51
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE INSTITUTO DE QUÍMICA QUÍMICA ISABELA ABREU TRINDADE DA SILVA ESPECTROFLUORIMETRIA PARA A DETERMINAÇÃO DE ASPARTAME COMO ADULTERANTE EM ADOÇANTES NITERÓI 2016
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE QUÍMICA
QUÍMICA
ISABELA ABREU TRINDADE DA SILVA
ESPECTROFLUORIMETRIA PARA A DETERMINAÇÃO DE
ASPARTAME COMO ADULTERANTE EM ADOÇANTES
NITERÓI
2016
II
ISABELA ABREU TRINDADE DA SILVA
ESPECTROFLUORIMETRIA PARA A DETERMINAÇÃO DE
ASPARTAME COMO ADULTERANTE EM ADOÇANTES
Monografia apresentada ao Curso de
Graduação de Bacharelado em Química
Industrial da Universidade Federal Fluminense
como requisito parcial para a obtenção do Grau
de Bacharel em Química Industrial.
Orientadora: Profa. Dra. Flávia Ferreira de Carvalho Marques
Coorientadora: Ma. Renata Corrêa de Carvalho
III
ISABELA ABREU TRINDADE DA SILVA
ESPECTROFLUORIMETRIA PARA A DETERMINAÇÃO DE
ASPARTAME COMO ADULTERANTE EM ADOÇANTES
Monografia apresentada ao Curso de
Graduação de Bacharelado em Química
Industrial da Universidade Federal
Fluminense como requisito parcial para a
obtenção do Grau de Bacharel em Química
Industrial.
Aprovada em 19 de dezembro de 2016.
BANCA EXAMINADORA
Niterói
2016
IV
S586 Silva, Isabela Abreu Trindade
Espectrofluorimetria para a determinação de aspartame como
adulterante em adoçantes / Isabela Abreu Trindade Silva. – Ni-
terói: [s.n.], 2016.
51f.
Trabalho de Conclusão de Curso - (Bacharelado em Quími-
ca Industrial) – Universidade Federal Fluminense, 2016.
1. Espectroscopia de fluorescência. 2. Fluorimetria. 3. Edul-
corante. 4. Método analítico. I. Título.
CDD.535.84
V
A vida vai ficando cada vez mais dura perto do topo.
(Friedrich Nietzsche)
VI
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por tudo que fez, faz e fará por mim. Por seu cuidado
e consolo nos momentos difíceis. Por não ter me deixado desistir e me abençoar todos os dias
com vida e saúde. Tudo que alcancei até hoje foi por sua grandiosa graça e misericórdia. Não
tenho palavras pra agradecer o seu amor por mim.
Agradeço ao meu muito saudoso e amado pai, Agenor, que sempre me ensinou o
caminho correto a seguir, sempre me deu todas as oportunidades de conquistar meus sonhos e
sempre me ensinou a ser o melhor que eu possa ser. A pessoa que mais vibrou com todas as
minhas conquistas, desde as mais bobas até as mais importantes. Devo muito a ele por ter me
dado educação e me ensinado valores que carregarei eternamente comigo, mas principalmente
por ter me ensinado o que é o amor. Dedico todas as minhas conquistas a ele e gostaria do
fundo do meu coração que estivesse aqui.
Agradeço a minha mãe e aos meus irmãos, Rosangela, Raphael e Bruno por estarem
comigo e sempre cuidarem de mim. Por me incentivarem e acreditarem no meu potencial.
Agradeço ao meu marido, Rodrigo, que muitas vezes aguentou meu mau humor nos
finais de período da faculdade, me incentivando em todos os momentos. Sou grata por seu
amor, carinho, cuidado, paciência e compreensão, por ser meu ombro amigo e ouvir meus
desabafos.
Agradeço a minha orientadora, Profa. Dra. Flávia Marques, por ter sido tão atenciosa
comigo. Por ter se mostrado uma professora no sentido mais profundo da palavra, não
apenas de uma disciplina, mas uma professora de vida.
Agradeço a minha querida coorientadora, Renata Corrêa, por toda paciência em me
ensinar e auxiliar no meu projeto, o que tornou tudo muito mais agradável. Por estar sempre
pronta para tirar minhas dúvidas, se mostrando interessada e empolgada com nosso projeto. É
bom trabalhar com pessoas assim!
Agradeço aos professores da UFF pelo exemplo de profissionais que foram para mim,
principalmente aos professores Euler Gigante, Eluzir Chacon, Méri Vieira, João Célio e
Odivaldo Cambraia. Gostaria também de agradecer ao Prof. Annibal Duarte Pereira Netto, por
ceder espaço em seu laboratório para que eu pudesse realizar meu projeto de monografia.
Por fim, agradeço às amigas Julianna Pinho, Olívia Moreira, Barbara Jardim e Laís
Oliveira por todo apoio que sempre me deram e que tornaram os dias na UFF inesquecíveis.
VII
RESUMO
A alimentação tem um papel fundamental na preservação de uma boa saúde. Uma dieta rica em
açúcar pode resultar em ganho de peso e alterações das taxas sanguíneas, como glicose e
colesterol. O aumento da preocupação com estes riscos foi o motivador para o desenvolvimento
de edulcorantes, que são substâncias menos calóricas e que podem substituir o açúcar refinado.
No entanto, o uso dos edulcorantes artificiais em adoçantes de mesa desperta a atenção dos
consumidores devido à existência de dados controversos no que diz respeito à segurança em sua
utilização. Dentre os vários edulcorantes existentes, o aspartame tem sido alvo de diversas
pesquisas no campo científico que o responsabilizam por alterações neuroquímicas, além de
problemas dermatológicos, respiratórios, neurológicos e até mesmo câncer. Ainda não há, na
literatura, relatos de metodologias de análise para determinação de aspartame utilizando a
espectrofluorimetria. Por este motivo, este trabalho teve como objetivo desenvolver um método
baseado na fluorimetria para a determinação deste edulcorante, especialmente como
contaminante em adoçantes de mesa que apresentam outra composição, verificando se os
mesmos estão em conformidade com a informação fornecida no rótulo. As condições analíticas
otimizadas foram: (i) soluções de amostra e padrão preparadas em água ultrapura e (ii) varredura
normal com medições dos sinais fluorescentes em λexc/λem = 210/285 nm. O método analítico foi
validado, demonstrando linearidade na faixa de 0,5 a 5,0 mg L-1
, e alta sensibilidade verificada
através do limite de detecção de 0,13 mg L-1
. Repetitividade com RSD = 3,2% (n = 7) e precisão
intermediária com tcalculado (0,191) < tcrítico (2,780) para 95% de confiança, demonstraram a boa
precisão do método. Diferentes marcas de adoçante que não continham aspartame em sua
composição foram analisadas, e em nenhuma delas este edulcorante foi detectável. Portanto, o
método desenvolvido neste trabalho é bastante simples e de baixo custo, podendo ser uma ótima
alternativa para o controle de qualidade destes tipos de adoçantes, garantindo a segurança
principalmente dos consumidores que não podem ingerir aspartame, como fenilcetonúricos,
gestantes e lactentes.
Palavras chave: alimentação, saúde, edulcorantes, aspartame, contaminante, determinação,
espectrofluorimetria.
VIII
ABSTRACT The feeding has a fundamental role in preserving good health. High consumption of sugar may
result in weight gain and changes in blood rates such as glucose and cholesterol. The
development of sweeteners came with the risks associated with the consumption of sugars.
However, the use of artificial sweeteners in tabletop sweeteners has attracted the attention of
consumers because of the existence of controversial data regarding the safety of their use.
Aspartame, an artificial sweetener, has been responsible for neurochemical alterations, as well
as dermatological, respiratory, neurological and even cancer problems. There are still no reports
in the literature of methodologies for the determination of aspartame using spectrofluorimetry.
For this reason, the aim of this work was to develop a method based on fluorimetry for the
determination of this sweetener, especially as a contaminant in tabletop sweeteners that present
another sweetener in their composition. The optimized analytical conditions were: (i) sample
solutions and standard solutions prepared in ultrapure water and (ii) normal scanning with
fluorescence signal measurements at λexc / λem = 210/285 nm. The analytical method was
validated, showing linearity in the range of 0.5 to 5.0 mg L-1
, and high sensitivity verified
through the limit of detection of 0.13 mg L-1
. Repeatability with RSD = 3.2% (n = 7) and
intermediate precision with tcalculate (0,191) <tcritical (2,780) at 95% confidence, demonstrated the
good precision of the method. Different brands of sweeteners that did not contain aspartame in
their composition were analyzed, and in none of them was this sweetener detectable. Therefore,
the method developed in this work is quite simple and low cost, and can be a great alternative
for the quality control of these types of sweeteners, ensuring the safety of consumers who can
not ingest aspartame, such as phenylketonuric, pregnant women and infants.
Keywords: food, health, sweeteners, aspartame, contaminant, determination,
spectrofluorimetry.
IX
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................. 16
1.1 Alimentação...................................................................................................................... 16
1.2 Edulcorantes...................................................................................................................... 17
1.3 Aspartame......................................................................................................................... 18
1.4 Métodos analíticos para determinação de aspartame......................................................... 20
2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS ....................................................................................22
2.1 Objetivos........................................................................................................................... 22
2.1.1 Objetivo geral ................................................................................................................ 22
2.1.2 Objetivos específicos .................................................................................................... 22
2.2 Justificativas...................................................................................................................... 22
3. FLUORIMETRIA – BREVE FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA....................................... 24
4. MATERIAIS, REAGENTES, SOLUÇÕES, INSTRUMENTAÇÃO E MÉTODOS......... 27
4. 1 Materiais e Reagentes.................................................................................................... 27
4.1.1 Amostras.......................................................................................................................27
4.2 Soluções...........................................................................................................................27
4.3 Medições por espectrofluorimetria................................................................................ 28
4.4 Preparo das amostras de adoçante em pó.........................................................................28
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................................30
5.1 Verificação do par excitação/emissão (exc/em) fluorescente para o aspartame ..........30
5.2 Estudo do efeito do solvente.............................................................................................31
5.3 Estudo da influência do pH.............................................................................................. .32
5.4 Estudo da influência do tratamento fotoquímico..............................................................36
5.5 Estudo da estabilidade do aspartame em meio aquoso.....................................................37
5.6 Condições finais experimentais otimizadas para a determinação espectrofluorimétrica do
aspartame.................................................................................................................... ..............38
5.7 Obtenção dos parâmetros analíticos de mérito.................................................................39
5.8 Aplicação do método analítico..........................................................................................42
6. CONCLUSÕES .................................................................................................................... 45
X
7. BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................... 46
XI
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura química do aspartame............................................................................... 18
Figura 2: Diagrama de orbitais moleculares no estado fundamental e excitado da
molécula...................................................................................................................................24
Figura 3: Diagrama simplificado indicando os processos que ocorrem na fluorescência.......25
Figura 4: Espectros de excitação e emissão fluorescente de (a) solução aquosa de aspartame
1,0 mg L-1
e (b) água ultrapura (branco)...................................................................................30
Figura 5: Espectros de excitação e emissão fluorescentes dos solventes (a) metanol, (b) etanol,
(c) metanol:água 1:1, (e) água ultrapura e de (d) solução aquosa do aspartame 1,0 mg L-1
,
todos obtidos em fenda de 20 nm..............................................................................................31
Figura 6: Espectros de excitação e emissão fluorescentes de (a) aspartame 1,0 mg L-1
em HCl
0,1 mol L-1
e (b) HCl 0,1 mol L
-1 (branco), todos obtidos com fenda de 20 nm.......................32
Figura 7: Espectros de excitação e emissão fluorescentes de (a) aspartame 1,0 mg L-1
em
NaOH 0,1 mol L-1
e (b) NaOH 0,1 mol L
-1 (branco), todos obtidos com fenda de 20 nm.......33
Figura 8: Os principais produtos de degradação do aspartame quando em (a) baixos valores
de pH e (b) elevados valores de pH.........................................................................................34
Figura 9: Reação de ciclização intramolecular do aspartame (Fonte: adaptado de referência
38)..............................................................................................................................................34
Figura 10: Influência do pH no sinal fluorescente do aspartame 1,0 mg L-1
...........................35
Figura 11: Espectros de excitação e emissão fluorescente (λexc = 210 nm e λem = 285 nm,
fenda de 20 nm) da solução aquosa de aspartame 1,0 mg L-1
, após diferentes tempos de
irradiação UV: (a) 0 min; (b) 15 min; (c) 30 min, sendo os espectros da água ultrapura
(branco) apresentados em (d)...................................................................................................37
Figura 12: Estudo da estabilidade de uma solução aquosa de aspartame 1,0 mg L-1
ao longo do
tempo. Medições realizadas em fenda de 20 nm.......................................................................38
XII
Figura 13: Curva analítica para soluções aquosas de aspartame obtida através de varredura
normal (λexc/λem = 210/285 nm) em fenda de 10 nm.................................................................40
Figura 14: Gráfico de resíduos para as determinações fluorimétricas soluções aquosas de
aspartame...................................................................................................................................40
Figura 15: Espectros de excitação e emissão de (a) amostra E (adoçante com aspartame), (b)
solução aquosa de aspartame 5,0 mg L-1
, (c) amostra A (adoçante sem aspartame), (d) água
ultrapura (branco). Os resultados para as amostras B, C e D mostrados na Tabela 7 foram
iguais ao resultado da amostra A...............................................................................................44
XIII
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Principais métodos analíticos instrumentais reportados na literatura para
determinação de aspartame......................................................................................................21
Tabela 2: Comparação entre os sinais líquidos fluorescentes do aspartame em pH original da
solução aquosa (7,62), e em meios fortemente ácido e básico................................................33
Tabela 3: Comprimentos de onda máximos de excitação (λexc) e emissão (λem) fluorescente do
aspartame 1,0 mg L-1
e os seus respectivos sinais líquidos em diferentes valores de pH
(tampão Britton-Robinson) e em solução aquosa.................................................................... 35
Tabela 4: Efeito da irradiação UV no sinal fluorescente do aspartame 1,0 mg L-1
. Medições
realizadas em fenda de 20 nm................................................................................................. ..36
Tabela 5: Resumo das condições experimentais selecionadas para determinação
espectrofluorimétrica do aspartame em adoçantes....................................................................39
Tabela 6: Parâmetros analíticos de mérito do método desenvolvido por
espectrofluorimetria..................................................................................................................42
Tabela 7: Determinação de aspartame em amostras de adoçantes de mesa (sachês de 800
mg)............................................................................................................................................43
XIV
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA – Agencia Nacional de Vigilância Sanitária
BRICS - Brasil, Rússia, Índia, China e África do Sul
DPR – Desvio Padrão Relativo
DKP - Dicetopiperazina
FDA – Food and Drug Administration
FAO – Food and Agriculture Organization
IDA – Ingestão Diária Aceitável
INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia
JECFA – Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives
LAQAFA – Laboratório de Química Analítica Fundamental e Aplicada
LD – Limite de Detecção
LQ – Limite de Quantificação
OMS – Organização Mundial de Saúde
SVS/MS - Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde
UERJ– Universidade Estadual do Rio de Janeiro
VIGITEL - Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito
Telefônico
u.a. – Unidades arbitrárias
WHO – World Health Organization
exc – Comprimento de onda de excitação
XV
em – Comprimento de onda de emissão
16
1. INTRODUÇÃO
1.1 Alimentação
A alimentação tem um papel fundamental na vida de todos os seres vivos. No
entanto, tem se tornado cada vez mais industrializada, devido à praticidade e ao pouco
tempo que a correria do dia a dia impõe. A organização humanitária britânica, Oxfam,
realizou uma pesquisa revelando que o país que tem a alimentação mais saudável no mundo
é a Holanda e, em 25º lugar no ranking, ficou o Brasil. 1
A relação direta entre o que as pessoas comem e a influência em sua saúde tem
causado preocupação. Já é comprovado cientificamente que obesidade, doenças
cardiovasculares, distúrbios metabólicos e diabetes são consequências não só do
sedentarismo, mas também da má alimentação. 2
Uma dieta baseada em alimentos ricos em açúcar e gordura é o fator determinante que
resulta em peso corporal inadequado. Estudos indicam que, no Brasil, a obesidade e sobrepeso
atingem 30% das crianças e adolescentes. 3, 4
Baseados nessa questão atual, pesquisadores do Instituto de Medicina da
Universidade Estadual do Rio de Janeiro (UERJ) desenvolveram um guia de alimentação
saudável com recomendações e instruções sobre os alimentos que devem ser ingeridos em
uma dieta ideal e como cada um desses nutrientes influencia na perda ou ganho de peso.
Entre as recomendações para uma boa alimentação destacam-se a redução de açúcar,
refrigerantes, sal, leites e derivados com alto teor de gordura. 3
Outro seguimento importante que tem se destacado na busca por uma alimentação
balanceada e de baixo teor calórico é o de desenvolvimento muscular corporal, que é cada
vez mais almejado nas academias de ginástica. A busca pelo corpo “ideal” tem feito muitas
pessoas mudarem sua alimentação e aumentarem os níveis de exercício físico. Porém, não
são poucos os casos de internações, bulimia, anorexia e, em casos mais extremos, morte,
devido à busca pelo estereótipo imposto pela sociedade. 5
O aumento percentual da obesidade para os brasileiros adultos (índice de massa
corporal acima de 25), segundo o BRICS (Brasil, Rússia, Índia, China e África do Sul,
países que compartilham de uma situação econômica com índices de desenvolvimento e
17
situações econômicas parecidas), foi de 39% em 2006 para 49% em 2014 (mulheres) e de
47% em 2006 para 57% em 2014 (homens). 6
O estudo feito pela Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças
Crônicas por Inquérito Telefônico (VIGITEL) demonstra que o número de brasileiros
acima do peso vêm crescendo com o passar dos anos; porém, ainda fica abaixo da média
quando comparado à África do Sul, Rússia e China, ficando acima apenas da Índia. 6
1.2 Edulcorantes
O aumento na preocupação com os riscos oferecidos pelo consumo excessivo de
produtos com sacarose em sua composição, como refrigerantes, salgados e massas, foi o
grande motivador do desenvolvimento de substâncias que permitissem a substituição desse
açúcar por algo menos calórico e que mantivesse o sabor adocicado dos mesmos.
Neste contexto, os edulcorantes são substâncias com poder adoçante elevado e baixo
teor calórico utilizados na formulação de produtos destinados a pessoas diabéticas e/ou
obesas. 7, 8
A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomendou, em 2014, que o consumo de
açúcar fosse reduzido de 10% da dieta diária para apenas 5% tanto para adultos quanto para
crianças. O objetivo dessa recomendação é a diminuição na quantidade de açúcar ingerido a
partir de produtos industrializados que muitas vezes não são vistos como doce. No ketchup,
por exemplo, a quantidade de açúcar é de 4 g em uma colher de chá, enquanto que em uma
lata de refrigerante tem cerca de 40 g em geral. 8, 9
A substituição ou diminuição do açúcar deve ser levada em consideração por sua
riqueza em calorias e pobreza em nutrientes. O açúcar refinado, mais utilizado à mesa, após
as etapas de refinamento fica pobre em vitaminas e sais minerais, permanecendo, em quase
totalidade, a sacarose. 9
Os adoçantes de mesa, segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA), são produtos formulados para conferir sabor doce aos alimentos e bebidas, e são
constituídos por edulcorante(s) previsto(s) em Regulamento Técnico para Açúcares e
Produtos para Adoçar (Resolução RDC nº 271, de 22 de setembro de 2005)12
. Dentre os
edulcorantes artificiais destacam-se a sacarina, ciclamato, acesulfame-k, sucralose e o
aspartame (substância de interesse neste trabalho).8
O uso dos edulcorantes artificiais em adoçantes de mesa desperta a preocupação dos
consumidores devido à existência de dados controversos no que diz respeito à segurança em
18
sua utilização. Antes da autorização do consumo de qualquer um desses aditivos, faz-se
necessário um controle rigoroso com avaliação toxicológica em que os efeitos do uso desses
edulcorantes devem ser observados por longos períodos para caracterização de acúmulo no
organismo e detecção de possível toxicidade. São encontrados relatos na literatura que
relacionam seu consumo como causa de problemas graves de saúde como câncer, alergias e
hiperatividade. Portanto, todos os aditivos devem ser analisados periodicamente, pois podem
sofrer variações nas condições de utilização que alterem seu comportamento, aumentando ou
diminuindo sua possível toxicidade. 9, 10, 11
1.3 Aspartame
O aspartame, descoberto acidentalmente em 1965 por um pesquisador dos
laboratórios G. D. Searle, nos Estados Unidos, é um tipo de edulcorante sintético que
apresenta poder adoçante 200 vezes maior que a sacarose. Seu sabor é o mais próximo ao do
açúcar comum, o que é relativamente bom quando comparado com a grande maioria dos
edulcorantes sintéticos que podem apresentar gosto agridoce, doce-azedo, doce metálico ou
até mais doce que o próprio açúcar. 12, 13
Quimicamente chamado de N-L-alfa-aspartil-L-fenilalanina-L-metil-éster, com
fórmula química C14H18N2O5, massa molar 294,301g mol-1
e é sólido branco solúvel em
água, sendo composto pelos aminoácidos ácido aspártico e fenilalanina. A Figura 1
apresenta sua estrutura química. 13
Figura 1: Estrutura química do aspartame.
O consumo de aspartame só foi autorizado no Brasil em 1988, após a realização de
diversos estudos toxicológicos e, ainda assim, há questionamentos em relação a sua
segurança e toxicidade. Após ingestão, o aspartame é rapidamente hidrolisado no intestino
19
formando o dipeptídeo L-aspartil-L-fenilalanina e metanol. Por sua vez, o dipeptídeo é
metabolizado nas células da mucosa intestinal em ácido aspártico e fenilalanina e o metanol
é metabolizado em formaldeído e, então, em ácido fórmico. Estudos realizados in vivo
demonstram que o formaldeído pode estar relacionado com o aumento da incidência de
linfomas e leucemias, porém, segundo alguns autores, seriam necessárias altas doses de
aspartame para gerar toxicidade, uma vez que a quantidade de metanol e, consequentemente,
de formaldeído liberada pela digestão do aspartame é muito pequena 14, 15, 16
. Pesquisadores
buscam a confirmação ou não da relação do consumo de aspartame com aparecimento de
tumores, câncer, mudanças de humor e perda de memória12, 17,18
. Alguns efeitos colaterais
associados ao aspartame, já comprovados cientificamente, são indução de reações de
hipersensibilidade, manifestadas por urticária, prurido e angioedema, e acidose tubular
renal, quando consumido em grande quantidade. 14
A avaliação toxicológica deste agente edulcorante pelo Joint Food and Agriculture
Organization (FAO) / World Health Organization (WHO) Expert Committee on Food
Additives (JECFA), um comitê científico internacional de especialistas que avalia a
inocuidade de aditivos alimentares, estabeleceu que a Ingestão Diária Aceitável (IDA) de
aspartame seria de 40 mg kg-1
de peso corpóreo, valor que também corresponde à IDA do
aspartame no Brasil.15, 19
Segundo o Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia (INMETRO), o
aspartame é contraindicado para fenilcetonúricos, gestantes e lactentes 12
. A contraindicação
do consumo de aspartame durante a gestação é motivada pelo acúmulo de ácido aspártico.
Segundo o pesquisador Sturtevant20
, através de suas pesquisas em ratos, a ingestão
considerável de aspartame é responsável pela produção de necrose neuronal hipotalâmica. O
autor Stegink, por sua vez, afirma que o ácido aspártico não se acumula nos tecidos fetais e,
por isso, não existe comprovação da toxicidade fetal resultante do consumo de aspartame
durante a gestação. 21
Um dos mais evidentes e comprovados danos causados pela ingestão de aspartame
remete às pessoas com uma doença rara, conhecida mundialmente como fenilcetonúria. Trata-
se da mutação no gene responsável pela codificação da enzima fenilalanina-hidroxilase,
ativada no fígado e com função de metabolizar o aminoácido fenilalanina em tirosina.
Quantidades excessivas de fenilalanina no sangue fazem com que este aminoácido tenha
capacidade de entrar no Sistema Nervoso Central, causando consequências tóxicas
gravíssimas, como retardo mental. Essa doença é diagnosticada no “teste do pezinho” em
recém-nascidos, por isso é de suma importância sua realização. O diagnóstico precoce é
20
fundamental para controle e tratamento adequado da doença, sendo necessária a exclusão ou
substituição de todos os alimentos que forneçam, de alguma forma, a fenilalanina. Esse
controle impede o desenvolvimento de retardo mental, porém, são necessários alimentos que
deem o aporte proteico que é perdido pela exclusão desse aminoácido. 22
Segundo a determinação da Portaria da Secretaria de Vigilância Sanitária do
Ministério da Saúde - SVS/MS N.º 29/98, deve constar no rótulo de alimentos com adição de
aspartame, em negrito, a informação “contém fenilalanina” para que se torne possível o
controle dietético pelos portadores dessa deficiência metabólica. 23
1.4 Métodos analíticos para a determinação de aspartame
O aspartame tem sido alvo de diversas pesquisas no campo científico, principalmente
devido ao interesse da indústria em comprovar ou não se este edulcorante é prejudicial à
saúde. As técnicas mais utilizadas para sua determinação é a espectrofotometria de absorção
molecular no UV-visível, Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência (HPLC) e eletroforese
capilar (EC), ambas acopladas com detectores espectrofotométricos de absorção no
ultravioleta (UV) 10, 24, 25
. Alguns métodos espectrofotométricos, métodos cromatográficos e
eletroforéticos encontrados na literatura para esta determinação estão resumidos na Tabela 1.
Métodos baseados na espectrofluorimetria para a determinação do aspartame não foram
amplamente explorados como os anteriores, sendo somente encontrados na literatura métodos
cromatográficos utilizando a técnica de Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência (HPLC)
acoplada com detector de fluorescência.
21
Tabela 1. Principais métodos analíticos instrumentais reportados na literatura para
determinação de aspartame.
Técnica utilizada Características Referências
Eletroforese Capilar - UV
λ = 220 nm
26 LD = 5,1 mg L-1
LQ = 9,4 mg L-1
Faixa Linear = 6,5 - 21,5 mg L-1
Espectrometria de absorção
no UV-Vís
Determinação indireta do aspartame
utilizando ninidrina como reagente
derivatizante.
λ = 603 nm
LD = 0,577 mg L-1
LQ não especificado
Faixa Linear = 5,89 - 58,9 mg L-1
27
HPLC – UV
λ = 210 nm
28
LD = 0,08 mg L-1
LQ = 0,23 mg L-1
Faixa Linear = 1,5 - 50 mg L-1
HPLC-Fluorescência
Determinação indireta do aspartame
utilizando fluorescamina como
reagente de fluorescência
λexc/λem = 395/482
LD = 0,04 mg L-1
LQ não especificado
Faixa Linear = 1,0 – 4,0 mg L-1
29
Portanto, como não há na literatura registro de desenvolvimento de método
espectrofluorimétrico para a determinação de aspartame, a proposta desse trabalho foi
desenvolver um novo método analítico baseado na espectrofluorimetria, que seja de fácil
realização, simples, rápido e economicamente favorável para sua quantificação em adoçantes
de mesa. Comparada a outras técnicas, como HPLC, a espectrofluorimetria apresenta maior
rapidez, simplicidade e menor consumo de reagentes.
22
2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS
2.1 Objetivos
2.1.1 Objetivo geral
O presente trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de um método analítico
baseado na espectrofluorimetria que seja simples, rápido, sensível e de baixo custo para
determinação do edulcorante artificial aspartame como adulterante em adoçantes de mesa.
2.1.2 Objetivos específicos
- Estudar as características fluorescentes da molécula do aspartame para a otimização
das condições experimentais que proporcionem a melhor sensibilidade para o método
espectrofluorimétrico;
- Validar a metodologia desenvolvida considerando os seguintes parâmetros:
linearidade e faixa linear, limites de detecção e quantificação, precisão e exatidão;
- Realizar estudos de preparo das amostras (adoçantes de mesa);
- Aplicar o método para quantificar aspartame, principalmente em adoçantes de mesa
na forma de pó (sachês), que dizem não ter este edulcorante em sua formulação, verificando
se os mesmos estão em conformidade com a informação fornecida no rótulo;
2.2 Justificativas
O mercado de consumo dos adoçantes de mesa encontra-se em expansão não só
pelo aumento de casos de diabetes, mas também porque a procura por este produto é
motivada por interesse das pessoas em manter a boa forma corporal, já que os adoçantes têm
uma quantidade de calorias muito menor que o açúcar comum.
No entanto, conforme já mencionado na Seção 1.3, o uso do aspartame é alvo de
diversas críticas devido à sua possível toxicidade. Muitos estudos indicam que seu consumo
em excesso pode causar reações graves à saúde como problemas dermatológicos,
respiratórios, neurológicos e até mesmo câncer. 10
23
Por este motivo, visando preservar a saúde do consumidor, é importante ampliar e
simplificar os meios analíticos para quantificação deste edulcorante, principalmente com o
intuito de identificar a sua presença ou não como adulterante em adoçantes de mesa nos quais
os fabricantes declaram não conter este edulcorante.
24
3. FLUORIMETRIA – BREVE FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
A fluorescência é um fenômeno que ocorre devido à emissão da radiação por espécies
químicas (luminóforos) após terem absorvido radiação eletromagnética na região do visível e do
ultravioleta. Portanto, ao absorver um fóton, a molécula é promovida para um estado de maior
energia, denominado estado excitado singleto (S1). Uma molécula que não absorveu nenhum
fóton encontra-se no estado fundamental singleto, denominado S0 (Figura 2). A fluorescência,
portanto, é caracterizada pela transição da molécula do estado excitado ao estado fundamental
com liberação de fótons, mantendo o mesmo número quântico de spin. 30, 31
Figura 2: Diagrama de orbitais moleculares no estado fundamental e excitado da molécula.31
O diagrama a seguir (Figura 3) representa, de forma sucinta, as etapas do fenômeno
da fluorescência. Pode-se observar a ocorrência da absorção de energia eletromagnética pela
molécula ocasionando a transição eletrônica do estado fundamental para o estado excitado de
maior energia e, em seguida, o relaxamento da molécula do nível de mais alta energia para um
de menor dentro daquele mesmo estado vibracional e, por último, a liberação de fótons que
resulta na fluorescência. 31
25
Figura 3: Diagrama simplificado indicando os processos que ocorrem na fluorescência. 31
Quanto maior a população de elétrons deslocalizados em uma molécula, maior seu
potencial fluorescente. Esta característica é preponderante em moléculas orgânicas
aromáticas. Existem também outros fatores que interferem diretamente na fluorescência,
como a estrutura da molécula, temperatura, o solvente utilizado, o pH na solução do analito, a
presença de heteroátomos e espécies capazes de desativar a molécula.31, 32
A presença de heteroátomos, por exemplo, afeta a fluorescência principalmente
quando estes estão ligados diretamente com o sistema π conjugado, pois há redução da
energia devido à transição eletrônica ser do tipo n → π* que representa absorção molar muito
menor do que transições do tipo π → π* que acontecem na ausência de heteroátomos
resultando na diminuição da fluorescência neste tipo de molécula. Estruturas planares de
moléculas são favorecidas pelo aumento na conjugação e interação dos elétrons
deslocalizados. 31
O tipo de solvente escolhido deve levar em consideração que suas características
podem afetar a fluorescência, pois conforme a sua polaridade, caráter prótico e viscosidade
podem acontecer aumento ou diminuição do sinal fluorescente. 31
A espectrofluorimetria constitui uma técnica de obtenção de espectros de emissão
molecular partindo da excitação do analito em comprimentos de onda específicos. A aplicação
de energia em forma de luz sobre o analito resulta na excitação da amostra em seu
comprimento de onda de absorção que é chamado também de excitação e, em um
comprimento de onda maior de emissão chamado de comprimento de onda de fluorescência.
31, 32, 33
26
Os espectros fluorescentes regularmente apresentam imagens de excitação e emissão
que podem ser sobrepostas. Isto acontece devido às diferenças de energia entre os estados
vibracionais no estado fundamental e no estado excitado serem as mesmas. 31
27
4 MATERIAIS, REAGENTES, SOLUÇÕES, INSTRUMENTAÇÃO E
MÉTODOS
4.1 Materiais e reagentes
A água ultrapurificada (18,2 MΩcm) utilizada para o preparo de todas as
soluções aquosas foi obtida a partir do sistema de purificação de água Arium Bagtanks,
Sartorius, Alemanha. Ácido clorídrico P.A. (Vetec, Brazil), hidróxido de sódio (Merck,
Brasil), etanol (Vetec, Brasil) e metanol (J.T.Baker, EUA) foram utilizados na
otimização do método espectrofluorimétrico. Ácido bórico (Vetec, Brasil), ácido
fosfórico (Vetec, Brasil) e ácido acético (Vetec, Brasil) foram utilizados no preparo do
tampão Britton-Robinson e o pH foi ajustado com solução de NaOH 0,1 mol L-1
com
auxílio de um pHmetro (DM-22, Digimed, Brasil). Câmara de radiação ultravioleta
construída no próprio laboratório - LaQAFA (Laboratório de Química Analítica
Fundamental e Aplicada) foi usada para o estudo da influência do tratamento
fotoquímico no sinal fluorescente do aspartame.34
4.1.1 Amostras
Quatro marcas distintas de adoçantes de mesa comercializados em forma de pó
(sachê), cuja composição (segundo o rótulo do fabricante) não apresentava o aspartame
como edulcorante, foram analisadas neste trabalho. Estes adoçantes foram adquiridos de
diferentes estabelecimentos comerciais (restaurantes, lanchonetes e padarias) da cidade
de Niterói, RJ-Brasil.
4.2 Soluções
Para a otimização do método espectrofluorimétrico foi utilizada solução
padrão de aspartame 1,0 mg L-1
(0,0034 mol L-1
), obtida a partir da diluição de solução
estoque 100 mg L-1
em diferentes solventes, como metanol, etanol, HCl 0,1 mol L-1
,
NaOH 0,1 mol L-1
e tampão Britton-Robinson em diferentes valores de pH.
O tampão Britton-Robinson foi preparado com a mistura de partes iguais das
soluções de ácido fosfórico 0,04 mol L-1
, ácido acético 0,04 mol L-1
e ácido bórico
28
0,04 mol L-1
com adições de volume adequado de NaOH 0,1 mol L-1
para atingir o pH
desejado.
O estudo do efeito da radiação ultravioleta foi realizado com a solução aquosa
de aspartame 1,0 mg L-1
. Esta solução foi colocada em tubos de quartzo (1,9 cm de
diâmetro e 13,7 cm de altura) e posicionada no centro do reator fotoquímico por 15 e 30
minutos.
A partir da solução estoque 100 mg L-1
(0,34 mol L-1
), preparada a cada dia de
análise, foram feitas diluições e soluções de 0,5; 0,75; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 mg L-1
que
foram utilizadas na construção das curvas analíticas.
4.3 Medições por espectrofluorimetria
O estudo da fluorescência do aspartame foi realizado no espectrofluorímetro da
marca VARIAN, modelo Cary Eclipse, tendo como fonte de excitação uma lâmpada
pulsátil do tipo descarga de xenônio, com 80 Hz e 12 watts. O equipamento apresenta
abertura de fenda (banda espectral de passagem) variando de 1,5 a 20 nm e permite
velocidade de varredura de 0,01 a 2400 nm min-1
. Seu detector, um fotomultiplicador
PMT R928, tem resposta sensível que detecta radiação até 900 nm. A aquisição de dados
e total controle do equipamento foi feita com o sistema operacional SWEclipse® Bio
Pack V 1.1 (XP WIN2000) software.
Para a medidas espectrofluorimétricas, foram utilizadas as bandas espectrais de
passagem de 10 e 20 nm, com velocidade de varredura de 1200 nm s-1
e cubetas de
quartzo com caminho óptico de 1 cm. Os comprimentos de onda de excitação (exc) e
emissão (em) máximos do aspartame em que foram feitas as medidas foram exc/em=
210/285 nm. Os valores dos sinais dos brancos foram medidos em todas as análises para
que, posteriormente, fossem feitos os cálculos dos valores líquidos referentes ao sinal
fluorescente do analito.
4.4 Preparo das amostras de adoçante em pó
Todo o conteúdo dos sachês das amostras de adoçantes foi pesado (800 mg) e
dissolvido em 250 mL de água ultrapura. As soluções foram previamente filtradas, antes
29
das medidas por espectrofluorimetria, com filtros de membrana de politetrafluoretileno
(PTFE) de porosidade 0,45 μm, para eliminar os excipientes dos adoçantes que não são
totalmente solúveis em água.
30
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um método analítico
espectrofluorimétrico eficaz, rápido e de baixo custo para determinação de aspartame
em adoçantes, tendo em vista que não existem muitas citações na literatura que utilizem
esta técnica na determinação em questão.
Foram realizados estudos de otimização, através da avaliação de fatores como
solvente, pH do meio e irradiação ultravioleta, com o objetivo de verificar a influência
destes parâmetros no sinal fluorescente do aspartame e garantir maior seletividade e
sensibilidade ao método.
5.1 Verificação do par excitação/ emissão (exc/em) fluorescente para o aspartame
O primeiro estudo realizado foi a verificação dos comprimentos de onda
máximos de excitação (λexc) e de emissão (λem) fluorescente do aspartame através da
varredura de sua solução aquosa a 1,0 mg L-1
. O par exc/em encontrado foi 210/285 nm
e os respectivos espectros de excitação e emissão, obtidos com fenda de 20 nm, podem
ser vistos na Figura 4.
200 250 3000
200
400
600
800
1000
Comprimento de onda (nm)
Inte
nsi
dad
e d
o s
inal
flu
ore
scen
te (
u.a
.)
(a)
(b)
(a)
(b)
Figura 4: Espectros de excitação e emissão fluorescente de (a) solução aquosa de
aspartame 1,0 mg L-1
e (b) água ultrapura (branco).
31
5.2 Estudo do efeito do solvente
A viscosidade, a polaridade e o caráter prótico do solvente afetam diretamente
a luminescência do analito, sendo que os solventes mais polares tendem a estabilizar os
luminóforos no estado excitado, desfavorecendo perda de energia por processos como
relaxação vibracional e favorecendo a fluorescência 35
. Sendo assim, metanol, etanol e
água:metanol (1:1 v/v) foram utilizados com o objetivo de verificar a influência do
solvente no sinal fluorescente do aspartame.
Os resultados obtidos (Figura 5) mostraram que os solventes metanol, etanol e
a mistura metanol:água (1:1 v/v) apresentavam alto sinal de fundo (provavelmente por
contaminantes provenientes da própria fabricação), tornando inviável o uso para
medição do aspartame.
Portanto, a utilização de água como solvente apresentou vantagens, tornando o
método mais simples, barato e seguro. Além disso, tendo em vista que a aplicação do
método é em amostras de adoçantes, o uso de soluções aquosas dispensaria um
tratamento dos rejeitos. Por este motivo, o desenvolvimento do método
espectrofluorimétrico prosseguiu com o emprego de água ultrapura como solvente.
Inte
nsi
dad
ed
osi
nal
flu
ore
scen
te(u
.a.)
200 250 3000
200
400
600
800
1000
Comprimento de onda (nm)
(c)
(e)
(a)
(d)
(b)
(d)
(e)
Figura 5: Espectros de excitação e emissão fluorescentes dos solventes (a) metanol, (b)
etanol, (c) metanol:água 1:1, (d) solução aquosa do aspartame 1,0 mg L-1
e de (e) água
ultrapura, todos obtidos em fenda de 20 nm.
32
5.3 Estudo da influência do pH
O pH é um parâmetro muito importante na fluorescência devido às diferenças
entre as propriedades luminescentes de moléculas com carga ou neutras, sendo que as
primeiras apresentam maior chance de fluorescer devido à maior rigidez molecular 35
.
Sendo assim, foi realizado um estudo das características fluorescentes do aspartame em
meio ácido e básico, utilizando soluções deste analito em HCl 0,1 mol L-1
e NaOH 0,1
mol L-1
.
As Figuras 6 e 7 mostram os espectros de excitação e emissão fluorescentes do
aspartame nos meios ácido e básico, respectivamente. Como pode ser visto, houve um
decréscimo no sinal líquido fluorescente do aspartame em ambos os meios, em
comparação com o sinal líquido deste analito em meio aquoso (pH original igual a
7,62). Além disso, observou-se também um deslocamento do λexc de 210 nm (em água
ultrapura) para 220 nm (em NaOH 0,1 mol L-1
). A Tabela 2 apresenta a comparação
entre os sinais líquidos fluorescentes do aspartame nos meios aquoso, ácido e básico,
demonstrando que maiores intensidades foram alcançadas em solução aquosa.
(a)
(b)
200 250 3000
200
400
600
800
1000
Comprimento de onda (nm)
Inte
nsi
dad
ed
osi
nal
flu
ore
scen
te(u
.a.)
(a)
(b)
Figura 6: Espectros de excitação e emissão fluorescentes de (a) aspartame 1,0 mg L-1
em
HCl 0,1 mol L-1
e (b) HCl 0,1 mol L
-1 (branco), todos obtidos com fenda de 20 nm.
33
(b)
(a)
200 250 3000
200
400
600
800
1000
Comprimento de onda (nm)
Inte
nsi
dad
ed
osi
nal
flu
ore
scen
te(u
.a.)
(a)
(b)
Figura 7: Espectros de excitação e emissão fluorescentes de (a) aspartame 1,0 mg L-1
em NaOH 0,1 mol L-1
e (b) NaOH 0,1 mol L
-1 (branco), todos obtidos com fenda de 20
nm.
Tabela 2: Comparação entre os sinais líquidos fluorescentes do aspartame em pH
original da solução aquosa (7,62), e em meios fortemente ácido e básico.
Solvente Sinal líquido fluorescente do aspartame
Água ultrapura 390
HCl 0,1 mol L-1
306
NaOH 0,1 mol L-1
331
O aspartame é relativamente estável no estado sólido e a baixas temperaturas.
Porém, a degradação da substância em solução é dependente do pH do meio e da
temperatura. Em meios com baixos valores de pH, o dipeptídeo é hidrolisado em seus
aminoácidos constituintes (ácido aspártico e fenilalanina); já em altos valores de pH,
uma ciclização intramolecular ocorre formando o DKP (dicetopiperazina) como
principal produto de degradação. As reações citadas são favorecidas pelo aumento da
34
temperatura e do tempo de exposição do aspartame às condições necessárias para sua
degradação. A Figura 8 apresenta os principais produtos de degradação do aspartame e
na Figura 9 observa-se a reação de ciclização intramolecular do aspartame com a
formação de DKP 36, 37, 38
. Portanto, sabendo-se que o aspartame é instável em soluções
ácidas e básicas, é possível sugerir que a variação do sinal fluorescente nestes meios
pode ser devido à degradação da molécula gerando substâncias que apresentam sinais
fluorescentes menores do que o do aspartame em solução aquosa.
Figura 8: Os principais produtos de degradação do aspartame quando em (a) baixos
valores de pH e (b) elevados valores de pH. (Fonte: adaptado de referência 38).
Figura 9: Reação de ciclização intramolecular do aspartame (Fonte: adaptado de
referência 38).
Um estudo mais detalhado do pH foi realizado utilizando tampão Britton-
Robinson na faixa de valores de pH compreendidos entre 2,0 e 12,0. Pequenos
deslocamentos do par λexc/λem e diferentes valores de intensidade fluorescente foram
35
observados em comparação com solução aquosa do analito, conforme apresentado na
Tabela 3 e na Figura 10. Como a maior intensidade fluorescente foi obtida em solução
aquosa, evidenciou-se que o emprego do tampão Britton-Robinson para obtenção de
diferentes valores de pH não favoreceu o aumento da sensibilidade do método.
Tabela 3: Comprimentos de onda máximos de excitação (λexc) e emissão (λem)
fluorescente do aspartame 1,0 mg L-1
e os seus respectivos sinais líquidos em diferentes
valores de pH (tampão Britton-Robinson) e em solução aquosa.
pH λexc/λem (nm) Sinal líquido
fluorescente (u.a.)
2,0 197/290 149
4,0 210/285 243
6,0 220/297 34
7,62 (pH original da solução aquosa) 210/285 390
8,0 210/285 65
10,0 215/290 133
12,0 215/290 24
0
100
200
300
400
2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0
pHInte
nsi
dad
ed
osi
nal
flu
ore
scen
te(u
.a.)
Figura 10: Influência do pH no sinal fluorescente do aspartame 1,0 mg L-1
.
36
5.4 Estudo da influência do tratamento fotoquímico
De um modo geral, a incidência de radiação UV sobre a solução do analito
pode ocasionar uma transformação na molécula de forma a produzir derivado(s) com
fluorescência maior do que a molécula inicial (ganho de sensibilidade para o método),
além de reduzir o sinal de potenciais interferentes. Por outro lado, o efeito contrário
também pode ocorrer, ou seja, a irradiação UV pode produzir derivados com menor
eficiência quântica. 35
Sabendo disso, soluções aquosas do aspartame a 1,0 mg L-1
condicionadas em
tubos de quartzo foram submetidas a diferentes tempos (15 e 30 min) de irradiação UV
em câmara de UV artesanal construída no próprio laboratório. Os resultados obtidos
estão na Tabela 4, na qual é possível observar uma queda considerável na intensidade do
sinal fluorescente do analito quando exposto à irradiação UV. No entanto, não houve
alteração dos comprimentos de onda máximos de excitação e emissão após tratamento
fotoquímico.
Tabela 4: Efeito da irradiação UV no sinal fluorescente do aspartame 1,0 mg L-1
.
Medições realizadas em fenda de 20 nm.
Tempo na câmara de
UV (min)
Sinal líquido fluorescente
(u.a.)
0 332
15 18
30 0
Portanto, estes estudos demonstraram que o uso da irradiação UV não era
vantajoso para o método, pois houve grande perda de sensibilidade, conforme também
pode ser visto nos espectros de excitação e emissão mostrados na Figura 11.
37
200 250 300 3500
200
400
600
800
1000
Comprimento de onda (nm)
Inte
nsi
dad
e d
o s
inal
flu
ore
scen
te (
u.a
.)
(c)(c)
(a) (a)
(b) (b)
(d)(d)
Figura 11: Espectros de excitação e emissão fluorescente (λexc = 210 nm e λem = 285 nm,
fenda de 20 nm) da solução aquosa de aspartame 1,0 mg L-1
, após diferentes tempos de
irradiação UV: (a) 0 min; (b) 15 min; (c) 30 min, sendo os espectros da água ultrapura
(branco) apresentados em (d).
5.5 Estudo da estabilidade do aspartame em meio aquoso
Como já mencionado na Seção 5.3, o aspartame tem certa estabilidade quando
está no estado sólido e a baixas temperaturas, podendo sofrer degradação dependendo
do meio, do pH, da temperatura e do tempo em que se encontra em solução.
Um estudo da estabilidade do sinal fluorescente do analito em solução aquosa
foi realizado com o intuito de saber por quanto tempo a solução deste analito poderia ser
preservada sem que houvesse qualquer alteração do sinal. A Figura 12 apresenta o
resultado deste estudo, o qual foi realizado em solução aquosa de aspartame 1,0 mg L-1
,
com medições feitas em intervalos de 30 em 30 min durante 4 h e 30 min.
38
Figura 12: Estudo da estabilidade de uma solução aquosa de aspartame 1,0 mg L-1
ao
longo do tempo. Medições realizadas em fenda de 20 nm.
Com este estudo, concluiu-se que a solução aquosa de aspartame pode ser
armazenada em temperatura ambiente e sem a necessidade de estar ao abrigo da luz por
até 3h e 30min, sem que a mesma sofra alteração significativa de suas características
luminescentes originais. Além disso, nenhum deslocamento das bandas de excitação e
emissão fluorescentes foi observado.
5.6 Condições finais experimentais otimizadas para a determinação
espectrofluorimétrica do aspartame
Após os estudos de otimização dos parâmetros principais para obtenção do
melhor sinal analítico e, consequentemente, melhor sensibilidade, realizados nas Seções
de 5.1 a 5.5, a Tabela 5 apresenta as condições finais obtidas.
39
Tabela 5: Resumo das condições experimentais selecionadas para determinação
espectrofluorimétrica do aspartame em adoçantes.
Tipo de Varredura Normal
λexc/λem 210/285
pH original (pH = 7,62)
Solvente Água ultrapurificada
Como pode ser visto, o método desenvolvido apresenta condições
experimentais que são extremamente simples, sendo esta uma grande vantagem que
favorece a sua aplicação.
5.7 Obtenção dos parâmetros analíticos de mérito
Os parâmetros analíticos de mérito foram obtidos para o aspartame nas
condições estabelecidas na Tabela 6, de acordo com o documento DOQ-CGCRE-008
(“Orientação sobre validação de métodos analíticos”) do INMETRO. 39
Para a obtenção dos parâmetros relacionados com a resposta linear, pelo menos
três curvas analíticas foram construídas e cada ponto da curva foi o resultado médio de
três medições de sinal de fluorescência obtidos no comprimento de onda máximo de
emissão (285 nm). As curvas foram realizadas em banda espectral de passagem (fenda)
de 20 ou 10 nm, sendo os melhores resultados obtidos em fenda de 10 nm. Este estudo
permitiu verificar uma faixa de resposta linear que se estendeu de 0,5 mg L-1
a 5,0 mg L-
1, caracterizada pelo valor de R
2 igual a 0,9977 (Figura 13); e o comportamento
homoscedástico foi confirmado através do gráfico de resíduos (Figura 14).
40
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
Sin
al f
luo
resc
ente
(u
.a.)
Concentração (mg L-1)
Figura 13: Curva analítica para soluções aquosas de aspartame, obtida através de
varredura normal (λexc/λem = 210/285 nm) em fenda de 10 nm.
-8,0
-6,0
-4,0
-2,0
0,0
2,0
4,0
6,0
0,0 2,0 4,0 6,0
Res
ídu
os
Concentração (mg L-1)
Figura 14: Gráfico de resíduos para as determinações fluorimétricas de soluções aquosas
de aspartame.
41
A detectabilidade do método foi avaliada pelos valores de limite de detecção
(LD) e de quantificação (LQ) usando os seguintes critérios: LD = 3s/a e LQ= 10s/a, em
que s é o desvio padrão de 7 medições independentes do branco (água ultrapura) e a é o
coeficiente angular da curva analítica. Valores satifatórios de 0,13 e 0,43 mg L-1
foram
obtidos para o LD e LQ, respectivamente.
A precisão foi avaliada em termos da repetitividade e precisão intermediária.
A repetitividade representa a concordância entre os resultados de medições
sucessivas efetuadas sob as mesmas condições de medição, ou seja, mesmo
procedimento, analista e instrumento usado sob as mesmas condições, mesmo local e
repetições em um curto intervalo de tempo. Neste trabalho, a repetitividade foi avaliada
através de 7 medições consecutivas, usando solução aquosa de aspartame na
concentração de 3,0 mg L-1
(centro da curva analítica). O resultado obtido produziu um
desvio padrão relativo de 3,2%, sendo este valor considerado satisfatório, pois é menor
que o valor máximo permitido (5%).39
Já a precisão intermediária refere-se à precisão avaliada sobre a mesma
amostra, utilizando o mesmo método, no mesmo laboratório, mas definindo exatamente
quais as condições a variar (uma ou mais), tais como: diferentes analistas; equipamentos
e tempos. Neste trabalho optou-se por avaliar a precisão intemediária através de 7
medições independentes de solução aquosa de aspartame 3,0 mg L-1
realizadas pelo
mesmo analista em dias diferentes. O teste t-Student (nível de confiança de 95%) foi
usado para comparar as médias do sinal líquido fluorescente obtidas em dias diferentes.
O valor de tcalculado (0,191) obtido foi menor que o valor de tcrítico (2,780), sendo assim,
pode-se concluir que não existe diferença entre as médias dos sinais fluorescentes
obtidos em dias diferentes, e, portanto, o método é preciso no nível de precisão
intermediária.
A viabilidade do método foi verificada através de ensaios de recuperação.
Amostras de adoçantes de mesa (em pó - sachês) de quatro diferentes marcas (A, B, C e
D), em triplicatas autênticas, foram fortificadas com concentração conhecida de
aspartame (1,0 mg L-1
) e as recuperações foram obtidas através da seguinte equação:
Recuperação (%) = [(C1-C2)/C3]*100, em que C1 é a concentração do analito na amostra
fortificada; C2 é a concentração do analito na amostra não fortificada e C3 é a
concentração do analito adicionado na amostra. A recuperação média do aspartame nas
42
amostras variou de 111 a 120%, o que representa um resultado satisfatório40
,
confirmando a eficácia e a viabilidade do método desenvolvido para a determinação de
aspartame em adoçantes.
Enfim, um resumo dos resultados dos parâmetros analíticos de mérito pode ser
visto na Tabela 6.
Tabela 6: Parâmetros analíticos de mérito do método desenvolvido por
espectrofluorimetria.
Parâmetros analíticos de mérito Aspartame
Equação da curva analíticaa Y = 37,754*X – 5,7865
Coeficiente de determinação (R2) 0,9977
Faixa linear (mg L-1
)
0,5 – 5,0
LD (mg L
−1) 0,13
LQ (mg L
−1) 0,43
Repetitividade (DPR%, n = 7) 3,2%
Precisão intermediária (teste t-Student; 95%
confiança; n=14, 2 dias) tcalculado (0,191) < tcrítico (2,780)
Recuperação média (n = 3) 111-120%
aY = intensidade do sinal fluorescente (u.a.); X =
concentração do aspartame em mg L
−1
5.8. Aplicação do método analítico
O método analítico espectrofluorimétrico desenvolvido foi aplicado para
análise de adoçantes de mesa, comercializados na forma de pó (listados na Tabela 7), os
quais, segundo o rótulo dos fabricantes, não continham aspartame em sua composição.
Estas determinações tinham como objetivo verificar se estes adoçantes estavam em
43
conformidade com a informação fornecida ao consumidor, ou seja, confirmar se
realmente não tinham aspartame (seria um adulterante) na mistura em pó.
As amostras estudadas (A, B, C e D) apresentavam em sua composição os
mesmos excipientes, entre eles dióxido de silício (antiumectante) e lactose (diluente).
Para comparação, uma amostra de adoçante de mesa (identificada como E) com os
mesmos excipientes das demais amostras, mas apresentando o aspartame como
edulcorante, também foi analisada. Todos os adoçantes (A, B, C, D e E) foram
preparados conforme descrito no item 4.4 e analisados através do método
espectrofluorimétrico desenvolvido com as condições apresentadas na Tabela 5,
utilizando banda espectral de passagem de 10 nm. Dois sachês de cada marca foram
analisados e os sinais fluorescentes das amostras A, B, C e D corresponderam ao sinal
fluorescente da água ultrapura (branco). Estes resultados levam à conclusão de que os
adoçantes (A, B, C e D) cuja composição era sucralose, realmente não apresentavam o
aspartame como um contaminante a um nível detectável pelo método
espectrofluorimétrico desenvolvido neste trabalho. Vale ressaltar que o método
desenvolvido apresentou boa sensibilidade, com limite de detecção de 0,13 mg L-1
(130
ppb) para o aspartame.
Este método, portanto, pode ser uma alternativa simples aplicada ao controle de
qualidade destes tipos de adoçantes, garantindo a segurança principalmente dos
consumidores que não podem ingerir aspartame, como fenilcetonúricos, gestantes e
lactentes.
Os resultados deste estudo podem ser vistos na Tabela 7 e na Figura 15.
Tabela 7: Determinação de aspartame em amostras de adoçantes de mesa (sachês de 800
mg).
Marcas Tipo de
edulcorante Informação no rótulo
Concentração de
aspartame (mg L-1
)
A Sucralose Não contêm fenilalanina < LD
B Sucralose - < LD
C Sucralose - < LD
D Sucralose - < LD
44
200 250 3000
200
400
600
800
1000
Comprimento de onda (nm)
Inte
nsi
dad
ed
osi
nal
flu
ore
scen
te(u
.a.)
(a) (a)
(b)(b)
(c) (d) (d)(c)
Figura 15: Espectros de excitação e emissão de (a) amostra E (adoçante com aspartame),
(b) solução aquosa de aspartame 5,0 mg L-1
, (c) amostra A (adoçante sem aspartame),
(d) água ultrapura (branco). Os resultados para as amostras B, C e D mostrados na
Tabela 7 foram iguais ao resultado da amostra A.
45
6 CONCLUSÕES
Com o intuito de quantificar aspartame em amostras de adoçantes de mesa,
principalmente naqueles cuja composição não deve conter este (como informado no
rótulo), um método baseado na espectrofluorimetria foi desenvolvido e validado com
sucesso. Estudos das características fluorescentes deste analito foram realizados e as
condições finais mostraram que o método apresentou sensibilidade, precisão e exatidão
adequadas. Além disso, o método foi aplicado em diferentes amostras de adoçante à
base de sucralose e o aspartame não foi detectado.
Como continuação e trabalho futuro, pretende-se ainda realizar ensaios de
recuperação em dois outros níveis de concentração (0,5 e 4,0 mg L-1
), além de
experimentos para melhorar as taxas de recuperação, aproximando-as mais do valor de
100%.
Uma quantidade maior de adoçantes de mesa de diferentes composições, marcas
e tipos (em pó e líquido) também será analisada para verificar a presença ou não de
aspartame na formulação. Amostras de bebidas dietéticas (sucos, refrigerantes) também
poderão ser estudadas. No entanto, vale acrescentar que, dependendo da amostra,
estudos de interferência e seletividade deverão ser realizados, pois a
espectrofluorimetria pode não ser uma técnica muito seletiva para algumas amostras,
visto que muitas substâncias podem fluorescer na mesma faixa de comprimento de
onda.
Enfim, o método desenvolvido neste trabalho pode ser uma boa alternativa para
análise de rotina no controle de qualidade de alguns adoçantes de mesa.
46
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