Mise au point d’un couplage entre techniques électrochimiques et optiques

pour la détection de phénomènes biologiques

Anne MEUNIER,a Isabelle FANGET,b Marine BRETOU,b Rémy FULCRAND, a Frédéric LEMAITRE,a Manon GUILLE,a Stéphane

ARBAULT,c François DARCHEN,b Christian AMATOREa  

a. Ecole Normale Supérieure, UMR CNRS-ENS-UPMC 8640 «PASTEUR», Département de Chimie, PARIS, FRANCE b. UMR 8192, Institut de Biologie Physico-Chimique, 13 rue Pierre et Marie Curie, 75005 Paris c. Université de Bordeaux 1, Institut des Sciences Moléculaires UMR 5255, Site ENSCPB, 16, av. Pey Berland, 33607 Pessac

Anne Meunier, le 28 Mai 2010 Journée Electrochimie 1/14

Plan

I.  L’exocytose

II.  Principes Analytiques •  Ampérométrie sur UME à fibre de carbone •  Microscopie de fluorescence à excitation par onde

évanescente TIRF

III.  Conceptions des dispositifs de couplage •  Premiers dispositifs •  Évolution des dispositifs

IV.   Choix des cellules utilisées

V.  Conclusion et Perspectives

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I. L’exocytose

Exocytose : Mécanisme permettant la libération de molécules dans le milieu extracellulaire à travers la membrane plasmique

http://www.lecorpshumain.fr/corpshumain/img_fiches/fonctionnement/transmission_influx_3.jpg

Arrimage Fusion

Milieu extracellulaire

Milieu intracellulaire Membrane

cellulaire

Amorçage

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•  Transmission nerveuse : Exocytose des neurotransmetteurs dans la fente synaptique à informations envoyées au système nerveux

•  Transmission humorale : Exocytose d’hormones dans le sang à réactions métaboliques

II. Principes analytiques

-  Ampérométrie sur ultramicroélectrode à fibre de carbone

Stimulation

- Capillaire de verre rempli d’une solution de stimulation permettant l’entrée de Ca2+ dans le milieu intracellulaire.

Adrénaline Chromaffines

E = +650 mV / Ag/AgCl

Sérotonine Mastocytes

E = +650 mV / Ag/AgCl

Microélectrode de carbone Ø = 10 µm

Cellule

Capillaire de stimulation

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II. Principes analytiques

-  Ampérométrie sur ultramicroélectrode à fibre de carbone

Avantages

-  Détection directe et en temps réel

-  Informations sur la cinétique des évènements

-  Informations sur la quantité de molécules libérées

Inconvénients

- Les molécules libérées doivent être électroactives.

-  Pas d’information avant la libération donc pas d’information sur le comportement des vésicules

avant la fusion

Anne Meunier, le 28 Mai 2010 Journée Electrochimie 5/14

C. Amatore et al. BioPhysChem. 2007, 129, 181-189

II. Principes analytiques

-  Microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente

Principe

Excitation des vésicules marquées

par une sonde fluorescente par une onde évanescente

 

Onde évanescente : excitation sur une très faible profondeur (50 à 300 nm) à Seules les vésicules proches de la membrane plasmique seront observées à Pas de gène pour la détection

http://www.ibpc.fr/UPR1929/jph/34.htm

Vésicules marquées

Cellule

i

Faisceau laser

eau verre

i > icritique (icritique = 64°)

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II. Principes analytiques

-  Microscopie de fluorescence à excitation par onde évanescente

Avantages

-  Détection directe et en temps réel

-  Observation du mouvement des vésicules

Inconvénients

- Pas d’information sur la quantité de molécules libérées

-  Nécessité de marquer les vésicules avec une sonde fluorescente si celles-ci ne

l’expriment pas constitutivement

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III. Conception des dispositifs de couplage

-  Propriétés requises : Visibles en TIRFM

à substrat transparent Détectables en ampérométrie

à substrat conducteur

ITO (Indium Tin Oxide) : Oxyde d’indium dopé à l’étain (90% In2O3 + 10% SnO2)

Limites    

-­‐   Épaisseur d’ITO : de l’ordre de la centaine de nm pour la transparence

-  Surface active de l’ITO : de l’ordre de la centaine de micron pour limiter le

bruit électrique

Détection au pôle basal de la cellule

Variabilité cellulaire à Probabilité d’avoir une cellule observable en TIRF dans un puits de 100 µm de diamètre : faible à Augmentation de la surface de l’électrode

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III. Conception des dispositifs de couplage

Procédé technologique

à Plusieurs électrodes indépendantes par dispositifs

à Électrodes en forme de bandes

Cellule

Verre ITO

SU8 3010 (Enduction et photolithographie, 10µm )

UV UV

Cellule

Bande D’ITO

Capillaire d’injection (stimulation)

Cellule

AZ 9260

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IV. Choix des cellules

-  Conditions requises : - Visibles en TIRFM : exprimant constitutivement une sonde fluorescente ou pour lesquelles le protocole de marquage des vésicules est maîtrisé

- Détectables en ampérométrie : libérant des molécules électroactives

- Fréquence de sécrétion modérée afin de pouvoir attribuer à chaque pic ampérométrique le signal optique lui correspondant

•  Neurones : cellules ne se reproduisant pas et dont la manipulation est délicate

•  Cellules endocrines :

cellules chromaffines (adrénaline) Fréquence de sécrétion trop élevée

cellules PC12 (dopamine)

mastocytes (histamine, sérotonine)

K. Kumakura, Cellular and Molecular Neurobiology, 2005, 25, 34 C. L. Haynes, Biophysical Chemistry, 2008, 137, 63–69

cellules BON (sérotonine) BC 21 et N13 : cellules humaines provenant d’une tumeur du pancréas

Freq chrom ≈ 420 pics.min-1 Freq PC12 ≈ 60 pics.min-1

Freq Mast ≈ 320 pics.min-1

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IV. Choix des cellules

-  Etude ampérométrique sur électrode de carbone des cellules BON :

BC 21 non

chargées

BC 21 chargé

es

N 13 non chargées

N13 chargées

t1 (ms) / 6,2 ± 0,7 9,0 ± 0,2 8,4 ± 0,2

t2 (ms) / 18,7 ± 1,5 24,5 ± 0,5 23,4 ± 0,6

t ½ (ms) / 24,8 ± 2,1 33,5 ± 0,7 31,7 ± 0,7

t 20/90 (ms) / 7,1 ± 0,9 11,0 ± 0,3 11,7 ± 0,3

Fréquence (pic.min-1) / 3,3 3,5 5,1

Charge (fC) / 165 ± 21 246 ± 10 243 ± 34

Imax (pA) / 5,0 ± 0,4 6,0 ±0,3 6,0 ± 0,9

-­‐   Cinétique du même ordre de grandeur -  Charge et intensité : N13 > BC21 -  Fréquence : N13 chargées > N13 non chargées

Cellules  choisies  :  BON  N13  Chargées  

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IV. Choix des cellules

-  Etude ampérométrique des cellules BON N13 sur ITO : -  Etude au pole basal

N13 chargées

Fréquence (pic.min-1) 5,8

Charge (fC) 154 ± 14

Imax (pA) 3,6 ± 0,3

t1 (ms) 9,7 ± 0,4

t2 (ms) 22,2 ± 0,7

t ½ (ms) 31,9 ± 0,8

t 20/90 (ms) 15,6 ± 0,5

-  Fréquence de sécrétion du même ordre de grandeur qu’au pôle apical -  Charge et intensité plus faible

Grandeurs adaptées au couplage de

l’ampérométrie et de la microscopie TIRF

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Conclusion et perspectives

Electrochimie (Ampérométrie )

Informations •  sur la cinétique des évènements

•  sur la quantité de molécule libérées •  sur le mouvement des vésicules

Cellules BON N13 chargées

-  Procédure de marquage par une

sonde fluorescente bien maitrisée

- Fréquence de sécrétion adaptée au

couplage

Substrat ITO

-  Conducteur pour la détection électrochimique

-  Transparent pour la détection optique

à Essais de couplage en cours

Microscopie (TIRFM)

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Remerciements

UMR CNRS-ENS-UPMC 8640 « PASTEUR », ENS, PARIS

Christian AMATORE Frédéric LEMAITRE

Manon GUILLE Rémy FULCRAND

Yong CHEN ACM (Villiers-Saint-Frédéric)

UMR 8192, Institut de Biologie Physico-Chimique, PARIS

François Darchen Isabelle Fanget Marine Bretou

Université de Bordeaux 1, Institut des Sciences

Moléculaires UMR 5255, Pessac

Stéphane ARBAULT

Anne Meunier, le 28 Mai 2010 Journée Electrochimie 14/14

ITO Verre SU-8 3010

(Enduction et photolithographie, 10µm )

100µm UV