UNIVERZA V LJUBLJANI - ffa.uni-lj.si · 5.3.2 Sarkoidoza ... krvi vezan na DBP, nato se odcepi ter...

UNIVERZA V LJUBLJANI

FAKULTETA ZA FARMACIJO

NATAŠA PLAVLJANIĆ

PRIMERJAVA ENCIMSKOIMUNSKE IN RADIOIMUNSKE METODE ZA

DOLOČANJE 1,25 – (OH)2 VITAMINA D V PLAZMI

COMPARISON OF ENCIME – LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY AND

RADIOIMMUNOASSAY FOR DETERMINATION OF 1,25 – (OH)2 VITAMIN D

IN PLASMA

DIPLOMSKA NALOGA

Ljubljana 2008

Diplomsko nalogo sem opravljala v Laboratoriju za analitiko hormonov in tumorskih

markerjev Kliničnega inštituta za kemijo in biokemijo v Ljubljani pod mentorstvom doc.

dr. Milana Skitka, mag. farm., spec. med. biokem. in somentorstvom dr. Aleša Jerina, univ.

dipl. kem., spec. med. biokem..

Zahvaljujem se svojemu mentorju doc. dr. Milanu Skitku, mag. farm., spec. med. biokem.

za presojo in pregled dela, somentorju dr. Alešu Jerinu, univ. dipl. kem., spec. med.

biokem., ki mi je svetoval in me usmerjal pri izdelavi diplomske naloge.

Zahvaljujem pa se tudi Stanki Cankar, dipl. inž. lab. biomed. za pomoč pri izvedbi

praktičnega dela diplomske naloge.

Posebna zahvala pa gre mojim staršem in domačim, ki so mi omogočili študij in me

podpirali, spodbujali in mi potrpežljivo stali ob strani.

IZJAVA:

Izjavljam, da sem diplomsko nalogo izdelala samostojno pod vodstvom mentorja doc. dr.

Milana Skitka, mag. farm., spec. med. biokem. in somentorja dr. Aleša Jerina, univ. dipl.

kem., spec. med. biokem..

Ljubljana, 2008 Nataša Plavljanić

Predsednik diplomske komisije: izr. prof. dr. Vojko Kmetec

Član diplomske komisije: doc. dr. Bojan Doljak

Kazalo vsebine:

SEZNAM OKRAJŠAV.................................................................................................................................- 2 - II. UVOD.......................................................................................................................................................- 3 -

1. SPLOŠNO O VITAMINU D ..................................................................................................................- 3 -

2. METABOLIZEM VITAMINA D ..........................................................................................................- 3 -

3. DNEVNE POTREBE VITAMINA D IN VSEBNOST V HRANI.......................................................- 5 -

4. BOLEZNI POVEZANE Z POMANJKANJEM VITAMINA D .........................................................- 7 - 4.2 KONGENITALNA HIPOFOSFATEMIJA........................................................................................- 9 - 4.3 OSTEOMALACIJA ...........................................................................................................................- 9 - 4.4 OSTEOPOROZA ...............................................................................................................................- 9 - 4.5 HIPOPARATIROIDIZEM ...............................................................................................................- 11 - 4.6 HIPERPARATIROIDIZEM.............................................................................................................- 12 -

4.6.2 Sekundarni hiperparatiroidizem................................................................................................- 13 - 5.1 TOKSIČNOST VITAMINA D IN KALCIFEDIOLA .....................................................................- 14 -

5.3.1 Granulomatozne bolezni ...........................................................................................................- 14 - 5.3.2 Sarkoidoza ................................................................................................................................- 15 -

6. FUNKCIJA VITAMINA D V LEDVICAH ........................................................................................- 15 - 6.1 BOLEZNI POVEZANE Z VITAMINOM D IN LEDVICAMI.......................................................- 15 -

6.1.1 Toksičen vpliv vitamina D na ledvice.......................................................................................- 15 - 6.1.2 Poškodba ledvic ........................................................................................................................- 16 - 6.1.3 Ostale bolezni: ..........................................................................................................................- 16 -

7. METODE ZA DOLOČANJE VITAMINA D.....................................................................................- 16 - 7.1.2 IMUNOLOŠKE METODE, KI TEMELJIJO NA REAKCIJI ANTIGEN - PROTITELO......- 18 - 7.1.3 RADIOIMUNOLOŠKA METODA ( RIA ).............................................................................- 18 - 7.1.4 ENCIMSKO IMUNSKA METODA ( ELISA ) .......................................................................- 19 -

III. NAMEN DELA.....................................................................................................................................- 25 - METODE IN MATERIALI ........................................................................................................................- 26 -

1. VZORCI.................................................................................................................................................- 26 - 2.1 ELISA METODA.............................................................................................................................- 27 -

NAMEN UPORABE .........................................................................................................................- 27 - PRINCIP TESTA...............................................................................................................................- 27 - ANALITČNA OBČUTLJIVOST......................................................................................................- 28 - NATANČNOST ................................................................................................................................- 28 - ANALITIČNA SPECIFIČNOST ......................................................................................................- 28 - OPOZORILA IN ROKOVANJE.......................................................................................................- 28 - VAKUUMSKA POSODA VAC ELUT SPS 24 VARIAN INC .......................................................- 30 - IZRAČUN REZULTATOV ..............................................................................................................- 33 - ORIENTACIJSKE REFERENČNE VREDNOSTI...........................................................................- 34 - OMEJITVE POSTOPKA ..................................................................................................................- 34 - KONTROLA KAKOVOSTI .............................................................................................................- 34 -

2.2 RIA METODA .................................................................................................................................- 35 - NAMEN UPORABE .........................................................................................................................- 35 - PRINCIP TESTA...............................................................................................................................- 35 - ANALITIČNA OBČUTLJIVOST.....................................................................................................- 35 - NATANČNOST ................................................................................................................................- 35 - ANALITIČNA SPECIFIČNOST ......................................................................................................- 36 - 1470 WALAC WIZARD GAMA ŠTEVEC GMI INC .....................................................................- 36 - POTEK ANALIZE ............................................................................................................................- 38 - IZRAČUN REZULTATOV ..............................................................................................................- 41 -

ORIENTACIJSKE REFERENČNE VREDNOSTI...........................................................................- 41 - OMEJITVE POSTOPKA ..................................................................................................................- 41 - KONTROLA KAKOVOSTI .............................................................................................................- 42 -

IV. PREGLED REZULTATOV ..............................................................................................................- 43 -

1. STATISTIČNO VREDNOTENJE METOD.......................................................................................- 43 - A.) Aritmetična sredina ..........................................................................................................................- 43 - B.) Standardna deviacija.........................................................................................................................- 43 - C.) Koeficient variacije...........................................................................................................................- 43 - D.) Passing in Bablok regresija...............................................................................................................- 43 - E.) Primerjava metod po Bland Altmanu................................................................................................- 44 - F.) t test...................................................................................................................................................- 45 -

2. IZRAČUN REZULTATOV .................................................................................................................- 45 - ELISA METODA...................................................................................................................................- 45 - RIA METODA .......................................................................................................................................- 46 -

3. PRIMERJAVA KONCENTRACIJ MED METODAMA .................................................................- 48 - V. RAZPRAVA...........................................................................................................................................- 49 - VI. SKLEP ..................................................................................................................................................- 52 - VII. VIRI IN LITERATURA ......................................................................................................................- 53 -

Literatura slik:...........................................................................................................................................- 54 - Kazalo slik:

Slika 1: Ergokalciferol - vitamin D2 in holekaciferol - vitamin D3 ..............................................................- 3 - Slika 2: Aktivacija vitamina D3 ....................................................................................................................- 4 - Slika 3: Ukrivljene noge zaradi rahitisa ........................................................................................................- 8 - Slika 4: prerez vretenc pri zdravem človeku in pri hudi osteoporozi ..........................................................- 10 - Slika 5: Zlom na vretencih in zlom kolka pri osteoporozi...........................................................................- 11 - Slika 6: Indirektna ˝Sendvič ˝ELISA...........................................................................................................- 20 - Slika 7: Analizator Personal Lab .................................................................................................................- 29 - Slika 8: Vac Elut SPS 24.............................................................................................................................- 30 - Slika 9: Walac Wizard gama števec ............................................................................................................- 36 - Slika 10: Passing in Bablok regresijska premica .........................................................................................- 44 - Slika 11: Bland Altman ...............................................................................................................................- 44 - Slika 12: Standardna krivulja za ELISA metodo.........................................................................................- 46 - Slika 13: Standardna krivulja za RIA metodo .............................................................................................- 47 - Kazalo tabel:

Tabela 1: Viri vitamina D v hrani..................................................................................................................- 6 - Tabela 2: Material prisoten v kompletu.......................................................................................................- 31 - Tabela 3: Material prisoten v kompletu.......................................................................................................- 37 -

DIPLOMSKA NALOGA: Primerjava radioimunske in encimskoimunske metode za določanje 1,25 - (OH)2 vitamina D v plazmi

I. POVZETEK

Vitamin D je antirahitični vitamin, ki ga pogosto imenujemo ˝vitamin sonca˝, saj je

ultravijolična svetloba odgovorna za njegovo produkcijo. Lahko nastaja v koži pod

vplivom ultravijolične svetlobe ( endogeni vir vitamina D ) ali pa ga vnašamo v telo s

prehrano ( eksogeni vir vitamina D ). Če je dovolj sonca, se sintetizira v koži iz

provitamina D in ga v idealnih okoliščinah ni potrebno vnašati v telo s hrano. Vitamin D

pa lahko vnašamo v telo tudi s prehrano, ki vsebuje naravno nizke ravni vitamina D2 ( npr.:

mleko, maslo, kosmiči z dodatkom vitamina D), ali pa z prehranskimi dopolnili, ki so

pripravljeni in se dobijo v trgovinah, ter s terapevtskimi formulacijami vitaminov D2. Vit.

D lahko prepreči ali pa zdravi rahitis.

Vit. D sam po sebi ni dejaven, ko stopi v krvni obtok. Biološko dejavnost dobi šele z

kompleksnim nizom v presnovi. Skupaj z PTH regulira homeostazo kalcija v plazmi.

Pospešuje absorpcijo kalcija in fosfatov in je nujno potreben za normalno rast in

mineralizacijo kosti in zob.

Pri tej diplomski nalogi smo določali koncentracijo 1,25-(OH)2 D v serumu z dvema

metodama; in sicer z encimskoimunsko metodo in radioimunsko metodo. Pri obeh

metodah smo uporabili iste vzorce, saj smo hoteli metodi primerjati med seboj in ugotoviti

katera metoda je zanesljivejša in enostavnejša za uporaba ter katera je boljša. Do sedaj se

je za določanje 1,25-(OH)2 D uporabljala radioimunska metoda, pri kateri se uporabljajo

radioaktivni izotopi, ki so zdravju škodljivi in nevarni. Zato smo poizkusili ali bi

encimskoimunska metoda lahko nadomestila radioimunsko metodo.

Dobljeni rezultati so pokazali, da metodi ne dajeta enakih rezultatov. Da bi ugotovili,

katera metoda je boljša, smo pri vrednotenju rezultatov upoštevali kontrolni karti obeh

metod. Radioimunska metoda se je izkazala za bolj zanesljivo kot encimskoimunska

metoda.

Na podlagi eksperimentalnega dela smo zaključili, da encimskoimunska metoda ne more

nadomestiti dolgoletno in preverjeno radioimunsko metodo.

- 1 -


SEZNAM OKRAJŠAV

VDR – vitamin D receptor

1,25-(OH)2 D – 1,25-dihidroksivitamin D

Vit. D – vitamin D

PTH – paratiroidni hormon

iPTH – imunoreaktivni paratiroidni hormon

Ag – antigen

Ab – protitelo

TMB – tetrametilbenzidin

NSB – kalij fosfatni želatinski pufer

GAR precipitacijski kompleks- kozji proti kunčji precipitacijski kompleks

DBP - vitamin D vezujoči protein

MEN - multipla endokrina neoplazija

DHH - družinska hipokalciurična hiperkalcemija

µg - mikrogram

µL - mikroliter

- 2 -


II. UVOD

1. SPLOŠNO O VITAMINU D

Vitamin D je edini vitamin, ki ga telo lahko proizvede samo, in sicer s pomočjo obsevanja

kože z ultravijolično svetlobo. Človeške potrebe po vitaminu D zadovolji že 10 do 15

minutno izpostavljanje soncu 2 do 3 krat na teden. Ljudje, ki živijo bolj severno ali pa so

pretežno v zaprtih prostorih, so manj izpostavljeni soncu, si lahko dovolj vitamina D

zagotovijo le z ustrezno prehrano ali pa z jemanjem vitaminskih dopolnil.

Vitamin D je netopen v vodi, topi pa se v maščobi, alkoholu, kloroformu,etru in

rastlinskih oljih. Pospešuje absorpcijo kalcija in fosforja iz prebavnega sistema in vpliva na

nalaganje in absorpcijo kalcija v kosteh. Potreben je za normalno rast in mineralizacijo

kosti in zob. 1

2. METABOLIZEM VITAMINA D

Vitamin D se uvršča med vitamine, čeprav gre za hormon (zaradi steroidne strukture in

načina delovanja). Obravnava se kot prohormon z različnimi aktivnimi metaboliti, ki

delujejo kot hormoni. Najučinkovitejši obliki, ki se uporabljata v terapevtske namene sta

vitamina D2 - ergokalciferol in D3 - holekalciferol. 1

Slika 1: Ergokalciferol - vitamin D2 in holekaciferol - vitamin D3

- 3 -


Koža

Holekalciferol (vitamin D3)

jetra

inhibicija

25 – hidroksiholekalciferol

aktivacija

ledvice Paratiroidni hormon

1,25 – dihidroksikalciferol

Intestinalni epitelij

Kalcij Kalcij stimulirajoča alkalna fosfataza

vezoči ATP-aza

protein

Inhibicija

Intestinalna apsorbcija kalcij

Plazemska koncentracija kalcijevih ionov

Slika 2: Aktivacija vitamina D3

Ergokalciferol oz. vitamin D2 je antirahitična substanca, ki se pridobiva z ultravijoličnim

sevanjem iz ergosterola (sterol v glivicah in kvasovkah). To je glavna naravna oblika

vitamina D v rastlinah. Rastlinojedci uporabljajo vitamin D2 kot glavni vir vitamina D.

- 4 -


Lahko se metabolizira v različne oblike, ki predstavljajo analoge vitamina D3. ena od teh

oblik je tudi hormonsko aktivna oblika vitamina D2 1,25 – dihidroksivitamin D.

Vitamin D3 – holekalciferol nastaja v koži z fotolizo pod vplivom UV- radiacije ( β žarki)

iz 7 – dehidroholesterola, ki je normalno prisoten v koži. Ko je koža izpostavljena soncu,

pride do razčlenitve B-obroča v steroidni strukturi, pri čemer se tvori provitamin D3, ki se

spontano izomerizira v vitamin D3.

Holekalciferol se v jetrih aktivira in se v procesu 25 – hidroksilacije pretvori v kalcifediol

oz. 25 – hidroksiholekaciferol. Kalcifediol lahko s povratno zvezo inhibira reakcijo

pretvorbe, ta povratna zveza pa je pomembna zaradi zelo natančnega nadziranja

koncentracije kalcifediola v plazmi ter zaradi nadziranja pretvorbe vitamina D3 v

kalcifediol. V taki obliki pa se v jetrih skladišči za nadaljnjo uporabo.

V procesu 1α – hidroksilacije se kalcifediol nadalje hidroksilira v glavno biološko aktivno

obliko kalcitriol ( 1,25- dihidroksiholekalciferol). Do te hidroksilacije pride v proksimalnih

tubulih ledvic. Ta oblika je najaktivnejša oblika vitamina D. Kalcitriol nekaj časa potuje po

krvi vezan na DBP, nato se odcepi ter vstopi v tarčno celico z difuzijo in prid v stik z

VDR. Kalcitriol se veže s transkripcijskim faktorjem, ki regulira gensko ekspresijo

transportnih proteinov, ki so vključeni v absorpcijo kalcija v črevesju. Rezultat tega je

vzdrževanje koncentracije kalcijevih in fosfatnih ionov v krvi in kosteh. Pri tem pa še

sodelujeta paratiroidni hormon in kalcitonin. Če ledvice odstranimo, vitamin D izgubi ves

svoj učinek. Če ni PTH-ja je tvorba kalcitriola popolnoma prekinjena, zato PTH močno

vpliva na funkcionalne učinke vitamina D v organizmu. 2

3. DNEVNE POTREBE VITAMINA D IN VSEBNOST V HRANI

Izpostavljanje kože sončni svetlobi zagotovi 80 – 90 % potrebne količine vitamina D.

zadostuje že kratek čas na soncu, in sicer 5-10 min 2-3 krat na dan, ta pa je odvisen tudi od

tipa kože, starosti in prisotnosti UVB radiacije. Izpostavljeni morajo biti roke, obraz in

hrbet. Če uporabljamo kreme z visokimi zaščitnimi faktorji, ne pride do sinteze vitamina

D, prav tako pa je sinteza zmanjšana ob slabem vremenu in v zimskem obdobju.

- 5 -


Ko se proizvede dovolj vitamina D, se dodatni vitamin D pretvori v neaktivno obliko in

se skladišči v telesu. Prekomerno izpostavljanje soncu ne poveča nivoja vitamina D,

poveča pa tveganje za dolgotrajne poškodbe kože.

Tabela 1: Viri vitamina D v hrani

HRANA VSEBNOST VITAMINA D V µg

Losos ( kuhan ) 9

Sardine v olju 6,25

Tuna v olju 5

Mleko obogateno z vitaminom D,

en kozarec

2,45

Margarina ( 1 žlica) 1,5

Fruchtzwerge 2 lončka( 100 g ) 1,25

Ementalec ( 1 rezina ) 1,10

Jajce (v rumenjaku) 0,5

Mleko, 1 kozarec 023

Jogurt ( 125 g) 0,08

Ribje olje polenovke 1 žlica 0,034

Vitamin D pa se nahaja tudi v kosmičih in mleku z dodatkom vitamina D in v prehranskih

dopolnilih, ki so že pripravljena ( AD3 kapljice, Alpha D3, Plivit D3, Rocatrol).

Priporočene dnevne količine vnosa vitamina D v telo so:

200 – 600 IE na dan oz.

5 – 15 µg na dan

Zgornja meja tolerance vitamina D pa znaša 2000 IE oz. 50 µg na dan, kar je 10 krat

povečana normalna priporočena količina.

Do pomanjkanja vitamina D ponavadi pride zaradi neustrezne prehrane, premalo

izpostavljanja sončni svetlobi, upočasnjene absorpcije, povišanje izločanja ter ob

- 6 -


nezmožnosti pretvorbe v ledvicah. Pri dojenčkih in v otroštvu pomanjkanje vitamina D

povzroča rahitis, pri odraslih pa pomanjkanje tega vitamina povzroča mehčanje kosti.

Prevelika količina vitamina D pa povzroča zmanjšanje apetita, telesne teže, morsko

bolezen, glavobol, depresijo in pa prenakopičenje kalcija v mladosti. 4

4. BOLEZNI POVEZANE Z POMANJKANJEM VITAMINA D

Večjo možnost za razvoj pomanjkanja vitamina D imajo starejši ljudje ( nad 50 let ), saj

je pri starejših zmanjšana sposobnost pretvorbe 7 – dehidroholesterola v provitamin D3 v

koži. Prav tako pa tudi ledvice, ki pretvarjajo kalcifediol v aktivno obliko ne delujejo

brezhibno kot pri mladih ljudeh. Za pomanjkanjem vitamina D pa trpijo tudi ljudje, ki niso

dovolj izpostavljeni sončni svetlobi. Tem ljudem se zato priporoča jemanje nadomestkov

vitamina D kot so šumeče tablete ali pa prehranska dopolnila, ki vsebujejo vitamin D. 1

4.1 RAHITIS

Ob pomanjkanju vitamina D se pojavi rahitis, saj je proces v kosteh skoraj prekinjen. Gre

za nezadostno mineralizacijo kosti, ki je posledica pomanjkanje kalcijevih in fosfatnih

ionov v ekstracelularni tekočini. Pojavlja se samo pri otrocih, ki jim kosti še rastejo. Zaradi

vse pogostejše uporabe nadomestkov vitamina D, so problemi v povezavi z rahitisom pri

otrocih vse redkejši.

Rahitis se pojavlja večinoma spomladi, saj se vitamin D ustvarjen prejšnje poletje, ki se

je skladiščil v jetrih, porabi preko zime. Absorpcija kalcija in fosforja iz kosti pod vplivom

PTH, lahko za nekaj časa prepreči klinične znake vitamina D.

Pri rahitisu se v plazmi rahlo zniža koncentracija kalcija, veliko bolj pa se zniža

koncentracija fosfata. Do takšnih razlik pride, ker paratiroidne žleze preprečujejo, da bi se

koncentracija kalcija znižala in ob najmanjšem znižanju koncentracije povečajo absorpcijo

kalcija iz kosti. To pa ni zadosten regulacijskih sistem, ki bi preprečeval znižanje vrednosti

fosfata, in zato povečano delovanje paratiroidnih žlez pravzaprav poveča izločanje fosfatov

preko urina.

Pri dolgotrajnem rahitisu se zaradi kompenzacijskega povečanja izločanja PTH pretirano

poveča demineralizacija kosti. Posledica tega je, da kosti slabijo. Kost postaja vedno

šibkejša, ker osteoblasti izgubljeno kostno maso nadomeščajo z osteidom, ki pa se zaradi

- 7 -


pomanjkanja kalcija in fosfata ne more mineralizirati. To vse pa vodi v motnje razvoja in

hude deformacije kosti.

V zgodnjih fazah rahitisa se tetanija ne pojavi skoraj nikoli. Paratiroidne žleze konstantno

stimulirajo osteoklastno absorpcijo iz kosti in s tem vzdržujejo normalno koncentracijo

kalcija v ekstracelularni tekočini. Ko se zaloge kalcija v kosteh izčrpajo toliko, da vrednost

kalcija v krvi pade pod 1 mmol/L se običajno razvijejo znaki tetanije. Otrok lahko umre

zaradi tetaničnega krča laringealnih ( respiratornih ) mišic, zato mu je potrebno

intravenozno vbrizgati kalcij, ki takoj prepreči tetanijo.

Simptomi:

- mišični krči

- počasnejše zaraščanje lobanjskih kosti

- hrbtenična krivina je pri otrocih od enega do štirih let nenormalna

- noge so ukrivljene

- otroci shodijo pozneje

- starejše otroke in mladostnike med hojo boli

- zaradi sploščitve medeničnih kosti in zoženja porodnih poti pri mladostnicah pozneje

oteženo rojevanje

Slika 3: Ukrivljene noge zaradi rahitisa

Terapija pri rahitisu pomeni po eni strani priskrbeti zadostne količine kalcija in fosfata v

prehrani, po drugi strani pa dodati zadostne količine vitamina D. Če vitamin D ni dodan, se

le majhne količine kalcija in fosfata absorbirajo iz črevesja.

- 8 -


4.2 KONGENITALNA HIPOFOSFATEMIJA

Kongenitalna hipofosfatemija ali vitamin D rezistenten rahitis je vrsta ledvične bolezni, ki

izzove rahitis in osteomalacijo. Nastane kadar je absorpcija fosfata v ledvičnih tubulih

zmanjšana. Pri ljudeh, ki so jim odstranili ledvico ali je bila ta poškodovana in se zdravijo s

hemodializo, lahko izzove hude zaplete. To obliko rahitisa zdravimo z fosfatnimi

substancami in ne s kalcijem in vitaminom D.

4.3 OSTEOMALACIJA

Osteomalacija je rahitis odraslih. Tu gre za mehčanje, slabljenje in demineralizacijo kosti

zaradi pomanjkanja vitamina D. Ker imajo odrasli že zgrajen skelet, ne potrebujejo toliko

kalcija in vitamina D kot otroci. Osteomalacija tako nastopi le, če je resno motena

absorpcija maščob ( steatoreja ). Občasno je absorpcija kalcija in fosfata pri odraslih tako

slaba, da se lahko pojavi rahitis. Ta praktično nikoli ne napreduje do tetanije, vseeno pa

težko poškoduje kosti. Klinični znaki osteomalacije so oslabelost kosti ( gumijasta

konsistenca ), zelo redko pa pride do tetanije. Najpogostejši vzrok za slabšo absorpcijo

vitamina D so nekatera zdravila

( antikonvulzivi, holestiramin), za moteno črevesno absorpcijo fosfatov ali ledvično

reasorpcijo pa toksične snovi ( aluminij, kadmij, fluoridi).

Poznamo še ledvični rahitis, ki je tip osteomalacije, ki nastane kot posledica

dolgotrajnega obolenja ledvic ( ledvična insuficienca, ledvična odpoved ). Glavni vzrok

tega stanja je predvsem nezmožnost ledvic, da tvori 1,25 – dihidroksiholekalciferol. Pri

ljudeh, ki so jim odstranili ledvico ali pa je ta bila poškodovana in se zdravijo z

hemodializo, pojav ledvičnega rahitisa predstavlja hud zaplet. Pojavi se lahko tudi

hipokalcemija. 4

4.4 OSTEOPOROZA

Je najpogostejše obolenje kosti pri odraslih, še posebej pogosta pa je v visoki starosti.

Definirana je kot zmanjšanje kostne mase na volumsko enoto kosti. Tej definicij ustreza

širok spekter motenj z različnimi vzroki, v ožjem smislu pa osteoporozo pojmujemo kot

bolezen, kjer je primarno moteno nastajanje organskega matriksa kosti.

- 9 -


Slika 4: prerez vretenc pri zdravem človeku in pri hudi osteoporozi

Od osteomalacije in rahitisa se razlikuje prav po tem, da je primarno prizadeto nastajanje

organskega matriksa kosti, kot sekundarni učinek pa je zmanjšana mineralizacija kosti, saj

se ob izgubi kostnega matriksa kristali kalcijevega hidroksiapatita nimajo kam vezati. Pri

osteoporozi se aktivnost osteoblastov v kosteh običajno zniža, posledično pa je zmanjšano

tudi odlaganje osteoida. Včasih pa je vzrok za zmanjšanje kostnega tkiva tudi prekomerna

aktivnost osteoklastov. Osteoporoza je pogosta pri ženskah v postmenopavzalnem

obdobju, ker pomanjkanje estrogena pospeši kostno resorpcijo in zavre nalaganje osteoida,

s tem pa je onemogočeno nalaganje mineralov na organski kostni matriks. Vzroki za

osteoporozo so lahko dedni ali pa pridobljeni, pogosto pa so kombinirani.

Pridobljeni vzroki:

- fizična neaktivnost

- pomanjkanje vitamina C, ki nujen za nemoteno sintezo kolagena, ki je osnovna

sestavina organskega matriksa

- podhranjenost ( ne more se tvoriti zadosten proteinski matriks)

- zmanjšana sekrecija estrogena po menopavzi

- starost ( zmanjšana koncentracija rastnega hormona )

- Cushingov sindrom

- hipogonadizem pri moških

- alkohol

- 10 -


Pri osteoporozi se pojavijo pogostejše frakture in deformacije, najhujša komplikacija pa je

zlom kolka.

Slika 5: Zlom na vretencih in zlom kolka pri osteoporozi

Diagnostika temelji na merjenju gostote kostne mase, kar naredimo z denziometrom, ki

deluje na osnovi rentgenskih žarkov. Merjenje je neboleče, sevanje pa je zanemarljivo

majhno. Osteoporozo lahko preprečimo z ustrezno zdravo prehrano, ki vsebuje veliko

kalcija, z redno telesno aktivnostjo oz. vadbo, na razpolago pa imamo tudi zdravila, kot so

hormoni, bifosfonati, kalcitonin, kalcij, vitamin D. Preprečimo pa jo tudi tako, da

prenehamo kaditi in z zmernim uživanjem alkohola. 4

4.5 HIPOPARATIROIDIZEM

Hipoparatiroidizem je stanje zmanjšanega izločanja obščitničnega hormona PTH, ki je

odgovoren za uravnavanje aktivnosti osteoklastov. Lahko je posledica kirurške odstranitve

obščitnice, genetske motnje, avtoimunske bolezni, Wilsonove bolezni ali zmanjšanega

odzivanja tarčnih celic na PTH. V primeru premajhnega izločanja postanejo osteoklasti

skoraj popolnoma neaktivni, kar privede do zmanjšane reabsorpcije kalcija iz kosti in

posledično do hipokalcemije. Izmed vseh mišic so na tetanični spazem najbolj občutljive

mišice grla.

Za zdravljenje hipoparatiroidizma se zelo redko uporablja PTH, ker je ta hormon zelo

drag, in deluje le nekaj ur, prav tako pa organizem zanj ustvarja protitelesa. Večinoma se

za zdravljenje uporablja vitamin D v velikih količinah ( 100000 IE na dan ) skupaj z

kalcijem v obliki kalcijevega glukonata ( 25 do 50 mmol), saj skupaj vzdržujeta

koncentracijo kalcija v telesnih tekočinah v normalni ravni. Včasih pa se namesto

- 11 -


inaktivnega vitamina D dodaja kalcitriol, saj je močnejši in deluje hitreje, vendar pa ta

povzroča tudi stranske učinke.

4.6 HIPERPARATIROIDIZEM

4.6.1 Primarni hiperparatiroidizem

Primarni hiperparatiroidizem nastane zaradi prekomerne produkcije in sproščanja PTH-ja

iz obščitnic. Pogostejši je pri ženskah, ker nosečnost in laktacija dražita paratiroidne žleze

in ustvarjata predispozicijo za razvoj tovrstnih tumorjev. Povzročijo ga lahko adenom,

karcinom ali pa difuzna hiperplazija.

1. Adenom

Je najpogostejši vzrok za nastanek primarnega hiperparatiroidizma. Večina paratiroidnih

adenomov prizadene posamezno žlezo. Tumorske celice obščitnic izločajo prevelike

količine PTH-ja, saj se na spremenjeno koncentracijo kalcija v krvi odzivajo slabše ali pa

se sploh ne odzivajo.

2. Karcinom obščitnic

Je zelo redek. Vaskularna ali kapsularna invazija s tumorskimi celicami je zelo dober

indikator malignosti, vendar ta karakteristika ni vedno prisotna. V večini primerov

podpirajo diagnozo lokalne ponovitve ali metastaze v jetrih, pljučih ali kosteh.

3. Paratiroidna hiperplazija

Ponavadi se nanaša na povečanja ali abnormalnosti vseh štirih žlez. Lahko je del

sindroma avtosomne dominantne multiple endokrine neoplazije ( MEN ) oz. družinske

hipokalciurične hiperkalcemije (DHH ). Gre za bolezen, kjer je gen za receptor. Ki je

občutljiv za kalcijeve ione mutiran. Ta receptor je izražen v različnih tkivih. V obščitnicah

zazna plazemsko koncentracijo kalcijevih ionov in določi koliko PTH-ja se izloči. V

ledvicah pa določa nivo ekskrecije kalcijevih ionov z urinom. Pri DHH je okvarjena

zmožnost receptorja za zaznavanje kalcijevih ionov v serumu, zato se kljub normalni

serumski koncentraciji kalcijevih ionov iz obščitnic izloča PTH, izločanje kalcijevih ionov

z urinom pa se zmanjša. Posledica tega je koncentracija kalcijevih ionov v serumu

- 12 -


povišana v urina pa znižana. DHH zajame vse štiri žleze, zato je v takih družinah povečana

možnost za nastanek raka na obščitnicah.

Obščitnice takih pacientov so tipično povečane. Prekomerno izločanje PTH-ja poveča

aktivnost osteoklastov, ki razgrajujejo kostnino. Posledično se koncentracija kalcijevih

ionov v ekstracelularni tekočini poveča, koncentracija fosfatnih ionov za zmanjša. PTH

zmanjša tudi reabsorpcijo bikarbonatnega iona v ledvicah, zato se njegova koncentracija v

ekstracelularni tekočini zniža in pride do metabolne acidoze.

Klinični znaki so pri večini bolnikov asimptomatski, pri nekaterih pa je klinična slika zelo

raznolika:

- težave s skeletom ( zlomi, kostne ciste )

- hiperkalcemija

- ledvični kamni

- metastatične kalcifikacije

- znaki depresije živčevja

- bruhanje

- poliurija

4.6.2 Sekundarni hiperparatiroidizem

Pojavlja se visoka vrednost PTH-ja, in sicer kot kompenzacijska reakcija na

hipokalcemijo, in ne nastaja zaradi primarne spremembe v obščitničnih žlezah. Pri

pacientih s kronično renalno okvaro se pojavlja veliko dejavnikov, ki prispevajo k

povečanju obščitnic. To pa vključuje zmanjšano produkcijo 1,25-dihidroksivitamina D,

zmanjšano absorpcijo kalcija v črevesju, odpornost na PTH in zadrževanje fosfata v

ledvicah. Če pa ne gre za renalno okvaro pa se sekundarni hiperparatiroidizem lahko

razvije zaradi pomanjkanja vitamina D ali kalcija.

Klinični znaki:

- pomanjkanje vitamina D → to vodi do osteomalacije

- velike količine izločenega PTH → to povzroča absorpcijo kostnine

Diagnostika hiperparatiroidizma temelji na merjenju koncentracije kalcijevih ionov v

serumu in na merjenju imunoreaktivnega PTH ( iPTH ). 1

- 13 -


5. BOLEZNI POVEZANE Z PREKOMERNO KOLIČINO VITAMINA D

Vitamin D ima v človeškem telesu dolgo razpolovno dobo in širok razpon distribucije.

Hrana in vitaminske tablete vsebujejo zelo majhne koncentracije vitamina D, da je

prekomeren odmerek v normalnih pogojih skoraj nemogoča. Prekomerni vnos pa lahko

vodi do hiperkalcemije in ateroskleroze. 1

5.1 TOKSIČNOST VITAMINA D IN KALCIFEDIOLA

Običajen vzrok, da pride do te toksičnosti je nepravilna uporaba farmakoloških sredstev,

zlasti kadar je vitamin D predpisan kot terapija, in sicer pri hipoparatiroidizmu, renalnih

motnjah, osteoporozi, osteomalaciji, … Lahko pa se pojavi tudi pri pretiranem jemanju

vitaminskih nadomestkov. Prevelika izpostavljenost soncu pa ne vpliva preveč na

toksičnost vitamina D. Drugi dejavniki, ki še vplivajo na to toksičnost so povečan vnos

kalcija s hrano, zmanjšana ledvična funkcija, dodajanje vitamina A in pa granulomatozne

motnje. 1

5.2 TOKSIČNOST KALCITRIOLA

Kalcitriol se uporablja za zdravljenje številnih metabolnih kostnih bolezni, saj ima

sposobnost zaviranja sinteze PTH. Tudi v tem primeru pride do toksičnosti zaradi

nepravilne uporaba farmakoloških sredstev. Dnevne doze nad 0,75 µg so lahko že toksične. 1

5.3 OBLIKE ENDOGENE TOKSIČNOSTI VITAMINA D

5.3.1 Granulomatozne bolezni

Bolniki z granulomatoznimi obolenji so preobčutljivi na vitamin D, zato se pri njih

razvije hiperkalcemija tudi brez pretiranega vnosa vitamina D. Ta sindrom je povzročen z

ektopično produkcijo 1,25-(OH)2 D toksičnosti. To toksičnost povzroča samo

granulomatozno tkivo. 1

- 14 -


5.3.2 Sarkoidoza

Je najbolj pogosta granulomatozna bolezen, ki je povezana s hiperkalcemijo. Pri tem

nastanejo v mnogih organih granulomi. Sarkoidni granulomi ustvarjajo aktivirani vitamin

D, ki stopnjuje vsrkavanje kalcija iz črevesa. Visoka koncentracija kalcija v krvi povzroči

izgubo apetita, slabost, bruhanje, žejo in čezmerno nastajanje seča. Pogosto se razvije tudi

hiperkalciurija. Če visoka koncentracija kalcija v krvi traja predolgo, povzroči nastanek

ledvičnih kamnov in posledično lahko tudi odpoved ledvic. 1

6. FUNKCIJA VITAMINA D V LEDVICAH

Ledvice imajo življenjsko pomembno funkcijo pri nadzoru kalcija in fosforja v plazmi. V

času 24-ih ur se 8g kalcija filtrira skozi glomerule, okoli 7,8g pa se ga reabsorbira v

proksimalnih in distalnih tubulih ter v Henleyjevi zanki. Koncentracija kalcija v urinu se

mora izenačiti s koncentracijo kalcija, ki se je absorbiral v tankem črevesju. Reabsorpcijo

kalcija v ledvicah kontrolirajo številni faktorji: celotna filtracija natrija, aktivnost številnih

hormonov, tok urina…

Ledvice predstavljajo mesto sinteze kalcitriola, ter izražajo številne proteine, ki so odvisni

od vitamina D kot so: Ca črpalka, natrij/kalcijev izmenjevalec in kalbindin-D, izražajo pa

tudi VDR, poleg tega pa še kalcifediol in kalcitriol. 1

6.1 BOLEZNI POVEZANE Z VITAMINOM D IN LEDVICAMI

6.1.1 Toksičen vpliv vitamina D na ledvice

Sposobnost koncentriranja urina je lahko zmanjšana , saj visoka koncentracija kalcija

spremeni delovanje vazopresina na ledvične tubule. Pojavi se lahko poliurija in posledično

tudi polidipsija. Prvi znak pojava toksičnosti vitamina D je hiperkalciurija, ki se pojavi

pred hiperkaclemijo.

- 15 -


6.1.2 Poškodba ledvic

Ledvice so tiste, ki vitamin D preoblikujejo v aktivno obliko kalcitriol. Če pride do

oslabitve ledvic, kosti ne dobijo dovolj kalcija, ker ledvice ne pretvarjajo zadostno količino

vitamina D v kalcitriol in pa ker se v krvi nabira preveč fosforja. Zato morajo bolniki s

poškodovanimi ledvicami jemati sintetični kalcitriol ali sintetični vitamin D.

6.1.3 Ostale bolezni:

- osteomalacija pri kronični napaki ledvic, povzročena z zmanjšano produkcijo vitamina D

in z zadrževanjem fosforja v ledvicah

- zastrupitev s PTH-jem in metastazne kalcifikacije

- tvorba ledvičnih kamnov pri hiperparatireoidizmu

7. METODE ZA DOLOČANJE VITAMINA D

7.1 IMUNOKEMIJSKE TEHNIKE

Odkar se je imunologija pojavila kot veja medicine pred več kot dvema stoletjema,

obravnava nove pristope k nadzorovanju nalezljivih bolezni pri človeku in živalih. Že od

začetka je bila obravnavana kot znanost, ki je tesno povezana z mikrobiologijo. Zdaj se je

imunologija razvila v eno od najbolj kreativnih vej medicine. Razumevanje mehanizma

imunskega sistema in imunoloških lastnosti patogenov je tlakovana pot za razvoj različnih

pristopov za izdelavo učinkovitih cepiv proti različnim človeškim in živalskim boleznim.

Prav tako pa razumevanje in znanje interakcij antigen protitelo v in vitro pogojih omogoča

razvoj različnih imunoloških testov, ki se uporabljajo za diagnostiko nalezljivih in tudi

nenalezljivih bolezni. Zelo velika natančnost interakcij antigen protitelo je vodila do

razvitja različnih, ekstremno uporabnih in visoko občutljivih imunokemijskih tehnik. 5

- 16 -


7.1.1 IMUNSKI SISTEM

V obrambo proti mikroorganizmom so večceličarji razvili specializirana, po telesu

razporejena obrambna tkiva, v katerih imunske celice prepoznavajo, uničujejo in

odstranjujejo te mikroorganizme. Med evolucijo so se razvile različne imunske celice, ki se

razlikujejo glede na mehanizem delovanja.

- fagocitne celice: najpreprostejše, fagocitoza

- limfociti: natančno prepoznajo tujke in ustrezno ukrepajo

- limfociti B

- limfociti T

- monociti

Antigen ( Ag )

Antigen je snov, ki v telesu oz. organizmu povzroči imunski odziv. Nanje se specifično

vežejo protitelesa, ki imajo specifična mesta – epitop, na katera se antigeni vežejo.

Protitelo (Ab )

Protitelo je topna glikoproteinska molekula, ki spada v skupino imunoglobulinov.

Sposobna je prepoznati tujek in se nanj vezati, ter s tem prepreči, da bi tujki škodovali

organizmu. Protitelesa razvrščamo v več razredov:

- IgG

- IgM

- IgA

- IgD

- IgE

Med seboj se razlikujejo po velikosti in po vlogi, ki jo imajo. Sestavljena so iz dveh lahkih

in dveh težkih verig. 11

- 17 -


7.1.2 IMUNOLOŠKE METODE, KI TEMELJIJO NA REAKCIJI ANTIGEN - PROTITELO

● precipitacijske tehnike

● aglutinacijski test

● radioimunološka metoda (RIA)

● encimsko imunska metoda (ELISA)

● encimsko oligonukleotidna metoda (ELOSA)

● imunoblotting

● fluorescenčna metoda

● …

7.1.3 RADIOIMUNOLOŠKA METODA ( RIA )

RIA se uporablja v biomedicinskem področju za raziskovanje in diagnostiko človeških in

živalskih bolezni. Ta tehnika omogoča hitro meritev antigena v pikogramih ter omogoča

relativno natančnost z uporabo radioaktivno označenih antigenov. RIA vključuje reakcijo

specifičnih protiteles z mešanico radioaktivno označenih in neoznačenih antigenov.

Označeni in neoznačeni antigeni med seboj tekmujejo za vezavo na protitelo. Po koncu

reakcije ločimo vezane in nevezane antigene, ter kvantitativno merimo radioaktivnost z

uporabo primernih standardov. Na ta način lahko ocenimo količino inhibicije od

radioaktivno označenega in neoznačenega antigena. Ker je test zelo občutljiv ga lahko

uporabljamo za kvantitativno določanje določenih proteinov, kot so encimi,

imunoglobulini, virusni proteini, hormoni, antibiotiki, steroidi, id… Pri tej metodi se

največ uporabljajo reagenti označeni z I125 ali I131. Oba izotopa emitirata energijo, ki jo

lahko detektiramo z scintilacijskim spektrofotometrom, ki je opremljen z detektorjem.

Direktna RIA

Če določamo antigen je protitelo označeno z radioizotopom in se inkubira in redči z

različnimi razredčitvami pripravkov, ki vsebujejo antigen. Če pa določamo protitelo pa

inkubiramo označen antigen z raztopinami, ki vsebujejo protitelo.

- 18 -


Indirektna RIA

Pri tej metodi nista radioaktivno označena niti protitelo niti antigen. Označen pa je

antiglobulin oz. sekundarno protitelo, ki ga pripravimo z vbrizgavanjem Ig. Tako je

posredno primarna reakcija merjena s sekundarno imunološko reakcijo.

Kompetetivna RIA

Med reakcijo Ag-Ab nastane kompleks, ki je premo sorazmeren s koncentracijo Ag v

vzorcu. Nato dodamo standardno količino označenega Ag v reakcijsko zmes in re –

inkubiramo. Označen Ag reagira samo z preostalimi mesti na Ab, ki niso zasedena.

Količina označenih Ag povezanih z Ab so zato obratno sorazmerna količini Ag v vzorcu.

Najbolj pogosto za ločevanje označenih in neoznačenih reagentov uporabljamo centrifugo.

7.1.4 ENCIMSKO IMUNSKA METODA ( ELISA )

ELISA je eden od najbolj občutljivih in specifičnih imunskih metod za kvantitativno

določanje Ag in Ab. Princip metode je podoben RIA metodi, vendar tu namesto

radioaktivnega izotopa za označevanje imunskega kompleksa uporabimo encim. Za

določanje protiteles se uporablja indirektna ELISA, za določanje antigenov pa se uporablja

direktna ELISA.

Direktna ELISA

Pri direktni ELISI je označen encim konjugiran z bodisi Ag ali Ab specifičnim za Ag.

Mikrotitrsko ploščo je obloženo z antigenom inkubiramo z primarnimi protitelesi za Ag,

ki ga določamo. Prisotnost kompleks Ag – Ab detektiramo s pomočjo encima, in sicer

prvo kompleks speremo, da odstranimo nevezane Ag, dodamo substrat, ki ob prisotnosti

encima spremeni barvo, katere intenzivnost merimo. Koncentracija Ag in prisotnost

encima sta obratno sorazmerni. Največkrat se uporabljata encima peroksidaza in alkalna

fosfataza.

- 19 -


Indirektna ELISA

Pri indirektni ELISI pa je encim pritrjen na Ab. Na nosilcu imamo vezan znan Ag.

Dodamo vzorec s Ab in speremo nevezana Ab. Nato dodamo še Ab, ki so označena z

encimom, ki se vežejo na že vezana Ab, in spet speremo, da odstranimo še nevezana

označena Ab. Na koncu dodamo substrat, ki ob prisotnosti encima spremeni barvo, katere

intenzivnost merimo.

1. vezano Ab na plošči

2. preiskovani Ag vezan na Ab

3. detekcijsko Ab vezano na kompleks

Ag –Ab

4. Ab označeno z encimom vezano na

detekcijsko Ab

5. sprememba barve zaradi prisotnosti

encima

Slika 6: Indirektna ˝Sendvič ˝ELISA

Kompetitivna ELISA

Kompetitivna ELISA se uporablja za določanje Ag. Prosti Ag in Ab se inkubirajo, da

nastane kompleks Ag – Ab. Ta kompleks vežemo na Ag, ki je vezan na nosilno ploščo. S

spiranjem odstranimo vse snovi, ki niso reagirale. Dodamo sekundarna Ab, ki so označena

z encimom. Na koncu pa spet dodamo substrat, da pride do barvne spremembe.

Koncentracija Ag in intenzivnost barve sta obratno sorazmerna. 5

- 20 -


7.2 KROMATOGRAFSKE METODE

Kromatografske metode opisujejo skupino laboratorijskih tehnik, kjer gre za separacijo

zmesi. V postopku kromatografije je možno spremljati, kako preiskovana zmes potuje

skozi mobilno in stacionarno fazo, pri tem pa se deli zmesi ločujejo in izolirajo, kar

omogoča, da jih lahko analiziramo in kvantitativno določamo. Kromatografija se lahko

uporablja v analitične metode za določanje prisotnosti in koncentracije analita v vzorcu,

lahko pa se uporablja tudi za ločevanje substanc iz zmesi. Te metode omogočajo ločevanje

in kvantitativno določanje substanc, ki imajo zelo podobne lastnosti. Ločevanje poteka

tako, da se substance razdelijo v dve fazi, v stacionarno in mobilno.

7.2.1 RAZDELITEV KROMATOGRAFSKIH METOD

Kromatografske metode se lahko razdelijo glede na različne kriterije: glede na fizično

stanje, obliko sistema in mehanizem ločevanja.

Kromatografske metode glede na fizično stanje:

- tekočinska kromatografija:

tekoča-tekoča LLC (porazdelitev)

tekoča-trdna LSC, PC, (adsorpcija)

tekoča-trdna IEC (ionska izmenjava)

tekoča-trda EC (izločitev)

- plinska kromatografija:

plin-tekoča GLC (porazdelitev)

plin- trdna GSC (adsorpcija)

Kromatografske metode glede na mehanizem ločevanja:

- ionsko izmenjevalna

- ločevanje glede na velikost substanc

- 21 -


7.2.2 HPLC

HPLC metoda je oblika tekočinske kolonske kromatografije, ki se uporablja za ločevanje

substance iz zmesi na osnovi kemijskih interakcij med substancami, ki jih analiziramo in

stacionarno fazo v koloni. Pri tej metodi pod visokim pritiskom substance potujejo skozi

kolono. V mobilno fazo se vnese majhna količina vzorca in na osnovi specifičnih

kemijskih in fizičnih interakcij prihaja do različnega zadrževanja substance v koloni. Čas

zadrževanja je odvisen od lastnosti substance, ki se analizairajo, od stacionarne faze in

sestave mobilne faze. Čas v katerem se eluira substance se imenuje retencijski čas, ta pa je

karakterističen za vsako substance.

7.2.3 KOMPONENTE HPLC SISTEMA:

rezervoar z mobilno fazo,

črpalka,

injektor,

kolona

detektor

rekorder

Značilna topila mobilne faze:

ADSORPCIJA/PORAZDELITEV: heksan, metilenklorid, kloroform, metanol, acetonitril

REVERZNA FAZA: metanol/voda, acetonitril/voda, reagenti z ionskimi pari

IONSKA IZMENJAVA: vodne puferske raztopine

IZLOČITVENA KROMATOGRAFIJA: tetrahidrofuran, kloroform

- 22 -


Zahteve HPLC črpalk:

1. Črpanje konstantnega volumna (tekočine) mora biti neodvisno od "povratnega pritiska"

(upora) kolone.

2. Pretok mobilne faze (tekočine) mora biti brez "pulziranja" (nihanja), kar zmanjšuje šum

detektorja

3. Na izhodu naj bi bil dosežene visok tlak(do 600 barov).

4. Dobro je, če lahko črpamo neomejeno množino topila (mobilne faze) z možnostjo

recikliranja, izokratskega in gradientnega izpiranja.

5. Zaželeno je široko območje pretokov mobilne faze (do 10 ml/min) za različne HPLC

tehnike.

HPLC kolone

Kolona je napolnjena z delci polnila (običajno velikost <10 µm), ki so prekriti s

stacionarno fazo. Z izbiro ustreznih faz in ostalih pogojev je dosežena separacija

večkomponentne mešanice v nekaj minutah.

7.2.4 VRSTE DETEKORJEV:

Detektorji imajo pomembno vlogo pri določanju analitov. Detektor zazna spremembo, ki

jo pretvori v električni signal, ki je propocionalen intenziteti neke lastnosti mobilne faze ali

substance, ki jo določamo. Detektorji morajo imeti visoko občutljivost, visoko dinamično

območje in linearnost v širokem območju.

- 23 -


Vrste detektorjev:

spektrofotometrični

fluorescenčni

elektrokemijski

refraktometrični

masni spektrometer

- 24 -


III. NAMEN DELA

Namen dela te diplomske naloge je bil primerjati encimskoimunsko metodo za določanje

vitamina D z radioimunsko metodo, ki se trenutno uporablja za določanje vitamina D v

Hormonskem laboratoriju v sklopu KC Ljubljana.

Pri primerjavi smo uporabili iste vzorce, nekatere smo tudi redčili, želeli pa smo preveriti

ali bo encimskoimunska metoda boljša in ali bomo z njo lahko nadomestili radioimunsko

metodo. Razlog za vpeljevanje nove metode je predvsem narava radioimunskih metod, saj

se pri njih uporabljajo radioaktivne snovi, ki pa so škodljive zdravju.

Za lažje ovrednotenje smo rezultate statistično obdelali in dobljene rezultate med seboj

primerjali.

- 25 -


METODE IN MATERIALI

1. VZORCI

Za analizo smo izbrali 14 vzorcev preiskovanih oseb različnega spola in starosti, v

katerih smo določali vitamin D z dvema metodama in sicer; z ELISA in z RIA metodo. Vsi

vzorci so bili pravilno prineseni v laboratorij, ker smo jih takoj vnesli v računalnik in

zabeležili potrebne preiskave. Preverili smo tudi, če so vzorci pravilno odvzeti, če je

zadostna količina vzorca in ali so hemolizirani ali lipemični, ter vse zabeležili. Vzorce smo

do analize zmrznili na – 4° C.

Vse vzorce in reagente smo pred analizo za nekaj časa pustili na sobni temperaturi, da so

se odtalili, nato pa smo jih rahlo premešali z vortexom, da so bili homogeni. Reagenti,

standardi, kontrole in ves ostali material iz kompleta pa je že bil pripravljen za uporabo,

tako, da ga ni bilo potrebno posebej pripravljati. Spiralni pufer smo razredčili z destilirano

vodo v razmerju 1:10 ( 100 ml koncentrata in 900 ml destilirane vode ).

Vzorce smo na kolono nanesli tako da smo najprej dodali toliko vzorca kolikor ga je bilo

nato pa še TRIS HCl pufer, da smo dosegli količino 500 µl. Za analizo smo prvotno izbrali

40 vzorcev, vendar ker ni bilo vseh vzorcev dovolj za obe metodi, smo jih za primerjavo

metod izbrali le 14. Standarde in vzorce smo analizirali v dvojnikih.

Pri RIA metodi smo standarde od 1 do 5, ki so bili liofilizirani rekonstituirali tako, da

smo dodali vsakemu standardu 3 ml osnovne standardne raztopine. Ostali reagenti so že

bili pripravljeni za uporabo. Pred pričetkom analize smo tudi pripravili organska topila za

ekstrakcijo.

Razmerje topila Vrsta topila Volumen ( 1 l )

70 : 30 metanol

deionizirana voda

700 ml

300 ml

90 : 10 heksan

metilen klorid

900 ml

100 ml

99 : 1 heksan

izopropanol

990 ml

10 ml

92 : 2 heksan

izopropanol

920 ml

80 ml

- 26 -


2. METODI ZA DOLOČANJE VITAMINA D

Vitamin D smo določali z ELISA metodo in RIA metodo, kateri smo tudi primerjali med

seboj.

2.1 ELISA METODA

NAMEN UPORABE

To imunodiagnostično metodo uporabljamo za kvantitativno in vitro določanje 1,25(OH)2

D v plazmi ali serumu.

PRINCIP TESTA

Pri tej metodi se mora biološko aktiven metabolit vitamina D 1,25 – (OH)2 D ločiti z

dvema ločenima kolonama ( ekstrakcija ). Ekstrakcijo oziroma ločitev se mora narediti

predvsem zato, da se loči 1,25 – (OH)2 D od ostalih metabolitov vitamina D, predvsem od

25 – dihidroksivitamina D in 24,25 – dihidroksivitamina D. Ta metoda je kompetitivna

encimsko imunokemijska metoda, zato temelji na tekmovanju med 1,25 – (OH)2 D v

vzorcu z 1,25 – (OH)2 D označenim z encimom peroksidaza za prosto vezavno mesto na

specifičnem protitelesu za vitamin D.

Po ekstrakciji je treba narediti predinkubacijo in vzorce inkubirati. Po tej stopnji se vzorci

nanesejo na mikrotitrsko ploščo, kjer 1,25 – (OH)2 D prisoten v vzorcu tekmuje z

označenim 1,25 – (OH)2 D za prosto vezavno mesto na specifičnem protitelesu. Z

naraščanjem koncentracije 1,25 – (OH)2 D v vzorcu upada količina označenega 1,25 –

(OH)2 D. Po spiranju se odstranijo nevezane komponente, dodati pa je treba encimski

substrat. Reakcija se ustavili tako, da se doda reagent za to pripravljen reagent (žveplova

kislina). Meri se ekstinkcija vzorcev pri valovni dolžini 450 nm. Intenziteta barve je

obratno sorazmerna z koncentracijo 1,25 – (OH)2 D v vzorcu. Krivulja absorbanc v

odvisnosti od koncentracij se dobi z rezultati kalibratorjev. Koncentracija 1,25 – (OH)2 D

se določili direktno iz krivulje.

- 27 -


ANALITČNA OBČUTLJIVOST

Občutljivost te metode je 10,4 pmol/L

NATANČNOST

Natančnost metode so pri firmi Immundiagnostik 1,25 (OH)2 D izračunali tako, da so en

vzorec določili v 21 replikah in dobili CV = 6,6 %

ANALITIČNA SPECIFIČNOST

Analitična specifičnost nam kaže sposobnost metode, da v kemijski zmesi podobnih

analitov izmeri samo tisti analit, ki ga določamo.

SUBSTANACA Navzkrižna reakcija v %

1,25 – ( OH )2 Vit D3 100 %

Vit D2 in D3 < 0,01 %

24,25 – ( OH )2 Vit D3 < 0,1 %

25 – OH Vit D2 < 0,1 %

25 – OH VIT D3 < 0,01 %

Alfakalcidol < 0,003 %

OPOZORILA IN ROKOVANJE

Standardni in kontrolni vzorci vsebujejo humane materiale, ki so bili testirani in

negativni na HBsAG, anti – HIV in anti – HCV. Vendar, ker nobena metode ne nudi 100

% sigurnost, da vzorci ne vsebujejo infektivne snovi smo s temi vzorci ravnati kot z

potencialnimi infekcijskimi vzorci. Reagent stop vsebuje žveplovo kislino, ki je močna

kislina, zato smo z njim ravnali previdno. Reagente moramo porabiti do navedenega roka

uporabnosti.

- 28 -


Analizator Personal Lab ADALTIS

Personal Lab je funkcionalen in intenziven analizator z dvema ploščama, kjer je možna

polna avtomatizacija laboratorijskih testov v imunoencimskih tehnikah. Dokazana in

utrjena izvedenska mnenja tega analizatorja omogočajo prilagodljive instrumente za

uporabo širokega območja od diagnostičnih potreb iz avtoimunosti do rodnosti oz.

nosečnosti, od bolezni ščitnic do nalezljivih bolezni ( HIV ), retrovirusov in tudi hepatitisa

tipov A, B, C, D in E.

Analizator se pa tudi prilagaja proizvajalčevim metodam in nudi učinkovito alternativo

tradicionalnim ročnim metodam, kot to omogočajo dosedanji EIA analizatorji z zaprtim

sistemom.

Analizator Personal Lab omogoča dva osnovna modula:

- instrument, ki vsebuje vse sestavne dele za obdelavo vzorcev in reagentov

- vodstven sistem, ki vsebuje instrumente za kontroliranje s programsko opremo in

podatkovno upravljanje dela

Analizator je zgrajen tako, da ima pokrov, ki ga je možno odpreti in tako omogoča

preprost dostop in enostavno upravljanje in obratovanje z kompatibilno strojno opremo

Microsoft Windows 98.

Slika 7: Analizator Personal Lab

- 29 -


VAKUUMSKA POSODA VAC ELUT SPS 24 VARIAN INC

Varian Vac Elut SPS 24 je vakuumska posoda, ki se uporablja za fazno ekstrakcijo in

vzorčno filtriranje. Istočasno sprejme 24 kolon. Steklene stene omogočajo, da spremljamo

vzorec tekom cele analize. Iz vseh kolon se zbirajo odpadne snovi, ki se izločijo skozi lijak

v kontejnerje odpadnih snovi, kar preprečuje navzkrižno kontaminacijo vzorca in pa tudi

zmanjša izpostavljenost nevarnim odpadkom. Tako se odpadne snovi odstranjujejo ne da bi

bilo potrebno odstranili pokrov. Zbiralna stojala se lahko postavijo v notranjost pred

pričetkom ekstrakcije.

Slika 8: Vac Elut SPS 24

- 30 -


Tabela 2: Material prisoten v kompletu

SESTAVINE KOLIČINA

testna ploščica z vrsticami 96

ELISA spiralna tekočina 10x koncentrirana 1 x 100 ml

TRIS – HCL pufer 1 x 30 ml

etanol ( pripravljen za uporabo ) 1 x 1,5 ml

raztopina protiteles ( mišja – anti 1,25 – (OH)2

Vitamin D ) pripravljena za uporabo

1 x 2,5 ml

standardi in NSB, pripravljeni za uporabo

(0; 11; 27; 69.1; 172,8; 432 pmol/L)

7 x 2,5 ml

kontrola, pripravljena za uporabo 2 x 2,5 ml

konjugat, pripravljen za uporabo 1 x 22 ml

TMB substrat, pripravljen za uporabo 2 x 15 ml

ELISA stop substrat, pripravljen za uporabo 1 x 7 ml

Vsi reagenti morajo biti primerno shranjeni in sicer na temperaturi 2 – 8° C. Tudi po

odprtju so reagenti stabilni na temperaturi 2 – 8 °C do roka uporabe, ki je natisnjen na

škatli kompleta.

Uporabili smo še naslednji material:

- kromabond kolone

- silikatne kolone

- destilirana oz. deionizirana voda

- diizopropileter p.a.

- izopropanol p.a.

- heksan p.a.

- metanol p.a.

- deionizirana voda

- 12 mm steklene epruvete

- 31 -


- nastavljive pipete ( 20 – 1000 µl )

- avtomatsko pipeto

- Vortex

- Vac Elut SPS 24

- analizator Adaltis Personal Lab

POSTOPEK:

Ekstrakcija

Na vakuumsko posodo VAC ELUT SPS 24 smo nastavili kromabond kolone, pod njimi

pa prazne označene epruvete kamor so se na koncu zbirali eluati.

- na kromabond kolone smo pipetirali 500 µL NSB, standarde in vzorce, kjer je bilo

vzorca manj kot 500 µL smo dodali Tris-HCL pufer ( najprej smo nanesli pufer in

nato še vzorec), pustili smo da se vse adsorbira ( približno 10 minut)

- nastavili smo silikatne kolone in nanj kromabond kolone, tako da se je eluat iz

naslednje stopnje lahko zbiral direktno na silikatne kolone

- nato smo kolone spirali z diisopropiletrom in sicer 4 x po 1ml ( 3 minute za vsako

spiranje ), s tem smo ekstrahirali vitamin D iz kolon, eluat pa se je zbiral direktno v

silikatne kolone

- zatem smo kolone spirali z pripravljeno raztopino izopropanol/heksan v razmerju

4/96 in sicer 5 x po 2 ml

- nato smo spirali še z pripravljeno raztopino izopropanol/heksan v razmerju 6/94 3 x

po 2 ml

- nazadnje smo še 1,25 – dihidroksivitamin D eluirali iz kolon z 2 x po 2 ml

raztopine izopropanol/heksan v razmerju 25/75

- Po spiranju smo eluate uparili pod tokom dušika

- 32 -


Pred inkubacija

Po izhlapevanju smo vsem vzorcem dodali 20 µL etanola ter rahlo premešali, in 450 µl

reagenta, ki vsebuje protitelesa ter prav tako rahlo premešali. Vse skupaj smo prekrili z

parafilmom ter pustili, da se je inkubiralo 1 uro.

ELISA ( avtomatizirani del analize )

- po inkubaciji smo pipetirali 200 µL preinkubiranih vzorcev na mikrotitrsko ploščo (

delali smo v dvojniku)

- mikrotitrsko ploščo smo prekrili z parafilmom in inkubirali 18 ur na temperaturi 4ºC

- po inkubaciji smo ploščo vstavili v analizator Personal Lab Adaltis, ki smo ga prej

vključili, naredili samokontrolo, spirali in napolnili celico ter namestili spiralni pufer,

konjugat, substrat ter stop reagent

- ploščo se je nato spirala z spiralnim pufrom 5 x po 300 µL

- dodali smo 200 µL konjugata v vsak vzorec ter inkubirali eno uro

- nato se je spiralo s spiralnim pufrom 5 x 300 µL

- dodali smo 200 µL substrat ter inkubirali na sobni temperaturi v temnem 20 minut

- na koncu smo dodali še 50 µL stop reagenta in rahlo premešamo ter zmerimo

absorbanco pri 450 nm

Rezultate smo odčitali direktno iz krivulje.

IZRAČUN REZULTATOV

Rezultate odčitamo direktno iz standardne krivulje.

- 33 -


ORIENTACIJSKE REFERENČNE VREDNOSTI

Orientacijske referenčne vrednosti 1,25 (OH)2 D v serumu so naslednje:

odrasli (20 – 50 let) 36,7 – 114,5 pmol/L

otroci do 12 let približno 40 % večje

nosečnice (8. – 42. teden) približno 60 % večje

starejši od 70 let približno 40 % večje

Orientacijske referenčne vrednosti pa so tudi odvisne od letnega časa, in sicer pozimi so

nekoliko manjše, poleti, ko smo pa več izpostavljeni sončnim žarkom pa so te vrednosti

nekoliko višje.

OMEJITVE POSTOPKA

Vzorce v katerih je koncentracija 1,25 (OH)2 D višja kot najvišji standard, je potrebno

ponovno analizirati.

KONTROLA KAKOVOSTI

Za kontrolo kakovosti smo uporabili kontrolna vzorca, ki bi morala padati v interval

podanih vrednosti za kontrolna vzorca. V primerih, če eden ali več kontrolnih vzorcev ne

pada v podani interval, rezultati vzorcev mogoče niso veljavni.

- 34 -


2.2 RIA METODA

NAMEN UPORABE

Ta kompetitivna radioimunska metoda se uporablja za kvantitativno in vitro določanje

1,25-(OH)2 D v serumu ali plazmi.

PRINCIP TESTA

DiaSorin 1,25-(OH)2 vitamin D test je sestavljen iz dvostopenjskega postopka. Test

vključuje predhodno ekstrakcijo in pozneje še prečiščevanje metabolitov vitamina D iz

seruma ali EDTA krvne plazme z uporabo C18OH kolon. Po ekstrakciji se za določanje

uporablja RIA kompetitivno metodo. Pri RIA postopku se uporabljajo poliklonska

protitelesa, ki so specifična za oba 1,25-dihidroksivitamin D2 in 1,25-dihidroksivitamin

D3. Vzorci, protitelesa in tracer se morajo inkubirati. Faza ločitve je dosežena po 20-

minutah inkubacije z dodatkom precipitacijskega kompleksa sekundarnih protiteles. Po

centrifugiranju in odlitju supernatanta ostanejo vezne frakcije v kroglicah, ter se

preračunajo v gama števcu. Vrednosti so izračunane direktno iz standardno krivulje.

Končne koncentracije 1,25-dihidroksivitamina D v serumu in EDTA krvni plazmi so

podani v pg/mL, zato smo jih preračunali v pmol/L.

ANALITIČNA OBČUTLJIVOST

Analitična občutljivost te metode je ≤ 4,32 pmol/L.

NATANČNOST

Pri firmi DiaSorin so izvedli teste in določili, da je med meritvami CV = 7,7 %, med

dnevi CV = 11,1 % in totalni CV = 12,3%.

- 35 -


ANALITIČNA SPECIFIČNOST

SUBSTANCA NAVZKRIŽNA REAKCIJA

1,25 Vit D3 100 %

1,25 –Vit D2 109%

24,25- ( OH )2 Vit D3 < 0,08 %

25,26 – ( OH )2 Vit D3 < 0,08 %

25 Vit D3 < 0,01 %

1470 WALAC WIZARD GAMA ŠTEVEC GMI INC

Gama števci imajo to prednost, da se snovi ne dotikajo. Štetje epruvet poteka tako, da se

gama žarki sipljejo na material, prestreza pa jih detektor. Povečan signal na detektorju

pomeni navzočnost snovi, ki je radioaktivno označena.

Gama števec 1470 Wallac Wizard prenese signal iz vzorcev na konvektor, tudi

potencionalno mesto onesnaženja je odstranjeno. Visoka resolucija MCA tehnologije je

narejena za geometrijsko štetje. Ta gama števec ima 1, 2, 5 ali deset cevi za nosilnost in

lahko sprejme vse RIA stekleničke.

Slika 9: Walac Wizard gama števec

- 36 -


Tabela 3: Material prisoten v kompletu

SESTAVINE KOLIČINA

1,25 – (OH)2 D NSB pufer,

pripravljen za uporabo

3ml

1,25 – (OH)2 D standard 0,


20 ml

1,25 – (OH)2 D3 standard 1-5,

liofilizarni reagent

5× 3 ml

1,25 – (OH)2 D antiserum,


35 ml

125 I 1,25 – (OH)2 D3,


10 ml

1,25 – (OH) D3 pretreatment raztopina,


50 ml

1,25 – (OH)2 D GAR precipitacijski kompleks 2 × 35 ml

1,25 – (OH)2 D kontrolni serum,


2 × 3 ml

95 % etanol 7 ml

Reagenti v kompletu so lahko shranjeni na temperaturi – 15 ° C do 6 mesecev.

Uporabili smo še:

- C18OH kolone

- borosilikatne steklene epruvete

- stojalo za epruvete

- parafilm

- centrifugo

- gama števec

- vortex mešalec

- 37 -


- pipete

- deionizirano vodo

- Vac Elut SPS 24

- tekoči dušik

- vodno kopel

- organska topila: - acetonitril

- metanol

- heksan

- diklorometan

- izopropanol

POTEK ANALIZE

PREDHODNA EKSTRAKCIJA

1. rekonstituirali smo liofilizirane standarde z dodatkom 3.0 mL standarda 0, rahlo

premešali in pustili stati 20 minut, da je bila rekonstrukcija popolna. Zamrznjene

reagente smo dali na sobno temperaturo. Pred uporabo smo reagente rahlo

premešali.

2. pipetirali smo po 500 L standardov, kontrol in vzorcev v borosilikatne steklene

epruvete

3. dodali smo 500 L acetonitrila v vsako epruveto, premešali na vortexu 3 krat v

času 10 minut

4. centrifugirali smo 10 minut pri 25 C pri 760 g

5. supernatant smo prelili v testne epruvete, kroglice oz.usedlino pa zavrgli

6. dodali smo 500 L pretreatment raztopine v vsako epruveto in rahlo premešali

7. vzorci so bili pripravljeni na nanos na C18OH kolono

- 38 -


REGENERACIJA C18OH KOLONE

Kolone smo sprali z 5 mL raztopine 90 : 10 heksan / diklorometan, 5 mL izopropanolom in

5 mL metanola pred prvo uporabo. Vsaka raztopina je popolnoma pretekla skozi kolono

preden smo dodali drugo raztopino.

EKSTRAKCIJA

Opis in analiza ekstrakcije Korak ekstrakcije Pozicija na

VacElut-u

Regeneracija kolone

Odstranimo vse moteče snovi

iz prejšnjega koraka

1. dodali smo 1 mL metanola in

vklopili vakuum

2. izklopili smo vakuum

WASTE

Nanesemo vzorce

pripravljene iz predhodne

ekstrakcije

3. nanesli smo vzorce

in vklopili vakuum

WASTE

Odstranjevanje metabolitov

vitamina D

Odstranimo polarne lipide, soli

in pigmente

Odstranimo 25(OH)D

Odstranimo 25(OH)D;

24,25(OH)2D;

25,26(OH)2D

4. dodali smo 5 mL 70:30

metanol/destilirana voda


heksan/metilklorid


heksan/izopropanol


WASTE

- 39 -


Zbiranje 1,25-(OH)2D

Spiranje čistega 1,25- (OH)2D


heksan/izopropanol in vklopili

vakuum


COLLECT

SUŠENJE IN REKONSTRUKCIJA ELUATOV

1. epruvete z vzorcu smo postavili v kopel ( 37C), da se posušijo

2. vzorce smo uparili pod tokom dušika (20 minut)

3. vzorce smo odstranili takoj ko so bili suhi

4. vzorce smo rekonstituirali z 50 L 95 % etanolom, narahlo premešali in dodali 125

L tracerja v vsako epruveto ter rahlo premešali. ( dodali smo eno epruveto za

celotno štetje in eno za NSB, ter v vsako dodali 50 L 95 % etanola in 125 L

tracerja )

5. analizo smo naredili takoj, ko so bili vzorci rekonstituirani

POSTOPEK ANALIZE

1. pripravili smo borosilikatne epruvete v dvojniku in napipetirali 75 L

rekonstituiranih vzorcev (standardi, kontrole in vzorci)

2. v epruvete za TC in NSB smo dodali 75 L TC in NSB, ki smo jih pripravili (korak

4)

3. dodali smo 300 L NSB pufra v NSB epruveto

4. dodali smo 300 L primarnih protiteles v vse epruvete razen v TC in NSB

5. dobro smo premešali in inkubirali 2 uri na 25 C ( rekonstituirali smo GAR

precipitacijski kompleks z 35 mL destilirane/deionizirane vode in mešali dokler

- 40 -


raztopina ni bila homogena , nato smo jo pustili stati 30 minut pred uporabo-vmes

smo premešali)

6. dodali smo 500 L GAR precipitacijskega kompleksa v vsako epruveto razen v TC

in inkubirali 20 minut pri 25 C

7. centrifugirali smo vse epruvete razen TC 20 minut pri 25 C in 1800 g

8. odlili smo vse supenatante razen TC (primerno odstranimo-posesamo); vsa

tekočina je morala biti odstranjena

9. merili smo radioaktivnost z štetjem vseh epruvet z gama števcem (epruvete so se

štele najmanj 1minuto)

IZRAČUN REZULTATOV

Rezultate smo odčitali direktno iz standardne krivulje. Standardna krivulja predstavlja

razmerje cpm vrednostmi standardov ( B ) in cpm vrednostmi ničelnega standarda ( B0 ).

Z dobljenimi vrednostmi smo izračunali B / B0 koeficient za vsak standard in vzorec.

ORIENTACIJSKE REFERENČNE VREDNOSTI

Orientacijske refernčne vrednosti : 54,2 – 142,8 pmol/L (pri populaciji 21 – 68 let

starosti)

OMEJITVE POSTOPKA

Čas, ki ga porabimo za štetje z gama števcem mora biti pravšnje, da preprečimo

prisotnost napak (akumulacija od 2000 cpm lahko prinese 5 % napako, 10000 cpm pa 1 %

napako ). Karakteristike testa niso utemeljene za otroško populacijo.

- 41 -


KONTROLA KAKOVOSTI

Za kontrolo kakovosti smo uporabili kontrolna vzorca, ki imata določen interval

normalnih vrednosti, v katerega morata ta kontrolna vzorca spadati.

- 42 -


IV. PREGLED REZULTATOV

1. STATISTIČNO VREDNOTENJE METOD

A.) Aritmetična sredina

Aritmetična sredina pri RIA metodi = 92,92 pmol/L

Aritmetična sredina pri ELISA metodi = 78,21 pmol/L

B.) Standardna deviacija

Standardna deviacija pri: RIA metodi = 59,83

ELISA metodi = 45,17

C.) Koeficient variacije

CV pri RIA metodi = 0,6439 ( 64,4 % )

CV pri ELISA metodi = 0,5775 ( 57,7 % )

D.) Passing in Bablok regresija

Z regresijo določimo enačbo medsebojnega odnosa.

Enačba premice:

Y a b x ; kjer a določa odsek na ordinatni osi, b pa naklon premice ali regresijski

koeficient.

Y = 19,7178 + 0,8659 x

- 43 -


Passing in Bablok regresijska premica s 95 % mejami odstopanja in napovedi

Slika 10: Passing in Bablok regresijska premica

E.) Primerjava metod po Bland Altmanu

Slika 11: Bland Altman

- 44 -


F.) t test

t - test je najbolj enostavna statistična metoda za analizo razlik oz. sprememb v primeru da

primerjamo dva vzorca. Pri tem testu testiramo razlike med aritmetičnima sredinama dveh

vzorcev. Ločimo t test neodvisnih vzorcev in t test odvisnih vzorcev.

Razlika aritmetičnih sredin Standardna deviacija Standardna napaka P

14,71 53,01 20,03 0,4695

Iz t testa vidimo, da je nivo statističnega rizika 46,95 %.

2. IZRAČUN REZULTATOV

ELISA METODA

Standardni vzorci :

standard A ( 0 pmol/ l ): 1,178 pmol / l

standard B ( 11 pmol / l ): 11,077 pmol / l

standard C ( 27 pmol / l): 27,125 pmol / l

standard D (69,1 pmol /l ): 70,418 pmol l

standard E ( 172,8 pmol /l ): 172,81 pmol / l

standard F ( 432 pmol / l ): 432 pmol / l

Kontrolni vzorci:

kontrolni vzorec 1 ( 4,32 – 56,16 pmol / l ) : 43,76 pmol / l

kontrolni vzorec 2 (56,16 – 146,88 pmol / l ) : 54,088 pmol / l

- 45 -


Umeritvena krivulja za ELISA metodo

Standardna krivulja

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 100 200 300 400 500

Koncentracija v pmol / l

Ab

sorb

anca

Slika 12: Standardna krivulja za ELISA metodo

RIA METODA

Standardni vzorci:

standard 0 ( 0 pmol / l ) : 0 pmol / l

standard 1 ( 10,8 pmol / l ) : 13,66 pmol / l



standard 4 ( 162 pmol / l ) : 161,1 pmol / l

standard 5 ( 432 pmol / l ) : 442,1 pmol / l

Kontrolni vzorci

Kontrolni vzorec 1 ( 46,22 – 107,57 pmol / l ) : 82,29 pmol / l

Kontrolni vzorec 2 ( 122,9 – 287,06 pmol / l ) : 285,09 pmol / l

- 46 -


Umeritvena krivulja za RIA metodo

CPM standarda / vzorca – CPM NSB x 100 = B / Bo ( % )

CPM 0 standard – CPM NSB

Standardna krivulja

0102030405060708090

100

0 100 200 300 400 500

Koncentracija v pmol / l

% B

/ B

0

Slika 13: Standardna krivulja za RIA metodo

- 47 -


3. PRIMERJAVA KONCENTRACIJ MED METODAMA

Vzorec ELISA

pmol/L

RIA

pmol/ L

1 100,9 109,2

2 42,4 55,3

3 48,7 109,8

4 159 51,1

5 133,9 134,5

6 51,5 57,9

7 70,6 42,9

8 20,5 38,6

9 87,6 82,4

10 78,7 133,4

11 23,9 80,6

12 136,7 91,8

13 28,2 46,3

14 112,4 267,1

- 48 -


V. RAZPRAVA

Vitamin D uvrščamo med vitamine, čeprav gre za hormon in sicer spada v skupino

steroidnih hormonov. Ta vitamin je edini, ki ga človeško telo proizvede samo s pomočjo

UV svetlobe. Vitamin D tako nastaja v koži, lahko pa ga v telo vnesemo z prehrano. Sam

po sebi ni dejaven, biološko dejavnost dobi šele v presnovi. Vitamin D se obravnava kot

prohormon z aktivnimi metaboliti, ki delujejo kot hormoni. Tako imamo več oblik

vitamina D in sicer ergokalciferol, holekalciferol, kalcifediol, kalcitriol. Najaktivnejša

biološka oblika je kalcitriol, ki s pomočjo PTH-ja in kalcitonina vzdržuje koncentracijo

kalcijevih in fosfatnih ionov v krvi in tudi v kosteh.

Če pride do pomanjkanja vit D se lahko pojavijo bolezni kot so rahitis, ki se pojavlja pri

otrocih, osteoporoza, ki se pojavlja pri odraslih, pojavijo pa se tudi druge bolezni npr.

kongenitalna hipofosfatemija, ki izzove rahitis ali osteomalacijo, osteomalacija, ki je

rahitis odraslih ter hipo- in hiperparatiroidizem.

Lahko pa se tudi pojavijo težave pri prekomernem vnosu vitamina D v organizem. Pojavi

se lahko toksičnost vit D, kalcifediola in kalcitriola, ter tudi granulomatozne bolezni in

sarkoidoza.

Ker se pa kalcitriol sintetizira v ledvicah, se lahko ob neprimernih količinah vit D v

organizmu pojavijo tudi težave povezane z ledvicami in sicer lahko pride do toksičnega

vpliva na ledvice, do poškodb ledvic, do tvorbe ledvičnih kamnov,…

V tej diplomski nalogi smo primerjali ELISA metodo za določanje 1,25-(OH)2 vit D z

RIA metodo. Naš namen je bil ugotoviti ali bi lahko ELISA nadomestila do sedaj

uporabljano RIA metodo, saj se pri RIA metodi uporablja radioaktivno izotop I125, ki je

zdravju škodljiv.

V analizo smo vzeli 14 vzorcev preiskovancev, katerim smo izmerili koncentracijo 1,25-

(OH)2 vit D v plazmi z obema metodama.

- 49 -


Vzorci so bili pravilno odvzeti in pripravljeni. Vzorci so bila odvzeti z EDTA ali

heparinom in so v laboratorij bili prineseni na ledu, do analize pa so bili zmrznjeni.

Prvo smo preizkušali RIA metodo, ki je ročna metodo in pri kateri se uporablja izotop

I125, ki je radioaktiven. Ta metoda je kompetitivna in se uporablja za kvantitativno

določanje 1,25(OH)2 Vit D v serumu ali plazmi.

Princip te metode je v kompetitivnem odnosu med 1,25-(OH)2 vit D v vzorcu

preiskovanca in 1,25-(OH)2 vit D označenimi z I125 za prosta vezavna mesta na Ab.

Protitelesa so pri tej metodi pritrjena na steni epruvete. Po inkubaciji in precipitaciji smo

presežek odsesali in s tem prekinili kompetitivni odnos. Z gama števcem smo izmerili

radioaktivnost

Nato smo še izvedli ELISA metodo. Tudi ta metoda je kompetitivna in se uporablja za

kvantitativno določanje 1,25-(OH)2 vit D v plazmi ali serumu. Za izvedbo meritev smo

uporabili analizator ADALTIS Personal Lab, s katerim smo ELISA metodo izvedli

avtomatizirano in ne ročno. Pri tej metodi smo najprej z ekstrakcijo odstranili 1,25-(OH)2

vit D od ostalih metabolitov vit D. Tudi pri tej metodi gre za tekmovanje med 1,25-(OH)2

vit D v vzorcu in z encimom označenim 1,25-(OH)2 vit D za prosta vezavna mesta na

specifičnem Ab. ELISA metodo smo izvedli na mikrotitrski ploščici. Proste nevezane

komponente smo odstranili s spiranjem, za odkrivanje 1,25-(OH)2 vit D pa smo uporabili

encimski substrat. Po zaustavljeni reakciji smo merili absorbanco pri valovni dolžini

450nm , kjer je bila absorbanca obratno sorazmerna z koncentracijo 1,25-(OH)2 vit D v

vzorcu.

Metodi se razlikujeta po tem, da so pri RIA metodi Ab vezana na epruveto in moramo

prebitek nevezanih Ab izsesati, pri ELISA metodi pa je prebitek Ab v isti reakcijski

posodi. Pri ELISA metodi so zato vrednosti nekoliko višje, saj ima manjšo analitično

specifičnost in je manj občutljiva.

Enako smo pri ELISA metodi odčitali rezultate direktno iz standardne krivulje, ki smo jo

dobili s pomočjo standardnih vzorcev.

- 50 -


Izmerjene vrednosti koncentracije 1,25-(OH)2 vit D v vzorcih z RIA metodo se bistveno

razlikujejo od izmerjenih vrednosti istih vzorcev izmerjenih z ELISA metodo. Glede na

dobljene ovrednotene rezultate lahko sklepamo, da je ena metoda boljša kot druga.

Za ugotovitev katera metoda je boljša oziroma za ugotovitev ali bi lahko

encimskoimuunska metoda zamenjala RIA metodo smo obe med seboj primerjali.

Analitična specifičnost nam kaže sposobnost metode, da v kemijski zmesi podobnih snovi

izmeri samo koncentracijo preiskovane snovi. Ugotovili smo tudi da je RIA metoda bolj

specifična.

RIA metoda je tudi bolj občutljiva saj je meja občutljivosti ≤ 2 pg/ml, občutljivost ELISA

metode pa je 4,8pg/ml.

Pri ugotavljanju katera metoda je boljša smo upoštevali tudi ponovljivost metode, kar

smo izvedli z večkratnim merjenjem kontrolnih vzorcev. Pri ELISA metodi smo še

dodatno pripravili nekaj vzorcev, ki smo jih večkrat izmerili. In sicer en vzorec smo

analizirali v dvojniku in smo ga 4x razredčili, nato pa smo še isti vzorec analizirali v

trojniku in smo ga 8x razredčili. Za vzorec pa smo uporabili standard 5, ki smo ga

uporabili pri RIA metodi, njegova koncentracija pa je 432 pmol/l.

Rezultate ponovljivosti so bili:

4x redčen

vzorec

4x redčen

vzorec

8x redčen

vzorec

8x redčen

vzorec

8x redčen

vzorec

5219,2 pmol/L 3532,8 pmol/L 6049,6 pmol/L 12668 pmol/l 20766,4 pmol/L

Glede na dobljene rezultate smo ugotovili, da je ELISA metoda zelo slabo ponovljiva, saj

je razlika med rezultati istega vzorca večkrat merjenega zelo velika.

Če povzamemo vse parametre, ki smo jih primerjali za ugotovitev katera metoda je

boljša, pridemo do ugotovitve, daje do sedaj uporabljena RIA metoda veliko boljša kot

ELISA metoda, vendar je tudi ELISA metoda primerljiva in bi se lahko uporabljala.

- 51 -


VI. SKLEP

Za določanje koncentracije vitamina D v serumu smo uporabili dve metodi. S tem smo

želeli ugotoviti ali lahko dobljene vrednosti obeh metod med seboj primerjamo.

Vitamin D smo določili z radioimunsko metodo nato pa še z encimskoimunsko metodo.

Naš namen je bil ugotoviti ali lahko encimskoimunska metoda nadomesti radioimunsko

metodo, saj se pri slednji uporablja radioaktivni izotop, ki je zdravju škodljiv.

Na podlagi dobljenih rezultatov, ki smo jih dobili z uporabo obeh metod, lahko

zaključimo, da bi encimskoimunska metoda lahko zamenjala oz. nadomestila do sedaj

uporabljeno zanesljivo radioimunsko metodo.

RIA metoda pa sicer daje boljše rezultate, ki so tudi bolj zanesljivi zaradi večje

občutljivosti in specifičnosti metode in čeprav se pri tej metodi uporablja radioaktivni

izotop, ki je zdravju škodljiv, je bolje, da bi jo zaradi zanesljivejših rezultatov uporabljali

še naprej.

- 52 -


VII. VIRI IN LITERATURA

1. A. Guyton, J. Hall : Textbook of Medical Physiology; 10 edition, Saunders 2000

poglavje 79

2. http://sl.wikipedia.org/wiki/Vitamin_D

3. http ://sl.wikipedia.org/wiki/ELISA

4. Feldman D.: Vitamin D; Academic press, California, 1997

5. S. K. Sawhney, RAndhir Singh : Introductory Practical Biochemistry; Alpha

Science International Ltd. Harrow U.K. 2005 str. 306 -350

6. A. Guyton, J. Hall : Textbook of Medical Physiology; 10 edition, Saunders 2000

poglavje 79

7. J. Lange: pathophysiology of Disease; 3rd Edition, poglavje 17

8. http ://www.vitamins-supplements.org/vitamin-D.

9. http://info.cancerresearchchuk.org/healthyliving/sunsmart/howdoweknow/vitamind

10. B. Štraus: medicinska biokemija; Jumena Zagreb 1988

11. M. Vozelj: Temelji imunologije; DZ Slovenije, Ljubljana 2000

12. http://sl.wikipedia.org/wiki/Kromatografija

13. http://en.wikipedia.org/wiki/HPLC

14. G. Beckett, S. Walker, P. Rae, P. Ashby: Clinical Biochemistry; 7th edition,

Blackwell Publising, USA 2005

15. N. V. Bhavagan: Medical Biochemistry; 4th edition, Harcourt/Academic Press, San

Diego 2002

16. http://www.adaltis.com/content/product/instruments/personalLAB/default.aspx

17. http://www.alpha-omega-diagnostics.com/instruments/processors/elisa/index.php

18. http://www.gmi-

inc.com/BioTechLab/Wallac%20Wizard%201470%20gamma%20counter.htm

19. http://www.uphs.upenn.edu/ifem/ins/wallac_wizard_1470_gamma_counter.htm

20. http://www.chromtech.com/2001catalog/SeparatePgs/139.pdf

21. http://www.labx.com/v2/spiderdealer2/vistasearchdetails.cfm?LVid=4887673&rv=

1

22. http://en.wikipedia.org/wiki/Radioimmunoassay

23. http://www.antibodystation.com/elisa-radioimmunoassay/

- 53 -

http://info.cancerresearchchuk.org/healthyliving/sunsmart/howdoweknow/vitamind

http://sl.wikipedia.org/wiki/Kromatografija

http://en.wikipedia.org/wiki/HPLC

http://www.adaltis.com/content/product/instruments/personalLAB/default.aspx

http://www.alpha-omega-diagnostics.com/instruments/processors/elisa/index.php

http://www.gmi-inc.com/BioTechLab/Wallac%20Wizard%201470%20gamma%20counter.htm

http://www.gmi-inc.com/BioTechLab/Wallac%20Wizard%201470%20gamma%20counter.htm

http://www.uphs.upenn.edu/ifem/ins/wallac_wizard_1470_gamma_counter.htm

http://www.chromtech.com/2001catalog/SeparatePgs/139.pdf

http://www.labx.com/v2/spiderdealer2/vistasearchdetails.cfm?LVid=4887673&rv=1

http://www.labx.com/v2/spiderdealer2/vistasearchdetails.cfm?LVid=4887673&rv=1

http://en.wikipedia.org/wiki/Radioimmunoassay

http://www.antibodystation.com/elisa-radioimmunoassay/


- 54 -

24. http://www.immundiagnostik.com/index.html

25. http://www.diasorin.com/en/

26. http://www.ezdravje.com/si/vitmin/vitamini/koliko/vitaminD/

27. http://www.waichung.demon.co.uk/webanim/125DWeb.htm

Literatura slik:

1. http://sl.wikipedia.org/wiki/Slika:Ergocalciferol.gif,

http://www.icgeb.trieste.it/~p450srv/ligand/D3.gif

2. http://www.plivazdravlje.hr/img/news/rahitis.jpg

3. http://www.ezdravje.si/si/zenska/osteo/

4. http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/4/4b/ELISA-

sandwich.svg/300px-ELISA-sandwich.svg.png

5. http://www.adaltis.com/content/product/instruments/personalLAB/default.aspx

6. http://www.chromtech.com/2001catalog/SeparatePgs/139.pdf

7. http://www.gmi-inc.com/BioTechLab/Wallac%20Wizard%201470%20gamma

%20counter.htm

http://www.immundiagnostik.com/index.html

http://www.diasorin.com/en/

http://www.ezdravje.com/si/vitmin/vitamini/koliko/vitaminD/

http://www.waichung.demon.co.uk/webanim/125DWeb.htm

Date post:	08-Oct-2019
Category:	Documents
Upload:	others
View:	1 times
Download:	0 times

UNIVERZA V LJUBLJANI - ffa.uni-lj.si · 5.3.2 Sarkoidoza ... krvi vezan na DBP, nato se odcepi ter...

Documents