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( 1 2 )Uni t ed S t a t e s Paten tKakkis

US006585971B1

( 1 0 )P a t e n t N 0 . :( 4 5 )Date o f P a t e n t :

U S 6 , 5 8 5 , 9 7 1B1J u l .1 ,2 0 0 3

( 5 4 ) RECOMBINANT( X - L - I D U R O N I D A S E ,METHODS FOR PRODUCING ANDPURIFYING THE SAME AND METHODSFOR TREATING DISEASE CAUSED BYDEFICIENCIES THEREOF

( 7 5 ) I n v e n t o r :E m i l D . K a k k i s , N o v a t o ,CA U S )

( 7 3 ) A s s i g n e e : Harbor-UCLA R e s e a r c ha n dE d u c a t i o nI n s t i t u t e ,To r r a n c e , CA ( U S )

S u b j e c t t o a n y d i s c l a i m e r , t h e t e r m o f t h i sp a t e n t i s e x t e n d e d o r a d j u s t e d u n d e r 3 5U . S . C . 1 5 4 ( b )b y 2 3 2 d a y s .

( * ) N o t i c e :

( 2 1 ) A p p l .N o . :0 9 / 7 1 1 , 2 0 5

( 2 2 ) F i l e d : N o v . 9 , 2 0 0 0

R e l a t e d U S . A p p l i c a t i o nData

ontmuation-m- arto a i c a t i o n 0. , , e on3 C p f p p l ' N 09/439 923 ?l d

N o v . 1 2 , 1 9 9 9 , n o w P a t .N o . 6 , 4 2 6 , 2 0 8 .

( 5 1 ) I n t . C l . 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . A61K 8 / 4 3 ; A61K 8 / 4 7 ;C12N 9 / 0 0 ; C12N 9 / 2 4

( 5 2 ) US. l . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 4 2 4 / 9 4 . 6 1 ; 424/941; 435/183;4 3 5 / 2 0 0

( 5 8 ) Field of Search . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 435/183, 200;4 2 4 / 9 4 . 1 ,9 4 . 6 1

( 5 6 ) R e f e r e n c e s C i t e dU . S . PATENT DOCUMENTS

3 , 4 7 2 , 9 3 1 A 1 0 / 1 9 6 9 S t o u g h t o n3 , 8 9 1 , 7 5 7A 6 / 1 9 7 5 H i g u c h i5 , 2 7 0 , 0 5 1 A 1 2 / 1 9 9 3 H a r r i s6 ,149 ,909 A 11/2000 Scott e t a l . . . . . . . . . . . . .. . 4 2 4 / 9 4 6 16 ,238 ,662 B1 5/2001 Scott e t a l . . . . . . . . . . . . .. . 4 2 4 / 9 4 6 1

FOREIGN PATENT DOCUMENTS

GB 1001949 8 / 1 9 6 5GB 1 029 548 A 8/2002W0 WO 3 / 1 0 2 4 4 5 / 1 9 9 3W0 WO 7 / 1 0 3 5 3 3 / 1 9 9 7W0 WO 9 / 5 1 7 2 4 1 0 / 1 9 9 9W0 WO 9 / 5 8 6 9 1 1 1 / 1 9 9 9

OTHER PUBLICATIONS

C l e m e n t s ,e t a l . , I m m u n o p u r i ? c a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o no f human o t L i d u r o n i d a s eW i t h t h e u s e o f monoclona la n t i b o d i e s , B i o c h e m .J . v o l .2 5 9 , p p . 1 9 9 2 0 8( 1 9 8 9 ) .K a k k i s , e t a l . , O v e r e x p r e s s i o no f t h e human l y s o s o m a lenzyme o t L i d u r o n i d a s ei n C h i n e s eH a m s t e r O v a r yc e l l s ,P r o t .E x p . P u r i f v o l .5 , p p .2 2 5 2 3 2( 1 9 9 4 ) .S c o t t , e t a l . , Chromosomal l o c a l i z a t i o n o f t h e humano t L i d u r o n i d a s eg e n e ( IDUA) t o 4 p 1 6 . 3 Am. J . Hum.G e n e t . v o l .4 7 , p p . 8 0 2 8 0 7( 1 9 9 0 ) .Z h a o ,e t a l . , C a r b o h y d r a t es t r u c t u r e s o f r e c o m b i n a n thumano t L i d u r o n i d a s es e c r e t e d b y C h i n e s e H a m s t e r O v a r yc e l l s ,J . B i o l .Chem. v o l .2 7 3 , N o . 3 6 , p p . 2275822765( 1 9 9 7 ) .K a k k i s , e t a l . , L o n g T e r ma n d H i g h D o s eT r i a l so fEnzyme R e p l a c e m e n t T h e r a p yi n t h e C a n i n e Model o fM u c o p o l y s a c c h a r i d o s i sI ,B i o c h e m .M o l .M e d .v o l .5 8 , N o .2 , p p .1 5 6 1 6 7( 1 9 9 6 ) .

N e u ? e l d ,e t a l . , T h e M u c o p o l y s a c c h a r i d o s e s ,T h e Meta

b o l i cB a s i s o f I n h e r i t e d D i s e a s e , S c r i v e r ,C . R . ,B e a u d e t ,A . L . , S l y ,W. S . , a n d Va l l e ,D . E d s . McGraW i l l , N e W o r k ,p p .1 5 6 5 1 5 8 7( 1 9 8 9 ) .Rome, e t a l . , o t L I d u r o n i d a s ef o rHuman K i d n e y Metho d s i n E n z y m o l o g y ,v o l .8 3 , p p . 5 7 8 5 8 2( 1 9 8 2 ) .Schuchman, e t a l . ,Human o t L I d u r o n i d as e : P u r i ? c a t i o na n d P r o p e r t i e so f t h e H i g h U p t a k e ( H i g h e r M o l e c u l a rWe i g h t ) a n d t h eL o W U p t a k e ( P r o c e s s e d ) F o r m s J . B i o .C h e m ,v o l .2 5 9 , N o . 5 , p p .3 1 3 2 3 1 4 0( 1 9 8 4 ) .S c o t t , e t a l . , H u m a n o t L I d u r o n i d a s e :cDNA s o l a t i o n a n dE x p r e s s i o n , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA v o l . 8 8 , p p .9 6 9 5 9 6 9 9 ,( 1 9 9 1 ) .S c o t t ,e t a l . , M u l t i p l e P o l y m o r p h i s m sW i t h i n t h eo t L I d u

r o n i d a s e Gene ( I D U A ) :I m p l i c a t i o n s f o r a R o l e i n Modi?c a t i o n o f MPSID i s e a s e P h e n o t y p e ,Hum. M o l . G e n e t . v o l .2 , N o . 9 , p p . 1 4 7 1 1 4 7 3( 1 9 9 3 ) .S t o l t z f u s ,e t a l . , M u c o p o l y s a c c h a r i d o s i sI : c l o n i n g a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f cDNA e n c o d i n g c a n i n e o t L I d ur o n i d a s e , Am. J . Hum. G e n e t . , v o l .4 7 , N o . 3 , p . A 1 6 7 ,( 1 9 9 0 ) .K a k k i s , E . , e ta l . , S t r o n g T r a n s c r i p t i o n a lA c t i v a t i o n o fT r a n s l o c a t e d C M y c Genes O c c u r s W i t h o u t a S t r o n gNearby E n h a n c e r o r P r o m o t e r , N u c l e i c A c i d s R e s . 1 6 ( 1 ) : 7 7 9 6( 1 9 8 8 ) .L e d l e y, F . D . , C l i n i c a l A p p l i c a t i o n o f S o m a t i c G e n eT h e r a p yi n I n b o r n E r r o r s o f M e t a b o l i s m , J . I n h e r i t .M e t a b .D i s . 1 3 : 5 9 7 6 1 6( 1 9 9 0 ) .L o W r y ,RB, t a l . An U p d a t eo n t h e F r e q u e n c yo f Mucop o l y s a c c h a r i d e S y n d r o m e si n B r i t i s hC o l u m b i a , HumanG e n e t i c s 8 5 : 3 8 9 3 9 0( 1 9 9 0 ) .M y e r o W i t z ,R . ,e t a l . , M a t u r a t i o no f o t L I d u r o n id a s ei nC u l t u r e d H u m a n F i b r o b l a s t s , J . B i o l . C h e m . 2 5 6 ( 6 ) : 3 0 4 4 3 0 4 8( 1 9 8 1 ) .M o s k o W i t z ,S . M . , e t a l . , C l o n i n g a n dE x p r e s s i o no f c D N AE n c o d i n g t h e Human L y s o s o m a l E n z y m e , o t L I d ur o n i d a s e , FASEB J .6:A77 ( 1 9 9 2 ) .N e l s o n , 1 . , I n c i d e n c e o f t h e M u c o p o l y s a c c h a r i d o s e si nN o r t h e r nI r e l a n d , Human G e n e t i c s 1 0 1 : 3 3 5 3 5 8( 1 9 9 7 ) .S c r i v e r ,C . R . ,B e a u d e t , A . L . , S l y ,WS n d Va l l e ,D . E d s .

T h e M e t a b o l i cB a s i s o f I n h e r i t e d D i s e a s e p p 1 5 6 5 1 5 8 7 ,McGraW i l l , N e WY o r k ( 1 9 8 9 ) .

( L i s tc o n t i n u e d o n n e x t p a g e . )

P r i m a r yE x a m i n e r P o n n a t h a p uA c h u t a m u r t h yA s s i s t a n t ExaminerManjunath N . Rao( 7 4 ) A t t o r n e y,A g e n t , o r F i r m A l b e r tP . H a l l u i n ; R o b i n C .C h i a n g ; HoWrey Simon A r n o l d & h i t e L L P

( 5 7 ) ABSTRACT

The p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s a r e c o m b i n a n thuman ( X - Li d u r o n i d a s e a n d b i o l o g i c a l l y a c t i v e f r a g m e n t sa n d m u t a n t st h e r e o f , l a r g es c a l e m e t h o d st o p r o d u c e a n dp u r i f y commerc i a l g r a d e r e c o m b i n a n thuman o t - L - i d u r o n i d a s eenzyme a sWe l l a s methods t o t r e a tc e r t a i n g e n e t i c d i s o r d e r s i n c l u d i n go t - L - i d u r o n i d a s e d e ? c i e n c y a n d m u c o p o l y s a c c h a r i d o s i sI

( M P S1 ) .

3 0 C l a i m s , 1 4 Drawing S h e e t s

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U S 6 , 5 8 5 , 9 7 1B1P a g e 2

OTHER PUBLICATIONS

S h u l l ,R . M . , e t a l . , Enzyme R e p l a c e m e n ti n a C a n i n eModel o f H u r l e r S y n d r o m e , P r o c . N a t l . A c a d . S c i , USA9 1 : 1 2 9 3 7 1 2 9 4 1( 1 9 9 4 ) .S t o l t Z f u s ,L . J . , e ta l . , C l o n i n g a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o fcDNA E n c o d i n g C a n i n e o t L I d u r o n i d a s e , J . B i o l .C h e m . 2 6 7 ( 1 0 ) : 6 5 7 0 6 5 7 5( 1 9 9 2 ) .T a y l o r , J e t a l . , o t L I d u r o n i d a s ei n Norma l and Mucop o l y s a c c h a r i d o s i s Ty p e 1Human S k i n F i b r o b l a s t s , B i oc h e mJ . 2 7 4 : 2 6 3 2 6 8( 1 9 9 1 ) .T o l s t o s h e v ,P. , e t a l . , G e n e E x p r e s s i o n U s i n g R e t r o v i r a lVe c t o r s , C u r r e n t O p i n i o n sB i o t e c h . 1 : 5 5 6 1( 1 9 9 0 ) .T u c k e r , P. W. e t a l . , Mouse IgA Heavy C h a i n G e n eS e q u e n c e : I m p l i c a t i o n s f o r E v o l u t i o n o f I m m u n o g l o b u l i nH i n g e E X o n s , P r o c . N a t l . A c a d . S c i .U S A 7 8 ( 1 2 ) : 7 6 8 4 7 6 8 8( 1 9 8 1 ) .U n g e r , E . G . , e t a l . , R e c o m b i n a n to t L I d u r o n i d a s e :C h a ra c t e r i Z a t i o n o f t h e P u r i ? e d EnZyme a n d C o r r e c t i o n o fMucop o l y s a c c h a r i d o s i s T y p e I F i b r o b l a s t s , B i o c h e m .J . 3 0 4 : 4 3 4 9( 1 9 9 4 ) .A n s o n , D . S . e t a l . , C o r r e c t i o n f o H u m a n M u c o p o l y s a cc h a r i d o s i s Ty p e V I F i b r o b l a s t s W i t h R e c o m b i n a n tN A c e t y l g a l a c t o s a m i n e 4 S u l p h a t a s e , B i o c h e mJ . 2 8 4 : 7 8 9 7 9 4( 1 9 9 2 ) .B a r t o n , R . W. , e t a l . , T h eH u r l e r C o r r e c t i v eF a c t o r , J . B i o l .C h e m . 2 4 6 ( 2 4 ) : 7 7 7 3 7 7 7 9( 1 9 7 1 ) .

B i e l i c k i , J e t a l . , Recombinant HumanI d u r o n a t e 2 S u l p h a t a s e: C o r r e c t i o no f M u c o p o l y s a c c h a r id o s i s T y p e

I IF i b r o b l a s t s a n d C h a r a c t e r i Z a t i o n

o ft h e P u r i

? e d E n Z y m e , B i o c h e m .J 2 8 9 : 2 4 1 2 4 6( 1 9 9 3 ) .

C l e m e n t s , e t a l . ,Human a l p h a L i d u r o n i d a s e1 . P u r i ? c at i o n ,m o n o c l o n a la n t i b o d y p r o d u c t i o n , n a t i v ea n d s u b u n i tm o l e c u l a r m a s s , E u r o p e a n J o u r n a l o f B i o c h e m i s t r y,1 5 2 ( 1 ) : 4 3 4 9( 1 9 9 4 ) .F r i e d m a n , T. , P r o g r e s s T o W a r dHuman G e n e T h e r a p y, S c i e n c e 2 4 4 : 1 2 7 5 1 2 8 1( 1 9 8 9 ) .H o o g e r b r u g g e ,P. M . , e t a l . , A l l o g e n e i c B o n e MarroWT r a n s p l a n t a t i o nf o rL y s o s o m a lS t o r a g eD i s e a s e s , L a n c e t 3 4 5 1 1 3 9 8( 1 9 9 5 ) .I o a n n o u ,Y. A . , e t a l . , O v e r e X p r e s s i o no f Human o t G a l a ct o s i d a s e A e s u l t s i n I t s I n t r a c e l l u l a rA g g r e g a t i o n ,C r y s t a ll i Z a t i o ni n L y s o s o m e s , a n dS e l e c t i v e S e c r e t i o n , J . C e l lB i o l . 1 1 9 ( 5 ) : 1 1 3 7 1 1 5 0( 1 9 9 2 ) .K a k k i s , e t a l . , E n Z y m e r e p l a c e m e n tt h e r a p y i n mucop o l y s a c c h a r i d o s i s1 . , New E n g l a n dJ o u r n a l o f M e d i c i ne ,3 4 4 ( 3 ) : 1 8 2 1 8 8( 2 0 0 1 ) .F r a n c h i m o n t e t a l . A g e n t s a n d A c t i o n s ,6 / 1 3 ( 2 4 ) ,( s e ee n c l o s e da b s t r a c t ) . *

1 9 7 6 , v o l .

* c i t e d b y examiner

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U . S . P a t e n t J u l .1 ,2 0 0 3 S h e e t 3 o f 1 4 U S 6 , 5 8 5 , 9 7 1B 1

F I G . 7 - 3

2 0 0 0 2 0 1 0 2 0 2 0 2 0 3 0_ k *

2 0 4 0 2 0 5 0 kk * * *

CAG GTG TTT GAG T G GAAG GAC TTG GTC T C CAGC C T G G C CAGG AGA T A C ATC GGT AGGG l n Va l P h e G l u T r p Ly s A s p L e u Va l S e r S e r L e u A l a A r g A r g T y r I l e G l y A r g

2060 2070 2080 2090 2100 2110* * k k * 1 : ' k * k k k

T A C GGA CTG G C G C A T G T T T C CAAG T G GAAC T T CGAG ACG T G GAAT GAG CCA GAC C A CT y r G l y L e u A l a H i s Va l S e r Ly s T r p A s n P h e G l u T h r T r p A s n G l u P r o A s p H i s

2 1 2 0 2130 2140 2 1 5 0 2160* * 9 : * ~ k * ~ k * k * *

C A C G A C T T T G A C A A C G T C T C CATG A C CATG C A A G G C T T C C T GAAC T A C T A CGAT G C C

H i s A s p P h e A s p A s nVa l S e r M e t T h r M e t G l n G l y P h e L e u A s nT y r T y r A s p A l a2170 2180 2190 2200 2210 2220

* *

TGC TCG GAG GGT CTG C G CGCC GCC AGC CCC G C CCTG CGG CTG GGA GGC CCC GGC GACC y s S e r G l u G l y L e u A r g A l a A l a S e r P r o A l a L e u A r g L e u G l yG l y P r o G l y A s p

2230 2240 2 2 5 0 2260 2270 2280* * * k k * k * ~ k * *

T C C T T C C A C A C C C C A0 0 6 C G AT C C C C GC T G A G CT G GG G C C T C C T G C G C C A C T G C C A CS e r P h e H i s T h r P r o P r o A r g S e r P r o L e u S e r T r p G l y L e u L e u A r g H i s C y sH i s

2 2 9 0 2 3 0 0 2 3 1 0 2 3 2 0 2 3 3 0 2 3 4 0

G A C G G T A C C A A CT T C T T CA C TG G GG A G G C GG G C G T GC G G C T G G A C T A C A T C T C C C T CA s p G l y T h r A s n P h e P h e T h r G l y G l u A l a G l y Va l A r g L e u A s p T y r I l e S e r L e u

2350 2360 2370 2380 2390

CAC AGG AAG GGT GCGC G CAGC TCC ATC TCC ATC CTG GAG CAG GAG AAG GTC GTC GCGH i s A r g L y s G l y A l a A r g S e r S e r I l e S e r I l e L e u G l u G l n G l uL y s Va l Va l A l a

2400 2410 2420 2430 2440 2450k

C A GC A GA T C C G GC A GC T C T T CC C C A A G T T C G C GG A CA C C C C CA T T T A C A A C G A C G A GG l n G l n I l e A r g G l n L e u P h e P r o L y s P h e A l a A s p T h r P r oI l e T y r A s n A s pG l u

2 4 6 0 2 4 7 0 2480 2 4 9 0 2500 2510 k k k * k k I : ~ k ~ k k * *

GCG G A C C C G C T G G T G G G C T G GT C C C T GCCA C A G C C G T G GAGG GCG GAC GTG ACCT A CA l a A s p P r o L e u Va l G l y T r p S e r L e u P r o G l n P r o T r pA r g A l a A s p Va l T h r T y r

2 5 2 0 2 5 3 0 2 5 4 0 2 5 5 0 2560

G C GG C CATG G T G G T GAAG G T C A T CG C GC A GC A T C A GA A CC T GCTA C T G G C CAAC A C CA l a A l a M e t Va l Va l L y s Va l I l e A l a G l n H i s G l n A s n L e u L e u L e uA l a A s n T h r

2570 2580 2590 2600 2610 2620I : * * * k * * k k k - k *

ACC TCC G C C T T C C C C T A CGCG C T CCTG AGC AAC G A CAAT G C C T T CCTG AGC TAC CACThr Ser Ala Phe Pro Tyr Ala Leu L e u Ser Asn Asp Asn Ala Phe Leu Ser Tyr H i s

2630 2640 2650 2660 2670 2680* *

CCG CAC CCC TTC GCG CAG CGC ACG CTC ACC GCG CGC TTC CAG GTC AACAAC ACC CGCP r o H i s P r o P h e A l a G l n A r g T h r L e u T h r A l a A r g P h eG l n Va l A s n A s n T h r A r g

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U . S . P a t e n t J u l .1 , 2 0 0 3 S h e e t 8 0 f 1 4 U S 6 , 5 8 5 , 9 7 1B1

{aw fG a i i P r a i a E n i g m ai s v i z ?5 5 5 w{:Qmammamg

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11/33

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12/33

U . S . P a t e n t J u l .1 ,2 0 0 3 S h e e t 1 0 0 f1 4 U S 6 , 5 8 5 , 9 7 1B 1

4 R e d u c t i o ni n L i v e rVo l u m eD u r i n gE n z y m eT h e r a p y/ G .

23451 :O

I

1 2 1 6 2 0 2 4 2 8 3 2 5 6 4 b 4 4 4 8 5 2 5 6 6 034

E9 ;6 mS Q

1 . 8

We e k s o f T h e r a p y

U r i n a r yG A GE x c r e t i o nD u r i n gE n z y m eT h e r a p yOMOOT

- O HACOOZ

v RCDOO3+ S S H O 0 4 I - S W D O O 5I G M D O O 6

ANOO7MOO8

-*- C E L O O 9AP BBGOTO

0 6tem8

4 05O 2 5We e k s o f Tr e a t m e n t

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13/33

U . S . P a t e n t

F / G .

egrees

egrees

F I G .

U S 6 , 5 8 5 , 9 7 1B1u l . 1 , 2 0 0 3 S h e e t 1 1 0 f 1 4

6 E l b o w0 n d K n e eE x t e n s i o nI n H A C O O 21 8 0

1 7 5 *

1 7 0

1 6 5 '

1 6 0 *

1 5 5

1 5 0

1 4 5 ' i g h tE l b o w140- O L e f tE l b o w

v R i g h tK n e e1 3 5 - v R i g h t K n e e

6 1 b 2 b 5 b 4 0 5 0 6 0We e k s

CDOOZJ-RS- R C D O O 3 L Sv S S H O O 4 - R S' SSHOO4-LSI SWDOO5-RS

W D O O S - L SBGO10-RSBGO10-LS

0 1 0 2 b 5 b 4 b 5 b 6 b7 b 8 b9 ' 0 1 d 0 1 1 ' 0 1 1 27 We e k s

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U . S . P a t e n t J u l .1 ,2 0 0 3 S h e e t 1 3 0 f1 4 U S 6 , 5 8 5 , 9 7 1B 1

P u l m o n a r yF u n c t i o nT e s t si n G M D O O B1 . 6

5 2 w k s

2 3 0 I m p r o v e m e n t1 . 4

1 . 2

7 0/ G .

I n c r e a s e dH e i g h tG r o w t hVe l o c i t y

8 5 M e a n I n c r e a s e i n G r o w t hR a t e

O l dg r o w t hr a t e

P a s t - t r e a t m e n t. o

P r e t r e a t m e n t

_ _42 86411 99911

:95Q QQ

2 0 8 1 8 2 1 5 6 1 3 0 1 0 4

We e k s

F I G . 7 7

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U . S . P a t e n t J u l .1 , 2 0 0 3 S h e e t 1 4 0 f 1 4 U S 6 , 5 8 5 , 9 7 1B1

C h i n z s e z H u m s t e rO v a r yH o s tP r o t e i nC o n t a m i n a t i o nb yE L I S AA s s a y

S O U R C EA N DB AT C H P E R C E N TC H O Pp E u N R z l Y Ta E o g R g - t iN U M B E R ( m k r o g m mp e rm i l l i g r a m )C O N TA M I N AT I O NC H O P

P r i o rP r o c e s s( C o r s o n / R E I )C 9 0 0 2 1 4 1 . 4 9 8 . 6

C 9 0 0 3 2 4 2 . 4 9 7 . 6C 9 0 0 4 i 6 1 . 6 9 8 . 4

N e wP r o c e s s( G o l l i )P 1 0 0 3 < 1 . 3 < 0 . 1 3 > 9 9 . 9

P 1 0 0 6 1 . 2 0 . 1 2 9 9 . 9

P 1 0 0 7 ( 0 . 6 ( 0 . 0 6 > 9 9 . 9

P 1 0 0 8 ( 0 . 6 7 ( 0 . 0 6 7 > 9 9 . 9

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U S 6 , 5 8 5 , 9 7 1B11

RECOMBINANT t-L-IDURONIDASE,METHODS FOR PRODUCING AND

PURIFYING THE SAME AND METHODSFOR TREATING DISEASE CAUSED BY

DEFICIENCIES THEREOF

T h i s a p p l i c a t i o n i s a c o n t i n u a t i o n - i n - p a r t o f US. p a t e n ta p p l i c a t i o n S e r. No. 0 9 / 4 3 9 , 9 2 3 , ? l e don N o v . 1 2 , 1999 n o wU S . P a t .N o . 6 , 4 2 6 , 2 0 8 ,J u l .3 0 , 2 0 0 2 .

F I E L D OF THE INVENTION

The p r e s e n t i n v e n t i o n i s i n t h e ? e l d o f m o l e c u l a rb i o l o g y,e n Z y m o l o g y ,b i o c h e m i s t r y a n d c l i n i c a lm e d i c i n e . I np a r t i c u l a r , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s a human recomb i n a n t o t - L - i d u r o n i d a s e ,m e t h o d so f l a r g e - s c a l ep r o d u c t i o na n d p u r i ? c a t i o n o f c o m m e r c i a lg r a d e human r e c o m b i n a n to t - L - i d u r o n i d a s e enZyme, and methods t o t r e a t c e r t a i ng e n e t i cd i s o r d e r si n c l u d i n g o t - L - i d u r o n i d a s ed e ? c i e n c ya n dm u c o p o l y s a c c h a r i d o s i sI ( M P SI ) .

BACKGROUND OF THE INVENTION

C a r b o h y d r a t e sp l a y a number o f i m p o r t a n t r o l e si n t h ef u n c t i o n in g o f l i v i n go r g a n i s m s . I n a d d i t i o n t o t h e i rm e t ab o l i c r o l e s ,c a r b o h y d r a t e sa r e s t r u c t u r a l c o m p o n e n t so f t h ehuman body c o v a l e n t l y a t t a c h e d t o numerous o t h e r e n t i t i e ss u c h a s p r o t e i n sa n d l i p i d s( c a l l e dg l y c o c o n j u g a t e s ) .F o re x a m p l e , human c o n n e c t i v e t i s s u e s a n d c e l l membranesc o m p r i s ep r o t e i n s ,c a r b o h y d r a t e sa n d a p r o t e o g l y c a nm a t r i x .T h e c a r b o h y d r a t ep o r t i o n o f t h i sp r o t e o g l y c a n m a t r i x p r ov i d e s i m p o r t a n tp r o p e r t i e s t o t h eb o d y s s t r u c t u r e .

A e n e t i cd e ? c i e n c yo f t h ec a r b o h y d r a t e - c l e a v i n g ,l y s osomal e n Z yme o t - L - i d u r o n i d a s e c a u s e s a lysosomal s t o r a g e

d i s o r d e r k n o W n a s m u c o p o l y s a c c h a r i d o s i sI (M PS I )( N e u f e l d a n d M u e n Z e r ,p p . 1 5 6 5 1 5 8 7 ,i n T h e M e t a b o l i cB a s i s o f I n h e r i t e d D i s e a s e , E d s . C . R . S c r i v e r ,A . L .B e a u d e t , W. S . S l y ,a n d D . Va l l e , M c G r a W - H i l l ,NeWY o r k( 1 9 8 9 ) ) I n a s e v e r e f o r m , MPS i s commonly k n o W n a sH u r l e r s y n d r o m ea n d i s a s s o c i a t e d Wi t h m u l t i p l e p r o b l e m ss u c h a s mental r e t a r d a t i o n , c l o u d i n g o f t h e c o r n e a , c o a r se n e d f a c i a lf e a t u r e s ,c a r d i a cd i s e a s e ,r e s p i r a t o r yd i s e a s e ,l i v e ra n d s p l e e n e n l a r g e m e n t , h e r n i a s ,a n d j o i n ts t i f f n e s s .P a t i e n t s s u f f e r i n gf r o m H u r l e r s y n d r o m eu s u a l l y d i eb e f o r eage 1 0 . I n an i n t e r m e d i a t e fo rm knoWn a s Hurler-Scheies y n d r o m e , m e n t a l f u n c t i o n i s g e n e r a l l y n o t s e v e r e l ya f f e c t e d ,b u t p h y s i c a l p r o b l e m sm a y l e a d t o d e a t h b y t h et e e n s o r t We n t i e s . S c h e i e syndrome i s t h e m i l d e s t form o f

MPS . I t i s c o m p a t i b l e W i t ha normal l i f e s p a n , b u t j o i n ts t i f f n e s s ,c o r n e a l c l o u d i n g a n d h e a r t v a l v e d i s e a s e c a u s es i g n i ? c a n tp r o b l e m s .

The f r e q u e n c y o f MPS i s e s t i m a t e d t o b e 1 : 1 0 0 , 0 0 0a c c o r d i n g t o a B r i t i s h Columbia s u r v e y o f a l l neWborns( L o W r y ,e t a l . ,H u m a n G e n e t i c s 8 5 : 3 8 9 3 9 0( 1 9 9 0 ) ) a n d1 : 7 0 , 0 0 0 a c c o r di n gt o a n I r i s hs t u d y ( N e l s o n ,H u m a n e n e ti c s 101:355358 ( 1 9 9 0 ) ) . T h e r e a p p e a r s t o be no e t h n i cp r e d i l e c t i o n f o rt h i sd i s e a s e . I t i s l i k e l y t h a tWo r l d W i d et h ed i s e a s e i s u n d e r d i a g n o s e de i t h e rb e c a u s e t h e p a t i e n t d i e s o fa c o m p l i c a t i o nb e f o r e t h e d i a g n o s i s i s made o r b e c a u s e t h em i l d e r f o r m s o f t h e syndrome m a y b e m i s t a k e nf o r a r t h r i t i so r m i s s e d e n t i r e l y .E f f e c t i v e neWborn s c r e e n i n g f o r MPSW o u l dl i k e l y? n d some p r e v i o u s l y u n d e t e c t e dp a t i e n t s .

E x c e p t f o r a feW p a t i e n t s Which q u a l i f y f o r bone marroWt r a n s p l a n t a t i o n , t h e r e a r e n o s i g n i ? c a n t t h e r a p i e s a v a i l a b l ef o r a l l MPS p a t i e n t s .H o b b s , e t a l . ( L a n c e t 2 : 709712( 1 9 8 1 ) ) ? r s t r e p o r t e d t h a tb o n e marroW t r a n s p l a n t a t i o n s u cc e s s f u l l y t r e a t e d a H u r l e r p a t i e n t .S i n c e t h a tt i m e , c l i n i c a ls t u d i e s a t s e v e r a l t r a n s p l a n t c e n t e r s h a v e shoWn i m p r o v e

10

1 5

20

25

30

35

40

45

50

55

60

6 5

2ment i n p h y s i c a l d i s e a s e a n d s l o W i n g o r s t a b i l i Z i n go fd e v e l o p m e n t a ld e c l i n ei f p e r f o r m e de a r l y .( W h i t l e y ,e t a l . ,Am. . Med. G e n e t . 4 6 : 209218 ( 1 9 9 3 ) ; Ve l l o d i , e t a l . , A r c h .D i s . C h i l d . 7 6 : 9 2 9 9( 1 9 9 7 ) ; P e t e r s , e t a l . , Blood 9 1 :26012608 ( 1 9 9 8 ) ; G u f f o n , e t a l . , J . P e d i a t r i c s 1 3 3 :

1 1 9 1 2 5( 1 9 9 8 ) )H o We v e r ,t h e s i g n i ? c a n tm o r b i d i t y a n dm o r t a l i t y, a n d t h e n e e d f o r matched d o n o r m a r r o W,l i m i t s t h eu t i l i t yo f b o n e marroW t r a n s p l a n t s .An a l t e r n a t i v et h e r a p ya v a i l a b l e t o a l la f f e c t e d p a t i e n t s Would p r o v i d e a n i m p o r t a n tb r e a k t h r o u g hi n t r e a t i n ga n d m a n a g i n gt h i sd i s e a s e .

EnZyme r e p l a c e m e n t t h e r a p y h a s b e e n c o n s i d e r e d ap o t e n t i a lt h e r a p y f o r M P S I f o l l o W i n gt h e d i s c o v e r y t h a to t - L - i d u r o n i d a s ec a n c o r r e c t t h e enZymatic d e f e c t i n H u r l e rc e l l si n c u l t u r e ,b u t t h e d e v e l o p m e n to f human t h e r a p y h a sbeen t e c h n i c a l l y u n f e a s i b l e u n t i l n o W . I n t h e c o r r e c t i v ep r o c e s s , t h e enZyme c o n t a i n i n g a m a n n o s e - 6 - p h o s p h a t er e s i d u e i s t a k e n u p i n t oc e l l st h r o u g h r e c e p t o r - m e d i a t e de n d o c y t o s i sa n d t r a n s p o r t e d t o t h el y s o s o m e sW h e r ei t c l e a r st h e s t o r e d s u b s t r a t e s ,h e p a r a ns u l f a t ea n d d e r m a t a ns u l f a t e .A p p l i c a t i o n o f t h i st h e r a p y t o humans h a s p r e v i o u s l y n o tb e e n p o s s i b l e d u e t o i n a d e q u a t e s o u r c e s o f o t - L - i d u r o n i d a s ei n t i s s u e s .

For o t - L - i d u r o n i d a s e enZyme t h e r a p y i n MPS , a recomb i n a n t s o u r c e o f en Z yme h a s been needed i n o r d e r t o o b t a i nt h e r a p e u t i c a l l y s u f f i c i e n ts u p p l i e s o f t h e e n Z y m e .T h e cDNAf o r t h e c a n i n e enZyme Was c l o n e d i n 1 9 9 1 ( S t o l t Z f u s , e t a l . ,J . B i o l . Chem. 2 6 7 : 6 5 7 0 6 5 7 5( 1 9 9 2 ) a n d f o r t h e humanenZyme i n t h e same y e a r. ( S c o t t , e t a l . ,P r o c . N a t l . A c a d . S c i .U S A . 8 8 : 9 6 9 5 9 6 9 9( 1 9 9 1 ) , M o s k o W i t Z ,e t a l . ,FASEB J6 : A 7 7 ( 1 9 9 2 ) ) . F o l l o W i n gt h e c l o n i n g o f cDNA o r o t - Li d u r o n i d a s e ,t h ep r o d u c t i o n o f a d e q u a t eq u a n t i t i e so f r e c o mb i n a n t o t - L - i d u r o n i d a s e a l l o We d t h e s t u d y o f enZymer e p l a c e m e n tt h e r a p y i nc a n i n e M P S . ( K a k k i s ,e t a l . ,P r o t e i nE x p r .P u r i f .5 :2 2 5 2 3 2( 1 9 9 4 ) )E n Z y m er e p l a c e m e n ts t u d i e si n t h e c a n i n e MPS model d e m o n s t r a t e dt h a t i n t r a v e n o u s l ya d m i n i s t e r e d recombinant o t - L - i d u r o n i d a s e d i s t r i b u t e dW i d e l y a n d r e d u c e d l y s o s o m a ls t o r a g e f r o m many t i s s u e s .( S h u l l , e t a l . , P r o c . N a t l . A c a d .S c i .U . S . A . 9 1 : 1293712941( 1 9 9 4 ) ; K a k k i s , e t a l . ,B i o c h e m .M o l . Med. 5 8 : 1 5 6 1 6 7( 1 9 9 6 ) ) .

BRIEF SUMMARY OF THE INVENTION

I n one a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s a method t omass p r o d u c ehuman r e c o m b i n a n to t - L - i d u r o n i d a s ei n l a r g es c a l e a m o u n t sW i t h a p p r o p r i a t e p u r i t y t o e n a b l e l a r g e s c a l ep r o d u c t i o nf o r l o n g t e r m p a t i e n t u s e o f t h e enZyme t h e r a p y.I n a b r o a d e m b o d i m e n t ,t h e method c o m p r i s e st h e s t e p o ft r a n s f e c t i n g a cDNA ncoding f o r a l l o r p a r t o f a n o t - Li d u r o n i d a s e i n t o a c e l ls u i t a b l e f o r t h e e x p r e s s i o n t h e r e o f . I nsome embodiments, a cDNA ncoding f o r a complete o t - Li d u r o n i d a s e i s u s e d , p r e f e r a b l y a human o t - L - i d u r o n i d a s e .HoWever, i n o t h e r embodiments, a cDNA n c o d i n g f o r ab i o l o g i c a l l y a c t i v e f r a g m e n to r m u t a n tt h e r e o f m a y b e u s e d .S p e c i ? c a l l y , one o r m o r e a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n s may bemade W h i l e p r e s e r v i n go r e n h a n c i n gt h eb i o l o g i c a l a c t i v i t yo f t h e enZyme. I n o t h e r p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s ,a n e x p r e ss i o n v e c t o r i s used t o t r a n s f e r t h e cDNA n t o a s u i t a b l e c e l lo r c e l l l i n e f o r e x p r e s s i o n t h e r e o f . I n o n e p a r t i c u l a r l y p r ef e r r e d embodiment, t h e cDNA s t r a n s f e c t e d i n t o a C h i n e s eh a m s t e r o v a r y c e l l t oc r e a t e c e l l l i n e 2 . 1 3 1 . I n y e t o t h e rp r e f e r r e de m b o d i m e n t s ,t h ep r o d u c t i o n p r o c e d u r ef e a t u r e sone o r m o r e o f t h e fol loWing c h a r a c t e r i s t i c s Which haved e m o n s t r a t e dp a r t i c u l a r l yh i g hp r o d u c t i o nl e v e l s :( a )t h ep Ho f t h e c e l lg r o W t hc u l t u r e m a y b e l o W e r e dt o a b o u t 6 . 5 t o 7 . 0 ,p r e f e r a b l y t o a b o u t 6 . 8 7 . 0 d u r i n gt h ep r o d u c t i o n p r o c e s s ,( b ) a s m a n y a s 2 t o 3 . 5 c u l t u r e volumes o f t h e m e d i u m m a yb e c h a n g e d d u r i n g e a c h 2 4 - h o u r p e r i o d b y c o n t i n u o u s

8/10/2019 US 6,585,971-Jul 20

18/33

U S 6 , 5 8 5 , 9 7 1B13

p e r f u s i o n , ( c )o x y g e ns a t u r a t i o n m a y b e o p t i m i z e dt o a b o u t40 b u t m a y b e a s h i g h a s 80 , ( d ) m a c r o p o r o u sc e l l u l o s em i c r o c a r r i e r s W i t h a b o u t 5 erum i n t h e medium i n i t i a l l y ,m a y b e u s e d t o p r o d u c e c e l l mass f o l l o We d by a r a p i dW a s h o u ts h i f t t op r o t e i n - f r e e medium f o rp r o d u c t i o n , ( e ) a

p r o t e i n - f r e e o r l o W protein-medium such a s a JRH Bios c i e n c e s PF-CHO p r o d u c t m a y b e o p t i m i Z e d t o i n c l u d esupplemental amounts o f one o r m o r e i n g r e d i e n t s s e l e c t e df r o m t h eg r o u p c o n s i s t i n go f : g l u t a m a t e , a s p a r t a t e ,g l y c i n e ,r i b o n u c l e o s i d e s , a n d d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s ; a s t i r r e dt a n ks u s p e n s i o nc u l t u r e m a y b e p e r f u s e d i n a c o n t i n u o u sp r o c e s st o p r o d u c e i d u r o n i d a s e .

I n a s e c o n d a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s at r a n s f e c t e d c e l ll i n eW h i c h f e a t u r e s t h e a b i l i t yt o p r o d u c eo t - L - i d u r o n i d a s e i n amounts Which e n a b l e u s i n g t h e enZymet h e r a p e u t i c a l l y .I n p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s ,t h e p r e s e n ti n v e n t i o n f e a t u r e s a recombinant Chinese hamster ov ary c e l ll i n e s u c h a s t h e 2 . 1 3 1 c e l l l i n et h a t s t a b l y a n d r e l i a b l yp r o d u c e s a m o u n t so f o t - L - i d u r o n i d a s eW h i c he n a b l e u s i n g

t h e enZyme h e r a p e u t i c a l l y .I n some p r e f e r r e d e m b o d i m e n t s ,t h e c e l l l i n e m a y c o n t a i n more t h a n 1 copy o f a n e x p r e s s i o nc o n s t r u c t . I n even more p r e f e r r e d embodiments, t h e c e l l l i n ee x p r e s s e s recombinant o t - L - i d u r o n i d a s e i n amounts o f a tl e a s t2 0 m i c r o g r a m sp e r 1 0 7 c e l l sp e r d a y .

I n a t h i r d a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s n o v e lv e c t o r s s u i t a b l e t o produce o t - L - i d u r o n i d a s e i n amountsW h i c he n a b l e u s i n g t h ee n Z y m et h e r a p e u t i c a l l y .I n p r e f e r r e de m b o d i m e n t s ,t h e p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s a n e x p r e s s i o nv e c t o r c o m p r i s i n g a c y t o m e g a l o v i r u s p r o m o t e r / e n h a n c e re l e m e n t , a 5 i n t r o n c o n s i s t i n g o f a murine C O . i n t r o n , acDNA ncoding a l l o r a f ragment o r mutant of an o t - Li d u r o n i d a s e , a n d a 3 b o v i n e g r o W t hhormone p o l y a d e n y l at i o n s i t e . A l s o , p r e f e r a b l y t h e cDNA n c o d i n g a l l o r a

fragment o r mutant o f an o t - L - i d u r o n i d a s ei s a b o u t 2 . 2 k b i nl e n g t h . T h i s e x p r e s s i o n v e c t o r m a y b e t r a n s f e c t e d a t , f o re x a m p l e , a 50 t o 1 r a t i o W i t h any a p p r o p r i a t e commons e l e c t i o n v e c t o r s u c h a s p S V 2 N E O , t o e n h a n c e m u l t i p l ec o p y i n s e r t i o n s .A l t e r n a t i v e l y, g e n e a m p l i ? c a t i o n m a y b eu s e d t o i n d u c e m u l t i p l e copy i n s e r t i o n s .

I n a f o u r t h a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n p r o v i d e s n o v e lo t - L - i d u r o n i d a s ep r o d u c e di n a c c o r d a n c eW i t h t h e m e t h o d so f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n a n d t h e r e b y p r e s e n t i n a m o u n t sW h i c he n a b l e u s i n g t h ee n Z y m et h e r a p e u t i c a l l y .T h e s p e c i ? ca c t i v i t yo f t h e o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g t o t h e p r e s e n ti n v e n t i o n i s i ne x c e s s o f 2 0 0 , 0 0 0u n i t s p e r m i l l i g r a mp r o t e i n .P r e f e r a b l y , i t i s i n e x c e s s o f a b o u t 2 4 0 , 0 0 0u n i t s p e r m i l l igram p r o t e i n .T h e m o l e c u l a rWe i g h to f t h eo t - L - i d u r o n i d a s eo f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n i s a b o u t 8 2 , 0 0 0 d a l t o n s , a b o u t7 0 , 0 0 0d a l t o n s b e i n g a m i n o a c i d ,a n d a b o u t 1 2 , 0 0 0d a l t o n sb e i n gc a r b o h y d r a t e s .

I n a ? f t h a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s a n o v e lmethod t o p u r i f y o t - L - i d u r o n i d a s e . According t o a ? r s tembodiment , a c e l l m a s s m a y be g r o W n i n a b o u t 5s e r u m - c o n t a i n i n gmedium, f o l l o We dby a s W i t c h t o a modi? e d p r o t e i n - f r e ep r o d u c t i o nmedium Wi t h o u ta n y s i g n i ? c a n ta d a p t a t i o n t o p r o d u c ea h i g h s p e c i ? c a c t i v i t y s t a r t i n gm a t er i a l f o r p u r i ? c a t i o n . I n o n e p r e f e r r e d embodiment, a t h r e es t e p c o l u m n c h r o m a t o g r a p h ym a y b e u s e d t o p u r i f y t h eenZyme. Such a t h r e e s t e p column c h r o m a t o g r a p h ym a yi n c l u d e u s i n g a b l u e s e p h a r o s e F F, a Cu++ c h e l a t i n gs e p h a r o s ec h r o m a t o g r a p h ya n d a p h e n y l s e p h a r o s eH P h r om a t o g r a p h y .I n a n o t h e r p r e f e r r e d e m b o d i m e n t ,a n a c i d p Ht r e a t m e n t s t e p i s u s e d t o i n a c t i v a t e p o t e n t i a l v i r u s e s W i t h o u th a r m i n gt h ee n Z y m e .C o n c a n a v a l i nA - S e p h a r o s e ,H e p a r i nS e p h a r o s e a n d S e p h a c r y l 200 columns a r e removed a n dB l u e - S e p h a r o s ea n d c o p p e r c h e l a t i n g c o l u m n s a d d e d t oi n c r e a s e t h ec a p a c i t y o f t h e l a r g e s c a l ep u r i ? c a t i o n p r o c e s s ,

10

1 5

20

25

30

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6 5

4t o r e d u c e u n d e s i r a b l e l e a c h a b l e si n a p p r o p r i a t e f o r l o n g t e r mp a t i e n t u s e ,a n d t o i m p r o v et h ep u r i t y o f t h ep r o d u c t .

I n a s i x t h a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s n o v e lmethods o f t r e a t i n g d i s e a s e s c a u s e d a l l o r i n p a r t by ad e ? c i e n c y i n o t - L - i d u r o n i d a s e . I n o n e e m b o d i m e n t ,t h i s

method f e a t u r e s a d m i n i s t e r i n g a recombinant o t - Li d u r o n i d a s e o r a b i o l o g i c a l l y a c t i v e fragment o r mutantt h e r e o f a l o n e o r i n combination With a p h a r m a c e u t i c a l l ys u i t a b l e c a r r i e r .I n o t h e r e m b o d i m e n t s ,t h i smethod f e a t u r e st r a n s f e r r i n g a n u c l e i c a c i d encoding a l l o r a p a r t o f a no t - L - i d u r o n i d a s e i n t o one o r m o r e h o s t c e l l s i n v i v o . Pref e r r e d e m b o d i m e n t si n c l u d e o p t i m i Z i n gt h e d o s a g e t o t h en e e d s o f t h e o r g a n i s mt o b e t r e a t e d ,p r e f e r a b l y m a m m a l s o rh u m a n s ,t o e f f e c t i v e l ya m e l i o r a t e t h e d i s e a s e s y m p t o m s .I np r e f e r r e de m b o d i m e n t s ,t h ed i s e a s ei s M u c o p o l y s a c c h a r i d os i sI (MPS ) , H u r l e r s y n d r o m e ,H u r l e r - S c h e i es y n d r o m eo rS c h e i e s y n d r o m e .

I n a s e v e n t h a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s n o v e lp h a r m a c e u t i c a lc o m p o s i t i o n sc o m p r i s i n go t - L - i d u r o n i d a s eu s e f u l f o r t r e a t i n g a d i s e a s e c a u s e d a l l o r i n p a r t b y ad e ? c i e n c y i n o t - L - i d u r o n i d a s e . S u c h c o m p o s i t i o n sm a y b es u i t a b l e f o r a d m i n i s t r a t i o n i n a number o f Wa y s such a sp a r e n t e r a l , t o p i c a l ,i n t r a n a s a l ,i n h a l a t i o n o r o r a la d m i n i s t r at i o n . Within t h e s c o p e o f t h i s a s p e c t a r e embodimentsf e a t u r i n g n u c l e i c a c i d s e q u e n c e sencoding a l l o r a p a r t o f a no t - L - i d u r o n i d a s e Which m a y b e a d m i n i s t e r e d i n v i v o i n t oc e l l s a f f e c t e d W i t h a n o t - L - i d u r o n i d a s ed e ? c i e n c y .

DESCRIPTION OF THE FIGURES

F I G . 1 r e p r e s e n t s t h e n u c l e o t i d e a n d deduced amino a c i ds e q u e n c e s o f cDNA n c o d i n g o t - L - i d u r o n i d a s e (SEQ I DNOS:1 a n d 2 ) . N u c l e o t i d e s 1 t h r o u g h 6 2 0 0 a r ep r o v i d e d .Amino a c i d s a r e p r o v i d e ds t a r t i n g W i t h t h e ? r s t m e t h i o n i n e

i n t h e o p e n r e a d i n g f r a m e .F I G . 2 r e p r e s e n t s t h e r e s u l t s from SDS-PAGE r u n s o f

e l u a t e o b t a i n ed a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e s a s d e s c r i b e db e l o W. The t o p p a n e l shoWs t h e S D S - PA G E r e s u l t so fp u r i ? e d o t - L - i d u r o n i d a s e( 3 m i c r o g r a m s )a n d c o n t a m i n a n t sfrom t h e p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o n scheme d i s c l o s e d i nK a k k i s ,e t a l . ,P r o t e i n x p r ' .P u r i f .5 : 2 2 5 2 3 2( 1 9 9 4 ) . I n t h ebottom p a n e l , S D S - PA G E r e s u l t s o f p u r i ? e d o t - Li d u r o n i d a s e W i t h c o n t a m i n a n t sf r o m a n u n p u b l i s h e dp r i o rp r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o np r o c e s s ( U S . p a t e n t a p p l i c a t i o nS e r .N o s . 0 9 / 0 7 8 , 2 0 9and 0 9 / 1 7 0 , 9 7 7 )r e f e r r e d t o a s t h e C a r s o nm e t h o d i n L a n e s 2 ( 7 . 5m i c r o g r a mo t - L - i d u r o n i d a s e ) a n dL a n e 3 ( 5 . 0m i c r o g r a mo t - L - i d u r o n i d a s e ) a r ec o m p a r e dt ot h a to f t h e p r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o np r o c e s s o f t h e p r e s e n ti n v e n t i o n r e f e r r e d t o a s t h e G a l l i P r o c e s s ( L a n e 4 5 m i c r ograms o t - L - i d u r o n i d a s e ) . Lane 1 c o n t a i n s t h e m o l e c u l a rWe i g h t m a r k e r . F I G . 2 s h o W s t h a t t h e G a l l i p r o d u c t i o n /p u r i ? c a t i o n m e t h o do f t h ep r e s e n t i n v e n t i o n y i e l d s a h i g h l yp u r i ? e d o t - L - i d u r o n i d a s ep r o d u c t W i t hf e We r c o n t a m i n a n t si n c o m p a r i s o nWi t h p r i o rp r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o ns c h e m e s .

F I G S .3A3Bd e m o n s t r a t e st h e o t - i d u r o n i d a s e p r o d u c t i o nl e v e l o v e r a 30-day p e r i o d , d u r i n g Which t i m e c e l l s a r es W i t c h e d a t d a y 5 from a serumcontaining medium t o as e r u m - f r e e medium. o t - I d u r o n i d a s e p r o d u c t i o n Wa s c h a r a ct e r i Z e d b y : ( 1 )a b s e n c e o f a n e e d f o ra d a p t a t i o n When c e l l sa r e s W i t c h e d from s e r u m - c o n t a i n i n gt o s e r u m - f r e e m e d i u ma t 1 0 0 2 0 0( t o p a n d b o t t o m p a n e l s ) W i t h a n u n i n t e r r u p t e di n c r e a s ei n p r o d u c t i v i t y( t o p p a n e l ) ; ( 2 ) ah i g h l e v e lo fp r o d u c t i o n i n e x c e s s o f 4 mg e r l i t e r( 1 0 0 0 p e r m L ) i n ap r o t e i n - f r e emedium ( b o t t o m p a n e l ) ;a n d ( 3 ) a b o o s t i no t - i d u r o n i d a s e p r o d u c t i o n W i t h b u t y r a t e i n d u c t i o n e v e n t s( b o t t o mp a n e l ) .

F I G . 4 d e m o n s t r a t e s a d e c r e a s e i n l i v e r volume d u r i n genZyme t h e r a p y i n M P S p a t i e n t s .

8/10/2019 US 6,585,971-Jul 20

19/33

U S 6 , 5 8 5 , 9 7 1B15

F I G . 5 d e m o n s t r a t e s u r i n a r y GAG e x c r e t i o n d u r i n ge n z y m et h e r a p y .

F I G . 6 d e m o n s t r a t e s elbow and knee e x t e n s i o n i nHAC002 d u r i n g e n Z y m et h e r a p y .

F I G . 7 d e m o n s t r a t e s s h o u l d e r?exion o 104 Weeks i n f o u rp a t i e n t sW i t h t h em o s t r e s t r i c t i o nd u r i n g e n Z y m et h e r a p y .

F I G . 8 d e m o n s t r a t e si m p r o v e m e n ti n s l e e p a p n e a b e f o r ea n d a f t e rs i xWeeks o f t h e r a p y.

F I G . 9 d e m o n s t r a t e s t h e improvement i n a p n e a s a n dh y p o p n e a sd u r i n g s l e e pWi t h e n Z y m et h e r a p y i n e a c h i n d iv i d u a l p a t i e n t .

F I G . 1 0 d e m o n s t r a t e s t h e i m p r o v e m e n ti n p u l m o n a r yf u n c t i o n t e s t sb e f o r e and a f t e r 12 and 52 Weeks o f enZymet h e r a p y i n o n e p a t i e n t .

F I G . 1 1 d e m o n s t r a t e s i n c r e a s e d h e i g h t g r o W t hv e l o c i t yW i t h enZyme t h e r a p y .

F I G . 1 2 s h o W st h e d e g r e e o f c o n t a m i n a t i o nby C h i n e s eH a m s t e rO v a r y P r o t e i n (CHOP) a n d d e g r e e o f p u r i t yo fo t - L - i d u r o n i d a s e ,p r o d u c e db y ( 1 ) t h e C a r s o n m e t h o d ,a nu n p u b l i s h e d p r i o rp r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o np r o c e s s( U S .p a t e n t a p p l i c a t i o n S e r .N o s . 0 9 / 0 7 8 , 2 0 9a n d 0 9 / 1 7 0 , 9 7 7 a n d( 2 )t h eG a l l im e t h o d ,t h ep r o d u c t i o n / p u r i ? c a t i o np r o c e s s o ft h e p r e s e n t i n v e n t i o n . T h u s , F I G . 1 2 shoWs t h a t o t - Li d u r o n i d a s e p r o d u c e da n d p u r i ? e d b y t h eG a l l im e t h o dh a sa h i g h e r d e g r e e o f p u r i t y a n d l o We r d e g r e e o f CHOPc o n t a m i n a t i o ni n c o m p a r i s o nt o t h a t o f t h e C a r s o nm e t h o d .

DETAILED DESCRIPTION OF THEINVENTION

I n one a s p e c t , t h e p r e s e n t i n v e n t i o n f e a t u r e s a method t op r o d u c eo t - L - i d u r o n i d a s ei n a m o u n t s W h i c he n a b l e u s i n g t h e

enZyme t h e r a p e u t i c a l l y .I n g e n e r a l , t h e m e t h o d f e a t u r e st r a n s f o r m i n ga s u i t a b l e c e l ll i n eW i t h t h e cDNA n c o d i n gf o ra l l o f o t - L - i d u r o n i d a s e o r a b i o l o g i c a l l y a c t i v e fragment o rmutant t h e r e o f . Those o f s k i l li n t h e a r tm a y p r e p a r e e x p r e ss i o n c o n s t r u c t s o th e r t h a n t h o s e e x p r e s s l y d e s c r i b e d h e r e i nf o r o p t i m a l p r o d u c t i o no f o t - L - i d u r o n i d a s ei n s u i t a b l ec e l ll i n e s t r a n s f e c t e d t h e r e W i t h . M o r e o v e r ,s k i l l e d a r t i s a n s m a ye a s i l yd e s i g nf r a g m e n t s o f cDNA e n c o d i n g b i o l o g i c a l l ya c t i v ef r a g m e n t s a n d m u t a n t s o f t h e n a t u r a l l yo c c u r r i n go t - L - i d u r o n i d a s eWhich p o s s e s s t h e s a m e o r s i m i l a r b i o l o g ic a l a c t i v i t yt o t h e n a t u r a l l yo c c u r r i n gf u l l - l e n g t he n Z y m e .

To c r e a t e a r ecombinan t source f o r o t - L - i d u r o n i d a s e , al a r g e s e r i e so f e x p r e s s i o n v e c t o r s m a y b e c o n s t r u c t e d a n dt e s t e d f o r e x p r e s s i o n o f a o t - L - i d u r o n i d a s ec D N A . Based on

t r a n s i e n t t r a n s f e c t i o n experiments, a s Well a s s t a b l et r a n s f e c t i o n s , a n e x p r e s s i o n c o n s t r u c t m a y b e i d e n t i ? e d t h a tp r o v i d e s a p a r t i c u l a r l y h i g h l e v e l o f e x p r e s s i o n . I n o n eembodiment o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n , a C h i n e s e h a m s t e rc e l ll i n e2 . 1 3 1 d e v e l o p e db y t r a n s f e c t i o n o f t h eo t - L - i d u r o n i d a s ee x p r e s s i o n c o n s t r u c t a n d s e l e c t i o n f o r ah i g h e x p r e s s i o nc l o n e p r o v i d e s p a r t i c u l a r l yh i g h l e v e le x p r e s s i o n . S u c h aC h i n e s e h a m s t e rc e l l l i n ea c c o r d i n g t o t h i sembodiment o ft h e p r e s e n t i n v e n t i o n m a y s e c r e t e a b o u t 5 , 0 0 0 t o 7 , 0 0 0 f o l dmore o t - L - i d u r o n i d a s e t h a n n o r m a l . The o t - L - i d u r o n i d a s ep r o d u c e dt h e r e b y may b e p r o p e r l y p r o c e s s e d , t a k e nu p i n t oc e l l sW i t h h i g h a f ? n i t y a n d i s c o r r e c t i v e f o ro t - L - i d u r o n i d a s ed e ? c i e n t c e l l s ,s u c h a s t h o s e f r o m p a t i e n t s s u f f e r i n g f r o mH u r l e r sS y n d r o m e .

The method f o r p r o d u c i n g o t - L - i d u r o n i d a s e i n amountst h a t e n a b l e u s i n g t h e enZyme t h e r a p e u t i c a l l y f e a t u r e s ap r o d u c t i o n p r o c e s ss p e c i ? c a l l y d e s i g n e d t o m a s s p r o d u c ec o m m e r c i a l g r a d e e n Z y m e , W h e r e i n t h e q u a l i t y o f t h eenZyme h a s b e e n deemed a c c e p t a b l e f o r a d m i n i s t r a t i o n t ohumans b y r e g u l a t o r y a u t h o r i t i e so f v a r i o u s c o u n t r i e s .The

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6 5

6l a r g es c a l e p r o d u c t i o n o fc o m m e r c i a lg r a d e enZyme n e c e ss i t a t e sm o d i ? c a t i o n so f t h e c e l lc u l t u r e s c a l e ,m i c r o c a r r i e rs y s t e m s , a n d p u r i ? c a t i o n scheme. I n p r e f e r r e de m b o d i m e n t s ,t h e c e l lc u l t u r e s c a l e i s i n c r e a s e d f r o m 4 5l i t e r st o 110 l i t e r so r more, With a change t o continuous

p e r f u s i o n . The i n c r e a s e i n s c a l e i s n e c e s s a r y t o p r o d u c es u f ? c i e n t m a t e r i a l f o r p o t e n t i a l l a r g e s c a l ep r o d u c t i o n f o rl o n g t e r m p a t i e n t u s e .A c c o r d i n gt o p r e f e r r e d e m b o d i m e n t sof such a process, microcarriers a r e u s e d a s a l o W c o s ts c a l a b l e s u r f a c e on Which t o g r o W a d h e r e n t c e l l s .I n p a rt i c u l a r l yp r e f e r r e d e m b o d i m e n t s , s u c h m i c r o c a r r i e r s a r em a c r o p o r o u sa n d a r e s p e c i ? c a l l y composed o f modi?edc a r b o h y d r a t e ss u c h a s c e l l u l o s e , e . g . ,C y t o p o r e b e a d smanuf a c t u r e d b y P h a r m a c i a .M a c r o p o r o u sc e l l u l o s em i c r o c a r r i e r sa l l o Wi m p r o v e dc e l la t t a c h m e n ta n d p r o v i d e a l a r g e rs u r f a c ea r e a f o r a t t a c h m e n t , Which s e x p e c t e d t o y i e l d a n i n c r e a s e dc e l ld e n s i t y d u r i n g t h e c u l t u r ep r o c e s s . H i g h e rc e l ld e n s i t i e sa r e e x p e c t e d t o i n c r e a s e p r o d u c t i v i t y . I n p r e f e r r e de m b o d i m e n t s ,h e p a r i n - S e p h a r o s ea n d S e p h a c r y l 2 0 0 c o l

umns a r e r e p l a c e d W i t h B l u e - S e p h a r o s ea n d Copper c h e l a ti n g c o l u m n s t o i n c r e a s e t h e c a p a c i t y o f t h e l a r g es c a l ep u r i ? c a t i o n p r o c e s sa n d t o i m p r o v et h ep u r i t y o f t h ep r o d u c t .I n a p a r t i c u l a r l yp r e f e r r e d e m b o d i m e n t ,t h e c o p p e rc h e l a t i n gcolumn s u s e d t o r e d u c e C h i n e s e h a m s t e r o v a r yc e l lp r o t e i nc o n t a m i n a n t st o v e r y loW l e v e l s a p p r o p r i a t e f o r l a r g e s c a l ed i s t r i b u t i o n .U s i n g e m b o d i m e n t so f t h e p r e s e n t m e t h o df e a t u r i n g m o d i ? c a t i o n s a n d i n d u c t i o n d e s c r i b e d b e l o W,a p p r o x i m a te l y 1 5mg e r l i t e ro f c u l t u r e p e r d a y , o r more a tp e a k c u l t u r i n g d e n s i t y c a n b e p r o d u c e ds t a r t i n gW i t h a 1 1 0l i t e rc u l t u r e s y s t e m .

A c c o r d i n gt o o t h e r p r e f e r r e d e m b o d i m e n t so f t h e methodf o r p r o d u c i n g o t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n g t o t h e p r e s e n ti n v e n t i o n , a c u l t u r e sys tem i s o p t i m i Z e d . I n a ? r s t

e m b o d i m e n t ,t h e c u l t u r e p H s l o We r e dt o a b o u t 6 . 5 t o 7 . 0 ,p r e f e r a b l y t o a b o u t 6 . 7 7 . 0 d u r i n gt h ep r o d u c t i o n p r o c e s s .One a d v a n t a g e o f s u c h a p H i s t o e n h a n c e a c c u m u l a t i o n o flysosomal e n Z y m e s t h a t a r e more s t a b l e a t a c i d i c pH. I n asecond embodiment , a s m a n y a s 2 t o 3 . 5 c u l t u r e v o l u m e s o ft h emedium may b e c h a n g e dd u r i n g e a c h 2 4 - h o u rp e r i o d b yc o n t i n u o u sp e r f u s i o n . One a d v a n t a g eo f t h i sp r o c e d u r ei s t oenhance t h e s e c r e t i o n r a t e o f r e c o m b i n a n to t - L - i d u r o n i d a s eand t o c a p t u r e more a c t i v e enZyme. I n a t h i r d embodiment ,o x ygen s a t u r a t i o n i s o p t i m i Z e d a t a b o u t 40 . I n a f o u r t he m b o d i m e nt , m a c r o p o r o u sm i c r o c a r r i e r s W i t h a b o u t 5serum i n i t i a l l yi n t h e medium, a r e used t o produce a c e l lm a ss f o l l o W e d by a r a p i d Washout s h i f tt o a p r o t e i n - f r e emedium f o r p r o d u c t i o n ( F I G .3 ) . I n a ? f t h e m b o d i m e n t ,ap r o t e i n - f r e e g r o W t hmedium, s u c h a s a J R H B i o s c i e n c e sPF-CHO p r o d u c t , m a y e o p t i m i Z e dt o i n c l u d e s u p p l e m e n t a lamounts of one o r m o r e i n g r e d i e n t s s e l e c t e d f rom t h e groupc o n s i s t i n go f :g l u t a m a t e ,a s p a r t a t e ,g l y c i n e ,r i b o n u c l e o s i d e sand d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s .I n a s i x t h embodiment, a s m a n ya s 2 t o 3 . 5 c u l t u r e volumes o f t h e medium m a y be changedd u r i n g e a c h 2 4 - h o u rp e r i o d b y c o n t i n u o u sp e r f u s i o n .S u c han i n d u c t i o n p r o c e s s m a y p r o v i d e a b o u ta t W o - f o l d i n c r e a s ei n p r o d u c t i o n W i t h o u ts i g n i ? c a n t l y a l t e r i n g p o s tt r a n s l a t i o n a lp r o c e s s i n g .

P a r t i c u l a r l yp r e f e r r e d e m b o d i m e n t so f t h e m e t h o d f o rp r o d u c i n go t - L - i d u r o n i d a s ea c c o r d i n g t o t h ep r e s e n t i n v e nt i o n f e a t u r e o n e , more t h a n o n e , o r a l l o f t h e o p t i m i Z a t i o n sd e s c r i b e d h e r e i n and m a y b e e m p l o y e d a s d e s c r i b e d i n more

d e t a i lb e l o W. The p r o d u c t i o nmethod o f t h e p r e s e n t i n v e nt i o nm a y , t h e r e f o r e , p r o v i d e a p r o d u c t i o n c u l t u r e p r o c e s sh a v i n g t h ef o l l o Wi n gf e a t u r e s :

1 .A m i c r o c a r r i e r b a s e dc u l t u r e u s i n g m a c r o p o r o u sm i c r oc a r r i e r beads m a d e o f mo di ? ed c e l l u l o s e o r a n e q u i v a l e n tt h e r e o f i s p r e f e r a b l y u s e d i n l a r g e s c a l e c u l t u r e ? a s k s W i t h

8/10/2019 US 6,585,971-Jul 20

20/33

U S 6 , 5 8 5 , 9 7 1B17

o v e r h e a d s t i r r i n g o r a n e q u i v a l e n t t h e r e o f . Attachment o fc e l l s t o t h e s e b e a d s m a y b e a c h i e v e dby c u l t u r e i n a 5 e t a lbovine se rum may be added t o DME/F12 : 1 o r a p r o t e i nf r e e medium modi?ed W i t h i n g r e d i e n t s i n c l u d i n gr i b o n u c l e o s i d e s , d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s ,p y r u v a t e , n o n

e s s e n t i a l a m i n o a c i d s ,a n d HEPES. A f t e r a b o u t 3 6d a y s i nt h i s medium, a W a s h o u t p r o c e d u r e i s b e g u n i n W h i c hp r o t e i n - f r e emedium e p l a c e st h es e r u m - c o n t a i n i n gmediuma t a n i n c r e a s i n g p e r f u s i o n r a t e d e p e n d e n t on t h e g l u c o s ec o n t e n t a n d c u l t u r e c o n d i t i o n . S u b s e q u e n t l y ,a n d t h r o u g h o u tt h e e n t i r e r e m a i n i n g c u l t u r e p e r i o d , t h e c e l l sa r e c u l t i v a t e di n a p r o t e i n - f r e e medium. The u s e o f a p r o t e i n - f r e e mediumi n enZyme p r o d u c t i o ni s b e n e ? c i a l i n r e d u c i n g t h e e x p o s u r er i s ko f b o v i n e s p o n g i f o r me n c e p h a l o p a t h y( B S E )a n d o t h e ri n f e ct i o u s b i o l o g i c a g e n t s s u c h a s v i r u s e s t o p a t i e n t s b e i n gt r e a t e d W i t h t h e enZyme, Wherein t h e r i s k o f BSE r o t h e rh a r m f u l a g e n t s i s d e p e n d e n t on t h e amount o f p o t e n t i a ls e r u me x p o s u r e . I n p r i o r p u b l i s h e ds t u d i e s ,t h e c a r r i e r su s e dt o groW t h e c e l l s Were b o v i n e g e l a t i n m i c r o c a r r i e r s , u s e d a t

1 gram p e r l i t e r o r 100 t i m e s t h e p r o d u c t c o n c e n t r a t i o n .L e a c h i n go f 1 o f t h eg e l a t i np r o t e i n f r o m t h em i c r o c a r r i e r sWould r e p r e s e n t a r e l a t i v e1 0 0 c o n t a m i n a t i o na n d t h e r e b yc o n t r i b u t e t o t h e r i s k o f BSE. Thus, n e W c a r r i e r s a r e e i t h e rd e x t r a n o r c e l l u l o s e - b a s e d a n d c o n s i s t o f c a r b o h y d r a t e s , andn o t a n i m a l - d e r i v e dm a t e r i a l s .

F I G . 3 s h o W s t h a t t h e c e l l s a r e g r o W n t o a d e n s i t y i n 5serum c o n t a i n i n g medium a n d t h e n s W i t c h e dW i t h o u t anya d a p t a t i o n t o a p r o t e i n - f r e e medium. F I G . 3 s p e c i ? c a l l yshoWs t h a t :1 ) C e l l s s u r v i v e a n d c o n t i n u e t o p r o d u c e i d ur o n i d a s e When s h i f t e d W i t h o u ta d a p t a t i o n . I n c o n t r a s t , o t h e rs t u d i e s Would s u g g e s t t h a t a d a p t a t i o n t o a p r o t e i n - f r e emedium s n e c e s s a r y. I n t h e method o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n ,enZyme p r o d u c t i o nc o n t i n u e s a t l e v e l s c o m p a r a b l et o serum

c o n t a i n i n g m e d i u m . 2 ) o t - L - I d u r o n i d a s e p r o d u c e d i n ap r o t e i n - f r e e medium r e t a i n s a l e v e l o f p r o d u c t i o n i n e x c e s so f 4 mg e r l i t e ro r 1 , 0 0 0 u n i t s p e r m l . 3 ) o t - L - I d u r o n i d a s ep r o d u c e di n a p r o t e i n - f r e emedium h a s h i g h u p t a k ei n d i c a ti n g t h a tt h e s h i f ti n medium a n d , h e n c e , a s h i f ti n c a r b o h yd r a t e s b e i n g f e d t o c e l l s ,d o e s n o t a d v e r s e l y a f f e c tt h e h i g hu p t a k e c h a r a c t e r o f t h e e n Z y m e . E i g h t l o t s o f o t - Li d u r o n i d a s e h a v e been p r o d u c e da n d r e l e a s e d i n t h i smannerW i t h a n u p t a k eh a l f maximal v a l u e o f l e s s t h a n 2 nM n a l ll o t s .

2 . The c u l t u r e c o n d i t i o n s a r e p r e f e r a b l y maintained a t ad i s s o l v e d o x y g e n o f 40 o f a i r s a t u r a t i o n a t a pH f a b o u t6 . 8 7 . 0and a t a t e m p e r a t u r e o f a b o u t 3537 C . T h i s m a yb e a c h i e v e d u s i n ga c o n t r o l u n i t ,m o n i t o r i n gu n i t a n d a p p r o

p r i a t ep r o b e s s u c h a s t h o s e p r o d u c e d b y A p p l i k o n o rM e t t l e r . H o W e v e r ,s k i l l e da r t i s a n sW i l l r e a d i l ya p p r e c i a t et h a tt h i sc a n e a s i l y b e a c h i e v e d by e q u i v a l e n t c o n t r o l s y st e m s p r o d u c e dby o t h e r m a n u f a c t u r e r s .An a i r s a t u r a t i o n o fa b o u t 40 r e s u l t s i ni m p r o v e do t - L - i d u r o n i d a s e s e c r e t i o nt h o u g h u p t o 8 0 a i r s a t u r a t i o n m a y b e u s e d . HoWever,f u r t h e r i n c r e a s e s i n oxygen t o , f o r e x a m p l e , 9 0 a i rs a t u r a t i o n ,d o n o t p r o v i d e s i g n i ? c a n t l y e n h a n c e ds e c r e t i o no v e r 80 a i r s a t u r a t i o n . The d i s s o l v e d o x y g e n m a y bes u p p l i e d b y i n t e r m i t t e n t o r c o n t i n u o u s o x y g e n s p a r g i n gu s i n g a 5 micron s t a i n l e s s s t e e l o r l a r g e r o p e n i n gs p a r g e r , o re q u i v a l e n t t h e r e o f .ApH f a b o u t 6 . 8 7 . 0i s o p t i m a l f o rt h ea c c u m u l a t i o no f t h e o t - L - i d u r o n i d a s eenZyme. The enZymei s p a r t i c u l a r l y u n s t a b l e a t p H s a b o v e a b o u t 7 . 0 .BeloW a p Ho f a b o u t 6 . 7 ,t h e s e c r e t i o n r a t em a y d e c r e a s e , p a r t i c u l a r l ybeloW a pH f a b o u t 6 . 5 .The c u l t u r e i s t h e r e f o r e m a i n t a i n e do p t i m a l l y b e t W e e na p H o f a b o u t 6 . 8 7 . 0 .

3 . The p r o d u c t i o n c u l t u r e medium m a y b e a modi?edf o r m o f t h e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e p r o p r i e t a r y mediumfrom JR i o s c i e n c e s c a l l e d E x c e l l P F CHO. T h i s medium

10

1 5

20

25

30

35

40

45

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55

60

6 5

8s u p p o r t s l e v e l s o f s e c r e t i o n e q u i v a l e n t t o t h a t o f serum u s i n ga c e l l l i n e such a s t h e 2 . 1 3 1 c e l l l i n e .I t m a y be p r e f e r a b l ymodi?ed t o i n c l u d e a n a c i d i c p H o f a b o u t 6 . 8 7 . 0( 1 0 . 1 ) ,and b u f f e r e d With HEPES t 7 . 5 mM r 15 mM. he m e d i u mm a y c o n t a i n 0 . 0 5 t o 0.1 o f P l u r o n i c s F - 6 8 (BASF), a

n o n - i o n i c s u r f a c t a n t o r a n e q u i v a l e n t t h e r e o f Which f e a t u r e st h e a d v a n t a g eo f p r o t e c t i n g c e l l sf r o m s h e a r f o r c e s a s s o c ia t e d W i t h s p a r g i n g . The medium m a y f u r t h e r c o n t a i n ap r o p r i e t a r ys u p p l e m e n tt h a ti s i m p o r t a n t i n i n c r e a s i n gt h ep r o d u c t i v i t y o f t h e medium o v e r o t h e r p r o t e i n - f r e e mediat h a t a r e p r e s e n t l y a v a i l a b l e . Those s k i l l e d i n t h e a r t Wi l lr e a d i l y u n d e r s t a n d t h a t t h e c h o i c e o f c u l t u r e medium m a y b eo p t i m i Z e dc o n t i n u a l l ya c c o r d i n g t o p a r t i c u l a rc o m m e r c i a le m b o d i m e n t sa v a i l a b l e a t p a r t i c u l a r p o i n t s i n t i m e . S u c hc h a n g e s encompass no more t h a n r o u t i n e e x p e r i m e n t a t i o nand a r e i n t e n d e d t o be W i t h i n t h e s c o p e o f t h e p r e s e n ti n v e n t i o n .

4 . The p r o d u c t i o n medium m a y b e a n a l y Z e d u s i n g a na m i n oa c i da n a l y Z e rc o m p a r i n gs p e n t medium Wi t h s t a r t i n gmedium. Such a n a l y s e s h a v e d e m o n s t r a t e dt h a tt h e 2 . 1 3 1c e l ll i n ed e p l e t e s a s t a n d a r d P F CHO medium o f g l y c i n e ,g l u t a m a t e a n d a s p a r t a t e t o a l e v e l o f a r o u n d 1 0 o f t h es t a r t i n gc o n c e n t r a t i o n . S u p p l e m e n t a t i o no f t h e s e a m i n oa c i d s t o h i g h e r l e v e l s m a y e s u l ti n e n h a n c e dc u l t u r e d e n s i t ya n d p r o d u c t i v i t y t h a tm a y l e a d t o a 23 f o l d h i g h e r p r o d u ct i o n t h a n a t b a s e l i n e . S k i l l e d a r t i s a n s Wi l l a p p r e c i a t e t h a to t h e r c e l ll i n e s W i t h i n t h e s c o p e o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n m a yb e e q u a l l y u s e f u l f o rp r o d u c i n go t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n gt o t h e p r e s e n t m e t h o d . Hence, more o r l e s s s u p p l e m e n t a ln u t r i e n t s m a y b e r e q u i r e d t o o p t i m i Z e t h e medium. Sucho p t i m i Z a t i o n s a r e i n t e n d e d t o be W i t h i n t h e s c o p e o f t h ep r e s e n t i n v e n t i o n a n d m a y b e p r a c t i c e d W i t h o u t u n d u ee x p e r i m e n t a t i o n .

5 . The medium m a y b e s u p p l e m e n t e dW i t h t h e f o u rr i b o n u c l e o s i d e s a n d f o u r d e o x y r i b o n u c l e o s i d e s e a c ha ta b o u t 1 0 m g / l i t e r t o s u p p o r t t h e d i h y d r o f o l a t e r e d u c t a s ed e ? c i e n t c e l ll i n e2 . 1 3 1 . S k i l l e d a r t i s a n s Wi l l a p p r e c i a t e t h a to t h e r c e l ll i n e s W i t h i n t h e s c o p e o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n m a yb e e q u a l l y u s e f u l f o rp r o d u c i n go t - L - i d u r o n i d a s e a c c o r d i n gt o t h e p r e s e n t method. H ence, more o r l e s s r i b o n u c l e o s i d e sa n d d e o x y r i b o n u c l e o s i d e sm a y b e r e q u i r e d t o o p t i m i Z et h emedium, a n d a l t e r n a t i v es o u r c e s o f p u r i n e sa n d p y r m i d i n e sf o r n u c l e i c a c i d s y n t h e s i s m a y b e u s e d s u c h a s h y p o x a n t h i n ea n d t h y m i d i n e . Such o p t i m i Z a t i o n sa r e i n t e n d e d W i t h i n t h es c o p e o f t h e p r e s e n t i n v e n t i o n a n d m a y b e p r a c t i c e d W i t h o u tu n d u e e x p e r i m e n t a t i o n .

6 . A f t e r r e a c h i n gc o n ? u e n c ea t a b o u t 3 6d a y s o f c u l t u r e ,

a n i n c r e a s i n g r a t e o f c o n t i n u o u s p e r f u s i o n i s i n i t i a t e d .Ac h a n g eo f medium may b e a c c o m p l i s h e d ,f o re x a m p l e ,u s i n ga s l a n t f e e d t u b e c o n s t r u c t e d and p o s i t i o n e d t o a l l o W t h eu p t a k eo f medium W i t h o u tremoval o f t h e m i c r o c a r r i e r s e v e nW h i l e t h ec u l t u r e i s s t i r r e d .B y pumping o u t medium t h r o u g ht h e s l a n tf e e d t u b e , m i c r o c a r r i e r s s e t t l eWi t h i n t h e body o ft h e t u b e i n s i d e t h e c u l t u r e and a r e n o t r em oved f rom t h ec u l t u r e d u r i n g t h e c h a n g e o n medium. I n t h i sm a n n e r , t h em i c r o c a r r i e r s W i t h t h e c e l l m a s s a r e s e p a r a t e d from s u p e rn a t a n t c o n t a i n i n g t h e e n Z y m e .

7 . The r a p i d a n d f r e q u e n t t u r n o v e r o f t h e medium h a sb e e n shoWn b y p r o d u c t i v i t y s t u d i e s t o r e s u l ti n i m p r o v e do v e r a l l c o l l e c t i o n o f enZyme from t h e c e l l c u l t u r e . L e s st u r n o v e r o f medium r e s u l t s i n l e s st o t a lp r o d u c t i o n o fenZyme on a d a i l y b a s i s . U s i n g t h e p e r f u s i o n o f 2 3 . 5c u l t u r e volumes p e r d a y, t h e c e l l sm a y b e m a i n t a i n e d i ne x c e l l e n t c o n d i t i o nW i t h h i g hd e g r e e s o fv i a b i l i t ya n d a h i g hl e v e lo f p r o d u c t i v i t y .

8 . P r o d u c t i o no f o t - L - i d u r o n i d a s em a y b e e n h a n c e dby t h eu s e o f s o d i u mb u t y r a t e i n d u c t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n ( F I G .

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