WESTERN BLOT

La técnica de inmunotransferencia (immunoblotting o Western blot) es un sistema rápido y muy sensible para la detección y caracterización de proteínas que se basa en la especificidad de reconocimiento entre antígeno y anticuerpo. Implica la separación por electroforesis en geles de poliacrilamida y una transferencia cuantitativa e irreversible a una membrana, de las proteínas de una mezcla compleja (lisado total celular). Los antígenos que se han transferido a la membrana son reconocidos por anticuerpos monoclonales policlonales específicos de ellos.

Directo:

• El anticuerpo primario marcado se une al antígeno de la membranay reacciona con el sustrato originando una señal detectable. En elmétodo directo de detección, el anticuerpo primario que se utilizapara detectar el antígeno sobre la superficie de la membrana, debeir marcado con una enzima

Indirecto

• El anticuerpo primario sin marcar reacciona con el antígeno. Luego,un anticuerpo secundario marcado se une al primario y reaccionacon el sustrato. En el método indirecto, se añade primero unanticuerpo primario sin marcar contra el antígeno de la superficiede la membrana; posteriormente se añade un anticuerposecundario marcado contra el anticuerpo primario.

Se usa principalmente para determinar la presencia o ausencia de una proteína concreta en una muestra. También nos puede ser útil para determinar los niveles de dicha proteína en esa muestra, o el tamaño de esta proteína, ya que en determinadas enfermedades el problema no es la ausencia total de una molécula sino su reducción o la expresión de una forma truncada de dicha proteína.

Enfermedades Inflamatorias Enfermedades Infecto-Contagiosas Perfil de Citoquinas en Modelos Experimentales Factores de Crecimiento Proteínas de Secreción Se emplea como prueba definitiva de la encefalopatía espongiforme bovina,

comúnmente llamada "enfermedad de las vacas locas". Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot.

En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar lapresencia del FIV en gatos.

Aunque el VIH suele detectarse mediante la técnica ELISA, el Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado positivo en un grupo que no es de riesgo o en una población donde la prevalencia del virus es muy baja.

Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Se transfieren a una membrana las proteínas de células que, se sabe, están infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hay que probar con esta membrana. Este paso es equivalente a la incubación con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero, serán estos los que realicen el papel de anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima-señal. La aparición de bandas indica la presencia de proteínas contra las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo.