Supporting Information� Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, 69451 Weinheim, 2011

New Insight into Marine Alkaloid Metabolic Pathways: Revisiting OroidinBiosynthesis

Gr�gory Genta-Jouve,[a] Nadja Cachet,[a] Serge Holderith,[b] FranÅois Oberh�nsli,[c] Jean-Louis Teyssi�,[c]

Ross Jeffree,[c] Ali Al Mourabit,*[d] and Olivier P. Thomas*[a]

cbic_201100449_sm_miscellaneous_information.pdf

S2  

General Information for the isolation and characterization processes 

Analytical and semi‐preparative HPLC purification were carried out on a Waters 600 system equipped with a Waters 996 Photodiode Array detector and a Waters 717 plus Autosampler. A fraction collector Foxy 200 (Roucaire) was used for automated collection after semi‐preparative HPLC. NMR experiments were performed on a Bruker Avance 500 MHz spectrometer. Chemical shifts (δ in ppm) are referenced to residual proton (δH 3.31) signals of CD3OD, the solvent. 

Isolation and characterization of oroidin (1). 

The dried sponge  (9.97 g) was cut  into pieces of about 1 cm3 and extracted with MeOH/CH2Cl2 1:1 at room  temperature  yielding  3.17  g of  crude  extract  after  solvent  evaporation.  The  crude  extract was fractionated by RP‐C18 Vacuum Liquid Chromatography  (elution with a decreasing polarity gradient of H2O/MeOH from 1:0 to 0:1, then MeOH/CH2Cl2 from 1:0 to 0:1). The H2O/MeOH 1:3 (0.41 g) was then subjected to RP‐C18 semi‐preparative HPLC (Waters, Symmetry C18, 300 × 7.8 mm, 7 µm) with a gradient of H2O/MeOH/TFA  (flow 3.0 mL.min‐1, 75:25:0.1  to 25:75:0.1)  to  yield pure oroidin  (1)  (tr: 25.5; 67.2 mg).  

2.62.83.03.23.43.63.84.04.24.44.64.85.05.25.45.65.86.06.26.46.66.87.07.27.4f1 (ppm)

-500

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

5500

6000

Oroidin

4.04

4.05

6.07

6.10

6.11

6.12

6.28

6.31

6.72

6.84

NH

O

NH

N

NHNH2

Br

Br

1H NMR (500 MHz, CD3OD) spectrum of oroidin (1). 

S3  

Quantification of oroidin (1). 

The quantification of oroidin (1) was performed by HPLC‐MS using an Agilent 1200 series HPLC coupled with 3200 QTRAP® LC/MS/MS AB Sciex Instrument. Injections were made on a Zorbax C18 (150 mm x 2.1 mm, 3.5 µm) column at 40 °C with a gradient mobile phase of H2O/MeOH/FA (flow 0.4 mL.min‐1, from 85:15:0.1 to 30:70:0.1 in 20 min). 

 

HPLC‐MS traces of oroidin (1) standard 

150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850m/z, Da

0.0

2.0e6

4.0e6

6.0e6

8.0e6

1.0e7

1.2e7

1.4e7

1.6e7

1.8e7

2.0e7

2.2e7

2.4e7

Inte

nsity

, cps

390.1

392.0

165.2 373.3 412.0299.6

S4  

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

0

50

100

150

200

250

Aera

(mA

U)

Qty (mg)

Equation y = a + b*xAdj. R-Square 0.99965

Value Standard ErrorAera Intercept 0 --Aera Slope 373.53565 2.63098

Oroidin (1) calibration curve. 

S5  

Global view of the protocol 

S6  

Kinetics of proline and arginine incorporation 

L‐[U‐14C]proline (9.95 GBq.mmol‐1, Amersham) 

L‐[U‐14C]arginine (12.8 GBq.mmol‐1, Perkin Elmer) 

A  sample  of  the  seawater  (2 mL)  present  in  the  closed  beaker was  counted  in  a  liquid  scintillation analyzer (Tri‐Carb 2900TR, Perkin Elmer). 

Color  Wet weight  Amino acid Added radioactivity  % incorporation after 12 h Red  6.1 g

L‐ [U‐14C]arginine 44 kBq 90 

Blue  6.9 g 52 kBq 97 Green  6.0 g

L‐[U‐14C]proline 44 kBq 98 

Pink  8.8 g 66 kBq 94 

S7  

Autoradiography parameters:

Semi‐automatic sample application for qualitative and quantitative analyses was performed with ATS 4 (CAMAG). Chromatogram development was performed with the automatic developing chamber ADC 2 (CAMAG). Beta‐radioactivity thin layer analysis was performed by RadioTLC with Rita Star (Raytest) and autoradiography was performed with beta‐imager  (Biospace  Lab).  For  thin  layer  chromatography we used HPTLC plates (Silica gel 60 RP‐18 F254, Glass plates 20 x 10 cm, Merck) for RadioTLC and TLC plates (Silica gel RP‐18W/UV254, aluminum sheets 20 x 20 cm, Merck) for autoradiography.

Limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) by autoradiography

Autoradiography counting of the radioactivity associated to spots of 36 mm2 deposited on a HPTLC plate was quantified on 85.25 mm2  squares with 65 h of  counting. The mean  value of  the background  for 

85.25 mm2 squares was measured as 0.314 cpm with 0.028 cpm of noise σ. We used statistical theory of hypothesis  testing  to define both detection  limit  (LOD) and quantification  limit  (LOQ)1.  LOD and  LOQ were then defined as: 

3.29 0.092 

  .  

Beta autoradiography detection efficiency

3.7 Bq of pure L‐[U‐14C]proline was deposited on a 36 mm2 square and 14C counting was measured by autoradiography on a 85.25 mm2 square containing the radioactive spot. 

 Deposited activity (Bq) 

dpm  cpm  Corrected cpm  Efficiency (%) 

L‐[U‐14C]proline  3.7  216 27.7 27.4 12.7 

                                                            1 1. Currie, L. A. Detection and quantification limits: basic concepts, international harmonization, and outstanding (“low‐level”) issues. Applied Radiation and Isotopes. 2004, Vol. 61, 61, pp. 145‐149. 

S8  

LOQ for the incorporation rate and isotopic ratio of oroidin (1)

The incorporation rate into oroidin (1) is given by: 

    % 100 ..

100 with 1.2 0.2

    0.0225 0.00375 0.314

ww: sponge wet weight in g ; m in mg and in the formula aexp is measured in cpm 

The LOQ of incorporation rate is: 

. % 

The isotopic ratio of oroidin (1) for a sponge of 1 g (wet weight) is given by: 

    1.2 0.2  

    45.10.314

 

sa: specific activity of the amino acid precursor in Bq.mmol‐1 and in the formula aexp is measured in cpm 

The LOQ of isotopic ratio for a sponge of 1 g (wet weight) is: 

.  

 

S9  

Metabolisation of L-[U-14C]proline into oroidin (1) after 3, 13 and 38 days

Each sponge individual (approximately 5 g ww) of Axinella damicornis was freeze‐dried and extracted 3 times by  20 mL of  CH2Cl2/MeOH  1:1  in  an ultrasonic bath. After  addition of  1  g of C18 phase  to  the organic extract the solvents were removed under reduced pressure. Desalting was performed by reverse phase SPE (Strata C18‐E, 2 g, phenomenex). Elution of the SPE cartridge with H2O/MeOH 1:3 (20 mL) led to the desalted P‐2‐AI secondary metabolites. 

For qualitative analyses: semi‐automatic sample application of the desalted extract was performed with ATS 4 and chromatogram development was performed with the automatic developing chamber ADC 2 on RP‐C18 HPTLC plates with H2O/MeOH/Formic Acid 2:8:0.4 as the eluent. Beta‐radioactivity thin  layer analysis was performed by RadioTLC with 3 h of counting time. 

For quantitative analysis: automated fractionation (1 tube.min‐1) of the desalted extract was performed by  RP‐C18  semi‐preparative  HPLC  (Waters,  Symmetry  C18,  300  ×  7.8 mm,  7  µm) with  a  gradient  of H2O/MeOH/TFA (flow 3.0 mL.min‐1, 75:25:0.1 to 25:75:0.1). Evaporation of the fractions was undertaken with Speedvac (Thermo Electron Corporation, SPD 111‐V). Oroidin (1) was collected pure in fraction 28 and dissolved in MeOH to a final concentration of 1 mg.mL‐1 as checked by HPLC‐MS (see before). Semi‐automatic sample application of oroidin (1) (100 µg in 6 mm × 6 mm squares) was performed with ATS 4 on C18 TLC plates. Beta autoradiography with beta imager was used for quantitative detection with 65 h of counting time on squares of 85.25 mm2 centered on the deposited spot. 

S10  

 Measured activity 

(cpm) Incorporation 

rate (%) Isotopic ratio (g‐1) 

O3  0.55  5.4E‐03 O13  1.43  2.5E‐02 O38  2.29  4.4E‐02  9.0E‐09 

 

L‐[U‐14C]proline (9.95 GBq.mmol‐1, Amersham) 

S11  

Metabolisation of L-[U-14C]arginine, L‐[1‐14C]ornithine hydrochloride, L-[U-14C]lysine and L‐[U‐14C]histidine into oroidin (1) after 13 days.

The same quantitative analytical protocol as above was used with 13 days of metabolization time, changing the amino acid precursor. 

 Measured Activity 

(cpm) Incorporation rate 

(%) Arginine  0,48  3.8E‐03 Ornithine  0,47  3.6E‐03 Lysine  1,70  3.1E‐02 Histidine  0,34  6.7E‐04 

 

L‐[U‐14C]lysine (9.25 GBq.mmol‐1, Hartmann analytic) 

L‐[U‐14C]histidine (12.5 GBq.mmol‐1, Amersham) 

L‐[U‐14C]arginine (12.8 GBq.mmol‐1, Perkin Elmer) 

L‐[1‐14C]ornithine hydrochloride (1.92 GBq.mmol‐1, Hartmann analytic)