MICOLOGIA ITALIANA anno XLII, n. 1-2-3, gennaio-dicembre 2013

Parole chiave

Phragmites australis, die-back, controllo biologico, Trichoderma

saturnisporum

Keywords

Phragmites australis, die-back, biological control, Trichoderma

saturnisporum

Antagonismo in vitro tra Gibberella fujikuroi e funghi endofiti associati a Phragmites australisIn vitro antagonism between Gibberella fujikuroi and fungal endophytes associated with Phragmites australis

Riassunto

Il fenomeno del declino delle popolazioni di Phragmitesaustralis (Cav.) Trin. ex Steudel è stato osservato in diversi paesi europei, inclusa l’Italia, e riferito principalmente al-la sindrome di die-back. I fattori coinvolti nel fenomeno so-no numerosi, di natura sia abiotica sia biotica. Tra i fattori biotici possono assumere notevole rilevanza le tossine pro-dotte da alcuni patogeni vegetali, come Gibberella fujiku-roi (Sawada) Wollenw. Al fine di individuare un’opportuna strategia di controllo biologico nei confronti di G. fujikuroi,capace di assicurare la protezione del delicato equilibrio dell’ecosistema palustre a dominanza di P. australis, lo sco-po di questo studio è stato quello di saggiare l’attività an-tagonistica in vitro di alcuni funghi endofiti nei confronti di G. fujikuroi. I risultati hanno evidenziato che alcuni isola-ti fungini utilizzati hanno inibito la crescita della colonia di G. fujikuroi in coltura duale. Trichoderma saturnisporum ha mostrato il massimo effetto inibitore sulla crescita mice-liare di G. fujikuroi, mentre gli isolati di Acremonium sp., Penicillium concentricum e Pycnidiophora dispersa hanno evidenziato una inibizione della crescita miceliare mode-sta. In coltura duale con G. fujikuroi, l’antagonista T. satur-nisporum ha determinato l’ arresto della crescita della co-lonia a distanza seguito dalla completa sovrapposizione di G. fujikuroi. Questi risultati dimostrano il potenziale ruolo dei funghi endofiti nella prevenzione o riduzione dei danni causati da G. fujikuroi a carico degli individui di P. australis.

PAOLA ANGELINI

ANNA PANTAZI

DANIELA GIGANTE

ALESSANDRO PROPERZI

ROBERTO VENANZONI

Dipartmento di Biologia Applicata, Università di Perugia, Borgo XX giugno 74 -

06121 Perugiae-mail: paola.angelini@unipg.it

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Summary

The decline of the common reed, Phragmites austra-lis (Cav.) Trin. ex Steudel (Poaceae) has been observed in many European countries, including Italy, and primarily as-cribed to the die-back syndrome. Several biotic and abiotic factors have been implicated in P. australis decline, the bi-otic factors including toxins produced by plant pathogens such as Gibberella fujikuroi (Sawada) Wollenw. In order to identify a suitable strategy for biologically controlling G. fu-jikuroi and ensuring the protection of the delicate ecologi-cal balance of P. australis-dominated ecosystems, this study tested the in vitro antagonistic activity of some endophytic fungi against G. fujikuroi.

The result showed that some of these fungal isolates could inhibit G. fujikuroi mycelial growth in dual cultures. Trichoderma saturnisporum Hammill had the maximum in-hibitory effect on G. fujikuroi mycelial growth, whereas iso-lates of Acremonium sp., Penicillium concentricum Samson, Stolk & Hadlok and Pycnidiophora dispersa Clum showed significantly modest mycelial growth inhibition. In dual cul-tures with G. fujikuroi, the antagonistic T. saturnisporumshowed initial deadlock, followed by complete replacement of G. fujikuroi.

These results demonstrate the potential role of fungal en-dophytes to prevent or reduce damage caused by G. fujik-uroi to reed plants.

Introduzione

Gli individui di popolazioni naturali di Phragmitesaustralis (Cav.) Trin. ex Steudel (cannuccia di palu-de) convivono con una moltitudine di microrganismi che possono svolgere nell’ecosistema palustre diverse funzioni e dare luogo a situazioni di convivenza dura-ture nel tempo (WONG et al., 1999; LUO et al., 2004; VAN RYCKEGEM e VERBEKEN, 2005; VAN RYCKEGEM et al.,2007); tra questi microrganismi si hanno anche gli en-dofiti (dal greco “endon”, dentro e “ phyton”, pianta) (PELAEZ et al., 1998; WIRSEL et al., 2001; ERNST et al.,2003; NEUBERT et al., 2006; KHIDIR et al., 2010). Una categoria di endofiti è rappresentata da microrgani-smi fungini ed è stato stimato che possano costituire più di un milione di differenti specie di cui solo una piccola quota, circa il 5% è stata identificata (OWEN e HUNDLEY, 2004). Un endofita è un organismo che vi-

ve all’interno di un tessuto vegetale in un certo momento del ciclo biologico della pianta, con il quale instaura re-lazioni neutrali o mutualistiche ed al quale non causa alcun sintomo di ma-lattia (SCHULZ e BOYLE, 2005; RAGAZZI,2009) se non nel momento in cui la pianta ospite è soggetta a condizioni di stress. Il termine “endofita” descrive quindi uno status transitorio, poiché la stabilità o la variabilità dell’interazio-ne asintomatica dipende da numerosi fattori (SCHULZ e BOYLE, 2005).

Un fungo patogeno rimane tale an-che se presenta una lunga fase endo-fitica asintomatica. L’endofita, inteso in senso stretto, è tale anche se, dopo es-sersi insediato in una nicchia limitata, ne invade estesamente i tessuti interni e ne provoca il deterioramento (HYDE

e SOYTONG, 2008). A livello molecola-re e biochimico il fungo endofita può scatenare realmente delle alterazio-ni negative, ma tanto deboli da non produrre sintomi visibili a carico del-la pianta o dell’organo, bloccando-si così in una fase latente, in un inter-vallo di tempo tra il momento dell’in-fezione e il momento dell’apparizione del sintomo (SINCLAIR e CERKAUSKAS,1996; RAGAZZI, 2004). Si ha prova evi-dente della sua presenza solamente quando l’ospite subisce uno stress o si approssima alla senescenza, quan-do cioè si innescano appropriati sti-moli ecologici o fisiologici (RAGAZZI etal., 2003; ELMER e MARRA, 2011). In particolari circostanze, tuttavia, alcu-ni endofiti possono diventare parassi-ti e contribuire ad aggravare lo stato di deperimento dell’ospite (RAGAZZI etal., 2003; CORNICK et al., 2005; LYGIS

et al., 2005; GONTHIER et al., 2006; GIORDANO et al., 2008; ELMER e MAR-

RA, 2011).Vari sono stati gli studi condotti in

diverse aree geografiche allo scopo di definire la composizione della po-

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polazione endofitica fungina di varie specie vegetali. In particolare, nel La-go Trasimeno è stata studiata la popo-lazione endofitica fungina relativa ad individui di P. australis mostranti un di-verso grado di declino (PICCO et al.,2011; ANGELINI et al., 2012; PEROTTO

et al., 2013). Tale declino è stato in-terpretato come il risultato della sin-drome di die-back descritta da VAN

DER PUTTEN (1997) come un fenome-no anomalo, spontaneo e irreversibile di ritiro, distruzione o scomparsa di un canneto maturo osservabile in un ar-co di tempo più breve di un decennio.

A partire dagli anni ’50 in Svizze-ra, sono divenute sempre più frequen-ti in Europa centrale e nord-orienta-le le segnalazioni di ecosistemi palu-stri a dominanza di P. australis affet-ti dal fenomeno del die-back (GIGAN-

TE et al., 2011). I fattori coinvolti sono numerosi, di diversa natura (abiotici, biotici ed antropici) e possono esse-re distinti in predisponenti (condizio-ni chimiche sfavorevoli dell’acqua e del sedimento, scarsa variabilità intra-specifica dovuta alla preponderanza dei fenomeni di propagazione vege-tativa, allelopatia e auto-allelopatia, competizione radicale, danno mec-canico), scatenanti (prolungata per-sistenza del periodo di sommersione, diffusione di parassiti animali e vege-tali particolarmente aggressivi) e con-comitanti (diffusione di parassiti non aggressivi capaci di aggravare lo sta-to di salute di individui già fortemen-te debilitati).

Il declino di P. australis si manifesta attraverso un complesso quadro sin-tomatologico. Riduzione dell’altezza, del diametro ed in generale della ta-glia degli individui, indebolimento dei culmi, accrescimento in cespi, eleva-ta mortalità di gemme ed apici radica-li, disseccamento precoce, fenomeni anomali di lignificazione e suberizza-

zione dei tessuti, formazione di callus e blocchi nell’a-erenchima, anomalie nell’epoca di fioritura, anoma-lie nell’architettura dell’apparato radicale sono alcu-ni tipici tratti diagnostici del fenomeno evidenziati in numerosi studi in Europa settentrionale (una sintesi è riportata in VAN DER PUTTEN, 1997). Il risultato com-plessivo è un degrado incrementale del canneto ed il suo progressivo arretramento. Molti di tali caratte-ri sono stati riscontrati nella popolazione di cannuc-cia del Lago Trasimeno, dove il presente studio è sta-to condotto (GIGANTE et al., 2011; GIGANTE e VENAN-

ZONI, 2012; REALE et al., 2011, 2012).Tra i fattori biotici che possono avere un ruolo nel

fenomeno, ci sono alcuni endofiti capaci di assume-re comportamento patogenetico, come Gibberella fujikuroi (Sawada) Wollenw (LESLIE, 1999; LESLIE et al., 2004; SERGHAT et al., 2005). Tale specie fungina, in un contesto di declino di P. australis, può essere conside-rata uno dei principali fattori che contribuiscono al-la mortalità (PICCO et al., 2011; ANGELINI et al., 2012; PEROTTO et al., 2013).

Al fine di individuare un’opportuna strategia di controllo biologico nei confronti di G. fujikuroi, (rite-nuto un fattore concomitante ad altri fattori di natura biotica ed abiotica) capace di assicurare la protezio-ne del delicato equilibrio dell’ecosistema palustre a dominanza di P. australis, lo scopo di questo studio è stato quello di selezionare degli endofiti fungini con capacità antagonistiche nei confronti di G. fujikuri da saggiare in programmi di lotta biologica capaci di ri-spettare il delicato equilibrio di tali ambienti naturali di rilevante importanza conservazionistica.

Materiali e metodi

I funghi endofiti sono stati isolati da campioni di ra-dici e foglie di individui di P. australis provenienti da diversi siti del Lago Trasimeno caratterizzati da un di-verso grado di declino, sulla base di quanto riportato in GIGANTE et al., (2011) e REALE et al., (2012).

In particolare sono stati prelevati campioni nei se-guenti siti: 1) Oasi “La Valle”: individui con gravi sin-tomi di declino; 2) Porto di Panicarola: individui con lievi segni di declino; 3) Rio Pescia: individui con nor-male aspetto e crescita vigorosa; 4) Passignano: in-dividui con normale aspetto e crescita vigorosa. La

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sterilizzazione dei campioni di radici e foglie e l’iso-lamento degli endofiti sono stati effettuati secondo il metodo di ARNOLD et al. (2007). Tutti gli isolati fungini sono stati identificati mediante metodi morfo-moleco-lari (ANGELINI et al., 2012).

Valutazione dell’attività antagonistica degli

isolati

Tra tutti gli isolati ottenuti ne sono stati scelti 9 di cui alcuni appartenenti a generi già noti per le loro po-tenziali capacità antagonistiche (Trichoderma, Acre-monium) e altri a generi più attivi nel colonizzare e pigmentare il substrato (Penicillium, Pycnidiophora, Talaromyces) (Tab. 1).

La loro attività antagonistica è stata valutata nei confronti del fungo patogeno Gibberella fujikuroi (Sa-wada) Wollenw utilizzando due metodologie: il meto-do degli accrescimenti delle colonie (ANSELMI et al.,1992) e quello delle interazioni fra le colonie (BA-

DALYAN et al., 2002).Per entrambi i metodi i 9 endofiti sono stati posti

in confronto duale con G. fujikuroi. A tal fine, due di-schetti di agar di 5 mm di diametro, colonizzati dal micelio uno del patogeno e l’altro dell’endofita, pre-levati dal margine di colonie di 7 giorni di età, sono stati posti alla distanza di 4,5 cm uno dall’altro in pia-stre Petri (Ø 10 cm), contenenti 20 ml di Agar Pata-ta Destrosio (PDA, Fluka). Le prove relative a ciascu-na combinazione endofita-patogeno sono state alle-stite con tre replicazioni. Nel controllo il micelio di G.fujikuroi è stato posto a confronto con agar non colo-

nizzato da micelio; le piastre così otte-nute sono state incubate in termostato a 25 °C ed in assenza di luce.

Per il metodo degli accrescimenti, dopo 24 ore dall’inoculazione è stato misurato l’accrescimento radiale del-le due colonie lungo due direttrici tra loro ortogonali. I rilievi sono continuati fino a quando le colonie del controllo hanno raggiunto il margine della pia-stra. L’inibizione percentuale dell’ac-crescimento (I) è stata calcolata appli-cando la seguente formula: I = (R.M.-r.m.) / R.M. x 100 dove r.m. è il rag-gio delle colonie in direzione dell’an-tagonista e R.M. è la media dei tre raggi della colonia nelle altre direzio-ni. I dati ottenuti sono stati elaborati statisticamente, previa trasformazione angolare, mediante ANOVA e test di Duncan (P 0,05).

Nel metodo delle interazioni ifa-li, la valutazione dell’attività antago-nistica dei funghi endofiti è stata ef-fettuata dopo 30 giorni di incuba-zione, utilizzando un indice di anta-gonismo calcolato secondo la meto-dologia proposta da BADALYAN et al.(2002). Essa contempla 7 tipi di in-terazioni tra le colonie delle specie a confronto, a ciascuna delle quali vie-

Endofiti Nr. isolato Tessuto

Acremonium sp. 60 R, F

Hypocrea koningii Lieckf., Samuels & W. Gams 36 R, F

Penicillium concentricum Samson, Stolk & Hadlok 53 R

Penicillium raistrickii G. Sm. 35 R

Pycnidiophora dispersa Clum 5 L

Talaromyces flavus (Klöcker) Stolk & Samson 27 R, L

Trichoderma harzianum Rifai 31 R

Trichoderma saturnisporum Hammill 2 R

Zopfiella latipes (N. Lundq.) Malloch & Cain 48 R

Tab. 1 - Specie fungine isolate da radici (R ) e foglie (F) di Phragmites australis, impiegate nelle prove di antagoni-smo in coltura duale.

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ne assegnato un valore (Tab. 2). L’in-dice di antagonismo (IA) è calcola-to mediante la formula: IA = n x i, dove n rappresenta la frequenza di ciascun tipo d’interazione e i il rela-tivo valore. L’elaborazione statistica dei dati è stata effettuata mediante analisi della varianza e test di Dun-can (P 0,05).

Risultati

Inibizione dell’accrescimento delle colonie di G.

fujikuroi

I risultati dell’inibizione dell’accrescimento delle colonie di G. fujikuroi, sintetizzati in Tab. 3, hanno evi-denziano come T. saturnisporum abbia l’effetto inibi-tore massimo sulla crescita miceliare (30 gg. dopo l’i-

Tab. 2 – Caratteristiche delle interazioni ifali e valori numerici attribuiti secondo la scala di Badalyan et al. (2002).

Tipologie di

interazioni ifaliCaratteristiche Valori numerici

AArresto della crescita delle colonie per contatto con reciproca inibizione

1

B Arresto a distanza senza contatto miceliare 2

C Crescita di una colonia sull’altra senza arresto iniziale 3

CA1Parziale crescita di una colonia sull’altra dopo arresto iniziale per contatto

3,5

CB1Parziale crescita di una colonia sull’altra dopo arresto iniziale a distanza

4

CA2Completa crescita di una colonia sull’altra dopo arresto iniziale per contatto

4,5

CB2Completa crescita di una colonia sull’altra dopo arresto iniziale a distanza

5

Funghi antagonistiG. fujikuroi (isolato 34) (% riduzione accrescimento)

Acremonium sp. 5,1 (± 0,63) b

Hypocrea koningii 29,1 (± 1,12) f

Penicillium concentricum 8,9 (± 0,17) c

Penicillium raistrickii 24,1 (± 0,63) e

Pycnidiophora dispersa 16,5 (± 0,86) d

Talaromyces flavus 51,9 (± 0,52) i

Trichoderma harzianum 43 (± 1,15) g

Trichoderma saturnisporum 59,5 (± 0,86) h

Zopfiella latipes 26,6 (± 0,34) ef

Controllo * 0 (± 0,00) a

Tab. 3 – Inibizione percentuale (I%) dell’accrescimento radiale delle colonie di G. fujikuroi per effetto dei funghi an-tagonisti (dopo 30 gg dall’inoculazione).

I valori sono la media di tre ripetizioni ± errore standard. I dati seguiti da lettere differenti indicano dif-ferenze significative secondo il test di Duncan (p 0,05) .*: Colonie di G. fujikuroi cresciute in assenza di antagonisti.

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noculazione) (ANGELINI et al., 2008 a, b; ANGELINI etal., 2009; ANGELINI et al., 2010), con una riduzione delle dimensioni della colonia di circa il 60% rispet-to al controllo, mente gli isolati di Acremonium sp., P. concentricum e P. dispersa mostrano una inibizione della crescita miceliare modesta, con una riduzione delle colonie che varia da 5,1 a 16,5% (differenze sta-tisticamente significative).

Interazione fra le colonie dei funghi posti a

confronto

Le colture duali sono state esaminate dopo 30 gior-ni per valutare il tipo di interazione tra le colonie dei funghi posti a confronto, in accordo con BADALYAN etal. (2002). I risultati sono mostrati in Tab. 4. Sono sta-te osservate 4 tipologie di interazioni: A, B, CB1 e CB2.

Sebbene tutti i funghi abbiano mostrato un’attività antagonistica, questa è risultata maggiormente eleva-ta da parte di T. saturnisporum (IA= 5), T. harzianum (IA= 4), H. koningii (IA= 4), Acremonium sp. (IA= 4) e P. dispersa (IA= 4), più moderata da parte degli al-tri isolati.

In particolare T. saturnisporum e T. harzianum han-no mostrato un’azione antagonistica contro il patoge-no G. fujikuroi caratterizzata dall’arresto delle ife a di-stanza (Fig. 1c, d) seguito dalla parziale o completa (Fig. 1d) sostituzione di G. fujikuroi.

Sulla base del tipo di interazioni antagonistiche osservate nelle prove in coltura duale le due specie di Trichoderma sono risultate quelle maggiormente

competitive nei confronti del patoge-no saggiato raggiungendo il più ele-vato valore di IA (Tab. 4).

Discussione

L’impiego di funghi antagonisti è un utile mezzo di difesa delle piante da agenti fitopatogeni fungini. I risul-tati di questa ricerca hanno consenti-to di selezionare nuovi isolati fungini che per le loro capacità antagonisti-che si candidano per essere saggia-ti in programmi di lotta biologica, at-ti a prevenire o ridurre i danni causati dalle tossine (acido gibberellico, mo-niliformina, fumonisine, acido fusari-co, beauvericina, fusaproliferina) pro-dotte dal fungo patogeno Gibberel-la fujikuroi a carico della cannuccia di palude (Phragmites australis) (LE-

SLIE et al., 2004; ANGELINI et al., 2012; PEROTTO et al., 2013). È infatti ormai ben noto che gli endofiti sono in gra-do di prevenire o ridurre i danni cau-sati dai patogeni alle piante attraverso diversi meccanismi d’azione quali: la competizione per le sostanze nutritive

Endofiti Tipologie di interazione1 Indice di antagonismo2

Acremonium sp. CB1* 4 c

Hypocrea koningii CB1* 4 c

Penicillium concentricum B 2 b

Penicillium raistrickii B 2 b

Pycnidiophora dispersa CB1* 4 c

Talaromyces flavus A 1 a

Trichoderma harzianum CB1* 4 c

Trichoderma saturnisporum CB2* 5 d

Zopfiella latipes B 2 b

1. Vedi Tab. 2. 2. I dati seguiti da lettere differenti indicano differenze significative secondo il test di Dun-can (P 0,05). *, le colonie dei funghi endofiti si accrescono su quelle di G. fujikuroi.

Tab. 4 – Indice di antagonismo e tipologie di interazione tra i funghi antagonisti e G. fujikuroi (isolato 34) secondo la scala di Badalyan et al. (2002).

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e lo spazio, la produzione di inibitori allelochimici (batteriocine, antibiotici, enzimi litici), e l’induzione della rispo-sta sistemica (BAILEY et al., 2008). Nel presente lavoro, molto probabilmen-te, T. flavus e Acremonium sp. hanno inibito lo sviluppo del patogeno attra-

verso la produzione di metaboliti secondari diffusibili che ne hanno bloccato le ife (Fig. 1a, b) (MADI et al.,1997; WICKLOW et al., 2005).

Tuttavia, grazie alla maggiore capacità di inibire la crescita delle colonie di G. fujikuroi ed al maggior indice di antagonismo, T. saturnisporum è un buon candidato per ulteriori studi riguardanti test con iso-

Fig. 1. Interazioni tra le colonie di G. fujikuroi e di alcuni endofiti in coltura duale su PDA. a – parziale crescita di Acremonium sp. su G. fujikuroi dopo arresto iniziale a distanza (CB1), dopo 20 giorni di incubazione. b – Arresto do-po contatto tra G. fujikuroi e T. flavus (A), dopo 20 giorni di incubazione; si osserva una pigmentazione brunastra della colonia di G. fujikuroi. c – arresto iniziale a distanza tra G. fujikuroi e T. harzianum (CB1), dopo 10 giorni di in-cubazione. d - completa crescita di T. saturnisporum su G. fujikuroi dopo arresto iniziale a distanza (CB2); dopo 10 giorni di incubazione.

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lati provenienti da diverse aree geografiche e diver-se specie botaniche.

Per vari anni, le ricerche sui Trichoderma hanno preso in esame le specie ad habitus terricolo (HAR-

MAN et al., 2004); solo recentemente l’attenzione è stata rivolta verso quelle specie in grado di colonizza-re, come endofiti, i tessuti di piante erbacee e legnose (BAILEY et al., 2008) e di essere potenzialmente utiliz-zate come agenti di biocontrollo (MEJIA et al., 2008). In studi recenti è stata dimostrata per alcune specie di Trichoderma la capacità di indurre nella pianta ri-sposte sistemiche di difesa (HORST et al., 2005; VINA-

LE et al., 2008).Ciò ha ampliato le possibilità di utilizzare come

bio-fungicidi questi funghi che per le loro capacità, sia come micoparassiti, sia come produttori di meta-boliti bioattivi vengono studiati da più di 30 anni con buoni risultati (VERMA et al., 2007). Per esempio, at-tualmente la lotta biologica contro le principali fito-patie del cacao in centro America si basa proprio sull’impiego di specie endofite appartenenti al gene-re Trichoderma con capacità antimicrobiche (TONDJE

et al., 2006).In conclusione, se i risultati della presente ricerca,

ottenuti in laboratorio, verranno confermati in plan-ta, in serra e in pieno campo, sarà possibile mettere a punto tecniche di lotta biologica contro G. fujiku-roi, specie fungina coinvolta nel declino di P. australis.

A tal fine sarà opportuno caratterizzare i metaboli-ti prodotti da T. saturnisporum e studiare la capacità di penetrazione attiva o passiva degli stessi all’inter-no della pianta.

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