ANÁLISIS COMPARATIVO DE LOS EVENTOS PATOLÓGICOS IMPLICADOS EN MODELOS TRALI INMUNES Y NO INMUNES

M. B. Tamarozzi,1 S. G. Soares,2 A. Sá Nunes,3 H. H. Paiva,1 F. P. Saggioro,4 A. B. Garcia,1 A. R. Lucena-Araujo,1 R. P. Falcão,1 J. O. Bordin5 & E. M. Rego1

ANTECEDENTES

El TRALI o Lesion Pulmonar Aguda Asociada a la Transfusion (Transfusion-related acute lung injury) se caracteriza por la transmigración de leucocitos a nivel de capilares alveolares Modelo Inmune: Se atribuye a la infusión de aloanticuerpos

Modelo No inmune: Presencia de moléculas Pro-inflamatorias en combinación con la posterior infusión de Modificadores de la Respuesta Biológica (BRMs)

INTRODUCCION TRALI es una complicación potencialmente mortal producida por las transfusiones Edema pulmonar bilateral Hipoxemia Hipotensión Fiebre CianosisFunción cardiaca normal

Ocurre dentro de 1-6 horas de la transfusión Se relaciona su aparición con transfusiones de Plasma Fresco Congelado y Concentrados Plaquetarios

INTRODUCCION Histológicamente se caracteriza por edema intersticial e intra-alveolar.

Alteración de la membrana alveolo-capilar

Migración de células inflamatorias

OBJETIVO El Objetivo de esta publicación es comparar los eventos patológicos implicados en el TRALI, inducidos por presencia de anticuerpos o por BRMS en modelos murinos. En el modelo inmune se utilizo anticuerpos específicos anti HNA-2 Se comparó los niveles de:

Moléculas de los queratinocitos derivados de las quimiocinas (KC)

Proteína inflamatoria de los Macrófagos (MIP-2) Interleucinas IL-1β, IL.6, IL8, TNF-α

La expresión de adhesinas CD11b, CD54, CD66, CD62L

MATERIAL Y METODO Los anticuerpos para la citometría de flujo fueron obtenidos de BD Bioscience (San Jose, CA, EE.UU.): anti-hCD11b, anti-hCD54, anti-hCD62L, anti-hCD66b, anti-mCD11b, anti mCD54, anti-mCD62L, anti- mCD66b, anti-MGR-1 y anti-mMHC clase II.

Los animales de experimentación: su utilizaron ratones NOD / SCID (NOD / LtSz PrKdcscid / PrKdcscid) y BALB, obtenidos de la Facultad de Ciencias Farmacéuticas de Ribeirão Preto de la Universidad de Sao Paulo. Machos de 8 a 10 semanas.

MATERIAL Y METODOModelo inmune de TRALI Se aislaron neutrófilos de donantes sanos con al menos 50% de HNA-2 (+)

Las células aisladas se suspendieron en 2-5 x 106 células / ml en RPMI 1640 y se incubaron con 5 μg / ml de anticuerpos monoclonales anti-HNA-2 (anti-CD177, clon 7D8)

Las células se lavaron y resuspendieron en PBS estéril a 5 x 106 células en 100 μL e inoculados por vía intravenosa en el plexo retro-orbital de ratones NOD / SCID

Después de 6 h, los ratones fueron sacrificados por ketamina / xilazina sobredosis, y los pulmones fueron aislados y perfundidos con solución salina.

MATERIAL Y METODOModelo no inmune de TRALI Se seleccionaron las dosis de 1 mg / kg de lipopolisacárido (LPS) y 50 ng / kg de factor activador de Plaquetas (PAF) PAF se utilizó como lípido bioactivo para simular los lípidos acumulados en sangre almacenada.

Ratones BALB / c fueron inyectados con 1 mg / kg intra-pulmonar de LPS, seguido de la administración intravenosa de 50 ng / kg de PAF 2 hrs más tarde. En los grupos de control, LPS y PAF fueron reemplazados por PBS.

Los animales fueron sacrificados 40 minutos después de la última inyección, y los pulmones se procesaron como se describe anteriormente

MATERIAL Y METODOEnsayo de mieloperoxidasa El secuestro pulmonar de neutrófilos se evaluó determinando los niveles de mieloperoxidasa (MPO) del tejido

Análisis de la filtración capilar-alveolar La extravasación de Azul de Evans en un lavado broncoalveolar (BAL) se utilizó para evaluar cuantitativamente las filtración capilar-alveolar

Se inyectaron ratones por vía intravenosa con colorante azul de Evans (25 mg / kg en 100 ll PBS). BAL se realizó por inyección intratraqueal de 1 ml PBS seguido por aspiración suave.

MATERIAL Y METODOAnálisis Histopatológico Se fijaron los pulmones izquierdos en formalina neutra al 10% durante 24 h y embebidos en parafina. Las secciones de tejido (5 μm) fueron teñidas con hematoxilina y eosina (H & E) para el análisis.

Para el modelo de TRALI inmune, otro conjunto de animales (N = 3 por grupo) se trató como se ha descrito anteriormente y los pulmones se incluyeron en metacrilato de glicol, se seccionaron a 2 μm y se tiñeron con H & E.

RESULTADOS MODELO INMUNE

Figura (a): Concentración de MieloperoxidasaFigura (b): Cuantificación de Azul de Evans por BAL

Figura (c): Corte histológico pulmón con anti-HNA

Figura (d): Grupo control inoculado sin anti-HNA

Figura (e): Sin inoculación de anti-HNA

RESULTADOS MODELO NO INMUNE

Figura (a): Concentración de MieloperoxidasaFigura (b): Cuantificación de Azul de Evans por BAL

Figura (c): PBS Figura (d): PAF Figura (e): LPS Figura (f): LPS + PAF

RESULTADOS AMBOS MODELOS

MEDICIÓN DE MOLECULAS DE ADHESIONFigura (a): Modelo InmuneFigura (b): Modelo no Inmune

RESULTADOS MODELO INMUNE

MEDICIÓN DE CITOQUINASFigura (a): Homogenizado pulmonar de ratones NOD / SCIDFigura (b): Producción in vitro de IL-8 en neutrófilos humanos

RESULTADOS MODELO NO INMUNE

MEDICIÓN DE CITOQUINAS Figura (c): Proteína inflamatoria de macrófagosFigura (d): Interleucinas

DISCUSION

ANÁLISIS COMPARATIVO DE LOS EVENTOS PATOLÓGICOS IMPLICADOS EN MODELOS TRALI INMUNES Y NO INMUNES

M. B. Tamarozzi,1 S. G. Soares,2 A. Sá Nunes,3 H. H. Paiva,1 F. P. Saggioro,4 A. B. Garcia,1 A. R. Lucena-Araujo,1 R. P. Falcão,1 J. O. Bordin5 & E. M. Rego1