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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO...

Date post:19-Nov-2018
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  • UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO

    VINICIUS SANTOS GOMES DA SILVA

    PROSPECO DE RIZBIOS DE LEGUMINOSAS ARBREAS EM SOLOS DO SEMIRIDO BRASILEIRO SOB DIFERENTES USOS DA

    TERRA

    Recife 2017

  • Vinicius Santos Gomes da Silva

    Engenheiro Agrnomo

    Prospeco de rizbios de leguminosas arbreas em solos do Semirido brasileiro sob diferentes usos da terra

    Tese apresentada ao Programa de Ps-

    Graduao em Cincia do Solo, da

    Universidade Federal Rural de Pernambuco,

    como parte dos requisitos para obteno do

    ttulo de Doutor em Agronomia Cincia do Solo

    Orientadora

    Dra. Carolina Etienne de Roslia e Silva Santos

    Coorientadores

    Prof. Dr. Alexandre Tavares da Rocha

    Dra. Ana Dolores Santiago de Freitas

    Recife 2017

  • Autorizo a reproduo e divulgao total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio

    convencional ou eletrnico, para fins de estudo e pesquisa desde que citada a fonte.

    Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP) Sistema Integrado de Bibliotecas da UFRPE Nome da Biblioteca, Recife-PE, Brasil

    S586p Silva, Vinicius Santos Gomes da Prospeco de rizbios de leguminosas arbreas em solos do Semirido brasileiro sob diferentes usos da terra / Vinicius Santos Gomes da Silva. 2017. 159 f. : il. Orientadora: Carolina Etienne de Roslia e Silva Santos. Coorientadores: Ana Dolores Santiago de Freitas; Alexandre Tavares da Rocha. Tese (Doutorado) Universidade Federal Rural de Pernambuco, Programa de Ps-Graduao em Cincias do Solo, Recife, BR-PE, 2017. Inclui referncias. 1. Diversidade rizobiana 2. Eficincia simbitica 3. Fixao biolgica de nitrognio 4. Leucaena leucocephala

    5. Mimosa caesalpiniifolia I. Santos, Carolina Etienne de Roslia e Silva, orient. II. Freitas, Ana Dolores Santiago de, coorient. III. Rocha, Alexandre Tavares da, coorient. IV. Ttulo CDD 631.4

  • VINICIUS SANTOS GOMES DA SILVA

    Prospeco de rizbios de leguminosas arbreas em solos do Semirido brasileiro sob diferentes usos da terra

    Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Agronomia - Cincia do Solo,

    da Universidade Federal Rural de Pernambuco, como parte dos requisitos para

    obteno do ttulo de Doutor em Agronomia Cincia do Solo.

    Aprovada em 08 de agosto de 2017

    Dra. Carolina Etienne de Roslia e Silva Santos Orientadora

    Universidade Federal Rural de Pernambuco

    BANCA EXAMINADORA

    Dr. Drio Costa Primo Universidade Federal de Pernambuco

    Profa. Dra. Izabel Cristina de Luna Galindo Universidade Federal Rural de Pernambuco

    Profa. Dra. Giselle Gomes Monteiro Fracetto Universidade Federal Rural de Pernambuco

    Dra. Ana Dolores Santiago de Freitas Universidade Federal Rural de Pernambuco

  • Aos meus pais, Eliane e Valdemy, principais

    incentivadores na realizao deste sonho.

    DEDICO

  • AGRADECIMENTOS

    A Deus por guiar, iluminar e me dar tranquilidade para seguir em frente com os

    meus objetivos e no desanimar com as dificuldades.

    Aos meus pais, minha irm Elaine e minha namorada Sabrina, que sempre me

    motivaram, entenderam as minhas faltas e momentos de afastamento, e me

    mostraram o quanto importante estudar.

    A minha orientadora Carolina Etienne de Roslia e Silva Santos e minha

    coorientadora Ana Dolores Santiago de Freitas, agradeo o apoio inestimvel para

    realizao deste estudo, a dedicao, amizade e o entusiasmo cientfico que

    souberam transmitir durante esses anos de convivncia. Agradeo ainda pela

    confiana e por compartilhar de suas linhas de pesquisa e que hoje podemos ver

    alguns frutos desse trabalho.

    Ao meu coorientador Alexandre Tavares da Rocha pelas contribuies neste

    trabalho.

    A Universidade Federal Rural de Pernambuco, em especial ao Programa de

    Ps-Graduao em Cincia do Solo, pela oportunidade e condies concedidas para

    realizao da pesquisa.

    Aos professores da Ps-Graduao em Cincia do Solo da UFRPE,

    representados por Newton Pereira Stamford, Giselle Gomes Monteiro Fracetto, Felipe

    Jos Cury Fracetto, Emdio Cantidio Almeida de Oliveira, Mateus Rosas Ribeiro Filho,

    Maria Betnia Galvo dos Santos Freire, Flvio Adriano Marques e Mrio Lira de

    Andrade Jnior pelos ensinamentos transmitidos durante meu doutoramento.

    Ao amigo Mauro Wagner de Oliveira, que foi meu orientador na graduao e

    mestrado, por ter me inserido no meio acadmico, pelo compartilhamento de suas

    ideias e experincias, e por sempre acreditar e me incentivar a seguir em frente no

    meio cientfico.

    Ao laboratrio de Genmica do Instituto Agronmico de Pernambuco, pela

    contribuio para realizao deste estudo, em especial s pesquisadoras Maria do

    Carmo Catanho Pereira de Lyra e Adlia Cavalcanti Mergulho, pelos conselhos,

    amizade e ensinamentos.

    Ao pesquisador Paulo Ivan Fernandes Jnior, pela presteza e ajuda no

    desenvolvimento da tese.

  • Aos estimados colegas bolsistas e estagirios, que muito ajudaram na

    construo deste trabalho, Pablo Accio Souza, Andressa Oliveira e Cntia Gouveia.

    E ao amigo, colega de doutorado, Aleksandro Ferreira da Silva, pela amizade, suporte

    e auxlio em vrias etapas do trabalho.

    Aos amigos de ps-graduao, representados por Abrao Ccero da Silva,

    Adriana Bezerra da Silva, Aglair Cardoso, Bruno Campos Mantovanelli, Carlos Vitor

    Oliveira Alves, Jusclia Ferreira da Silva, Mayame de Brito Santana, Juliet Emlia

    Santos Souza, Jssyca Adriana Gomes Florncio, Leandro Reis, Gerson Moreira

    Barros, Emanuelle Maria da Silva, Felipe Martins do Rgo Barros, Jssica Rafaela de

    Souza Oliveira, Tiago Santos e Thiago Schlosser.

    A Sra. Maria do Socorro Santana, secretria do Programa de Ps-Graduao

    em Cincia do Solo pela cordialidade e presteza.

    A FACEPE (Fundao de Amparo Cincia e Tecnologia do Estado de

    Pernambuco) pela concesso da bolsa de doutorado.

    Enfim a todos que contriburam diretamente ou indiretamente para este trabalho

    e fizeram parte da minha jornada. Muito obrigado!

  • LISTA DE TABELAS

    Captulo 01

    Tabela 1 - Caractersticas gerais dos municpios de Belo Jardim na mesorregio do

    Agreste e Serra Talhada na mesorregio do Serto, Semirido do estado

    de Pernambuco, Brasil. ............................................................................ 60

    Tabela 2 - Anlises fsicas de amostras de solos coletadas em reas com diferentes

    formas de uso da terra no Semirido de Pernambuco ............................. 62

    Tabela 3 - Caracterizao qumica de solos coletados em reas com diferentes formas

    de uso da terra no Semirido de Pernambuco. ........................................ 62

    Tabela 4 - Nmero e biomassa seca de ndulos em mudas de sabi (Mimosa

    caesalpiniifolia) e leucena (Leucaena leucocephala) em solos coletados em

    diferentes sistemas de uso da terra, na regio Semirida brasileira. ....... 65

    Tabela 5 - Biomassa seca da parte area e de razes, e nitrognio acumulado na

    biomassa area de sabi (Mimosa caesalpiniifolia) e leucena (Leucaena

    leucocephala) cultivadas em solos coletados sob diferentes sistemas de

    uso da terra na regio Semirida brasileira. ............................................. 69

    Captulo 02

    Tabela 1 - Caractersticas gerais dos municpios de Belo Jardim na mesorregio do

    Agreste e Serra Talhada na mesorregio do Serto, Semirido do estado

    de Pernambuco, Brasil. ............................................................................ 81

    Tabela 2 - Anlises fsicas e classificao textural de amostras de solos coletadas em

    reas com diferentes formas de uso da terra no Semirido de Pernambuco.

    ................................................................................................................. 84

    Tabela 3 - Caracterizao qumica de solos coletados em reas com diferentes formas

    de uso da terra no Semirido de Pernambuco. ........................................ 84

    Tabela 4 - Teste de qui-quadrado para as frequncias observadas e esperadas para

    proporo de isolados bacterianos de ndulos de sabi (Mimosa

    caesalpiniifolia Benth.) oriundos de diferentes sistemas de uso da terra que

    amplificaram fragmentos de genes simbiticos. ....................................... 90

    Tabela 5 - Teste de qui-quadrado para as frequncias observadas e esperadas para

    proporo de isolados bacterianos de ndulos de leucena (Leucaena

  • leucocephala (Lam.) de Wit) oriundos de diferentes sistemas de uso da

    terra que amplificaram fragmentos de genes simbiticos. ........................ 91

    Tabela 6 - Nmero de grupos, ndices de dominncia de Simpson, diversidade de

    Shannon, riqueza de Margalef e equitabilidade de Pielou de bactrias

    isoladas de ndulos de sabi (Mimosa caesalpiniifolia Benth.) e leucena

    (Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit.) cultivadas em amostras de solos

    provenientes de diferentes sistemas de uso da terra no Semirido brasileiro

    ................................................................................................................. 99

    Tabela 7 - Resultados da pesquisa de similaridade no GenBank com o programa Blast

    de 20 isolados de ndulos de sabi (Mimosa caesalpiniifolia Benth.)

    cultivados em solos do Semirido brasileiro sob diferentes usos da terra.

    ............................................................................................................... 102

    Tabela 8 - Resultados da pesquisa de similaridade no GenBank com o programa Blast

    de 19 isolados de ndulos de leucena (Leucaena leucocephala (Lam.) de

    Wit.) cultivados em solos do Semirido brasileiro sob diferentes usos da

    terra. ....................................................................................................... 103

    Captulo 03

    Tabela 1 - Distribuio do nmero de isolados de acordo com os usos da terra em que

    foram obtidos. ......................................................................................... 118

    Tabela 2 - Valores mdios da eficincia relativa de isolados rizobianos de sabi

    (Mimosa caesalpiniifolia Benth.) e leucena (Leucaena leucocephala (Lam.)

    de Wit.) oriundos de solos do Semirido brasileiro sob diferentes usos da

    terra. ....................................................................................................... 122

    Tabela 3 - Teste de qui-quadrado para as frequncias observadas e esperadas para

    proporo de rizbios eficientes nativos de solos do Semirido brasileiro

    sob diferentes usos da terra para inoculao de sabi (Mimosa

    caesalpiniifolia Benth.) e leucena (Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit.).

    ............................................................................................................... 124

    Tabela 4 - Valores mdios da massa de matria seca da parte area (MSPA), nmero

    de ndulos (NN), massa seca de ndulos (MSN), acmulo de nitrognio na

    parte area (ANPA), e da eficincia relativa dos diferentes isolados de

    rizbios inoculados em sabi (Mimosa caesalpiniifolia Benth.), ............. 125

  • Tabela 5 - Valores mdios da massa de matria seca da parte area (MSPA), nmero

    de ndulos (NN), massa seca de ndulos (MSN), acmulo de nitrognio na

    parte area (ANPA), e da eficincia relativa dos diferentes isolados de

    rizbios inoculados em leucena (Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit).

    ............................................................................................................... 126

    Tabela 6 - Matriz de correlao entre a massa de matria seca da parte area (MSPA),

    acmulo de nitrognio na parte area (ANPA), eficincia relativa, nmero

    de ndulos (NN) e massa seca de ndulos (MSN) dos rizbios altamente

    eficientes (>80% de eficincia relativa) inoculados em Mimosa

    caesalpiniifolia Benth e Leucaena leucocephala (Lam.) de

    Wit...........................................................................................................120

    Tabela 7 - Resultados da pesquisa de similaridade no GenBank com o programa Blast

    dos isolados de ndulos de sabi (Mimosa caesalpiniifolia Benth.) e

    Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit cultivados em solos do Semirido

    brasileiro sob diferentes usos da

    terra................................................................................................... ..0129

    Captulo 04

    Tabela 1 - Atributos qumicos e fsicos dos solos e caractersticas dos municpios em

    que eles foram coletados........................................................................ 143

    Tabela 2- Isolados bacterianos oriundos de ndulos de leguminosas arbreas

    utilizados no experimento. ...................................................................... 144

    Tabela 3 - Medidas de altura e dimetro de mudas de Leucaena leucocephala e

    Mimosa Caesalpiniifolia crescendo em resposta inoculao de rizbios,

    aos 30, 60 e 90 dias aps a semeadura. ................................................ 147

    Tabela 4 - Valores mdios do nmero e biomassa seca de ndulos de mudas de

    Leucaena leucocephala e Mimosa caesalpiniifolia cultivadas em diferentes

    solos (Arg = Argissolo, Lat = Latossolo, Luv = Luvissolo) do Nordeste

    brasileiro, em funo da inoculao de rizbios nativos da regio Semirida

    do Brasil.................................................................................................. 149

    Tabela 5 - Valores mdios da biomassa seca de razes e da parte area de mudas de

    Leucaena leucocephala e Mimosa caesalpiniifolia cultivadas em diferentes

    solos (Arg = Argissolo, Lat = Latossolo, Luv = Luvissolo) do Nordeste

  • brasileiro, em funo da inoculao de isolados de rizbios nativos da

    regio Semirida do Brasil...................................................................... 150

    Tabela 6 - Valores mdios dos teores e acmulo de nitrognio da parte area de

    mudas de Leucaena leucocephala e Mimosa caesalpiniifolia cultivadas em

    diferentes solos (Arg = Argissolo, Lat = Latossolo, Luv = Luvissolo) do

    Nordeste brasileiro, em funo da inoculao de isolados de rizbios

    nativos da regio Semirida do Brasil. .................................................. 152

    Tabela 7 - Coeficiente de correlao da altura de plantas aos 90 dias (ALT), dimetro

    das plantas aos 90 dias (DIA), nmero de ndulos (NN), massa seca de

    ndulos (MSN), parte area (MSPA), razes (MSR) concentrao de

    nitrognio na parte area (CNPA), acmulo de nitrognio na parte area

    (ANPA) das mudas de Leucaena leucocephala e Mimosa caesalpiniifolia.

    ............................................................................................................... 153

  • LISTA DE FIGURAS

    Captulo 01

    Figura 1 - Mapa dos municpios de Belo Jardim na mesorregio do Agreste e Serra

    Talhada na mesorregio do Serto, Semirido do estado de Pernambuco,

    Brasil. ....................................................................................................... 61

    Figura 2 - Aumentos mdios na altura de mudas de sabi (Mimosa caesalpiniifolia) (A)

    e leucena (Leucaena leucocephala) (B) aos 30, 60 e 90 dias aps o plantio,

    comparaes feitas no ltimo dia de avaliao de cada espcie. Mdias

    com a mesma letra no dIferem entre si pelo teste de Tukey (p < 0,05). . 66

    Figura 3 - Aumentos mdios no dimetro de mudas de sabi (Mimosa caesalpiniifolia)

    (A) e leucena (Leucaena leucocephala) (B) aos 30, 60 e 90 dias aps o

    plantio, comparaes feitas no ltimo dia de avaliao de cada espcie.

    Mdias com a mesma letra no diferem entre si pelo teste de Tukey (p <

    0,05). ........................................................................................................ 67

    Figura 4 - Aumentos mdios no nmero de fololos de mudas de sabi (Mimosa

    caesalpiniifolia) (A) e leucena (Leucaena leucocephala) (B) aos 30, 60 e 90

    dias aps o plantio, comparaes feitas no ltimo dia de avaliao de cada

    espcie. Mdias com a mesma letra no diferem entre si pelo teste de

    Tukey (p < 0,05). ...................................................................................... 68

    Captulo 02

    Figura 1 - Mapa dos municpios de Belo Jardim na mesorregio do Agreste e Serra

    Talhada na mesorregio do Serto, Semirido do estado de Pernambuco,

    Brasil. ....................................................................................................... 82

    Figura 2 - Avaliao da qualidade da extrao do DNA total de alguns isolados

    utilizados no estudo, por meio da eletroforese em gel de agarose a 0,8 %

    por 30 minutos a 80 v, foi utilizado em cada poo 2,0 L do DNA de cada

    isolado. ..................................................................................................... 88

    Figura 3 - Amplificao do gene nifH (M = marcado de peso molecular 100pb) em

    isolados de sabi (Mimosa caesalpiniifolia Benth). .................................. 89

    Figura 4 - Distribuio de isolados de ndulos de duas leguminosas arbreas em

    funo do tempo de crescimento em YMA. (A) sabi (Mimosa

  • caesalpiniifolia Benth.) e (B) leucena (Leucaena leucocephala (Lam.) de

    Wit.) .......................................................................................................... 92

    Figura 5 - Distribuio de isolados de ndulos de duas leguminosas arbreas em

    funo da produo de muco (exopolissacardeos). (A) sabi (Mimosa

    caesalpiniifolia Benth.) e (B) leucena (Leucaena leucocephala (Lam.) de

    Wit.). ......................................................................................................... 94

    Figura 6 - Distribuio de isolados de ndulos de duas leguminosas arbreas em

    funo da alterao do pH em meio YMA. (A) sabi (Mimosa caesalpiniifolia

    Benth) e (B) leucena (Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit.). ............... 95

    Figura 7 - Distribuio de isolados de ndulos de duas leguminosas arbreas em

    funo do dimetro da colnia em meio YMA. (A) sabi (Mimosa

    caesalpiniifolia Benth) e (B) leucena (Leucaena leucocephala (Lam.) de

    Wit.). ......................................................................................................... 96

    Figura 8 - Distribuio de isolados de ndulos de duas leguminosas arbreas em

    funo da cor de suas colnias nos diferentes sistemas de uso da terra. (A)

    sabi (Mimosa caesalpiniifolia Benth) e (B) leucena (Leucaena

    leucocephala (Lam.) de Wit.) .................................................................... 97

    Figura 9 - Dendograma das caractersticas fenotpicas de isolados de ndulos de duas

    leguminosas arbreas que amplificaram fragmentos de genes simbiticos

    (A). Mimosa caesalpiniifolia Benth., (B) Leucaena leucocephala (Lam) de

    Wit. ......................................................................................................... 100

    Figura 10 - rvore filogentica construda a partir das sequncias parciais do gene

    16S rRNA dos isolados bacterianos de (A) leucena e (B) sabi e outras

    sequncias de estirpes de rizbios disponveis no GenBank. ................ 104

    Captulo 04

    Figura 1 - Municpios em que foram coletadas as amostras de solo utilizadas no

    experimento. Serra Talhada no Serto, Belo Jardim no Agreste e Paudalho

    na Zona da Mata de Pernambuco. ......................................................... 142

    Figura 2 - Eficincia relativa de isolados rizobianos inoculados em leucena (A) e sabi

    (B). .......................................................................................................... 151

  • SUMRIO

    1 INTRODUO GERAL ......................................................................................... 23

    1.1 Hipteses ............................................................................................................ 25

    1.2 Objetivo Geral ..................................................................................................... 25

    1.3 Objetivos especficos........................................................................................... 26

    2 REVISO BIBLIOGRFICA ................................................................................... 27

    2.1 Principais entradas de nitrognio (N) em sistemas agrcolas e naturais ............. 27

    2.2 Fixao biolgica do nitrognio ........................................................................... 28

    2.3 Associao simbitica rizbio-leguminosa .......................................................... 29

    2.3.1 Bactrias fixadoras de nitrognio que nodulam leguminosas ........................... 30

    2.3.2 A famlia Leguminosae ..................................................................................... 31

    2.3.3 Importncia de leguminosas arbreas na fixao biolgica de N2 ................... 32

    2.4. Semirido brasileiro: caractersticas e usos da terra .......................................... 33

    2.4.1 Utilizao de leguminosas arbreas no Semirido brasileiro ........................... 34

    2.4.1.1 Leucena: caractersticas, uso e fixao biolgica de nitrognio .................... 35

    2.4.1.2 Sabi: caractersticas, uso e fixao biolgica de nitrognio ........................ 36

    2.5 Ocorrncia, caractersticas e diversidade de rizbios no Semirido brasileiro .... 36

    2.5.1 Caracterizao fenotpica de bactrias que nodulam leguminosas .................. 38

    2.5.2 Caracterizao genotpica de bactrias que nodulam leguminosas ................. 39

    2.6 Eficincia simbitica de rizbios no Semirido brasileiro .................................... 42

    REFERNCIAS ......................................................................................................... 43

    3 SISTEMAS DE USO DA TERRA AFETAM A NODULAO E O CRESCIMENTO

    DE LEGUMINOSAS ARBREAS EM SOLOS DO SEMIRIDO BRASILEIRO ........ 55

    Resumo ..................................................................................................................... 56

    Abstract ..................................................................................................................... 57

    3.1 Introduo ........................................................................................................... 58

    3.2 Material e mtodos .............................................................................................. 60

    3.3 Resultados e Discusso ...................................................................................... 64

    3.4 Concluses ......................................................................................................... 70

    Referncias ............................................................................................................... 71

    4 CARACTERIZAO DE BACTRIAS DE NDULOS DE LEGUMINOSAS

    ARBREAS CULTIVADAS EM SOLOS SOB DIFERENTES USOS DA TERRA DO

    SEMIRIDO BRASILEIRO ........................................................................................ 75

  • Resumo ..................................................................................................................... 76

    Abstract ..................................................................................................................... 77

    4.1 Introduo ........................................................................................................... 78

    4.2 Material e Mtodos .............................................................................................. 81

    4.2.1 Captura de rizbios .......................................................................................... 81

    4.2.2 Isolamento e caracterizao fenotpica das bactrias dos ndulos .................. 83

    4.2.3.1 Extrao de DNA ........................................................................................... 85

    4.2.3.2 Amplificao de fragmentos de genes nifH e nodC ....................................... 85

    4.2.4 Avaliao da diversidade dos isolados bacterianos ......................................... 86

    4.2.5 Sequenciamento parcial do gene 16S rRNA e anlises filogenticas .............. 86

    4.3 Resultados e Discusso ...................................................................................... 88

    4.3.1 Obteno dos isolados bacterianos dos ndulos das leguminosas.................. 88

    4.3.2 Amplificao simultnea de fragmentos dos genes nifH e nodC como ferramenta

    para a seleo preliminar das bactrias .................................................................... 88

    4.3.3 Caracterizao fenotpica ................................................................................. 91

    4.3.4 Avaliao da diversidade .................................................................................. 97

    4.3.5 Sequenciamento parcial do gene 16S rRNA e anlises filogenticas ............ 100

    4.4 Concluses ........................................................................................................ 105

    Referncias ............................................................................................................. 106

    5 EFICINCIA SIMBITICA DE RIZBIOS NATIVOS DE SOLOS DO SEMIRIDO

    BRASILEIRO, SOB DIFERENTES USOS DA TERRA, PARA INOCULAO DE

    LEGUMINOSAS ARBREAS ................................................................................. 113

    Resumo ................................................................................................................... 114

    Abstract ................................................................................................................... 115

    5.1 Introduo ......................................................................................................... 116

    5.2 Material e Mtodos ............................................................................................ 118

    5.2.1 Origem dos isolados ....................................................................................... 118

    5.2.2 Experimento de eficincia simbitica.............................................................. 118

    5.2.3 Sequenciamento parcial do gene 16S rRNA dos isolados mais eficientes ..... 120

    5.3 Resultados e Discusso .................................................................................... 121

    5.3.1 Capacidade simbitica ................................................................................... 121

    5.3.2 Eficincia simbitica ....................................................................................... 121

    5.3.3 Sequenciamento parcial do gene 16S rRNA dos isolados mais eficientes ..... 128

    5.4 Concluses ........................................................................................................ 130

  • Referncias ............................................................................................................. 131

    6 EFICINCIA DE RIZBIOS NATIVOS DO SEMIRIDO BRASILEIRO NO

    CRESCIMENTO DE LEGUMINOSAS ARBREAS EM DIFERENTES SOLOS ..... 137

    Resumo ................................................................................................................... 138

    Abstract ................................................................................................................... 139

    6.1 Introduo ......................................................................................................... 140

    6.2 Material e Mtodos............................................................................................ 142

    6.3 Resultados e Discusso .................................................................................... 146

    6.4 Concluso ......................................................................................................... 154

    Referncias ............................................................................................................. 155

    7 CONSIDERAES FINAIS ................................................................................. 159

  • Prospeco de rizbios de leguminosas arbreas em solos do Semirido brasileiro sob diferentes usos da terra

    RESUMO

    A inoculao de leguminosas arbreas com bactrias fixadoras de nitrognio,

    pode contribuir para elevar as quantidades de N2 fixado, sendo uma prtica de suma importncia para aquisio de nitrognio em locais onde o aporte de tecnologia baixo, como os verificados no Semirido brasileiro. Alm disso, o uso de rizbios nativos eficientes e competitivos representam uma importante estratgia para a recuperao de reas degradadas do bioma Caatinga. Objetivou-se com este trabalho isolar, caracterizar, avaliar a diversidade e selecionar rizbios eficientes e competitivos nativos do Semirido brasileiro. Para isso, foram realizadas expedies no Semirido de Pernambuco para coleta de amostras de solos (Luvissolo e Argissolo) sob diferentes sistemas de uso da terra: vegetao nativa (caatinga) e reas com diferentes sistemas agrcolas (monocultivo e consrcio com vrias espcies), as quais foram usadas para o cultivo em vaso de duas leguminosas arbreas, sabi (Mimosa caesalpiniifolia Benth.) e leucena (Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit.), usadas como planta-isca para obteno de ndulos e que serviram para avaliar a habilidade dos rizbios nativos em promover crescimento e nodulao. Foi constatada a existncia de populaes de bactrias naturalmente estabelecidas com capacidade de nodular as leguminosas arbreas nos sistemas de uso avaliados, sendo verificada uma maior nodulao nas plantas cultivadas no Argissolo. Dos ndulos obtidos, foram isoladas em meio YMA 213 bactrias de leucena e 160 de sabi. Todos os isolados foram avaliados quanto a habilidade de fixar nitrognio e formar ndulos por meio da amplificao de fragmentos de genes simbiticos nifH e nodC, os que apresentaram amplificao de pelo menos um gene simbitico (104 isolados de sabi e 144 de leucena) foram selecionados e na sequncia foram caracterizados fenotipicamente, com base nas caractersticas, foram agrupados, e avaliados quanto a sua diversidade. Constatou-se que os sistemas de uso da terra no influenciaram nos ndices de diversidade. Com o agrupamento por espcie, foram formados 20 grupos de isolados de sabi e 19 de leucena. Representantes dos grupos tiveram o gene 16S do rRNA parcialmente sequenciado para determinar o posicionamento taxonmico. Ficou evidenciado maior promiscuidade da leucena, uma vez que a mesma nodulou com representantes dos gneros Rhizobium, Ensifer, Mesorhizobium e Burkholderia, enquanto o sabi nodulou somente com bactrias do gnero Burkholderia. Os 104 isolados de sabi e 144 de leucena foram avaliados quanto a eficincia simbitica em experimentos em casa de vegetao e cultivados em substrato estril contendo uma mistura de areia e vermiculita, os mais eficientes foram selecionados e avaliados quanto a sua eficincia simbitica em trs solos (Latossolo, Argissolo e Luvissolo). Os isolados 36F e 45G para leucena e 1E e 4D de sabi mostraram-se bem promissores quanto FBN.

    Palavraschave: Diversidade rizobiana. Eficincia simbitica. Fixao biolgica de

    nitrognio. Leucaena leucocephala. Mimosa caesalpiniifolia.

  • Prospecting of rhizobia from Brazilian Semiarid region under different land use systems for inoculation of tree legumes

    ABSTRACT

    The inoculation of tree legumes with nitrogen fixing bacteria can contribute to

    increase as N2 fixed amounts, being a practice of importance for input of nitrogen in places where entry of technology is reduced, such as those verified in the Brazilian Semiarid region. In addition to this, the use of efficient and competitive native rhizobia represents an important strategy for lands reclamation of the Caatinga biome. The aim of this study was to isolate, characterize, evaluate a diversity and select efficient and competitive native rhizobia to the Brazilian Semiarid region. For this, were carried out expeditions in Brazilian Semiarid region for collect soil samples (Luvisol and Ultisol) under different land use systems: native vegetation (caatinga) and areas with different agricultural systems (such as monoculture and consortium and several species). The soil samples were used for cultivation of tree two legumes in pots. Sabia (Mimosa caesalpiniifolia Benth.) and leucena (Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit), were used as trapplant to obtain nodules and served to evaluate the ability of native rhizobia to promote growth and natural nodulation. Was verified the existence of populations of bacteria naturally established with ability to nodulate the tree legumes in all land use systems evaluated. Verified a greater nodulation in the plants cultivated in the Ultisol. From nodules obtained, were isolated in YMA medium, 213 bacteria of leucena and 160 of sabia. All isolates were evaluated by ability to nitrogen fixation and form nodules, through the symbiotic genes fragments amplification (nifH and nodC). Were selected the isolates which amplified the symbiotic genes (104 isolates of sabi and 144 of leucena), in the sequence were characterized phenotypically. Based on characteristics, the isolates were grouped and evaluated by diversity. Was verified that land use systems did not influence diversity indices. Were formed 20 groups of isolates of sabi and 19 of leucena, representatives of the groups had the 16S rRNA gene partially sequenced to determine the taxonomic positioning. Was evidenced more promiscuity of the leucena, since it nodulated with representatives of the genus Rhizobium, Ensifer, Mesorhizobium and Burkholderia, while sabia were nodulated only by Burkholderia. The 104 isolates of sabi and 144 of leucena were evaluated to symbiotic effectiveness in greenhouse experiments in cropping on sterile substrate, containing a mixture of sand and vermiculite. The isolates more efficient were selected and evaluated for their symbiotic effectiveness in three soils (Oxisol, Ultisol and Luvisol). The isolates 36F and 43K for leucena, 1E and 4D for sabia showed very promising for BNF.

    Keywords: Rhizobia diversity. Symbiotic effectiveness. Biological nitrogen fixation. Leucaena leucocephala. Mimosa caesalpiniifolia.

  • 23

    1 INTRODUO GERAL

    Regies semiridas em todo o mundo esto sujeitas seca e a flutuaes

    naturais do clima. A seca pode ser causada pela diminuio da precipitao, aumento

    da evaporao, abaixamento dos lenis freticos ou por mudanas no uso da terra.

    As suas principais consequncias incluem a reduo da produo agrcola,

    degradao do solo e alteraes dos ecossistemas.

    No Brasil, a regio semirida estende-se por uma extensa rea no Nordeste, e

    caracterizada por elevadas temperaturas, reduzidas precipitaes pluviais e baixa

    produo de biomassa. Nestas condies, um sistema de produo sustentvel exige

    prticas eficientes de manejo, pois a capacidade regenerativa dos solos baixa.

    Contudo, o que se tem verificado, normalmente, so prticas de manejo pouco

    sustentveis, em sistemas de uso da terra que se caracterizam predominantemente

    pela substituio da caatinga por reas de cultivo, com corte e queima da vegetao

    nativa.

    Aps as mudanas de uso da terra, com as sucesses de cultivos agrcolas e

    atividades pastoris, o solo torna-se empobrecido em nutrientes, as reas so

    degradadas, e ento so abandonadas para regenerao da vegetao natural.

    Nestas, o restabelecimento da fertilidade do solo fundamental para que ocorra, de

    maneira mais rpida, a reabilitao da vegetao. No tocante aos nutrientes, em

    regies semiridas, o nitrognio tem sido um dos elementos mais limitantes em

    ecossistemas naturais e agrcolas. A principal via de entrada deste elemento para

    estes locais a fixao biolgica (FBN), a qual, se bem manejada, se caracteriza

    como alternativa vivel e sustentvel para reabilitao de reas degradadas.

    O plantio de leguminosas arbreas com habilidade de se associar

    simbioticamente com bactrias fixadoras de nitrognio se constitui em uma estratgia

    para favorecer o aumento da disponibilidade de N no sistema. Essas leguminosas

    podem ser usadas na alimentao animal, adubao verde, plantas de cobertura,

    produo de madeira e lenha, cercas vivas, rvores de sombra, quebra-ventos, e em

    sistemas agroflorestais. Para a escolha das espcies, devem ser consideradas

    caractersticas de rusticidade, rpido crescimento, alta produo de biomassa e

    principalmente habilidade de estabelecer simbiose com rizbios. Entre as espcies

  • 24

    que renem essas caractersticas podem ser destacadas a leucena (Leucaena

    leucocephala (Lam.) de Wit.) e o sabi (Mimosa caesalpiniifolia Benth.).

    O sucesso da insero dessas leguminosas depende, principalmente, do

    estabelecimento de uma simbiose eficiente com os micro-organismos diazotrficos

    nativos. A eficincia simbitica pode ser restringida por diversas condies

    relacionadas planta, ao microssimbionte e s condies edafoclimticas.

    Evidentemente, com a inexistncia de populaes nativas de bactrias capazes de

    nodular determinada espcie vegetal, a simbiose no se estabelece. Deste modo, a

    introduo de leguminosas arbreas em um sistema agroflorestal ou em uma rea a

    ser recuperada deve ser precedida por avaliaes das populaes rizobianas

    naturalmente estabelecidas. Estas informaes serviro para identificao de

    populaes indgenas eficientes, e da necessidade de inoculao, quando ocorrer a

    presena de bactrias compatveis, mas ineficientes.

    Diferentes sistemas de uso da terra ou coberturas vegetais podem afetar a

    diversidade rizobiana, possibilitando o favorecimento de populaes diferenciadas

    com relao eficincia simbitica. Poucos estudos abordaram a ocorrncia,

    diversidade e eficincia de microssimbiontes de leucena e sabi naturalmente

    estabelecidos em solos do Semirido brasileiro. Deste modo, pesquisas desta

    natureza fazem-se necessrias, uma vez que a obteno e o conhecimento da

    diversidade de rizbios nativos representam uma importante estratgia nesta regio,

    pois constitui o passo inicial para a seleo de estirpes eficientes e competitivas para

    a confeco de inoculantes para uso biotecnolgico, em especial, nos ecossistemas

    naturais e agrcolas onde o aporte de tecnologias baixo, como os usados pela

    agricultura familiar no Nordeste. Diante dessas consideraes, no presente trabalho,

    avaliou-se em solos do Semirido brasileiro sob diferentes usos da terra, a ocorrncia,

    diversidade e a eficincia de populaes de rizbios naturalmente estabelecidas com

    habilidade de se associar simbioticamente com leucena e sabi.

    A tese est dividida em referencial terico e quatro captulos. O referencial

    terico traz uma reviso bibliogrfica sobre FBN e sua importncia para o Semirido

    brasileiro. No primeiro captulo foi estudado, a ocorrncia de populao rizobiana

    nativa com capacidade de nodular leucena e sabi em solos sob diferentes sistemas

    de uso da terra no Semirido Brasileiro. O segundo captulo trata do isolamento,

    caracterizao fenotpica e gentica de bactrias de ndulos de sabi e leucena

  • 25

    cultivadas em solos sob diferentes sistemas de uso da terra no Semirido brasileiro.

    Neste captulo, as bactrias so submetidas amplificao de fragmentos de genes

    simbiticos, sendo selecionadas as que amplificaram o nifH e/ ou nodC. No terceiro

    captulo as bactrias selecionadas aps a amplificao de genes simbiticos, so

    avaliadas quanto a sua capacidade simbitica em estudos com substrato estril para

    selecionar os isolados mais eficientes. No quarto captulo os isolados mais eficientes

    do terceiro captulo foram testados em vasos com solo no esterilizado para verificar

    o potencial simbitico e a competitividade desses isolados com as estirpes nativas do

    solo, a fim de selecionar os isolados com maiores potenciais para experimentao em

    campo e possvel utilizao como inoculante comercial.

    1.1 Hipteses

    Solos do Semirido brasileiro abrigam populaes rizobianas capazes de

    nodular L. leucocephala e M. caesalpiniifolia, sendo o potencial simbitico varivel

    com o sistema de uso da terra.

    As bactrias de ndulos de L. leucocephala e M. caesalpiniifolia presentes em

    solos do Semirido brasileiro apresentam alta diversidade, e esta diversidade

    afetada pelo sistema de uso da terra.

    Nos solos do Semirido brasileiro existem populaes nativas de bactrias

    nodulferas eficientes na fixao de nitrognio em plantas de L. leucocephala e M.

    caesalpiniifolia, sendo a eficincia alterada pelo sistema de uso da terra.

    A inoculao de L. leucocephala e M. caesalpiniifolia com isolados rizobianos

    estimula o crescimento e o acmulo de nitrognio das leguminosas.

    1.2 Objetivo Geral

    Avaliar em solos do Semirido brasileiro, sob diferentes usos da terra, a

    ocorrncia, diversidade e a eficincia de populaes de rizbios, naturalmente

    estabelecidas, com habilidade de se associar simbioticamente com L. leucocephala e

    M. caesalpiniifolia.

  • 26

    1.3 Objetivos especficos

    Avaliar o crescimento e a nodulao natural de L. leucocephala e M.

    caesalpiniifolia em solos do Semirido brasileiro sob diferentes sistemas de uso da

    terra.

    Obter uma coleo de rizbios nativos de solos do Semirido brasileiro, sob

    diferentes sistemas de uso da terra (caatinga, monocultivo e consrcio), capazes de

    nodularem plantas de L. leucocephala e M. caesalpiniifolia.

    Determinar caractersticas fenotpicas e genotpicas da coleo de rizbios

    nativos de solos do Semirido brasileiro, sob diferentes sistemas de uso da terra.

    Avaliar se a diversidade rizobiana tem sido alterada pelas mudanas de uso

    da terra nos sistemas estudados.

    Avaliar a eficincia simbitica de rizbios de L. leucocephala e M.

    caesalpiniifolia no crescimento de mudas em substrato estril e em solo.

    Selecionar rizbios eficientes e promissores para serem utilizados como

    inoculantes para sabi e leucena.

  • 27

    2 REVISO BIBLIOGRFICA

    2.1 Principais entradas de nitrognio (N) em sistemas agrcolas e naturais

    Quinto elemento mais abundante do universo, o N, perde em quantidade

    apenas para o hidrognio, hlio, oxignio e nenio (HILY BLANT et al., 2010).

    essencial vida, pois participa da constituio de cidos nuclicos, aminocidos,

    protenas e hormnios. Deste modo, as principais reaes bioqumicas nos seres

    vivos so dependentes de N, sendo carbono, oxignio e hidrognio os demais

    elementos que os organismos requerem em maiores quantidades (CANFIELD;

    GLAZER; FALKOWSKI, 2010).

    Em plantas, as elevadas exigncias de N o tornam um dos fatores mais

    limitantes para os sistemas agrcolas e naturais (PEUELAS et al., 2013), sendo as

    principais fontes de fornecimento: 1) o solo, principalmente pela

    decomposio/mineralizao da matria orgnica; 2) fixao no biolgica, resultante

    de processos naturais; 3) fertilizantes nitrogenados e 4) fixao biolgica do N

    atmosfrico (N2) (HUNGRIA; CAMPO; MENDES, 2007).

    No que se refere ao N do solo, o estoque contido na matria orgnica finito,

    passvel de exaurimento, aps cultivos sucessivos. As condies climticas

    predominantes nos trpicos intensificam a decomposio da matria orgnica, bem

    como as perdas, e resultam em baixos teores do elemento (MAIA et al., 2008).

    A fixao no biolgica representa outra via de aporte de N, resultante de

    processos naturais, tais como a reao de descargas eltricas com o N2, vulcanismo

    e combusto, estas fontes contribuem com aproximadamente 4 Tg de nitrognio

    fixado anualmente na Terra (SCHUMANN; HUNTRIESER, 2007).

    Os fertilizantes nitrogenados contribuem com cerca de 100 Tg das entradas

    anuais de N (GALLOWAY et al., 2013). uma fonte obtida por meio de processo

    industrial, que apresenta alta demanda energtica e requer: 1) hidrognio (oriundo de

    gs de petrleo); 2) um catalisador metlico (usualmente o ferro); 3) altas

    temperaturas (400 a 650C); e 4) altas presses (20 a 40 MPa) (EPSTEIN; BLOOM,

    2006). Estima-se em seis barris de petrleo o custo energtico por tonelada de NH3

    produzida (HUNGRIA; MENDES; MERCANTE, 2013). O alto custo desses insumos e

    as incertezas climticas, que diminuem as respostas das culturas sua aplicao,

  • 28

    reduzem a viabilidade da aplicao de fertilizantes nitrogenados por grande parte dos

    agricultores (FREITAS et al., 2015).

    Por fim, tem-se como via de entrada do nitrognio a fixao biolgica de

    nitrognio (FBN), contribuindo com 190 Tg ano-1. Consiste na converso do N2

    atmosfrico em formas assimilveis pelos organismos vivos (EPSTEIN; BLOOM,

    2006), de importncia fundamental para manuteno da vida na Terra, sendo

    considerada o segundo processo biolgico mais importante da natureza, depois da

    fotossntese (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).

    2.2 Fixao biolgica do nitrognio

    Na Terra, um dos principais reservatrios do N a atmosfera. Nela o N gasoso

    apresenta uma concentrao de cerca de 78% de seu volume, apresentando um

    estoque de aproximadamente 3,9x1021 Tg na forma diatmica (N2) no combinada

    (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Apesar do grande reservatrio, devido tripla ligao

    covalente entre os tomos de nitrognio, o N2 no est disponvel para os eucariotos

    e para maioria dos procariotos, uma vez que a maioria dos organismos o absorve

    apenas nas formas combinadas. Assim, processos que resultem na quebra da ligao

    trivalente so de grande importncia para a manuteno na vida da Terra, j que o N

    presente nos ecossistemas oriundo direta ou indiretamente do N2. (SHRIDHAR,

    2012).

    A FBN merece destaque dentre os processos de quebra da tripla ligao do N2,

    por ser a principal forma de entrada de N em sistemas naturais e agrcolas de

    subsistncia (FREITAS et al., 2015). Este processo realizado por organismos

    diazotrficos que englobam uma grande variedade de procariotos dos domnios

    Archaea e Bacteria, incluindo representantes de arqueias, bactrias gram negativas e

    gram positivas que apresentam elevada diversidade fenotpica, fisiolgica e gentica

    (MOREIRA et al., 2010).

    Os fixadores de N podem ser de vida livre, ou viver em associaes, estas

    podem variar em especificidade, estrutura e localizao (MOREIRA et al., 2010).

    Conforme o tipo de relao que estabelecem com as plantas eles so classificados

    em: 1) associativos, aqueles que formam associaes superficiais aos tecidos

    radiculares, 2) endofticos, os que colonizam os tecidos internos das plantas, 3)

    simbiticos, os capazes de formar ndulos, pertencentes aos grupos Frankia e

  • 29

    rizbios. Frankia induz a nodulao em plantas das famlias Betulaceae,

    Casuarinaceae, Coriariaceae, Datiscaceae, Elaeagnaceae, Myricaceae, Rhamnaceae

    e Rosaceae. E rizbios formam ndulos nas simbioses com leguminosas (SANTI;

    BOGUSZ; FRANCHE, 2013).

    2.3 Associao simbitica rizbio-leguminosa

    Dentre as associaes entre fixadores de N2 e plantas, certamente a que se

    tem maior interesse e, por consequncia, a mais estudada a simbiose rizbio e

    leguminosa, devido a sua importncia econmica, e maior impacto quantitativo sobre

    o ciclo do nitrognio (SPRENT; ARDLEY; JAMES, 2017). Estima-se que 47 Tg de N2

    so fixados anualmente por leguminosas nas atividades agrcolas e pastoris

    (HERRIDGE; PEOPLES; BODDEY, 2008), e 5 milhes de toneladas mtricas fixados

    por leguminosas em ecossistemas naturais (GRAHAM; VANCE, 2003).

    Esta simbiose resultado de um processo complexo de comunicao

    molecular, que envolve a expresso de genes em ambos os parceiros simbiticos

    (LIRA JNIOR; NASCIMENTO; FRACETTO, 2015). Inicialmente, as razes das

    leguminosas exsudam um coquetel de compostos fenlicos, identificados como

    flavonoides, chalconas, betanas e isoflavonoides (ANDREWS; ANDREWS, 2017). A

    percepo destes compostos pelas bactrias ativa os genes da nodulao (nod) e

    induzem reaes quimiostticas que direcionam os rizbios para as razes. Aps a

    ativao dos genes da nodulao, os rizbios comeam a sintetizar os fatores nod,

    identificados como lipoquitooligossacardeos, que atuam como molculas

    sinalizadoras induzindo a expresso gnica na planta hospedeira (LIRA JNIOR;

    NASCIMENTO; FRACETTO, 2015).

    Depois da exsudao e quimiotaxia, inicia-se o processo de colonizao, com

    a adeso e multiplicao dos rizbios ao redor dos pelos radiculares. Na sequncia,

    o pelo se encurva envolvendo os rizbios e, por meio da degradao de parte da

    parede celular do pelo, a plasmalema comea a se invaginar. Os rizbios invadem o

    pelo radicular utilizando um tubo denominado de cordo de infeco. No interior do

    cordo, as bactrias continuam se multiplicando formando o ndulo primrio. A partir

    do estabelecimento do ndulo definitivo, as bactrias, que se encontram dentro das

    clulas do crtex, param de se multiplicar, aumentam de tamanho e sofrem vrias

    transformaes bioqumicas at se transformarem em bacteroides, e ento, tornam-

    se capazes de fixar N2 (SANTOS et al., 2008).

  • 30

    2.3.1 Bactrias fixadoras de nitrognio que nodulam leguminosas

    As bactrias fixadoras de nitrognio que nodulam leguminosas tm sido

    coletivamente denominadas de rizbios (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). O primeiro

    isolamento de bactrias oriundas de ndulos de leguminosas foi realizado por

    Beijerinck (1888) e o termo rizbio oriundo da primeira espcie descrita, Rhizobium

    leguminosarum (FRANK, 1889).

    At a dcada de 80 (sculo XX), todas as bactrias fixadoras de N2 nodulferas

    eram classificadas no gnero Rhizobium, que abrangia tanto as bactrias de

    crescimento rpido, como as lentas (WALKER et al., 2015). Jordan (1982) props a

    separao dos rizbios em dois gneros conforme o tempo de crescimento,

    Bradyrhizobium, que englobaria os rizbios de crescimento lento e Rhizobium os de

    crescimento rpido.

    Posteriormente, uma nova subdiviso do gnero Rhizobium foi realizada. Chen,

    Yan e Li (1988) utilizaram mtodos de hibridizao de DNA e sorolgicos em rizbios

    isolados de ndulos de Glycine max e propuseram a criao do gnero Sinorhizobium.

    Mais tarde outros gneros foram descritos, incluindo Azorhizobium isolado em ndulos

    de Sesbania rostrata (DREYFUS; GARCIA; GILLIS, 1988), Mesorhizobium obtido em

    Cicer arietinum (JARVIS et al., 1997), Allorhizobium isolado de Neptunia natans

    (LAJUDIE et al., 1998).

    At o final do sculo XX, somente as -proteobactrias (gneros Allorhizobium,

    Azorhizobium. Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Rhizobium e Sinorhizobium) eram

    consideradas como bactrias capazes de formar ndulos em leguminosas. Em 2001,

    dois gneros (Burkholderia e Cupriavidus) de -proteobactrias foram relatados como

    capazes de nodular leguminosas (MOULIN et al., 2001). A partir de ento, diversas

    outras bactrias foram includas como rizbios. Atualmente, os gneros de rizbios

    esto distribudos em -proteobactrias (Aminobacter, Azorhizobium, Bradyrhizobium,

    Devosia, Ensifer (Sinorhizobium), Mesorhizobium, Methylobacterium, Microvirga,

    Neorhizobium, Ochrobactrum, Phyllobacterium, Rhizobium e Shinella), -

    proteobactrias (Boedetella, Burkholderia, Cupriavidus, Neisseria e Boedetella)

    (HOWIESON; DILWORTH, 2016) e Pseudomonas sp. e Xanthomonas no grupo das

    -proteobactrias (SHIRAISHI; MATSUSHITA; HOUGETSU, 2012).

  • 31

    No tocante s espcies, difcil precisar a quantidade de bactrias que

    nodulam leguminosas, em razo da insero de novas espcies, e tambm da

    frequente reclassificao das j descritas, com base na web site

    https://www.rhizobia.co.nz/taxonomy/rhizobia que compila dados do NCBI (National

    Center for Biotechnology Information) e LPSN (List of Prokaryotic Names with

    Standing in Nomenclature) atualmente so registradas 98 espcies (WEIR, 2016).

    Este nmero provavelmente deve ser aumentado, uma vez que a maioria dos estudos

    de taxonomia de rizbios foram conduzidos com bactrias isoladas de leguminosas

    produtoras de gros de importncia agrcola, cultivadas em regies de clima

    temperado (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Trabalhos utilizando espcies nativas de

    regies tropicais ainda so escassos, mas demonstram o elevado potencial de

    descrio de novas espcies (RADL et al., 2014; SANFRONOVA et al., 2017).

    2.3.2 A famlia Leguminosae

    A famlia Leguminosae, tambm denominada Fabaceae, a terceira maior

    famlia de Angiospermas (>19.500 espcies e 730 gneros), sendo Asteraceae e

    Orchidaceae maiores em nmero de espcies (LPWG, 2013). Com base nas

    estruturas florais, a famlia dividida em trs subfamlias, Caesalpinioideae,

    Mimosoideae, e Papillionoideae, que representam 22%, 10%, e 67%,

    respectivamente, do total de espcies (SPRENT; ARDLEY; JAMES, 2017). Os

    membros das Caesalpinioideae esto agrupados em quatro tribos: Caesalpinieae,

    Cassieae, Cercideae e Detarieae compreendendo 170 gneros e 2.250

    espcies. Mimosoideae agrupada em duas tribos: os Ingeae e Mimoseae, com 80

    gneros e 3.270 espcies, enquanto a Papilionoideae composta por 28 tribos com

    480 gneros e 13.800 espcies (ANDREWS; ANDREWS, 2017). Recentemente,

    uma nova classificao de subfamlia foi proposta com base em anlise filogentica,

    abrangendo cerca de 20% das espcies e 90% dos gneros, utilizando de

    sequncias do gene matt plasti. A partir dos resultados foi proposta a separao

    das leguminosas em seis subfamlias Caesalpinioideae, Cercidoideae,

    Detarioideae, Dialioideae, Duparquetioideae e Papilionoideae (LPWG, 2017).

    As estruturas das flores dos membros das subfamlias diferem

    significativamente, mas as leguminosas so extremamente diversas em muitos

    outros aspectos como a) hbito de crescimento, abrangendo ervas, arbustos, lianas

  • 32

    e rvores (SPRENT; ARDLEY; JAMES, 2017), b) habitats, as leguminosas esto

    presentes desde florestas tropicais at desertos, de baixadas at habitats alpinos,

    alm da existncia de espcies aquticas (LPWG, 2017) c) nodulao, levantamentos

    em campo, casa de vegetao e viveiros avaliaram a habilidade de nodulao em

    cerca de 23% das espcies conhecidas e demonstraram que 88% eram nodulferas.

    Das plantas avaliadas, nodularam 96% das Papilionoideae, 87% Mimosoideae, e

    24% das Caesalpinioideae (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).

    A maioria das espcies da famlia possui reconhecida importncia ambiental, e

    muitas so cultivadas desde a antiguidade como alimentcias, forrageiras,

    madeireiras, oleaginosas, adubo verde, fornecedoras de celulose, melferas,

    medicinais, ornamentais e ainda, para recuperao de reas degradadas (GRAHAM;

    VANCE, 2003).

    2.3.3 Importncia de leguminosas arbreas na fixao biolgica de N2

    O manejo da (FBN) por meio da utilizao de leguminosas arbreas tem sido

    uma estratgia utilizada para prover sustentabilidade e a segurana alimentar nos

    sistemas agrcolas dos trpicos e, assim, vem recebendo ateno de pesquisadores,

    organizaes governamentais e agricultores (MUNROE; ISAAC, 2013).

    Nas reas cultivadas, pastagens, sistemas agroflorestais e em reas

    degradadas, a incluso destas rvores tem reduzido a eroso, aumentado a

    biodiversidade, restaurado a cobertura vegetal e mantido a fertilidade dos solos

    (KURPPA; LEBLANC; NYGREN, 2010; CHAER et al., 2011; ISAAC; KIMARO, 2011;

    SILESHI et al., 2014), apresentando-se como alternativa para reduzir a fragilidade de

    alguns sistemas de produo agrcola praticados nos trpicos.

    Em regies tropicais, as leguminosas arbreas frequentemente obtm mais da

    metade de suas exigncias de nitrognio a partir da FBN (FREITAS et al., 2010;

    ANDREWS et al., 2011). Entretanto, a capacidade de fixao varia muito entre as

    espcies e dependente das especificidades da simbiose e das condies

    ambientais. No Qunia, por exemplo, de 70 a 90% do N na biomassa de Sesbania

    sesban e Calliandra calothyrsus foi derivado da FBN, totalizando 120 a 360 kg ha-1

    ano-1 (STAHL et al., 2002), enquanto no Sudo, 48% do N de Acacia senegal foi fixado

    a partir da atmosfera (% Ndfa), introduzindo 36 kg ha -1ano-1 de N para o agrossistema

    (RADDAD et al., 2005), corroborando que o manejo da FBN via leguminosas arbreas

  • 33

    pode representar significativas entradas de N para sistemas produtivos, assim como

    para reabilitao de reas degradadas.

    2.4. Semirido brasileiro: caractersticas e usos da terra

    Regies semiridas compem mais de 18% da superfcie da Terra

    (KOOHAFKAN; STEWART, 2008). No Brasil, estende-se por cerca de 1 milho de

    km2, abrangendo 1.113 municpios de nove estados (Piau, Cear, Rio Grande do

    Norte, Paraba, Pernambuco, Alagoas, Sergipe, Bahia e Minas Gerais) (BRASILEIRO

    et al., 2009).

    A principal formao vegetal da regio a caatinga (LIMA JNIOR et al., 2014),

    uma floresta seca, constituda por formaes xerfilas, heterogneas e de fisionomias

    e diversidades variadas (ALVES; ARAJO; NASCIMENTO, 2009), composta de uma

    vegetao que varia de aberta e arbustiva at fechada e florestal (SANTOS et al.,

    2013). A vegetao constituda, principalmente, de espcies herbceas, arbustivas

    e arbreas de pequeno porte, caduciflias, e geralmente com espinhos (ALVES;

    ARAJO, NASCIMENTO, 2009).

    O clima predominante na regio semirido quente, classificado em Koppen

    como tipo BSh. No qual so observadas elevadas temperaturas mdias (23 e 27C)

    e reduzidas precipitaes pluviais (300 a 800 mm anuais) com um perodo de

    estiagem de oito a nove meses, e precipitao concentrada entre fevereiro e abril

    (ALVARES et al., 2014).

    No mbito das atividades antrpicas, a agricultura e pecuria configuram-se

    como as principais atividades econmicas desenvolvidas pela populao habitante da

    regio (BARRETO et al., 2010). A agricultura, historicamente, vem sendo praticada de

    modo itinerante, onde os sistemas de produo so baseados na converso da

    vegetao nativa em reas de cultivo, com corte e queima da caatinga, explorao

    por um curto perodo e subsequente abandono (pousio), antes de novo ciclo de

    derrubada e queima (ARAJO FILHO, 2002). A pecuria desenvolvida

    predominantemente em sistemas de criao extensiva, tendo a caatinga como a

    principal, e muitas vezes, a nica fonte de alimentos para os rebanhos ovinos,

    caprinos e bovinos. Nas reas de caatingas arbreas, como nas arbustivas, os

    criadores de gado queimam o pasto antes da estao das chuvas, para facilitar o

    brotamento do mesmo, inserindo nas reas uma grande quantidade de animais

  • 34

    (bovinos, caprinos e ovinos), acima da capacidade de suporte das mesmas (ALVES,

    ARAJO; NASCIMENTO, 2009).

    2.4.1 Utilizao de leguminosas arbreas no Semirido brasileiro

    Secas cclicas, balano hdrico anual negativo, solos rasos, baixa produo de

    fitomassa, rpida decomposio da matria orgnica e dificuldade para manuteno

    da cobertura vegetal so caractersticas do Semirido brasileiro (MAIA et al., 2008;

    ALBUQUERQUE et al., 2012). Estes fatores, combinados com os sistemas

    agropecurios extrativistas, em uma agricultura desenvolvida s custas do

    desmatamento indiscriminado da caatinga, queimadas, perodos de pousio

    inadequados e atividades pastoris com predomnio de superpastejo, tem resultado em

    solos carentes em nutrientes e ambientes degradados (ARAJO FILHO, 2002).

    A intensificao das atividades antrpicas ocasiona, geralmente, uma reduo

    na diversidade das plantas e, uma alterao na disponibilidade dos recursos, o que

    leva a uma diminuio na diversidade de animais e, provavelmente, de micro-

    organismos do solo. Estas mudanas podem levar a alteraes nas funes dos

    ecossistemas, nos servios ambientais prestados, afetando sua produtividade e

    sustentabilidade (JESUS et al., 2005).

    Em reas degradadas do Semirido brasileiro, o restabelecimento da fertilidade

    do solo fundamental para criar condies que acelerem a recomposio da

    vegetao (CHAER et al., 2011). A disponibilidade de N um fator chave nesse

    processo, visto que tem sido relatado como um dos nutrientes mais limitantes para o

    crescimento de plantas, e a FBN via simbiose rizbio leguminosa a principal via de

    entrada deste elemento em reas em regenerao (FREITAS et al., 2015). Logo, o

    manejo adequado, por meio da incluso de leguminosas arbreas que se associam

    as bactrias fixadoras de nitrognio, constitui-se em uma opo promissora para

    criao de sistemas de produo agrcolas mais sustentveis e para recuperao de

    reas degradadas.

    Informaes sobre a FBN em leguminosas arbreas nos solos do Semirido

    brasileiro so escassas, mas os poucos estudos evidenciam a importncia deste

    processo para estes locais (FREITAS et al., 2010; NASCIMENTO, 2013; MARTINS et

    al., 2015a; SILVA et al., 2017). Freitas et al. (2010) estimaram a FBN em leguminosas

    da Caatinga e destacaram que Mimosa tenuiflora, Mimosa arenosa e Piptadenia

  • 35

    stipulacea apresentam alto potencial de fixao, demonstrado por contribuies

    mdias que chegaram a 68% de N derivado da fixao biolgica. Nascimento (2013)

    avaliou a contribuio da FBN na nutrio de mudas de leucena (Leucaena

    leucocephala (Lam.) de Wit.) e sabi (Mimosa caesalpiniifolia Benth.) cultivadas em

    solos do Semirido nordestino e verificaram contribuies de at 99%, o que indica o

    elevado potencial destas plantas para serem utilizadas na regio.

    Alm do potencial de uso para recuperao de reas degradadas, as

    leguminosas arbreas podem ser utilizadas em sistemas agrossilvipastoris e

    agroflorestais, na produo de forragem, na estabilizao de taludes contra a eroso,

    como cobertura rica em nitrognio para agrossistemas, produo de madeira e lenha,

    e cercas vivas (BARRETO et al., 2010; MARTINS et al., 2015a).

    A escolha das espcies deve levar em considerao as seguintes

    caractersticas: fcil estabelecimento no campo, sistema radicular profundo,

    crescimento rpido, elevada produo de biomassa, altos teores de N e P na

    biomassa, biomassa de fcil decomposio, tolerncia s condies adversas de solo

    e clima, e principalmente habilidade de estabelecer simbiose com rizbios

    (DRUMMOND et al., 2004; COSTA; DURIGAN, 2010; CHAER et al., 2011; SILVA et

    al., 2016). Dentre as leguminosas que renem essas caractersticas, so aqui

    destacadas a leucena (Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit) e o sabi (Mimosa

    caesalpiniifolia Benth.).

    2.4.1.1 Leucena: caractersticas, uso e fixao biolgica de nitrognio

    A leucena (Leucaena leucocephala (Lam.) de Wit) uma leguminosa arbrea

    nativa da Amrica Central, pertencente subfamlia Mimosoideae, que tem sido

    amplamente distribuda nas regies tropicais (PENICHE et al., 2014). uma espcie

    considerada pioneira e de alta plasticidade, apresentando bom crescimento tanto em

    locais midos como secos, demonstrado por bom desenvolvimento em ambientes que

    variam desde 650 a 3.000 mm de precipitao anual (COSTA; DURIGAN, 2010).

    uma leguminosa que se destaca por mltiplas possibilidades de

    aproveitamento, sendo utilizada na produo de lenha e madeira, alimentao animal,

    quebra vento, adubos verdes, sistemas agroflorestais, e reabilitao de reas

    degradadas, sendo ampla sua utilizao nestes ambientes perturbados devido ao seu

    rpido crescimento, produo de elevadas quantidades de sementes, capacidade de

  • 36

    se reproduzir sexuaada e assexuadamente, curto perodo pr-reprodutivo (COSTA;

    DURIGAN, 2010) alta produo de biomassa (CHOTCHUTIMA et al., 2013) e,

    principalmente, pela capacidade de estabelecer simbiose com uma ampla gama de

    rizbios.

    Em sua regio de origem, o Mxico, L. leucocephala nodulada por uma

    seleo diversificada de rizbios, incluindo Ensifer (Sinorhizobium), Rhizobium e

    Bradyrhizobium (WANG; ROMERO; ROMERO, 1999). At o momento no foram

    investigados os gneros que promovem a nodulao no Semirido brasileiro. Em

    outras regies semiridas, como Panxi na China, os gneros que promoveram

    nodulao foram os mesmos verificados no Mxico, acrescentando-se Mesorhizobium

    (XU et al., 2013).

    2.4.1.2 Sabi: caractersticas, uso e fixao biolgica de nitrognio

    O sabi (Mimosa caesalpiniifolia Benth.) uma leguminosa arbrea de

    crescimento rpido pertencente a subfamlia Mimosoideae (NOVEMBRE et al., 2007)

    que apresenta elevada capacidade de fornecimento de nitrognio via deposio de

    folhas (FERREIRA et al., 2007; FREIRE et al., 2010), alto teor de N nas folhas, cerca

    de 2,4 dag kg-1 (SOUZA et al., 2007) e alta produo de biomassa (cerca de 7 t ha-1)

    (NBREGA 2014).

    Nativa da regio Nordeste do Brasil, uma espcie utilizada principalmente

    para produo de madeira, aproveitada na forma de estacas e moures para

    confeco de cercas, e como fonte energtica (RIBASKI et al., 2003).

    Ao analisar a capacidade simbitica de sabi com rizbios nos solos do

    Semirido brasileiro, verifica-se que esta espcie nodula predominantemente com

    Burkholderia, com isolados que de uma maneira geral so de rpido crescimento e

    que acidificam o meio de cultura (CHEN et al., 2008; REIS JUNIOR et al., 2010;

    MARTINS et al., 2015b).

    2.5 Ocorrncia, caractersticas e diversidade de rizbios no Semirido brasileiro

    O sucesso da introduo de leguminosas arbreas nos sistemas de cultivo

    depende, em grande parte, de estarem noduladas. Entretanto, pode acontecer que,

    mesmo na presena de diazotrficas compatveis e com a formao de ndulos nas

    plantas, a simbiose no seja eficiente (FAYE et al., 2007). Silva et al. (2017),

  • 37

    estimaram a fixao de nitrognio em caatinga sob diferentes tempos de regenerao,

    e verificaram nodulao nas plantas, mas constataram que, em mdia, apenas 20 a

    46% do nitrognio era proveniente da fixao, com uma contribuio mxima de 18

    kg ha-1, sugerindo baixa eficincia do processo.

    Logo, a avaliao da ocorrncia ou no de bactrias eficientes na comunidade

    nativa da rea e a previso da necessidade de inoculao, configura-se em um

    importante passo para o estabelecimento de leguminosas arbreas (SOUZA et al.,

    2007). Havendo necessidade de inoculao, muitas vezes inocula-se com estirpes

    obtidas e recomendadas para outras regies, o que tem resultado com frequncia na

    ausncia de ganhos no crescimento vegetativo, nos teores de N na planta e na

    nodulao das razes de leguminosas cultivadas em solos do Semirido brasileiro

    (MARINHO et al., 2014; SIZENANDO et al., 2016). Esta ausncia de resposta

    inoculao pode ser resultante da baixa adaptabilidade das estirpes recomendadas

    s condies edafoclimticas da regio ou incapacidade para colonizar efetivamente

    as razes na presena de populaes de rizbios j estabelecidas no solo

    FERNANDES; FERNANDES; HUNGRIA, 2003).

    A nodulao e/ou a eficincia do processo de fixao biolgica de nitrognio

    podem ser restringidas por diversas condies relacionadas planta, ao

    microssimbionte e s condies de clima e solo que afetam a simbiose. Tanto o

    crescimento de rizbios em vida livre nos solos, como sua capacidade de nodular as

    plantas e fixar nitrognio, so sensveis a condies ambientais e podem ser

    dependentes da qualidade do solo. Diferentes coberturas vegetais ou manejos afetam

    a diversidade de rizbios (JESUS, 2004; SANTOS et al., 2017), podendo favorecer,

    de forma diferenciada, populaes mais ou menos eficientes.

    Vrios trabalhos demonstraram a capacidade de leguminosas arbreas

    associarem-se com rizbios nativos do Semirido brasileiro (REIS JUNIOR et al.,

    2010; SILVA et al., 2016; SILVA et al., 2017; MENEZES et al., 2017), contudo, pouco

    ainda se sabe sobre as caractersticas, diversidade e eficincia de seus

    microssimbiontes. A fim de preencher esta lacuna, nos ltimos anos vem crescendo

    o interesse sobre a diversidade de rizbios nativos de solos da regio, principalmente

    os capazes de nodular leguminosas da caatinga do gnero Mimosa (TEIXEIRA et al.,

    2010; FREITAS et al. 2014; MARTINS et al., 2015b) e Erytrina (MENEZES et al., 2016;

    MENEZES et al., 2017). Os resultados das pesquisas indicam a presena de uma

  • 38

    comunidade muito diversa com representantes dos gneros Bradyrhizobium,

    Paraburkholderia, Rhizobium, (REIS JNIOR et al., 2010; MARTINS et al., 2015b;

    RADL et al., 2014; MENEZES et al., 2017).

    Atualmente diversas tcnicas baseadas em caractersticas fenotpicas e

    genticas esto disponveis para caracterizao e avaliao da diversidade rizobiana

    (FREITAS et al., 2007; FREITAS et al., 2014; MARTINS et al., 2015b; MENEZES et

    al., 2016). Frequentemente so empregados, inicialmente, mtodos fenotpicos, que

    consistem na caracterizao das bactrias por meio de testes morfolgicos,

    bioqumicos e fisiolgicos, que permitem uma descrio inicial dos micro-organismos

    em estudo e possibilitam agrupar os isolados quanto ao fentipo (SANTOS et al.,

    2017).

    2.5.1 Caracterizao fenotpica de bactrias que nodulam leguminosas

    A caracterizao fenotpica de isolados realizada em meio YMA slido com

    azul de bromotimol em um pH de 6,8 a 7,0 (VINCENT, 1970), e so avaliadas as

    caractersticas de tempo de crescimento, alterao no pH do meio de cultura, dimetro

    das colnias, colorao da colnia, produo de muco (exopolissacardeos

    extracelulares), dentre outros (MARTINS et al., 1997). Howieson e Dilworth (2016)

    descrevem as caractersticas em meio YMA apresentadas por bactrias dos gneros

    Azorhizobium, Bradyrhizobium, Devosia, Mesorhizobium, Methylobacterium,

    Microvirga, Neorhizobium, Ochrobactrum, Phyllobacterium, Rhizobium, Ensifer,

    Shinella, Burkholderia e Cupriavidus.

    Com relao ao tempo de crescimento e alterao do pH em meio de cultura,

    trabalhos que avaliaram as caractersticas de bactrias que nodulam leguminosas

    cultivadas em solos do Semirido brasileiro tm demonstrado o predomnio de

    bactrias de crescimento rpido e que acidificam o meio (SANTOS et al., 2007;

    MEDEIROS et al., 2009; TEIXEIRA et al., 2010; MARTINS et al., 2015b; MENEZES

    et al., 2016).

    As colnias de rizbios podem desenvolver colorao branca, amarela, creme

    e rsea (HOWIESON; DILWORTH, 2016). Santos et al. (2007) em estudo de

    caracterizao e seleo de populaes nativas de rizbios para feijo-caupi cultivado

    em solo da regio Semirida de Pernambuco verificaram uma predominncia de

    colnias de cor branca. Menezes et al. (2016) avaliaram a diversidade de rizbios de

  • 39

    Eritrina velutina (Willd) nativos da Caatinga e observaram a maior frequncia de

    colnias cremes e amarelas.

    Os trabalhos que avaliaram o dimetro das colnias tm adotado a

    estratificao em trs grupos: as que apresentam dimetro inferior a 1 mm, colnias

    com dimetro que variam de 1 a 2 mm e os isolados que desenvolvem colnias com

    dimetro superior a 2mm (HOWIESON; DILWORTH, 2016). Para isolados de Arachis

    hipogea, Arachis villosulicarpa, Stylosanthes guyanensis, Stylosanthes scabra,

    Aeschynomene americana, Aeschynomene paniculatae, Aeschynomene histrix

    cultivados em solos da caatinga, foi verificado por Santos et al. (2007) que as colnias,

    em sua maioria, tinham dimetro entre 1 a 2 mm.

    A produo de muco vem sendo descrita como um mecanismo envolvido no

    processo de adaptao e sobrevivncia dos rizbios sob condies edafoclimticas

    adversas, tais como, temperatura elevada (SILVA et al., 2007). Realizando a

    caracterizao fenotpica de bactrias isoladas de ndulos de Erythrina velutina

    cultivadas em solos do Semirido brasileiro, Menezes et al. (2016) verificaram que em

    72% dos isolados existia alta capacidade de produo de muco. Resultados

    semelhantes foram observados por Freitas et al. (2007) com Jacatup, e por Freitas

    et al. (2014) com Mimosa tenuiflora e Mimosa paraibana.

    2.5.2 Caracterizao genotpica de bactrias que nodulam leguminosas

    Os mtodos genotpicos de taxonomia, direcionados para molculas de cidos

    nuclicos, tem avanado nos ltimos 20 anos e, resultaram no desenvolvimento de

    importantes ferramentas para estudos de diversidade rizobiana (GIONGO et al., 2007;

    OLIVEIRA et al., 2012; MARTINS et al., 2015b; RODRIGUES, 2016; MENEZES et al.,

    2017).

    2.5.2.1 Fingerprinting genmico

    Dentre as tcnicas de caracterizao genotpica empregadas para estudos de

    rizbios que nodulam leguminosas, merecem destaque aquelas baseadas no

    fingerprinting genmico. Por meio da tcnica de PCR (Polymerase Chain Reaction)

    promovida a amplificao de sequncias de DNA repetitivas e altamente conservadas

    presentes em mltiplas cpias nos genomas da maioria das bactrias (FREITAS et

    al., 2007; LEITE, 2011; MENEZES et al., 2016). Estes elementos repetitivos parecem

  • 40

    estar localizados em diferentes posies intergnicas, em ambas as orientaes,

    sendo o ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus), REP (Repetitive

    Extragenic Palindromic) e BOX (Box element) as trs principais famlias de elementos

    (HUNGRIA.; CHUEIRE; BANGEL, 2008). Segundo Martins et al. (2015b), as

    amplificaes com os oligonucleotdeos dos elementos REP, ERIC e BOX geram

    perfis eletroforticos altamente caractersticos, permitindo a distino entre isolados

    rizobianos.

    O BOX-PCR, por gerar impresses digitais mais robustas e produzir um padro

    de fragmentos mais complexos, tem sido umas das tcnicas moleculares mais

    utilizadas em estudos de diversidade de rizbios provenientes do Semirido brasileiro

    (FREITAS et al.,2007; FREITAS et al., 2014; MARTINS et al., 2015b; MENEZES et

    al., 2016).

    2.5.2.2 Amplificao de fragmentos de genes simbiticos para seleo de bactrias

    de ndulos de leguminosas

    Nem todas as bactrias isoladas de ndulos de leguminosas so

    necessariamente rizbios (FERNANDES JUNIOR, 2013). Tal fato evidenciado

    quando so inoculados em seus hospedeiros de origem e constata-se ausncia de

    nodulao (SILVA et al.,2012; XU et al. 2013; ARAJO.; CARVALHO; MOREIRA,

    2017). A falta de ndulos pode estar relacionada aos genes de codificao da

    nitrogenase (nif) e da nodulao (nod) de alguns rizbios serem codificados no

    plasmdeo. Esta caracterstica confere a estes isolados maior instabilidade gentica,

    fazendo com que os genes da nodulao possam ser perdidos com o tempo

    (HOWIESON; DILWORTH, 2016). A no nodulao do hospedeiro de origem pode

    tambm estar ligada ao isolamento de organismos no simbiontes presentes na parte

    interna e externa dos ndulos radiculares durante o processo de

    isolamento/purificao, a exemplo de bactrias dos gneros Paenibacillus e Bacillus,

    que so endofticas de ndulos, mas no nodulferas (COSTA et al., 2013;

    JARAMILLO et al., 2013).

    Para evitar gastos de recursos e de tempo com a caracterizao e avaliao

    simbitica de bactrias que no apresentam a capacidade de nodular, recomendada

    a confirmao da nodulao em experimentos com substrato estril, onde a bactria

    isolada reinoculada na planta hospedeira original. Este processo, conhecido como

  • 41

    autenticao, geralmente realizado em condies de casa de vegetao, utilizando

    vasos com areia e vermiculita (esterilizados) como substrato (VINCENT, 1970).

    Os ensaios para a autenticao frequentemente ocupam grande espao e

    correm o risco de serem perdidos caso ocorra nodulao no tratamento controle no

    inoculado. Nestes experimentos, a obteno do resultado depende do

    desenvolvimento vegetativo da espcie avaliada, podendo levar muito tempo para

    algumas culturas. Dessa forma, novas abordagens metodolgicas que diminuam a

    quantidade de isolados a serem avaliados nos estudos de autenticao ou suprimam

    sua necessidade tm sido demandadas (FERNANDES JUNIOR et al., 2013).

    Como alternativa a esses experimentos de autenticao, foram propostas

    metodologias que indicam a capacidade de FBN por meio da amplificao de

    fragmentos dos genes nifH e nodC. Inicialmente pela amplificao individual dos

    genes nifH e nod C (MOTHAPO et al., 2013) e, posteriormente, com o sistema duplex

    em que ocorre a amplificao simultnea dos fragmentos dos dois genes

    (FERNANDES JUNIOR et al., 2013). O duplex foi utilizado por Silva (2015) e

    Rodrigues (2016) em isolados de ndulos de Mimosa tenuiflora, Anadenanthera

    colubrina e Erythrina velutina cultivadas em solos da caatinga, servindo para

    selecionar bactrias para estudos de eficincia simbitica.

    2.5.2.3 Sequenciamento do gene 16S rRNA

    O sequenciamento do gene 16S rRNA uma das mais importantes ferramentas

    utilizadas pela rizobiologia para o posicionamento taxonmico e classificao de

    rizbios. O gene 16S rRNA um componente da subunidade 30S dos ribossomos dos

    procariotos, cujas outras molculas de RNA componentes so a 23S e a 5S. Como o

    16S o mais conservado dos rRNAs, ele proposto como um relgio evolucionrio

    capaz da reconstruo da rvore da vida (WOESE, 1987). O gene 16S considerado

    um bom marcador filogentico por exibir algumas regies conservadas, as quais so

    teis para decifrar as relaes filogenticas entre organismos distantes e regies mais

    variveis, utilizadas para diferenciar organismos estreitamente relacionados

    (WILLEMS, 2006; RADL et al., 2014).

  • 42

    2.6 Eficincia simbitica de rizbios no Semirido brasileiro

    Com relao eficincia simbitica de rizbios no Semirido brasileiro, at o

    momento os trabalhos tm sido direcionados para o feijo-caupi (MARTINS et al.,

    2003; MARINHO et al., 2014; MARINHO et al., 2017) e fornecem indicativo de que

    solos da regio semirida so fontes importantes de micro-organismos com potencial

    biotecnolgico para uso como inoculantes.

    A metodologia para obteno de bactrias eficientes na FBN compreende na

    coleta de ndulos nas razes de leguminosas presentes na rea de estudo (REIS

    JUNIOR et al., 2010), de ndulos de plantas-iscas crescendo em vasos com solo da

    rea (SANTOS et al., 2017), ou de ndulos de plantas-iscas inoculadas com diluio

    do solo crescendo em substrato estril (JESUS, 2004). Vale ressaltar, que nestes

    estudos, interessante realizar a coleta de material em diferentes tipos de solo, como

    tambm em diferentes sistemas de uso da terra e/ou diferentes coberturas vegetais,

    uma vez que a populao bacteriana pode variar em tamanho, nmero de indivduos

    e eficincia simbitica de acordo com o solo, ambiente, uso da terra ou cobertura

    vegetal (NASCIMENTO, 2013; SANTOS et al., 2017).

    Aps a obteno dos ndulos, na sequncia realizado o isolamento do rizbio

    em meio YMA, purificao das colnias, seleo das bactrias isoladas em condies

    controladas (asspticas) e no controladas. A seleo de micro-organismos uma

    das etapas mais importantes nesse processo, pois nessa etapa confirmado se a

    bactria isolada realmente rizbio, e se capaz de nodular e fixar nitrognio. Atravs

    da confirmao, identifica-se a eficincia da FBN nas bactrias avaliadas. Para tanto,

    existem diferentes condies de ensaio, compondo as bases de recomendao de

    estirpes, que se divide em quatro etapas: 1) seleo em condies controladas em

    laboratrio; 2) seleo em condies esterilizadas em vasos com substrato estril; 3)

    seleo em vasos com solo no esterilizado; e 4) seleo em condies de campo. A

    obteno de uma coleo de isolados nativos e a pr-seleo de bactrias eficientes

    geram recursos genticos para implementao de programas para a recomendao

    de novas estirpes (FARIA, 2002).

    Estudos de diversidade e eficincia e seleo de rizbios associados a

    leguminosas arbreas em solos do Semirido brasileiro podem revelar possibilidades

    de explorao para uso em sistemas agroflorestais, recuperao de reas degradadas

    e solos depauperados (MENEZES et al., 2017).

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    REFERNCIAS

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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO VINICIUS SANTOS GOMES DA SILVA PROSPECÇÃO DE RIZÓBIOS DE LEGUMINOSAS ARBÓREAS EM SOLOS DO SEMIÁRIDO BRASILEIRO SOB DIFERENTES USOS DA TERRA Recife 2017
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