UV VIS Spektrofotometrija

7/22/2019 UV VIS Spektrofotometrija

http://slidepdf.com/reader/full/uv-vis-spektrofotometrija 1/56

Optič ke metodeUV-VIS spektrofotometrija

Atomska apsorpciona spektrofotometrija

Plamena fotometrija

Fluorescentne metode

Turbidimetrija i nefelometrija

Masena spektroskopija



Analitič ki signal: svetlost Svetlost:

ČESTICA (FOTON-roj fotona)

ELEKTROMAGNETNI TALAS

Talasna dužina (λ)

Frekvencija ( ν)Energija (E)

E=h ν νν ν= h c/ λλλλ



E – energija fotona, odnosno svetlosti,h – Plankova konstanta h = 6,625×10-34 J s),ν – frekvencija svetlosti,

c – brzina prostiranja svetlosti, c = 300 000 km/s (uvakuumu)λ – talasna dužina svetlosti.

Jedinica za energiju fotona - nije Joul, već eV

1eV = 1,602 × 10-19 J

λ ν chhE ==



Talasna dužinaAmplituda



S pek t ar



Spektar





Podela spektara

Prema izgledu:Linijski (atomi)Trakasti (molekuli)Kontinualni (usijana čvrsta tela)

Prema mehanizmu nastajanja:

Apsorpcioni (uzorak apsorbuje)Emisioni (uzorak emituje)

Ramanski (uzorak rasejava)



TrakastiLinijski

Kontinuirani



Apsorpciona spektrofotometrija

UV-VIS spektrofotometrija

UV znači: ultra (iznad, preko) +violet (ljubič asto) 200-380 nm

VIS-visible (vidljivo) 380-780 nm



Apsorpcija zrač enja dovodi do prelaza

valentnih elektrona iz osnovnog u pobuđ eno stanje

h ν = Eviše-Eniže

hromoforna grupa ili hromofora

Molekul ili deo molekula

koji je odgovoran za apsorpcijuu UV delu spektra



Pobuđ uju se valentni elektroni:

sigma (σ)elektroni

pi (π) elektronislobodni elektronski parovi (n)

Pobuđivanje:

Iz vezivne u antivezivne



Dozvoljenielektronski prelazi

σ→σ*n→σ*

π→π*n→π*



Jedan elektronski prelaz-jednaapsorpciona traka A=f( λ λλ λ )

λ max -ona talasna dužina koju jedinjenje najviše apsorbuje

1.Mesto u spektru2. Intenzitet3. Poluširina



Koliko je λ max ?



Šta utič e na λ max ?

1.Priroda supstanceRazličita jedinjenja imaju

različite hromofore (molekulili deo molekula koji je

odgovoran za apsorpciju uUV-VIS oblasti)



Apsorpcioni spektar benzena (1) oko

255 nm i fenola (2) oko 270 nm

180 200 220 240 260 280 300

2

1

n-π∗

π−π∗

A

λ, nm



Više dvostrukih veza

pomeranje ka većim talasnimdužinama- batohromno pomeranje



Proteini (belanč evine) apsorbuju u

UV oblasti spektraBelance je belo!

Hromofore:

Peptidna veza (-CONH-)Aromatične aminokiseline u bočnom

lancuProstetične grupe



UV spektri :

a)proteina b) nukleinskih kiselina



Pored strukture, na položaj

apsorpcione trake utič u:

pHSlaba baza ili slaba

kiselina-u jonskom ili

molekulskom obliku uzavisnosti od pH

Izobestična tačka

Provera:Kapnite par kapi

limuna u čaj…



Rastvarač

Jod u etru je ljubičastJod u vodi je žućkasto-braon



Šta znač i reč HROMOFORA?

Grčki:NOSILAC BOJE chroma + phoros



Bo ja jed injenja

Selektivna apsorpcijau vidljivom delu spektra(400-800 nm)

Komplementarne bojeKomplementarno-

koje se dopunjuje,

nadopunjujuće



Predmeti su one boje koju

reflektuju



Rastvori su one boje koju propuštaju,

a ne apsorbuju



Zašto je NaCl bezbojan, a

NiCl2 obojen?

11Na→1s2

2s2

2p6

3s1

Na+ →1s2 2s2 2p6 isto kao i Ne

Velika E da se prevede u pobuđenostanje ⇒u UV oblasti

28Ni → 1s22s22p63s23p64s23d8

Ni2+ → 1s22s22p63s23p64s23d6

Mala E da se prevede u pobuđeno

stanje⇒ u VIS oblasti



Koje je boje ovo jedinjenje?

600 620 640 660 680 700

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

A

λλλλ, nm



Šta nam govore UV-VIS spektri?

Kvalitativna analiza:Koja supstanca je u uzorku?

Ali ne možemo biti 100% sigurni

Aktivnost enzima preko pojave ili



Aktivnost enzima preko pojave ili

nestanka spektara njihovih supstrata.

NADH ima maxna 340 nm

NAD+ nema max na

340 nm



Ispitivanja aktivnosti brojnih enzima koji katalizujureakcije koje uključuju učešće redoks para

NAD+ /NADH.

Alkohol-dehidrogenaza katalizuje:

C2H5OH + NAD+

→ CH3CHO + NADH + H+

Raste apsorbancija na 340 nm

Sorbitol-dehidrogenaza katalizuje:D-Fruktoza +NADH → D-Sorbitol +NAD+

Smanjuje se apsorbancija na 340 nm

l



Kvantitativna analiza

kolika je koncentracija?



LAMBERT-BEEROV ZAKON

I k db

dI =−

∫∫ =−b I

J

dbk I dI p

00

bk I

I p=−

0ln

kb

p

e I I −=

0



Eksponencijalni oblik Lambertovog

zakona

kb p e I I −= 0

Intenzitet propuštene svetlosti eksponencijalno opada sa

debljinom sloja kroz koju svetlost prolazi.



U zakon se “ubacuje” i Beer sa

koncentracijom…

cba A =

Apsorbancija nekog rastvora srazmerna je koncentraciji

tog rastvora, debljini sloja kroz koji svetlost prolazi

i apsorptivnosti rastvorene supstance.

Beerov zakon:



Lambert-Beerov zakon

A- apsorbancija I

o- intenzitet upadne svetlosti

I p- intenzitet propuštene svetlosti a-(molarni) apsorpcioni koeficijent ili (molarna) apsorptivnost

b-dužina optičkog puta

c-koncentracija

cba

I

I A p

== 0log



Transparencija

Izražava se u procentima:

Veza između apsorbancije itransparencije:

0 I

I

T p

=

100%0

⋅= I

I T p

T T I

I

A

p 1

logloglog 0

=−=−=

T

T

A %log2

100

1001log −=⋅=

Važna veličina, jedino se može meriti

Ip



Veza izmeđ u A i T

IZMEĐU 20 - 80%T, ODNOSNO 0,1 - 0,7 A

T A log−=



Kalibraciona kriva

Beerov zakon:nagib=ab, odseč ak =0

cba A=

0,0

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

koncentracija

y= kx + n jednačina prave

A

Metoda kalibracione krive



Metoda kalibracione krive

(standardna, analitič ka kriva)

A=f(c)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

0,0

0,2

0,4

Ax

cx

A

c,%

Serija standardnihrastvora (najmanje 6)

poznatih koncentracija.Sa krive se odredinepoznata

koncentracija

O ič j L b B



Ogranič enja Lambert-Beerovog

zakonaJedan do dva reda veličine

U intervalu od 1x10-5 do 5x10-4mol/dm3 ili

1x10-4 do 1x10-3 mol/dm3

Dve grupe razloga: Zbog rastvorka i rastvarača,

t°C slabo Zbog aparata (pozadinsko

zračenje)

Isključivo zamonohromatskusvetlost!



Izbor radne talasne dužine

Zašto je najbolja kalibraciona kriva br. 1?



Instrumenti

mere APSORBANCIJU i TRANSPARENCIJU

FotometriSpektrofotometri

IZVOR ZRAČENJA

MONOHROMATORDETEKTOR



Izvori zrač enja-lampe VIS deo spektra: volframova lampa

(360- 950 nm)

UV deo spektra: deuterijumova i

vodonič na (190-420 nm)cevi za pražnjenje živina lampa- linijske spektre



Monohromator

Od polihromatske treba da izdvojimonohromatsku svetlost.

Sastoji se od:

1. Ulaznog i izlaznog razreza2. Sistema za kolimaciju (sočiva i ogledala)

3. Disperzionog elementa: prizma ilidifrakciona rešetka



Disperzioni element PRIZMA

DIFRAKCIONAREŠETKA

U VIS oblasti spektra-stakleneU UV oblasti spektra- kvarcne



KiveteStaklene- za VIS oblast

Kvarcne-za UV oblast

Najčešćeprečnika 1 cm (dužina

optičkog puta)



Kivete

Detektor: fotoćelija



Detektor: fotoć elija,

fotomultiplikator i fotodiode

Intenzitet fotostrujesrazmeran

intenzitetu svetlosti

i= k × ×× × Ip

Sheme



Sheme

spektrofotometra



Sheme spektrofotometara



Fotometar Jednostavniji uređaji od spektrofotometara

Samo u VIS oblasti spektra Meri se apsorbancija i transparencija obojenih rastvora- određuje se

koncentracija

Kao monohromatori FILTERI

Kako izabrati filter prema boji



Kako izabrati filter prema boji

ispitivanog rastvora?

Boja filtera jekomplementarna boji

ispitivanog rastvora.

To znači da filter trebamaksimalno da propustisvetlost one boje koju rastvormaksimalno apsorbuje.

Ako merimo apsorbanciju žutom



Ako merimo apsorbanciju žutom

rastvoru, izabraćemo filter:

CrveniŽuti

Zeleni

Narandžasti

Plavi

Ljubičasti



Šta je slepa proba?Rastvor = rastvorak + rastvarač

Apsorbuje i rastvorak i rastvarač

Eliminisati apsorbanciju (transparenciju)

rastvarača tako što se kazaljka instrumentadovede na 0 apsorbancije, odnosno 100%transparencije

Na taj način merenjem se dobija samoapsorbancija (transparencija) rastvorka.

Praktične vežbe



Praktič ne vežbe

1. SpektrofotometrijaSnimiti apsorpcioni spektar A=f(λ), naći λmax, na toj

talasnoj dužini izmeriti apsorbanciju standardnih

rastvora (koji ste prethodno napravili), nacrtatikalibracionu krivu i sa nje odrediti nepoznatukoncentraciju i molarni apsorpcioni koeficijent.

2. Fotometrija

Izmeriti apsorbanciju i transparenciju standardnog inepoznatog rastvora i izračunati koncentracijukoristeći metodu standarda.

Date post:	10-Feb-2018
Category:	Documents
Upload:	mikicacica
View:	240 times
Download:	0 times

UV VIS Spektrofotometrija

Documents