Usporedba metoda analize krivulje taljenja visokerezolucije (HRM) i krivulje taljenja pomoću FREThibridizacijskih proba za detekciju insercije TA upromotoru gena UGT1A1
Jirouš, Maja
Undergraduate thesis / Završni rad
2017
Degree Grantor / Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj: Josip Juraj Strossmayer University of Osijek, Faculty of Medicine / Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku, Medicinski fakultet
Permanent link / Trajna poveznica: https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:152:584406
Rights / Prava: In copyright
Download date / Datum preuzimanja: 2021-11-28
Repository / Repozitorij:
Repository of the Faculty of Medicine Osijek
SVEUČILIŠTE JOSIPA JURJA STROSSMAYERA U OSIJEKU
MEDICINSKI FAKULTET OSIJEK
Preddiplomski sveučilišni studij medicinsko laboratorijske
dijagnostike
Maja Jirouš
USPOREDBA METODA ANALIZE
KRIVULJE TALJENJA VISOKE
REZOLUCIJE (HRM) I KRIVULJE
TALJENJA POMOĆU FRET
HIBRIDIZACIJSKIH PROBA ZA
DETEKCIJU INSERCIJE TA U
PROMOTORU GENA UGT1A1
Završni rad
Osijek, 2017.
SVEUČILIŠTE JOSIPA JURJA STROSSMAYERA U OSIJEKU
MEDICINSKI FAKULTET OSIJEK
Preddiplomski sveučilišni studij medicinsko laboratorijske
dijagnostike
Maja Jirouš
USPOREDBA METODA ANALIZE
KRIVULJE TALJENJA VISOKE
REZOLUCIJE (HRM) I KRIVULJE
TALJENJA POMOĆU FRET
HIBRIDIZACIJSKIH PROBA ZA
DETEKCIJU INSERCIJE TA U
PROMOTORU GENA UGT1A1
Završni rad
Osijek, 2017.
Rad je ostvaren u Laboratoriju za molekularnu dijagnostiku i tipizaciju tkiva Odjela
laboratorijske dijagnostike i kliničke transfuzijske medicine Kliničkog zavod za transfuzijsku
medicinu Kliničkog bolničkog centra Osijek.
Mentor rada: doc.dr.sc Saška Marczi
Rad ima 34 lista, 4 tablice i 7 slika.
Zahvala
Zahvaljujem mentorici, doc.dr.sc. Saški Marczi na velikodušnoj pomoći, savjetima i
usmjeravanju tijekom izrade završnog rada.
Veliko hvala mojoj obitelji, posebno roditeljima, na pruženoj podršci, razumijevanju i
omogućenom školovanju.
SADRŽAJ
POPIS KRATICA .................................................................................................................... I
1. UVOD ................................................................................................................................... 1
1.1. Bilirubin-UDP-glukuronozil transferaza ........................................................................ 1
1.2. Gen UGT1A1 .................................................................................................................. 2
1.3. Značaj određivanja insercije TA u promotoru gena UGT1A1 ........................................ 3
1.4. Metodologija lančane reakcije polimerazom u stvarnom vremenu (Real-Time PCR) ... 4
1.4.1. Metoda analize krivulje taljenja visoke rezolucije (HRM) .................................... 6
1.4.2. Metoda analize krivulje taljenja pomoću FRET hibridizacijskih proba ................ 7
2. CILJ ISTRAŽIVANJA ....................................................................................................... 9
3. ISPITANICI I METODE ................................................................................................. 10
3.1. Ustroj istraživanja ......................................................................................................... 10
3.2. Ispitanici ........................................................................................................................ 10
3.3. Metode .......................................................................................................................... 10
3.3.1. Izolacija DNA ...................................................................................................... 11
3.3.2. Mjerenje koncentracije DNA ............................................................................... 12
3.3.3. HRM .................................................................................................................... 12
3.3.4. FRET .................................................................................................................... 14
3.3.5. Elektroforeza DNA u agaroznom gelu ................................................................ 17
3.3.6. Statističke metode ................................................................................................ 17
4. REZULTATI ..................................................................................................................... 18
4.1. HRM ............................................................................................................................. 18
4.2. FRET ............................................................................................................................. 22
4.3. Usporedbe karakteristika Real-time PCR metoda HRM i FRET ................................. 25
5. RASPRAVA ....................................................................................................................... 27
6. ZAKLJUČAK .................................................................................................................... 29
7. SAŽETAK .......................................................................................................................... 30
8. SUMMARY ........................................................................................................................ 31
9. LITERATURA .................................................................................................................. 32
10. ŽIVOTOPIS ..................................................................................................................... 34
I
POPIS KRATICA
Ct eng. threshold cycle
Cp eng. crossing point
CNI Crigler-Najjarov sindrom, tip I
CNII Crigler-Najjarov sindrom, tip II
DNA deoksiribonukleinska kiselina (eng. deoxyribonucleic acid)
dATP deoksiadenozin trifosfat
dTTP deoksitimidin trifosfat
dCTP deoksicitidin trifosfat
dGTP deoksigvanozin trifosfat
dsDNA dvolančana deoksiribonukleinska kiselina (eng. double-stranded DNA)
EDTA etilendiamintetraoctena kiselina (eng. ethylenediaminetetraaceticacid)
FRET prijenos energije fluorescentnom rezonancijom (eng. fluorescence resonance
energy transfer)
HRM analiza krivulje taljenja visoke rezolucije (eng. high resolution melting)
KBC Klinički bolnički centar
PCR lančana reakcija polimerazom (eng. polymerase chain reaction)
RNA ribonukleinska kiselina (eng. ribonucleic acid)
TA timin-adenin
Tm temperatura taljenja (eng. melting temperature)
SNP polimorfizam jednog nukleotida (eng. single nucleotide polymorphism)
UDP uridin difosfat
UGT uridin difosfat glukuronozil transferaza (eng. uridine diphosphate-glucuronosyl
transferase)
Uvod
1
1. UVOD
1.1. Bilirubin-UDP-glukuronozil transferaza
UDP-glukuronozil transferaze (UGT) predstavljaju porodicu enzima membrane
endoplazmatskog retikuluma koji kataliziraju proces glukuronidacije, reakciju faze II
metabolizma lijekova u jetri. Glukuronidacija je proces tijekom kojeg se odvija prijenos kisele
glukuronske skupine s uridin difosfoglukuronske kiseline na funkcionalne skupine specifičnih
supstrata, čime se povećava polarnost ciljne lipofilne molekule te se omogućuje njeno
izlučivanje iz organizma putem žuči ili urina. Jetra je glavni organ u kojem se odvija proces
glukuronidacije, a osim u jetri, UGT-i su lokalizirani i u crijevima, bubrezima, plućima te
drugim tkivima i organima. Osim što sudjeluje u detoksifikaciji lijekova, glukuronidacijom se
smanjuje i štetan utjecaj okolišnih otrova, karcinogena, toksina iz prehrane, te se postiže
održavanje homeostaze endogenih molekula kao što su bilirubin, masne kiseline, steroidni
hormoni i žučne kiseline (1).
UGT-i su građeni od dviju podjednako velikih N- i C- terminalnih domena. C-
terminalna domena zajednička je svim UGT-ima; sadrži transmembransku uzvojnicu, koja
služi za usidravanje enzima u membranu, te vezno mjesto za UDP-glukuronsku kiselinu. N-
terminalna domena sadrži vezno mjesto za supstrate te se zbog toga razlikuje među UGT-ima
(2). Iako se N-terminalne domene razlikuju, često je moguće da jedna molekula bude supstrat
više različitih UGT-a. Za razliku od toga, glukuronidaciju bilirubina katalizira jedino
bilirubin-UDP-glukuronozil transferaza (bilirubin-UGT) (3,4). Bilirubin je tvar žućkastog
pigmenta koja nastaje razgradnjom hema, a ako se u organizmu nalazi u visokim
koncentracijama ima toksičan učinak. Pomoću bilirubin-UDP-glukuronozil transferaze
bilirubin prelazi iz slobodnog, nekonjugiranog oblika u konjugirani, polarniji oblik, koji se
lako izlučuje iz organizma. Ukoliko se bilirubin ne konjugira te se nakuplja u krvi
(hiperbilirubinemija) dolazi do žutice, tj. ikterusa, stanja koje karakterizira žućkasto obojenje
kože i bjeloočnica. Reakcija glukuronidacije bilirubina stoga je vrlo važna jer visoke
koncentracije nekonjugiranog bilirubina mogu imati štetan utjecaj na mozak. Nekoliko
mutacija u genu za bilirubin-UGT uzrokuju nastanak nefunkcionalnog enzima, zbog čega se
kod pacijenata javljaju povišene razine bilirubina u krvi. Među stanjima koja se povezuju s
mutacijama u genu za bilirubin-UGT važno je spomenuti Crigler-Najjarov sindrom, tip I i II
te Gilbertov sindrom. Crigler-Najjarov sindrom rijedak je autosomno recesivni poremećaj koji
može biti posljedica najmanje 85 različitih mutacija. Sindrom može imati letalan ishod ako
dođe do oštećenja mozga zbog nakupljanja nekonjugiranog bilirubina u mozgu, što se naziva
Uvod
2
kernikterus. Klinička slika Crigler-Najjar sindroma I (CNI) teža je od Crigler-Najjar sindroma
II (CNII) jer je kod CNI funkcija enzima izgubljena u potpunosti, dok je kod CNII očuvano
do 20% enzimatske aktivnosti (4,5). Gilbertov sindrom je blaga nasljedna hiperbilirubinemija
s 6-12%-tnom pojavnošću u populaciji, a nastaje kao posljedica smanjene konjugacije
bilirubina u jetri (1). Insercija TA u promotoru gena UGT1A1 mutacija je koja dovodi do
Gilbertovog sindroma, ukoliko je naslijeđena na oba alela. Kod pacijenata s Gilbertovim
sindromom očuvano je oko 30% aktivnosti bilirubin-UDP-glukuronozil transferaze, te se
stoga javljaju povremene faze blage hiperbilirubinemije koje rijetko dovode do žutice.
Povišene razine bilirubina prisutne su kada je organizam u stanju stresa koji može biti izazvan
dehidracijom, teškom fizičkom aktivnošću, menstruacijom, dužim gladovanjem ili bolešću
(5,6).
1.2. Gen UGT1A1
UGT1A1 gen kodira istoimeni UGT1A1 enzim, tj. bilirubin-UDP-glukuronozil
transferazu. UGT1A1 dio je superobitelji UGT gena koja sadrži UGT1 i UGT2 obitelji te
UGT1A, UGT2A i UGT2B podobitelji. Lokus podobitelji UGT1A nalazi se na dužem kraku 2.
kromosoma (2q37), obuhvaća 210 kb te sadržava kodirajuće sekvence za 9 različitih UGT1A
enzima; UGT1A1, UGT1A3–UGT1A10 (Slika 1). Lokus je građen od ukupno 17 egzona, od
kojih 4 egzona (egzoni 2, 3, 4, 5) sudjeluju u izgradnji svakog UGT1A enzima. Od preostalih
13 egzona, njih 9 sudjeluju u izgradnji funkcionalnog proteina, dok ostalih 4 egzona
predstavljaju pseudogene. Da bi došlo do sinteze proteina, za svaki UGT potreban je jedan od
9 „prvih“ egzona te 4 nizvodna egzona (egzoni 2, 3, 4 i 5) koji su zajednički svim UGT1A
enzimima. „Prvi“ egzoni kodiraju N-terminalnu domenu enzima, dok zajednički egzoni 2-5
kodiraju C-terminalnu domenu (2).
Poznato je nekoliko polimorfizama gena UGT1A1, među kojima se ističu
polimorfizmi u promotorskoj regiji koji utječu na efikasnost transkripcije. UGT1A1*1 je divlji
tip alela (eng. wild-type), sadrži 6 TA (timin-adenin) ponavljanja u TATA box-u promotorske
regije (slijed A(TA)6TAA) te je povezan s normalnom aktivnošću enzima. UGT1A1*28,
najčešća polimorfna varijanta sa 7 TA ponavljanja (A(TA)7TAA), nastaje insercijom TA u
TATA box-u promotorske regije gena UGT1A1. Zbog insercije TA u promotorskoj regiji gena
UGT1A1 smanjena je brzina inicijacije transkripcije gena, što dovodi do slabije aktivnosti
enzima i smanjenja glukuronidacije na 30% u odnosu na divlji tip alela. Ukoliko je varijanta
Uvod
3
UGT1A1*28 naslijeđena na oba alela (UGT1A1 7/7 genotip), nastaje Gilbertov sindrom, koji
se definira kao blaga nasljedna hiperbilirubinemija. Rjeđe varijante gena prisutne u osoba
afričkog podrijetla su UGT1A1*37 i UGT1A1*36. UGT1A1*36 sadrži 8 TA ponavljanja, zbog
čega je inicijacija transkripcije još manje učinkovita, a aktivnost enzima smanjena za čak
50%, za razliku od UGT1A1*37 varijante koja sadrži 5 TA ponavljanja te ima povećanu
promotorsku aktivnost. U osoba azijskog podrijetla mutacije u promotorskoj regiji vrlo su
rijetke. Najčešća mutacija u azijskoj populaciji je missense mutacija u jednoj kopiji UGT1A1
gena koja rezultira zamjenom glicina argininom na 71. položaju u enzimu bilirubin-UGT (1).
Slika 1. Struktura gena UGT1A.
1.3. Značaj određivanja insercije TA u promotoru gena UGT1A1
Glukuronidacija, kao jedna od glavnih reakcija faze II metabolizma lijekova u jetri,
predstavlja važan korak u biotransformaciji lijekova (1). Brojni lijekovi metaboliziraju se
putem glukuronidacije enzimom bilirubin-UGT. Zbog reducirane aktivnosti enzima, koja se
javlja kao posljedica insercije TA u promotoru gena UGT1A1, metabolizam lijekova je
usporen te je moguća pojava toksičnog učinka lijeka na organizam. Neki od lijekova koji se
metaboliziraju bilirubin-UGT-om su: paracetamol, tolbutamid i lorazepam (1). Veliku
pozornost privukao je protutumorski lijek irinotekan koji kod pacijenata s Gilbertovim
sindromom izaziva teške nuspojave.
Irinotekan se koristi u liječenju metastatskog kolorektalnog karcinoma, često u
kombinaciji s ostalim lijekovima, a nešto rjeđe koristi se i u liječenju karcinoma pluća,
želudca i ginekoloških tumora (7). Metabolizam i inaktivacija irinotekana odvijaju se putem
bilirubin-UDP-glukuronozil transferaze, a s obzirom da je kod homozigota za gen
UGT1A1*28 aktivnost enzima smanjena, povećan je rizik od toksičnosti terapije
Uvod
4
irinotekanom. Naime, nakon intravenozne injekcije, irinotekan se metabolizira u aktivni oblik
SN-38, koji ima 100-1000 puta potentnije djelovanje. SN-38 veže se za kompleks DNA i
topoizomeraze, čime nastaje tzv. trojni kompleks (SN-38-topoizomeraza-DNA) koji
zaustavlja kretanje „replikacijskih rašlji“. Zbog sprječavanja replikacije DNA i interakcije
između replikacijskih enzima i trojnog kompleksa dolazi do dvolančanog loma unutar DNA, a
posljedično tome do apoptoze stanice. SN-38 inaktivira se glukuronidacijom u jetri, postaje
topljiv u vodi te se najvećim dijelom izlučuje putem žuči, a oko 30% izlučuje se urinom. Kod
bolesnika s Gilbertovim sindromom irinotekan uzrokuje teške proljeve i neutropenije, zbog
čega samo liječenje irinotekanom može postati razlog duljoj hospitalizaciji. Upravo zbog toga
vrlo je važno otkriti pacijente koji imaju TA inserciju u promotoru gena UGT1A1 kako bi se
lijek pravilno dozirao i izbjegao toksičan učinak lijeka. Prema preporuci FDA (Food and Drug
Administration) i KNMP (Dutch Pharmacogenomics Working Group) doze irinotekana veće
od 250 mg/m2 potrebno je smanjiti za 30% kod homozigota za gen UGT1A1*28, dok
prilagođavanje doze za heterozigote nije potrebno jer bi smanjivanje doze moglo uzrokovati
neuspjeh u liječenju (3).
1.4. Metodologija lančane reakcije polimerazom u stvarnom vremenu (Real-Time PCR)
Lančana reakcija polimerazom, tj. PCR (eng. polymerase chain reaction) metoda je
kojom se in vitro umnaža određeni fragment DNA te pritom nastaje velik broj kopija tog
fragmenta DNA. PCR je otkrio i opisao Kary Mullis 1983. godine te je za to otkriće 1993.
godine dobio Nobelovu nagradu za kemiju. Otkriće PCR-a imalo je vrlo značajnu ulogu u
razvitku molekularne dijagnostike te se danas rad bez PCR-a u laboratoriju za molekularnu
dijagnostiku gotovo ne može ni zamisliti. Razvitkom PCR-a tijekom godina nastale su mnoge
napredne inačice, među kojima je vrlo važna Real-Time PCR, tj. lančana reakcija
polimerazom u stvarnom vremenu. Real-Time PCR temelji se na klasičnoj PCR reakciji, a
njegova prednost je u kvantifikaciji PCR produkata za vrijeme procesa umnažanja. S obzirom
da Real-Time PCR ne zahtijeva kasnije metode detekcije i kvantifikacije, kao što je gel
elektroforeza, brža je i preciznija metoda.
Za svaku PCR reakciju potreban je uzorak DNA, sva 4 deoksinukleotida (dATP,
dTTP, dCTP, dGTP), termostabilna Taq polimeraza, dvije početnice (eng. primer), ioni
magnezija (MgCl2) te reakcijski pufer. Real-Time PCR zahtijeva i fluorescentne boje ili
fluorescentno obilježene oligonukleotidne probe jer se kvantifikacija produkata temelji na
Uvod
5
kontinuiranom mjerenju njihove fluorescencije. Za razliku od klasične PCR metode koja se
odvija u tzv. PCR termoblokovima, Real-Time PCR zahtijeva specijalizirane Real-Time
uređaje koji, osim termobloka u kojem se odvija reakcija, imaju i sustav optičkih detektora
koji mjere fluorescenciju te računalni program za interpretaciju rezultata. Metoda započinje
zagrijavanjem na temperaturu od 94°C, pri čemu dolazi do denaturacije DNA. Zatim se
temperatura snižava na 50-60°C kako bi se početnice vezale za komplementarni slijed DNA
na 5' i 3' krajevima fragmenta od interesa. Formulom Tm = 4 x(nG + nC) + 2 x(nA + nT) (n-
broj nukleotida početnice) određuje se temperatura ispod koje dolazi do komplementarnog
vezanja početnica na kalup DNA. U PCR reakciji za sintezu DNA najčešće se koristi
termostabilna Taq polimeraza dobivena iz mikroorganizma Thermus aquaticus. Nakon
vezanja početnica temperatura se podiže na 72°C jer je to temperatura pri kojoj Taq
polimeraza ima optimalnu aktivnost. Nakon umnažanja željenog odsječka DNA opet dolazi
do denaturacije, tj. ciklus se ponavlja, s time da nakon svakog ciklusa PCR smjesa sadržava 2n
kopija DNA, pri čemu n označava broj ciklusa. Ukoliko se u Real-Time PCR reakciji koristi
fluorescentna boja ona će se vezati za DNA kada se nalazi u dvolančanom obliku, dok će se
fluorescentno obilježene probe vezati za komplementarni slijed jednolančane DNA. Emitirana
svjetlost fluorescentnih molekula mjeri se tijekom cijele reakcije, s time da povećanje
fluorescencije odgovara povećanju broja umnoženih produkata. Prosječna PCR reakcija
odvija se u 30-40 ciklusa, odnosno sve do postizanja tzv. plato faze kada PCR reakcija više
nije efikasna. Četiri su faze PCR reakcije: osnovna (bazna), eksponencijalna, linearna i plato
(Slika 2). U prvoj, baznoj fazi uočava se samo pozadinski signal zbog nedovoljnog broja
produkata. Eksponencijalna faza koja slijedi prva je koja jasno prikazuje umnožavanje
odsječaka DNA. Redni broj ciklusa tijekom kojeg započinje vizualizacija amplifikacije
produkata, tj. ciklus kojim započinje eksponencijalna faza označava se kao Ct (eng. threshold
cycle) ili Cp (eng. crossing point) vrijednost. Amplifikacija se u eksponencijalnoj fazi odvija
najvećom brzinom te u svakom ciklusu dolazi do udvostručavanja produkata. Kako se
reagensi troše, reakcija usporava, ne dolazi do udvostručavanja produkata u svakom ciklusu te
je reakcija u linearnoj fazi. Slijedi plato faza, koje je konačna, jer su reagensi potrošeni i
reakcija više ne napreduje (8).
Osim što omogućuje preciznu kvantifikaciju broja kopija DNA/RNA u uzorku, Real-
Time-PCR koristi se za kvantifikaciju ekspresije gena, određivanje varijacija u broju kopija,
SNP (eng. single nucleotide polymorphism) genotipizaciju, detekciju patogena te ima brojne
druge primjene. U Real-Time PCR metodi koriste se različite oligonukleotidne probe i
principi na temelju kojih se stvara fluorescentni signal. Najčešće korištene su probe koje se
Uvod
6
temelje na FRET reakciji, TaqMan, Molecular beacon te Scorpion probe. Analiza svojstava
PCR produkata temelji se na krivulji taljenja koja se dobiva obradom fluorescentnog signala
molekula kojima su probe obilježene. Za kvantifikaciju produkata i analizu njihovih svojstava
koriste se i interkalirajuće fluorscentne boje koje izrazito fluoresciraju kada su vezane za
dvostruku uzvojnicu DNA te se one primjenjuju u HRM metodi, tj. analizi krivulje taljenja
visoke rezolucije.
Slika 2. Krivulja PCR reakcije
1.4.1. Metoda analize krivulje taljenja visoke rezolucije (HRM)
Analiza krivulje taljenja visoke rezolucije (HRM, eng. high resolution melting) je
metoda koja se zbog svoje preciznosti, u odnosu na klasične metode analize krivulje taljenja,
sve više koristi u genotipizaciji. HRM omogućuje preciznu detekciju promjene slijeda
nukleotida unutar određenog fragmenta DNA, bez korištenja obilježenih proba.
Metoda započinje umnažanjem određenog fragmenta DNA pomoću PCR reakcije, u
prisutnosti fluorescentne boje koja ima svojstvo vezanja na dvolančanu DNA. SYBR® Green,
LCGreen (Roche LightCycler®), SYTO
® i EvaGreen
® neke su od boja koje se primjenjuju u
HRM metodi, a sve se temelje na svojstvu da se specifično vežu za dvostruku DNA uzvojnicu
te tako vezane jako fluoresciraju. Nakon PCR-a produkt se postepeno tali povišenjem
temperature, a emitirana fluorescencija, odnosno pad fluorescencije, mjeri se kako bi u
konačnici nastala krivulja karakteristična za amplikon. Na početku analize, pri nižim
temperaturama, fluorescencija je visoka jer se DNA nalazi u obliku dvostruke uzvojnice na
koju je čvrsto vezana fluorescentna boja. Povišenjem temperature dolazi do denaturacije DNA
te disocijacije boje, koja u nevezanom stanju vrlo slabo fluorescira, zbog čega se
fluorescencija smanjuje za čak 1000 puta. Pad fluorescencije na početku je blag, sve do
denaturacije dsDNA, tj. do postizanja temperature taljenja (Tm), kada se očituje nagli pad
Uvod
7
fluorescencije. Temperatura taljenja je točka pri kojoj je 50% DNA dvostruko zavijeno, a
preostalih 50% nalazi se u obliku jednostruke DNA. Na temelju razlika u Tm i obliku krivulje
taljenja, moguće je razlikovati mutirani od divljeg (wild-type) tipa alela te homozigote od
heterozigota. Prvotno nastala krivulja taljenja prikazuje odnos fluorescencije i temperature, tj.
pad fluorescencije uslijed povišenja temperature. Da bi se temperatura taljenja preciznije
prikazala te lakše uočile razlike između pojedinih genotipova, računalni program vrši
normalizaciju početne krivulje, promjenu po temperaturi (eng. temperature shift) i izračunava
negativnu derivaciju fluorescencije po temperaturi te u konačnici nastaje specifična krivulja
koja se koristi za analizu (9-12) (Slika 3).
1.4.2. Metoda analize krivulje taljenja pomoću FRET hibridizacijskih proba
U Real-Time PCR metodologiji često se za detekciju mutacija i polimorfizama koriste
FRET (eng. fluorescence resonance energy transfer) hibridizacijske probe (Slika 4). FRET
predstavlja kvantni fenomen pri kojem između dviju fluorescentnih molekula dolazi do
prijenosa energije bez emisije fotona. U FRET reakciji prva fluorescentna molekula (donor)
biva pobuđena svjetlošću određene valne duljine, te tako pobuđena fluorescira, odnosno
emitira svjetlost veće valne duljine, koja pobuđuje drugu fluorescentnu molekulu (akceptor).
Da bi FRET reakcija bila moguća, dvije fluorescentne molekule moraju biti u neposrednoj
blizini, na udaljenosti od 1 do 10 nm. Također, vrlo je važan kriterij da se emisijski spektar
donora preklapa s apsorpcijskim spektrom akceptora (13, 14). Za detekciju promjena slijeda
baza unutar DNA koriste se dvije oligonukleotidne probe obilježene fluorescentnim
molekulama. Svaka proba komplementarna je određenom slijedu DNA, a nakon
komplementarnog vezanja nalaze se u neposrednoj blizini, u razmaku od 1-5 nukleotida,
kako bi se mogao odviti FRET. Jedna proba obilježena je na 3' kraju fluoresceinom (anchor
proba), dok je druga proba na 5' kraju obilježena akceptorskom bojom (sensor proba).
Fluorescein na anchor probi apsorbira svjetlost vanjskog izvora te svjetlošću koju emitira
pobuđuje akceptorsku boju na sensor probi, koja pak emitira svjetlost koju detektira optički
sustav Real-Time PCR uređaja. Anchor proba veže se za onaj slijed fragmenta na kojem se
nalazi potencijalna mutacija. Proba je dizajnirana tako da se komplementarno veže s divljim
tipom alela, a ukoliko se radi o mutiranom tipu alela neće se u potpunosti komplementarno
vezati, tj. neće se povezati vodikovim vezama s nukleotidima koji su promijenjeni. Budući se
detekcija mutacija temelji na analizi krivulje taljenja, nakon PCR reakcija umnožavanja
Uvod
8
specifičnog odsječka DNA, Real-Time PCR uređaj vrši program taljenja (eng. melting
program). Program se sastoji od polaganog zagrijavanja do temperature od 94°C i mjerenja
fluorescencije. Ukoliko umnoženi fragment sadržava promjenu u slijedu baza (mutacija ili
polimorfizam) temperatura taljenja (Tm) sensor probe bit će niža u odnosu na temperaturu
taljenja prilikom vezanja za fragment divljeg tipa alela, odnosno uočit će se raniji pad
fluorescencije. Promjena fluorescencije u ovisnosti o temperaturi može se prikazati kao
promjena negativne derivacije fluorescencije u ovisnosti o temperaturi te se u takvom prikazu
pad fluorescencije pri određenoj temperaturi očituje kao vrh krivulje (eng. peak). Primjenom
FRET proba, na temelju razlika u Tm, moguće je detektirati promjene u samo jednoj bazi, tzv.
SNP (eng. single nucleotide polymorphism).
Slika 3. Shematski prikaz FRET hibridizacijskih proba
Cilj istraživanja
9
2. CILJ ISTRAŽIVANJA
Cilj je ovog istraživanja testirati i usporediti specifičnost, pouzdanost, efikasnost,
robusnost, utrošak vremena te financijske troškove za metode analize krivulje taljenja visoke
rezolucije (HRM) i krivulje taljenja pomoću FRET hibridizacijskih proba za detekciju
insercije TA u promotoru gena UGT1A1.
Ispitanici i metode
10
3. ISPITANICI I METODE
3.1. Ustroj istraživanja
Istraživanje je osmišljeno kao presječna studija (15). Provedeno je u Laboratoriju za
molekularnu dijagnostiku i tipizaciju tkiva Odjela laboratorijske dijagnostike i kliničke
transfuzijske medicine Kliničkog zavoda za transfuzijsku medicinu KBC-a Osijek u periodu
od travnja do lipnja 2017. godine.
3.2. Ispitanici
Testirano je po 3 uzorka od svakog genotipa (TA6/6, TA6/7, TA7/7), ukupno 9 DNA
uzoraka bolesnika poznatog genotipa. To su uzorci DNA izolirani iz uzoraka krvi pacijenata
kojima je molekularna dijagnostika genotipizacije UGT1A1 učinjena FRET metodom na
Real-Time PCR uređaju u rutinskom dijagnostičkom programu u Laboratoriju za molekularnu
dijagnostiku i tipizaciju tkiva KBC-a Osijek. Uzorci krvi bolesnika bili su popraćeni
liječničkom uputnicom i pri dolasku u laboratorij dobili su jedinstvenu oznaku. Pacijenti nisu
sudjelovali aktivno u istraživanju. Istraživanje nije zahtijevalo ni nove kontakte prema
pacijentima. Istraživanje je odobreno od strane Etičkog povjerenstva Medicinskog fakulteta
Osijek.
U analizi su korišteni i referentni uzorci - uzorci DNA uspješno testirani u okviru
vanjske kontrole kvalitete (Instand e.V.) tijekom 2016. godine: po 1 uzorak od svakog
genotipa, ukupno 3 DNA uzorka poznatog genotipa.
3.3. Metode
U ovom radu za svaku od testiranih metoda učinjena je verifikacija oligonukleotidnih
početnica te amplifikacije željenog odsječka kalupa. Nadalje, testirana je specifičnost,
pouzdanost, efikasnost i robusnost dviju metoda koje se temelje na Real-Time PCR
metodologiji - FRET i HRM. Osim navedenih svojstava dviju metoda uspoređen je i utrošak
vremena te financijski troškovi potrebni za izvedbu testova. Pri testiranju navedenih
metodoloških svojstava svaki uzorak primijenjen je u duplikatu, a testovi ponovljeni dva puta.
Ispitanici i metode
11
3.3.1. Izolacija DNA
DNA je izolirana iz uzoraka pune periferne krvi primjenom ''High Pure PCR Template
Preparation Kit'' (Roche Diagnostics, Mannheim, Njemačka) seta za izolaciju DNA.
Enzimskom aktivnošću proteinaze K uz pomoć pufera za razgradnju proteina denaturirani su
stanični proteini te je tako omogućeno oslobađanje DNA iz stanice koja se zatim veže na
staklenu mrežicu u kolektorskoj tubici.
Materijal: 200 µl pune periferne krvi s EDTA antikoagulansom, High Pure PCR Template
Preparation Kit, izopropanol, apsolutni etanol, destilirana H2O.
Pribor: mikropipete (volumena do: 20 μL, 200 μL, 1000 μL), nastavci (sterilni, nekorišteni),
plastične tubice volumena 1,5 mL i 2,0 mL (sterilne, nekorištene), mikrocentrifuga (do 14200
o/min) s regulacijom temperature, grijač/shaker Thermo Shaker TS-100, zamrzivač (-20 °C),
hladnjak (+4 °C), jednokratne zaštitne rukavice.
Postupak: Prvi postupak u izolaciji DNA je liza stanica proteinazom K uz pufer za
razgradnju proteina (6 M gvanidin-HCl, 10 mM urea, 10 mM Tris-HCl, 20% triton X-100
(v/v), pH 4.4, 25 °C). U sterilnu mikroepruvetu s 200 µL pune periferne krvi dodaje se 200
µL pufera za razgradnju proteina i 40 µL vodene otopine proteinaze K, smjesa se promiješa te
slijedi inkubacija na 70°C tijekom 10 minuta. Zatim se dodaje 100 µL izopropanola koji
omogućuje bolje prijanjanje DNA na mrežicu, sve se dobro promiješa te se ukupni sadržaj
prenosi u kolektor tubicu koja sadrži staklenu mrežicu za vezanje DNA. Slijedi centrifugiranje
pri brzini od 8000 x g, u trajanju od 1 minute. DNA ostaje vezana na staklenu mrežicu, a
ostali stanični sastojci su eluirani s kolone. Osim DNA, na mrežici ostaju vezane i “nečistoće“
kao što su neki proteini i polisaharidi te stoga slijedi postupak ispiranja kako bi u konačnici na
mrežici ostala čista DNA. Nakon centrifugiranja, tubica sa staklenom mrežicom prebacuje se
u novu kolektor tubicu. Dodaje se 500 µL pufera za uklanjanje inhibitora (5M gvanidin-HCl,
20 mM Tris-HCl, pH 6,6 (25 °C)), a zatim 500 µL pufera za ispiranje (20 mM NaCl, 2
mM Tris-HCl, pH 7,5 (25 °C)), dva puta zaredom. Nakon svakog dodavanja pufera uzorak se
centrifugira (8000 x g/1 min), tubica sa staklenom mrežicom stavlja se u nove kolektorske
tubice, a nakon posljednjeg centrifugiranja slijedi kratko centrifugiranje u trajanju od 10
sekundi pri brzini od 13000 x g. Dodatkom 200 µL eluacijskog pufera (10 mM Tris-HCl, pH
8,5, 25°C) koji je zagrijan na 70 °C i centrifugiranjem (8000 x g / 1 min) DNA je eluirana s
mrežice. Izolirana DNA prenesena je u označenu mikroepruvetu u kojoj se uzorak do analize
čuva na -20 °C.
Ispitanici i metode
12
3.3.2. Mjerenje koncentracije DNA
Prije same genotipizacije UGT1A1 (TA)n polimorfizma provedeno je
spektrofotometrijsko mjerenje koncentracije uzoraka DNA te provjerena njihova čistoća.
Apsorbancija uzoraka mjerena je pri valnim duljinama od 230, 260 i 280 nm. Apsorbancija
izmjerena pri 260 nm koristi se za određivanje koncentracije DNA, dok se mjerenje
apsorbancije pri valnoj duljini od 280 nm koristi za određivanje koncentracije proteina u
uzorku. Omjer apsorbancija A260/A280 daje podatak o čistoći DNA, tj. kontaminiranosti uzorka
proteinima te, ukoliko se radi o uzorku čiste DNA, vrijednost omjera je između 1,8 i 2,0.
Vrijednost omjera manja od 1,8 označuje onečišćenost uzorka proteinima. Osim proteinima,
uzorak može biti kontaminiran organskim spojevima kao što su urea, EDTA, ugljikohidrati i
fenolatni ioni. Povećana apsorbancija uzorka pri valnoj duljini od 230 nm ukazuje na
kontaminacija navedenim spojevima.
Materijal: uzorci DNA, eluacijski pufer iz seta za izolaciju DNA,destilirana H2O
Pribor: uređaj SpectraMax QuickDrop UV-Vis Spectrophotometer, mikropipeta volumena do
10 μL, sterilni jednokratni nastavci, jednokratne zaštitne rukavice
Postupak: Na spektrofotometru se odabere opcija mjerenja koncentracije DNA. Pipetom se
nanese 2 L uzorka DNA. Nakon izvršenog mjerenja uređaj prikaže vrijednosti apsorbancija
pri valnim duljinama 260 nm, 280 nm i 230 nm, koncentraciju DNA te omjer A260/A280. Pri
prvom mjerenju je umjesto uzorka, kao slijepa proba, korišten eluacijski pufer, iz seta za
izolaciju DNA, u kojem je DNA uzoraka otopljena. Destilirana voda korištena je za čišćenje
optičke podloge spektrofotometra nakon svakog mjerenja.
Za obje korištene metode, HRM i FRET, potrebno je da koncentracije uzoraka budu
ujednačene te je nakon mjerenja svakom uzorku DNA pomoću TE pufera prilagođena
koncentracija.
3.3.3. HRM (High Resolution Melting)
Za genotipizaciju UGT1A1 (TA)n polimorfizma korištena je HRM metoda
modificirana prema radu Minucci i sur (12). Analizirano je ukupno 13 uzoraka: 9 uzoraka
DNA pacijenata (po 3 uzorka od svakog genotipa TA6/6, TA6/7 i TA7/7), 3 referentna uzorka
(za svaki genotip po jedan) te negativna kontrola (H2O PCR grade). Prije PCR reakcije bilo je
Ispitanici i metode
13
potrebno pripremiti reakcijsku smjesu prema uputama proizvođača (Roche Diagnostics). PCR
reakcija i nakon nje izvršen „melting“ program odvijali su se u LightCycler® 480 II uređaju.
U reakciji su korištene neobilježene oligonukleotidne početnice te LC 480 High Resolution
Melting boja koja ima svojstvo vezanja na dvolančanu DNA. Za obradu podataka dobivenih
analizom taljenja DNA korišten je program LightCycler® 480 Gene-Scanning Software
Version 1.2 (Roche Diagnostics).
Urađena je optimizacija koncentracije MgCl2 tako što je u PCR reakcijama korištena
serija razrjeđenja MgCl2 konačne koncentracije od 1,5 mM do 3,5 mM. Nadalje, urađena je
optimizacija koncentracija kalupa genomske DNA konačnih koncentracija 0,4 ng/L do 1,6
ng/L. Optimalne konačne koncentracije MgCl2 (3 mM) i kalupa DNA (1,6 ng/L) korištene
su u daljnjoj analizi usporedbe metoda HRM i FRET.
Pribor i oprema: PCR kabinet za sterilni rad Bioair Aura (Euroclone), LightCycler 480 II
Real -Time PCR uređaj (Roche Diagnostics), Centrifuga Multifuge 3 SR (Heraeus), short-spin
centrifuga, mikrotitarske ploče za LightCycler 480 (bijele, 96 jažica, Roche), mikropipete
volumena do 10 μL, 100 μL i 200 μL, filter nastavci, plastične tubice volumena 0,5 mL i 2
mL, alu folija, jednokratne zaštitne rukavice.
Reagensi: LightCycler 480 High Resolution Melting Master (Roche Diagnostics),
neobilježene početnice HPLC čistoće.
Oligonukleotidne početnice: UGT1A1-F: 5'- GGTGTATCGATTGGTTTTTGC-3'
UGT1A1-R: 5'-TTTGCTCCTGCCAGAGGTT-3'
Postupak:
1. Priprema reakcijske smjese:
Otopiti reagense u ohlađenom stalku. Reakcijska smjesa za svaki uzorak sadržavala je
točno određene volumene i konačne koncentracije sljedećih reagensa: Master Mix (1x konc.),
0,2 M svake od početnica, 3,0 mM MgCl2, 1,6 ng/L kalupa DNA.
Reakcijske smjese finalnog volumena 20 L pripremane su za 1 uzorak više. Nakon
što je reakcijska smjesa vortexirana i spuštena (spin down), po 15 µL reakcijske smjese
podijeljeno je u jažice LightCycler mikrotitarske ploče. U svaku jažicu ploče dodano je 5 µL
uzorka DNA. Za negativnu kontrolu umjesto uzorka stavljano je 5 µL vode (PCR-grade, iz
LC 480 HRM Master seta). Ploča je zatim pokrivena prozirnom folijom te centrifugirana
tijekom 2 min. na 1500 x g. Nakon toga ploča je postavljena u uređaj LightCycler 480 II te je
pokrenut PCR program.
Ispitanici i metode
14
2. PCR program:
Tablica 1. Program za Real-Time PCR i HRM analizu amplificiranog produkta Postavke
Tip termo-bloka Volumen reakcijske smjese (µL)
96 20
Detekcijski format Ekscitacijski filter Emisijski filter
Sybre Green I / HRM boja 465 510
Programi
Naziv programa Broj ciklusa Način analize
Preinkubacija 1 -
Amplifikacija 47 Kvantifikacija
Krivulja taljenja 1 Krivulja taljenja
Hlađenje 1 -
Ciljne
temperature
Ciljna
temperatura
(°C)
Način akvizicije Trajanje
(hh:mm:ss)
Brzina promjene temperature (°C/s)
Akvizicije
(po °C)
Pre-inkubacija 95 - 00:10:00 4.4 (4.8) -
Amplifikacija 95 - 00:00:10 4.4 (4.8) -
53 - 00:00:15 2.2 (2.5) -
72 Jednostruko 00:00:10 4.4 (4.8) -
Krivulja taljenja 95 - 00:01:00 4.4 (4.8) -
40 - 00:01:00 2.2 (2.5) -
65 - 00:00:01 1
95 Kontinuirano - - 25
Hlađenje 40 - 00:00:10 2.2 (2.5) -
3.3.4. FRET Druga metoda korištena za genotipizaciju UGT1A1 (TA)n polimorfizma je FRET
metoda modificirana prema radu Borlak i sur (16). Analizirani su isti uzorci koji su analizirani
i HRM metodom, ukupno 13 uzoraka: 9 uzoraka DNA pacijenata (po 3 uzorka od svakog
genotipa TA6/6, TA6/7 i TA7/7), 3 referentna uzorka (za svaki genotip po jedan) te negativna
kontrola (voda PCR-grade, iz LC DNA Master Hyb seta). Kao i kod HRM metode, prije PCR
reakcije pripremljena je reakcijska smjesa te se reakcija odvijala u LightCycler® 480 II
uređaju. Da bi došlo do FRET reakcije, korištene su dvije vrste obilježenih proba; anchor
proba koja je na 3' kraju obilježena fluoresceinom te sensor proba koja je na 5' kraju
obilježena LC-Red 640 akceptorskom bojom. Probe su nakon vezanja za DNA kalup bile
udaljene za 2 baze. Kraća sensor proba sadržava slijed koji se veže za dio fragmenta na kojem
Ispitanici i metode
15
se nalazi mutacija, a fluorescein na anchor probi služio je kao izvor svjetlosti koji pobuđuje
akceptorsku boju na sensor probi. Real-Time PCR uređaj detektirao je promjene u
fluorescenciji tijekom reakcije, pri čemu je gubitak fluorescencije označavao taljenje sensor
probe. Računalni program stvorio je krivulju taljenja umnoženih fragmenata kao rezultat
omjera negativne derivacije fluorescencije i temperature te se na temelju razlike u temperaturi
taljenja i obliku krivulje mogu razlikovati genotipovi TA6/6, TA6/7 i TA7/7.
Urađena je optimizacija koncentracije MgCl2 tako što je u PCR reakcijama korištena
serija razrjeđenja MgCl2 konačne koncentracije od 3,0 mM do 5,0 mM. Optimalna konačna
3,0 mM koncentracija MgCl2 korištena je u daljnjoj analizi usporedbe metoda HRM i FRET.
Pribor i oprema: PCR kabinet za sterilni rad Bioair Aura (Euroclone), LightCycler 480II
Real-Time PCR uređaj (Roche), Centrifuga Multifuge 3 SR (Heraeus), short-spin centrifuga,
mikrotitarske ploče za LightCycler 480 (bijele, 96 jažica, Roche), mikropipete volumena do
10 μL, 100 μL i 200 μL, filter nastavci, plastične tubice volumena 0,5 mL i 2 mL, alu folija,
jednokratne zaštitne rukavice.
Reagensi: LC DNA Master Hybridization Kit (Roche Diagnostics), neobilježene početnice
(Metabion), fluorescentno obilježene probe (TibMolBiol).
Oligonukleotidne početnice:
UGT1A1-sense: 5-AAGTGAACTCCCTGCTACCTT-3
UGT1A1-antisense: 5-CCACTGGGATCAACAGTATCT-3
Oligonukleotidne probe:
UGT1A1-anchor:
5-CTTTGCTCCTGCCAGAGGTTCGCCCT-fluorescein-3
UGT1A1-sensor:
5-Lightycler-Red640-CCTACTTATATATATATATATATGGCAAAAACC-P-3
Postupak:
1. Priprema reakcijske smjese:
Reagensi su otopljeni u ohlađenom stalku. Reakcijska smjesa ukupog volumena 20
L, za svaki je uzorak sadržavala točno određene volumene i koncentracije sljedećih
Ispitanici i metode
16
reagensa: LC DNA Master Hyb (1x konc.), 3,0 mM MgCl2, 0,4 M početnice, 0,2 M probe,
6,0 ng/L kalupa DNA.
Reakcijske smjese pripremane su za 1 uzorak više. Nakon što je reakcijska smjesa
vortexirana i spuštena (spin down), po 16 µL reakcijske smjese podijeljeno je u jažice
LightCycler mikrotitarske ploče. U svaku jažicu ploče dodano je 4 µL uzorka DNA. Za
negativnu kontrolu umjesto uzorka stavljano je 4 µL vode (PCR-grade, iz LC DNA Master
Hyb Kita). Ploča je zatim pokrivena prozirnom folijom te centrifugirana tijekom 2 minute na
1500 x g. Nakon toga ploča je postavljena u uređaj LightCycler 480 II te je pokrenut PCR
program.
2. PCR program: Tablica 2: Program za Real-Time PCR i FRET analizu amplificiranog produkta
Postavke
Tip termo-bloka Volumen reakcijske smjese (µL)
96 20
Detekcijski format Ekscitacijski filter Emisijski filter
Programi
Naziv programa Broj ciklusa Oblik analize
Preinkubacija 1 -
Amplifikacija 45 Kvantifikacija
Krivulja taljenja 1 Krivulja taljenja
Hlađenje 1 -
Ciljne temperature
Ciljna temperatura (°C)
Način akvizicije Trajanje (hh:mm:ss)
Brzina promjene temperature (°C/s)
Akvizicije (po °C)
Preinkubacija 95 - 00:02:00
Amplifikacija 95 - 00:00:00
55 Jedinstveno 00:00:07
72 - 00:00:12
Krivulja taljenja 95 - 00:00:30
45 - 00:00:30
94 Kontinuirano 00:00:00
Hlađenje 40 - 00:00:30
Ispitanici i metode
17
3.3.5 Elektroforeza DNA u agaroznom gelu
Kvaliteta specifičnih odsječaka DNA umnoženih pomoću oligonukleotidnih početnica
za metode HRM i FRET provjerena je pomoću agarozne gel elektroforeze. Rađena je 2%
elektroforeza DNA u agaroznom gelu. Za bojanje DNA korištena je boja GelRed (Olerup), a
marker se sastojao od ljestvica DNA odsječaka veličina 50, 100, 200, 300, 400, 500 i 1000 pb.
3.3.6. Statističke metode
Karakteristike Real-Time PCR metoda HRM i FRET definirane su u odnosu na rezultate
krivulja taljenja referentnih uzoraka. U testovima verifikacije svojstava uspoređivanih metoda
razrjeđenja pojedinih komponenata PCR smjese testirana su u duplikatu u dva neovisna
ponavljanja te su rezultati obrađeni metodama deskriptivne statistike.
Rezultati
18
4. REZULTATI
4.1. HRM
Za dobru HRM analizu sve amplifikacijske krivulje produkata PCR-a trebale bi imati
Cp (eng. crossing point) vrijednosti 30 i sve bi krivulje amplifikacije trebale dostići jednaku
visinu platoa. Pokusi titracije serije koncentracija MgCl2 od 1,5 mM do 3,5 mM pokazali su
da uz 1,5 mM konačnu koncentraciju MgCl2 ne dolazi do amplifikacije produkta PCR-a
(Slika 4A). Kao optimalna koncentracija za HRM analizu pokazala se 3,0 mM koncentracija
MgCl2 (Slika 4B), titracijski set 4 (MM4) u pokusima titracije koncentracije MgCl2. Svi su
uzorci reakcijskog seta MM4 imali Cp vrijednosti 30 (između 25,5 i 28,8), kao i reakcijski
setovi MM2, MM3 i MM5, no za razliku od drugih reakcijskih setova u MM4 su sve
amplifikacijske krivulje dostigle jednaku visinu platoa.
Kvaliteta amplificiranog produkta veličine 70 pb verificirana je i 2% agaroznom gel
elektroforezom (Slika 4C). Rezultat gel elektroforeze (Slika 4C) potvrđuje rezulate analize
PCR amplifikacije učinjene Abs Quant / Fit Point analizom u programu LC480 Software 1.5
(Slika 4 A i B).
Rezultati
19
A
B
C
B
Slika 4: Rezultati analize amplifikacije kalupa DNA u reakcijskim titracijskim setovima
MgCl2. (A) Nema amplifikacije produkta PCR-a u reakcijskom setu MM1 (1,5 mM MgCl2).
(B) Optimalna amplifikacija kalupa DNA u reakcijskom setu MM4 (3,0 mM MgCl2).
(C) Slika 2% agarozne gel elektroforeze produkata PCR reakcija reakcijskih setova MM1 i
MM4 (M = DNA marker, NC = negativna kontrola).
Nakon analize PCR amplikona i odabira optimalnih koncentracija sastojaka reakcijske
smjese, analizirane su krivulje taljenja amplificiranog odsječka DNA pomoću Light Cycler
480 Gene Scaning programa (Slika 5).
Rezultati
20
A
B
C
Rezultati
21
D
Slika 5. Postupak promjene oblika te nastajanja konačnih diferencijalnih krivulja taljenja
DNA tijekom HRM genotipizacije. (A) Početne krivulje taljenja dobivene nakon „melting“
programa. Za normalizaciju krivulja taljenja pre-melting temperatura bila je postavljena na
72,11-74,58 C, a post-melting temperatura na 78,04-79,00 C (B) Krivulje taljenja nakon
normalizacije. (C) Krivulje taljenja nakon normalizacije i promjene po temperaturi.
(D) Konačne diferencijalne krivulje taljenja dobivene kao rezultat negativne derivacije po
fluorescenciji.
Prije „melting“ programa i HRM analize, tj. nakon PCR reakcije, očitane su Cp
vrijednosti za uzorke svakog od tri genotipa. Analizom Cp vrijednosti uočeno je da su sve Cp
vrijednosti manje od 30, što odgovara uvjetu dobre HRM analize. Usporedba Cp vrijednosti
korištena je kao provjera reproducibilnost i pouzdanosti HRM metode. Svaki uzorak
amplificiran je u duplikatu te je PCR reakcija ponovljena dva puta. Na temelju podataka o Cp
vrijednostima izračunate su aritmetičke sredine sa standardnim devijacijama i raspon Cp
vrijednosti za svaki genotip. Cp vrijednosti između TA7/7, TA6/7 i TA6/6 genotipova
neznatno su se razlikovale, a isto tako između Cp vrijednosti uzoraka svakog pojedinog
genotipa postojao je mali raspon, tj. niska vrijednost standardne devijacije. Između prvog i
drugog ponavljanja PCR reakcije nije bilo značajnih razlika u Cp vrijednostima (Tablica 3).
Rezultati
22
Tablica 3. Usporedba Cp vrijednosti za uzorke sva tri genotipa
1. ponavljanje
Cp prosjek SD Raspon Cp
(ciklusa) Ukupno raspon (ciklusa)
TA6/6
(Ref66, 66-1, 66-2, 66-3) 25,83 0,15
25,64-25,99
(0,35)
3,22 ciklusa
(Cp 28,86 – Cp 25,64) TA6/7
(Ref67, 67-1, 67-2, 67-3) 26,23 0,50
25,75-26,82
(1,07)
TA7/7
(Ref77, 77-1, 77-2, 77-3) 26,88 1,39
25,68-28,86
(3,18)
2. ponavljanje
TA6/6
(Ref66, 66-1, 66-2, 66-3) 26,27 0,19
26,07-26,48
(0,41)
2,15 ciklusa
(Cp 28,22 – Cp 26,07)
TA6/7
(Ref67, 67-1, 67-2, 67-3) 26,78 0,52
26,30-27,25
(0,95)
TA7/7
(Ref77, 77-1, 77-2, 77-3) 27,18 0,75
26,45-28,22
(1,77)
4.2. FRET
Analiza krivulja taljenja produkata PCR-a titracije serije koncentracija MgCl2 od 3,0
mM do 5,0 mM pokazala je da je 3,0 mM konačna koncentracija MgCl2 optimalna
koncentracija za FRET analizu (Slika 6). Krivulje taljenja svakog pojedinog uzroka, kao i
razlike između TA7/7, TA6/7 i TA 7/7 genotipova, jasno su se mogle uočiti samo uz 3,0 mM
koncentraciju MgCl2 (Slika 6A). Povećanjem koncentracije MgCl2 (titracijski setovi MM2,
MM3, MM4 i MM5) preciznost analize se smanjivala zbog preklapanja krivulja te sve manje
mogućnosti uočavanja razlika između genotipova (Slika 6 B, C, D i E) .
Rezultati
23
Slika 6: Oblik krivulja taljenja u ovisnosti o koncentraciji MgCl2 (A) 3,0 mM MgCl2 – MM1
(B) 3,5 mM MgCl2 – MM2 (C) 4,0 mM MgCl2 – MM3 (D) 4,5 mM MgCl2 – MM4 (E) 5,0
mM MgCl2 – MM5
A
B C
D E
Rezultati
24
Prisutnost i kvaliteta amplificiranog fragmenta DNA veličine 242 pb u reakcijskoj
smjesi MM1 potvrđeni su 2% agaroznom gel elektroforezom. Rezultat gel elektroforeze
(Slika 7B) potvrđuje rezulate analize PCR amplifikacije učinjene Abs Quant / Fit Point
analizom u programu LC480 Software 1.5 (Slika7A).
A B
Slika7: Rezultat analize amplifikacije kalupa DNA u reakcijskom titracijskom setu MM1.
(A) Optimalna amplifikacija kalupa DNA u reakcijskom setu MM1 (3,0 mM MgCl2).
(B) Slika 2% agarozne gel elektroforeze produkata PCR reakcije reakcijskog seta MM1, (M =
DNA marker).
Usporedbom vrijednosti temperatura taljenja (Tm) između mjerenja provjeravane su
reproducibilnost i pouzdanost FRET metode. Svaki uzorak amplificiran je u duplikatu, PCR
reakcija ponovljena je dva puta te su na temelju izmjerenih Tm izračunate prosječne Tm za
uzorke svakog genotipa, kao i raspon Tm. Razlike u Tm uzoraka istog genotipa bile su vrlo
male. Raspon Tm bio je manji od 1°C kod svih uzoraka, osim uzoraka TA6/6 genotipa u
drugom ponavljanju kod kojih je raspon Tm iznosio 2,11°C. Između prvog i drugog
ponavljanja također nije bilo velikih razlika u Tm (Tablica 4).
Rezultati
25
Tablica 4: Usporedba vrijednosti Tm za uzorke sva tri genotipa
1. ponavljanje
Tm1 prosjek
(C) SD
Raspon
Tm1(C)
Tm2 prosjek
(C) SD
Raspon
Tm2(C)
TA6/6
(Ref66, 66-1, 66-2, 66-3) 55,55 0,07
55,54-55,66
(0,12)
TA6/7
(Ref67, 67-1, 67-2, 67-3) 55,96 0,18
55,73-56,13
(0,4) 59,46 0,06
59,4-59,5
(0,1)
TA7/7
(Ref77, 77-1, 77-2, 77-3)
58,83 0,08 58,7-58,9
(0,2)
2. ponavljanje
TA6/6
(Ref66, 66-1, 66-2, 66-3) 55,39 0,72 53,62-55,73
(2,11)
TA6/7
(Ref67, 67-1, 67-2, 67-3) 55,93 0,10 55,81-56,05
(0,24) 59,26 0,04
59,2-59,3
(0,1)
TA7/7
(Ref77, 77-1, 77-2, 77-3)
59,04 0,15 58,8-59,3
(0,5)
4.3. Usporedbe karakteristika Real-time PCR metoda HRM i FRET
Titracijama sastojaka reakcijskih smjesa za HRM i za FRET metode testirana je
robusnost tih metoda. Pokazano je da HRM tolerira promjene u koncentraciji MgCl2 između
2,0 mM i 3,5 mM što se tiče same amplifikacije PCR produkta, no za specifične konačne
krivulje genotipova u analizi rezultata bilo je potrebno odabrati optimalnu reakcijsku smjesu
točno određenih koncentracija sastojaka. FRET metoda također tolerira određeni raspon
koncentracija MgCl2 (3,0 mM do 5,0 mM) pri kojima dolazi do amplifikacije produkta, no iz
oblika krivulja Tm analize vidljivo je da se porastom koncentracije MgCl2 krivulje pomiču
tako da na kraju više nema specifične razlike između vrhova krivulja za svaki od genotipova.
Za FRET metodu je također bilo potrebno odabrati optimalnu reakcijsku smjesu koja je
najefikasnija i najspecifičnija za genotipizaciju TA6/7 polimorfizma u genu UGT1A1.
Rezultati
26
Verifikacija amplifikacije za svaki real-time PCR za obje metode učinjena je Abs
Quant / Fit Point analizom u programu LC480 Software 1.5, a za određene je amplifikacije
potvrđena i 2% agaroznom gel elektroforezom (Slike 4 i 7).
Pouzdanost i reproducibilnost HRM metode provjerena je usporedbom Cp vrijednosti
za uzorke sva tri genotipa rađene u duplikatu i ponovljene dva puta (Tablica 3). Sve su Cp
vrijednosti bile ispod 30 ciklusa, raspona od 2,15 do 3,22 ciklusa što pokazuje da je metoda
reproducibilna. Osim toga, za svako je ponavljanje svakog uzorka analizirana i konačna
diferencijalna krivulja taljenja visoke rezolucije (Slika 5D) uz uvjet da su svi parametri PCR
programa i analize u Gene Scaning programu bili jednako namješteni kako bi bili usporedivi.
Pouzdanost i reproducibilnost FRET metode provjerena je usporedbom Tm vrijednosti
za uzorke sva tri genotipa rađene u duplikatu i ponovljene dva puta (Tablica 4). Ukupno je
raspon Tm vrijednosti bio od 0,1 do 2,11 C, što je prihvatljivo te potvrđuje da je metoda
reproducibilna.
Utrošak vremena za pripremu reakcijske smjese i samu Real-Time PCR reakciju
između HRM i FRET metode se ne razlikuje. Nešto više vremena potrebno je uložiti u analizu
dobivenih rezultata kod HRM metode.
Usporedba financijskih troškova pokazala je da je FRET metoda 2,5 puta skuplja u
odnosu na HRM metodu.
Rasprava
27
5. RASPRAVA
Određivanje insercije TA u promotoru gena UGT1A1 molekularno je dijagnostički
postupak kojim se može potvrditi dijagnoza Gilbertovog sindroma. Utvrđivanje genotipa
polimorfizma TA u genu UGT1A1 može pomoći i u pravilnom doziranju lijekova koji se
metaboliziraju putem glukuronidacije enzimom bilirubin-UGT (1,3). U postupku dijagnostike
vrlo je važno imati pouzdanu, specifičnu i robusnu metodu, kojom se do rezultata dolazi u što
kraćem vremenskom roku. Također je poželjno da financijski troškovi potrebni za izvedbu
budu što niži. U ovom su istraživanju ispitane i uspoređene karakteristike FRET i HRM
metode.
Testirani su specifičnost, pouzdanost, efikasnost, robusnost, vremenski utrošak te
financijski troškovi dviju navedenih metoda. Za testiranje i usporedbu karakteristika korišteno
je devet DNA uzoraka poznatog genotipa - po tri uzorka od svakog genotipa (TA6/6, TA6/7 i
TA7/7), tri referentna uzorka kao pozitivne kontrole te voda kao negativna kontrola.
Prilikom testiranja karakteristika HRM metode utvrđeno je da je metoda specifična za
genotipizaciju UGT1A1 jer je HRM analizom točno i jasno određen genotip uzorka.
Specifičnost metode potvrđuju i krivulje taljenja ispitivanih uzoraka koje su oblikom i
temperaturom taljenja odgovarale krivuljama taljenja referentnog uzorka istog genotipa.
Usporedbom Cp vrijednosti nakon PCR programa utvrđen je ukupni raspon od 2,15 do 3,22
ciklusa, što je potvrdilo da je metoda pouzdana i reproducibilna. Robusnost HRM metode
provjeravana je tiracijama koncentracije MgCl2 od 1,5 mM do 3,5 mM. Testovi titracije
pokazali su da se amplifikacija događa pri koncentracijama od 2,0 do 3,5 mM, dok pri
koncentraciji od 1,5 mM amplifikacije nije bilo. Usporedbom s FRET metodom može se
uočiti da FRET metoda tolerira veći raspon koncentracije MgCl2 što se tiče same
amplifikacije. Iako se amplifikacija tijekom HRM metode odvijala pri koncentracijama MgCl2
od 2,0 do 3,5 mM, isto kao i kod FRET metode samo je koncentracija od 3,0 mM bila
povoljna za kvalitetnu analizu zbog oblika krivulja taljenja. Priprema reakcijskih smjesa za
HRM metodu traje jednako kao i priprema za FRET metodu, jedino je nešto više vremena
potrebno utrošiti kod analize rezultata HRM metode zbog normalizacije i derivatizacije
krivulja. Ukupno trajanje HRM metode iznosi otprilike 1,5h (16). Kod HRM metode nema
potrebe za kupovanjem dodatnih obilježenih oligonukleotidnih proba te je metoda financijski
povoljnija jer su troškovi u odnosu na FRET metodu 2,5 puta manji.
Rasprava
28
Osim uspoređivanih karakteristika, uočeno je da je HRM metoda prikladnija za
detekciju heterozigotnog TA 6/7 genotipa zbog boljeg prikaza. Analizom krivulja taljenja
FRET metode, odnosno analizom vrhova krivulja (engl. peak) negativnih derivacija
fluorescencije po temperaturi mogu se uočiti jasno odvojeni vrhovi krivulja te krivulje
različitih Tm za homozigotne genotipove TA7/7 i TA6/6, dok krivulje taljenja heterozigotnih
uzoraka i njihovi vrhovi krivulja izgledom ne odgovaraju očekivanjima. Očekivano bi bilo da
se kod heterozigotnih uzoraka, zbog prisutnosti dvaju različitih alela, isto tako može uočiti
krivulja s dva vrha, pri čemu bi svaki trebao odgovarati Tm homozigotnih genotipova.
Međutim, nakon genotipizacije UGT1A1 (TA)n polimorfizma FRET metodom utvrđeno je da
krivulja taljenja heterozigotnih genotipova izgleda kao krivulja taljenja uzoraka genotipa TA
6/6 s blagim proširenjem prema većoj vrijednosti Tm, što je u skladu i s krivuljama FRET
analize prikazanim u radu Borlak i sur. (16). Za razliku od krivulja taljenja FRET metode,
konačnim diferencijalnim krivuljama taljenja HRM metode jasno se mogu razlučiti sva tri
genotipa. Ovo istraživanje potvrđuje navode Minucci i sur. (12) da HRM metodu možemo
smatrati korisnom tehnikom za detekciju insercije TA u genu UGT1A1.
Zaključak
29
6. ZAKLJUČAK
Na temelju provedenog testiranja karakteristika te usporedbe metoda analize krivulje taljenja
visoke rezolucije (HRM) te analize krivulje taljenja pomoću FRET hibridizacijskih proba
može se zaključiti:
1. obje metode su specifične, pouzdane i efikasne za detekciju genotipova TA 6/6, TA 6/7 i
TA 7/7 u promotoru gena UGT1A1
2. metoda analize krivulje taljenja pomoću FRET hibridizacijskih proba je 2,5 puta skuplja u
odnosu na HRM analizu
3. za analizu rezultata kod HRM metode potrebno je utrošiti malo više vremena
4. HRM metoda je prikladnija za detekciju heterozigotnog TA6/7 genotipa
Sažetak
30
7. SAŽETAK
Cilj istraživanja: Testirati i usporediti specifičnost, pouzdanost, efikasnost, robusnost,
utrošak vremena te financijske troškove za metode analize krivulje taljenja visoke rezolucije
(HRM) i krivulje taljenja pomoću FRET hibridizacijskih proba za detekciju insercije TA u
promotoru gena UGT1A1.
Ispitanici i metode: U istraživanju je korišteno 9 DNA uzoraka poznatog genotipa - po tri
uzorka od svakog genotipa (TA6/6, TA6/7 i TA7/7) te po jedan referentan uzorak za svaki
genotip. Genotipizacija uzoraka učinjena je HRM i FRET metodama.
Rezultati: Titracijama koncentracije MgCl2 testirana je robusnost HRM i FRET metoda te je
utvrđeno da FRET metoda tolerira veći raspon koncentracija što se tiče amplifikacije, no
jedino je koncentracija od 3,0 mM bila optimalna za analizu rezultata genotipizacije kod obje
metode. Usporedbom Cp vrijednosti za HRM metodu te usporedbom vrijednosti Tm za FRET
metodu utvrđen je mali ukupni raspon te ustanovljeno da su metode pouzdane i
reproducibilne. Usporedbom vremena koje je potrebno za izvedbu metoda utvrđeno je da
HRM metoda traje malo duže zbog analize rezultata, dok je usporedbom financijskih troškova
utvrđeno da je FRET metoda 2,5 puta skuplja.
Zaključak: Testiranjem i usporedbom karakteristika HRM i FRET metoda dokazano je da su
obje metode specifične, pouzdane i efikasne za genotipizaciju UGT1A1 (TA)n polimorfizma.
Također je utvrđeno da je metoda analize krivulje taljenja pomoću FRET hibridizacijskih
proba 2,5 puta skuplja u odnosu na HRM analizu, dok je za analizu rezultata kod HRM
metode potrebno utrošiti malo više vremena. Nadalje, utvđeno je da je HRM metoda
prikladnija za detekciju heterozigotnog TA 6/7 genotipa.
KLJUČNE RIJEČI: analiza krivulja taljenja, FRET hibridizacijske probe, gen UGT1A1, HRM
Summary
31
8. SUMMARY
Comparison of high resolution melting (HRM) and FRET HybProbes melting curve analysis
for TA-insertion in UGT1A1 gene promoter
Objectives: The aim of this study was to test and compare specificity, reliability, efficiency,
robustness, time consumption and financial costs of high resolution melting method (HRM)
and FRET HybProbes melting curve analysis for TA-insertion in UGT1A1 gene promoter.
Patients and methods: In this study 9 DNA samples of known genotypes were used - three
samples of each genotype (TA6/6, TA6/7 and TA7/7) and one reference sample for each
genotype. Samples genotyping was performed using HRM and FRET methods.
Results: The robustness of HRM and FRET methods was tested by titration of MgCl2
concentration and it was found that the FRET method tolerates a larger concentration range as
far as amplification is concerned, but the only optimal concentration for genotyping result
analysis in both methods was 3.0 mM. By comparing the Cp values for the HRM method and
by comparing the Tm value for the FRET method, a small overall range was found and it was
confirmed that the methods were reliable and reproducible. By comparing the time required
for implementation of both methods, it was found that the HRM method lasts a little longer
due to analysis of the results, while by comparing the financial costs it is determined that the
FRET method is 2.5 times more expensive.
Conclusion: Testing and comparing the characteristics of HRM and FRET methods showed
that both methods are specific, reliable and effective for genotyping UGT1A1 (TA)n
polymorphisms. It was also found that the FRET HybProbes melting curve analysis method is
2.5 times more expensive than HRM analysis, while analyzing results of the HRM method
takes a little more time. Furthermore, it was found that the HRM method is more suitable for
detection of heterozygous TA 6/7 genotype.
KEY WORDS: melting curve analysis, FRET HybProbes, UGT1A1 gene, HRM
Literatura
32
9. LITERATURA
1. Guillemette C. Pharmacogenomics of human UDP-glucuronosyltransferase enzymes.
Pharmacogenomics J. 2003; 3: 136-158
2. Manevski N. Activity and Enzyme Kinetics of Human UDP-Glucuronosyltransferases:
Studies of Psilocin Glucuronidation and the Effects of Albumin on the Enzyme Kinetic
Mechanism(disertacija). Helsinki: 2013; 15-20
3. Dean L. Irinotecan Therapy and UGT1A1 Genotype. U: Dean L. Medical Genetics
Summaries. Bethesda (MD): National Center for Biotechnology Information (US); 2015:1-8
4.Genetics Home Reference. UGT1A1 gene. Dostupno na adresi:
https://ghr.nlm.nih.gov/gene/UGT1A1#conditions. Datum pristupa: 22.7.2017.
5. Murray R K, Bender A, Botham K M, Kennelly P J, Rodwell V W, Well A. Harperova
ilustirana biokemija. Lovrić J, Sertić J, urednici. 28. izd. Zagreb: Medicinska naklada; 2011.
6. Genetics Home Reference. Gilbert syndrome. Dostupno na adresi:
https://ghr.nlm.nih.gov/condition/gilbert-syndrome. Datum pristupa: 22.7.2017.
7. Yi L, Lin G, Zhang K, Wang L, Zhang R, Xie J, i sur. Molecular Genetics External Quality
Assessment Pilot Scheme for Irinotecan-Related UGT1A1 Genotyping in China. PLoS One.
2016; 11(1): e0148081.
8. Shipley GL. An introduction to real-time PCR. U: Dorak MT ur. Real-time PCR;2006:1-
37.
9. Dujols V, Kusukawa N, McKinney JT, Dobrowolsky SF, Wittwer CT. High-resolution
melting analysis for scanning and genotyping. U: Dorak MT ur. Real-time PCR;2006:155-
169.
10. Applied Biosystems. A Guide to High Resolution Melting (HRM) Analysis. SAD:2009.
Literatura
33
11. Roche Diagnostics GmbH. High Resolution Melting:Optimization Strategies. Mannheim,
Njemačka: 2008.
12. Minucci A, Concolino P, Giardina B, Zuppi C, Capoluongo E. Rapid UGT1A1 (TA)n
genotyping by high resolution melting curve analysis for Gilbert's syndrome diagnosis. Clin
Chim Acta. 2010; 246–249
13. Didenko V V. DNA Probes Using Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET):
Designs and Applications. Biotechniques. 2001; 31(5): 1106–1121.
14. Hussain S A i sur. An Introduction to Fluorescence Resonance Energy Transfer
(FRET)[internet]. Tripura, India: ResearchGate; 2009. Dostupno na adresi:
https://www.researchgate.net/publication/45867167_An_Introduction_to_Fluorescence_Reso
nance_Energy_Transfer_FRET. Datum pristupa: 5.8.2017.
15. Marušić M. Uvod u znanstveni rad u medicini. 4. izd. Zagreb: Medicinska naklada; 2008.
16. Borlak J, Thum T, Landt O, Erb K, Hermann R. Molecular diagnosis of a familial
nonhemolytic hyperbilirubinemia (Gilbert's syndrome) in healthy subjects. Hepatology.
2000;32(4):792-795.
Životopis
34
10. ŽIVOTOPIS
MAJA JIROUŠ
Datum i mjesto rođenja:
8. rujan 1995. godine, Virovitica
Kontakt:
Obrazovanje:
2010.-2014. Gimnazija Petra Preradovića u Virovitici, smjer prirodoslovno-
matematička gimnazija
2014.-2017. Sveučilišni preddiplomski studij medicinsko laboratorijske
dijagnostike na Medicinskom fakultetu Sveučilišta Josipa Jurja Strossmayera u
Osijeku