas das algas D. delicatula

e S. filipendula, com o objetivo de identificar quais destes polissacarídeos são

responsáveis pelas atividades biológicas previamente identificadas através dos

extratos ricos em polissacarídeos sulfatados.

As heterofucanas da alga S. filipendula não apresentaram atividade

anticoagulante para os testes de PT e APTT (Tabela XII). Este resultado já era

esperado, já que quando se avaliou o potencial anticoagulante do extrato rico em

polissacarídeos sulfatados de S. filipendula, também não foi encontrada nenhuma

atividade. A alga S. filipendula sintetiza um complexo sistema de heterofucanas

compostas, além de galactose e fucose, de uma variedade de açúcares neutros que

possivelmente não apresentam sulfatação, e, portanto, provavelmente estes

monossacarídeos impedem a interação destas heterofucanas com fatores da

coagulação. Resultados semelhantes foram encontrados em pesquisas

desenvolvidas com galactanas sulfatadas de invertebrados marinhos e

heterofucanas de algas marrons que mostraram que a inserção de monossacarídeos

não sulfatados em regiões de ramificações destes polissacarídeos pode prevenir a

sua interação com cofatores da coagulação e suas proteases alvo, inibindo desta

forma, a atividade anticoagulante in vitro (BERTEAU & MULLOY, 2003, PEREIRA et

al., 2005, ROCHA et al., 2005a). Por fim, não se pode descartar o uso das

heterofucanas de S. filipendula em terapias anticoagulantes devido somente ao fato

destas não apresentarem atividades para os ensaios de PT e APTT. Estudos

anteriores desenvolvidos pelo grupo de pesquisa em que este trabalho está inserido

identificaram heterofucanas que não apresentam atividade anticoagulante in vitro,

mas possuem uma considerável atividade antitrombótica in vivo, estimulando a

síntese por células endoteliais de um heparam sulfato com característica

antitrombótica (ROCHA et al., 2005a, BARROSO et al., 2008).

Para a alga D. delicatula, todas as heterofucanas prolongaram o tempo de

coagulação quando comparadas ao controle salino no teste de APTT (Figura 15).

Novamente, nenhuma correlação foi encontrada entre a atividade anticoagulante e o

teor de sulfato dos polissacarídeos sulfatados (R2 = 0,190), corroborando com

diversos trabalhos encontrados na literatura que afirmam que a posição do

grupamento sulfato no polissacarídeo e sua devida proporção são essenciais para a

atividade anticoagulante. Vale destacar ainda, que DD-1,5v apresentou a atividade

DISCUSSÃO


104

mais proeminente, inclusive com razão de APTT semelhante à clexane® quando

comparadas na mesma concentração (0,1 mg/mL). Atualmente, trabalhos estão

sendo desenvolvidos com objetivos de purificar e caracterizar a estrutura

tridimensional de DD-1,5v a fim de identificar os padrões estruturais responsáveis

pela sua elevada atividade anticoagulante.

As algas D. delicatula e S. filipendula tiveram suas heterofucanas avaliadas

com relação ao potencial antioxidante através dos mesmos ensaios a que foram

submetidos os extratos ricos em polissacarídeos sulfatados: Capacidade

antioxidante total (CAT), sequestro de radicais superóxido e hidroxila, quelação

férrica e poder redutor.

Assim como o observado para os extratos, as heterofucanas mostraram alto

potencial no ensaio de CAT (Figura 16 e Figura 22). Para a alga D. delicatula, DD-

1,0v apresentou a maior atividade com 37,3 equivalentes de ácido ascórbico (figura

17). Esta atividade, bem como as de DD-0,5v, DD-0,7v, DD-1,3v e DD-1,5v, foram

superiores àquela encontrada para o extrato de D. delicatula rico em polissacarídeos

sulfatados (23,0 equivalentes de ácido ascórbico). No que diz respeito às

heterofucanas de S. filipendula, a atividade antioxidante permite a classificação em

três grupos: baixo (SF-2,0v), intermediário (SF-0,5v e SF-1,5v) e alto (SF-0,7v e SF-

1,0v) potencial antioxidante. O baixo potencial antioxidante apresentados pelas

frações polissacarídicas SF2,0v e DD-2,0v, revela que possivelmente o potencial

antioxidante das fucanas é referente as fucanas A e B, já que estas frações são

compostas somente por fucanas C, ao passo que as demais frações contêm fucana

A e/ou fucana B.

Dentre as heterofucanas de D. delicatula, apenas DD-0,5v, DD-0,7v e DD-

1,0v mostraram atividade antioxidante para o ensaio de sequestro de radicais

hidroxilas, ainda assim as atividades podem ser consideradas irrisórias, ao passo

que para o sequestro de radicais superóxido, DD-0,5v e DD-0,7v apresentaram

baixa capacidade de sequestro destes radicais, enquanto DD-1,5v mostrou uma

atividade apenas moderada (13,4%). Quando comparamos esses resultados com

aqueles encontrados para o extrato rico em polissacarídeos sulfatados de D.

delicatula, encontramos um dado interessante: O extrato apresentou uma atividade

sequestradora de radicais superóxido cerca de 2,4 vezes maior do que DD-1,5v.

Possivelmente, o potencial de sequestro encontrado para o extrato é resultado da

somatória de atividades das heterofucanas que parecem agir de forma sinérgica no

DISCUSSÃO


105

sequestro de radicais superóxido, promovendo uma ação mais eficiente. Logo,

quando do processo de fracionamento e isolamento dos polissacarídeos, estes

perdem parte do potencial antioxidante que apresentavam em conjunto.

No que tange as heterofucanas de S. filipendula, SF-0.7v, SF-1.0v, and SF-

1.5v apresentaram atividade antioxidante para o sequestro de radicais hidroxila,

enquanto SF-0,7v e SF-2,0v mostraram potencial antioxidante no sequestro de

radicais superóxido (Tabela XIII). Esses dados são surpreendentes se levarmos em

consideração que o extrato polissacarídico de S. filipendula não mostrou atividade

antioxidante para os sequestros de hidroxila e superóxido (tabela VI). Esse achado

permite elaborar algumas hipóteses: 1) Os polissacarídeos sulfatados de S.

filipendula provavelmente necessitam de uma quantidade de massa mínima para

apresentar atividade sequestradora de radicais, o que aconteceu apenas quando

estes foram fracionadas; 2) alguns dos polissacarídeos sulfatados podem agir de

forma antagônica, abolindo a atividade antioxidante dos outros polímeros no extrato

polissacarídico; 3) Outros elementos presentes no extrato podem formar agregados

com os polissacarídeos sulfatados, não permitindo a interação destes com os

radicais formados, logo abolindo a atividade antioxidante do extrato polissacarídico.

Para testar essas hipóteses são necessários estudos mais aprofundados com os

polissacarídeos de S. filipendula, porém, independente destas hipóteses, esse

achado nos permite concluir que apenas os ensaios de sequestro de radicais

superóxido e hidroxila não podem ser usados como parâmetros de avaliação do

potencial antioxidante de extratos ricos em polissacarídeos sulfatados, e sim, estes

ensaios devem estar associados a outros testes antioxidantes, como os utilizados

neste trabalho de pesquisa.

Fucanas de macroalgas marinhas geralmente não apresentam atividade

antioxidante através do sequestro de radicais livres, especificamente superóxido e

hidroxila (LEE et al., 2008). Poucos trabalhos mostram fucanas com considerável

potencial de sequestro desses radicais. Para o ensaio de sequestro de radicais

hidroxila, existe apenas um único relato de polissacarídeo sulfatado de alga marinha

com atividade considerável, trata-se de uma fucana extraída da alga L. japonica, que

necessitou de uma concentração extremamente alta (2,5 mg/mL) para inibir cerca de

90% dos radicais formados, concentração esta cinco vezes superior a utilizada no

nosso trabalho (WANG et al., 2008).

DISCUSSÃO


106

Alguns antioxidantes inibem a interação entre metais de transição e lipídeos

pela sua interação com íons de ferro, por impedimento estérico ou levando a

formação de complexos insolúveis. Além disso, íons de metais de transição também

podem reagir com H2O2 gerando o radical hidroxila (JOMOVA & VALKO, 2011).

Diversos relatos de polissacarídeos sulfatados com capacidade de quelar íons ferro

são encontrados na literatura (QI et al., 2005, WANG et al., 2008, CAMARA et al.,

2011), indicando que este parece ser um dos principais mecanismos de ação

antioxidante destes biopolímeros. Os resultados encontrados neste trabalho

mostraram que apenas três extratos não apresentaram poder quelante, incluindo o

extrato de S. filipendula (Figura 10). Entretanto, todas as heterofucanas extraídas

de S. filipendula mostraram atividade dose-dependente para o ensaio de quelação

férrica (Figura 23), com destaque para SF-2,0v com atividade superior à descrita

para polissacarídeos sulfatados de L. japônica (WANG et al., 2008), U. pertusa (QI et

al., 2005) e de derivados sulfatados quimicamente dos mesmos polissacarídeos de

U. pertusa (QI et al., 2006) e apenas 1,7 vezes inferior ao EDTA. O processo de

fracionamento com volumes crescentes de acetona mostrou-se altamente eficiente

para a extração de polissacarídeos sulfatados da alga S. filipendula, removendo

composto que anulam a atividade antioxidante destas heterofucanas, como pode ser

observado a partir destes resultados e da atividade sequestradora de radicais.

Para o ensaio de poder redutor, os extratos de S. filipendula e D. delicatula

foram classificados dentro do grupo com alta atividade redutora (Figura 11), com

potencial similar ao encontrado para o ácido ascórbico. Os testes realizados com os

polissacarídeos sulfatados destas algas permitiram identificar quais as

heterofucanas responsáveis por esse alto potencial antioxidante. Para D. delicatula,

as heterofucanas DD-1,0v, DD-1,3v e DD-1,5v apresentam atividades

correspondentes à 50% da atividade apresentada pela vitamina C, um composto de

referência conhecido por apresentar um considerável poder redutor (Figura 18).

Ainda, essas três frações polissacarídicas são ricas em fucana B (Figura 14),

indicando ser esta a principal responsável pelo potencial redutor dos polissacarídeos

sulfatados de algas marrons. Para S. filipendula, apesar de todos os polissacarídeos

apresentarem potencial considerável, SF-1,0v aparece com a melhor atividade,

praticamente similar à vitamina C (Figura 24).

As algas selecionadas para terem seus polissacarídeos analisados neste

trabalho apresentaram atividade antiproliferativa frente à linhagem celular tumoral

DISCUSSÃO


107

HeLa, após incubação por 72h. Nessas mesmas condições as heterofucanas de D.

delicatula também apresentaram resultados interessantes, merecendo um maior

destaque as atividades encontradas para DD-0,7v e DD-1,3v (64,5% e 93,4%,

respectivamente) (Figura 19A). Fica claro que estas heterofucanas possivelmente

apresentam potencial para o tratamento de linhagens tumorais, como a observada

para HeLa, entretanto, atualmente existe uma busca incessante por novos

compostos que apresentem efeitos colaterais menos agressivos, e dentre estas

condições, a ação especifica contra uma determinada linhagem celular aparece

como prioridade, ou seja, os compostos que afetam apenas células tumorais são

considerados mais eficientes. De forma surpreendente, quando as heterofucanas

foram incubadas com a linhagem celular MC3T3 (pré-osteoblastos de origem

murina), todas apresentaram um alto poder antiproliferativo, chegando a 99,2% de

inibição (DD-1,5v) (Figura 19B).

Quanto aos polissacarídeos sulfatados de S. filipendula, todos mostraram um

efeito antiproliferativo dose dependente frente às células HeLa (Figura 25A). SF-

1,5v, inibindo cerca de 53,5% das células incubadas, apresentou a atividade mais

significativa. Entretanto, o resultado que merece maior destaque é a ausência de

inibição de células MC3T3 observada para SF0,7v, SF-1,0v e SF-1,5v, indicando

que SF-1,5v inibe a proliferação celular de HeLa por um mecanismo celular que não

é afetado quando a fração polissacarídica é incubada com a linhagem normal

MC3T3. Diversos estudos in vivo e in vitro de atividades antitumorais de fucanas têm

sido relatados (LIN et al, 2010; HOLTKAMP et al, 2009). Estes polímeros podem agir

através de diferentes mecanismos, como por exemplo, Inibição da adesão celular à

matriz extracelular (ROCHA et al., 2001); Inibição da angiogênese (LEE et al., 2008),

bloqueio do ciclo celular (RIOU et al., 1996, JI et al., 2004) e ativação da via das

caspases (AISA et al., 2005, TERUYA et al., 2007).

As heterofucanas avaliadas neste trabalho apresentam um excelente

potencial farmacológico: anticoagulante, antioxidante e antitumoral. A partir dos

resultados obtidos fazem-se necessários estudos mais aprofundados, que ajudem

na compreensão acerca dos principais mecanismos de ação que levam estes

polissacarídeos a desempenharem estas atividades biológicas. Para a continuidade

deste trabalho, um polissacarídeo foi selecionado para avaliação de seu mecanismo

de ação. A heterofucana escolhida foi SF-1,5v, que apresentou uma considerável

DISCUSSÃO


108

atividade antiproliferativa frente a linhagem celular HeLa e não alterou a proliferação

celular de células normais osteoblásticas (MC3T3).

5.3. Determinação do mecanismo de ação antiproliferativo de SF-1,5v frente à linhagem celular tumoral HeLa.

A heterofucana SF-1,5v, extraída da alga marrom S. filipendula apresentou

atividade antitumoral célula-específica, inibindo a proliferação da linhagem tumoral

HeLa após incubação por 72 h. Para uma melhor dinâmica experimental na

determinação dos mecanismos de ação, as celulas HeLa foram incubadas com SF-

1,5v por períodos de 24 h e 48 h, a fim de verificar se esta apresenta atividade

antiproliferativa em tempos inferiores à 72 h. A inibição tempo-dependente de SF-

1,5v sobre a proliferação celular de células HeLa pode ser visto na Figura 26. SF-

1,5v inibiu a proliferação celular em 47,3% no tempo de incubação de 24 h (2,0

mg/mL). Estes valores são consideravelmente superiores ao encontrado para outros

polissacarídeos sulfatados extraídos de algas marrons do gênero Sargassum, como

fucanas obtidas de S. kjellmanianum e S. stenophyllum que não inibiram mais que

40% da proliferação das células L-1210 (linhagem linfocitária leucêmica) e HeLa,

respectivamente (YAMAMOTO et al., 1984, STEVAN et al., 2001). Portanto, levando

em consideração que SF-1,5v promove um decréscimo antitumoral significativo

diante das células HeLa em um período de 24h, decidiu-se adotar este tempo de

incubação como padrão para os ensaios posteriores.

Para confirmar se a inibição da proliferação celular mostrada no experimento

anterior se deve a indução da apoptose, as células HeLa foram incubadas com a

heterofucana SF-1,5v, seguido de marcação com anexina V-FITC (proteína anexina

V unida à isotiocianato de fluoresceína) e iodeto de propídeo (PI). A análise dos

resultados foi feita através da citometria de fluxo (Figura 27). A Anexina V-FITC

caracteriza-se por se ligar à fosfatidilserina (FS), um fosfolipídio de membrana

localizado no lado intermembrana de células vivas. Durante os eventos que levam a

apoptose, ocorre a sua externalização ativamente para a camada externa da

membrana plasmática, onde sua presença e requerida para o reconhecimento e

fagocitose da célula morta (CHEN et al., 2011). Por sua vez o PI caracteriza-se por

DISCUSSÃO


109

atravessar a membrana citoplasmática de células necróticas, permitindo desta forma

a sua rápida identificação. A partir do tratamento com SF-1,5v podemos verificar que

houve um aumento significativo de células em estagio inicial de apoptose (19,8%),

confirmando que o principal mecanismo de ação antiproliferativo de SF-1,5v é

através da indução da apoptose.

Duas vias celulares, conhecidas como via extrínseca e via intrínseca da

apoptose podem desencadear os mecanismos apoptóticos (CHAUDHARI et al.,

2008, JEONG & SEOL, 2008) Figura 4Figura 4 e Figura 5), e em ambas as vias as

caspases desempenham papel chave: caspase-8 e caspase-9 como iniciadoras das

vias extrínseca e intrínseca, respectivamente, e caspase-3 como efetora das duas

vias. Estas vias, monitoradas principalmente através da ativação da procaspase-9 e

procaspase-3, aparecem como o principal mecanismo antitumoral de diversos

polissacarídeos sulfatados de macroalgas marinhas (AISA et al., 2005, TERUYA et

al., 2007).

Portanto, SF-1,5v foi avaliado quanto a capacidade de ativar a via das

caspases através da técnica de western blot (Figura 28A). Nenhuma alteração foi

observada nos conteúdos das duas procaspases aqui analisadas, procaspase-3 e

procaspase-9, indicando que SF-1,5v provavelmente desempenha sua atividade

antiproliferativa através de uma via diferente da ativação das caspases. Este

resultado foi confirmado após incubação das células HeLa com um inibidor

específico de caspase, zVAD, na presença e na ausência de SF-1,5v (Figura 28B).

zVAD não alterou a proliferação celular de HeLa, ratificando que a ativação de

caspase não é essencial para SF-1,5v induzir a apoptose em células HeLa.

Alguns trabalhos mostram que a ativação das caspases não necessariamente

leva à morte celular, o que mostra a importância de outras vias independente de

caspase no processo de apoptose. Uma fucana extraída de F. vesiculosus induz a

expressão de caspase-3 e reduz o potencial elétrico mitocondrial de células HS-

sultan. Entretanto, experimentos com inibidores de caspases mostraram que a

ativação de caspases era responsável por apenas 69% da atividade apoptótica do

polissacarídeo, indicando que outras vias independentes de caspases estão

envolvidas na indução da morte celular, especificamente, a ativação de ERK

(extracellular signal–regulated kinase) (AISA et al., 2005). Em trabalhos posteriores,

esta mesma fucana inibiu a proliferação de células HCT-15 (linhagem tumoral de

cólon) através da ativação de ERK e p38 e do bloqueio de PI3K/AKt (HYUN et al.,

DISCUSSÃO


110

2009b), bem como através da produção de óxido nítrico induzida pela ativação de

NFkB (NAKAMURA et al., 2006).

Neste trabalho, outras vias indutoras de morte celular independentes de

caspases foram avaliadas quanto ao efeito do tratamento de HeLa com SF-1,5v.

Devido a MAPK, uma família de proteínas quinases ativadas por mitógenos, estar

diretamente envolvida nos processos de proliferação, diferenciação e apoptose

(MIYAKAWA et al., 2001, GALLO & JOHNSON, 2002, KAPUR et al., 2002), foi

estudada a fosforilação de ERK e p38 através de western blot (Figura 29). SF-1,5v

não alterou a fosforilação destas duas proteínas, indicando que a via MAPK não é

afetada pela heterofucana. AKt, outra proteína quinase, tem um papel chave em

múltiplos processos celulares, como o metabolismo de glicose, proliferação, e é

fundamental à sobrevivência celular através da supressão da apoptose

(NICHOLSON & ANDERSON, 2002, SCHEID & WOODGETT, 2003), logo, o

bloqueio de AKt promove a inibição da proliferação e a indução da apoptose.

Novamente, SF-1,5v não alterou o padrão de fosforilação de AKt.

O fator de transcrição NFkB está envolvida na expressão de genes que

participam de processos imunológicos, apoptóticos e tumorigênicos, e pode ser

ativado por estímulos apoptóticos envolvidos em danos no DNA, induzindo a

expressão de uma variedade de genes pró-apoptóticos. Quando incubada com SF-

1,5v por 24h, a fosforização de NFkB também não pôde ser observada (Figura 29).

A proteína quinase GSK-3β tem sido associada a uma diversidade de

processos biológicos, entre eles a apoptose, o que a torna uma excelente candidata

em terapias antitumorais (LUO, 2009). Percebe-se claramente, que o conteúdo de

GSK-3β fosforilado é alterado após incubação com SF-1,5v, indicando que a

heterofucana promove a desfosforilação (ativação) de GSK-3β. Esta proteína

promove a ativação de uma gama de moléculas, entre elas a proteína supressora de

tumor p53 (LUO, 2009), que mantêm a integridade do genoma, prevenindo desta

forma, o aparecimento de tumores (ZHELTUKHIN & CHUMAKOV, 2010), logo a

ativação de p53 foi avaliada. Entretanto, esta proteína não foi afetada por SF-1,5v.

A desfosforilação de GSK-3β está envolvida no processo de apoptose,

indicando que SF-1,5v provavelmente induz morte celular através da ativação desta

proteína. Para determinar o papel de GSK-3β na apoptose induzida pelo

polissacarídeo sulfatado nas celulas HeLa, estas foram incubadas com cloreto de

litium, um inibidor específico de GSK-3β, e o número de células em apoptose foi

DISCUSSÃO


111

quantificado através de citometria de fluxo (Figura 30). O cloreto de lítio não alterou

a apoptose induzida por SF-1,5v, mostrando que GSK-3β também não é essencial

para a atividade apoptótica deste polissacarídeo sulfatado em células HeLa. Um

resultado semelhante foi relatado para fucana de F. vesiculosus, que promove

desfosforilação de GSK-3β, mas este efeito não está envolvido na morte celular de

células HS-sultans induzida por fucana (AISA et al., 2005).

Foi observado até aqui, que a heterofucana SF-1,5v induz apoptose em

células HeLa por uma via independente da ativação de caspases. Ainda, os

resultados anteriores mostraram que SF-1,5v não altera as vias de sinalização de

NF�B, Akt, GSK-3�, MAPK (ERK and p38) e GSK.

Estudos mostram que a mitocôndria, além da participação na via intrínseca da

apoptose, também libera fatores envolvidos no processo de morte celular

independente de caspases. Mais recentemente, foi descrita a liberação, na via

mitocondrial, de uma flavoproteína conhecida por Fator Indutor de Apoptose (AIF)

(SMITH et al., 2008, HANGEN et al., 2010, NORBERG et al., 2010, MCMILLAN &

QUADRILATERO, 2011, SEVRIOUKOVA, 2011).

AIF migra da mitocôndria para o núcleo após um estímulo de apoptose e

induz a condensação da cromatina e fragmentação do DNA em fragmentos de 50Kb,

independente da ativação das caspases (GRIVICICH et al., 2007, AKEMATSU &

ENDOH, 2010, MCMILLAN & QUADRILATERO, 2011). AIF também induz exposição

de fosfatidilserina na superfície celular e pode manter a atividade apoptótica na

presença do inibidor pan-caspase (z-VAD) (HANGEN et al., 2010). Visto que o

tratamento com SF-1,5v induz exposição de fosfatidilserina na superfície celular e a

atividade apoptótica é mantida na presença de z-VAD, nós mensuramos AIF

citosólico através de western blot (Figura 31). Os níveis de AIF no citosol

aumentaram de maneira tempo-dependente após tratamento com SF-1,5v,

indicando que o principal mecanismo de morte celular induzido pela heterofucana é

através da liberação mitocondrial de AIF no citoplasma.

Como as proteínas Bcl-2 e Bax, apresentam papel chave na liberação de AIF

no citoplasma, a primeira inibindo esse processo, e a segunda favorecendo a

permeabilização da membrana, entrada de íons cálcio e consequente liberação do

fator no citoplasma celular, estas também foram avaliadas quanto a influencia de SF-

1,5v em suas concentrações. Fica claro que SF-1,5v promove a supressão da

expressão de Bcl-2, ao mesmo tempo em que induz a expressão de Bax (Figura 31).

DISCUSSÃO


112

A partir desses resultados pode ser proposto um esquema para os eventos

envolvidos na morte celular de HeLa induzidas por SF-1,5v (Figura 32). Inicialmente,

SF-1,5v promove alterações na expressão das proteinas BCL-2 e Bax, suprimindo a

primeira e promovendo a expressão da segunda no citoplasma. Bax, por sua vez,

promove o aumento da permeabilidade da membrana externa mitocondrial, o que

leva a liberação de diversos fatores, entre eles o AIF. Em seguida, AIF induz a celula

à apoptose, possivelmente através de ligacao ao DNA, e consequente recrutamento

e ativação de endonucleases, promovendo a degradação do DNA em fragmentos de

50Kb, bem como a condensação da cromatina e a formação de corpos apoptóticos

(CREGAN et al., 2004, HANGEN et al., 2010, NORBERG et al., 2010).

Por fim, este trabalho é o primeiro relato mostrando uma fucana cujo principal

mecanismo antiproliferativo é a liberação de AIF mitocondrial para o citosol. Desta

forma, SF-1,5v aparece como um promissor fármaco na terapia antitumoral,

principalmente por oferecer uma alternativa aos quimioterápicos tradicionais,

afetando uma via de sinalização celular diferenciada. Estudos mais aprofundados

estão sendo desenvolvidos pelo nosso grupo de pesquisa com o objetivo de purificar

Figura 32. Mecanismo de ação antiproliferativo de SF-1,5v frente a linhagem celular tumoral HeLa.

DISCUSSÃO


113

SF-1,5v, determinar a sua estrutura química e avaliar os mecanismos de ação

antiproliferativo frente à outras linhagens celulares tumorais.

CONCLUSÕES


114

6 – CONCLUSÕES

Os extratos ricos em polissacarídeos sulfatados extraídos das onze

macroalgas marinhas apresentaram efeito anticoagulante, antioxidante e/ou

antiproliferativo em diferentes níveis de atividades;

As algas marrons apresentaram os melhores potenciais de exploração

farmacológica dentre todas as algas estudadas;

Através do fracionamento com volumes crescentes de acetona foram obtidas

seis frações ricas em polissacarídeos sulfatados para a alga D. delicatula e cinco

frações para a alga S. filipendula;

As algas marrons S. filipendula e D. delicatula sintetizam um complexo

sistema de heterofucanas compostas de fucose, galactose, ácido glucurônico,

glicose, manose e/ou xilose;

Apesar de todas as frações estudados serem constituídos por sulfato, apenas

aqueles obtidos da alga D. delicatula apresentaram atividade anticoagulante para o

teste de aPTT;

Todas apresentaram atividade para os diferentes ensaios antioxidantes,

entretanto, a quelação férrica aparece como o principal mecanismo de ação

antioxidante;

Todas as frações ricas em polissacarídeos sulfatados mostraram potencial

antiproliferativo frente a linhagem celular tumoral de cólon uterino (HeLa);

Dentre todas as frações ricas em polissacarídeos sulfatados aqui estudadas,

apenas as frações SF0,7v, SF-1,0v e SF-1,5v, não inibiram a proliferação celular de

células pré-osteoblásticas (MC3T3);

SF1,5v induz a apoptose em células HeLa através da liberação do Fator

Indutor da Apoptose (AIF) no citosol, uma via independente da ativação das

caspases;

Este trabalho é o primeiro relato mostrando uma fucana cujo principal

mecanismo antiproliferativo é a liberação de AIF mitocondrial para o citosol, o que

torna SF-1,5v um promissor fármaco na terapia antitumoral, possibilitando uma

alternativa aos quimioterápicos tradicionais.

REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS


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7 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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APÊNDICES


133

8 - APÊNDICES

APÊNDICE A

APÊNDICES


134

APÊNDICE B

APÊNDICES


135

APÊNDICE C

APÊNDICES


136

APÊNDICE D

APÊNDICES


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APÊNDICE E

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