FCCP behoudt significante invloed op het zuurstofverbruik in mitochondriën als complex III in de oxidatieve fosforylering geremd is door antimycine A

Rijkje Bresser (2565799)Caro Bruna (2564831)

BiochemieVrije Universiteit Amsterdam

18/11/2014

INHOUDSOPGAVE

Lijst van afkortingen.....................................................1

Abstract..................................................................2

Inleiding.................................................................3

Achtergrondinformatie...................................................3

Probleemgebied..........................................................5

Onderzoekshypothese.....................................................5

Probleemgebied..........................................................5

Onderzoekshypothese.....................................................6

Materiaal en methode......................................................6

Onderzoeksobjecten......................................................6

Procedure...............................................................6

Data-analyse............................................................7

Resultaten................................................................8

In welke mate heeft het toevoegen van de ontkoppelaar (FCCP) invloed op het zuurstofverbruik als complex III in de oxidatieve fosforylering geremd is met antimycine A?.....................8

Wat is de IC50 van antimycine A na FCCP toegevoegd te hebben?..........................9

Discussie................................................................10

Referentielijst..........................................................12

Bijlage..................................................................13

1

FCCP: trifluorocarbonylcyanide phenylhydrazoneATP: adenine trifosfaatADP: adenine difosfaatPi: pyrofosfaatIC50: half maximal inhibitory concentrationRM: reactiemediumNADH: nicotinamideadeninedinucleotide

2

LIJST VAN AFKORTINGEN

Het doel van dit onderzoek was om te onderzoeken wat het effect is, als FCCP (ontkoppelaar) en antimycine A (remmer complex III) beide worden toegevoegd aan geïsoleerde mitochondriën uit rattenlevers. Bovendien is er onderzoek gedaan naar de IC50 van antimycine A. Het gebruikte substraat voor dit onderzoek is malaat en door middel vaneen oxigraaf is de afname in zuurstofconcentratie gemeten tijdens het toevoegen van antimycine A en FCCP. Er is gevonden dat antimycine A een hele sterke remmer van complex III is. Bovendien isgevonden dat FCCP significante invloed behoudt op het zuurstofverbruik in mitochondriën als complex III in de oxidatieve fosforylering geremd is door antimycine A. De resultaten wijken af van de hypothese aangezien FCCP nog steeds een invloed heeft op de zuurstofconcentratie als complex III in de oxidatieve fosforylering geremd is. De IC50 kon niet bepaald worden, omdat de gebruikte concentratie van antimycine A te hoog was.

ACHTERGRONDINFORMATIE

Ademhaling is een van de belangrijkste processen voor bijna alle levende organismen op de aarde. Bij de ademhaling stroomt er lucht van buiten via de longen naar de longblaasjes. Hierbij vindt een uitwisseling van gassen plaats. Zuurstof wordt afgegeven aan de bloedstroom en wordt verspreid door het hele lichaam naar alle cellen, terwijl koolstofdioxide (afval) wordt afgegeven aan de longen om vervolgens weer afgegeven te worden aan de buitenlucht(Stryer 2006). De cel ademhaling vindt plaats in de mitochondriën. Hierbij wordt energie, ATP (adenine trifosfaat), gesynthetiseerd. Glucose wordt omgezet door middel van het proces glycolyse, waarbij een belangrijk

3

ABSTRACT

INLEIDING

substraat wordt gemaakt: pyruvaat. Pyruvaat kan de matrix van de mitochondriën in diffunderen. Als pyruvaat eenmaal in de matrix aanwezig is kan een ander belangrijk proces plaatsvinden, namelijk de citroenzuurcyclus1. De citroenzuurcyclus vindt plaats in de matrixvan het mitochondrion. Bepaalde producten van de citroenzuurcyclus kunnen vervolgens als protondonor (H+) de oxidatieve fosforylering van de mitochondriën in werking zetten.

Figuur 1: Citroenzuurcyclus (www.gopixpic.com 22/11/2014)

Bij de omzetting van malaat naar oxaalacetaat in de citroenzuurcyclus wordt NAD+ omgezet tot NADH+H+ (een protondonor)2. Dit product kan gebruikt worden in het eerste complex van de oxidatieve fosforylering van het mitochondrion. Er zijn in totaal 5 complexen, een co-enzym Q (ubiquinon) en eiwit cytochroom c, die de oxidatieve fosforylering reguleren3. Bij het product NADH+H+ worden daarvan 4 complexen gebruikt, complex I,III,IV en V, het co-enzym Q en cytochroom c. Als NADH+H+ interactie aangaat met het eerste complex van de oxidatieve fosforylering, komen er 4 protonen en 2 elektronen vrij. Deze protonen worden de matrix uit gepompt naar de intermembraanruimte en de elektronen worden doorgegeven aan het volgende complex, complex III, via co-enzym Q. Bij complex III worden 2 protonen uit de matrix gepompt en de elektronen worden weerdoorgegeven naar complex IV via het eiwit cytochroom c. Bij complex

1 Zie figuur 1 in het verslag2 Zie figuur 1 in het verslag3 Zie figuur 2 in het verslag

4

IV worden weer 4 protonen de intermembraanruimte ingepompt. De elektronen worden afgegeven aan zuurstof. Ze gaan een interactie aanmet waterstof en vormen zo water.De reactie gaat als volgt: O2 + 4H+ 2H2O (met 2 elektronen). Door middel van complex V worden 4 protonen terug de matrix ingepompt en worden ook ADP (adenine difosfaat) en Pi (pyrofosfaat) de matrix ingepompt. ADP en Pi worden omgezet in ATP.

Figuur 2: Oxidatieve fosforylering (home.kpn.nl 22/11/2014)

Bepaalde stoffen kunnen een sterke invloed hebben op de oxidatieve fosforylering. Zo zijn er bepaalde remmers en ontkoppelaars voor de complexen. Antimycine A staat bekend om het remmen van complex III. Als complex III geremd is kan er geen elektronentransport plaatsvinden naar complex IV en zal de reactie van zuurstof naar water dus niet, of in sterk verminderde mate optreden. Dan is er duseen zeer lage ademhaling en dus een lage omzetting van de zuurstof in de mitochondriën. Trifluorocarbonylcyanide phenylhydrazone (FCCP), een ontkoppelaar, maakt het membraan permeabel waardoor protonen gemakkelijk de membraan kunnen passeren. Hierdoor neemt de membraanpotentiaal sterkaf. Er staat dus geen spanning meer over het membraan, omdat aan

5

beide kanten een gelijke concentratie van protonen is. Deze potentiaal is wel noodzakelijk voor het maken van ATP. Door de aanwezigheid van FCCP kunnen de complexen van de elektronentransportketen maximaal werken, hierdoor zal het zuurstofverbruik heel hoog zijn.

PROBLEEMGEBIED

De oxidatieve fosforylering is een belangrijk deel van de ademhalingvan de cel. Deze wordt vooraf gegaan door de glycolyse, waar pyruvaat ontstaat. Het gevormde pyruvaat wordt de matrix van de mitochondriën in getransporteerd en daar verder afgebroken door de citroenzuurcyclus. Hier ontstaat malaat, wat wordt omgezet in oxaalacetaat, waarbij NADH+H+ ontstaat. Dit product wordt gebruikt voor zijn elektronen. De afgestane elektronen doorlopen de complexenin de elektronentransportketen. Er kan invloed worden uitgeoefend opdeze complexen door verschillende stoffen die de complexen remmen ofstimuleren. Voor dit onderzoek zijn de effecten van twee van deze stoffen bekeken, namelijk de remmer van complex III (antimycine A) en de ontkoppelaar (FCCP). Het is al bekend uit de Handleiding (van Zon, L, 2014) wat deze twee stoffen afzonderlijk van elkaar doen.Het is echter niet bekend wat het effect is als deze twee stoffen incombinatie met elkaar worden gebruikt. Daarom is in dit onderzoek onderzocht in welke mate het toevoegen van de ontkoppelaar (FCCP) invloed heeft op het zuurstof verbruik als complex III in de oxidatieve fosforylering geremd is met antimycine A. ONDERZOEKSHYPOTHESE

De hypotheses zijn gebaseerd op de informatie gegeven in de Handleiding (van Zon, L, 2014). Eerst wordt de antimycine A toegevoegd, dit remt de afname van zuurstofconcentratie (er is een sterk verminderde elektronenoverdracht). Daarna wordt de FCCP pas toegevoegd. Dit zou in afwezigheid van een remmer moeten zorgen vooreen enorme daling in de zuurstofconcentratie. Dus wordt er met antimycine A verwacht dat er sterk verminderde omzetting van zuurstof plaatsvindt, omdat complex III al geremd is. Er komen veel minder tot geen elektronen van complex III naar complex IV. Hierdoorwordt zuurstof niet omgezet tot water, omdat complex IV de elektronen niet ontvangt. In theorie zou FCCP dus zijn werking moeten verliezen. De uitkomst die verwacht wordt, is een hele sterke

6

afname in zuurstofverbruik, direct nadat de remmer antimycine A is toegevoegd. Zelfs zo sterk dat er bijna geen zuurstof meer om wordt gezet tot water. Als dan daarna de FCCP wordt toegevoegd, wordt er verwacht dat er geen verandering meer te zien is in de grafiek in dezuurstofconcentratie over de tijd. De werking van de remmer is zo dominant dat het toevoegen van de ontkoppelaar geen invloed meer zalhebben op de zuurstofconcentratie.

PROBLEEMGEBIED

Wat in dit onderzoek onderzocht is, is wat het effect zou zijn als eerst de ontkoppelaar wordt toegevoegd en dan pas de remmer van complex III. Theoretisch gezien zou het effect van de FCCP vrijwel helemaal opgeheven moeten worden. Er zal worden onderzocht wat de IC50 (half maximal inhibitory concentration) van antimycine A is dooreerst de FCCP toe te voegen. Door dit onderzoek wordt nagegaan of antimycine A als redmiddel gebruikt kan worden om het zuurstofverbruik te verlagen als er sprake is van een mutatie in hetbinnenste membraan van de mitochondriën. Uit eerder gedaan onderzoekis gebleken dat het MERRF syndroom een ziekte is die eiwitten aantast die belangrijk zijn voor de oxidatieve fosforylering (M. Mancuso 2004) . Het is nog niet aangetoond wat deze ziekte precies met de elektronentransportketen doet, maar dat hij invloed heeft op de binnenmembraan is wel bekend (M. Mancuso 2004). Het zou dus kunnen dat er door deze ziekte iets verandert in het membraan, wat ervoor zorgt dat de H+ gradiënt verdwijnt tussen de intermembraanruimte en de matrix. Dit zou hele erge gevolgen kunnen hebben voor ATP synthese. De ontkoppelaar (FCCP) heeft ditzelfde effect. Het MERRF syndroom zou dan nagebootst kunnen worden door hetgebruik van deze ontkoppelaar. Met toevoeging van antimycine A kan dan bepaald worden of dit een effectief redmiddel zou kunnen zijn tegen het MERRF syndroom.

ONDERZOEKSHYPOTHESE

Als eerst FCCP wordt toegevoegd wordt er een hoge afname in de zuurstofconcentratie verwacht. Na toevoeging van antimycine A, zal deze snelle daling in zuurstofconcentratie afnemen naarmate er meer antimycine A wordt toegevoegd. Verder zal de concentratie op een gegeven moment in de tijd niet meer verder afnemen, omdat complex III dan in zulke mate geremd is dat er helemaal geen

7

elektronenoverdracht meer plaatsvindt. De oxidatieve fosforylering zal dan geheel geremd worden.

Om de genoemde hypotheses te toetsen, wordt bij dit onderzoek malaatals substraat gebruikt. Door middel van een oxigraaf wordt de invloed van antimycine A en FCCP op de zuurstofconcentratie gemeten.Deze resultaten worden via Datalyse in een grafiek weergegeven op de computer.

ONDERZOEKSOBJECTEN

Als onderzoeksobject voor dit onderzoek zijn mitochondriën uit rattenlevers geïsoleerd. Dit was al gedaan voor het onderzoek volgens het protocol (van Zon, L. (2014). Practicum Experimenteel Onderzoek (p.65-66;). Amsterdam: Amsterdam Vrije Universiteit)

PROCEDURE

8

MATERIAAL EN METHODE

Er zijn vijf verschillende proeven uitgevoerd om antwoord te kunnen geven op de twee onderzoeksvragen. Er is gebruik gemaakt van speciaal geïsoleerde mitochondriën, een reactie medium en nog drie verschillende oplossingen: malaat, met een concentratie van 4.54 mM,FCCP, met een concentratie van 0.4 µM en antimycine A, met een concentratie van 1.82 µM. Het reactiemedium bestond uit een oplossing van 50 mM mannitol, 20 mM HEPES, 115 mM KCl, 2.3 mM MgCl2 en 5 mM KH2PO4. Voor elke proef werden de verschillende soorten oplossingen toegevoegd per state. Een meting van de ademhaling wordtnamelijk onderverdeeld in vier verschillende states. Bij state 1 werden de mitochondriën toegevoegd. Er ontstond een kleine daling inde zuurstofconcentratie door het endogeen substraat wat nog aanwezigwas. Eind state 1 begint de lijn minder te dalen en is het endogeen substraat op. Op dat moment werd het malaat toegevoegd en begon state 2. Bij de proeven 2, 3, 4 en 5 zijn de rest van de oplossingentoegevoegd tijdens state 2 of state E.

Tijdens de proeven is het reactiemedium bij kamertemperatuur bewaard. Er is op gelet dat er geen luchtbelletjes in het vaatje zaten. Bovendien is het vaatje tussen de verschillende proeven door regelmatig schoongemaakt met water en alcohol.

Proef 1 was de controleproef4, met alleen toevoeging van het substraat malaat. Er is 1,1 ml van het reactiemedium (RM) toegevoegdaan het reactievaatje. Bovendien werd er meteen daarna 20 µl mitochondriën toegevoegd. Zodra in state 1 de ademhaling begon af tenemen, is er in state 2 10 µl 4.54 mM malaat toegevoegd. Deze stappen zijn bij elke proef uitgevoerd.

Proef 2 verliep hetzelfde als de proef 1. Na het meten van de state 2 ademhaling, is er 2 µl 1.82 µM van de remmer van complex III, antimycine A toegevoegd.

Proef 3 begon hetzelfde als de eerste. In state 2 is er 2 µl 0.4 µM van de ontkoppelaar, FCCP, toegevoegd. Hierbij begon state E.

Bij proef 4 zijn er twee oplossingen toegevoegd tijdens state 2. De toevoegingen bij deze proef zijn hetzelfde de eerste proef, alleen

4 Voor pipetteerschema van alle proeven, zie tabel 1 in de bijlage

9

tijdens state 2 is er 2 µl 1.82 µM antimycine A toegevoegd en daarnais er 2 µl 0.4 µl FCCP toegevoegd, waarbij state E begon.

Proef 5 is uitgevoerd met dezelfde oplossingen als bij proef 4. Er is alleen een verdunning gebruikt van de remmer antimycine A. De proef begon weer hetzelfde. Begin state E is er 2 µl 0.4 µl FCCP toegevoegd en later in state E is er een verdunning van antimycine Atoegevoegd. Er is 1 µl 18.2 nM antimycine A toegevoegd, dus een 1000keer verdunning van de voorgaande experimenten.

DATA-ANALYSE

Bij alle bovenstaande proeven is er gebruik gemaakt van een afgesloten reactievaatje van ongeveer 1 ml, met een constante temperatuur van 25 C. De zuurstofconcentratie in het reactievaatje is gemeten met behulp van een Clark elektrode. Deze hele opstelling wordt ook wel een oxigraaf genoemd. De helling van de grafieken zijnbepaald om vervolgens het zuurstofgebruik te kunnen berekenen5. Dit hebben wij berekend aan de hand van onderstaande formule in Excel.

Snelheid van het zuurstofverbruik (in µM/min/mg eiwit)=

gemetensneheid(Vs )∗60∗aantalµMzuurstofperVoltaantalmgeiwit∈deoplossingvandemitochonriën(1,6)

IN WELKE MATE HEEFT HET TOEVOEGEN VAN DE ONTKOPPELAAR (FCCP) INVLOED OP HET ZUURSTOFVERBRUIK ALS COMPLEX III IN DE OXIDATIEVE FOSFORYLERING GEREMD IS MET ANTIMYCINE A?

Tabel 1: de snelheid van zuurstofverbruik na toediening van antimycine A, FCCP of beide.Weergegeven zijn de proeven, het zuurstofverbruik µM O2/minuut/mg mitochondrieel eiwit bij toevoeging van malaat, antimycine A, FCCP en bij een verdunde concentratie van antimycine A.

Proef Verbr. O2 Verbr. O2 Verbr. O2 Verbr. O2 5 Zie tabel 2 in de bijlage

10

RESULTATEN

state 2 (inµM/min/mg)

antimycine A (in µM/min/mg) 18,2 µM

FCCP (in µM/min/mg)

verdund antimycine A (in µM/min/mg)18,2 nM

1 15,182 9,71 3,393 8,55 63,254 6,86 2,23 2,705 11,02 24,84 -5,53Gemiddelde 10,26 2,81 Verbr.: Verbruik

Toevoeging van alleen malaatTijdens proef 1 is alleen malaat toegevoegd aan het reactievaatje. Hierbij is gekeken naar wat de invloed van malaat is op de snelheid van het zuurstofverbruik. De snelheid van het zuurstofverbruik is met ….% toegenomen ten opzichte van de toevoeging van alleen de mitochondriën.

Toevoeging antimycine A Tijdens proef 2 is de invloed van antimycine A op de snelheid van het zuurstofverbruik gemeten. De snelheid van het zuurstofverbruik is met 67,0% afgenomen ten opzichte van de snelheid van het zuurstofverbruik als er alleen malaat is toegevoegd.

Toevoeging FCCP Tijdens proef 3 is de invloed van FCCP op de snelheid van het zuurstofverbruik gemeten. De snelheid van het zuurstofverbruik is met 516% toegenomen ten op zichte van de snelheid van het zuurstofverbruik als er alleen malaat is toegevoegd.

Toevoeging antimycine A en toevoeging FCCP Tijdens proef 4 is eerst antimycine A toegevoegd om de invloed van deze remmer te bepalen op het zuurstofverbruik. Antimycine A laat een duidelijke remming zien in het zuurstofverbruik van 78,3%. Vervolgens is FCCP toegevoegd. Dit gaf weer een stijging van 21,1% in de ademhaling van de mitochondriën ten opzichte van de snelheid van het zuurstofverbruik na toevoeging van antimycine A.

11

WAT IS DE IC50 VAN ANTIMYCINE A NA FCCP TOEGEVOEGD TE HEBBEN?

Toevoeging van antimycine A na toevoeging van FCCP Tijdens proef 5 is de IC50 van antimycine A geprobeerd te bepalen. Bij een concentratie van 18,2 nM antimycine A, waarvan 1µl gepipetteerd wordt, is al 122% remming in zuurstofverbruik gevonden6 ten opzichte van de snelheid van het zuurstofverbruik na toevoeging van FCCP. Wat opmerkelijk is, is dat met 10 keer minder remmer met een verdunde concentratie bij proef 5, in verhouding veel meer remming te zien is dan bij proef 2 en 4, namelijk een ruim twee keerzo sterke remming. Verder is het zuurstofverbruik na toevoeging van FCCP bij proef 5 maar 39,3% van het zuurstofverbruik na toevoeging van dezelfde hoeveelheid FCCP bij proef 3. Moet bij de discussie!!!!!

Door middel van verschillende proeven is er vastgesteld wat het toevoegen van FCCP voor invloed heeft op het zuurstofverbruik als complex III van de elektronentransportketen geremd is door remmer antimycine A. De aparte werking van antimycine A en FCCP is bepaald aan de hand van respectievelijkproef 2 en 3. Met proef 4 is de invloed van FCCP op het zuurstofverbruik bepaald, als complex III geremd is. Door het toevoegen van antimycine A in state 2 ontstaat er een remming van 78,3% in het zuurstofverbruik.

6 Zie grafiek 5 in de bijlage

12

DISCUSSIE

Vervolgens is de ontkoppelaar FCCP toegevoegd. Uit onze resultaten is gebleken dat dit effect heeft gehad op het zuurstofverbruik. Er is namelijkeen daling van 21,1% in het zuurstofverbruik te zien ten opzichte van de snelheid van het zuurstofverbruik in state 2 na toevoeging van antimycine A.

Als vijfde experiment hebben wij ondergezocht hoe sterk de remmer antimycine A werkt op complex III. De bedoeling was om van de IC50 van antimycine A te bepalen door telkens een beetje van de verdunde oplossing toe te voegen. Hier kwam uit naar voren dat het toevoegen 1.82 µM antimycine A al genoeg was om de ademhaling geheel stop te zetten12.

Onze hypothese stelde dat na het toevoegen van antimycine A een sterk verminderde omzetting van zuurstof zou optreden, omdat er zeer sterk verminderde elektronenoverdracht plaatsvindt naar zuurstof door complex IV.Aan de resultaten te zien klopte onze hypothese. Onze hypothese stelde ook dat er geen toename in zuurstofverbruik meer op zou treden na toevoeging van FCCP. De resultaten toonden echter aan dat FCCP wel een effect heeft ophet zuurstofverbruik, er is namelijk 21,1% meer toename in de ademhaling. Dit is tegen onze verwachtingen in. Wij hadden verwacht dat antimycine A complex III dusdanig zou remmen dat de werking van de ontkoppelaar niet meer van toepassing zou zijn. Wij hebben geen verklaring voor het feit dat FCCP wel effect heeft op het zuurstofverbruik. Dit zou eventueel een voorstel kunnen zijn voor een vervolgonderzoek. Er zou onderzocht kunnen worden of het daadwerkelijk een effect van FCCP is en geen spreiding. Er zullen veel meer metingen met deze opzet moeten worden gedaan om dit vast te stellen, bijvoorbeeld door te meten met verschillende concentraties van FCCP. Het onderzoek heeft uitgewezen dat het toevoegen van FCCP invloed heeft op het zuurstofverbruik, als antimycine A complex III geremd heeft van de elektronentransportketen. De invloed die FCCP heeft als complex III al geremd is, is niet zo groot als FCCP heeft als de remmer niet is toegevoegd, maar er is wel degelijk verschil te zien.De vijfde proef is anders verlopen dan verwacht. Het plan was de IC50

te bepalen door steeds een µl van een verdunde oplossing van antimycine A toe te voegen, nadat de ontkoppelaar al was toegevoegd.Dit is fout gegaan, doordat er ervanuit was gegaan dat een oplossingdie 1000x verdund was, genoeg was om het effect van de ontkoppelaar langzaam aan te doen opheffen. Met deze verdunde concentratie van antimycine A zien we echter bij proef 5 een ruim 2x zo grote remmingals bij de concentratie van antimycine A bij proef 2 en 4. Dit is erg opmerkelijk. Wij denken dat dit komt doordat er bij proef 5 eerst FCCP was toegevoegd en daarna pas antimycine A, terwijl bij de

13

proeven 2 en 4 geen FCCP aanwezig was bij toevoeging van antimycine A.

Voor dit onderzoek was bedacht de ontkoppelaar FCCP en de remmer antimycineA samen te combineren, om te kijken wat het effect van FCCP was als complexIII al geremd was door antimycine A. Na de experimenten is gebleken dat onze proefopzet niet volledig was. Een optie die er was, was dat er in state 2 ADP toegevoegd zou worden, waarmee de P/O ratio berekend had kunnenworden.

Met proef 5 wilden we de IC50 van antimycine A bepalen. Voor deze proef is er een 1000x verdunde oplossing van antimycine A gebruikt, ten opzichte vande andere proeven, om een geleidelijke afname te meten in de snelle daling na toevoeging van FCCP. Nu bleek dat de remmer zo sterk was, zelfs na verdunning, dat FCCP meteen geen effect meer had. Hierdoor hebben wij met de vijfde proef geen goede resultaten kunnen verkrijgen. Los van dit was ertoch nog een beetje goed nieuws: de FCCP leek meer invloed te hebben op de zuurstofconcentratie afname dan was verwacht. Er was een opmerkelijke versnelling in de zuurstofafname te zien in de snelheid die gemeten was metde oxigraaf na toevoeging van FCCP. Uiteindelijk hebben wij dus nog wel resultaten kunnen verwerken van ons oorspronkelijk experiment.

De vijfde proef heeft aangetoond dat toevoegen van antimycine het effect van de eerder toegevoegde FCCP opheft. Als blijkt dat het MERRF syndroom inderdaad hetzelfde effect heeft als FCCP op het binnenste membraan, zou antimycine A inderdaad als effectief redmiddel kunnen worden gebruikt. Hiermoet echter wel bij gezegd worden dat het nog niet duidelijk is wat het MERRF syndroom precies met de oxidatieve fosforylering doet. Het zou eventueel nader onderzocht kunnen worden wat voor effect antimycine A levert bij patiënten met het MERRF syndroom.

Het viel op tijdens het experiment dat de helling bij de vijfde proef positief wordt na toevoeging van de remmer antimycine A7. Het is gebleken dat antimycine A een sterke remmer is, maar het lijkt ons niet mogelijk datde zuurstofconcentratie hoger wordt. Het negatieve getal in het zuurstofverbruik komt doordat er diffusie optreedt, omdat er zo’n hoge remming is van de ademhaling. Bovendien vonden wij tussen onze resultaten een grote afwijking in snelheid van zuurstofafname na toevoeging van malaat8. Wij denken dat dit komt door een onnauwkeurigheid in het pipetteren.

7 Zie grafiek 5 in de bijlage8 Voor snelheden zuurstofafname, zie in bijlage tabel 2

14

Verder zou het zo kunnen zijn dat er afwijkingen zijn ontstaan doordat de mitochondriën te lang buiten de koeling hebben gestaan of dat er niet nauwkeurig gepipetteerd is. Omdat wij bij proef 5 uiteindelijk niet de IC50van antimycine A hebben kunnen bepalen, zouden wij deze proef graag een keer over doen. Het is duidelijk geworden dat antimycine A een sterke remmer is. Bij het vervolgonderzoek zouden we hier rekening mee kunnen houden.

Wat uit dit onderzoek dus geconcludeerd kan worden is dat FCCP invloed heeft op het zuurstofverbruik nadat er al antimycine A is toegevoegd. Het zuurstofverbruik neemt namelijk toe vergeleken met de state ervoor, toen alleen antimycine A was toegevoegd. Bovendien valt er te concluderen dat antimycine A een sterke remmer is. Een suggestie voor een vervolgonderzoek is om te bepalen hoe sterk deze remmer is, door bijvoorbeeld de IC50 te bepalen, op dezelfde manier als hoe het in dit experiment is uitgevoerd. Wat er veranderd zou moeten worden zijn de concentraties van FCCP en antimycine A.

www.gopixpic.com 22/11/2014home.kpn.nl 22/11/2014

M. Mancuso, M. F., V. K. Mootha, A. Rocchi, S. Pistolesi, L. Murri, S. DiMauro and G. Siciliano (2004). "A novel mitochondrial tRNAPhe mutation causes MERRF syndrome." Neurology 62: 2119-2121..

Stryer, L. (2006). Biochemistry New York, W.H. Freeman and Company

15

REFERENTIELIJST

van Zon, L. (2014). Practicum Experimenteel Onderzoek. Amsterdam: AmsterdamVrije Universiteit.

Grafiek 1:blanco proef

16

BIJLAGE

1: toevoeging RM

2: toevoeging mitochondriën

3: toevoeging malaat

Grafiek 2: meting met antimycine A

1: toevoeging RM

2: toevoeging mitochondriën

3: toevoeging malaat

4: toevoeging antimycine A

17

Grafiek 3: meting met FCCP

1: toevoeging RM

2: toevoeging mitochondriën

3: toevoeging malaat

4: toevoeging FCCP

Grafiek 4: meting met antimycine A en FCCP

1: toevoeging RM

18

2: toevoeging mitochondriën

3: toevoeging malaat

4: toevoeging antimycine A

5: toevoeging FCCP

Grafiek 5: meting met FCCP en verdund antimycine A

1: toevoeging RM

2: toevoeging mitochondriën

3:toevoeging malaat

4: toevoeging FCCP

5: toevoegingantimycine A

19

Malaat (NAD+glutamaat)

FCCP (in alcohol) (200µM)

Antimycine A(In DMSO) (2mM)

Mitochondriën (82.9 mg/ml)

RM

Proef 1 10µl - - 20µl 1,1 mlProef 2 10µl - 2µl (conc?) 20µl 1,1mlProef 3 10µl 2µl (400E-9

µmol)- 20µl 1,1ml

proef 4 10µl 2µl (400E-9µmol)

2µl (concentratie)

20µl 1,1ml

Proef 5 10µl 1µl (0,02M)=1000 keer verdund

1µl (10E-9 millimol)

20µl 1,1ml

Tabel 1: Pipetteerschema

Grafiek 6: met deze grafiek hebben we uitgerekend welke hoeveelheid voltageovereenkomt met 250 µM O2. (0,2346 V = 250µM O2)

20

Proef Toevoeging

Richtingscoëfficiënt

Snelheden in µM O2/min/ mg eiwit

1 Malaat -0,0002 -15,1757

2 Malaat -0,00013 -9,70631

Antimycine A

-4,40E-05 -3,38951

3 Malaat -0,00011 -8,5508FCCP -0,00082 -

63,24514 Antimy

cine A-2,90E-05 -

2,23399FCCP -3,50E-05 -2,6962

5 FCCP -3,22E-04 -24,8358

5 Antimycine A

7,18E-05 5,528746

Tabel 2: de snelheden berekend aan de hand van de formules behorend bij de verkregen data

21