URINARY EXOSOMES: IS THERE A FUTURE?

Gdayllon Cavalcante Meneses

Patricia Gonzales, Trairak Pisitkun and Mark A. KnepperLaboratory of Kidney & Electrolyte Metabolism National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health Bethesda, MD, USA Nephrol Dial Transplant (2008) 23: 1799–1801

INTRODUÇÃO

Os exossomas são minúsculas vesículas (<100 nm) que contém diversas proteínas de membrana e citoplasmáticas das células de origem.

Foram primeiramente descritos em células sanguíneas, e estão presentes na maioria das células do corpo humano;

INTRODUÇÃO

São produzidos em todos os tipos de células epiteliais renais;

Os exossomas são vesículas originadas de corpos multivesiculares (MVB) no interior das células.

INTRODUÇÃO

Os Exossomos urinários constituem cerca de 3% do total de proteínas urinárias;

Quando exossomos são isolados, suas proteínas constituintes são enriquecidos > 30 vezes, melhorando a detecção de proteínas rara que pode ter valor de diagnóstico.

INTRODUÇÃO

A descoberta dos exossomas urinários;

Pode fornecer uma fonte de Biomarcadores protéicos para doenças

Fornecem importante significado fisiológico e patológico referente ao estado das células renais de origem.

INTRODUÇÃO

Exossomas urinários

Análise Proteômica

Proteínas citosólicas e de membrana

FORMAÇÃO DOS EXOSSOMAS URINÁRIOS

MVBS

MVB

MICROGRAFIA ELETRÔNICA

EXOSSOMAS URINÁRIOS (40-100 NM)

MICROGRAFIA ELETRÔNICA

EXOSSOMA URINÁRIO

OBJETIVO

Discutir possíveis aplicações da análise de exossomas urinários, bem como as barreiras para seu desenvolvimento na prática clínica entre outros.

COMO A ANÁLISE DE EXOSSOMAS URINÁRIOS PODERIA SER USADO EM PESQUISA CLÍNICA?

A descoberta de biomarcadores com aplicação em larga escala:

DESCOBERTA• Análise

Proteômica de urina de

pacientes bem caracterizados

VALIDAÇÃO• Quantificação

de biomarcadores

na urina de muitos

pacientes

IMPLEMENTAÇÃO

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSA (LC-MS/MS)

Importante ferramenta analítica para a análise de pequenas moléculas em diversas matrizes biológicas;

Diversos estudos têm sido direcionados no sentido de desenvolver metodologias, utilizando LC-MS/MS;

Exemplos: determinação de fármacos e metabolitos em biofluidos, análise de proteínas e peptídeos, determinação quantitativa de pequenas moléculas.

CROMATOGRAFIA LÍQUIDA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSA (LC-MS/MS)

• Alto poder de separação.Cromatografia

Líquida

• Alta seletividade e sensibilidadeEspectrometria

de massa

QUAIS SÃO OS PROCESSOS CLÍNICOS QUE PODERIAM SE BENEFICIAR COM A ANÁLISE DE EXOSSOMAS URINÁRIOS E BIOMARCADORES SUBSTITUTOS?

Potenciais aplicações: Herança autossômica, doença renal policística

dominante (DRPAD) (Hogan, et al 2007).

No transplante renal, onde os biomarcadores poderá fornecer orientações no intervalo antes da leitura da biópsia, permitindo uma escolha mais rápida da melhor terapia, na questão da lesão renal aguda x rejeição;

Grande potencial para as análises de mutações genéticas ( apresentam mRNA no seu lúmen).

BARREIRAS E LIMITAÇÕES DA ANÁLISE DE EXOSSOMAS URINÁRIOS

Difícil quantificação, deve-se saber a taxa absoluta da excreção de cada proteína e comparar as taxas de excreção entre pacientes e controles;

Variação na excreção de água altera a concentração das proteínas;

Como alternativa pode-se utilizar marcadores exossomais (Alix ou TSG101) que são encontrados em todos os exossomos.

USO DO INIBIDOR DE PROTEASE

Preservar as proteínas associadas aos exossomas, durante estocagem transporte e etc;

É recomendável a estocagem das amostras a -80ºC;

Após descongelamento, as amostras devem ser centrifugadas extensivamente afim de aumentar a recuperar os exossomas da urina congelada.

BARREIRAS E LIMITAÇÕES DA ANÁLISE DE EXOSSOMAS URINÁRIOS

Isolamento por Ultracentrifugação: O mais efetivo!

Desvantagem:

o Alto custo do equipamento;

o Suporte inviável em ambientes clínicos.

o Tendem a reter e concentrar proteínas solúveis que podem competir com as proteínas exossomais, dificultando a identificação.

PROCESSO DE

ULTRACENTRIFUGAÇÃO

BARREIRAS E LIMITAÇÕES DA ANÁLISE DE EXOSSOMAS URINÁRIOS

Abordagens utilizando ultrafiltração:

São promissores, mas tendem a reter e concentrar proteínas solúveis na urina, além de exossomos.

Dificuldades nos processos de separação de interferentes.

BARREIRAS E LIMITAÇÕES DA ANÁLISE DE EXOSSOMAS URINÁRIOS

A excreção da proteína Tamm-Horsfall (uromodulina, a mais abundante proteína excretada na urina).

Esta proteína tende a formar agregados fibrilares na urina, principalmente em baixa temperatura;

Estes agregados podem arrastar os exossomas e evitar o seu isolamento eficiente e purificação através de processos de centrifugação.

A ANÁLISE DE EXOSSOMAS URINÁRIOS É POTENCIALMENTE ÚTIL PARA ESTUDOS FISIOLÓGICOS?

Foi demonstrado que o isolamento de exossomas urinários detectou proteínas transportadoras de Na+ expressas ao longo dos túbulos renais (McKee et al., 2000).

o A Taxa de excreção de uma determinadaproteína é a diferença entre a taxa de sua produção e a taxa de sua degradação na célula;

o Deve-se conhecer a taxa de degradação para poder estimar a taxa de produção dessas proteínas.

CONCLUSÃO

Como qualquer nova ferramenta, a análise de exossomas tem vantagens e

desvantagens que devem ser exploradas antes de qualquer análise. No entanto,

dada a natureza não-invasiva do procedimento de coleta da amostra e a

grande quantidade de informações potencialmente disponíveis a partir de

tais estudos, parece provável que a análise de exosomas irá desempenhar um papel importante na pesquisa em

nefrologia no futuro.

BOA TARDE!!