ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ - Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣΣ Χ Ο Λ Η Ε Π Ι Σ Τ Η Μ Ω Ν Υ Γ Ε Ι Α Σ

Τ Μ Η Μ Α Ι Α Τ Ρ Ι Κ Η Σ

ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ

Διευθύντρια: Καθηγήτρια Ευθυμία Πετεινάκη

Διδακτορική Διατριβή

«ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΚΛΑΣΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ

ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΤΟΥ ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ ΤΗΣ ΑΥΤΟΜΑΤΗΣ

ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗΣ ΠΕΡΙΤΟΝΙΤΙΔΑΣ ΣΕ ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΚΙΡΡΩΣΗ»

υπό

ΕΡΓΙΝΑΣ ΜΑΛΛΗ

Ιατρού Βιοπαθολόγου

Υπεβλήθη για την εκπλήρωση μέρους των

απαιτήσεων για την απόκτηση του

Διδακτορικού Διπλώματος

Λάρισα, 2018

Institutional Repository - Library & Information Centre - University of Thessaly15/01/2022 00:15:22 EET - 65.21.229.84

© 2018 ΜΑΛΛΗ ΕΡΓΙΝΑ

Η έγκριση της διδακτορικής διατριβής από το Τμήμα Ιατρικής της Σχολής Επιστημών Υγείας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας δεν υποδηλώνει αποδοχή των απόψεων του συγγραφέα (σύμφωνα με τις διατάξεις του άρθρου 202, παράγραφος 2 του Ν.5343/1932).

2


Εγκρίθηκε από τα Μέλη της Επταμελούς Εξεταστικής Επιτροπής (7η/20-ΐ2-20ΐ8 γ ς ε ς ):

1ος Εξεταστής (Επιβλέπουσα)

Πετεινάκη ΕυθυμίαΚαθηγήτρια Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας

2ος Εξεταστής Γ εώργιος Ν. ΝταλέκοςΚαθηγητής Παθολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας

3ος Εξεταστής Κωνσταντίνος ΓουργουλιάνηςΚαθηγητής Πνευμονολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας

4ος Εξεταστής Σπηλιοπούλου ΊριςΚαθηγήτρια Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Πατρών

5ος Εξεταστής Γατσέλης ΝικόλαοςΕπίκουρος Καθηγητής Παθολογίας, Ιατρική Σχολή Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας

6ος Εξεταστής Ζάχου ΚαλλιόπηΕπίκουρη Καθηγήτρια Παθολογίας, Ιατρική Σχολή Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας

7ος Εξεταστής Κουκούλης ΓεώργιοςΚαθηγητής Παθολογικής Ανατομικής, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας

3


ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ

Η παρούσα διατριβή αποτελεί προϊόν ουσιαστικής και πολύτιμης συνεργασίας

με αξιόλογους επιστήμονες στους οποίους θα ήθελα να εκφράσω τη βαθιά μου

ευγνωμοσύνη. Καταρχήν θα ήθελα να ευχαριστήσω την Καθηγήτρια κ.Ευθυμία

Πετεινάκη για την αμέριστη υποστήριξη που μου παρείχε, τις πολύτιμες συμβουλές

καθώς και για την υπομονετική και γεμάτη έμπνευση καθοδήγησή της στην εκπόνηση

της διατριβής. Κυρίως θα ήθελα να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου για όλα όσα μου

έδειξε, μου έμαθε και με βοήθησε να ανακαλύψω.

Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Καθηγητή κ.Γεώργιο Ν. Νταλέκο για

την εμπιστοσύνη που μου έδειξε και την ευκαιρία που μου έδωσε να ασχοληθώ με

την έρευνα, καθώς και για την πολύτιμη καθοδήγησή του.

Επίσης θα ήθελα να εκφράσω τη βαθιά ευγνωμοσύνη μου στον Επίκουρο

Καθηγητή κ.Νικόλαο Γατσέλη για την πολύτιμη βοήθειά του και τις ουσιαστικές

συμβουλές και παρατηρήσεις του όσον αφορά στην εκπόνηση της διατριβής.

Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω τον κ.Γουργουλιάνη, τον κ.Κουκούλη, την

κ.Ζάχου και την κ.Σπηλιοπούλου για τις χρήσιμες παρατηρήσεις τους.

Ακόμα θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους τους συναδέλφους κλινικούς ιατρούς,

αλλά και τους συναδέλφους στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο για τη συνεργασία τους

κατά τη συλλογή των δεδομένων.

Τέλος θα ήθελα να ευχαριστήσω την οικογένειά μου, τον σύζυγό μου Άγγελο

και τις κόρες μου Κωνσταντίνα και Μαργαρίτα-Ελπίδα για την υπομονή τους και την

συμπαράστασή τους.

Εργίνα Μάλλη

4


ΣΥΝΤΟΜΟ ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ

ΠΡΟΣΩΠΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑΟνοματεπώνυμο: Εργίνα Μάλλη

Όνομα πατέρα: Θεμιστοκλής

Όνομα μητέρας: Μαργαρίτα

Τόπος γέννησης: Αθήνα

Ημερομηνία γέννησης: 07-08-1975

Υπηκοότητα: Ελληνική

Οικογενειακή κατάσταση: Έγγαμη (2 τέκνα)

Διεύθυνση: Κυψέλης 8, Λάρισα

Τηλέφωνο: 6974493920

e-mail: [email protected]

ΣΤΑΔΙΟΔΡΟΜΙΑ1993: Απολυτήριο Λυκείου από το 2ο Γενικό Λύκειο Θήβας με βαθμό 18 και 5/11.

1994: Εισαγωγή στην Ιατρική Σχολή του Παν/μίου Θεσσαλίας (Λάρισα) με

πανελλήνιες εξετάσεις

2001: Πτυχίο Ιατρικής Σχολής Παν/μίου Θεσσαλίας με βαθμό 7,68 (Λίαν καλώς).

2001: Άδεια ασκήσεως ιατρικού επαγγέλματος (Νομαρχιακή Αυτοδιοίκηση

Λάρισας:αρ. Πρωτοκόλλου: 7835)

2002: Τρίμηνη άσκηση στα Εξωτερικά Ιατρεία και στα αντίστοιχα του Τμήματος

Επειγόντων Περιστατικών της Παθολογικής, Καρδιολογικής και Χειρουργικής

Κλινικής του Περιφερειακού Γενικού Νοσοκομείου Λάρισας

2002- 2003: Ιατρός υπόχρεη υπηρεσίας υπαίθρου στο Περιφερικό Ιατρείο Ναρθακίου,

με εφημερίες στο Κέντρο Υγείας Φαρσάλων της Δ.Υ.Π.Ε. Θεσσαλίας

2003- 2004: Ειδικευόμενη Ιατρός Ιατρικής Βιοπαθολογίας στο Μικροβιολογικό

Εργαστήριο του Γενικού Νοσοκομείου Τρικάλων (Δ/ντρια: Μ. Λεμονή)

2005-2009: Ειδικευόμενη Ιατρός Ιατρικής Βιοπαθολογίας στο Μικροβιολογικό

Εργαστήριο του Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Λάρισας (Δ/ντής:

Καθηγητής Α. Μανιάτης έως Φεβρουάριο 2009 και στη συνέχεια Αναπληρώτρια

Καθηγήτρια Ε. Πετεινάκη)

2010: Απόκτηση τίτλου ιατρικής ειδικότητας Ιατρικής Βιοπαθολογίας (Νομαρχιακή

Αυτοδιοίκηση Λάρισας: αρ. Πρωτοκόλλου: 8278)

5


mailto:[email protected]

2010-2011: Επικουρική Ιατρός Επιμελήτρια Ε.Σ.Υ. στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο

του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Λάρισας (Δ/ντρια: Αναπληρώτρια Καθηγήτρια

Ε. Πετεινάκη)

2011: Παρακολούθηση του Εκπαιδευτικού Αντικειμένου με τίτλο: «Μικροβιολογία

τροφίμων- Τροφιμογενή Νοσήματα» στα πλαίσια του Προγράμματος

Συμπληρωματικής Εκπαίδευσης με τη χρήση Καινοτόμων Μεθόδων εξ Αποστάσεως

Εκπαίδευσης που οργανώθηκε από το Κέντρο Επαγγελματικής Κατάρτισης του

Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών

2012-2015: Επιστημονική Υπεύθυνη του Μικροβιολογικού Εργαστηρίου στο

διαγνωστικό κέντρο «Διαγνωστικό-Ιατρική Α.Ε.» στη Λάρισα

Σεπτέμβριος 2015 έως σήμερα: Επιμελήτρια Β' στο Μικροβιολογικό Εργαστήριο

του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Λάρισας

ΞΕΝΕΣ ΓΛΩΣΣΕΣ1. First certificate in English του Cambridge (Ιούνιος 1992)

2. Certificado Intermedio de Espanol (Ιούλιος 2005)

ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΑΡΘΡΩΝ ΣΤΟ ΔΙΕΘΝΗ ΙΑΤΡΙΚΟ ΤΥΠΟ1. Gatselis N, Malli E, Papadamou G, Petinaki E and Dalekos GN. Direct detection

of Cardiobacterium hominis in serum from a patient with infective endocarditis by

broad-range bacterial PCR. J Clin Microbiol 2006; 44: 669-672.

2. Malli E, Spiliopoulou I, Kolonitsiou F, Klapsa D, Giannitsioti E, Pantelidi K,

Pratti A, Panopoulou M, Grapsa S, Alepopoulou E, Neonakis I, Frantzidou F,

Alexiou-Daniel S, Bakola D, Koutsia-Carouzou C, Malamou-Lada H, Zerva L,

Vlahaki E, Kartali-Ktenidou S, Anastassiou ED, Petinaki E. In vitro activity of

daptomycin against Gram-positive cocci: the first multicentre study in Greece. Int J

Antimicrob Agents 2008 Dec; 32(6): 525-8.

3. Malli E, Spiliopoulou I, Kolonitsiou F, Neocleous Ch, Klapsa D, Pantelidi K,

Panopoulou M, Grapsa S, Alepopoulou E, Neonakis I, Alexiou-Daniel S, Bakola D,

Koutsia-Carouzou C, Malamou-Lada H, Zerva L, Vlahaki E, Kartali-Ktenidou S,

Anastassiou E, Petinaki E. In vitro activity of tigecycline against gram-positive cocci:

a multicentre study in Greece. J Antimicrob Chemother 2008 Nov; 62(5): 1158-60.

4. Damani A, Klapsa D, Panopoulou M, Spiliopoulou I, Pantelidi K, Malli E,

Kolonitsiou F, Grapsa S, Alepopoulou E, Frantzidou F, Vlahaki E, Koutsia-Carouzou

6


C, Malamou-Lada H, Zerva L, Kartali-Ktenidou S, Anastassiou ED, Maniatis AN,

Petinaki E. A newly described vancomycin-resistant ST412 Enterococcus faecium

predominant in Greek hospitals. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2010 Mar;

29(3):329-31. Epub 2009 Dec 17

5. Malli E, Tatsidou E, Damani A, Pantelidi K, Petinaki E, Skoulakis C, Drougka E,

Spiliopoulou I. Macrolide-resistant Streptococcus pyogenes in Central Greece:

prevalence; mechanism and molecular identification. Int J Antimicrob Agents. 2010

Jun; 35(6):614-5. Epub 2010 Mar 4

6. Mavroidi A, Miriagou V, Malli E, Stefos A, Dalekos GN, Tzouvelekis LS,

Petinaki E. Emergence of Escherichia coli sequence type 410 (ST410) with KPC-2 β-

lactamase. Int J Antimicrob Agents. 2012 Mar; 39(3):247-50. Epub 2012 Jan 9

7. Papagiannitsis CC, Malli E, Florou Z, Sarrou S, Hrabak J, Mantzarlis K,

Zakynthinos E, Petinaki E. Emergence of sequence type 11 Klebsiella pneumoniae

coproducing NDM-1 and VIM-1 metallo-a-lactamases in a Greek hospital. Diagn

Microbiol Infect Dis. 2017 Mar;87(3):295-297

8. Papagiannitsis CC, Malli E, Florou Z., Medvecky M, Sarrou S, Hrabak J, Petinaki

E. First description in Europe of the emergence of Enterococcus faecium ST117

carrying both vanA and vanB genes, isolated in Greece. J Glob Antimicrob Resist.

2017 Dec;11:68-70. doi: 10.1016/j.jgar.2017.07.010. Epub 2017 Jul 25

9. Papagiannitsis CC, Malli E, Tsilipounidaki K, Sarrou S, Medvecky M, Hrabak J,

Fthenakis GC, Petinaki E. First Description in Greece of mphC-positive

Staphylococci Causing Subclinical Mastitis in Ewes. Microb Drug Resist. 2018

Sep;24(7):1050-1053. doi: 10.1089/mdr.2017.0425. Epub 2018 Feb 28

10. Papagiannitsis CC, Sarrou S, Tsilipounidaki K, Malli E, Medvecky M, Hrabak J,

Fthenakis GC, Petinaki E. Characterisation of a ST100 Staphylococcus epidermidis

producing an lnuB nucleotidyltransferase: Evidence for interspecies spread of an

lnuB-carrying transposon. J Glob Antimicrob Resist. 2018 Jun;13:9-10. doi:

10.1016/j.jgar.2018.02.017. Epub 2018 Mar 1

11. Malli E, Florou Z, Tsilipounidaki K, Voulgaridi I, Stefos A, Xitsas S,

Papagiannitsis CC, Petinaki E. Evaluation of rapid polymyxin NP test to detect

colistin-resistant Klebsiella pneumoniae isolated in a tertiary Greek hospital. J

Microbiol Methods 2018 Oct;153:35-39. doi: 10.1016/j.mimet.2018.08.010. Epub

2018 Aug 23.

7


https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27993422


https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Malli%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30144479

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Florou%20Z%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30144479

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tsilipounidaki%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30144479

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Voulgaridi%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30144479

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Stefos%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30144479

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Xitsas%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30144479

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Papagiannitsis%20CC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30144479

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Petinaki%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30144479

12. Sarrou S, Malli E, Tsilipounidaki K, Florou Z, Medvecky M, Skoulakis A,

Hrabak J, Papagiannitsis CC, Petinaki E. MLSb-Resistant Staphylococcus aureus in

Central Greece: Rate of Resistance and Molecular Characterization.Microb Drug

Resist. 2018 Nov 7. doi: 10.1089/mdr.2018.0259.

13. Malli E, Gatselis NK, Dalekos GN, Petinaki E. Combination of vial culture and

broad-range PCR for the diagnosis of spontaneous bacterial peritonitis: experience in

a Greek tertiary care hospital. New Microbes New Infect. 2018 Dec 18;28:1-5. doi:

10.1016/j.nmni.2018.12.001. eCollection 2019 Mar.

14. Kontopoulou K, Iosifidis E, Antoniadou E, Tasioudis P, Petinaki E, Malli E,

Metallidis S, Vatopoulos A, Malisiovas N. The clinical significance of carbapenem-

resistant Klebsiella pneumoniae rectal colonization in critically ill patients: from

colonization to bloodstream infection. J Med Microbiol. 2019 Jan 28. doi:

10.1099/jmm.0.000921.

ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΑΡΘΡΩΝ ΣΤΟΝ ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΙΑΤΡΙΚΟ ΤΥΠΟ1. Μάλλη Ε, Πετεινάκη Ε. Εφαρμογή της ευρέος φάσματος 16S rRNA PCR στη

διάγνωση των βακτηριακών λοιμώξεων: «Μύθος ή πραγματικότητα;» Εφαρμοσμένη

Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Ιατρική 2008; 13:12-20.

2. Κλάψα Δ, Τιγκίρογλου Ε, Μάλλη Ε, Καρανίκα Μ, Μοράβα Μ, Πραττή Α,

Βαγιάννης Δ, Σκουλάκης X, Πετεινάκη Ε.: «Πιθανός ο ρόλος του Haemophilus

influenzae τύπου b στην παθογένεια της υποτροπιάζουσας φαρυγγοαμυγδαλίτιδας».

Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Ιατρική 2007; 11:33-40.

ΑΝΑΚΟΙΝΩΣΕΙΣ ΕΠΙΣΤΗΜΟΝΙΚΩΝ ΕΡΓΑΣΙΩΝ ΣΕ ΙΑΤΡΙΚΑ ΣΥΝΕΔΡΙΑ1. E Malli, D Klapsa, A Vasdeki, M Morava, M Pitsitaki, E Petinaki, A N Maniatis,

«Direct detection of Cardiobacterium hominis by broad-range 16S rRNA PCR and

sequencing in the serum of a patient with infective endocarditis», 16th European

Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, April 1-4/2006, Nice

2. Δ Κλάψα, Μ Βέργη, Μ Οικονόμου, Δ Καίρης, Μ Μοράβα, Ε Μάλλη, Α Πραττή,

Ε Πετεινάκη, Χρ Κούτσια-Καρούζου, Α Ν Μανιάτης, «Ελαττωμένη έκφραση των

icaA και icaC γονιδίων επηρεάζει το σχηματισμό της βιομεμβράνης» 4ο Πανελλήνιο

Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας, Απρίλιος 12-15/2006, Αθήνα, (Βιβλίο Περ. σελ.

107)

8



https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tsilipounidaki%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30403546

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Florou%20Z%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30403546

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Medvecky%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30403546

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Skoulakis%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30403546

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Hrabak%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30403546

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Papagiannitsis%20CC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30403546





https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Kontopoulou%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30688629

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Iosifidis%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30688629

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Antoniadou%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30688629

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Tasioudis%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30688629



https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Metallidis%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30688629

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vatopoulos%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30688629

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Malisiovas%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=30688629


3. C. Skoulakis, E. Tigiroglou, E. Malli, D. Klapsa, C. Papadakis, E. Petinaki.

Evidence for the role of Haemophilus influenzae in the pathogenesis of recurrent

tonsillitis. 17th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases/

25th International Congress of Chemotherapy. Munchen Germany 31 March-3 April

2007

4. Δ. Κλάψα, E. Τιγκίρογλου, E Μάλλη, Μ. Μοράβα, Α. Πραττή, Μ. Καρανίκα, Δ.

Βαλαγιάννης, X. Σκουλάκης, E. Πετεινάκη. Πιθανός ρόλος του Haemophilus

inflenzae στην παθογένεια της υποτροπιάζουσας φαρυγγοαμυγδαλίτιδας. 3ο Eθνικό

Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας, 9ο Πανελλήνιο Συνέδριο Νοσοκομειακών

Λοιμώξεων & Υγιεινής. 6-8 Φεβρουαρίου 2007

5. E. Μάλλη, Δ. Κλάψα, Α. Πραττή, Μ. Καρανίκα, Μ. Μοράβα, E. Γερογιάννη, Κ.

Γουργουλιάνης, E. Πετεινάκη. Άμεση ανίχνευση Clostridium sordellii σε πλευριτικό

υγρό ασθενούς με τη χρήση ευρέος φάσματος 16SrRNA PCR. 3ο Εθνικό Συνέδριο

Κλινικής Μικροβιολογίας και 9ο Πανελλήνιο Συνέδριο Νοσοκομειακών Λοιμώξεων

και Υγιεινής, Φεβρουάριος 2007, Αθήνα, (Βιβλίο Περ. σελ. 10)

6. Δ. Κλάψα, X. Σκέντου, Μ. Σταυροπούλου, Φ. Αναστασιάδου, E. Μάλλη, Ε.

Πετεινάκη. Συχνότητα Chlamydia trachomatis σε εγκύους στην περιοχή της

Θεσσαλίας, 4ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκομειακών

Λοιμώξεων, Φεβρουάριος 2009, Αθήνα, (Βιβλίο Περ. σελ. 63)

7. Α. Λιακόπουλος, Σ. Βουρλή, Λ. Ζαχαριάδου, Κ. Τσιβεριώτης, Α. Μαυροειδή, Φ.

Κολονίτσιου, E. Μάλλη, Μ. Οικονόμου, Ν. Πετροπούλου, Δ.Καίρης, Μ.

Πανοπούλου, Λ. Ζέρβα, Α. Πάγκαλη, X. Κούτσια- Καρούζου, Σ. Καρτάλη-Κτενίδου,

Ε.Δ. Αναστασίου, I. Σπηλιοπούλου, Ε. Πετεινάκη. Αντοχή στελεχών β-αιμολυτικού

στρεπτοκόκκου ομάδας Β στην Ελλάδα: φαινότυποι και μηχανισμοί αντοχής. 5ο

Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκομειακών Λοιμώξεων,

Φεβρουάριος 2011, Αθήνα, (Βιβλίο Περ. σελ. 27)

8. E. Μάλλη, Ε. Δρούγκα, Ε. Πρωτονοταρίου, Κ. Παπακωνσταντίνου, Μ. Ραπτάκη,

Β. Δαλαβίτσιου, Α. Μαυροειδή, Α. Λιακόπουλος, Μ. Σπυροπούλου, Μ. Οικονόμου,

Δ. Καίρης, X. Κούτσια- Καρούζου, Μ. Μαραγκός, Ε. Δίζα, Ματαυτσή, I.

Σπηλιοπούλου, Ε. Πετεινάκη. In vitro δραστικότητα βανκομυκίνης, λινεζολίδης και

δαπτομυκίνης έναντι χρυσίζοντα σταφυλοκόκκου. Νεότερα δεδομένα στην Ελλάδα.

5ο Εθνικό Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας και Νοσοκομειακών Λοιμώξεων,

Φεβρουάριος 2011, Αθήνα, (Βιβλίο Περ. σελ. 36)

9


9. S. Sarrou, Z. Florou, E. Malli, E. Petinaki. Rapid detection of vancomycin-

resistant enterococci (VRE) carriers in a tertiary Greek hospital. 26th European

Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Amsterdam, Netherlands

2016.

10. S. Sarrou, Z. Florou, E. Malli, E. Petinaki. Evaluation of the molecular assay

Genspeed® Superbug CR as screening test in a tertiary hospital with high prevalence

of multidrug resistant Gram-negative bacteria. 26th European Congress of Clinical

Microbiology and Infectious Diseases. Amsterdam, Netherlands 2016

11. .Σ. Σάρρου, Z. Φλώρου, E. Μάλλη, X. Γκουντέλα, Α. Διαμαντής, Μ. Ευθυμίου,

Κ Ματζαρλής, Ε. Ζακυνθινός, Ε. Πετεινάκη. Εφαρμογή της μοριακής μεθόδου

GenSpeed Superbug CR στον έλεγχο αποικισμού ενδονοσοκομειακών ασθενών με

πολυαθεκτικά Gram-αρνητικά βακτηρίδια. 9ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής

Βιοπαθολογίας. Αθήνα 02-04 Ιουνίου 2016

12. S. Sarrou, Z. Florou, E. Malli, C. Gountela, K. Mantzarlis, E. Zakynthinos, C.

Wechselberger, E. Petinaki. Rapid detection of new combinations of carbapemenase-

genes using GenSpeed® Superbug CR: a useful tool to eliminate their spread.

ISMD2016 Eleventh International Symposium on Molecular Diagnostics Medical

University of Graz, Austrian Society for Laboratory Medicine and Clinical Chemistry

Graz, May 26-28, 2016

13. Σ. Σάρρου, Z. Φλώρου, E. Μάλλη, X. Γκουντέλα, X. Χριστοφορίδης, Α.

Διαμαντής, Μ. Ευθυμίου, Κ. Τεπετές, Ε. Πετεινάκη. Υψηλή συχνότητα αποικισμού

VRE σε ασθενείς χειρουργικού τμήματος τριτοβάθμιου Νοσοκομείου. 9ο Πανελλήνιο

Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας. Αθήνα 02-04 Ιουνίου 2016

14. S. Sarrou, Z, Florou, E. Malli, E. Petinaki. Rapid detection vancomycin-resistant

enterococci (VRE) carriers in a tertiary Greek hospital. 8th International Congress of

Internal Medicine. Λάρισα 17-19 Μαρτίου 2016

15. Malli E, Vasileiou N, Sarrou S, Chatzopoulos D, Ioannidi K, Mavrogianni V,

Chatedaki C, Billinis C, Fthenakis G, Petinaki E. Identification and susceptibility

testing of staphylococcal isolates from subclinical mastitis in ewes in Greece. (P2089)

27th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Vienna,

Austria 2017

16. E. Μάλλη, Κ. Τσιλιπουνιδάκη, Σ. Ξύτσας , Π. Πυρίδου, Σ. Σάρρου, Α. Στέφος, Κ.

Παπαγιαννίτσης, Ε. Πετεινάκη. In vitro δραστικότητα των ceftaroline, ceftobiprole

10


και telavancin έναντι κλινικών στελεχών Staphylococcus aureus στη Θεσσαλία. 10°

Πανελλήνιο Συνέδρι° Ιατρικής Βι°παθ°λ°γίας Αθήνα 2018

17. Ε. Μάλλη, Κ. Τσιλιπουνιδάκη, Σ. Ξύτσας, Π. Πυρίδου, Α. Γεροντόπουλος, Κ.

Παπαγιαννίτσης, Ε. Πετεινάκη. In vitro δράση της κεφτολοζάνης-ταζομπακτάμης

έναντι GRAM (-) βακτηρίων από νοσοκομειακές λοιμώξεις στη Θεσσαλία. 10ο

Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας Αθήνα 2018

18. Ε. Μάλλη, Ι. Βουλγαρίδη, Κ. Τσιλιπουνιδάκη, Ζ. Φλώρου, Α. Στέφος, Σ. Ξύτσας,

Π. Πυρίδου, Κ. Παπαγιαννίτσης, Ε. Πετεινάκη. Αξιολόγηση του RAPID

POLYMYXIN NP TEST στην ανίχνευση Colistin ανθεκτικών στελεχών (ColR)

Klebsiella pneumoniae. 10ο Πανελλήνιο Συνέδριο Ιατρικής Βιοπαθολογίας Αθήνα

2018

19. Evaluation of Rapid Polymyxin NP test to detect colistin-resistant Klebsiella

pneumoniae in a tertiary hospital in Thessaly, Greece. (O0953) Malli E, Voulgaridi I,

Tsilipounidaki K, Stefos A, Xitsas S, Piridou P, Papagiannitsis CC, Petinaki E. 28th

European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Madrid, Spain

2018

20. K. Tsilipounidaki, E. Malli, S. Sarrou, Z. Florou, C. Papagiannitsis, E. Petinaki.

Characterization of an lnu(B)-positive ST100 Staphylococcus epidermidis isolated in

Greece from samples of animal origin. (P1839) 28th European Congress of Clinical

Microbiology and Infectious Diseases. Madrid, Spain 2018

21. E. Malli, K. Tsilipounidaki, S. Sarrou, Z. Florou, I. Voulgaridi, C. Papagiannitsis,

E. Petinaki. Characterization of ermB-positive staphylococci isolated in Greece from

samples of animal origin. (P1833) 28th European Congress of Clinical Microbiology

and Infectious Diseases. Madrid, Spain 2018

22. Τάσιου Ι., Συρογιαννόπουλος Γ., Πανισόη Γ., Μυλωνά ΑΜ, Μάλλη Ε., Γριβέα Ι.

Καταγραφή των ουρολοιμώξεων σε νοσηλευόμενα παιδιά στην κεντρική Ελλάδα. 1ο

Πανελλήνιο Συνέδριο Παιδιατρικών Λοιμώξεων. Αθήνα, 14-16 Δεκεμβρίου 2018

ΒΡΑΒΕΙΑ-ΔΙΑΚΡΙΣΕΙΣ1. Ε. Μάλλη, Ε. Πετεινάκη. Θέμα: Εφαρμογή της ευρέος φάσματος 16S rRNA

PCR στη διάγνωση των βακτηριακών λοιμώξεων: μύθος ή πραγματικότητα.

Εφαρμοσμένη Κλινική Μικροβιολογία και Εργαστηριακή Διαγνωστική. 2008. 1: 12

20. Βραβείο καλύτερης δημοσιευμένης εργασίας για το έτος 2008 από την Εταιρεία

Κλινικής Μικροβιολογίας και Εργαστηριακής Διαγνωστικής.

11


2. Ε. Κλάψα, Ε. Τιγκιρόγλου, Ε. Μάλλη, Μ. Μοράβα, Α. Πραττή, Μ. Καρανίκα, Δ.

Βαλαγιάννης, X. Σκουλάκης, Ε. Πετεινάκη. Θέμα: Πιθανός ο ρόλος του Haemophilus

influenzae στην παθογένεια της υποτροπιάζουσας φαρυγγοαμυγδαλίτιδας. 30 Εθνικό

Συνέδριο Κλινικής Μικροβιολογίας, 9ο Πανελλήνιο Συνέδριο Νοσοκομειακών

Λοιμώξεων & Υγιεινής. 6-8Φεβρουαριου 2007. Ειδικό Βραβείο προς τιμήν της

Καθηγήτριας κ. Αντιγόνης Αρσένη από την επιτροπή βράβευσης του συνεδρίου .

ΜΕΛΟΣ ΟΡΓΑΝΩΤΙΚΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗΣ ΣΥΝΕΔΡΙΩΝ1. Οργανωτική επιτροπή του 1ου Πανελλήνιου Διεπιστημονικού Συνεδρίου με θέμα

«Έρευνα - Πρόληψη - Αντιμετώπιση των κινδύνων στη χρήση του διαδικτύου».

Λάρισα, 27-29 Νοεμβρίου 2009 - Υπό την αιγίδα του ΥΠ.Ε.Π.Θ.

2. Οργανωτική επιτροπή του 2ου Πανελλήνιου Διεπιστημονικού Συνεδρίου με θέμα

«E-LIFE 20011: Οφέλη και κίνδυνοι στη χρήση του Διαδικτύου». Θεσσαλονίκη, 1-3

Απριλίου 2011.

3. Οργανωτική επιτροπή του 3ου Πανελλήνιου Διεπιστημονικού Συνεδρίου της

Ελληνικής Εταιρείας για τη Μελέτη της Διαταρραχής του Εθισμού στο Διαδίκτυο.

Αθήνα 1-2 Νοεμβρίου 2013

4. Οργανωτική επιτροπή του 4ου Πανελλήνιου Διεπιστημονικού Συνεδρίου της

Ελληνικής Εταιρείας για τη Μελέτη της Διαταρραχής του Εθισμού στο Διαδίκτυο.

Αθήνα 6-7 Νοεμβρίου 2015.

ΣΥΜΜΕΤΟΧΗ ΣΕ ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ1. «Μια Πολυκεντρική, Τυχαιοποιημένη, διπλά τυφλή μελέτη φάσης 2 της

ασφάλειας, της ανεκτικότητας και της αποτελεσματικότητας του ενδοφλέβιου CD101

έναντι της ενδοφλέβιας κασποφουγκίνης ακολουθούμενης από αποκλιμάκωση σε από

του στόματος φλουκοναζόλη για τη θεραπεία ασθενών με Καντινταιμία», της

χορηγού εταιρείας Cidara Therapeutics Inc.

2. «Μια πολυκεντρική ,τυφλή, τυχαιοποιημένη κλινική μελέτη για την εκτίμηση της

ασφάλειας, της ανοχής, της φαρμακοκινητικής και της αποτελεσματικότητας της

κεφταζιδίμης- αβιμπακτάμης σε σχέση με την κεφεπίμη, σε παιδιά από 3 μηνών

έως18 χρόνων με επιπλεγμένη λοίμωξη του ουροποιητικού (cUTIs)», της χορηγού

εταιρείας Astra Zeneca

12


3. «Μία πολυκεντρική, τυχαιοποιημένη, ανοικτής θεραπείας κλινική μελέτη του S-

649266 ή της βέλτιστης διαθέσιμης θεραπείας για τη θεραπεία των σοβαρών

λοιμώξεων που προκαλούνται από ανθεκτικά στην καρβαπενέμη, αρνητικά κατά

Gram παθογόνα», της χορηγού εταιρείας Shionogi Ltd .

4. «Ελεγχόμενη με εικονικό φάρμακο,διπλά τυφλή, τυχαιοποιημένη μελέτη του

Aerucin ως συμπληρωματικής αγωγής σε συνδυασμό με αντιβιοτικά, για τη θεραπεία

της πνευμοίας από P.aeruginosa» της χορηγού εταιρείας Aridis Pharmaceuticals Inc.

5. «Randomised (3:1), double blind, active comrarator-controlled trial in hospitalized

children from birth to <18 years of age with cUTI» της χορηγού εταιρείας MSD

Merck

6. «A multicenter, open-label, randomized, active-controlled, parallel group, pivotal

study to investigate the efficacy, safety and tolerability, and pharmacokinetics of

Murepavadin combined with one anti-pseudomonal antibiotic versus two anti-

pseudomonal antibiotics in adult subjects with ventilator-associated bacterial

pneumonia suspected or confirmed to be due to Pseudomonas aeruginosa» της

χορηγού εταιρείας Polyphor Ltd.

7. «Observattional study of clinical management of cUTI, cIAI and HABP/VABP

attributable to carbapenem-reistant Gram-negative infections (EU-CARE)» της

χορηγού εταιρείας Merck Sharp & Dohme Corp.

ΟΜΙΛΙΕΣ ΣΕ ΣΥΝΕΔΡΙΑ1. «Ο ρόλος του εργαστηρίου στη διάγνωση της ψευδομεμβρανώδους κολίτιδα». 5ο

Ετήσιο Μετεκπαιδευτικό Πρόγραμμα Μαθημάτων Παθολογικής Κλινικής

Πανεπιστημίου Θεσσαλίας. Λάρισα 2013

2. «Τροφιμογενείς λοιμώξεις-Πρόληψη». Πρόγραμμα μεταπτυχιακών σπουδών,

στην Πρωτοβάθμια Φροντίδα Υγείας. Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Θεσσαλίας 2016

3. «Γαστρεντερίτιδα από καμπυλοβακτηρίδιο». Ημερίδα με τίτλο: Ζωονόσοι: ένα

διαχρονικό πρόβλημα. Λάρισα 2016

4. «Βρουκέλλωση: ο ρόλος του βιοπαθολόγου στην Εργαστηριακή Διάγνωση».

Θερινό Σχολείο Δελφοί 2017

13


«ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΚΑΙ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΚΛΑΣΙΚΕΣ ΚΑΙ

ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΤΟΥ ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΚΟΥ ΠΑΡΑΓΟΝΤΑ

ΤΗΣ ΑΥΤΟΜΑΤΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗΣ ΠΕΡΙΤΟΝΙΤΙΓΑΣ ΣΕ

ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΜΕ ΚΙΡΡΩΣΗ»

ΜΑΛΛΗ ΕΡΓΙΝΑ

Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας, Τμήμα Ιατρικής, 2018

ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ

1. Ευθυμία Πετεινάκη, Καθηγήτρια Μικροβιολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο

Θεσσαλίας (Επιβλέπουσα)

2. Γεώργιος Ν. Νταλέκος, Καθηγητής Παθολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο

Θεσσαλίας

3. Κωνσταντίνος Γουργουλιάνης Καθηγητής Πνευμονολογίας, Ιατρική Σχολή,

Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας

14


Περίληψη

Η αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα είναι μια συχνή και σοβαρή επιπλοκή

που αφορά στους ασθενείς με ασκίτη. Ορίστηκε για πρώτη φορά το 1971 ως η

περιτονίτιδα που εμφανίζεται σε ασθενείς με κίρρωση του ήπατος και συνοδό ασκίτη,

στην οποία δεν ανευρίσκεται ενδοκοιλιακή πηγή λοίμωξης που να απαιτεί

χειρουργική αντιμετώπιση (δευτεροπαθής βακτηριακή περιτονίτιδα). Κύριος

παθογενετικός μηχανισμός της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας είναι η

βακτηριακή διαμετάθεση, που ορίζεται ως η δίοδος ζώντων μικροβίων της εντερικής

χλωρίδας, διαμέσου του εντερικού τοιχώματος σε εξωαυλικές εντοπίσεις. Είναι η πιο

συχνή επιπλοκή λοιμώδους αιτιολογίας στους κιρρωτικούς ασθενείς. Η διάγνωσή της

βασίζεται στην αύξηση του απόλυτου αριθμού των πολυμορφοπύρηνων στο ασκιτικό

υγρό >250 κύτταρα/mm3, ανεξάρτητα από το αποτέλεσμα της καλλιέργειας του

ασκιτικού υγρού. Ωστόσο η απομόνωση και η ταυτοποίηση του αιτιολογικού

παράγοντα της λοίμωξης είναι πολύ σημαντική για τη χορήγηση της κατάλληλης

αντιμικροβιακής θεραπείας. Σε μεγάλο ποσοστό ασθενών (60%) με αυτόματη

βακτηριακή περιτονίτιδα, η καλλιέργεια, η οποία προτείνεται να γίνεται με

ενοφθαλμισμό του ασκιτικού υγρού σε φιαλίδια αιμοκαλλιεργειών «παρά τη κλίνη»

του ασθενούς, παραμένει στείρα. Το γεγονός αυτό οφείλεται κατά κύριο λόγο στη

χαμηλή συγκέντρωση των μικροβιακών κυττάρων στο ασκιτικό υγρό (1

μικροοργανισμός ανά ml). Προκειμένου να διερευνηθεί ο αιτιολογικός μικροβιακός

παράγοντας, παράλληλα με τη συμβατική καλλιέργεια έχουν χρησιμοποιηθεί

μοριακές τεχνικές.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διερευνήθηκε η δυνατότητα

χρησιμοποίησης της ευρέος φάσματος 16S rRNA PCR στην ταυτοποίηση του

αιτιολογικού παράγοντα της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας σε ασθενείς που

νοσηλεύθηκαν στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Λάρισας, κατά το διάστημα

2008-2017.

Εξετάστηκαν 150 ασκιτικά υγρά (111 πυλαίας υπέρτασης και 39 μη πυλαίας

υπέρτασης), 32 από τα οποία χαρακτηρίστηκαν ως αυτόματη βακτηριακή

περιτονίτιδα σύμφωνα με τα κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα. 10 ml ασκιτικού

υγρού από κάθε ασθενή της μελέτης, ενοφθαλμίστηκαν σε φιαλίδια αιμοκαλλιεργειών

15


και άλλα 10 ml χρησιμοποιήθηκαν για την εφαρμογή ευρέος φάσματος 16S rRNA

PCR. Επιπλέον, η ίδια 16S rRNA PCR εφαρμόστηκε και στο υγρό της

αιμοκαλλιέργειας που περιείχε το ασκιτικό υγρό, μετά την παρέλευση 14 ημερών

επώασης. Στα δείγματα που η PCR έδωσε θετικό αποτελέσματα έγινε ανάλυση της

νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (sequencing) προκειμένου να ταυτοποιηθεί ο

μικροοργανισμός.

Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των καλλιεργειών, σε 4 από τις 32 περιπτώσεις

αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας απομονώθηκε μικροοργανισμός (12.5%), ο

οποίος ταυτοποιήθηκε ως Escherichia coli.

H εφαρμογή της ευρέος φάσματος 16S rRNA PCR απευθείας στο ασκιτικό

υγρό των πασχόντων, ανέδειξε τον ίδιο μικροοργανισμό με την καλλιέργεια, μόνο σε

μία περίπτωση (ευαισθησία 25%, ειδικότητα 100%, θετική και αρνητική

προγνωστική αξία 100% και 92.3% αντίστοιχα). Αναφορικά με τον χρόνο του

αποτελέσματος, το αποτέλεσμα της PCR προηγήθηκε κατά 3 ημερών του

αποτελέσματος της καλλιέργειας.

Από την άλλη μεριά, η εφαρμογή της μοριακής μεθόδου στα υγρά των

φιαλιδίων της αιμοκαλλιέργειας ταυτοποίησε γενετικό υλικό συγκεκριμένου

μικροοργανισμού σε 5 περιπτώσεις. Εκτός από τις 4 θετικές αιμοκαλλιέργειες, όπου

ταυτοποιήθηκε E. coli, ταυτοποίησε και μια επιπλέον περίπτωση από Brucella spp, η

οποία δεν είχε ανιχνευθεί με την καλλιέργεια. Ο συγκεκριμένος ασθενής είχε θετική

αιμοκαλλιέργεια από τον ίδιο μικροοργανισμό και πολύ υψηλό τίτλο Wright-Coombs.

Συμπερασματικά η εφαρμογή της ευρέος φάσματος 16S rRNA PCR σε

ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα απευθείας στο ασκιτικό υγρό, δε

φαίνεται να είναι ιδιαίτερα βοηθητική. Αντίθετα η παράταση της επώασης των

φιαλιδίων με το ασκιτικό υγρό από 5 ημέρες που είναι το σύνηθες, σε 14 ημέρες,

βοηθά σημαντικά στην ανάδειξη του μικροοργανισμού. Η εφαρμογή της ευρέος

φάσματος PCR σε όλα τα φιαλίδια που είναι αρνητικά μετά τον παρατεταμένο χρόνο

επώασης βοηθά σημαντικά, ιδιαίτερα στην ανίχνευση απαιτητικών μικροοργανισμών.

16


Abstract

Spontaneous bacterial peritonitis (SBP) is a frequent and severe complication

of cirrhotic patients with ascites. It was defined for the first time in 1971 by Conn as a

bacterial infection of the ascitic fluid (AF) in the absence of a focal contiguous source.

The key mechanism of the pathogenesis of SBP is bacterial translocation (BT),

defined as the passage of viable gut flora through the intestinal barrier to extra

luminal sites. It is nhe most frequent infectious complication in patient with cirrhosis.

SBP is diagnosed on the basis of PMN cell counts equal or greater than 250 cells/mm

in AF, regardless the result of the ascites culture. It is known that, in a high proportion

of SBP patients, cultures of AF remain negative, probably due to the relative low

concentration of bacteria in ascitic fluid (1 bacteria/ml). In general practice, ascites

culture is negative in approximately 60% of SBP patients, despite the inoculation of

ascites directly into blood culture bottles (AF vial cultures) at the bedside. Molecular

assays have been widely used for detection of microorganisms directly to clinical

specimens.

In this study, we assessed the value of broad range 16S rRNA PCR applied

either directly to ascitic fluid or to the ascitic fluid vial cultures, compared to the

standard of care that includes ascitic fluid vial culture.

A total of 150 ascitic fluids (39 non portal hypertension and 111 portal

hypertension) obtained from individual patients, were collected. SBP was diagnosed

in 32 of them. Ten ml of each ascitic fluid were inoculated into blood culture bottles

at the patients’ bedside and were inoculated for a period of 14 days. In addition, 10 ml

of ascitic fluid were also obtained for molecular analysis. Broad range 16S rRNA

PCR was applied directly to ascitic fluid and to the ascitic fluid vial cultures after the

incubation period. PCR amplicons were sequenced in both directions and were

compared with those submitted to GenBank and EMBL, using the BLAST algorithm.

Four out 32 AF vial cultures (12.5%) were found to be positive for

Escherichia coli. The application of 16S rRNA PCR directly to AF detected only one

of the four positive samples [sensitivity 25%, specificity 100%, positive predictive

value (PPV) 100%, negative predictive value (NPV) 90.32%]. However, the

application of 16S rRNA PCR to AF vial cultures after 14 days of incubation

correctly identified all the positive samples, including one more that was positive for

Brucella mellitensis (sensitivity 100%, specificity 80%, PPV 80%, NPV 100%). The

17


elongation of the incubation period of the AF vial cultures, combined with the use of

16S rRNA in negative vials, increases the possibility of identifying the causative

agents of SBP and could be applied in the clinical laboratory.

18


Πίνακας Περιεχομένων

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Πρώτο μέρος

Κεφάλαιο 1: Ασκίτης.................................................................................................25

1.1 Ορισμοί..............................................................................................................25

1.2 Αίτια ασκίτη......................................................................................................26

1.2.1 Ηπατική συμφόρηση.......................................................................................28

1.2.2 Ηπατοπάθειες.................................................................................................291.2.3 Χυλώδης ασκίτης........................................................................................... 301.2.4 Παγκρεατικός ασκίτης..................................................................................... 301.2.5 Χολώδης ασκίτης ...........................................................................................311.2.6 Νεφρογενής ασκίτης.......................................................................................311.2.7 Μυξοίδημα.....................................................................................................321.2.8 Νόσοι ωοθηκών.............................................................................................. 32

1.2.9 Λοιμώδη αίτια................................................................................................ 331.2.9α Φυματίωση...................................................................................................331.2.9β Ασκίτης σε ασθενείς με AIDS........................................................................ 331.2.10 Κακοήθη νεοπλάσματα................................................................................. 341.2.11 Οικογενής Μεσογειακός Πυρετός...................................................................351.2.12 Κοκκιωματώδης περιτονίτιδα........................................................................ 35

Κεφάλαιο 2: Παθολογοφυσιολογικοί μηχανισμοί παραγωγής ασκητικού υγρού . 36

2.1 Βασικές αρχές...................................................................................................36

2.2 Μηχανισμοί ανάπτυξης ασκιτικού υγρού λόγω πυλαίας υπέρτασης..........37

2.3 Μηχανισμοί ανάπτυξης ασκιτικού υγρού στην κίρρωση ............................37

2.4 Παθολογοφυσιολογική διάκριση ασκιτικού υγρού.......................................40

Κεφάλαιο 3: Κλινική εικόνα ασθενούς με περιτοναϊκή συλλογή..........................44

Κεφάλαιο 4: Εργαστηριακή ανάλυση ασκιτικού υγρού.........................................47

19


4.1 Μακροσκοπική εμφάνιση (χροιά-όψη) ασκιτικού υγρού 47

4.2 Προσδιορισμός μικροβιολογικών και βιοχημικών δεικτών του ασκιτικού

υγρού.......................................................................................................................48

4.2.1 Αριθμός λευκών............................................................................................. 494.2.2 Λευκωματίνη..................................................................................................504.2.3 Ολικά λευκώματα........................................................................................... 514.2.4 Καλλιέργεια....................................................................................................514.2.5 Γλυκόζη ....................................................................................................... 524.2.6 Γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) ...................................................................53

4.2.7 Αμυλάση........................................................................................................ 534.2.8 GRAM χρώση................................................................................................ 53

4.2.9 Κυτταρολογικές εξετάσεις...............................................................................544.2.10 Τριγλυκερίδια............................................................................................... 544.2.11 Εξετάσεις για το μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης...........................................544.2.12 Χολερυθρίνη.................................................................................................554.2.13 Άλλες εξετάσεις........................................................................................... 55

Κεφάλαιο 5: Αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα.................................................. 57

5.1 Ορισμοί-Ταξινόμηση........................................................................................ 57

5.2 Παράγοντες κινδύνου....................................................................................... 60

5.3 Παθογένεση.......................................................................................................61

5.4 Κλινική εικόνα αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας................................65

5.5 Ανάλυση ασκιτικού υγρού σε ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή

περιτονίτιδα............................................................................................................ 65

Κεφάλαιο 6: Οι μοριακές μέθοδοι ως εργαλείο για τη διάγνωση της αυτόματης

βακτηριακής περιτονίτιδας.................................................................. 69

Κεφάλαιο 7: Θεραπεία ασκίτη και αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας....... 70

7.1 Θεραπεία ασκίτη.............................................................................................. 70

7.2 Θεραπεία αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας .......................................70

Κεφάλαιο 8: Προφύλαξη έναντι αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας.............72

20


Δεύτερο Μέρος

Κεφάλαιο 1: Αρχές μοριακών μεθόδων...................................................................75

1.1 Εισαγωγή...........................................................................................................75

1.2 Αρχές μοριακών μεθόδων................................................................................ 76

1.3 Βασικές αρχές PCR.......................................................................................... 77

1.3.1 Η αρχή της μεθόδου........................................................................................771.3.2 Η διαδικασία της αντίδρασης...........................................................................781.3.3 Ευρέος φάσματος 16S rRNA PCR...................................................................801.3.4 Η εμφάνιση και η αποτύπωση του τελικού προϊόντος........................................ 821.3.5 Η επιλογή και η επεξεργασία του κλινικού δείγματος- Η απομόνωση του DNA ..831.3.6 Αναλυτική ευαισθησία, διαγνωστική ευαισθησία και διαγνωστική ειδικότητα ....84

1.3.7 Τα ψευδώς θετικά αποτελέματα....................................................................... 851.3.8 Τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα.................................................................86

1.4 Προσδιορισμός νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ενός μορίου DNA

(sequencing)............................................................................................................ 86

Κεφάλαιο 2: Οι μοριακές μέθοδοι ως εργαλείο για τη διάγνωση των

βακτηριακών λοιμώξεων .................................................................... 89

ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

Κεφάλαιο 1: Εισαγωγή-Σκοπός................................................................................ 95

1.1 Εισαγωγή...........................................................................................................75

1.2 Σκοπός...............................................................................................................76

Κεφάλαιο 2: Ασθενείς, υλικά και μέθοδοι...............................................................98

2.1 Πρωτόκολλο εργασίας .....................................................................................98

2.2 Ασθενείς........................................................................................................... 100

21


Κεφάλαιο 3: Αποτελέσματα 104

3.1 Ομάδα ασθενών με ασκίτη μη σχετιζόμενο με πυλαία υπέρταση........... 104

3.2. α Ομάδα ασθενών με ασκίτη πυλαίας υπέρτασης που δεν πληρούσαν τα

κριτήρια της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας....................................... 107

3.2. β Ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα.................................. 109

Κεφάλαιο 4: Συζήτηση............................................................................................ 115

Βιβλιογραφία:.......................................................................................................... 120

22


ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

23


ΠΡΩΤΟ ΜΕΡΟΣ

24


ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1°ΑΣΚΙΤΗΣ

1.1 ΟρισμοίΟ όρος «ασκίτης» προέρχεται από την ελληνική λέξη ασκός και

σημαίνει την ύπαρξη ελεύθερου υγρού στην περιτοναϊκή κοιλότητα [1].

Ο ασκίτης γίνεται κλινικά έκδηλος μετά από συλλογή τουλάχιστον 1lt

υγρού [2]. Οι υγιείς άνδρες έχουν λίγο ή καθόλου ενδοπεριτοναϊκό υγρό,

ενώ οι γυναίκες έχουν φυσιολογικά μέχρι και 20ml ανάλογα με τη φάση

του έμμηνου κύκλου στην οποία βρίσκονται [3].

Ανάλογα με τη βαρύτητά του ο ασκίτης χωρίζεται σε 3 βαθμούς

[4] (Πίνακας 1).

Πίνακας 1. Ταξινόμηση τ°υ ασκίτη ανάλογα με τη βαρύτητά τ°υ

ΒΑΡΥΤΗΤΑ

ΒΑΘΜΟΣ 1

Ήπι°ς ασκίτης

Μη εμφανής κλινικά ασκίτης.

Διάγνωση με υπερήχους

ΒΑΘΜΟΣ 2

Μέτριας βαρύτητας

Μικρής π°σότητας ασκιτική

συλλογή. Διάγνωση με κλινική

εξέταση. Ήπια διάταση του

κοιλιακού τοιχώματος.

ΒΑΘΜΟΣ 3

Σοβαρός ασκίτης

Σημαντική περιτοναϊκή συλλογή.

Διάταση του κοιλιακού τοιχώματος.

Ανάλογα με την εμφάνιση ή όχι επιπλοκών (αυτόματη βακτηριακή

περιτονίτιδα ή ηπατονεφρικό σύνδρομο) ο ασκίτης μπορεί να διακριθεί

σε επιπλεγμένο ή ανεπίπλεκτο [4]. Επίσης ανάλογα με την ανταπόκρισή

του στη θεραπεία, ο ασκίτης μπορεί να χαρακτηριστεί ως ανθεκτικός,

25


όταν δεν είναι δυνατό να «κινητοποιηθεί» ή όταν η γρήγορη υποτροπή

του μετά από ολική ή μαζική παρακέντηση δεν μπορεί να αποτραπεί με

φαρμακευτικά μέσα [5]. Ο ανθεκτικός ασκίτης μπορεί να υποδιαιρεθεί σε

ανθιστάμενο στα διουρητικά ασκίτη παρά την επίτευξη μέγιστης δόσης

και σε ασκίτη που δεν είναι δυνατό να αντιμετωπιστεί με διουρητικά

λόγω εμφάνισης επιπλοκών που εμποδίζουν την επίτευξη μίας

αποτελεσματικής δόσης διουρητικών [5].

1.2 Αίτια ασκίτηΣτο 80-85% των περιπτώσεων η ασκιτική συλλογή οφείλεται σε

παρεγχυματική νόσο του ήπατος, με δεύτερη αιτία από πλευράς

συχνότητας την καρκινωματώδη διήθηση του περιτοναίου. Λιγότερο

συχνά αίτια ασκίτη αποτελούν τα καρδιακά νοσήματα με επιβάρυνση της

δεξιάς κοιλίας, οι παθήσεις που χαρακτηρίζονται από σημαντικού

βαθμού υπολευκωματιναιμία και ακόμα σπανιότερα οι λοιμώξεις και

διάφορα άλλα αίτια [2].

Μία συνήθης και πρακτική ταξινόμηση των αιτιών του ασκίτη

είναι αυτή που διαιρεί τα αίτια ανάλογα με την προσβολή ή όχι του

περιτοναίου [2] (Πίνακας 2).

Πίνακας 2. Αίτια του ασκίτη

ΦΥΣΤΟΛΟΓΤΚΟ ΠΔΡΤΤΟΝΑΤΟ

Πυλαία υπέρταση1. Ηπατική συμφόρηση

Συμφορητική καρδιακή ανεπάρκεια

Συμπιεστική περικαρδίτιδα

Ανεπάρκεια τριγλώγχινας

Σύνδρομο Budd-Chiari

Φλεβοαποφρακτική νόσος

2. Ηπατοπάθεια

Κίρρωση

Αλκοολική ηπατίτιδα

Κεραυνοβόλος ηπατική ανεπάρκεια

26


Μαζικές ηπατικές μεταστάσεις

Ηπατική ίνωση

Οξύ λιπώδες ήπαρ της κύησης

3. Απόωραξη πυλαίας φλέβας

ΥπολευκωματιναιμίαΝεφρωσικό σύνδρομο

Εντεροπάθεια με απώλεια λευκώματος

Σοβαρή υποθρεψία με οίδημα ανά σάρκα

Διάωοοες καταστάσειςΧυλώδης ασκίτης

Παγκεατικός ασκίτης

Χολώδης ασκίτης

Νεφρογενής ασκίτης

Ουρογενής ασκίτης

Μυξοίδημα

Νόσος των ωοθηκών

ΠΑΣΧΟΝ ΠΕΡΙΤΟΝΑΙΟ

ΛοιμώξειςΒακτηριακή περιτονίτιδα

Φυματιώδης περιτονίτιδα

Μυκητιασική περιτονίτιδα

Περιτονίτιδα σχετιζόμενη με AIDS

Κακοήθεις παθήσεις Καρκινωμάτωση του περιτοναίου

Πρωτοπαθές μεσοθηλίωμα

Ψευδομυξοίδημα του περιτοναίου

Μαζικές ηπατικές μεταστάσεις

Ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα

Άλλες καταστάσεις Οικογενής μεσογειακός πυρετός

Αγγειίτιδα

Κοκκιωματώδης περιτονίτιδα

Ηωσινοφιλική περιτονίτιδα

27


1.2.1. Ηπατική συμφόρησηΑσκίτης μπορεί να παρατηρηθεί σε ασθενείς με δεξιά καρδιακή

ανεπάρκεια, λόγω της συμφόρησης του ήπατος στα πλαίσια της

γενικευμένης περιφερικής φλεβικής συμφόρησης σε αυτούς τους

ασθενείς [6] .

Η ανεπάρκεια της τριγλώγχινας και η χρόνια συμπιεστική

περικαρδίτιδα μπορούν επίσης να συνδυαστούν με ασκίτη, ο οποίος

οφείλεται όπως και στην περίπτωση της καρδιακής ανεπάρκειας στην

μειωμένη φλεβική αποχέτευση του ήπατος λόγω αύξησης των πιέσεων

στις δεξιές καρδιακές κοιλότητες [6].

Γενικά οι ασθενείς με ασκίτη που σχετίζεται με καρδιακά

νοσήματα αντιπροσωπεύουν το 5% του συνόλου. Η συμφόρηση του

ήπατος μπορεί να συνοδεύεται από κίρρωση του ήπατος («καρδιακή

κίρρωση») [4, 5].

Ηπατική συμφόρηση παρατηρείται και στο σύνδρομο Budd-Chiari

καθώς και στην φλεβοαποφρακτική νόσο του ήπατος. Ως σύνδρομο

Budd-Chiari αναφέρεται η θρομβωτική απόφραξη των μείζονων

ηπατικών φλεβών ή της κάτω κοίλης φλέβας [7]. Οι κύριες εκδηλώσεις

του συνδρόμου είναι το κοιλιακό άλγος και η εμφάνιση ασκίτη. Στις

οξείες μορφές του συνδρόμου ασκίτης παρατηρείται στο 90% των

ασθενών, ενώ στις υπόλοιπες μορφές στο 60% [8].

Η φλεβοαποφρακτική νόσος του ήπατος χαρακτηρίζεται από ίνωση

η οποία παρεμποδίζει τη ροή του αίματος από τις κεντρολόβιες και

μικρές υπολόβιες ηπατικές φλέβες. Η ίνωση αυτή μπορεί να είναι

αποτέλεσμα ακτινοβολίας στην περιοχή του ήπατος ή τοξικής βλάβης του

φλεβικού επιθηλίου από αντινεοπλασματικούς παράγοντες

(κυκλοφωσφαμίδη, κυτοσίνη, αραβινοσίδη και αζαθειοπρίνη) ή

πυρολιδιζινούχα αλκαλοειδή που περιέχονται σε ορισμένα βότανα (bush

28


tree disease). Η φλεβοαποφρακτική νόσος του ήπατος μπορεί επίσης να

παρατηρηθεί μετά από μεταμόσχευση μυελού των οστών (8).

1.2.2. ΗπατοπάθειεςΗ κίρρωση του ήπατος είναι μια διάχυτη εξεργασία που

χαρακτηρίζεται από εκτεταμένη ίνωση και ανάπτυξη αναγεννητικών

όζων στο ήπαρ. Αναπτύσσεται μετά από μακροχρόνια ηπατοκυτταρική

βλάβη που κατά κανόνα συνοδεύεται από ηπατοκυτταρική νέκρωση. Στα

κυριότερα αίτια της κίρρωσης συγκαταλέγονται οι χρόνιες ιογενείς

ηπατίτιδες, η αυτοάνοση ηπατίτιδα, η αλκοολική νόσος του ήπατος, η

πρωτοπαθής χολική χολαγγειίτιδα, η δεξιά καρδιακή ανεπάρκεια, το

σύνδρομο Budd-Chiari, η φλεβοαποφρακτική νόσος του ήπατος, η

αιμοχρωμάτωση, η ανεπάρκεια α1-αντιθρυψίνης, η νόσος του Wilson, η

κυστική ίνωση, η μη αλκοολική στεατοηπατίτιδα, διάφορα φάρμακα και

τοξίνες (μεθοτρεξάτη, αμιοδαρόνη), λοιμώξεις, κοκκιωματώδη νοσήματα

(σαρκοείδωση, φυματίωση) και άλλα. Ασκίτης στην κίρρωση

σχηματίζεται στη φάση της ρήξης της αντιρρόπησης (μη αντιρροπούμενη

κίρρωση) [2]. Ο ασκίτης στην κίρρωση οφείλεται στην ανάπτυξη πυλαίας

υπέρτασης που προκαλείται από τη μηχανική απόφραξη των κλάδων της

πυλαίας και των ηπατικών φλεβών από την ίνωση, τη θρόμβωση και την

οζώδη αναγέννηση του ηπατικού παρεγχύματος που χαρακτηρίζει την

παθολογική αυτή κατάσταση.

Η κεραυνοβόλος ηπατική ανεπάρκεια αποτελεί κλινικό σύνδρομο

που αναπτύσσεται σε ασθενείς με κατά κανόνα ελεύθερο ιστορικό

ηπατικής νόσου. Χαρακτηρίζεται από την ταχεία εγκατάσταση

βαρύτατης ηπατοκυτταρικής βλάβης, που εκδηλώνεται κυρίως ως

ηπατική εγκεφαλοπάθεια και βαριές διαταραχές της πηκτικότητας. Τα

συνήθη αίτια της κατάστασης αυτής είναι οι ιογενείς ηπατίτιδες,

φάρμακα (παρακεταμόλη, ισονιαζίδη, NSAIDS κα), τοξίνες (amanita

29


phaloides, τετραχλωράνθρακας) μεταβολικά αίτια (νόσος του Wilson,

ανεπάρκεια α1-αντιθρυψίνης) και διάφορες άλλες καταστάσεις όπως

υπερθερμία, ισχαιμική ή αυτοάνοση ηπατίτιδα [2].

Η αλκοολική ηπατίτιδα αποτελεί μία οξεία ή χρόνια φλεγμονή του

ήπατος αποτέλεσμα ηπατοκυτταρικής νέκρωσης, που επάγεται από την

κατάχρηση οινοπνεύματος. Αν και η κατάσταση αυτή είναι συχνά

αναστρέψιμη, αποτελεί πολλές φορές το πρόδρομο στάδιο της κίρρωσης

που ακολουθεί. Ο ασκίτης ανήκει στις επιπλοκές της νόσου και

υποστρέφει με τη βελτίωση της ηπατίτιδας [2].

Το οξύ λιπώδες ήπαρ της κύησης είναι σπάνιο σύνδρομο (1/13000

κυήσεις) με αυξημένη μητρική (75%) και βρεφική (85%) θνητότητα.

Εμφανίζεται συχνότερα σε πρωτοτόκες, δίδυμες κυήσεις και σε

προεκλαμψία ή εκλαμψία. Εκδηλώνεται συνήθως ως κεραυνοβόλος

ηπατική ανεπάρκεια [9] [2].

1.2.3. Χυλώδης ασκίτηςΧυλώδης ασκίτης ή χυλοπεριτόναιο ονομάζεται η συλλογή

γαλακτώδους, θολερού υγρού που περιέχει λέμφο στην περιτοναϊκή

κοιλότητα. Χυλώδης ασκίτης αναπτύσσεται ως αποτέλεσμα λεμφικής

απόφραξης. Στο 1/3 των περιπτώσεων οφείλεται σε κακοήθη νοσήματα

(κυρίως λεμφώματα ενηλίκων), στο 1/3 σε φλεγμονώδεις εξεργασίες

συμπεριλαμβανομένων και λοιμωδών αιτιών και στο υπόλοιπο 1/3 σε

άλλα αίτια. Το υγρό χαρακτηρίζεται από την παρουσία λιποσταγονιδίων,

που χρωματίζονται με Sudan χρώση και τη μεγάλη περιεκτικότητα του σε

τριγλυκερίδια (συχνά πάνω από 250mg/dl) [10] [11].

1.2.4. Παγκρεατικός ασκίτηςΟ όρος παγκρεατικός ασκίτης χρησιμοποιείται για χαρακτηρισμό

της χρόνιας συλλογής μεγάλων ποσοτήτων παγκρεατικού υγρού στην

30


περιτοναϊκή κοιλότητα. Παρατηρείται σε ασθενείς με οξεία ή

περισσότερο συχνά, χρόνια παγκρεατίτιδα, αλκοολικής ή τραυματικής

αιτιολογίας. Είναι σπάνια επιπλοκή των νόσων αυτών. Ο παγκρεατικός

ασκίτης είναι χρόνια νόσος που εκδηλώνεται με κοιλιακή διάταση,

κοιλιακό άλγος και απώλεια σωματικού βάρους. Η παθογένεια του

παγκρεατικού ασκίτη δεν είναι πάντοτε σαφής. Ωστόσο στο 85% των

ασθενών που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση διαπιστώθηκε η

παρουσία ψευδοκύστεων του παγκρέατος ή ρήξη του παγκρεατικού

πόρου [12] [13] .

1.2.5. Χολώδης ασκίτηςΟ χολώδης ασκίτης ή χολοπεριτόναιο είναι αποτέλεσμα

επικοινωνίας του χοληφόρου δέντρου με την περιτοναϊκή κοιλότητα. Η

διαφυγή χολής προς την περιτοναϊκή κοιλότητα μπορεί να προκαλέσει

έντονο κοιλιακό άλγος (χολώδης περιτονίτιδα) ή ήπια συμπτώματα

(χολώδης ασκίτης). Η πρώτη κατάσταση προκαλείται συνηθέστερα από

βιοψία ήπατος ή αφαίρεση λίθου από το χοληφόρο δέντρο, ενώ ο

χολώδης ασκίτης παρατηρείται συνήθως μετά από χειρουργική επέμβαση

στη χοληδόχο κύστη, αν και μπορεί να ακολουθήσει μετά από βιοψία

ήπατος. Η αναλογία χολερυθρίνης υγρού προς χολερυθρίνη ορού είναι

μεγαλύτερη από 1[1].

1.2.6. Νεφρογενής ασκίτηςΝεφρογενής ονομάζεται ο ασκίτης που αναπτύσσεται σε ασθενείς

με νεφρική ανεπάρκεια τελικού σταδίου και μεγάλη απίσχναση. Είναι

σπάνια κλινική οντότητα. Ο ακριβής μηχανισμός παραγωγής του δεν

είναι γνωστός. Σε μία έρευνα 7 από τους 12 συνολικά ασθενείς με

νεφρωσικό σύνδρομο στους οποίους εμφανίστηκε ασκίτης είχαν και

ηπατική νόσο (3 κίρρωση και 4 αμυλοείδωση) [14]. Σε μία άλλη έρευνα,

31


σε σύνολο 9 ασθενών με νεφρογενή ασκίτη, ένας αποδείχθηκε ότι είχε

κίρρωση του ήπατος, και άλλος ένας φυματιώδη περιτονίτιδα [1]. Η

υπερφόρτωση με υγρά φαίνεται ότι διαδραματίζει κάποιο ρόλο στα δύο

τρίτα των περιπτώσεων [1]. Επίσης η υπολευκωματιναιμία λόγω

απώλειας λευκώματος και ελαττωμένης πρόσληψης λευκώματος

επιβαρύνουν την κατάσταση. Το ασκιτικό υγρό περιέχει συνήθως μεγάλη

ποσότητα λευκώματος και αυξημένη συγκέντρωση γαλακτικής

αφυδρογονάσης.

1.2.7. ΜυξοίδημαΟ ασκίτης μπορεί να εμφανιστεί και ως σπάνια επιπλοκή του

χρόνιου υποθυρεοειδισμού. Η εξοίδηση λέμφου από τα λεμφαγγεία σε

συνδυασμό με την αυξημένη διαπερατότητα των τριχοειδών που

ενοχοποιούνται για τη δημιουργία οιδήματος των άκρων στους

υποθυρεοειδικούς ασθενείς μπορεί να ευθύνονται και για τον σχηματισμό

ασκιτικού υγρού [15].

1.2.8. Νόσοι των ωοθηκώνΤο σύνδρομο Meigs είναι ένα σπάνιο κλινικό σύνδρομο που

χαρακτηρίζεται από την παρουσία ασκίτη και υπεζωκοτικής συλλογής

υγρού (συνήθως δεξιάς) σε συνδυασμό με την παρουσία καλοήθους

όγκου της ωοθήκης. Ο ακριβής μηχανισμός με τον οποίο προκαλείται ο

ασκίτης δεν είναι γνωστός, πάντως η χειρουργική εξαίρεση του

καλοήθους όγκου οδηγεί σε υποχώρηση του ασκίτη και της

υπεζωκοτικής συλλογής μέσα σε 2-3 βδομάδες. Συνήθως το σύνδρομο

εμφανίζεται μετά την εμμηνόπαυση και εκδηλώνεται με θωρακικό πόνο

και κοιλιακή διάταση. Το υγρό θεωρείται ότι μετακινείται από την

περιτοναϊκή κοιλότητα προς τον υπεζωκοτικό χώρο διαμέσου μικρών

διαφραγματικών πόρων ή λεμφαγγείων [16] [17].

32


1.2.9. Λοιμώδη αίτιαΗ φλεγμονή του περιτοναίου ονομάζεται περιτονίτιδα και μπορεί

να είναι οξεία ή χρόνια. Κατά κανόνα η οξεία περιτονίτιδα είναι

δευτερογενής, αναπτύσσεται δηλαδή σε έδαφος οξείας σκωληκοειδίτιδας,

εκκολπωματίτιδας, γαγγραινώδους χολοκυστίτιδας ή διάτρησης πεπτικού

έλκους. Τα συχνότερα παθογόνα είναι το κολοβακτηρίδιο και ο

εντερόκοκκος. Γονοκοκκική περιτονίτιδα μπορεί να αναπτυχθεί από

επέκταση γονοκοκκικής λοίμωξης των έσω γεννητικών οργάνων.

1.2.9. α. Φυματίωση

Ασκίτης παρατηρείται στην πλειονότητα των ασθενών με

φυματιώδη περιτονίτιδα, αν και δε συνδυάζεται απαραίτητα με ινώδεις

βλάβες [1]. Το περιτόναιο προσβάλλεται είτε αιματογενώς σε

περιπτώσεις διασποράς, είτε με επέκταση βλαβών που εντοπίζονται

στους μεσεντέριους λεμφαδένες, το τοίχωμα του λεπτού εντέρου ή τις

σάλπιγγες. Η σχετικά συχνή ανάπτυξη φυματιώδους περιτονίτιδας σε

ασθενείς με ηπατική κίρρωση, επιβάλλει τη διαφορική διάγνωση της

νόσου αυτής από τον ασκίτη της πυλαίας υπέρτασης, τον οποίο άλλωστε

συχνά επιπλέκει. Στις μισές περιπτώσεις φυματιώδους περιτονίτιδας η

κύρια κλινική εκδήλωση είναι η κοιλιακή διάταση, ενώ στο σύνολο

σχεδόν των περιπτώσεων υπάρχει καθημερινή ή περιοδική πυρετική

κίνηση. Κίρρωση του ήπατος παρατηρείται στο 20% των ασθενών [1].

Σημεία πνευμονικής νόσου δεν παρατηρούνται και οι δερμοαντιδράσεις

είναι αρνητικές σε περισσότερο από τους μισούς ασθενείς. Αυξημένα

επίπεδα της απαμινάσης της αδενοσίνης (adenosine deaminase, ADA) σε

επίπεδα >30-39 IU/L είναι συνηγορητικά υπέρ φυματιώδους

περιτονίτιδας σε μη κιρρωτικούς ασθενείς, αν και δεν τεκμηριώνουν τη

διάγνωση με βεβαιότητα [18].

1.2.9. β. Ασκίτης σε ασθενείς με AIDS

33


Ασκίτης παρατηρείται στο 14% των ασθενών που πάσχουν από το

σύνδρομο της επίκτητης ανοσοανεπάρκειας (AIDS) [1]. Οι ασθενείς

αυτοί συχνά παρουσιάζουν ποικίλα προβλήματα και ως εκ τούτου οι

μηχανισμοί ανάπτυξης του ασκίτη είναι πολύπλοκοι. Σε μία έρευνα το

50% των ασθενών με AIDS έπασχαν και από πυλαία υπέρταση,

συνηθέστερα ιογενούς αιτιολογίας [19]. Άλλες συχνές αιτίες δημιουργίας

ασκίτη μη πυλαίας υπέρτασης σε αυτούς τους ασθενείς είναι οι λοιμώξεις

(φυματιώδης περιτονίτιδα, λοίμωξη του εντέρου από κυτταρομεγαλοϊό),

τα κακοήθη νοσήματα (σάρκωμα Kaposi, T-λέμφωμα) και η διάτρηση

κοίλου οργάνου [1]. Επιπροσθέτως η παγκρεατίτιδα και ο παγκρεατικός

ασκίτης είναι συχνές επιπλοκές του συνδρόμου, είτε λόγω προσβολής του

παγκρέατος από ευκαιριακά παθογόνα, είτε λόγω παγκρεατικής

αντίδρασης στη φαρμακευτική αγωγή. Γι’ αυτό το λόγο θα πρέπει να

ελέγχεται η τιμή της αμυλάσης στο ασκιτικό υγρό των ασθενών με AIDS

[1].

1.2.10. Κακοήθη νεοπλάσματαΤα κακοήθη νεοπλάσματα συμπεριλαμβάνονται στα

σημαντικότερα αίτια ασκίτη. Πρόκειται συνήθως για μεταστατικά

νεοπλάσματα που συχνότερα προέρχονται από πρωτοπαθή νεοπλάσματα

του στομάχου, του παχέος εντέρου, της ωοθήκης, του μαστού και

λιγότερο συχνά λέμφωμα, χολαγγειοκαρκίνωμα, μεσοθηλίωμα, καρκίνο

του προστάτη και καρκίνο του οισοφάγου [1]. Ο μηχανισμός της

ανάπτυξης του ασκίτη είναι πολυπαραγοντικός και περιλαμβάνει

απόφραξη των λεμφαγγείων, έκχυση του υγρού από τα τριχοειδή του

όγκου και αυξημένη διαπερατότητα του περιτοναίου εξαιτίας ουσιών των

οποίων η έκκριση προκαλείται από τον καρκίνο. Η κυτταρολογική

εξέταση του υγρού είναι θετική στο 40-60% των περιπτώσεων, αλλά

συνήθως δεν επαρκεί για τη διάγνωση και έχει χαμηλή ευαισθησία [20].

34


Οι απεικονιστικές μέθοδοι και η λαπαροσκόπηση είναι αρκετά χρήσιμες.

Οι καρκινικοί δείκτες είναι συχνά παραπλανητικοί σε ασθενείς με

ασκίτη. Έχει αναφερθεί αύξηση του CA 125 σε κιρρωτικούς ασθενείς με

ασκίτη χωρίς την παρουσία όγκου [20]. Το πρωτοπαθές μεσοθηλίωμα

είναι ένα σπάνιο πρωτοπαθές νεόπλασμα. Σχετικά σπάνιο είναι και το

ψευδομύξωμα του περιτοναίου. Χαρακτηρίζεται από την παρουσία

ζελατινοειδούς υλικού στην περιτοναϊκή κοιλότητα που προέρχεται από

ρήξη βλεννώδους κύστης της ωοθήκης ή βλεννοκήλης της

σκωληκοειδούς απόφυσης [21].

Οι ηπατικές μεταστάσεις μπορεί να προκαλέσουν δημιουργία

ασκίτη λόγω πυλαίας υπέρτασης οπότε το ασκιτικό υγρό έχει χαρακτήρες

όμοιους με αυτούς που παρατηρούνται στην κίρρωση [22].

1.2.11. Οικογενής Μεσογειακός ΠυρετόςΟ Οικογενής Μεσογειακός Πυρετός είναι κληρονομική νόσος

άγνωστης αιτιολογίας που εκδηλώνεται με υποτροπιάζοντα αυτοϊώμενα

επεισόδια πυρετού και ορογονίτιδας, που μπορεί να περιλαμβάνουν

περιτοναϊκή και/ή πλευριτική συλλογή. Σοβαρή προσβολή του ήπατος

είναι σπάνια εκδήλωση του συνδρόμου [23].

1.2.12. Κοκκιωματώδης περιτονίτιδαΑσκίτης μπορεί να παρατηρηθεί και σε διάφορα νοσήματα του

συνδετικού ιστού όπως στον συστηματικό ερυθηματώδη λύκο [24] και

στη νόσο του Still των ενηλίκων [25].

35


ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2°ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΑΣΚΗΤΙΚΟΥ ΥΓΡΟΥ

2.1.Βασικές αρχέςΗ περιτοναϊκή κοιλότητα περιέχει σε φυσιολογικές συνθήκες πολύ

μικρές ποσότητες ελεύθερου υγρού. Το 40-80% του συνολικού όγκου

του φυσιολογικού ασκιτικού υγρού ανανεώνεται κάθε ώρα. Οι δυνάμεις

που ελέγχουν τη διαπεριτοναϊκή αυτή διακίνηση φαίνεται ότι είναι οι

ίδιες που ελέγχουν και τη διακίνηση υγρών δια μέσου άλλων

τριχοειδικών δικτύων. Το υγρό ωθείται από τα τριχοειδή προς τους

ιστικούς χώρους μέσω της ενδοαγγειακής υδροστατικής πίεσης, που στην

προκειμένη περίπτωση είναι η υδροστατική πίεση μέσα στην πυλαία

φλέβα και έλκεται από την κολλοειδωσμωτική πίεση των λευκωμάτων

του διάμεσου χώρου, δηλαδή στην περίπτωση αυτή, του

ενδοπεριτοναϊκού χώρου. Προς τις αντίθετες κατευθύνσεις δρουν

αντίστοιχα η ογκωτική πίεση των λευκωμάτων του αίματος και η

υδροστατική πίεση του διάμεσου χώρου [2] (Εικόνα 1) .

Με βάση τα παραπάνω, ανάπτυξη ασκίτη μπορεί να συμβεί όταν

υπάρξει μείωση της ενδοαγγειακής ογκωτικής πίεσης, που χαρακτηρίζει

τις καταστάσεις υπολευκωματιναιμίας (π.χ. νεφρωσικό σύνδρομο,

κίρρωση, εντεροπάθεια με απώλεια λευκώματος), όταν αυξηθεί η

διαπερατότητα του περιτοναίου μετά από πρωτοπαθή ή δευτεροπαθή

προσβολή αυτού, καθώς και όταν συμβεί αύξηση της υδροστατικής

πίεσης στο φλεβικό σύστημα της πυλαίας φλέβας (πυλαία υπέρταση)

(Σχήμα 1) [2].

36


Εικόνα 1. Βασικοί παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί δημιουργίας ασκίτη

2.2. Μηχανισμοί ανάπτυξης ασκίτη λόγω πυλαίας

υπέρτασηςΕιδικά η ανάπτυξη ασκίτη λόγω πυλαίας υπέρτασης προϋποθέτει

την ύπαρξη κολποειδικού ή μετακολποειδικού κωλύματος. Η παρουσία

κωλύματος στα κολποειδή (π.χ. κίρρωση) ή μετακολποειδικά (θρόμβωση

των ηπατικών φλεβών) οδηγεί σε αύξηση της υδροστατικής πίεσης, που

μεταδίδεται στα κολποειδή. Υγρό πλούσιο σε λεύκωμα περνά από το

τοίχωμα των κολποειδών στην περιτοναϊκή κοιλότητα χωρίς δυνατότητα

επανεισόδου, αφού η ογκωτική του πίεση είναι αυξημένη, ενώ επιπλέον

υπάρχει και αυξημένη υδροστατική πίεση στα κολποειδή. Για το λόγο

αυτό, ασκιτικό υγρό δε δημιουργείται σε ασθενείς με προηπατική πυλαία

υπέρταση, αν δε συνυπάρχει παρεγχυματική ηπατική νόσος ή ταυτόχρονο

μεθηπατικό πρόβλημα [2].

2.3 Μηχανισμοί ανάπτυξης ασκίτη στην κίρρωση

37


Ο μηχανισμός ανάπτυξης ασκίτη στην κίρρωση είναι

πολυπαραγοντικός. Οι κυριότεροι μηχανισμοί είναι (Σχήμα 1):

• Η ύπαρξη πυλαίας υπέρτασης (αυξημένη υδροστατική

πίεση)

• Η υπολευκωματιναιμία (μειωμένη κολλοειδωσμωτική ή

ογκωτική πίεση)

• Η υπερπαραγωγή ηπατικής λέμφου

• Η γενικευμένη περιφεριακή αγγειοδιαστολή πιθανότατα

μέσω της επαγόμενης από ενδοτοξίνη απελευθέρωσης μεγάλων

ποσοτήτων οξειδίου του αζώτου (NO)

• Η κατακράτηση ύδατος και Na.

Επιπρόσθετα η ανεπαρκής αδρανοποίηση της αλδοστερόνης από

το πάσχον ήπαρ και η μείωση του ενεργού (δραστικού) όγκου που οδηγεί

σε αύξηση της έκκρισης της αντιδιουρητικής ορμόνης (ADH) και

περαιτέρω ενεργοποίηση του συμπαθητικού νευρικού συστήματος,

διαιωνίζουν το πρόβλημα, δημιουργώντας στην ουσία έναν

αυτοτροφοδοτούμενο ενισχυόμενο σύστημα παραγωγής ασκιτικού υγρού

[2].

38


Σχήμα 1. Παθοφυσιολογικοί μηχανισμοί δημιουργίας ασκίτη στην κίρρωση

Κίρρωση ήπατοςι 1Ηπατοκυτταρική ανεπάρκεια Πυλαία υπέρταση

t Παραγωγή J Σύνθεση λευκωματίνης αγγειοδιαστολήλέμφου σπλαχνικού δικτύου

ι Κολλοειδωσμωτικη πίεση -~Ζ>ι /

^Δραστικού όγκου πλάσματος

C

t Ρενίνης, αλδοστερόνης,

ADH

1f Κατακράτηση

ΑΣΚΙΤΗΣ t Υδροστατική πίεση

Na και H2O

Υπερπαραγωγή λέμφου στην κίρρωση

Στο κιρρωτικό ήπαρ η ίνωση συνεπάγεται την αλλαγή της

αρχιτεκτονικής του οργάνου. Η ίνωση του χώρου του Disse καθώς και το

κλείσιμο των ανοιγμάτων στο ενδοθήλιο των κολποειδών έχει ως

αποτέλεσμα η υδροστατική και η ογκωτική πίεση εντός του αυλού των

κολποειδών να ομοιάζει με αυτές του υπόλοιπου αγγειακού συστήματος.

Η διαφορά της ογκωτικής πίεσης μεταξύ του αυλού των κολποειδών και

του μεσοκυττάριου χώρου του ήπατος αυξάνει, και επομένως ευνοείται η

κατακράτηση υγρού εντός του αγγειακού δικτύου. Παρόλα αυτά η

ογκωτική πίεση δεν μπορεί να υπερισχύσει της υδροστατικής πίεσης, που

ευνοεί την παραγωγή λεμφικού υγρού [1].

Κατακράτηση Na και ύδατος στην κίρρωση

Η κατακράτηση νατρίου και ύδατος επανατροφοδοτεί τη

δημιουργία ασκιτικού υγρού. Αυτό συμβαίνει λόγω της μείωσης του

ενδοαγγειακού όγκου (δημιουργία ασκιτικού υγρού και σπλαχνική

αγγειοδιαστολή) και της δευτεροπαθούς ενεργοποίησης

39


αντισταθμιστικών μηχανισμών, όπως του συστήματος ρενίνης-

αγγειοτενσίνης-αλδοστερόνης [1]. Οι εναρκτήριοι μηχανισμοί που

ευθύνονται για τη νεφρική κατακράτηση Na και ύδατος σε ασθενείς με

κίρρωση του ήπατος δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί.

Σύμφωνα με τη θεωρία της ατελούς πληρώσεως, η κατακράτηση

υγρού σχετίζεται άμεσα με τη μείωση του ενδοαγγειακού όγκου, λόγω

της παγίδευσης σημαντικού ποσού αίματος στο φλεβικό σκέλος της

σπλαγχνικής κυκλοφορίας, η οποία βρίσκεται σε συνθήκες συμφόρησης

λόγω της πυλαίας υπέρτασης [1]. Ωστόσο ο όγκος πλάσματος είναι

φυσιολογικός ή αυξημένος και όχι ελαττωμένος σε ασθενείς με κίρρωση

και σαφώς αυξημένος σε κιρρωτικούς με ασκίτη [1]. Έτσι αργότερα

διατυπώθηκε η υπόθεση της υπερχείλησης, σύμφωνα με την οποία η

νεφρική κατακράτηση νατρίου είναι πρωτοπαθής διαταραχή, δηλαδή η

κατακράτηση των υγρών είναι η αιτία και ο ασκίτης το αποτέλεσμα [1].

Οι δύο αυτές θεωρίες συμπτύχθηκαν από τους Witte και Witte

[26] , μαζί με την αναγνώριση της σημασίας της υπερδυναμικής

κατάστασης στην κίρρωση. Η διαστολή των περιφερικών αγγείων στην

κίρρωση οδηγεί στη μείωση του δραστικού όγκου πλάσματος, αυξάνει

την καρδιακή απόδοση και δημιουργεί ένα αιμοδυναμικό προφίλ που

μοιάζει πολύ με αυτό της σήψης [1]. Έτσι έγινε αντιληπτό ότι λόγω της

υπερδυναμικής αυτής κατάστασης, η χαμηλή αγγειακή αντίσταση, η

αυξημένη αγγειακή χωρητικότητα στην κίρρωση, η ενεργοποίηση των

αντισταθμιστικών μηχανισμών, καθώς και η κατακράτηση νατρίου και

ύδατος, είναι αποτέλεσμα του μειωμένου δραστικού «effective» όγκου

του πλάσματος. Η θεωρία αυτή ονομάζεται υπόθεση της περιφερικής

αγγειοδιαστολής των αρτηριολίων της σπλαγχνικής κυκλοφορίας

[27] .

2.4 Παθοφυσιολογική διάκριση του ασκιτικού υγρού

40


Στο παρελθόν η συγκέντρωση των ολικών πρωτεϊνών στο ασκιτικό

υγρό χρησιμοποιήθηκε για την ταξινόμηση του ασκίτη σε εξίδρωμα

(συγκέντρωση >2,5 g/dl) και διΐδρωμα (συγκέντρωση <2,5 g/dl). Η

ταξινόμηση αυτή δε θεωρείται σήμερα χρήσιμη καθώς δε φαίνεται να

βοηθάει στην κατανόηση της παθοφυσιολογίας της παραγωγής ασκιτικού

υγρού. Μια πιο ορθολογική προσέγγιση είναι η διάκριση σε ασκιτικό

υγρό σχετιζόμενο ή όχι με πυλαία υπέρταση [2] [28].

Το ήπαρ και το έντερο μπορεί να θεωρηθεί ότι χωρίζουν δύο

χώρους: το πυλαίο φλεβικό σύστημα και τον περιτοναϊκό χώρο, μεταξύ

των οποίων υπάρχει ισορροπία υδροστατικής και ογκωτικής πίεσης.

Βασιζόμενοι στον νόμο του Starling και μετρώντας την ογκωτική πίεση

στους δύο αυτούς χώρους μπορούμε να υπολογίσουμε την πίεση στην

πυλαία φλέβα [1].

Ο Hoefs περιέγραψε μια εξίσωση που αποτελεί τη βάση για τον

υπολογισμό της διαφοράς λευκωματίνης του ασκιτικού υγρού σε

σύγκριση με τον ορό [29]. Με βάση την εξίσωση αυτή προκύπτει μία

καινούργια, απλούστερη σχέση, με βάση την οποία μπορεί να

υπολογιστεί η πίεση στην πυλαία φλέβα, όταν είναι γνωστή η τιμή της

λευκωματίνης στο ασκιτικό υγρό (Asc) και στον ορό (S) του ασθενούς.

Όταν η διαφορά στην τιμή της λευκωματίνης μεταξύ του ορού και του

ασκιτικού υγρού είναι πάνω ή ίση με 1,1 gr/dl, τότε υπάρχει πυλαία

υπέρταση με ακρίβεια που προσεγγίζει το 100%, ανεξάρτητα από την

ύπαρξη αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας, τη λαμβανόμενη

διουρητική αγωγή, την πιθανή ενδοφλέβια χορήγηση λευκωματίνης τις

προηγούμενες μέρες ή τη διενέργεια θεραπευτικών παρακεντήσεων.

Αντίθετα, αν η διαφορά είναι μικρότερη του 1,1 gr/dl , τότε ο ασθενής

δεν έχει πυλαία υπέρταση με ακρίβεια που επίσης προσεγγίζει το 100%

[2].

41


Με βάση τα παραπάνω η ταξινόμηση του ασκίτη σε ασκίτη

σχετιζόμενο με πυλαία υπέρταση (διαφορά λευκωματίνης >1,1 gr/dl) και

ασκίτη που δε σχετίζεται με πυλαία υπέρταση (διαφορά λευκωματίνης

<1.1gr/dl), έχει πλέον αντικαταστήσει τις παλαιότερες ταξινομήσεις του

ασκίτη (Πίνακας 3) [2].

Πίνακας 3: Παθολογοφυσιολογική διάκριση αιτιών ασκίτη

ΑΣΚΙΤΗΣ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΟΣ ΜΕ ΠΥΛΑΙΑ ΥΠΕΡΤΑΣΗ

Κίρρωση του ήπατος Αλκοολική ηπατίτιδα Καρδιακός ασκίτης Μικτός ασκίτηςΔιάχυτη μεταστατική νόσος του ήπατος Οξεία κεραυνοβόλος ηπατική ανεπάρκεια Σύνδρομο Budd-Chiari Θρόμβωση πυλαίας φλέβαςΜη θρομβωτική φλεβοαποφρακτική ενδοηπατική νόσος ΜυξοίδημαΟξύ λιπώδες ήπαρ της κύησηςΑΣΚΙΤΗΣ ΜΗ ΣΧΕΤΙΖΟΜΕΝΟΣ ΜΕ ΠΥΛΑΙΑ ΥΠΕΡΤΑΣΗ

Καρκινωματώδης περιτονίτιδαΦυματιώδης περιτονίτιδαΑπόφραξη ή εμβολή αγγείων της κοιλίαςΠαγκρεατικός ασκίτηςΧολικός ασκίτηςΝεφρογενής ασκίτηςΟρογονίτιδα από αυτοάνοσα ρευματικά νοσήματαΟικογενής μεσογειακός πυρετόςΝεφρωσικό σύνδρομοΠεριτονίτιδα από χλαμύδιαΠεριτονίτιδα από βρουκέλλαΣύνδρομο MeigsΜετεγχειρητική διαφυγή λέμφου

42


Σε ένα δεδομένο ασθενή ο προσδιορισμός της διαφοράς

λευκωματίνης υγρού από τη λευκωματίνη του ορού πρέπει να γίνει μόνο

κατά την πρώτη παρακέντηση καθώς δεν έχει καμία προγνωστική αξία

για την πορεία της υποκείμενης νόσου [2].

43


ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3°ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ ΠΕΡΙΤΟΝΑΪΚΗ ΣΥΛΛΟΓΗ

Τα συμπτώματα που προκαλούνται από την ανάπτυξη του

ασκιτικού υγρού εξαρτώνται από την ταχύτητα παραγωγής του και την

ποσότητά του. Ακόμα, ο ασθενής μπορεί να εμφανίζει συμπτώματα και

κλινικά σημεία που οφείλονται στη βασική του νόσο. Όταν η ποσότητα

του υγρού είναι μεγάλη, τότε ο ασθενής αισθάνεται τη διάταση των

κοιλιακών του τοιχωμάτων και μπορεί να αναφέρει δύσπνοια ή

ταχυκαρδία καθώς το υγρό πιέζει το διάφραγμα. Συνήθως όμως ο

ασθενής προσέρχεται στον ιατρό λόγω της διάτασης της κοιλιάς που

γίνεται αντιληπτή είτε από τον ίδιο, είτε από τους οικείους του [2]. Ήπιο

κοιλιακό άλγος μπορεί να οφείλεται στη διάταση των κοιλιακών

τοιχωμάτων από τη συσσώρευση του υγρού, αλλά μπορεί να οφείλεται

και σε λοίμωξη, ανάπτυξη νεοπλασίας ή κήλης [1].

Ο ασκίτης συνοδεύεται από ορισμένα χαρακτηριστικά επισκοπικά

ευρήματα. Η προοδευτική συσσώρευση ασκιτικού υγρού στην

περιτοναϊκή κοιλότητα προκαλεί διάταση των πλαγίων κυρίως κοιλιακών

περιοχών με αποτέλεσμα η κοιλιά στην ύπτια θέση να μοιάζει με κοιλιά

βατράχου (βατραχοειδής κοιλία). Η πλάγια έλξη που προκαλείται στον

ομφαλό προκαλεί την αποπλάτυνσή του (χαμογελαστός ομφαλός).

Αντίθετα η ταχεία παραγωγή υγρού προκαλεί ομοιόμορφη κοιλιακή

διάταση και το σχήμα της κοιλιάς δεν είναι βατραχοειδές αλλά σφαιρικό.

Κατά την όρθια θέση λόγω βαρύτητας το υγρό συσσωρεύεται κυρίως στο

υπογάστριο και τα πλάγια κοιλιακά τοιχώματα με αποτέλεσμα η

απόσταση από τη ξιφοειδή απόφυση μέχρι τον ομφαλό να είναι

μεγαλύτερη από την απόσταση από τον ομφαλό μέχρι την ηβική

σύμφυση (αντίθετα ευρήματα σε περιπτώσεις κύστεως ωοθήκης ή

καρκίνου των ωοθηκών) [2].

44


Κατά την αντικειμενική εξέταση του ασθενούς στην ύπτια θέση

διαπιστώνεται επικρουστικά αμβλύτητα στα πλάγια και τυμπανικότητα

στο κέντρο της κοιλιακής χώρας. Η περιφερική αμβλύτητα σχηματίζει

καμπύλη γραμμή με το κοίλο προς τα επάνω. Σημαντικό κλινικό σημείο

είναι η μετακινούμενη αμβλύτητα. Η επίκρουση γίνεται αρχικά με τον

ασθενή σε ύπτια θέση και στη συνέχεια διαδοχικά στις δύο θέσεις

πλάγιας κατάκλισης. Στην ύπτια θέση η επίκρουση της κοιλιακής χώρας

αποκαλύπτει αμβλύτητα στις πλάγιες κοιλιακές χώρες, ενώ στις θέσεις

πλάγιας κατάκλισης, λόγω βαρύτητας, διαπιστώνεται αμβλύτητα μόνο

στην κατωφερέστερη πλευρά του σώματος και μάλιστα σε μεγαλύτερη

έκταση, ενώ στην πλευρά που βρίσκεται προς τα πάνω υπάρχει

τυμπανικότητα. Η παρουσία μετακινούμενης αμβλύτητας προϋποθέτει

την ύπαρξη τουλάχιστον ενός λίτρου ασκιτικού υγρού. Όταν όμως το

υγρό είναι άφθονο και υπό τάση η αμβλύτητα είναι καθολική και μη

μετακινούμενη.

Άλλη κλινική δοκιμασία που μπορεί να είναι θετική σε

περιπτώσεις ελεύθερης συλλογής υγρού είναι το σημείο της αντιτυπίας ή

αναζήτησης ωστικών κυμάτων. Κατά τη δοκιμασία αυτή γίνεται

αντιληπτό από τον εξετάζοντα που έχει τοποθετημένη την παλάμη του

στο ένα πλάγιο της κοιλιακής χώρας, το αίσθημα που δημιουργείται από

κυματισμούς του υγρού που προκαλούνται μετά από πλήξη του αντίθετου

πλαγίου (η άκρα χείρα του ασθενούς είναι τοποθετημένη με το οπισθέναρ

στο μέσο της κοιλίας, ώστε να αποσβεστούν δερματικές ώσεις).

Χρήσιμο επίσης είναι το σημείο του επιπλέοντος πάγου ή ωστικής

ψηλαφήσεως, που προϋποθέτει την ύπαρξη μεγάλης ποσότητας

ασκιτικού υγρού και διογκωμένων υποχόνδριων σπλάγχνων ή

ενδοκοιλιακού όγκου. Το σημείο αυτό συνίσταται στην εκτέλεση

απότομων βραχέων ώσεων με τους δακτύλους, οπότε το διογκωμένο

σπλάγχνο βυθίζεται στο ελεύθερο περιτοναϊκό υγρό και στη συνέχεια

45


αιωρούμενο μέσα στο υγρό επανέρχεται και πλήττει την παλάμη και τους

δακτύλους του εξετάζοντος [2].

Με μέθοδο αναφοράς το υπερηχογράφημα (ανιχνεύει μέχρι 100ml

υγρού), η συνολική ακρίβεια της αντικειμενικής εξέτασης στη διάγνωση

του ασκίτη δεν υπερβαίνει το 60%. Το σημείο της αντιτυπίας έχει

μεγαλύτερη ειδικότητα, αλλά χαμηλή ευαισθησία (50%). Αντίθετα η

παρουσία μετακινούμενης αμβλύτητας έχει μεγάλη ευαισθησία αλλά

χαμηλή ειδικότητα (56%). Στον Πίνακα 4 αναφέρονται η ευαισθησία και

η ειδικότητα των κύριων τεχνικών εξέτασης. Έτσι το μόνο που μπορεί να

λεχθεί με βεβαιότητα είναι ότι όταν δεν υπάρχει επικρουστική

αμβλύτητα, η πιθανότητα απουσίας ασκίτη είναι πάνω από 90% [2] [30]

[4] [31] [32].Πίνακας 4. Ευαισθησία και ειδικότητα κλινικών σημείων στη διάγνωση του ασκίτη

ΤΕΧΝΙΚΗ ΕΞΕΤΑΣΗΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ

Βατραχοειδής διόγκωση 78% 44%

Επικρουστική αμβλύτητα 94% 29%

Μετακινούμενη

αμβλύτητα

83% 56%

Αντιτυπία 50% 82%

Το πιο αξιόπιστο σημείο για την ανίχνευση ασκιτικού υγρού κατά

την κλινική εξέταση αποτελεί σήμερα, η παρουσία αμβλύτητας κατά την

επίκρουση του υπογαστρίου με τον ασθενή στηριζόμενο στα χέρια και

στα γόνατα, οπότε μπορεί να ανιχνευτούν μέχρι και 120ml υγρού. [2].

Ο ασκίτης πρέπει να διαφοροδιαγνωστεί από άλλες καταστάσεις

που προκαλούν κοιλιακή διάταση, όπως παχυσαρκία, μετεωρισμός,

διόγκωση των υποχόνδριων σπλάγχνων (ήπαρ, σπλήνας), η κύηση και η

παρουσία άλλων ενδοκοιλιακών μαζών (κυρίως κύστεις και

νεοπλάσματα των ωοθηκών).

46


ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4°ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΟΥ ΑΣΚΙΤΙΚΟΥ ΥΓΡΟΥ

Η παρακέντηση του ασκιτικού υγρού είναι η ταχύτερη και πιο

χρήσιμη μέθοδος για τη διάγνωση της αιτίας της ασκιτικής συλλογής [1].

Διαγνωστική παρακέντηση του ασκίτη θα πρέπει να εκτελείται σε όλους

τους ασθενείς με πρωτοεμφανιζόμενο ασκίτη βαθμού 2 ή 3 και σε όλους

τους κιρρωτικούς ασθενείς με ασκίτη κατά την εισαγωγή τους στο

νοσοκομείο για τον αποκλεισμό αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας,

ανεξάρτητα από την αιτία εισόδου. Επίσης θα πρέπει να διενεργείται σε

όλους τους ασθενείς με ασκίτη που εμφανίζουν αιμορραγία

γαστρεντερικού, shock, πυρετό ή άλλα σημεία συστηματικής φλεγμονής,

καθώς και στους ασθενείς με επιδείνωση της ηπατικής ή της νεφρικής

λειτουργίας και σε αυτούς με σημεία ηπατικής εγκεφαλοπάθειας [30].

Οι επιπλοκές της παρακέντησης είναι πολύ σπάνιες και οι

συχνότερες είναι αιμάτωμα του κοιλιακού τοιχώματος (1%),

αιμοπεριτόναιο (0,1%) και ιατρογενής λοίμωξη (0,1%) [33].

4.1. Μακρ°σκ°πική εμφάνιση (χρ°ιά-όψη) τ°υ ασκιτικνύ υγρ°ύ

Τις περισσότερες φορές το ασκιτικό υγρό είναι διαυγές με κίτρινη

χροιά. Σκοτεινής χροιάς (σαν μελάσσα), υποδεικνύει διάτρηση

χοληφόρων ή του λεπτού εντέρου. Μαύρης απόχρωσης υγρό

παρατηρείται στο κακόηθες μελάνωμα και στην αιμορραγική

παγκρεατίτιδα (λόγω της μετουσίωσης των ερυθρών από τα παγκρεατικά

ένζυμα), ενώ στον παγκρεατικό ασκίτη έχει χαρακτηριστική εμφάνιση

τσαγιού [2]. Θολό υγρό παρατηρείται όταν υπάρχει αυξημένος αριθμόςΛ

πολυμορφοπυρήνων >1000/mm και πυώδες υγρό όταν ταΛ

πολυμορφοπύρηνα είναι >50000/mm . Ο ελάχιστος αριθμός ερυθρών που

απαιτούνται για να αποκτήσει αιματηρή όψη το ασκιτικό υγρό είναι

47


-5 -5

10000/mm , ενώ πάνω από 20000/mm χαρακτηρίζεται ως αιμορραγικό

[2]. Γαλακτώδης εμφάνιση του υγρού, οφειλόμενη σε αυξημένη

συγκέντρωση τριγλυκεριδίων (>100 mg/dl) παρατηρείται σε μικρό

ποσοστό κιρρωτικών ασθενών (2%), αλλά και σε περιπτώσεις

λεμφώματος ή καρκινωματώδους διήθησης των κοιλιακών λεμφαγγείων

[2].

4.2. Προσδιορισμός μικροβιολογικών και βιοχημικών δεικτών του ασκιτικου υγρου

Ο προσδιορισμός των δεικτών αυτών πρέπει να ακολουθεί έναν

αλγόριθμο βήμα προς βήμα, τόσο για λόγους κόστους όσο και γιατί

μπορεί να επιφέρει μεγαλύτερη σύγχυση κατά τη διερεύνηση του

ασθενούς. Στον Πίνακα 5 φαίνεται ο αλγόριθμος των εργαστηριακών

παραμέτρων που πρέπει να εκτελούνται κατά την ανάλυση του ασκιτικού

υγρού [32].

Πίνακας 5: Αλγόριθμος εργαστηριακών εξετάσεων ακιτικου υγρου

Εξετάσεις

ρουτίνας

Προαιρετικές

εξετάσεις (σε

υπόνοια λοίμωξης)

Ασυνήθεις

εξετάσεις

Αναποτελεσματικές

εξετάσεις

Αριθμός

λευκών και

τύπος

Καλλιέργεια σε

φιαλίδια αίματος

Κυτταρολογική PH

Λευκωματίνη Gram χρώση Τριγλυκερίδια Γαλακτικό οξύ

Ολικά

λευκώματα

Γαλακτική

αφυδρογονάση

(LDH)

Άμεση χρώση και

καλλιέργεια για

μυκοβακτηρίδιο

της φυματίωσης

Χοληστερόλη,

α1-αντιθρυψίνη,

φιμπρονεκτίνη,

γλυκοζαμινογλυκάνες

Γλυκόζη Χολερυθρίνη

Αμυλάση

Ο σκοπός της διενέργειας αυτών των εξετάσεων είναι ο

αποκλεισμός της δευτεροπαθούς περιτονίτιδας καθώς και η διερεύνηση

48


της ύπαρξης αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας. Επίσης να

διευκρινιστεί αν πρόκειται για ασκίτη πυλαίας υπέρτασης ή μη πυλαίας

υπέρτασης.

4.2.1 Αριθμός λευκών

Είναι η πιο χρήσιμη εξέταση και αν η παρακέντηση αποδώσει πολύ

μικρό όγκο υγρού, τότε αυτή είναι η πρώτη εξέταση που πρέπει να

γίνεται, καθώς απαιτούνται μόλις 10 μΐ για τη διενέργειά της. Το

ανώτερο φυσιολογικό όριο του συνολικού αριθμού λευκών

αιμοσφαιρίων, σε ασθενείς με ανεπίπλεκτο κιρρωτικό ασκίτη, είναι 500

κύτταρα/mm3, αλλά στη διάρκεια της διουρητικής αγωγής μπορεί ναΛ

αυξηθεί μέχρι και πάνω από 1000 κύτταρα/mm [34]. Το αντίστοιχο

φυσιολογικό όριο του απόλυτου αριθμού πολυμορφοπυρήνων είναι 250Λ

κύτταρα/mm , ανεξάρτητα της χορήγησης ή όχι διουρητικής αγωγή [2].

Τα περισσότερα αιμορραγικά ασκιτικά υγρά οφείλονται σε τραυματισμό

κατά την παρακέντηση. Σε αυτήν την περίπτωση για κάθε 250 ερυθρά

μπορεί να αφαιρεθεί ένα πολυμορφοπύρηνο, ενώ για κάθε 750 ερυθρά

μπορεί να αφαιρεθεί ένα λεμφοκύτταρο [35]. Κάθε λοιμώδες αίτιο

ασκίτη και κάθε λοιμώδης επιπλοκή του ασκίτη μπορεί να προκαλέσει

αύξηση του αριθμού των λευκών στο ασκιτικό υγρό. Το συχνότερο αίτιο

είναι η αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα στην οποία είναι αυξημένος

τόσο ο ολικός αριθμός των λευκών αιμοσφαιρίων, όσο και ο απόλυτοςΛ

αριθμός των πολυμορφοπύρηνων (>250/mm). Στη φυματιώδη

περιτονίτιδα και στην καρκινωμάτωση του περιτοναίου υπερτερούν τα

λεμφοκύτταρα όπως και στον χυλώδη ασκίτη λόγω διαφυγής

λεμφοκυττάρων στο ασκιτικό υγρό. Στον καρδιακό ασκίτη μπορεί να

αυξηθούν τα ερυθρά λόγω διαφυγής τους από την επιφάνεια του

συμφορημένου ήπατος [36].

49


Η μέθοδος αναφοράς για τη μέτρηση των λευκών αιμοσφαιρίων

είναι η μικροσκόπηση σε πλάκα Neubauer και ο προσδιορισμός του

τύπου των κυττάρων με τη χρήση κυτταροφυγόκεντρου. Ωστόσο είναι

κοπιαστική και το αποτέλεσμα εξαρτάται από τον εξεταστή, γι’ αυτό το

λόγο σε πολλά νοσοκομεία αντικαταστάθηκε από τη μέτρηση των

λευκών σε αυτόματα μηχανήματα που στηρίζονται στην κυτταρομετρία

ροής [30] [32]. Η ευαισθησία και η ειδικότητα της μεθόδου αγγίζουν το

100% [37] [38].

Η χρήση των ταινιών λευκοκυτταρικής εστεράσης (strips) που

βασίζεται στη δραστηριότητα της εστεράσης των ουδετερόφιλων

πολυμορφοπυρήνων και αποσκοπεί στην εκτίμηση του αριθμού των

λευκών αιμοσφαιρίων δεν προτείνεται για τη διάγνωση της αυτόματης

βακτηριακής περιτονίτιδας [30] [39].

4.2.2 Λευκωματίνη

Ο υπολογισμός της διαφοράς-κλίσης (gradient) λευκωματίνης

ορού και ασκιτικού υγρού είναι η πιο αξιόπιστη μέθοδος για τον

διαχωρισμό του ασκίτη, σε ασκίτη οφειλόμενο σε πυλαία υπέρταση ή όχι,

όπως εξηγείται αναλυτικά στο δεύτερο κεφάλαιο. Η ειδικότητα της

μεθόδου είναι 97% [30]. Για τον υπολογισμό της διαφοράς αυτής αρκεί η

μέτρηση της τιμής της λευκωματίνης του ορού και της λευκωματίνης του

ασκιτικού υγρού και στη συνέχεια η αφαίρεση της δεύτερης τιμής από

την πρώτη. Αν η διαφορά-κλίση (gradient) λευκωματίνης ορού και

ασκιτικού υγρού είναι μεγαλύτερη ή ίση με 1,1 gr/dl τότε ο ασθενής έχει

πυλαία υπέρταση, ενώ αν η διαφορά-κλίση (gradient) λευκωματίνης ορού

και ασκιτικού υγρού είναι μικρότερη από 1,1 gr/dl τότε ο ασθενής δεν

έχει πυλαία υπέρταση [28]. Τα δείγματα ορού και ασκιτικού υγρού

πρέπει να λαμβάνονται ταυτόχρονα ή με μικρή χρονική απόκλιση. Αν ο

ασθενής είναι αιμοδυναμικά ασταθής και η πίεση στην πυλαία φλέβα

50


μεταβάλλεται, όπως για παράδειγμα σε shock, τότε η διαφορά θα είναι

λιγότερο αξιόπιστη. Οι ασθενείς με μικτό ασκίτη, δηλαδή ασκίτη που

οφείλεται σε πυλαία υπέρταση και ακόμα ένα αίτιο ασκίτη έχουν και

αυτοί διαφορά-κλίση λευκωματίνης μεγαλύτερη από 1,1 gr/dl [36]. Ο

υπολογισμός της παραμέτρου αυτής δε χρειάζεται να επαναλαμβάνεται

σε κάθε εξέταση ασκιτικού υγρού πέραν της πρώτης [2].

4.2.3 Ολικά λευκώματα

Παλαιότερα το ασκιτικό υγρό χαρακτηριζόταν ως εξίδρωμα ή

εξίδρωμα. Σήμερα η διάκριση εξιδρώματος διϊδρώματος έχει

εγκαταλειφθεί, καθώς η συγκέντρωση του λευκώματος στο ασκιτικό

υγρό εξαρτάται από τη συγκέντρωση του ορού και την πίεση στο πυλαίο

σύστημα [29] [36]. Έτσι ένας κιρρωτικός ασθενής με σχετικά υψηλή

συγκέντρωση λευκώματος στον ορό, θα έχει υψηλά επίπεδα και στο

ασκιτικό υγρό χωρίς να έχει καρκίνο ή φυματίωση [40]. Το λεύκωμα δεν

αυξάνει στην περίπτωση της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας,

αντίθετα οι ασθενείς με χαμηλές τιμές έχουν αυξημένη πιθανότητα να

αναπτύξουν αυτήν την επιπλοκή [41] [42]. Συμπερασματικά ο

προσδιορισμός των ολικών πρωτεϊνών εξακολουθεί να παραμένει

χρήσιμος στην εκτίμηση του κινδύνου ανάπτυξης αυτόματης

βακτηριακής περιτονίτιδας (αυξημένος κίνδυνος όταν <1 gr/dl) και στη

διάγνωση της δευτεροπαθούς περιτονίτιδας (>1 gr/dl) [2] [41] [30].

4.2.4 Καλλιέργεια του ασκητικού υγρού

Η ευαισθησία της μεθόδου στην ανίχνευση βακτηριακών

κυττάρων, ιδιαίτερα στην περίπτωση της αυτόματης βακτηριακής

περιτονίτιδας, ποικίλλει ανάλογα με τον τρόπο που αυτή

πραγματοποιείται. Στην περίπτωση που η καλλιέργεια γίνεται με τις

συμβατικές μεθόδους (ενοφθαλμισμός του υλικού στα συνήθη θρεπτικά

51


υλικά), η ευαισθησία είναι 40%, ενώ στην περίπτωση που το υλικό

ενοφθαλμίζεται σε μπουκάλια αιμοκαλλιεργειών αμέσως μετά την

παρακέντηση δίπλα στο κρεβάτι του ασθενούς, τότε η ευαισθησία

ανέρχεται στο 90% [43][44]. Χωρίς εξαίρεση, όλες οι μελέτες

αναδεικνύουν την υπεροχή του ενοφθαλμισμού του υγρού σε φιαλίδια

αιμοκαλλιεργειών. Το πρόβλημα με τις συμβατικές καλλιέργειες είναι ότι

είναι σχεδιασμένες να ανιχνεύουν βακτήρια σε πολυμικροβιακές

λοιμώξεις στις οποίες η συγκέντρωση των βακτηρίων είναι αρκετά

υψηλή. Στην περίπτωση της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας όμως

η συγκέντρωση των βακτηρίων είναι πολύ χαμηλή με μέση τιμή ένα

βακτηριακό κύτταρο ανά ml [44] Τα φιαλίδια των αιμοκαλλιεργειών

είναι σχεδιασμένα να ανιχνεύουν ακόμα και μικρές συγκεντρώσεις

βακτηριακών κυττάρων και είναι ιδανικές για την αυτόματη βακτηριακή

περιτονίτιδα [44]. Ωστόσο δεν είναι όλα τα φιαλίδια αιμοκαλλιεργειών

ίδια. Μερικά επιτρέπουν τον ενοφθαλμισμό μόνο λίγων ml υγρού, άλλα

στην πραγματικότητα εμποδίζουν την ανάπτυξη ορισμένων βακτηρίων.

Ιδανικά συνιστάται η χρησιμοποίηση φιαλιδίων που επιτρέπουν τον

ενοφθαλμισμό 10-20 ml υγρού [44]. Πολύ σημαντικός είναι ο χρόνος που

μεσολαβεί από τη λήψη του ασκιτικού υγρού έως τον ενοφθαλμισμό του

στα φιαλίδια των αιμοκαλλιεργειών, ο οποίος πρέπει να είναι βραχύς.

Ακόμα και μικρή καθυστέρηση λίγων ωρών μειώνει δραματικά την

ευαισθησία της μεθόδου. Αυτό συμβαίνει, γιατί τα φιαλίδια των

αιμοκαλλιεργειών περιέχουν συστατικά και ουσίες, όπως αναστολείς της

φαγοκυττάρωσης, που προστατεύουν τα βακτηριακά κύτταρα από τη

φαγοκυττάρωση και επιτρέπουν την ανάπτυξη ακόμα και των λίγων

βακτηρίων που περιέχονται στο ασκιτικό υγρό των ασθενών με αυτόματη

βακτηριακή περιτονίτιδα [43].

4.2.5 Γλυκόζη

52


Εξαιτίας του μικρού μοριακού της βάρους η γλυκόζη εισέρχεται

εύκολα στο ασκιτικό υγρό. Έτσι η συγκέντρωση της γλυκόζης στοκ ορό

και στο ασκιτικό υγρό είναι παρόμοια. Μείωση της τιμής της

παρατηρείται στην περίπτωση που καταναλώνεται από μικρόβια ή λευκά

αιμοσφαίρια μέσα στην περιτοναϊκή κοιλότητα, δηλαδή σε περίπτωση

βακτηριακής λοίμωξης του υγρού. Σε περίπτωση διάτρησης του εντέρου

η συγκέντρωση της γλυκόζης πέφτει δραματικά (σχεδόν μηδενίζεται)

[45]. Στα αρχικά όμως στάδια της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας

δεν επηρεάζεται [46].

4.2.6 Γ αλακτική αφυδρογονάση (LDH)

Η γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) έχει μεγαλύτερο μοριακό

βάρος από την γλυκόζη και ως εκ τούτου εισέρχεται λιγότερο εύκολα

στην περιτοναϊκή κοιλότητα. Η αναλογία LDH ασκιτικού υγρού προς

LDH ορού σε ασθενείς με ανεπίπλεκτο κιρρωτικό ασκίτη είναι περίπου

0,4. Στην αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα, πιθανώς λόγω

απελευθέρωσης της από τα ουδετερόφιλα, η LDH του ασκιτικού υγρού

αυξάνει έτσι ώστε η αναλογία να είναι 0,9±0,3 [46]. Εάν η αναλογία είναι

πάνω από 1,0 τότε η LDH παράγεται ή απελευθερώνεται στην

περιτοναϊκή κοιλότητα, λόγω λοίμωξης ή όγκου [36].

4.2.7 Αμυλάση

Σε ασθενείς με ανεπίπλεκτο κιρρωτικό ασκίτη η αναλογία

αμυλάσης ασκιτικού υγρού προς αμυλάση ορού είναι περίπου 0,4 [36].

Αύξηση της αμυλάσης παρατηρείται σε παγκρεατικό ασκίτη (μπορεί να

φτάσει τις 4000 IU/L) και σε διάτρηση του λεπτού εντέρου (μικρότερη

αύξηση) [2].

4.2.8 GRAM χρώση

53


Η προσεκτική εξέταση της χρώσης μετά τη φυγοκέντρηση 50 ml

ασκιτικού υγρού είναι θετική μόνο στο 10% των περιπτώσεων της

αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας (ενώ όταν δεν προηγείται

φυγοκέντρηση στο 7%) [44]. Για να ανιχνευτεί μικροοργανισμός στην

χρώση Gram απαιτούνται 10000 βακτηριακά κύτταρα/ml υγρού, ενώ η

μέση συγκέντρωση μικροβίων σε περιπτώσεις αυτόματης βακτηριακής

περιτονίτιδας είναι 1 βακτήριο/ml [44]. Η Gram χρώση είναι

περισσότερο υποβοηθητική σε περιπτώσεις δευτεροπαθούς περιτονίτιδας

από διάτρηση κοίλου σπλάγχνου, καθώς στις περιπτώσεις αυτές η

συγκέντρωση των παθογόνων μικροβίων στο υγρό είναι μεγάλη [2].

4.2.9 Κυτταρολογική εξέταση

Η κυτταρολογική εξέταση του ασκιτικού υγρού είναι θετική στο

58%-75% των σχετιζόμενων με κακοήθεια περιστατικών ασκίτη. Αυτό

εξηγείται από το γεγονός ότι μόνο τα δύο τρίτα των ασθενών με κακοήθη

ασκίτη έχουν καρκινωμάτωση του περιτοναίου και ως εκ τούτου έχουν

βιώσιμα νεοπλασματικά κύτταρα στο περιτοναϊκό υγρό. Το ποσοστό των

ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων είναι σχεδόν μηδενικό. Η

κυτταρομετρία ροής ενδέχεται να ανιχνεύσει τη νόσο, όταν το

αποτέλεσμα της κυτταρολογικής είναι αρνητικό [22][36][47].

Συμπερασματικά η κυτταρολογική εξέταση θα πρέπει να ζητείται όταν

υπάρχει υποψία νεοπλασματικού ασκίτη από το ιστορικό και την κλινική

εξέταση [30].

4.2.10 Τριγλυκερίδια

Εάν το ασκιτικό υγρό είναι γαλακτώδες, θα πρέπει να

προσδιορίζεται η συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων. Στον χυλώδη ασκίτη

η τιμή αυτή είναι πάνω από 200 mg/dl, ενώ μπορεί να υπερβεί και τα

54


1000 mg/dl [10]. Η τιμή των τριγλυκεριδίων σε ασθενείς με κιρρωτικό

ασκίτη είναι περίπου 20 mg/dl [48].

4.2.11 Εξετάσεις για το μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης

Η άμεση χρώση Ziehl-Neelsen στο περιτοναϊκό υγρό έχει πολύ

χαμηλή ευαισθησία (0-2%). Η καλλιέργεια του υγρού για

μυκοβακτηρίδια έχει 50% περίπου ευαισθησία. Η εξέταση θα πρέπει να

πραγματοποιείται μόνο σε ασθενείς με υψηλή υποψία φυματιώδους

περιτονίτιδας (π.χ. πρόσφατη μετανάστευση από περιοχή υψηλής

ενδημικότητας ή σε ασθενείς με AIDS) [32]. Ο προσδιορισμός του

ενζύμου διαμινάση της αδενοσίνης (ADA) έχει 93% ευαισθησία και 96%

ειδικότητα για επίπεδα >30-39 IU/L σε μη κιρρωτικούς ασθενείς [18].

4.2.12 Χολερυθρίνη

Ικτερικής χροιάς δείγματα θα πρέπει να εξετάζονται για

χολερυθρίνη. Τιμή χολερυθρίνης στο ασκιτικό υγρό μεγαλύτερη από την

τιμή στον ορό υποδηλώνει διάτρηση του εντέρου ή των χοληφόρων εντός

της περιτοναϊκής κοιλότητας [36].

4.2.13 Άλλες εξετάσεις

α) pH

Το pH του ασκιτικού υγρού αποτελεί έναν έμμεσο τρόπο

εκτίμησης της παρουσίας ουδετερόφιλων στο υγρό. Θα πρέπει να

σημειωθεί ότι το δείγμα θα πρέπει να αποστέλλεται στο εργαστήριο

αμέσως, σε πάγο και σε φιαλίδιο χωρίς αντιπηκτικό. Η μέτρηση του pH

σπάνια χρησιμεύει σήμερα καθώς η μέτρηση των λευκών αιμοσφαιρίων

είναι απλούστερη και λιγότερο δαπανηρή εξέταση [36].

β) Γ αλακτικό οξύ

55


Το γαλακτικό οξύ χρησιμοποιήθηκε στο παρελθόν για το

διαχωρισμό λοιμώδους και νεοπλασματικού ασκίτη. Ωστόσο ο

μεταβολισμός του σχετίζεται με τις αλλαγές του pH και για τους ίδιους

λόγους δεν αποτελεί χρήσιμη διαγνωστική εξέταση [36].

γ) α1-αντιθρυψίνη, χοληστερόλη, φιμπρονεκτίνη,

γλυκοζαμινογλυκάνες.

Οι εξετάσεις αυτές έχουν προταθεί κατά το παρελθόν ως δείκτες

για την ανίχνευση του ασκίτη του σχετιζόμενου με νεοπλάσματα.

Σήμερα δε χρησιμοποιούνται στην κλινική πράξη [36]

56


ΚΕΦΑΛΑΙΟ 5°ΑΥΤΟΜΑΤΗ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗ ΠΕΡΙΤΟΝΙΤΙΔΑ

Η αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα είναι μια συχνή και σοβαρή

επιπλοκή που αφορά στους ασθενείς με ασκίτη. Ορίστηκε για πρώτη

φορά το 1971 από τον Harold Conn ως η περιτονίτιδα που εμφανίζεται σε

ασθενείς με κίρρωση του ήπατος και συνοδό ασκίτη, στην οποία δεν

ανευρίσκεται ενδοκοιλιακή πηγή λοίμωξης που να απαιτεί χειρουργική

αντιμετώπιση (δευτεροπαθής βακτηριακή περιτονίτιδα) [49].

Όταν πρωτοπεριγράφηκε είχε πολύ μεγάλη θνητότητα (90%), αλλά

στις μέρες μας έχει μειωθεί στο 20% λόγω έγκαιρης διάγνωσης και

θεραπείας [50].

Οι ασθενείς στους οποίους παρατηρείται συνήθως αυτή η επιπλοκή

είναι κιρρωτικοί ασθενείς με ασκίτη πυλαίας υπέρτασης [1]. Σπανιότερα

παρατηρείται σε ασθενείς με ασκίτη άλλης αιτιολογίας, όπως στο

νεφρωσικό σύνδρομο και στον καρδιογενή ασκίτη. Η μεγάλη συχνότητα

της επιπλοκής αυτής στους κιρρωτικούς ασθενείς αποδίδεται στα χαμηλά

επίπεδα λευκώματος στο ασκιτικό υγρό και στη μειωμένη ικανότητα

οψωνινοποίησης [1]. Όλοι οι κιρρωτικοί ασθενείς με ασκίτη μπορεί να

εμφανίσουν αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα. Η συχνότητά της, κατά

την εισαγωγή στο νοσοκομείο, κυμαίνεται μεταξύ 10-30% [51]. Η ετήσια

πιθανότητα εμφάνισης του πρώτου επεισοδίου στους κιρρωτικούς με

ασκίτη είναι 10% περίπου [52]. Περίπου στις μισές περιπτώσεις η

αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα εμφανίζεται κατά τη διάρκεια της

νοσηλείας, ενώ στις υπόλοιπες είναι παρούσα κατά την εισαγωγή στο

νοσοκομείο [53].

5.1 Ορισμνί-Ταξινόμηση

Η αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα χαρακτηρίζεται από αύξησηΛ

του αριθμού των πολυμορφοπυρήνων στο ασκιτικό υγρό >250/mm ,

57


ανεξάρτητα από το αποτέλεσμα της καλλιέργειας του ασκιτικού υγρού

[30] [32]. Η καλλιέργεια του ασκιτικού υγρού παραμένει στείρα σε

μεγάλο ποσοστό των ασθενών με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα,

κυρίως λόγω της χαμηλής συγκέντρωσης βακτηρίων [44].

Με βάση τα ευρήματα της διαγνωστικής παρακέντησης η

αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα ταξινομείται σήμερα στις κατηγορίες

που αναφέρονται στον πίνακα 6 [2].

Πίνακας 6: Ταξινόμηση αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας

Ουδετερόφιλα

πολυμορφοπύρηνα

(κύτταρα/mm3)

Καλλιέργεια

ασκιτικού

υγρού

Ενδοκοιλιακή

πηγή

λοίμωξης

Χορήγηση

κεφαλοσπορίνης

τρίτης γενιάς

«Κλασική» αυτόματη

βακτηριακή

περιτονίτιδα

>250Θετική (συχνά

μονομικροβιακή)Απούσα

Μείωση των

κυττάρων μετά

από 48 ώρες

θεραπείας

Πολυμορφοπυρηνικός

ασκίτης (CNNA)

>250 (συνήθως

>500)Αρνητική Απούσα

Μείωση των


από 48 ώρες

θεραπείας

Μονομικροβιακός μη

ουδετεροφιλικός

βακτηριοασκίτης

<250Θετική (πάντα

μονομικροβιακή)Απούσα

Μείωση των


από 48 ώρες

θεραπείας

Δευτεροπαθής

βακτηριακή

περιτονίτιδα

>250(συχνά

>8000)

Θετική

(πολλαπλά

αερόβια και

αναερόβια

μικρόβια)

Εμφανής (όχι

πάντα)

Συχνά

αμετάβλητος

αριθμός μετά

από 48 ώρες

θεραπείας

Η κλασική αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα χαρακτηρίζεται

από αύξηση του αριθμού των πολυμορφοπύρηνων στο ασκιτικό υγρόΛ

>250/mm και από θετική καλλιέργεια του ασκιτικού υγρού [52]. Στις

58


περισσότερες περιπτώσεις απομονώνεται μόνο ένα είδος μικροβίου. Η

παρουσία περισσοτέρων του ενός εγείρει την υπόνοια δευτεροπαθούς

περιτονίτιδας.

Ο πολυμορφοπυρηνικός ασκίτης (CNNA: culture negative

neutrocytic ascites) είναι μια υποπερίπτωση αυτόματης βακτηριακής

περιτονίτιδας στην οποία η καλλιέργεια του ασκιτικού υγρού είναι στείρα

[54]. Τα κλινικά χαρακτηριστικά του CNNA είναι παρόμοια με αυτά της

κλασικής αυτόματης περιτονίτιδας, και θα πρέπει να αντιμετωπίζεται με

τον ίδιο τρόπο [30].

Στον μονομικροβιακό μη ουδετεροφιλικό ασκίτη η καλλιέργεια

του υγρού είναι θετική (μόνο ένας μικροοργανισμός απομονώνεται),

αλλά ο αριθμός των ουδετεροφίλων είναι μικρότερος από 250/mm3 [1].

Η δευτεροπαθής βακτηριακή περιτονίτιδα χαρακτηρίζεται από

την άνοδο των ουδετερόφιλων πολύ πάνω από 250/mm3 και την

παρουσία ενδοκοιλιακής πηγής λοίμωξης που χρήζει χειρουργικής

αντιμετώπισης. Η καλλιέργεια του ασκιτικού υγρού είναι θετική και

συχνά πολυμικροβιακή. Κατά την εξέταση των βιοχημικών χαρακτήρων

του ασκιτικού υγρού πρέπει να συνυπάρχουν 2 από τα εξής: γλυκόζη

υγρού <50 mg/dl, ολικά λευκώματα >1 gr/dl ή LDH >225 UI/l [1].

Περιγράφεται επίσης και ο πολυμικροβιακός βακτηριοασκίτης

στον οποίο ο αριθμός των ουδετερόφιλων είναι >250/mm3, η καλλιέργεια

του ασκιτικού υγρού είναι θετική και απομονώνονται περισσότεροι του

ενός μικροοργανισμοί, ενώ δεν ανευρίσκεται ενδοκοιλιακή πηγή

λοίμωξης. Σε μερικούς από αυτούς τους ασθενείς ο βακτηριοασκίτης

είναι αποτέλεσμα δευτεροπαθούς αποικισμού του ασκιτικού υγρού από

μικροοργανισμούς που προέρχονται από εξωπεριτοναϊκές πηγές

λοίμωξης (π.χ. πνεύμονες, ουροποιητικό). Οι ασθενείς αυτοί έχουν

συνήθως συμπτώματα. Σε άλλους ασθενείς πρόκειται για πρωτοπαθή

αποικισμό του ασκιτικού υγρού και μπορεί να είναι ασυμπτωματικοί ή να

59


εμφανίζουν συμπτώματα. Στις ασυμπτωματικές μορφές του

βακτηριοασκίτη ο αποικισμός του ασκιτικού υγρού είναι παροδικός

συνήθως, ενώ στους ασθενείς που παρουσιάζουν συμπτώματα ο

βακτηριοασκίτης είναι το πρώτο βήμα προς την ανάπτυξη αυτόματης

βακτηριακής περιτονίτιδας [54].

Επίσης η αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα μπορεί να

χαρακτηριστεί ως «της κοινότητας» αν διαγνωστεί κατά τις πρώτες 3

μέρες από την εισαγωγή σε νοσοκομείο, ή «ενδονοσοκομειακή» αν

διαγνωστεί μετά [1].

5.2 Παράγοντες κινδύνου

Οι κιρρωτικοί ασθενείς με χαμηλά επίπεδα ολικών πρωτεϊνών στο

ασκιτικό υγρό (<1 gr/dl) αποτελούν ομάδα υψηλού κινδύνου για την

ανάπτυξη αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας (10πλάσιος κίνδυνος),

επειδή η οψωνική δραστηριότητα του υγρού βαίνει παράλληλα με τη

συγκέντρωση των ολικών πρωτεϊνών του. Η μειωμένη δε οψωνική

δραστηριότητα (μείωση της βακτηριοκτόνου ικανότητας των

φαγοκυττάρων) έχει σαν αποτέλεσμα την ανάπτυξη λοίμωξης [2][41].

Άλλοι παράγοντες κινδύνου για την ανάπτυξη αυτόματης

βακτηριακής περιτονίτιδας αποτελούν η αιμορραγία του γαστρεντερικού

συστήματος, η συνύπαρξη λοιμώξεων του ουροποιητικού συστήματος, η

σοβαρότητα της ηπατικής νόσου, ιατρογενείς παράγοντες καθώς και το

ιστορικό προηγούμενου επεισοδίου αυτόματης βακτηριακής

περιτονίτιδας [55]. Η σοβαρότητα της ηπατικής νόσου είναι πολύ

σημαντική για την ανάπτυξη αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας

καθώς το 70% των ασθενών που εμφανίζουν αυτήν την επιπλοκή

βρίσκονται σε στάδιο κίρρωσης C κατά Child-Pugh. Επιπλέον τιμές

χολερυθρίνης πάνω από 2,5 mg/dl αποτελούν ανεξάρτητο παράγοντα

κινδύνου για την ανάπτυξη αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας [55].

60


5.3 Παθογένεση

Οι κιρρωτικοί ασθενείς παρουσιάζουν αυξημένη συχνότητα

λοιμώξεων (περίπου 47% στους νοσηλευόμενους ασθενείς) [1], που

οφείλεται κυρίως στην ελαττωμένη ικανότητα του ανοσιακού τους

συστήματος να αντιμετωπίσει τους μικροοργανισμούς. Η μειωμένη

χημειοταξία των λευκών αιμοσφαιρίων, η εξασθενημένη κυτταρική

ανοσία, η μειωμένη δραστικότητα του συμπληρώματος, και η μειωμένη

δραστηριότητα των κυττάρων του δικτυοενδοθηλιακού συστήματος είναι

όλοι παράγοντες που ευνοούν την ανάπτυξη λοιμώξεων [56].

Οι συνήθεις εντοπίσεις των λοιμώξεων αυτών αφορούν στο

ουροποιητικό σύστημα, στους πνεύμονες, στα χειρουργικά τραύματα και

φυσικά στο ασκιτικό υγρό [1].

Ο ακριβής μηχανισμός μόλυνσης του ασκιτικού υγρού στους

κιρρωτικούς ασθενείς δεν είναι γνωστός. Η αιματογενής οδός και η

βακτηριακή διαμετάθεση (bacterial translocation) μικροβίων από το

περιεχόμενο του εντερικού σωλήνα στο ασκιτικό υγρό μέσω των

επιχώριων λεμφαδένων είναι οι δύο πιθανότεροι μηχανισμοί [1].

Συνοδός μικροβιαιμία παρατηρείται στο 50% περίπου των

περιπτώσεων αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας. Αυτό σε συνδυασμό

με την όχι σπάνια απομόνωση από το ασκιτικό υγρό μικροοργανισμών

που δεν ανήκουν στην εντερική χλωρίδα (όπως S trep to co ccu s

p n e u m o n ia e ) καθώς και με την επίσης όχι σπάνια, ανίχνευση

ταυτόχρονης εστίας λοίμωξης σε άλλο σημείο του σώματος (π.χ.

ουροποιητικό), συνηγορούν υπέρ της αιματογενούς διασποράς [1].

Ωστόσο ο πιθανότερος μηχανισμός επιμόλυνσης του ασκιτικού

υγρού στην αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα είναι η βακτηριακή

διαμετάθεση (bacterial translocation) μικροβίων από τον εντερικό

αυλό. Η διαμετάθεση μικροβίων είναι η διαδικασία κατά την οποία

61


μικρόβια και μικροβιακά προϊόντα (ενδοτοξίνες και βακτηριακό DNA)

διαπερνούν το εντερικό τοίχωμα και φθάνουν στους μεσεντέριους

λεμφαδένες και σε άλλα σημεία του σώματος [33]. Το γεγονός αυτό

εξηγεί την ταυτόχρονη παρουσία μικροοργανισμών της εντερικής

χλωρίδας στα μεσεντέρια γάγγλια των ασθενών με αυτόματη βακτηριακή

περιτονίτιδα και πυλαία υπέρταση [52] [57].

Δεν έχει εξηγηθεί πλήρως η αιτία της διαμετάθεσης μικροβίων

στους κιρρωτικούς ασθενείς. Ωστόσο έχουν προταθεί διάφοροι

μηχανισμοί που εμπλέκονται σε αυτήν την διαδικασία. Σε αυτούς

περιλαμβάνονται α) η υπερανάπτυξη μικροβίων εντός του εντερικού

αυλού, β) οι δομικές και λειτουργικές διαταραχές του εντερικού

βλεννογόνου, καθώς και γ) η ελαττωματική λειτουργία του τοπικού

ανοσιακού συστήματος [52] [58].

Στους κιρρωτικούς ασθενείς παρατηρείται υπερανάπτυξη

μικροβίων εντός του εντερικού αυλού [59] [60], εν μέρει λόγω της

στάσης του εντερικού περιεχομένου. Η υπερανάπτυξη της εντερικής

χλωρίδας έχει πολύ μεγάλη σημασία στην παθογένεση της αυτόματης

βακτηριακής περιτονίτιδας. Υπερανάπτυξη αερόβιων GRAM αρνητικών

βακτηρίων παρατηρήθηκε τόσο σε πειραματόζωα με κίρρωση, όσο και σε

κιρρωτικούς ασθενείς [59] και συνδέεται στενά με την ανεύρεση των

μικροβίων αυτών στους μεσεντέριους λεμφαδένες, καθώς και με την

ανάπτυξη αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας [60]. Η χορήγηση

αντιβιοτικών, που στοχεύουν στα αερόβια GRAM αρνητικά μικρόβια,

μειώνει σημαντικά τον κίνδυνο ανάπτυξης αυτόματης βακτηριακής

περιτονίτιδας σε κιρρωτικούς ασθενείς [61], ενώ η χορήγησή τους σε

κιρρωτικά πειραματόζωα αναστέλλει την υπερανάπτυξη της εντερικής

χλωρίδας, τη βακτηριακή διαμετάθεση και τελικά μειώνει την

πιθανότητα εμφάνισης αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας [62]. Η

υπερανάπτυξη μικροβίων στον εντερικό αυλό των κιρρωτικών ασθενών

62


πιθανότατα οφείλεται στον αυξημένο χρόνο διέλευσης του εντερικού

περιεχομένου [52]. Έρευνες έδειξαν ότι η χορήγηση σισαπρίδης και b-

blocker σε πειραματόζωα με κίρρωση αναστέλλει την υπερανάπτυξη

εντερικής χλωρίδας και τη μεταφορά μικροβίων από το έντερο στους

μεσεντέριους λεμφαδένες [63] [64]. Η στάση αυτή του εντερικού

περιεχομένου πιθανώς να οφείλεται στην συμπαθητικοτονία, στην

αυξημένη σύνθεση NO, σε δομικές βλάβες του εντερικού τοιχώματος και

σε οξειδωτικές βλάβες [65].

Στην παθογένεση της διαμετάθεσης και της αυτόματης

βακτηριακής περιτονίτιδας συμμετέχουν και άλλοι παράγοντες εκτός από

την υπερανάπτυξη μικροβίων στον εντερικό αυλό, όπως προκύπτει και

από έρευνες σε πειραματόζωα. Στον εντερικό βλεννογόνο κιρρωτικών

ποντικιών και κιρρωτικών ασθενών παρατηρείται υπεραιμία και οίδημα,

αύξηση των μεσοκυττάριων διαστημάτων [66], αγγειοδιαστολή,

μειωμένη αναλογία λαχνών/κρυπτών, μείωση του πάχους της μυϊκής

στοιβάδας του βλεννογόνου και στοιχεία φλεγμονής [67]. Αυτές οι

αλλαγές στη δομή του εντερικού τοιχώματος, που είναι πιθανότατα

αποτέλεσμα της πυλαίας υπέρτασης, έχουν ως συνέπεια την αυξημένη

διαπερατότητα του εντερικού τοιχώματος στα μικρόβια του εντερικού

σωλήνα. Αυξημένη διαπερατότητα έχει παρατηρηθεί σε κιρρωτικά

πειραματόζωα, καθώς και σε κιρρωτικούς ασθενείς, ιδίως εκείνους με

σοβαρή ηπατική ανεπάρκεια ή βακτηριακή λοίμωξη [68]. Οξειδωτικές

βλάβες στον εντερικό βλεννογόνο (πιθανώς λόγω της πυλαίας υπέρτασης

και της τοπικής ανοξίας) έχουν σχετιστεί με αυξημένη διαπερατότητα του

εντερικού τοιχώματος που υποβοηθά στη διαμετάθεση μικροβίων [69].

Έρευνες δείχνουν ότι η χορήγηση αντιοξειδωτικών παραγόντων

προλαμβάνει τη βλάβη του εντερικού τοιχώματος και τη βακτηριακή

διαμετάθεση τόσο σε κιρρωτικά πειραματόζωα, όσο και σε κιρρωτικούς

ασθενείς με ασκίτη [70]. Στους κιρρωτικούς ασθενείς παρατηρείται

63


μειωμένη συγκέντρωση χολικών αλάτων στον εντερικό αυλό, λόγω της

μειωμένης έκκρισής τους και της αυξημένης αποσύζευξης τους υπό την

επίδραση της εντερικής χλωρίδας [33]. Τα χολικά άλατα συμμετέχουν

στην αμυντική λειτουργία του εντερικού βλεννογόνου αδρανοποιώντας

τις βακτηριακές ενδοτοξίνες και μη επιτρέποντας την υπερανάπτυξη της

εντερικής χλωρίδας. Έτσι η ελάττωσή τους διευκολύνει τη βακτηριακή

διαμετάθεση [33]. Στους κιρρωτικούς ασθενείς εξαιτίας

πυλαιοσυστηματικών αναστομώσεων (λόγω της πυλαίας υπέρτασης) τα

κυκλοφορούντα βακτήρια δεν έρχονται σε επαφή με τα κύτταρα Kupffer.

Τα κύτταρα αυτά εδράζονται στα κολποειδή και συμμετέχουν στη

φαγοκυττάρωση των μικροβίων και την καταστροφή τους. Έτσι στους

ασθενείς με κίρρωση, η διαμετάθεση μικροβίων από το έντερο έχει ως

αποτέλεσμα την κυκλοφορία των μικροβίων στο αίμα και την

επιμόλυνση του ασκιτικού υγρού [67].

Η ανάπτυξη αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας, δηλαδή

λοίμωξης μετά τη μόλυνση του ασκιτικού υγρού, εξαρτάται και από την

οψωνική δραστηριότητα του ασκιτικού υγρού [1]. Η οψωνική

δραστηριότητα του ασκιτικού υγρού εκφράζεται ως ο λογάριθμος των

θανάτων κυττάρων του μικροβίου E sch er ich ia co li σε 60 λεπτά. Η

οψωνική δραστηριότητα του ασκιτικού υγρού είναι ελαττωμένη σε

ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα σε σχέση με αυτούς που

έχουν στείρες καλλιέργειες ασκιτικού υγρού. Σε μελέτη με 55 ασθενείς

που είχαν αρχικά στείρο ασκιτικό υγρό και ελαττωμένη οψωνική

δραστηριότητα ασκιτικού υγρού, οι 8 ανέπτυξαν αυτόματη βακτηριακή

περιτονίτιδα κατά τη διάρκεια της νοσηλείας τους, ενώ κανένας από τους

70 ασθενείς που είχαν στείρες καλλιέργειες ασκιτικού υγρού και

φυσιολογική οψωνική δραστηριότητα δεν ανέπτυξε αυτόματη

βακτηριακή περιτονίτιδα [71]. Η οψωνική δραστηριότητα του ασκιτικού

υγρού μπορεί να εκτιμηθεί αδρά από τα ολικά λευκώματα του ασκιτικού

64


υγρού [72]. Λεύκωμα <1 gr/dl σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο

ανάπτυξης αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας [41].

5.4 Κλινική εικόνα αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας

Οι ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα μπορεί να

εμφανίζουν ένα από τα παρακάτω: α) συμπτώματα και σημεία

περιτονίτιδας, δηλαδή κοιλιακό άλγος, έμετο, διάρροια, ειλεό,

ευαισθησία κατά την ψηλάφηση, β) συμπτώματα και σημεία

συστηματικής λοίμωξης, όπως πυρετό ή υποθερμία, φρίκια, ταχυκαρδία,

ταχύπνοια, λευκοκυττάρωση, γ) επιδείνωση της ηπατικής λειτουργίας, δ)

ηπατική εγκεφαλοπάθεια, ε) shock, στ) νεφρική ανεπάρκεια και ζ)

αιμορραγία του γαστρεντερικού [54].

Ωστόσο είναι σημαντικό να τονιστεί ότι η αυτόματη βακτηριακή

περιτονίτιδα μπορεί να είναι ασυμπτωματική, ιδίως στους εξωτερικούς

ασθενείς [73]. Συνοπτικά στον πίνακα 7 παρουσιάζονται τα συνήθη

συμπτώματα και σημεία των ασθενών με αυτόματη βακτηριακή

περιτονίτιδα .

Πίνακας 7: Συμπτώματα και σημεία αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας

Συμπτώματα - Σημεία Ποσοστό εμφάνισης (%)

Πυρετός 69

Κοιλιακό άλγος 59

Επιδείνωση του επιπέδου συνείδησης 54

Κοιλιακή ευαισθησία 49

Διάρροια 32

Παραλυτικός ειλεός 30

Υπόταση 21

Υποθερμία 17

5.5 Ανάλυση του ασκιτικού υγρού σε ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα

65


Η διάγνωση της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας βασίζεται

στην εργαστηριακή ανάλυση του ασκιτικού υγρού. Παρακέντηση του

ασκιτικού υγρού επιβάλλεται να γίνεται σε όλες τις καταστάσεις που

αναφέρονται στον πίνακα 8 , όπως έχει ήδη αναφερθεί στο κεφάλαιο 4.

Πίνακας 8: Ενδείξεις παρακέντησης ασκίτη

Πρωτοεμφανιζόμενος ασκίτης

Κατά την εισαγωγή κιρρωτικού με ασκίτη στο νοσοκομείο

Ασθενής με ασκίτη και:

• Αιμορραγία του γαστρεντερικού (παράγοντας κινδύνου)

• Shock

• Πυρετός

• Σημεία συστηματικής φλεγμονώδους αντίδρασης

• Επιδείνωση της νεφρικής λειτουργίας

• Σημεία ηπατικής εγκεφαλοπάθειας

Οι χρησιμότερες εξετάσεις κατά την ανάλυση του ασκιτικού υγρού

είναι ο αριθμός και ο τύπος των λευκών αιμοσφαιρίων, τα λευκώματα, η

LDH, η γλυκόζη και η καλλιέργεια [1]. Η όψη του ασκιτικού υγρού

ποικίλλει από διαυγής έως θολή. Η γλυκόζη μπορεί να είναι μειωμένη, η

LDH αυξημένη, ενώ ο προσδιορισμός της συγκέντρωση της

λευκωματίνης του ασκιτικού υγρού μας επιτρέπει τον υπολογισμό της

διαφοράς-κλίσης (gradient) της λευκωματίνης ορού-ασκιτικού υγρού. Η

χρώση Gram αποκαλύπτει μικροοργανισμό μόλις στο 10-20% των

66


περιπτώσεων αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας, λόγω της χαμηλής

συγκέντρωσης μικροοργανισμών στο υγρό (1 βακτήριο ανά ml) [44].

Η σημαντικότερη εξέταση ωστόσο είναι η αρίθμηση και ο τύπος

των λευκών αιμοσφαιρίων του ασκιτικού υγρού, στην οποία στηρίζεται

και η ταξινόμηση των μορφών της κλινικής αυτής οντότητας. Ο

απόλυτος αριθμός ουδετερόφιλων πολυμορφοπύρηνων στην αυτόματηΛ

βακτηριακή περιτονίτιδα είναι > 250/mm . Η ευαισθησία της εξέτασης

είναι 84% και η ειδικότητα 93% [1].

Όσον αφορά στην καλλιέργεια, το ασκιτικό υγρό θα πρέπει να

ενοφθαλμίζεται σε μπουκάλια αιμοκαλλιεργειών δίπλα στην κλίνη του

ασθενούς, καθώς αυτή η τεχνική καλλιέργειας υπερτερεί σημαντικά των

συμβατικών μεθόδων (παράγραφος 4.2.3).

Σε παλαιότερες μελέτες οι κύριοι μικροοργανισμοί που

απομονώνονταν στο ασκιτικό υγρό ήταν μέλη της οικογένειας των

εντεροβακτηριακών [74]. Ωστόσο τα τελευταία χρόνια έχουν περιγραφεί

αλλαγές στους μικροοργανισμούς που προκαλούν αυτόματη βακτηριακή

περιτονίτιδα, καθώς και ανάδυση μικροοργανισμών με αντοχή σε πολλά

αντιμικροβιακά φάρμακα [75]. Πολλές μελέτες περιγράφουν αλλαγή

στην επιδημιολογία των μικροοργανισμών. Οι εντερόκοκκοι

αναγνωρίζονται πλέον ως σημαντικός αιτιολογικός παράγοντας της

αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας. Σε έρευνα αναφέρεται αύξηση

του ποσοστού απομόνωσης εντεροκόκκων σε τριτοβάθμιο νοσοσκομείο

της Γερμανίας από 11% σε 35% μέσα σε μια δεκαετία [76]. Σε 4

νοσοκομεία της Γαλλίας εντερόκοκκοι απομονώθηκαν στο 24% των

περιπτώσεων, και στο 48% των ασθενών που λάμβαναν κινολόνες ως

προφύλαξη [77]. Η ανάδυση και διασπορά στελεχών S ta p h y lo co ccu s

a u reu s methicillin resistant (MRSA), εντεροβακτηριακών με ευρέος

φάσματος β-λακταμάσες (ESBL), καθώς και στελεχών K leb s ie lla

p n e u m o n ia e που παράγουν καρβαπενεμάσες (KPC) έχει περιγραφεί τα

67


τελευταία χρόνια [78] [79] και προκαλεί ανησυχία, καθώς σχετίζεται με

αυξημένη θνητότητα [80].

68


ΚΕΦΑΛΑΙΟ 6°ΟΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΩΣ ΕΡΓΑΛΕΙΟ ΓΙΑ ΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΗΣ ΑΥΤΟΜΑΤΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗΣ ΠΕΡΙΤΟΝΙΤΙΔΑΣ

Η αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα είναι μια πολύ σοβαρή και

δυνητικά θανατηφόρος επιπλοκή, που αφορά στους κιρρωτικούς κυρίως

ασθενείς με ασκίτη. Η ταχεία διάγνωσή της και η ταυτοποίηση του

παθογόνου μικροοργανισμού είναι πολύ σημαντική για την πρόγνωση

των ασθενών αυτών. Σήμερα η διάγνωσή της βασίζεται στην αύξηση του

απόλυτου αριθμού των πολυμορφοπυρήνων στο ασκιτικό υγρό και στην

απομόνωση του υπεύθυνου μικροοργανισμού με τον ενοφθαλμισμό του

ασκιτικού υγρού σε φιαλίδια αιμοκαλλιεργειών. Ωστόσο οι

αιμοκαλλιέργειες απαιτούν αρκετές μέρες (έως 5), για να δώσουν θετικό

σήμα. Στο σημείο αυτό πολλά αναμένεται να προσφέρει στο μέλλον η

εφαρμογή των μοριακών τεχνικών. Εκτενής αναφορά σε αυτές τις

τεχνικές, καθώς και στις εφαρμογές τους στη διάγνωση διάφορων

κλινικών οντοτήτων (συμπεριλαμβανομένης και της αυτόματης

βακτηριακής περιτονίτιδας) γίνεται στο δεύτερο μέρος της παρούσας

εργασίας.

69


ΚΕΦΑΛΑΙΟ 7°ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΑΣΚΙΤΗ ΚΑΙ ΑΥΤΟΜΑΤΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗΣ ΠΕΡΙΤΟΝΙΤΙΔΑΣ

7.1 Θεραπεία ασκίτη

Η θεραπεία του ασκίτη εξαρτάται από την υποκείμενη αιτία του.

Σε ασθενείς με χαμηλή διαφορά-κλίση λευκωματίνης (ασκίτης μη

πυλαίας υπέρτασης) δε βοηθά η στέρηση Na και ύδατος. Ακρογωνιαίος

λίθος στην αντιμετώπιση του καρκινωματώδους ασκίτη είναι οι

επαναλαμβανόμενες παρακεντήσεις. Σε φυματιώδη περιτονίτιδα

χορηγείται αντιφυματική αγωγή. Ειδική αντιβιοτική αγωγή απαιτεί και ο

ασκίτης που οφείλεται σε βρουκέλλα ή χλαμύδια. Ο παγκρεατικός

ασκίτης μπορεί να θεραπευθεί αυτόματα, μετά τη χορήγηση

σωματοστατίνης ή μετά από τοποθέτηση ενδοσκοπικών προθέσεων

(stents). Ο ασκίτης του Οικογενούς Μεσογειακού Πυρετού

ανταποκρίνεται συνήθως σε κορτικοστεροειδή και κολχικίνη. Ο

νεφρογενής ασκίτης μπορεί να απαιτήσει πιο επιθετική αιμοδιΰλιση ή

μεταμόσχευση νεφρού. Σε ασκίτη οφειλόμενο σε Συστηματικό

Ερυθηματώδη Λύκο χορηγούνται κορτικοστεροειδή ή

ανοσοτροποποιητικά φάρμακα.

Ο ασκίτης του κιρρωτικού ασθενούς, δηλαδή ο ασκίτης με υψηλή

διαφορά-κλίση λευκωματίνης (ασκίτης πυλαίας υπέρτασης)

αντιμετωπίζεται με μια σειρά θεραπευτικών ενεργειών. Συνοπτικά

αναφέρονται: α) περιορισμός της ημερήσιας πρόσληψης Na σε 80-120

mmol/day, που αντιστοιχούν σε 4,6-6,9 gr άλατος, β) χορήγηση

σπειρονολακτόνης ή/και φουροσεμίδης και γ) ενδοφλέβια χορήγηση

ανθρώπινης λευκωματίνης, σε ασθενείς με μυικές κράμπες [30].

7.2 Θεραπεία αυτόματης βακτηριακής περιτννίτιδας

70


Εμπειρική αντιβιοτική θεραπεία θα πρέπει να τίθεται αμέσως μετά

τη διάγνωση της κλινικής αυτής οντότητας. Το αντιβιοτικό που έχει

χρησιμοποιηθεί ευρέος στη θεραπεία της αυτόματης βακτηριακής

περιτονίτιδας από τη δεκαετία του 1990 είναι η κεφοταξίμη, λόγω των

υψηλών συγκεντρώσεων που επιτυγχάνονται στο ασκιτικό υγρό κατά τη

διάρκεια της θεραπείας, και επειδή το μικροβιακό της φάσμα

περιελάμβανε τους συνηθέστερους μικροοργανισμούς που ευθύνονταν

για αυτήν την επιπλοκή του ασκίτη. Στην πρώτη τυχαιοποιημένη

συγκριτική μελέτη [81] η κεφοταξίμη βρέθηκε να είναι το αντιβιοτικό με

το καλύτερο θεραπευτικό αποτέλεσμα. Άλλες μελέτες [82] απέδειξαν ότι

η διάρκεια της θεραπείας μπορεί να περιοριστεί στις 5 ημέρες. Η

συνιστώμενη δόση του αντιβιοτικού αυτού είναι 2 gr/8h ή 2 gr/12h [83].

Η χορήγηση πιπερακιλλίνης-ταζομπακτάμης έχει θέση στην αρχική

εμπειρική θεραπεία. Η χορήγηση σιπροφλοξασίνης ενδοφλεβίως για 7

μέρες έχει παρόμοια αποτελέσματα με την κεφοταξίμη, αλλά υψηλότερο

κόστος [84]. Ωστόσο η εξάπλωση στο νοσοκομειακό περιβάλλον

πολυανθεκτικών μικροοργανισμών τις τελευταίες δεκαετίες, οδήγησε και

στην ανάγκη προσαρμογής των οδηγιών για την εμπειρική θεραπεία της

αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας [80] [85]. Έτσι στην περίπτωση

νοσοκομειακής (ή σχετιζόμενης με ιδρύματα παροχής ιατρικής

φροντίδας) αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας προτείνεται η

χορήγηση μεροπενέμης, μόνη της ή σε συνδυασμό με γλυκοπεπτίδιο ή

δαπτομυκίνη [80] [85].

Επίσης σε ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα

προτείνεται η χορήγηση λευκωματίνης (1.5 gr/kg κατά τη διάγνωση και 1

gr/kg την τρίτη μέρα).

71


ΚΕΦΑΛΑΙΟ 8°

ΠΡΟΦΥΛΑΞΗ ΕΝΑΝΤΙ ΤΗΣ ΑΥΤΟΜΑΤΗΣ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΗΣ ΠΕΡΙΤΟΝΙΤΙΔΑΣ

Εφόσον τα περισσότερα επεισόδια αυτόματης βακτηριακής

περιτονίτιδας θεωρείται ότι οφείλονται σε διαμετάθεση (translocation)

των Gram αρνητικών βακτηρίων του εντερικού σωλήνα, η ιδανική

προφυλακτική αγωγή θα πρέπει να είναι δραστική έναντι αυτών των

μικροοργανισμών και να μη διαταρράσει τα αναερόβια της εντερικής

χλωρίδας [85]. Προφυλακτική αντιβιοτική αγωγή δίνεται σε ασθενείς με

υψηλό κίνδυνο για ανάπτυξη αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας [85]

και συγκεκριμένα: α) σε ασθενείς με οξεία αιμορραγία του

γαστρεντερικού σωλήνα, β) σε ασθενείς με χαμηλό λεύκωμα στο

ασκιτικό υγρό και χωρίς προηγούμενο επεισόδιο αυτόματης βακτηριακής

περιτονίτιδας (πρωτογενής προφύλαξη) και γ) σε ασθενείς με ιστορικό

αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας (δευτερογενής προφύλαξη) [86].

Συμπερασματικά η προφυλακτική αγωγή έναντι της αυτόματης

βακτηριακής περιτονίτιδας διέπεται από τις εξής αρχές:

Πρωτογενής προφύλαξη με νορφλοξασίνη (400 mg/day)

συστήνεται σε ασθενείς με ολικά λευκώματα στο ασκιτικό υγρό <1,5

g/dL, σε συνδυασμό με επηρεασμένη νεφρική λειτουργία (κρεατινίνη

>1,2 mg/dL ή υπονατριαιμία <130 mmol/L) ή ηπατική ανεπάρκεια

(Child-Pugh score >9 και χολερυθρίνη ορού >3 mg/dl).

Δευτερογενής προφύλαξη με νορφλοξασίνη (400 mg/day)

συστήνεται σε όλους τους ασθενείς με ιστορικό ενός επεισοδίου

αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας.

Σε τυχαιοποιημένη, διπλά τυφλή κλινική έρευνα η χορήγηση

νορφλοξασίνης μείωσε τον κίνδυνο ανάπτυξης αυτόματης βακτηριακής

72


περιτονίτιδας σε 20% από 68% [61]. Η διαλείπουσα χορήγηση

σιπροφλοξασίνης θα πρέπει να αποφεύγεται, γιατί φαίνεται να οδηγεί σε

επικράτηση στελεχών ανθεκτικών στις κινολόνες [61] [87]. Η χορήγηση

ριφαξιμίνης δεν μπορεί προς το παρόν να προταθεί για τη δευτερογενή

προφύλαξη έναντι της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας. Οι

ασθενείς που επιβιώνουν από ένα επεισόδιο αυτόματης βακτηριακής

περιτονίτιδας έχουν μικρό προσδόκιμο και θα πρέπει να θεωρούνται

υποψήφιοι για μεταμόσχευση ήπατος [30].

73


ΜΕΡΟΣ ΔΕΥΤΕΡΟ

74


ΚΕΦΑΛΑΙΟ 1°ΑΡΧΕΣ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΜΕΘΟΔΩΝ

1.1 ΕισαγωγήΟ ρόλος του μικροβιολογικού εργαστηρίου στην καθημερινή

πράξη εστιάζεται στη γρήγορη και αξιόπιστη διάγνωση του αιτιολογικού

παράγοντα της λοίμωξης, με στόχο την ορθολογική διαχείριση των

βακτηριακών λοιμώξεων. Αυτό απαιτεί γρήγορη και αξιόπιστη

ταυτοποίηση του αιτιολογικού παράγοντα, που ακολουθείται από έλεγχο

ευαισθησίας έναντι διάφορων αντιβιοτικών. Αυτές οι διαδικασίες

βοηθούν στην κατάλληλη θεραπευτική προσέγγιση της λοίμωξης, ενώ

αποφεύγεται η άσκοπη χρήση αντιμικροβιακών φαρμάκων [88]. Τα

μικροβιολογικά εργαστήρια έχουν αναπτύξει ποικίλες τεχνικές για την

ανίχνευση παθογόνων βακτηρίων στα κλινικά δείγματα. Οι συνηθέστερες

είναι η μικροσκόπηση και η καλλιέργεια του δείγματος [89]. Αν και η

GRAM χρώση συμβάλλει σημαντικά στην αρχική προσέγγιση,

χαρακτηρίζεται από χαμηλή ευαισθησία, ακόμα και όταν ο αριθμός των

βακτηριακών κυττάρων στο δείγμα είναι αρκετά μεγάλος. Επιπλέον, η

ανίχνευση του αιτιολογικού παράγοντα με τις συμβατικές μεθόδους

απαιτεί επώαση 2 τουλάχιστον ημερών. Επιπρόσθετα, δεν είναι σπάνιες

οι περιπτώσεις μικροβίων που είτε απομονώνονται δύσκολα με τις

παραδοσιακές μεθόδους (π.χ. χλαμύδια), είτε απαιτούν μακρά περίοδο

επώασης, όπως M yc o b a c te r iu m sp ., C a rd io b a c teriu m spp . [89] [90] [91].

Σε αυτό το πλαίσιο χρησιμοποιήθηκαν οι ορολογικές δοκιμασίες

προκειμένου να καλυφθεί το διαγνωστικό κενό που αφήνουν οι κλασικές

τεχνικές. Στις περισσότερες περιπτώσεις όμως απαιτούνται 2 δείγματα

αίματος με μεσοδιάστημα 15 ημερών, ενώ σε ασθενείς με

ανοσοανεπάρκεια δεν ανιχνεύονται αντισώματα.

75


Οι παραπάνω περιορισμοί έχουν οδηγήσει τα τελευταία 20-25

χρόνια στην ανάπτυξη εξελιγμένων τεχνικών, που βασίζονται στη

μοριακή βιολογία και έχουν εισαγάγει νέα δεδομένα στη διάγνωση των

βακτηριακών λοιμώξεων [92] [93]. Οι μέθοδοι μοριακής βιολογίας

συνεισφέρουν σημαντικά στην άμεση ανίχνευση παθογόνων

μικροοργανισμών σε κλινικά δείγματα (αίμα, ούρα, πύο, πτύελα,

ασκιτικό υγρό κτλ), καθώς είναι γρήγορες και περισσότερο αξιόπιστες

όσον αφορά στην ταυτοποίηση του μικροβίου σε σχέση με τις κλασικές

τεχνικές. Οι μοριακές τεχνικές έχουν ευρύ πεδίο κλινικών εφαρμογών,

όπως η ειδική ή η ευρέος φάσματος ανίχνευση παθογόνων, η ανίχνευση

γονιδίων παθογονικότητας, ο χαρακτηρισμός γονιδίων αντοχής κλπ.

Επιπλέον είναι πολύ σημαντικές για τη διάγνωση λοιμωδών ασθενειών,

όταν λόγω ειδικών συνθηκών τα μικρόβια είναι δύσκολο να αναπτυχθούν

στην καλλιέργεια (π.χ. ασθενείς που έχουν λάβει αντιμικροβιακή

θεραπεία κλπ).

1.2 Αρχές των μοριακών μεθόδων

Στην αρχή της δεκαετίας του '80 αναπτύχθηκε μια απλή διεργασία

πολλαπλασιασμού, δηλαδή αύξησης του αριθμού των θραυσμάτων των

νουκλεϊκών οξέων, που περιέχονται σε ένα δείγμα [94]. Έτσι μετά από

μεγάλες έρευνες ο Saiki [95] ανέφερε την πρώτη πρακτική εφαρμογή

ενζυματικού πολλαπλασιασμού νουκλεϊκών οξέων. Το 1989 η διεργασία

αυτή θεωρήθηκε «η σημαντικότερη επιστημονική εξέλιξη της χρονιάς»

[96]. Η εν λόγω διεργασία ονομάζεται αλυσιδωτή αντίδραση της

θερμοανθεκτικής πολυμεράσης (PCR). Μέσα σε λίγα χρόνια και μετά

από ορισμένες βελτιώσεις, η PCR εξελίχθηκε στην πιο συχνά

χρησιμοποιούμενη μέθοδο πολλαπλασιασμού των νουκλεϊκών οξέων,

ιδιαίτερα του DNA.

76


Οι μοριακές τεχνικές βασίζονται στο γεγονός ότι κάθε οργανισμός

περιέχει ορισμένο και μοναδικό γενετικό υλικό, ειδικό του είδους του.

Με τη χρήση των μοριακών τεχνικών το γενετικό αυτό υλικό καθίσταται

ορατό.

Οι μοριακές τεχνικές διακρίνονται: α) στις μη πολλαπλασιαστικές

(υβριδισμός) και β) στις πολλαπλασιαστικές (PCR).

Κατά τις πολλαπλασιαστικές μεθόδους μια ειδική αλληλουχία

DNA ενός ιού ή κυττάρου μπορεί από ένα μόνο αντίγραφο να

πολλαπλασιαστεί μέσα σε λίγη ώρα σε ανιχνεύσιμα επίπεδα. Αυτή η

τεχνική μπορεί να εφαρμοστεί και για τον πολλαπλασιασμό RNA μετά

από την παραγωγή cDNA με μια ανάστροφη τρανσκριπτάση (reverse

transcriptase) [97].

1.3 Βασικές αρχές της PCR1.3.1 Η αρχή της μεθόδου

Η PCR είναι μια εργαστηριακά ελεγχόμενη, in v itro , αντίδραση

πολυμερισμού του DNA, η οποία μιμείται ως ένα βαθμό τη φυσική

διαδικασία πολυμερισμού του DNA. Συγκεκριμένα καταλύεται από μια

DNA-εξαρτώμενη DNA πολυμεράση, η οποία βάσει ενός δίκλωνου,

τοπικά αποελικωμένου τεμαχίου DNA (template), και παρουσία ενός

ζεύγους καταλλήλων εκκινητών, των τεσσάρων dNTPs, και ιόντων Mg++

συνθέτει in v itro , έναν τεράστιο αριθμό νέων μορίων DNA, ως προς

εκείνο το τμήμα του αρχικού εκμαγείου, το οποίο αφορίζεται από τους

εκκινητές [98].

Η in v itro αντίδραση εκμεταλλεύεται την in v ivo δράση του

ενζύμου DNA πολυμεράση, που αποτελεί το ένζυμο αντιγραφής του

DNA σε κάθε κύτταρο κατά τη διαίρεσή του. Ειδικότερα, στο

διαιρούμενο κύτταρο, μετά την αποδιάταξη του δίκλωνου DNA, το

ένζυμο πολυμεράση «διαβάζει» τον ένα κλώνο (μονόκλωνο DNA) και

77


έχοντάς τον ως πρότυπο-μήτρα (template), συνθέτει συμπληρωματική

άλυσο DNA με κατεύθυνση από το 5' προς το 3' άκρο, παρουσία

τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων (dNTPs). Στην αντίδραση PCR

γίνεται η ίδια ενζυματική διεργασία από το ένζυμο πολυμεράση in v itro

[98] . Κατά την PCR χρησιμοποιείται μια θερμοανθεκτική πολυμεράση

για την παραγωγή πολλαπλών αντιγράφων ειδικών τμημάτων του DNA

μέσα σε ένα δείγμα στο οποίο περιέχονται περισσότερα μόρια DNA

άσχετα από το DNA στόχο.

1.3.2 Η διαδικασία της αντίδρασης

Για την πραγματοποίηση της αντίδρασης απαιτούνται το ένζυμο

DNA πολυμεράση, το DNA στόχος που θα πολλαπλασιαστεί,

τριφωσφορικά δεοξυριβονουκλεοτίδια (dDNTPs) για τη σύνθεση των

συμπληρωματικών αλύσων του DNA, ένα ζευγάρι αλληλουχιών DNA

μεγέθους 15-25 bp, συμπληρωματικών ως προς την αρχή και το τέλος

του DNA στόχου που θα πολλαπλασιαστεί και τέλος ένα ρυθμιστικό

διάλυμα ιόντων Mg++.

Η αντίδραση έχει τρία στάδια, το στάδιο της αποδιάταξης του

δίκλωνου DNA (denaturation), το στάδιο του υβριδισμού των

εναρκτήριων αλληλουχιών (annealing) και το στάδιο επέκτασης και

σύνθεσης της συμπληρωματικής αλυσίδας (extension). Τα τρία αυτά

στάδια αποτελούν ένα πλήρη κύκλο και κάθε αντίδραση PCR

αποτελείται από 25-40 παρόμοιους κύκλους. Η διαδικασία της συνεχούς

επανάληψης των τριών σταδίων ήταν αυτή που έδωσε στην αντίδραση το

όνομά της. Η όλη διαδικασία διαρκεί περίπου 3-4 ώρες, λαμβάνει μέρος

στο ίδιο αρχικό μείγμα αντιδραστηρίων, χωρίς προσθήκες, και στο τέλος

παράγεται η συγκεκριμένη περιοχή του DNA σε αριθμό αντιγράφων

μεγαλύτερο από 106 [98].

78


Το πρώτο στάδιο, δηλαδή το στάδιο της αποδιάταξης του

δίκλωνου DNA (εικόνα 2) πραγματοποιείται όταν αυξηθεί η

θερμοκρασία στο διάλυμα της αντίδρασης στους 93-950C. Στη

θερμοκρασία αυτή το δίκλωνο DNA διαχωρίζεται στους δύο

συμπληρωματικούς κλώνους. Στη συνέχεια, μετά την ελάττωση της

θερμοκρασίας στους 45-650C (στάδιο υβριδισμού) πραγματοποιείται ο

υβριδισμός, δηλαδή η ένωση των εναρκτήριων αλληλουχιών στις

συμπληρωματικές θέσεις των κλώνων του DNA. Η θερμοκρασία

υβριδισμού είναι ειδική κάθε ζεύγους των εναρκτήριων αλληλουχιών και

εξαρτάται από το μέγεθος και τη σύνθεση των αλληλουχιών. Τέλος, μετά

την εκ νέου αύξηση της θερμοκρασίας στους 720C (στάδιο της επέκτασης

του DNA), το ένζυμο DNA πολυμεράση χρησιμοποιώντας ως πρότυπο-

μήτρα το ήδη υπάρχον DNA συνθέτει τη συμπληρωματική αλυσίδα

προσθέτοντας δεοξυριβονουκλεοτίδια από το διάλυμα της αντίδρασης

στο 3'άκρο της.

Στο τέλος του πρώτου κύκλου της αντίδρασης οι κλώνοι του

στόχου DNA είναι τέσσερις (δύο αρχικοί, δύο νέοι) και αποτελούν τα

πρότυπα για τη σύνθεση καινούριου DNA στο δεύτερο κύκλο. Στο τέλος

του δεύτερου κύκλου οι κλώνοι είναι οκτώ. Με επαναλαμβανόμενους

κύκλους αυξάνει εκθετικά (8, 16, 32, 64 κτλ) ο αριθμός των ανατύπων

του στόχου DNA, διότι οι κλώνοι που σχηματίζονται χρησιμοποιούνται

ως πρότυπο στον επόμενο κύκλο. Έτσι επιτυγχάνεται μεγέθυνση 2n,

(όπου n είναι ο αριθμός των κλώνων) με την αντίδραση PCR [98].

Το κύριο προϊόν της αντίδρασης PCR είναι το τμήμα του δίκλωνου

DNA που περιλαμβάνεται μεταξύ των εκκινητών ολιγονουκλεοτιδίων.

Τα άκρα του καθορίζονται από το 5'άκρο των εκκινητών και το μέγεθος

του είναι ίσο με το άθροισμα των βάσεων των εκκινητών και της

παρεμβαλλόμενης αλληλουχίας του DNA στόχου.

79


Οι κυκλικές εναλλαγές της θερμοκρασίας στην αντίδραση PCR

πραγματοποιούνται με αυτοματοποιημένες συσκευές, εμπορικά

διαθέσιμες, που ονομάζονται θερμοκυκλοποιητές (thermo-cyclers) [98].

Εικόνα 2: Σχηματική αναπαράσταση ενός τυπικού πρωτοκόλλου PCR

1.3.3 Ευρέος φάσματος 16S rRNA PCR

Η χρήση οικουμενικών εναρκτήριων αλληλουχιών αποτελεί

παραλλαγή της αντίδρασης και ονομάζεται ευρέος φάσματος (broad-

range) PCR. Οι οικουμενικές εναρκτήριες αλληλουχίες έχουν σχεδιασθεί

να υβριδίζουν σε συντηρημένες θέσεις του υπό ανίχνευση γονιδίου, όταν

αυτό ανευρίσκεται σε περισσότερα του ενός βακτηριακά είδη. Ένα τέτοιο

γονίδιο είναι αυτό του 1 6 S rD N A , το οποίο απαντάται σε όλα τα

βακτηριακά είδη με ομοιότητα που αγγίζει το 90-95%. Έτσι λοιπόν,

σχεδιάζοντας εναρκτήριες αλληλουχίες που υβριδίζουν σε αυτές τις

συντηρημένες περιοχές, μπορεί να ληφθεί προϊόν πολλαπλασιασμού από

80


στελέχη που ανήκουν σε διαφορετικά βακτηριακά είδη. Στη συνέχεια ο

προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του προϊόντος του

πολλαπλασιασμού θα δώσει ως αποτέλεσμα το βακτηριακό είδος. Με

αυτήν την τεχνική έχει γίνει δυνατή η ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους

πολλών παθογόνων, που οι συμβατικές φαινοτυπικές μέθοδοι δεν

μπορούσαν να αναγνωρίσουν. Επίσης με αυτόν τον τρόπο έχει γίνει

δυνατή η ανίχνευση σε κλινικά δείγματα παθογόνων που δεν ήταν

δυνατόν να καλλιεργηθούν (π.χ. B a rto n e lla henselae , T ro p h erym a

w hipp le i). Σήμερα η PCR που πολλαπλασιάζει το I 6 S rR N A είναι μια

εδραιωμένη μέθοδος ανίχνευσης DNA σε κλινικά δείγματα [99] [100].

Διάφορα πρωτόκολλα έχουν προταθεί για τις περιπτώσεις

ανίχνευσης θετικού σήματος σε 16S rRNA PCR :

I. Πολλαπλασιασμός του 1 6 S rR N A γονιδίου και στη συνέχεια

ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλυσίδας (sequencing)

II. Πολλαπλασιασμός του 1 6 S rR N A γονιδίου και στη συνέχεια

υβριδισμός κατά Southern

III. Πολλαπλασιασμός του 1 6 S rR N A γονιδίου και στη συνέχεια

εφαρμογή PCR με εκκινητές ειδικούς για τα διάφορα είδη βακτηρίων

Τα δύο τελευταία πρωτόκολλα παρουσιάζουν το ίδιο πρόβλημα:

εξαρτώνται από την επιλογή εκκινητών και δεν ανιχνεύουν σπάνια είδη

για τα οποία δεν υπάρχουν πληροφορίες για την αλληλουχία των

γονιδίων τους. Αντίθετα, το πρώτο πρωτόκολλο οδηγεί στην

ταυτοποίηση τόσο νέων όσο και σπάνιων βακτηρίων [101]. Αυτή η

μέθοδος έχει εφαρμοστεί με επιτυχία στη διάγνωση περιπτώσεων

μηνιγγίτιδας, ενδοκαρδίτιδας, σηπτικής αρθρίτιδας κ.α. [100] [102] [103]

[104] [105] [106].

Τα βήματα της μεθόδου πολλαπλασιασμού του 1 6 S rR N A γονιδίου

με PCR που ακολουθείται από ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας

είναι:

81


i. Εκχύλιση του DNA από το κλινικό δείγμα. Το εξεταζόμενο DNA

ελέγχεται για την παρουσία αναστολέων της PCR με τη

χρησιμοποίηση εκκινητών που στοχεύουν στο γονίδιο της β2

σφαιρίνης.

ii. Στο DNA που απομονώθηκε εφαρμόζεται PCR με ζεύγος

εκκινητών που στοχεύουν στο 1 6 S rR N A γονίδιο.

iii. Στα προϊόντα της PCR γίνεται ανάλυση της νουκλεοτιδικής

αλληλουχίας.

iv. Ταυτοποίηση των βακτηρίων με τη σύγκριση της αλληλουχίας που

προέκυψε, με αυτές που βρίσκονται αποθηκευμένες στην

GenBank, χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα BLAST που βρίσκεται

στο website του National Center for Bioechnology Information

v. Φυλογενετική ανάλυση των βακτηρίων που δεν ταυτοποιήθηκαν.

vi. Ερμηνεία των αποτελεσμάτων. Η κλινική ερμηνεία μιας PCR με

θετικό σήμα είναι πολύ πολύπλοκη, καθώς πρέπει να διερευνηθεί

αν πρόκειται για αληθώς θετικό αποτέλεσμα ή αν πρόκειται για

ψευδώς θετικό λόγω επιμόλυνσης, καθώς και αν το μικροβιακό

γενετικό υλικό που ανιχνεύθηκε προέρχεται από ζώντα ή μη

μικροβιακά κύτταρα.

1.3.4 Η εμφάνιση και αποτύπωση του τελικού προιοντος πολλαπλασιασμού

Τα προϊόντα πολλαπλασιασμού της PCR γίνονται ορατά και

ελέγχονται με αρκετούς τρόπους, οι κυριότεροι των οποίων είναι: 1) η

απλή ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης μετά από σύνδεση του DNA με

βρωμιούχο αιθίδιο, 2) ο υβριδισμός με ιχνηθέτη με φθορίζουσα,

ανοσοενζυμική ή ραδιενεργό σήμανση. Η μέθοδος με πηκτή αγαρόζης

και βρωμιούχο αιθίδιο είναι η συχνότερα χρησιμοποιούμενη, έχει όμως

χαμηλότερη ευαισθησία σε σχέση με τις μεθόδους ιχνηθέτη. Στην εικόνα

82


3 απεικονίζεται ένα χαρακτηριστικό δείγμα ηλεκτροφόρησης σε πηκτή

αγαρόζης (gel).

Η ηλεκτροφόρηση γίνεται σε συσκευή οριζόντιας

ηλεκτροφόρησης, μέσα σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα, με τη χρήση ενός

ηλεκτρικού πεδίου σταθερής τάσης και κατεύθυνσης [98].

Εικόνα 3: Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης

1.3.5 Η επιλογή και επεξεργασία του κλινικού δείγματος-Η απομόνωση του DNA

Η πραγματοποίηση της αντίδρασης της PCR προϋποθέτει την

ύπαρξη του DNA στόχου σε καθαρή μορφή και σε επαρκή ποσότητα.

Όμως το DNA βρίσκεται μέσα στον πυρήνα του κυττάρου

(ευκαρυωτικού ή βακτηριακού) και η καταστροφή της κυτταρικής

δομής, χωρίς όμως την παράλληλη καταστροφή του DNA, απαιτεί μια

συγκεκριμένη διαδικασία (βρασμός, μείγματα ενζύμων π.χ. πρωτεϊνάση

Κ κτλ). Ακολουθεί εκχύλιση του DNA, απομάκρυνση όλων των ξένων

83


προς το DNA στοιχείων του κυττάρου και απενεργοποίηση των

ένζυμων που μπορεί να ευθύνονται για πιθανή υδρόλυση του DNA. Το

τελικό προϊόν αυτών των τεχνικών είναι καθαρό DNA σε υψηλή

συγκέντρωση, κατάλληλο για μακροχρόνια φύλαξη σε συνθήκες -200C

για όλες τις εφαρμογές της μοριακής βιολογίας. Οι τεχνικές αυτές

εκχύλισης βασίζονται σε διαφορετικές μεθόδους, οι πιο γνωστές εκ των

οποίων είναι οι ηθμοί πυριτίου, τα μαγνητικά σφαιρίδια κτλ [98].

1.3.6 Αναλυτική ευαισθησία, διαγνωστική ευαισθησία και διαγνωστική ειδικότητα

Η αναλυτική ευαισθησία του κάθε πρωτοκόλλου PCR (δηλαδή η

μικρότερη ποσότητα DNA που μπορεί να ανιχνεύσει η αντίδραση)

προσδιορίζεται με τη χρήση DNA πρότυπου στελέχους, του οποίου η

ακριβής συγκέντρωση μετά την εκχύλιση γίνεται γνωστή συνήθως με

φωτομέτρηση. Παρασκευάζονται στη συνέχεια υποδιπλάσιες

συγκεντρώσεις του DNA και πραγματοποιείται η αντίδραση της PCR. Η

τελευταία συγκέντρωση στην οποία η PCR είναι θετική με επαναλήψιμο

τρόπο είναι η αναλυτική ευαισθησία της μεθόδου.

Η διαγνωστική ευαισθησία, δηλαδή η ικανότητα να δίνει θετικό

αποτέλεσμα σε όλες τις περιπτώσεις της ύπαρξης της νόσου, εξαρτάται

όχι μόνο από την αναλυτική ευαισθησία, αλλά και από το βακτηριακό

φορτίο και την επακόλουθη ποσότητα DNA που παράγεται. Επίσης ο

τρόπος επεξεργασίας του δείγματος πριν την εκχύλιση, αλλά και η ίδια

η διαδικασία εκχύλισης, παίζουν σημαντικό ρόλο στη βελτίωση της

διαγνωστικής ευαισθησίας της μεθόδου.

Η διαγνωστική ειδικότητα τέλος, (δηλαδή η ικανότητα του

πρωτοκόλλου να ανιχνεύει ως θετικά μόνο τα θετικά δείγματα και όχι

τα αρνητικά, δηλαδή να μη δίνει ψευδώς θετικά αποτελέσματα)

εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από το σωστό σχεδιασμό των εναρκτήριων

84


αλληλουχιών και τον προσεκτικό προσδιορισμό των παραγόντων της

αντίδρασης με σημαντικότερο τη θερμοκρασία υβριδισμού [98].

1.3.7 Τα ψευδώς θετικά αποτελέσματα

Η μεγάλη ευαισθησία της PCR, που αποτελεί το κυριότερο

πλεονέκτημά της, μπορεί να αποτελέσει σημαντικό πρόβλημα, αφού το

αποτέλεσμα κάθε αντίδρασης είναι ένας τεράστιος αριθμός αντιγράφων

του DNA στόχου, αντίγραφα τα οποία με τη σειρά τους ενδέχεται να

αποτελέσουν υπόστρωμα, επιμολύνοντας τις επόμενες αντιδράσεις και

οδηγώντας σε ψευδώς θετικά αποτελέσματα.

Η αποφυγή των επιμολύνσεων επιτυγχάνεται πρωτίστως με τη

εφαρμογή διαδικασιών ορθής εργαστηριακής πρακτικής. Τέτοιες

διαδικασίες είναι μεταξύ άλλων η προσεκτική προετοιμασία και

εκτέλεση της διαδικασίας σε διαφορετικούς χώρους προετοιμασίας

δειγμάτων και αντίδρασης PCR, η χρήση απαγωγού συστήματος

αερισμού (laminar air flow cabinet) για την προετοιμασία των χημικών

αντιδραστηρίων, ο προσεκτικός καθαρισμός και αποστείρωση των

σωληναρίων και πιπετών, η χρήση γαντιών, μάσκας κτλ.

Εκτός όμως από τις παραπάνω συνθήκες ορθής εργαστηριακής

πρακτικής, έχουν εξελιχθεί και τεχνικές διάσπασης και καθαρισμού των

προϊόντων της PCR. Συχνότερα χρησιμοποιούμενη τεχνική είναι η

έκθεση του χώρου μετά την εργασία σε υπεριώδη (UV) ακτινοβολία και

ο καθαρισμός του με υποχλωριώδες διάλυμα.

Σημαντικός παράγοντας στον έλεγχο και τη διερεύνηση της πηγής

της κάθε επιμόλυνσης αποτελεί η χρήση πολλών αρνητικών control σε

διαφορετικά σημεία της αντίδρασης (αρχή, μέση και τέλος των

δειγμάτων), όπως επίσης και η χρήση αρνητικών control στην εκχύλιση

του DNA (extraction control), δειγμάτων δηλαδή που περιέχουν μόνο

H2O και των οποίων η επεξεργασία ακολουθεί την ίδια ακριβώς

85


διαδικασία όπως και των υπολοίπων δειγμάτων από την αρχή της

εκχύλισης του DNA [98].

1.3.8 Τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα

Τα κλινικά δείγματα μπορεί να περιέχουν χημικές ουσίες που να

επηρεάζουν τη διαδικασία της PCR, αναστέλλοντας την ενζυματική

αντίδραση. Ως αποτέλεσμα της δράσης των ουσιών αυτών, που

ονομάζονται γενικά «αναστολείς», η PCR καταλήγει σε αρνητικό

αποτέλεσμα, παρά την πιθανή ύπαρξη μεγάλων ποσοτήτων DNA στόχου

στο κλινικό δείγμα. Ο απλούστερος τρόπος για να ελεγχθεί εάν ένα

αρνητικό δείγμα είναι πραγματικά αρνητικό ή έχει γίνει αναστολή της

αντίδρασης, λόγω παρουσίας αναστολέα, είναι η επανάληψη της

αντίδρασης του δείγματος μετά από προσθήκη μικρής ποσότητας DNA

του θετικού control. Σε περίπτωση που η αντίδραση εξακολουθεί να είναι

αρνητική, τότε απαιτείται νέο δείγμα και επανάληψη της διαδικασίας από

τα αρχικά στάδια. Άλλη μέθοδος είναι η προσθήκη σε κάθε αντίδραση

και ενός δεύτερου ζεύγους εναρκτήριων αλληλουχιών για ένα ανθρώπινο

γονίδιο (π.χ. το γονίδιο της β2-σφαιρίνης). Η συγκεκριμένη αντίδραση

εφόσον είναι θετική πιστοποιεί και την ορθή εξαγωγή γενετικού υλικού

από το κλινικό δείγμα και την απουσία αναστολέων. [98].

1.4 Προσδιορισμός νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ενός μορίου DNA (sequencing)

Η πιο ειδική και πλήρης εξέταση για τη διάγνωση και την

τυποποίηση μικροοργανισμών είναι ο προσδιορισμός της αλληλουχίας

DNA συγκεκριμένων χρωμοσωμικών περιοχών. Οι τεχνικές

προσδιορισμού νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (sequencing) έχουν

αναπτυχθεί τόσο τα τελευταία χρόνια, ώστε η συγκριτική μελέτη

ομόλογων γονιδίων αποτελεί πλέον κύρια μέθοδο στη Μοριακή

Συστηματική Μικροβιολογία και στη φυλογενετική ταξινόμηση

86


Η συχνότερα χρησιμοποιούμενη μέθοδος ανάλυσης της

νουκλεοτιδικής αλληλουχίας είναι η ενζυμική μέθοδος του Sanger. Η

μέθοδος αυτή χρησιμοποιεί διδεοξυνουκλεοτίδια και βασίζεται στην

ικανότητά τους να σταματούν την επιμήκυνση ενός κλώνου DNA. Τα

διδεοξυνουκλεοτίδια είναι παράγωγα των δεοξυριβονουκλεοτιδίων χωρίς

την 3'-υδροξυλομάδα. Η DNA πολυμεράση συνθέτει έναν

συμπληρωματικό κλώνο του αναλυόμενου τμήματος DNA, ξεκινώντας

από εκκινητή. Πραγματοποιούνται τέσσερις διαφορετικές αντιδράσεις,

όπου καθεμία περιλαμβάνει ένα διδεοξυ-ανάλογο των τεσσάρων

νουκλεοτιδίων Α(αδενίνη), Τ(θυμίνη), Ο(κυτοσίνη), Ο(γουανίνη).

Τερματίζονται περίπου το 0,5% των αντιδράσεων. Οι τέσσερις

αντιδράσεις επισημαίνονται με τέσσερις φθορίζουσες χρωστικές,

συνδεδεμένες με τους εκκινητές ή τα διδεοξυριβονουκλεοτίδια. Δε

χρησιμοποιείται ραδιοεπισήμανση. Στη συνέχεια οι τέσσερις

διαφορετικές αντιδράσεις ηλεκτροφορούνται μαζί σε μια στήλη ή σε

τριχοειδές. Οι ηλεκτροφορητικές συνθήκες επιτρέπουν το διαχωρισμό

τμημάτων DNA που διαφέρουν σε μέγεθος ενός νουκλεοτιδίου.

Προκύπτει μια εικόνα όπως αυτή στο σχήμα 2, όπου η αλληλουχία

διαβάζεται από κάτω προς τα πάνω.

Σχήμα 2: Σχηματική αναπαράσταση ηλεκτροφόρησης κατά τη διάρκεια sequencing

3' A C G T 5'

-TTGACA

-TTGAC

-TTGA

-TTG

-ΤΤ

-T

87


Όταν τα τμήματα DNA φθάνουν στο τέλος της ηλεκτροφόρησης

σαρώνονται με τη βοήθεια laser. Με τη χρήση φωτοκυττάρου

ανιχνεύεται η εκπομπή φωτός και το σήμα μεταφέρεται σε ηλεκτρονικό

υπολογιστή που αυτόματα αναλύει και αποθηκεύει τα δεδομένα. Έχει

καθιερωθεί η ύπαρξη του νουκλεοτιδίου A να επισημαίνεται και να

φθορίζει σε πράσινο χρώμα, του νουκλεοτιδίου G σε μαύρο, του

νουκλεοτιδίου C σε μπλε και του νουκλεοτιδίου T σε κόκκινο. Τα

αυτόματα μηχανήματα εύρεσης της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας

(sequencer) αναλύουν ταυτόχρονα ακόμα και 384 τμήματα DNA. Οι

αλληλουχίες που προκύπτουν συγκρίνονται με τις αλληλουχίες που έχουν

υποβληθεί στην GenBank και EMBL, χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο

BLAST [98].

Στην εικόνα 4 φαίνεται ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα

αποτελέσματος sequencing που αντιστοιχεί σε E sc h er ic h ia coli.

Εικόνα 4: Αποτέλεσμα ανάλυσης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας E s c h e r ic h ia c o li

88



ΟΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΩΣ ΕΡΓΑΛΕΙΟ ΣΤΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΩΝ ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΩΝ ΛΟΙΜΩΞΕΩΝ

Η έγκαιρη διάγνωση των βακτηριακών λοιμώξεων συμβάλλει

σημαντικά στην εφαρμογή της ενδεδειγμένης αντιμικροβιακής θεραπείας

και στη γρήγορη διαχείριση του ασθενούς. Οι τεχνικές μοριακής

βιολογίας, όπως η τεχνική της αλυσιδωτής ατίδρασης της πολυμεράσης

(PCR), συμβάλλουν στη διάγνωση του αιτιολογικού παράγοντα των

βακτηριακών λοιμώξεων μέσω της ανίχνευσης βακτηριακού γενετικού

υλικού [106]. Ειδικότερα η PCR που πολλαπλασιάζει το I 6 S rR N A είναι

μια μέθοδος ανίχνευσης βακτηριακού DNA άμεσα στο κλινικό δείγμα

και έχει εφαρμοστεί σε πολλά και διαφορετικής προέλευσης κλινικά

δείγματα.

Συγκεκριμένα έχουν πραγματοποιηθεί πολλές μελέτες προκειμένου

να διερευνηθεί η χρησιμότητα της ευρέος φάσματος PCR στην

ταυτοποίηση του αιτιολογικού παράγοντα σε περιπτώσεις λ°ιμώδ°υς

ενδνκαρδίτιδας, δεδομένου ότι οι αιμοκαλλιέργειες παραμένουν στείρες

στο 2,5-31% των περιπτώσεων [91][107][108][109]. Η μη θετικοποίηση

των αιμοκαλλιεργειών θεωρείται ότι οφείλεται είτε στην προηγούμενη

λήψη αντιμικροβιακής αγωγής, είτε στην παρουσία αργά

αναπτυσσόμενων, ή απαιτητικών, ή ενδοκυττάριων μικροοργανισμών

[110], είτε τέλος στη μικρή συγκέντρωση των μικροοργανισμών στο προς

εξέταση δείγμα [111]. Η χρησιμότητα των μοριακών τεχνικών στη

λοιμώδη ενδοκαρδίτιδα έχει διερευνηθεί από πολλές μελέτες τα

τελευταία χρόνια. Στις περισσότερες από αυτές το κλινικό υλικό στο

οποίο έχουν εφαρμοστεί οι μοριακές τεχνικές είναι βαλβιδικός ιστός,

δείγμα που προκύπτει μετά από χειρουργική επέμβαση [112] [111] [113]

[114][115][116], ενώ σε κάποιες άλλες είναι δείγμα ολικού αίματος [117].

89


Στις μελέτες αυτές υποστηρίζεται ότι η εφαρμογή μοριακών τεχνικών

στους βαλβιδικούς ιστούς είναι σημαντική για την επιλογή της

κατάλληλης αντιμικροβιακής θεραπείας μετά το χειρουργείο στις

περιπτώσεις ενδοκαρδίτιδας με στείρες αιμοκαλλιέργειες. Αντίθετα λίγες

μόνο έρευνες προτείνουν την εισαγωγή της ευρέος φάσματος PCR στο

ολικό αίμα για τη διάγνωση της λοιμώδους ενδοκαρδίτιδας στην κλινική

πράξη. Ο κυριότερος λόγος είναι η δυσκολία στην ερμηνεία των

αποτελεσμάτων. Θετικό σήμα στην PCR με στείρα αιμοκαλλιέργεια

μπορεί να είναι ψευδώς θετικό εύρημα (αν πρόκειται για επιμόλυνση),

αλλά μπορεί να είναι αληθώς θετικό, αν έχει προηγηθεί λήψη

αντιβιοτικών ή αν η λοίμωξη οφείλεται σε απαιτητικό ή βραδέως

αναπτυσσόμενο μικροοργανισμό. Κατά την ερμηνεία προκύπτουν και

άλλα προβλήματα καθώς η μέθοδος ανιχνεύει βακτηριακό DNA στο αίμα,

που προέρχεται όχι μόνο από ζώντες αλλά και από νεκρούς

μικροοργανισμούς. Ένα τρίτο πρόβλημα είναι ο αυξημένος κίνδυνος

επιμόλυνσης όχι μόνο κατά τη λήψη του δείγματος αλλά και κατά τον

χειρισμό του στο εργαστήριο.

Η κλινική υποψία μηνιγγίτιδας προκύπτει από την κλινική εικόνα

του ασθενούς, ενώ εργαστηριακά η διάγνωση επιβεβαιώνεται από την

παρουσία εμπύρηνων κυττάρων στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ). Η

Gram χρώση, η ανίχνευση αντιγόνων, όπως και η καλλιέργεια του ΕΝΥ

έιναι σημαντικά εργαλεία για την ταυτοποίηση του υπεύθυνου

μικροοργανισμού. Η ευαισθησία των παραπάνω μεθόδων μειώνεται

σημαντικά σε περίπτωση προηγηθείσας αντιμικροβιακής θεραπείας.

Επιπλέον σε περιπτώσεις που η λοίμωξη οφείλεται σε βραδέως

αναπτυσσόμενα ή απαιτητικά βακτήρια, η καλλιέργεια παραμένει στείρα.

Στην περίπτωση της μηνιγγίτιδας, επειδή η επιδημιολογία της αφορά σε

συγκεκριμένα παθογόνα, πλην της ευρέος φάσματος PCR [118] [119],

έχει εφαρμοστεί και η multiplex PCR [120] [121] [122]. Οι περισσότερες

90


μελέτες συμφωνούν ότι η multiplex PCR έχει μεγαλύτερη ευαισθησία

από τις κλασικές μεθόδους στην ταυτοποίηση του αιτιολογικού

παράγοντα της μηνιγγίτιδας.

Η αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα είναι μια πολύ σοβαρή

και δυνητικά θανατηφόρος επιπλοκή που αφορά στους κιρρωτικούς

κυρίως ασθενείς με ασκίτη. Η ταχεία διάγνωσή της και η ταυτοποίηση

του παθογόνου μικροοργανισμού είναι πολύ σημαντική για την

πρόγνωση των ασθενών αυτών. Οφείλεται στη βακτηριακή διαμετάθεση

στο ασκιτικό υγρό. Σήμερα η διάγνωση της βασίζεται στην αύξηση του

απόλυτου αριθμού των πολυμορφοπυρήνων στο ασκιτικό υγρό

ανεξάρτητα από το αποτέλεσμα της καλλιέργειας του ασκιτικού υγρού. Η

απομόνωση και ταυτοποίηση του παθογόνου μικροοργανισμού γίνεται με

τη μέθοδο της καλλιέργειας και συγκεκριμένα με τον ενοφθαλμισμό του

ασκιτικού υγρού σε φιαλίδια αιμοκαλλιέργειας δίπλα στην κλίνη του

ασθενούς. Ωστόσο οι αιμοκαλλιέργειες απαιτούν αρκετές μέρες (έως 5)

μέχρι να θετικοποιηθούν, ενώ σημαντικό ποσοστό αυτών παραμένει

στείρο. Δεδομένου ότι η χορήγηση της κατάλληλης αντιμικροβιακής

αγωγής μπορεί να επηρεάσει σημαντικά την κλινική έκβαση και να

μειώσει την θνητότητα, διερευνήθηκε ευρέος η χρησιμότητα των

μοριακών τεχνικών στον προσδιορισμό του αιτιολογικού παράγοντα της

συγκεκριμένης κλινικής οντότητας.

Η πρώτη μεγάλη μελέτη στην οποία χρησιμοποιήθηκε η 16S rRNA

PCR, σε ασκιτικό υγρό και αίμα κιρρωτικών ασθενών με μη

πολυμορφοπυρηνικό ασκίτη [123], περιγράφει την ανίχνευση

βακτηριακού DNA σε 9 από τους συνολικά 28 ασθενείς. Η ταυτόχρονη

παρουσία του γενετικού υλικού βακτηρίων του ίδιου γένους και είδους σε

ασκιτικό υγρό και αίμα, θεωρήθηκε ότι οφείλεται σε ασυμπτωματικά

επεισόδια βακτηριακής διαμετάθεσης.

91


Η ίδια ομάδα ερευνητών παρουσίασε το 2008 μια πολυκεντρική

μελέτη, χρησιμοποιώντας την ίδια μεθοδολογία (16S rRNA και

sequencing σε ασκιτικό υγρό και αίμα), στην οποία βακτηριακό DNA

ανιχνεύθηκε σε 48 από τους 156 ασθενείς που εξετάστηκαν [124]. Καθώς

οι 48 αυτοί ασθενείς εμφάνιζαν υψηλότερη θνητότητα, η ανίχνευση

βακτηριακού DNA προτάθηκε ως δείκτης χειρότερης πρόγνωσης.

Σε μελέτη σε παιδιατρικούς ασθενείς [125] που χρησιμοποιήθηκε

επίσης η ευρέος φάσματος PCR (16S rRNA) στο ασκιτικό υγρό

ακολουθούμενη από ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας,

ανιχνεύθηκε βακτηριακό DNA σε 7 από τους 8 ασθενείς με αυτόματη

βακτηριακή περιτονίτιδα, ενώ με την κλασική καλλιέργεια απομονώθηκε

βακτηριακό αίτιο στους 4 από τους 8, οδηγώντας τους συγγραφείς στο

συμπέρασμα ότι η 16S rRNA PCR μπορεί να βοηθήσει στην

ταυτοποίηση του αιτιολογικού παράγοντα στην αυτόματη βακτηριακή

περιτονίτιδα. Ωστόσο στην ίδια έρευνα, η ανίχνευση βακτηριακού DNA

στο ασκιτικό υγρό ασθενών με μη πολυμορφοπυρηνικό ασκίτη και με

αρνητική καλλιέργεια, θεωρήθηκε είτε ως επιμόλυνση, είτε ως παροδικός

και χωρίς κλινική σημασία αποικισμός του ασκιτικού υγρού.

Η ανίχνευση βακτηριακού DNA με multiplex PCR προτάθηκε από

τον Bruns e t al. ως εργαλείο για τη διάγνωση της αυτόματης

βακτηριακής περιτονίτιδας καθώς και για τα επεισόδια βακτηριακής

διαμετάθεσης [126]. Στη συγκεκριμένη μελέτη βακτηριακό DNA

ανιχνεύθηκε σε 6 από τους 11 ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή

περιτονίτιδα που μελετήθηκαν (οι κλασικές μέθοδοι ταυτοποίησαν

βακτηριακό παράγοντα σε 5 από αυτούς), και η μέθοδος αυτή θεωρήθηκε

από τους συγγραφείς ως αξιόπιστη και εναλλακτική της καλλιέργειας για

την ταυτοποίηση μικροοργανισμών στο ασκιτικό υγρό ασθενών σε

κίνδυνο για την ανάπτυξη αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας. Η ίδια

μέθοδος εφαρμόστηκε τόσο στο ασκιτικό υγρό, όσο και στο αίμα 218

92


κιρρωτικών ασθενών με ασκίτη [127]. Η παρουσία βακτηριακού DNA,

δε συσχετίστηκε με αύξηση της θνητότητας σε αυτούς τους ασθενείς.

Η ευρέος φάσματος PCR σε συνδυασμό με T-RFLP ανάλυση και

quantitative PCR, προτάθηκε το 2010, ως μέθοδος ικανή να οδηγήσει σε

ταχύ χαρακτηρισμό του βακτηριακού περιεχόμενου του ασκιτικού υγρού,

παρέχοντας μία βάση για τη διάγνωση της αυτόματης βακτηριακής

περιτονίτιδας και για την έγκαιρη και στοχεύουσα αντιμικροβιακή

θεραπεία [128].

Βακτηριακό DNA ανιχνεύθηκε με Real Time PCR που

ακολουθήθηκε από ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας σε 92%

των περιπτώσεων αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας με θετική

καλλιέργεια ασκιτικού και στο 53% αυτών με αρνητική καλλιέργεια

[129], χωρίς όμως να κατορθωθεί πάντα να ταυτιστεί το βακτηριακό

DNA που ανιχνεύθηκε με το γενετικό υλικό συγκεκριμένου

μικροοργανισμού.

Η κλινική αξιολόγηση των αποτελεσμάτων των μοριακών

τεχνικών όταν αυτές εφαρμόζονται στο ασκιτικό υγρό, έχει απασχολήσει

την επιστημονική κοινότητα. Η ταυτόχρονη ανίχνευση βακτηριακού

DNA στον ορό και το ασκιτικό υγρό με την ευρέος φάσματος PCR σε μη

πολυμορφοπυρηνικό ασκίτη με αρνητική καλλιέργεια έχει ερμηνευθεί ως

δείκτης βακτηριακής διαμετάθεσης [123] και ως ανεξάρτητος

προγνωστικός παράγοντας ετήσιας θνητότητας [124]. Παρόλο που η

παρουσία βακτηριακού DNA στον ορό ή/και στο ασκιτικό υγρό

σχετίζεται με δυσλειτουργία της κυκλοφορίας [130], δεν υπάρχουν

επαρκείς μελέτες για να υποστηρίξουν την εφαρμογή του στην κλινική

πράξη [30] [127] .

93


ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ

94



ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ

1.1 Εισαγωγή

Η αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα είναι μια συχνή και δυνητικά

θανατηφόρα επιπλοκή του ασκίτη των κιρρωτικών ασθενών. Ορίστηκε

για πρώτη φορά το 1971 από τον Harold Conn. Η συχνότητά της, κατά

την εισαγωγή στο νοσοκομείο, κυμαίνεται μεταξύ 10-30% [50]. Η ετήσια

πιθανότητα εμφάνισης του πρώτου επεισοδίου στους κιρρωτικούς με

ασκίτη είναι 10% περίπου.

Κύριος παθογενετικός μηχανισμός της αυτόματης βακτηριακής

περιτονίτιδας είναι η βακτηριακή διαμετάθεση (bacterial translocation),

που ορίζεται ως η δίοδος ζώντων μικροβίων ή μικροβιακών προϊόντων

της εντερικής χλωρίδας, διαμέσου του εντερικού τοιχώματος, σε

εξωαυλικές εντοπίσεις. Στους κιρρωτικούς ασθενείς παρατηρείται

διαταρραχή της κινητικότητας του εντέρου. Αυτό προκαλεί αλλαγές στη

σύσταση της εντερικής χλωρίδας, η οποία σε συνδυασμό με τη

διαταρραχή της τοπικής αλλά και της χυμικής ανοσίας, διευκολύνει την

ανεμπόδιστη δίοδο μικροβίων και ενδοτοξινών από τον εντερικό αυλό,

στους μεσεντέριους λεμφαδένες. Τα μικρόβια στη συνέχεια αποικίζουν

το ασκιτικό υγρό διαμέσου της συστηματικής κυκλοφορίας [52] [67].

Η λοίμωξη του περιτοναίου που μπορεί να προκληθεί από την

είσοδο των μικροβίων, οδηγεί σε φλεγμονώδη αντίδραση και

συνεπακόλουθη αύξηση του αριθμού των πολυμορφοπυρήνων στο

ασκιτικό υγρό. Η αυτόματη βακτηριακή πεpιτ°vίτιδα χαρακτηρίζεται

από αύξηση του αριθμού των πολυμορφοπυρήνων στο ασκιτικό υγρό

>250 κύτταρα/mm3 ανεξάρτητα από το αποτέλεσμα της καλλιέργειας του

ασκιτικού υγρού [30] [32]. Η καλλιέργεια του ασκιτικού υγρού

95


παραμένει στείρα σε μεγάλο ποσοστό ασθενών με αυτόματη βακτηριακή

περιτονίτιδα, κυρίως λόγω της χαμηλής συγκέντρωσης βακτηρίων

[54][44]. Ο ενοφθαλμισμός του ασκιτικού υγρού σε φιαλίδια

αιμοκαλλιεργειών «παρά τη κλίνη» του ασθενούς, μπορεί να αυξήσει την

ευαισθησία της καλλιέργειας στο 90% [30][43][44]. Ωστόσο οι

καλλιέργειες του ασκιτικού υγρού παραμένουν στείρες στο 60% περίπου

των ασθενών με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα [54]. Ο

πολυμορφοπυρηνικός ασκίτης (CNNA: culture negative neutrocytic

ascites) είναι η συχνότερη υποπερίπτωση αυτόματης βακτηριακής

περιτονίτιδας, η οποία χαρακτηρίζεται από το γεγονός ότι η καλλιέργεια

του ασκιτικού υγρού είναι στείρα [54]. Στον μονομικροβιακό μη

ουδετεροφιλικό ασκίτη η καλλιέργεια του υγρού είναι θετική (μόνο

ένας μικροοργανισμός απομονώνεται), αλλά ο αριθμός τωνΛ

ουδετεροφίλων είναι μικρότερος από 250/mm [54]. Περιγράφεται επίσης

και ο πολυμικροβιακός βακτηριοασκίτης στον οποίο ο αριθμός των

ουδετερόφιλων είναι >250/mm3, η καλλιέργεια του ασκιτικού υγρού είναι

θετική και απομονώνονται περισσότεροι του ενός μικροοργανισμοί [54].

Η διάγνωση της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας βασίζεται

στην ανάλυση του ασκιτικού υγρού και συγκεκριμένα στον

προσδιορισμό του απόλυτου αριθμού των πολυμορφοπυρήνων. Τα

βακτήρια που συχνότερα απομονώνονται από την καλλιέργεια του

ασκιτικού υγρού είναι αυτά που ανήκουν στα εντεροβακτηριακά, ενώ τα

τελευταία χρόνια αυξάνεται η συχνότητα απομόνωσης εντεροκόκκων και

άλλων GRAM θετικών κόκκων. Παρά το γεγονός ότι τα μικρόβια που

εμπλέκονται στην παθογένεια της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας

είναι συνήθως μη απαιτητικά βακτήρια, καθώς και ότι το ασκιτικό υγρό

εμβολιάζεται σε φιαλίδια αιμοκαλλιεργειών, γεγονός που ενισχύει την

ευαισθησία της εξέτασης, μεγάλο ποσοστό των καλλιεργειών του

ασκιτικού υγρού παραμένει στείρο. Αυτό οφείλεται κατά ένα μέρος στον

96


μικρό αριθμό βακτηριακών κυττάρων που περιέχονται στο ασκιτικό υγρό

(1 βακτήριο ανά ml). Το ερώτημα που τίθεται είναι αν οι νεότερες

μοριακές μέθοδοι μπορούν να βοηθήσουν στην ταυτοποίηση των

μικροοργανισμών που εμπλέκονται στην παθογένεια της αυτόματης

βακτηριακής περιτονίτιδας.

1.2 Σκοπός της μελέτης

Στην έρευνα αυτή προσπαθήσαμε να εκτιμήσουμε τη δυνατότητα

των μοριακών μεθόδων και συγκεκριμένα της ευρέος φάσματος PCR να

προσδιορίσει τον αιτιολογικό παράγοντα της αυτόματης βακτηριακής

περιτονίτιδας, όταν εφαρμόζεται είτε στο ασκιτικό υγρό, είτε στο υγρό

των φιαλιδίων αιμοκαλλιεργειών που έχουν ενοφθαλμιστεί με ασκιτικό

υγρό και έχουν παραμείνει στείρες.

97


ΚΕΦΑΛΑΙΟ 2°ΑΣΘΕΝΕΙΣ, ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

2.1 Πρωτόκ°λλ° εργασίαςΌλα τα δείγματα των ασκιτικών υγρών που περιελήφθησαν στην

παρούσα μελέτη εξετάστηκαν ως προς το χρώμα και τη θολερότητα,

έγινε μέτρηση του αριθμού των εμπύρηνων κυττάρων και των ερυθρών

και προσδιορισμός του απόλυτου αριθμού των πολυμορφοπυρήνων. Σε

κάθε δείγμα μετρήθηκε η γλυκόζη, η LDH, το συνολικό λεύκωμα, η

λευκωματίνη του ασκιτικού υγρού καθώς και η λευκωματίνη στον ορό

του ασθενούς, προκειμένου να προσδιοριστεί στη συνέχεια η διαφορά-

κλίση (gradient) της λευκωματίνης.

Το πρωτόκολλο του Μικροβιολογικού Εργαστηρίου περιελάμβανε:

A. Καλλιέργεια ασκιτικού υγρού σε φιαλίδια αιμοκαλλιεργειών

B. Καλλιέργεια αίματος

C. Εφαρμογή 16S rRNA PCR άμεσα στο ασκιτικό υγρό

D. Εφαρμογή 16S rRNA PCR στο περιεχόμενο των φιαλιδίων που

περιείχαν το ασκιτικό υγρό μετά από επώαση

Α. Καλλιέργεια ασκιτικού υγρού σε φιαλίδια

αικοκαλλιεργειών. Ποσότητα 10 ml ασκιτικού υγρού εμβολιάζονταν σε

φιαλίδια αιμοκαλλιέργειας Bact/ALERT aerobic και anaerobic «παρά τη

κλίνη» του ασθενούς. Τα φιαλίδια επωάζονταν για 14 μέρες σε μηχάνημα

Bact/ALERT 3D (Biomerieux, La Balme les Grottes, France). Αν κατά τη

διάρκεια της επώασης δινόταν θετικό σήμα συμβατό με βακτηριακή

ανάπτυξη, τότε το περιεχόμενο του φιαλιδίου της αιμοκαλλιέργειας

ενοφθαλμίζονταν στα συνήθη καλλιεργητικά υλικά, δηλαδή σε

αιματούχο άγαρ (αεροβίως και αναεροβίως), σε σοκολατόχροο άγαρ και

σε McConkey άγαρ, ενώ ταυτοχρόνως γινόταν και GRAM χρώση.

Ακολουθούσε ταυτοποίηση του βακτηρίου σε επίπεδο γένους και είδους

98


και έλεγχος ευαισθησίας του στους αντιμικροβιακούς παράγοντες με το

αυτοματοποιημένο σύστημα VITEK 2 (Biomerieux, La Balme les

Grottes, France). Αν το μηχάνημα δεν έδινε σήμα βακτηριακής

ανάπτυξης τα δείγματα χαρακτηρίζονταν ως «στείρα».

Β. Καλλιέργεια αίκατοο. Σε όλους τους ασθενείς λαμβάνονταν

καλλιέργεια αίματος σε φιαλίδια Bact/ALERT aerobic και anaerobic που

επωάζονταν για 5 ημέρες. Αν κατά τη διάρκεια της επώασης δινόταν

σήμα βακτηριακής ανάπτυξης, τότε στο περιεχόμενο του φιαλιδίου

γινόταν Gram χρώση και ενοφθαλμίζονταν στα συνήθη καλλιεργητικά

υλικά (αιματούχο άγαρ, σοκολατόχροο άγαρ και McConkey άγαρ).

Ακολουθούσε ταυτοποίηση και έλεγχος της ευαισθησίας του

απομονωθέντος βακτηρίου σε αντιμικροβιακούς παράγοντες με το

αυτοματοποιημένο σύστημα VITEK 2.

C. Εφαρκογή 16S rRNA PCR άκεσα στο ασκητικό υγρό.

Παράλληλα με τον ενοφθαλμισμό του ασκιτικού υγρού στο φιαλίδιο των

αιμοκαλλιεργειών λαμβάνονταν μια επιπλέον ποσότητα ασκιτικού υγρού

10 ml, η οποία φυγοκεντρούνταν στις 2.000 rpm για 20 λεπτά. Μετά τη

φυγοκέντρηση και την απόρριψη του υπερκείμενου, στο σχηματισθέν

ίζημα α) εφαρμόζοταν 16S rRNA PCR και β) γινόταν επίστρωση σε

αντικειμενοφόρο πλάκα για χρώση Gram. Αρχικά, γινόταν απομόνωση

DNA με τη χρήση του QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN, Hilden,

Germany). Η παραγωγή και η καθαρότητα του DNA μετριούνταν με

φωτόμετρο BioPhotometer (Eppendorf) σε A260nm και σε

A260/A280nm. Προκειμένου να αποκλειστεί η παρουσία αναστολέων

της PCR και να διακριβωθεί η επιτυχημένη εξαγωγή DNA (extraction)

εφαρμοζόταν PCR για τη β2 σφαιρίνη χρησιμοποιώντας για εκκινητές

(primers) 5'-GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3' (forward) και 5'-

AACTTCATCCACGTTCACC-3' (reverse) [104]. Παράλληλα γινόταν

και PCR για το 1 6 S rR N A γονίδιο χρησιμοποιώντας τους εκκινητές 5'-

99


AGAGTTTGATCATGGCTCA-3' (forward) και 5'-

ACGGCGACTGCTGCTGGCAC-3' (reverse) [131]. Οι κύκλοι της PCR

ήταν οι ακόλουθοι: ένα αρχικό στάδιο στους 95°C για 4 λεπτά,

ακολούθως 35 κύκλοι ως εξής: στους 94oC για 30 δευτερόλεπτα, στους

55oC για 30 δευτερόλεπτα, και στους 72oC για 90 δευτερόλεπτα, καθώς

και ένα τελικό στάδιο στους 72°C για 10 λεπτά. Ο τελικός όγκος της

PCR φιλτραζόταν σε QIAquick Spin Columns για την απομάκρυνση

εκκινητών και νουκλεοτιδίων και ηλεκτροφορούνταν σε gel 1.5%

αγαρόζης με βρωμιούχο αιθίδιο. Το τελικό προϊόν στις 520 bp

αντιστοιχεί στον πολλαπλασιασμό του 1 6 S rR N A γονιδίου. Στα PCR

προιόντα γινόταν προσδιορισμός νουκλεοτιδικής αλληλουχίας και προς

τις 2 κατευθύνσεις σε ένα ABI 3130 genetic analyzer και οι αλληλουχίες

συγκρίνονταν με τις αλληλουχίες που έχουν υποβληθεί στην GenBank

και EMBL, χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο BLAST (εικόνα 4 γενικού

μέρους) [132].

D. Εφαρκοτή 16S rRNA PCR στο περιε/όκενο των φιαλιδίων

που περιείραν το ασκιτικό υγρό κετά από επώασε. Η ίδια διαδικασία

εφαρμοζόταν και στο περιεχόμενο των φιαλιδίων που είχαν

ενοφθαλμιστεί με ασκιτικό υγρό. Τα φιαλίδια που δεν έδωσαν σήμα

βακτηριακής ανάπτυξης εξετάζονταν μετά από 14 ημέρες επώασης, ενώ

τα θετικά φιαλίδια εξετάζονταν την ημέρα της θετικοποίησής τους. Από

κάθε φιαλίδιο λαμβάνονταν 100 μΐ, τα οποία αναμιγνύονταν με 1 ml

απεσταγμένου νερού και ακολουθούσε φυγοκέντρηση τις 10.000 rpm για

10 λεπτά. Το υπερκείμενο απορριπτόταν και ακολουθούσε επεξεργασία

500 μΐ του ιζήματος, τα οποία χρησιμοποιούνταν για την εξαγωγή DNA,

και ακολουθούσε η εφαρμογή 16S rRNA PCR, όπως περιγράφηκε

προηγουμένως.

2.2 Ασθενείς

100


Συνολικά εξετάστηκαν 150 συνεχόμενα δείγματα περιτοναϊκών

υγρών από αντίστοιχο αριθμό ασθενών που νοσηλεύονταν στο

Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Λάρισας κατά τη χρονική περίοδο 2008

2017. Χρησιμοποιήθηκαν στοιχεία από τους φακέλους παρακολούθησης

των ασθενών για να καταγραφούν οι ακόλουθες παράμετροι:

ονοματεπώνυμο(αρχικά), φύλο, ηλικία, κλινική, όπως και αν ο ασθενής

είχε λάβει προφύλαξη για αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα ή άλλη

αντιμικροβιακή θεραπεία. Ασθενείς που είχαν λάβει αντιμικροβιακή

αγωγή κατά τον τελευταίο μήνα πριν την παρακέντηση δε

συμπεριλαμβάνονταν στη μελέτη.

Σε όλα τα υγρά που ελήφθησαν έγινε καταγραφή του χρώματος,

της όψης, του αριθμού των λευκών και ερυθρών αμοσφαιρίων, του

απόλυτου αριθμού των πολυμορφοπυρήνων, της λευκωματίνης, της

διαφοράς-κλίσης λευκωματίνης ασκιτικού υγρού/ορού, της γλυκόζης, της

LDH και των ολικών λευκωμάτων.

Ακόμα καταγράφονταν αν επρόκειτο για ασθενή με αυτόματη

βακτηριακή περιτονίτιδα (απόλυτος αριθμός πολυμορφοπυρήνωνΛ

>250/mm ) και αν ναι, σε ποιά υπο-περίπτωση αυτόματης βακτηριακής

περιτονίτιδας ανήκε (κλασική αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα,

πολυμορφοπυρηνικός ασκίτης, μονομικροβιακός μη

πολυμορφοπυρηνικός ασκίτης και πολυμικροβιακός βακτηριασκίτης) [1]

[30] [52] [54] ή αν επρόκειτο για δευτεροπαθή περιτονίτιδα.

Στη συνέχεια καταγράφονταν τα αποτελέσματα των εξής

εξετάσεων: Gram χρώση, αποτέλεσμα της καλλιέργειας του ασκιτικού

υγρού και του είδους του μικροοργανισμού εφόσον αυτή ήταν θετική,

αποτέλεσμα της αιμοκαλλιέργειας και του είδους του μικροοργανισμού

εφόσον αυτή ήταν θετική, αποτέλεσμα της PCR στο αρχικό δείγμα του

ασκιτικού υγρού με χρήση ζεύγους εκκινητών για το γονίδιο της β2

σφαιρίνης, αποτέλεσμα της PCR στο αρχικό δείγμα του ασκιτικού υγρού,

101


αποτέλεσμα της PCR στο υγρό του φιαλιδίου, αποτέλεσμα του

sequencing (αν είχε πραγματοποιηθεί) στο προϊόν της PCR.

Επεξηγήσεις της καταγραφής

ΟΝΟΜΑΤΕΠΩΝΥΜΟ ΦΥΛΟ ΗΛΙΚΙΑ ΚΛΙΝΙΚΗ ΧΡΩΜΑ ΟΨΗ

ΑΠΟΛΥΤΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ

ΠΟΛΥΜΟΡΦΟΠΥΡΗΝΩΝ

ΑΡΙΘΜΟΣ

ΕΡΥΘΡΩΝ

ΓΛΥΚΟΖΗ ΑΛΒΟΥΜΙΝΗ LDH

102


ΛΕΥΚΩΜΑ GRADIENT ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ

ΑΣΚΙΤΙΚΟΥ

(σε φιαλίδια)

ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΟ

ΕΙΔΟΣ

SBP ΤΥΠΟΣ

SBP

ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ

ΑΙΜΑΤΟΣ

ΒΑΚΤΗΡΙΑΚΟ

ΕΙΔΟΣ

16S rRNA

ΣΤΟ

ΑΣΚΙΤΙΚΟ

β2 ΣΤΟ

ΑΣΚΙΤΙΚΟ

SEQUENCING

ΣΤΟ

ΑΣΚΙΤΙΚΟ

16S rRNA ΣΤΟ

ΦΙΑΛΙΔΙΟ (της

καλλιέργειας του

ασκιτικού)

β2 ΣΤΟ

ΦΙΑΛΙΔΙΟ

SEQUENCING

ΣΤΟ ΦΙΑΛΙΔΙΟ

ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΗ

ΑΝΤΙΜΙΚΡΟΒΙΑ

ΚΗ ΘΕΡΑΠΕΙΑ

103


ΚΕΦΑΛΑΙΟ 3°ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Από τους 150 ασθενείς, 106 ήταν άντρες (70,67%) και 44 ήταν

γυναίκες (29,33%). Ο μέσος όρος ηλικίας των 150 ασθενών ήταν 67,9

έτη. Το ηλικιακό εύρος των ασθενών ήταν 25-86 έτη.

Από το σύνολο των ασθενών του δείγματος, στους 111 (74%) η

διαφορά-κλίση της λευκωματίνης (gradient) στο ασκιτικό υγρό

υπολογίστηκε >1,1 g/dl και στους 39 (26%) ήταν <1,1 g/dl. Δηλαδή οι

111 ασθενείς είχαν ασκίτη πυλαίας υπέρτασης και οι 39 ασκίτη μη

σχετιζόμενο με πυλαία υπέρταση.

Διάγραμμα 1: Καταννμή των ασθενών ασκίτη πυλαίας και μη πυλαίας υπέρτασης (n=150)

Από τους 111 ασθενείς με ασκίτη πυλαίας υπέρτασης οι 32

(28,8%) είχαν αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα.

3.1. Ομάδα ασθενών με ασκίτη μη σχετιζόμενν με πυλαία υπέρταση

Στην ομάδα των ασθενών με ασκίτη μη σχετιζόμενο με πυλαία

υπέρταση ανήκαν 39 ασθενείς. Οι 26 ήταν άντρες και οι 13 γυναίκες. Ο

μέσος όρος ηλικίας ήταν 65 έτη, με εύρος 25-86. Οι μέσες τιμές των

αποτελέσματων των εργαστηριακών εξετάσεων στις οποίες υποβλήθηκε

104


το ασκιτικό υγρό των ασθενών με ασκίτη μη πυλαίας υπέρτασης

παρουσιάζονται στον πίνακα 9. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται ως μέσες

τιμές ± SD.

ΕΞΕΤΑΣΗ min max Mean± SD

Απόλυτος αριθμός

πολυμορφοπυρήνων(mm )

16 69310 6780,8±15354,2

Ερυθρά (/mm3) 5 750000 6668±14868868

Αλβουμίνη (g/dl) 0,7 3 1,96±0,71

Γλυκόζη (mg/dl) 1 1130 127,2±194

LDH (IU/l) 51 14479 1066±2813

Λεύκωμα (g/dl) 1 6,5 3,78±1.69

Πίνακας 9: Εργαστηριακές τιμές ασθενών με ασκίτη μη πυλαίας υπέρτασης (n=39)

Εξετάζοντας τους 39 ασθενείς ως προς το χρώμα του ασκιτικού

υγρού βρέθηκε ότι οι 27 είχαν κίτρινο χρώμα, οι 3 πορτοκαλόχροο, οι 4

ροδόχροο και οι 5 αιματηρό.

Διάγραμμα 2: Χρώμα ασκιτικού υγρού στους ασθενείς με ασκίτη μη πυλαίας υπέρτασης(η=39)

Αντίστοιχα ως προς την όψη του ασκιτικού υγρού, οι 14 είχαν

διαυγή όψη, οι 16 θολή και οι 9 ελαφρώς θολή όψη.

105


Διάγραμμα 3: Όψη ασκιτικού υγρού στους ασθενείς με ασκίτη μη πυλαίας υπέρτασης (n-39)

Οι 5 από αυτούς είχαν δευτεροπαθή περιτονίτιδα. Και στις 5

περιπτώσεις αναπτύχθηκε E sch er ich ia coli. Όλα τα ασκιτικά υγρά με

δευτεροπαθή περιτονίτιδα είχαν θολή όψη, ο απόλυτος αριθμός των

λευκών είχε μέση τιμή 13175/mm3 και η μέση τιμή της γλυκόζης ήταν

35,6 mg/dl.

Στην ομάδα των ασθενών με ασκίτη μη σχετιζόμενο με πυλαία

υπέρταση, η εφαρμογή της ευρέος φάσματος PCR στο ασκιτικό υγρό,

ανίχνευσε βακτηριακό DNA σε 8 ασθενείς. Η καλλιέργεια του ασκιτικού

υγρού σε 3 από αυτούς τους ασθενείς ήταν στείρα, αλλά στους

υπόλοιπους 5 ασθενείς η καλλιέργεια ήταν θετική και ο μικροοργανισμός

που αναπτύχθηκε ταυτοποιήθηκε ως E sch er ich ia co li . Επρόκειτο για τις

5 περιπτώσεις δευτεροπαθούς περιτονίτιδας. Παρόλου που η εφαρμογή

της ευρέος φάσματος PCR στο ασκιτικό υγρό ανίχνευσε βακτηριακό

DNA σε 8 ασθενείς της ομάδας αυτής, σε κανέναν από αυτούς δεν

ταυτοποιήθηκε το γενετικό υλικό συγκεκριμένου μικροοργανισμού κατά

την ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας με sequencing.

Στην ίδια ομάδα ασθενών η εφαρμογή της ίδιας μεθόδου (16S

rRNA) στο υγρό του φιαλιδίου της αιμοκαλλιέργειας μετά από επώαση

106


ανίχνευσε βακτηριακό DNA σε 8 ασθενείς. Στους 5 ασθενείς των οποίων

η καλλιέργεια ήταν θετική για E sch er ich ia co li ταυτοποιήθηκε γενετικό

υλικό E .co li με την ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας. Στους

υπόλοιπους 3 από τους 8 ασθενείς με θετική PCR, οι οποίοι είχαν στείρα

καλλιέργεια δεν ταυτοποιήθηκε γενετικό υλικό συγκεκριμένου

μικροοργανισμού με το sequencing.

3.2.α Ομάδα ασθενών με ασκίτη πυλαίας υπέρτασης που δεν

πληρούσαν τα κριτήρια της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας

Στην ομάδα των ασθενών με ασκίτη πυλαίας υπέρτασης που δεν

πληρούσαν τα κριτήρια για να χαρακτηριστούν ως αυτόματη βακτηριακήΛ

περιτονίτιδα, (απόλυτος αριθμός πολυμορφοπυρήνων < 250/mm),

ανήκαν 79 ασθενείς. Οι 57 από αυτούς ήταν άντρες και οι 22 γυναίκες. Ο

μέσος όρος ηλικίας ήταν 70 έτη, με εύρος 42-85. Οι μέσες τιμές των

αποτελέσματων των εργαστηριακών εξετάσεων στις οποίες υποβλήθηκε

το ασκιτικό υγρό των ασθενών με ασκίτη πυλαίας υπέρτασης

παρουσιάζονται στον πίνακα 10. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως

μέσες τιμές ± SD.


Απόλυτος αριθμός 30 222 154,5±14,1ο

πολυμορφοπυρήνων(/mm )

Ερυθρά (/mm3) 30 70000 3685±9255

Αλβουμίνη(g/dl) 0,2 2,8 0,99±0.62

Γλυκόζη (mg/dl) 66 307 135±47

LDH (IU/l) 27 699 151,5±153,1

Λεύκωμα (g/dl) 0,25 4,5 2,02±1.06

Πίνακας 10: Εργαστηριακές τιμές ασθενών με ασκίτη πυλαίας υπέρτασης

107


Εξετάζοντας τους 79 ασθενείς με ασκίτη ως προς το χρώμα του

ασκιτικού υγρού βρέθηκε ότι οι 64 είχαν κίτρινο χρώμα, οι 9

πορτοκαλόχροο, οι 3 ροδόχροο και οι 3 αιματηρό.

Διάγραμμα 4: Χρώμα ασκιτικού υγρού στους ασθενείς με πυλαία υπέρταση (όχι ΑΒΠ) (n=79)

Αντίστοιχα ως προς την όψη του ασκιτικού υγρού, οι 37 είχαν

διαυγή όψη, οι 20 θολή και οι 22 ελαφρώς θολή όψη.

Διάγραμμα 5 : Οψη ασκιτικού υγρού στους ασθενείς με πυλαία υπέρταση (όχι ΑΒΠ) (n=79)

Σε 4 από τους 79 αυτούς ασθενείς ανιχνεύθηκε η παρουσία

βακτηριακού DNA στο ασκιτικό υγρό με την εφαρμογή της 16S rRNA

PCR. Σε κανέναν όμως από αυτούς η ανάλυση της νουκλεοτιδικής

αλληλουχίας δεν ταυτοποίησε γενετικού υλικού συγκεκριμένου

108


μικροοργανισμού. Οι ασθενείς αυτοί είχαν στείρα καλλιέργεια ασκιτικού

υγρού.

Με την εφαρμογή της 16S rRNA PCR στο φιαλίδιο της

αιμοκαλλιέργειας ανιχνεύθηκε βακτηριακό DNA σε 5 από τους 79

ασθενείς, αλλά και πάλι το sequencing δεν ταυτοποίησε γενετικό υλικό

συγκεκριμένου μικροοργανισμού. Η καλλιέργεια του ασκιτικού υγρού

των ασθενών αυτών ήταν στείρα.

3.2.β Ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα

Οι ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα ήταν 32. Από

αυτούς οι 23 ήταν άνδρες και οι 9 γυναίκες. Ο μέσος όρος ηλικίας τους

ήταν 65±8,8 έτη.

Εξετάζοντας τους 32 ασθενείς ως προς το χρώμα του ασκιτικού

υγρού βρέθηκε ότι οι 24 είχαν κίτρινο χρώμα, οι 5 πορτοκαλόχροο, ο 1

ροδόχροο και οι 2 αιματηρό.

Διάγραμμα 6:Χρώμα ασκιτικού υγρού σε ασθενείς με ΑΒΠ (n=32)

Από τους 32 ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα, οι 7

είχαν ασκιτικό υγρό με διαυγή όψη, στους 22 είχε θολή όψη και στους 3

είχε ελαφρώς θολή όψη.

109


Διάγραμμα 7: Όψη ασκιτικού υγρού σε ασθενείς με ΑΒΠ (n=32)

Οι μέσες τιμές των αποτελέσματων των εργαστηριακών εξετάσεων

στις οποία υποβλήθηκε το ασκιτικό υγρό των ασθενών με αυτόματη

βακτηριακή περιτονίτιδα παρουσιάζονται στον πίνακα 11. Τα

αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± SD.


Απόλυτος αριθμός

πολυμορφοπυρήνων(/mm )

230 3680 811.43±990.7

Ερυθράί/mm3) 10 14000 18792.0±80671,12

Αλβουμίνη(μ/ά1) 0.3 2.5 0.650±0.75

Γλυκόζη^μ/ώ) 52 164 113.50±39.63

LDH(IU/1) 40 2247 217.80±482.22

Λεύκωμα(μ/ά1) 1.0 6.36 1.85±1.46

Πίνακας 11:Εργαστηριακά ευρήματα ασθενών με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα (n=32)

Σύμφωνα με όσα έχουν αναφερθεί για τον διαχωρισμό των

περιπτώσεων αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας σε υποτύπους, από

τους 32 ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα οι 3 (9,4%)

ανήκαν στην κλασική αυτόματη περιτονίτιδα, οι 28 (87,5%) είχαν

110


πολυμορφοπυρηνικό ασκίτη και ένας (3,1%) μονομικροβιακό μη

ουδετεροφιλικό ασκίτη.

Διάγραμμα 8: Υποτύποι αυτόματης βακτηρακής περιτονίτιδας (n=32)

Σε 4 από τους 32 (12,5%) ασθενείς η καλλιέργεια ήταν θετική. Και

στους 4 αυτούς ασθενείς ο μικροοργανισμός που απομονώθηκε ήταν

E sch er ich ia coli. Ο έλεγχος ευαισθησίας έναντι των διάφορων

αντιμικροβιακών παραγόντων αποκάλυψε ότι και τα 4 ήταν στελέχη που

παρήγαγαν ευρέος φάσματος β-λακταμάσες (ESBL).

Κατά την εφαρμογή των μοριακών τεχνικών που περιγράφηκαν

ανωτέρω, στο ασκιτικό υγρό των ασθενών με αυτόματη βακτηριακή

περιτονίτιδα, η PCR για τη β2 σφαιρίνη ήταν θετική και στα 32 δείγματα,

γεγονός που επιβεβαιώνει την ορθή εξαγωγή DNA και την απουσία

αναστολέων της PCR. Στην εικόνα 5 παρουσιάζεται μια ηλεκτροφόρηση

των αποτελεσμάτων PCR για β2 σφαιρίνη (ladder, 3 θετικά δείγματα,

αρνητικός και θετικός μάρτυρας). Ωστόσο, η PCR για το 1 6 S rD N A, όταν

εφαρμόστηκε απευθείας στο ασκιτικό υγρό ήταν θετική σε 5 δείγματα. Η

ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας με sequencing που

ακολούθησε στη συνέχεια, ταυτοποίησε γενετικό υλικό E .co li σε ένα

μόνο δείγμα, ενώ στα υπόλοιπα 4 δείγματα δεν υπήρξε ταυτοποίηση

συγκεκριμένου μικροοργανισμού, καθώς το γενετικό υλικό που είχε

δώσει θετικό σήμα στην PCR ήταν μικτό (mix). Το γεγονός αυτό

111


υποδηλώνει ύπαρξη στο κλινικό δείγμα, γενετικού υλικού περισσοτέρων

του ενός μικροοργανισμών. Η καλλιέργεια του ασκιτικού υγρού για το

δείγμα στο οποίο υπήρξε ταυτοποίηση γενετικού υλικού E .co li ανέπτυξε

στη συνέχεια τον ίδιο μικροοργανισμό. Το αποτέλεσμα της PCR

προηγήθηκε κατά 3 ημερών της καλλιέργειας. Συγκρίνοντας τα

αποτελέσματα της καλλιέργειας με αυτά των μοριακών μεθόδων,

βρέθηκε ότι μόνο σε ένα υπήρχε συμβατότητα στην ανίχνευση-

ταυτοποίηση του μικροοργανισμού. Όσον αφορά στα υπόλοιπα 4

δείγματα στα οποία ανιχνεύθηκε βακτηριακό γενετικό υλικό και δεν

υπήρξε ταυτοποίηση συγκεκριμένου μικροοργανισμού, τα 3 είχαν στείρα

καλλιέργεια, ενώ στο 1 η καλλιέργεια έδωσε θετικό σήμα και

αναπτύχθηκε E .co li.

Εικόνα 5: Ηλεκτροφόρηση PCR β2 σφαιρίνης

Από την άλλη μεριά, η εφαρμογή της 16S rRNA PCR στο

επεξεργασμένο υγρό των φιαλιδίων αιμοκαλλιέργειας, στα οποία είχε

ενοφθαλμιστεί αρχικά το ασκιτικό υγρό (μετά το πέρας της επώασης),

112


έδωσε θετικό σήμα σε 7 δείγματα. Στην εικόνα 6 παρουσιάζεται μια

ηλεκτροφόρηση των αποτελεσμάτων PCR για 1 6 S rR N A (ladder, ένα

αρνητικό δείγμα, δύο θετικά δείγματα, αρνητικός και θετικός μάρτυρας).

Η ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας με sequencing ταυτοποίησε

γενετικό υλικό E .co li σε 4 δείγματα. Τα δείγματα αυτά ήταν τα ίδια που

είχαν θετική καλλιέργεια ασκιτικού υγρού. Σε 2 δείγματα το αποτέλεσμα

του sequencing δεν ήταν ενδεικτικό κάποιου μικροοργανισμού (mix). Τα

δείγματα αυτά είχαν στείρα καλλιέργεια ασκιτικού υγρού. Σε ένα δείγμα

το αποτέλεσμα του sequencing αποκάλυψε γενετικό υλικό B ru ce lla

m elitensis . Η καλλιέργεια του ασκιτικού υγρού αυτού του ασθενούς ήταν

στείρα, παρά την παρατεταμένη επώαση των 14 ημερών. Ωστόσο ο ίδιος

μικροοργανισμός απομονώθηκε σε αιμοκαλλιέργεια του ασθενούς.

Σημειώνεται ότι οι αιμοκαλλιέργειες των υπόλοιπων ασθενών με

αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα ήταν στείρες.

Εικόνα 6: Ηλεκτροφόρηση PCR 16S rRNA

Για κάθε μια από τις μεθόδους που χρησιμοποιήθηκαν (16S rRNA

PCR στο ασκιτικό υγρό και 16S rRNA PCR στο περιεχόμενο των

φιαλιδίων των αιμοκαλλιεργειών στα οποία είχε ενοφθαλμιστεί το

ασκιτικό υγρό ) και με βάση τα αληθώς θετικά αποτελέματα (ΑΘ), τα

113


αληθώς αρνητικά (ΑΑ), τα ψευδώς θετικά (ΨΘ) και τα ψευδώς αρνητικά

(ΨΑ), τα οποία συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα των καλλιεργειών του

ασκιτικού υγρού, υπολογίστηκε η θετική προγνωστική αξία (PPV), η

αρνητική προγνωστική αξία (NPV), η ευαισθησία και η ειδικότητα. Στον

Πίνακα 12 παρουσιάζονται τα αποτελέσματα αυτά.

Μέθοδος ΑΘ ΑΑ ΦΘ ΦΑ Ευαισθησία% Ειδικότητα

%

PPV NPV

16SrRNA

στο

ασκιτικό

υγρό

1 28 0 3 25 100 100 90.32

16SrRNA

στο

φιαλίδιο

4 27 1* 0 100 96.42 80 100

Πίνακας 12: Συνοπτικά αποτελέσματα μεθόδου στους ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα

1* το αποτέλεσμα αντιστοιχεί στο δείγμα του ασθενούς με τη βρουκέλλωση

114


ΚΕΦΑΛΑΙΟ 4°ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Η αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα είναι μια σοβαρή επιπλοκή

σε ασθενείς με κίρρωση και ασκίτη. Η απομόνωση και ταυτοποίηση του

αιτιολογικού παράγοντα αυτής της επιπλοκής είναι δύσκολη, γιατί η

συγκέντρωση του μικροοργανισμού στο ασκιτικό υγρό, είναι πολύ

χαμηλή (1 μικροοργανισμός ανά ml). Η χρησιμότητα των μοριακών

τεχνικών στην ανίχνευση του αιτιολογικού παράγοντα της επιπλοκής

αυτής, καθώς και η κλινική σημασία των αποτελεσμάτων έχουν

απασχολήσει πολλές έρευνες.

Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης, ο

συνδυασμός της κλασικής καλλιέργειας του ασκιτικού υγρού (σε

φιαλίδια αιμοκαλλιεργειών) με την εφαρμογή μοριακών τεχνικών (16S

rRNA PCR) είχε ως αποτέλεσμα την ταυτοποίηση του αιτιολογικού

παράγοντα της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας σε 5 από τους 32

ασθενείς που εμφάνιζαν αυτήν την κλινική οντότητα,

συμπεριλαμβανομένου και ενός ασθενή με βρουκέλλωση. Η παράταση

της περιόδου επώασης φαίνεται να αυξάνει την ευαισθησία. Επιπλέον η

εφαρμογή της 16S rRNA PCR απευθείας στο ασκιτικό υγρό εμφανίζει

υψηλή ειδικότητα (100%), αλλά χαμηλή ευαισθησία (25%).

Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκαν 150 ασκιτικά υγρά από

διαφορετικούς ασθενείς (111 με ασκίτη πυλαίας υπέρτασης και 39 με

ασκίτη μη πυλαίας υπέρτασης). Σε 32 από τους 111 ασθενείς με ασκίτη

πυλαίας υπέρτασης διαπιστώθηκε αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα.

Στα δείγματα αυτά εφαρμόστηκε 16S rRNA PCR τόσο στο ασκιτικό

υγρό, όσο και στο φιαλίδιο της αιμοκαλλιέργειας που περιείχε το υγρό.

Η εφαρμογή της ευρέος φάσματος PCR απευθείας στο ασκιτικό

υγρό των ασθενών ταυτοποίησε τον αιτιολογικό παράγοντα σε 1 από

τους 4 ασθενείς με αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα και θετική

115


καλλιέργεια ασκιτικού υγρού, σε χρονικό διάστημα κατά πολύ μικρότερο

από τον χρόνο που χρειάστηκαν οι κλασικές μέθοδοι. Ωστόσο στο

ασκιτικό υγρό 1 από αυτούς τους 4 ασθενείς ανιχνεύθηκε βακτηριακό

DNA, που δεν κατέστη δυνατό να ταυτιστεί με συγκεκριμένο

μικροοργανισμό κατά την ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας

(sequencing) που ακολούθησε. Επιπλέον, στους άλλους 2 από αυτούς

τους 4 ασθενείς με θετική καλλιέργεια ασκιτικού υγρού η PCR δεν

ανίχνευσε βακτηριακό DNA. Με την εφαρμογή της ευρέος φάσματος

PCR στο ασκιτικό υγρό, δεν έγινε δυνατή η ταυτοποίηση του

αιτιολογικού παράγοντα της λοίμωξης στις 5 περιπτώσεις δευτεροπαθούς

περιτονίτιδας που περιελήφθησαν στην μελέτη. Στις περιπτώσεις αυτές

το θετικό αποτέλεσμα της PCR δεν ακολουθήθηκε από ταυτοποίηση

γενετικού υλικού συγκεκριμένου μικροοργανισμού, καθώς το γενετικό

υλικό που είχε δώσει θετικό σήμα στην PCR ήταν μικτό (mix). Το

γεγονός αυτό είναι αναμενόμενο καθώς πολλές φορές οι δευτεροπαθείς

περιτονίτιδες έχουν πολυμικροβιακή αιτιολογία .

Ένα από τα προβλήματα που παρουσιάστηκαν κατά την διάρκεια

της μελέτης αυτής ήταν ότι το θετικό για παρουσία βακτηριακού DNA

αποτέλεσμα της PCR δεν ακολουθούνταν από ταυτοποίηση

συγκεκριμένου μικροοργανισμού κατά το sequencing. Τα αποτελέσματα

αυτά έρχονται σε αντίθεση με τα αποτελέσματα άλλων ερευνών [123]

[124] που έχουν χρησιμοποιήσει μεθοδολογία παρόμοια με αυτής της

μελέτης. Στις μελέτες αυτές το θετικό αποτέλεσμα της ευρέος φάσματος

PCR ακολουθείται κατά κανόνα από ταυτοποίηση του γενετικού υλικού

συγκεκριμένου μικροοργανισμού κατά την ανάλυση της νουκλεοτιδικής

αλληλουχίας. Παρόμοιο φαινόμενο παρατηρείται όμως και σε άλλες

μελέτες [129]. Το γεγονός αυτό μπορεί να οφείλεται είτε σε χαμηλή

συγκέντρωση του βακτηριακού DNA στο προϊόν της PCR, που δεν

επιτρέπει την σωστή ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας, είτε σε

116


επιμόλυνση του δείγματος κατά την επεξεργασία του, με αποτέλεσμα την

παρουσία γενετικού υλικού περισσότερων του ενός βακτηρίων στο

προϊόν της PCR. Ακόμα, η περιγραφή πολυμικροβιακών καλλιεργειών σε

μεγάλο ποσοστό στα πειραματόζωα κατά τη διάρκεια επεισοδίων

βακτηριακής διαμετάθεσης [133], θα μπορούσε να εγείρει το ερώτημα αν

αυτό το φαινόμενο παρατηρείται και στους ανθρώπους.

Η ανίχνευση βακτηριακού DNA σε δείγματα με στείρα

καλλιέργεια ασκιτικού υγρού (ιδιαίτερα όταν δεν ακολουθείται από

αποτέλεσματα κατά την ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας), σε

ασθενείς χωρίς αύξηση των πολυμορφοπύρηνων στο ασκιτικό υγρό, που

δεν εμφανίζουν κλινικές ενδείξεις φλεγμονής, μπορεί να αντιστοιχεί σε

περιπτώσεις παροδικής παρουσίας μη ζώντων βακτηρίων στο ασκιτικό

υγρό και όχι σε περιπτώσεις βακτηριακής διαμετάθεσης.

Το φαινόμενο της μη ανίχνευσης βακτηριακού DNA σε ασκιτικό

υγρό, στο οποίο στη συνέχεια κατά την καλλιέργεια αναπτύχθηκε

μικροοργανισμός παρατηρείται και σε άλλες μελέτες [125] [134] [129].

Στην πιο γνωστή από αυτές, μια βραζιλιάνικη μελέτη σε παιδιατρικούς

ασθενείς, δεν ανιχνεύθηκε βακτηριακό DNA σε ασκιτικό υγρό που

ανέπτυξε στη συνέχεια Gram θετικό βακτηρίδιο [125]. Αυτό μπορεί να

οφείλεται είτε σε επιμόλυνση της καλλιέργειας του ασκιτικού υγρού, είτε

σε χαμηλή αναλυτική ευαισθησία της μεθόδου, ίσως λόγω λάθους

σχεδιασμού των εκκινητών, έτσι ώστε να μην περιλαμβάνουν το 1 6 S

rR N A του συγκεκριμένου βακτηρίου.

Η εφαρμογή της ευρέος φάσματος PCR στο περιεχόμενο του

φιαλιδίου της αιμοκαλλιέργειας, στο οποίο ενοφθαλμίστηκε αρχικά το

ασκιτικό υγρό, είχε ως αποτέλεσμα την ανίχνευση και την ταυτοποίηση

του μικροοργανισμού σε όλες τις περιπτώσεις περιτονίτιδας με θετική

καλλιέργεια (5 περιπτώσεις δευτεροπαθούς περιτονίδας και 4

περιπτώσεις αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας με θετική

117


καλλιέργεια), όπως αναμενόταν. Ακόμα, σε μια περίπτωση αυτόματης

βακτηριακής περιτονίτιδας, με στείρα καλλιέργεια ασκιτικού υγρού, κατά

την ανάλυση της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ταυτοποιήθηκε γενετικό

υλικό B ru c e lla m elitensis . Ο μικροοργανισμός αυτός έχει περιγραφεί ως

σπάνιο αίτιο αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας [135] [136] [137]. Σε

ενδημικές περιοχές, όπως η περιοχή μας, θα πρέπει να λαμβάνεται

υπόψιν η πιθανή εμπλοκή της B ru c e lla sp p σε περιπτώσεις αυτόματης

βακτηριακής περιτονίτιδας. Με την παρούσα μελέτη αποκαλύφθηκε ο

αιτιολογικός παράγοντας της αυτόματης βακτηριακής περιτονίτιδας σε

έναν ασθενή με αρνητική καλλιέργεια ασκιτικού υγρού, εφαρμόζοντας

ευρέος φάσματος PCR στο φιαλίδιο της αιμοκαλλιέργειας που περιείχε

το ασκιτικό υγρό. Ο μικροοργανισμός αυτός ήταν η B .m e liten s is , ένα

βακτήριο απαιτητικό ως προς την ανάπτυξή του, που απαιτεί στοχευμένη

αντιμικροβιακή θεραπεία.

Η παρούσα μελέτη δεν περιλαμβάνει στοιχεία για την έκβαση και

την κλινική πορεία των ασθενών με αρνητική καλλιέργεια στους οποίους

ανιχνεύθηκε βακτηριακό DNA. Ειδικά στους ασθενείς με αριθμόΛ

πολυμορφοπυρήνων < 250/mm η παρουσία γενετικού υλικού βακτηρίων

στο ασκιτικό υγρό, θα μπορούσε να οφείλεται σε παροδικό αποικισμό

του ασκιτικού υγρού από ζώντα ή μη βακτήρια, χωρίς την πρόκληση

φλεγμονώδους αντίδρασης. Έτσι δεν είναι δυνατό να συζητηθεί αν το

εργαστηριακό αυτό εύρημα έχει χρησιμότητα στην πρόγνωση των

ασθενών αυτών ή αν μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ανεξάρτητος

παράγοντας κινδύνου. Ένας ακόμα περιορισμός της μεθοδολογίας που

περιγράφεται στην παρούσα μελέτη είναι η μη εφαρμογή των μοριακών

μεθόδων και σε δείγμα αίματος των ασθενών. Ίσως θα ήταν χρήσιμο στο

μέλλον να ανακτηθούν τα στοιχεία αυτά για να διερευνηθεί η σχέση τους.

Συμπερασματικά, με τη μελέτη αυτή προτείνεται ένα νέο

πρωτόκολλο για την καλλιέργεια του ασκιτικού υγρού των ασθενών με

118


αυτόματη βακτηριακή περιτονίτιδα. Το πρωτόκολλο αυτό περιλαμβάνει

την παράταση του χρόνου επώασης σε 14 ημέρες, και στην περίπτωση

που η καλλιέργεια παραμένει στείρα μετά την πάροδο των 14 ημερών,

προτείνεται η εφαρμογή 16S rRNA PCR στο περιεχόμενο των φιαλιδίων

στα οποία ενοφθαλμίστηκε το ασκιτικό υγρό. Σύμφωνα με τα δεδομένα

της παρούσας μελέτης , ο συνδυασμός της κλασικής καλλιέργειας με την

16S rRNA PCR αυξάνει την πιθανότητα ταυτοποίησης του

μικροοργανισμού που είναι υπεύθυνος για την λοίμωξη.

119


ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

[1] Schiffs Diseases of the Liver, 12th Edition. WileyCom n.d. https://www.wiley.com/en-us/Schiff%27s+Diseases+of+the+Liver%2C+12th+Edition-p-9781119251224 (accessed June 7, 2018).

[2] Νταλέκος Γ. ΠΑΘΗΣΕΙΣ ΤΟΥ ΗΠΑΤΟΣ , ΤΩΝ ΧΟΛΗΦΟΡΩΝ ΟΔΩΝ ΚΑΙ ΤΟΥ ΠΑΓΚΡΕΑΤΟΣ. Λάρισα: Ιατρικό Τμήμα Λάρισας, Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας; 1999.

[3] CURRENT Medical Diagnosis and Treatment 2018, 57th Edition: 9781259861482: Medicine & Health Science Books @ Amazon.com n.d. https://www.amazon.com/CURRENT-Medical-Diagnosis-Treatment- 2018/dp/1259861481 (accessed June 7, 2018).

[4] Moore KP, Wong F, Gines P, Bernardi M, Ochs A, Salerno F, et al. The management of ascites in cirrhosis: report on the consensus conference of the International Ascites Club. Hepatol Baltim Md 2003;38:258-66. doi:10.1053/jhep.2003.50315.

[5] Arroyo V, Gines P, Gerbes AL, Dudley FJ, Gentilini P, Laffi G, et al.Definition and diagnostic criteria of refractory ascites and hepatorenal syndrome in cirrhosis. International Ascites Club. Hepatol Baltim Md 1996;23:164-76. doi:10.1002/hep.510230122.

[6] Runyon BA. Cardiac ascites: a characterization. J Clin Gastroenterol 1988;10:410-2.

[7] Harrison’s Principles of Internal Medicine, 19th Edition Textbook n.d. http://www.harrisonsim.com/ (accessed June 7, 2018).

[8] Van Wettere M, Bruno O, Rautou P-E, Vilgrain V, Ronot M. Diagnosis of Budd-Chiari syndrome. Abdom Radiol N Y 2017. doi:10.1007/s00261-017- 1447-2.

[9] Mufti AR, Reau N. Liver disease in pregnancy. Clin Liver Dis 2012;16:247-69. doi: 10.1016/j .cld.2012.03.011.

[10] Bhardwaj R, Vaziri H, Gautam A, Ballesteros E, Karimeddini D, Wu GY. Chylous Ascites: A Review of Pathogenesis, Diagnosis and Treatment. J Clin Transl Hepatol 2018;6:105-13. doi:10.14218/JCTH.2017.00035.

[11] Lopez-Gutierrez JC, Tovar JA. Chylothorax and chylous ascites: management and pitfalls. Semin Pediatr Surg 2014;23:298-302. doi:10.1053/j.sempedsurg.2014.09.011.

[12] Mann SK, Mann NS. Pancreatic Ascites. Am J Gastroenterol 1979;71:186-92.[13] Kriger AG, Gorin DS, Kaldarov AR. [Pancreatogenic ascites in chronic

pancreatitis]. Khirurgiia (Sofiia) 2014:70-2.[14] Ackerman Z. Ascites in Nephrotic syndrome. Incidence, patients’

characteristics, and complications. J Clin Gastroenterol 1996;22:31-4.[15] Khalid S, Asad-Ur-Rahman F, Abbass A, Gordon D, Abusaada K. Myxedema

Ascites: A Rare Presentation of Uncontrolled Hypothyroidism. Cureus 2016;8:e912. doi:10.7759/cureus.912.

[16] Riker D, Goba D. Ovarian mass, pleural effusion, and ascites: revisiting Meigs syndrome. J Bronchol Interv Pulmonol 2013;20:48-51. doi:10.1097/LBR.0b013e31827ccb35.

[17] Krenke R, Maskey-Warzechowska M, Korczynski P, Zielinska-Krawczyk M, Klimiuk J, Chazan R, et al. Pleural Effusion in Meigs’ Syndrome-Transudate or

120


https://www.wiley.com/en-

https://www.amazon.com/CURRENT-Medical-Diagnosis-Treatment-2018/dp/1259861481

https://www.amazon.com/CURRENT-Medical-Diagnosis-Treatment-2018/dp/1259861481

http://www.harrisonsim.com/

Exudate?: Systematic Review of the Literature. Medicine (Baltimore) 2015;94:e2114. doi:10.1097/MD.0000000000002114.

[18] Liao Y-J, Wu C-Y, Lee S-W, Lee C-L, Yang S-S, Chang C-S, et al. Adenosine deaminase activity in tuberculous peritonitis among patients with underlying liver cirrhosis. World J Gastroenterol 2012;18:5260-5. doi:10.3748/wjg.v18.i37.5260.

[19] Saab S, Rickman LS, Lyche KD. Ascites and the acquired immunodeficiency syndrome. Report of 54 cases. Medicine (Baltimore) 1996;75:131-41.

[20] Liu F, Kong X, Dou Q, Ye J, Xu D, Shang H, et al. Evaluation of tumor markers for the differential diagnosis of benign and malignant ascites. Ann Hepatol 2014;13:357-63.

[21] Carr NJ. Current concepts in pseudomyxoma peritonei. Ann Pathol 2014;34:9- 13. doi:10.1016/j.annpat.2014.01.011.

[22] Runyon BA, Hoefs JC, Morgan TR. Ascitic fluid analysis in malignancy- related ascites. Hepatol Baltim Md 1988;8:1104-9.

[23] Gatselis NK, Skendros P, Ritis K, Dalekos GN. Severe liver involvement in two patients with long-term history of fever: remember familial Mediterranean fever. BMJ Case Rep 2016;2016. doi:10.1136/bcr-2016-216941.

[24] Yu C, Gershwin ME, Chang C. Diagnostic criteria for systemic lupus erythematosus: a critical review. J Autoimmun 2014;48-49:10-3. doi:10.1016/j.jaut.2014.01.004.

[25] Kadavath S, Efthimiou P. Adult-onset Still’s disease-pathogenesis, clinical manifestations, and new treatment options. Ann Med 2015;47:6-14. doi:10.3109/07853890.2014.971052.

[26] Witte CL, Witte MH. The portocardiorenal axis and refractory ascites: the underfilled cup runneth over. Hepatol Baltim Md 1989;10:114-6.

[27] Schrier RW, Arroyo V, Bernardi M, Epstein M, Henriksen JH, Rodes J. Peripheral arterial vasodilation hypothesis: a proposal for the initiation of renal sodium and water retention in cirrhosis. Hepatol Baltim Md 1988;8:1151-7.

[28] Runyon BA, Montano AA, Akriviadis EA, Antillon MR, Irving MA, McHutchison JG. The serum-ascites albumin gradient is superior to the exudate-transudate concept in the differential diagnosis of ascites. Ann Intern Med 1992;117:215-20.

[29] Hoefs JC. Serum protein concentration and portal pressure determine the ascitic fluid protein concentration in patients with chronic liver disease. J Lab Clin Med 1983;102:260-73.

[30] European Association for the Study of the Liver. Electronic address: [email protected], European Association for the Study of the Liver. EASL Clinical Practice Guidelines for the management of patients with decompensated cirrhosis. J Hepatol 2018. doi:10.1016/j.jhep.2018.03.024.

[31] Garcia-Tsao G. Current management of the complications of cirrhosis and portal hypertension: variceal hemorrhage, ascites, and spontaneous bacterial peritonitis. Gastroenterology 2001;120:726-48.

[32] Runyon BA, Practice Guidelines Committee, American Association for the Study of Liver Diseases (AASLD). Management of adult patients with ascites due to cirrhosis. Hepatol Baltim Md 2004;39:841-56. doi:10.1002/hep.20066.

[33] Caruntu FA, Benea L. Spontaneous bacterial peritonitis: pathogenesis, diagnosis, treatment. J Gastrointest Liver Dis JGLD 2006;15:51-6.

[34] Bar-Meir S, Lerner E, Conn HO. Analysis of ascitic fluid in cirrhosis. Dig Dis Sci 1979;24:136-44.

121


mailto:[email protected]

[35] Hoefs JC. Increase in ascites white blood cell and protein concentrations during diuresis in patients with chronic liver disease. Hepatol Baltim Md 1981; 1:249— 54.

[36] Tadataka Yamada MD, David H Alpers MD, Loren Laine MD, Neil Kaplowitz MD, Chung Owyang, MD, Don W Powell MD, Tadataka Yamada MD, David H Alpers MD, Loren Laine MD, Neil Kaplowitz MD, Chung Owyang, MD, Don W Powell MD. Yamada’s textbook of Gastroenterology. 4th edition, 2003.

[37] van de Geijn G-JM, van Gent M, van Pul-Bom N, Beunis MH, van Tilburg AJP, Njo TL. A new flow cytometric method for differential cell counting in ascitic fluid. Cytometry B Clin Cytom 2016;90:506-11. doi:10.1002/cyto.b.21171.

[38] Fleming C, Brouwer R, van Alphen A, Lindemans J, de Jonge R. UF-1000i: validation of the body fluid mode for counting cells in body fluids. Clin Chem Lab Med 2014;52:1781-90. doi:10.1515/cclm-2014-0512.

[39] Gulberg V, Gerbes AL, Sauerbruch T, Appenrodt B. Insufficient sensitivity of reagent strips for spontaneous bacterial peritonitis. Hepatol Baltim Md 2007;46:1669; author reply 1669-1670. doi:10.1002/hep.21856.

[40] Sampliner RE, Iber FL. High protein ascites in patients with uncomplicated hepatic cirrhosis. Am J Med Sci 1974;267:275-9.

[41] Runyon BA. Low-protein-concentration ascitic fluid is predisposed to spontaneous bacterial peritonitis. Gastroenterology 1986;91:1343-6.

[42] Runyon BA, Hoefs JC. Ascitic fluid chemical analysis before, during and after spontaneous bacterial peritonitis. Hepatol Baltim Md 1985;5:257-9.

[43] Runyon BA, Antillon MR, Akriviadis EA, McHutchison JG. Bedside inoculation of blood culture bottles with ascitic fluid is superior to delayed inoculation in the detection of spontaneous bacterial peritonitis. J Clin Microbiol 1990;28:2811-2.

[44] Runyon BA, Canawati HN, Akriviadis EA. Optimization of ascitic fluid culture technique. Gastroenterology 1988;95:1351-5.

[45] Akriviadis EA, Runyon BA. Utility of an algorithm in differentiating spontaneous from secondary bacterial peritonitis. Gastroenterology 1990;98:127-33.

[46] Runyon BA, Hoefs JC. Ascitic fluid analysis in the differentiation of spontaneous bacterial peritonitis from gastrointestinal tract perforation into ascitic fluid. Hepatol Baltim Md 1984;4:447-50.

[47] DiBonito L, Falconieri G, Colautti I, Bonifacio D, Dudine S. The positive peritoneal effusion. A retrospective study of cytopathologic diagnoses with autopsy confirmation. Acta Cytol 1993;37:483-8.

[48] Runyon BA, Akriviadis EA, Keyser AJ. The opacity of portal hypertension- related ascites correlates with the fluid’s triglyceride concentration. Am J Clin Pathol 1991;96:142-3.

[49] Conn HO, Fessel JM. Spontaneous bacterial peritonitis in cirrhosis: variations on a theme. Medicine (Baltimore) 1971;50:161-97.

[50] Piano S, Fasolato S, Salinas F, Romano A, Tonon M, Morando F, et al. The empirical antibiotic treatment of nosocomial spontaneous bacterial peritonitis: Results of a randomized, controlled clinical trial. Hepatol Baltim Md 2016;63:1299-309. doi:10.1002/hep.27941.

[51] Singal AK, Salameh H, Kamath PS. Prevalence and in-hospital mortality trends of infections among patients with cirrhosis: a nationwide study of hospitalised

122


patients in the United States. Aliment Pharmacol Ther 2014;40:105-12. doi:10.1111/apt.12797.

[52] Guarner C, Soriano G. Bacterial translocation and its consequences in patients with cirrhosis. Eur J Gastroenterol Hepatol 2005;17:27-31.

[53] Cheong HS, Kang C-I, Lee JA, Moon SY, Joung MK, Chung DR, et al.Clinical significance and outcome of nosocomial acquisition of spontaneous bacterial peritonitis in patients with liver cirrhosis. Clin Infect Dis Off Publ Infect Dis Soc Am 2009;48:1230-6. doi:10.1086/597585.

[54] Rimola A, Garcia-Tsao G, Navasa M, Piddock LJ, Planas R, Bernard B, et al. Diagnosis, treatment and prophylaxis of spontaneous bacterial peritonitis: a consensus document. International Ascites Club. J Hepatol 2000;32:142-53.

[55] Cirera I, Bauer TM, Navasa M, Vila J, Grande L, Taura P, et al. Bacterial translocation of enteric organisms in patients with cirrhosis. J Hepatol 2001;34:32-7.

[56] Rimola A, Soto R, Bory F, Arroyo V, Piera C, Rodes J. Reticuloendothelial system phagocytic activity in cirrhosis and its relation to bacterial infections and prognosis. Hepatol Baltim Md 1984;4:53-8.

[57] Runyon BA, Sugano S, Kanel G, Mellencamp MA. A rodent model of cirrhosis, ascites, and bacterial peritonitis. Gastroenterology 1991;100:489-93.

[58] Such J, Runyon BA. Spontaneous bacterial peritonitis. Clin Infect Dis Off Publ Infect Dis Soc Am 1998;27:669-74; quiz 675-6.

[59] Casafont Morencos F, de las Heras Castano G, Martin Ramos L, L0pez Arias MJ, Ledesma F, Pons Romero F. Small bowel bacterial overgrowth in patients with alcoholic cirrhosis. Dig Dis Sci 1996;41:552-6.

[60] Llovet JM, Bartoli R, March F, Planas R, Vinado B, Cabre E, et al.Translocated intestinal bacteria cause spontaneous bacterial peritonitis in cirrhotic rats: molecular epidemiologic evidence. J Hepatol 1998;28:307-13.

[61] Gines P, Rimola A, Planas R, Vargas V, Marco F, Almela M, et al. Norfloxacin prevents spontaneous bacterial peritonitis recurrence in cirrhosis: results of a double-blind, placebo-controlled trial. Hepatol Baltim Md 1990;12:716-24.

[62] Guarner C, Runyon BA, Heck M, Young S, Sheikh MY. Effect of long-term trimethoprim-sulfamethoxazole prophylaxis on ascites formation, bacterial translocation, spontaneous bacterial peritonitis, and survival in cirrhotic rats. Dig Dis Sci 1999;44:1957-62.

[63] Pardo A, Bartoli R, Lorenzo-Zύniga V, Planas R, Vinado B, Riba J, et al. Effect of cisapride on intestinal bacterial overgrowth and bacterial translocation in cirrhosis. Hepatol Baltim Md 2000;31:858-63. doi:10.1053/he.2000.5746.

[64] Perez-Paramo M, Munoz J, Albillos A, Freile I, Portero F, Santos M, et al. Effect of propranolol on the factors promoting bacterial translocation in cirrhotic rats with ascites. Hepatol Baltim Md 2000;31:43-8. doi:10.1002/hep.510310109.

[65] Sharma M, Rai K, Sharma SS, Gupta YK. Effect of antioxidants on pyrogallol- induced delay in gastric emptying in rats. Pharmacology 2000;60:90-6. doi:10.1159/000028352.

[66] Such J, Guardiola JV, de Juan J, Casellas JA, Pascual S, Aparicio JR, et al. Ultrastructural characteristics of distal duodenum mucosa in patients with cirrhosis. Eur J Gastroenterol Hepatol 2002;14:371-6.

[67] Wiest R, Garcia-Tsao G. Bacterial translocation (BT) in cirrhosis. Hepatol Baltim Md 2005;41:422-33. doi:10.1002/hep.20632.

123


[68] Pascual S, Such J, Esteban A, Zapater P, Casellas JA, Aparicio JR, et al. Intestinal permeability is increased in patients with advanced cirrhosis. Hepatogastroenterology 2003;50:1482-6.

[69] Chiva M, Guarner C, Peralta C, Llovet T, G0mez G, Soriano G, et al. Intestinal mucosal oxidative damage and bacterial translocation in cirrhotic rats. Eur J Gastroenterol Hepatol 2003;15:145-50.

[70] Chiva M, Soriano G, Rochat I, Peralta C, Rochat F, Llovet T, et al. Effect of Lactobacillus johnsonii La1 and antioxidants on intestinal flora and bacterial translocation in rats with experimental cirrhosis. J Hepatol 2002;37:456-62.

[71] Runyon BA. Patients with deficient ascitic fluid opsonic activity are predisposed to spontaneous bacterial peritonitis. Hepatol Baltim Md 1988;8:632-5.

[72] Runyon BA, Morrissey RL, Hoefs JC, Wyle FA. Opsonic activity of human ascitic fluid: a potentially important protective mechanism against spontaneous bacterial peritonitis. Hepatol Baltim Md 1985;5:634-7.

[73] Evans LT, Kim WR, Poterucha JJ, Kamath PS. Spontaneous bacterial peritonitis in asymptomatic outpatients with cirrhotic ascites. Hepatol Baltim Md 2003;37:897-901. doi:10.1053/jhep.2003.50119.

[74] Campillo B, Richardet J-P, Kheo T, Dupeyron C. Nosocomial spontaneous bacterial peritonitis and bacteremia in cirrhotic patients: impact of isolate type on prognosis and characteristics of infection. Clin Infect Dis Off Publ Infect Dis Soc Am 2002;35:1-10. doi:10.1086/340617.

[75] Ning N-Z, Li T, Zhang J-L, Qu F, Huang J, Liu X, et al. Clinical and bacteriological features and prognosis of ascitic fluid infection in Chinese patients with cirrhosis. BMC Infect Dis 2018;18:253. doi:10.1186/s12879-018- 3101-1.

[76] Reuken PA, Pletz MW, Baier M, Pfister W, Stallmach A, Bruns T. Emergence of spontaneous bacterial peritonitis due to enterococci - risk factors and outcome in a 12-year retrospective study. Aliment Pharmacol Ther 2012;35:1199-208. doi:10.1111/j.1365-2036.2012.05076.x.

[77] Piroth L, Pechinot A, Di Martino V, Hansmann Y, Putot A, Patry I, et al. Evolving epidemiology and antimicrobial resistance in spontaneous bacterial peritonitis: a two-year observational study. BMC Infect Dis 2014;14:287. doi:10.1186/1471-2334-14-287.

[78] Alexopoulou A, Papadopoulos N, Eliopoulos DG, Alexaki A, Tsiriga A, Toutouza M, et al. Increasing frequency of gram-positive cocci and gramnegative multidrug-resistant bacteria in spontaneous bacterial peritonitis. Liver Int Off J Int Assoc Study Liver 2013;33:975-81. doi:10.1111/liv.12152.

[79] Fiore M, Maraolo AE, Gentile I, Borgia G, Leone S, Sansone P, et al. Nosocomial spontaneous bacterial peritonitis antibiotic treatment in the era of multi-drug resistance pathogens: A systematic review. World J Gastroenterol 2017;23:4654-60. doi:10.3748/wjg.v23.i25.4654.

[80] Fernandez J, Acevedo J, Castro M, Garcia O, de Lope CR, Roca D, et al. Prevalence and risk factors of infections by multiresistant bacteria in cirrhosis: a prospective study. Hepatol Baltim Md 2012;55:1551-61. doi:10.1002/hep.25532.

[81] Felisart J, Rimola A, Arroyo V, Perez-Ayuso RM, Quintero E, Gines P, et al. Cefotaxime is more effective than is ampicillin-tobramycin in cirrhotics with severe infections. Hepatol Baltim Md 1985;5:457-62.

124


[82] Runyon BA, McHutchison JG, Antillon MR, Akriviadis EA, Montano AA. Short-course versus long-course antibiotic treatment of spontaneous bacterial peritonitis. A randomized controlled study of 100 patients. Gastroenterology 1991;100:1737-42.

[83] Rimola A, Salmer0n JM, Clemente G, Rodrigo L, Obrador A, Miranda ML, et al. Two different dosages of cefotaxime in the treatment of spontaneous bacterial peritonitis in cirrhosis: results of a prospective, randomized, multicenter study. Hepatol Baltim Md 1995;21:674-9.

[84] Terg R, Cobas S, Fassio E, Landeira G, Rios B, Vasen W, et al. Oral ciprofloxacin after a short course of intravenous ciprofloxacin in the treatment of spontaneous bacterial peritonitis: results of a multicenter, randomized study.J Hepatol 2000;33:564-9.

[85] Wiest R, Krag A, Gerbes A. Spontaneous bacterial peritonitis: recent guidelines and beyond. Gut 2012;61:297-310. doi:10.1136/gutjnl-2011-300779.

[86] Fernandez J, Tandon P, Mensa J, Garcia-Tsao G. Antibiotic prophylaxis in cirrhosis: Good and bad. Hepatol Baltim Md 2016;63:2019-31. doi:10.1002/hep.28330.

[87] Bauer TM, Follo A, Navasa M, Vila J, Planas R, Clemente G, et al. Daily norfloxacin is more effective than weekly rufloxacin in prevention of spontaneous bacterial peritonitis recurrence. Dig Dis Sci 2002;47:1356-61.

[88] Mandell, Douglas, Bennett, Dolin, Blaser. Principles and Practice of Infectious Diseases, 8th Edition. 2015.

[89] Pavlin JA, Gilchrist MJR, Osweiler GD, Woollen NE. Diagnostic analyses of biological agent-caused syndromes: laboratory and technical assistance. Emerg Med Clin North Am 2002;20:331-50.

[90] Murray, Baron, Pfaller. Manual of Clinical Microbiology. 10th ed. 2011.[91] Gatselis N, Malli E, Papadamou G, Petinaki E, Dalekos GN. Direct detection of

Cardiobacterium hominis in serum from a patient with infective endocarditis by broad-range bacterial PCR. J Clin Microbiol 2006;44:669-72. doi:10.1128/JCM.44.2.669-672.2006.

[92] Naber SP. Molecular pathology--diagnosis of infectious disease. N Engl J Med 1994;331:1212-5. doi:10.1056/NEJM199411033311808.

[93] Pitt TL, Saunders NA. Molecular bacteriology: a diagnostic tool for the millennium. J Clin Pathol 2000;53:71-5.

[94] Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. 1986. Biotechnol Read Mass 1992;24:17-27.

[95] Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. 1985. Biotechnol Read Mass 1992;24:476-80.

[96] Guyer RL, Koshland DE. The Molecule of the Year. Science 1989;246:1543-6.[97] Wilson KH, Blitchington R, Shah P, McDonald G, Gilmore RD, Mallavia LP.

Probe directed at a segment of Rickettsia rickettsii rRNA amplified with polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1989;27:2692-6.

[98] Χαρβάλου Α. Διαγνωστική μοριακή Μικροβιολογία. Ιατρικές εκδόσεις Π.χ.Πασχαλίδη; n.d.

[99] Wilson KH, Blitchington RB, Greene RC. Amplification of bacterial 16S ribosomal DNA with polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1990;28:1942-6.

125


[100] Greisen K, Loeffelholz M, Purohit A, Leong D. PCR primers and probes for the 16S rRNA gene of most species of pathogenic bacteria, including bacteria found in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol 1994;32:335-51.

[101] Evertsson U, Monstein HJ, Johansson AG. Detection and identification of fungi in blood using broad-range 28S rDNA PCR amplification and species-specific hybridisation. APMIS Acta Pathol Microbiol Immunol Scand 2000;108:385- 92.

[102] Fischer-Romero C, Luthy-Hottenstein J, Altwegg M. Development and evaluation of a broad-range PCR-ELISA assay with Borrelia burgdorferi and Streptococcus pneumoniae as model organisms for reactive arthritis and bacterial meningitis. J Microbiol Methods 2000;40:79-88.

[103] Kotilainen P, Jalava J, Meurman O, Lehtonen OP, Rintala E, Seppala OP, et al. Diagnosis of meningococcal meningitis by broad-range bacterial PCR with cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol 1998;36:2205-9.

[104] Gatselis N, Malli E, Papadamou G, Petinaki E, Dalekos GN. Direct detection of Cardiobacterium hominis in serum from a patient with infective endocarditis by broad-range bacterial PCR. J Clin Microbiol 2006;44:669-72. doi:10.1128/JCM.44.2.669-672.2006.

[105] Makaritsis KP, Neocleous C, Gatselis N, Petinaki E, Dalekos GN. An immunocompetent patient presenting with severe septic arthritis due to Ralstonia pickettii identified by molecular-based assays: a case report. Cases J 2009;2:8125. doi:10.4076/1757-1626-2-8125.

[106] Petinaki E., Dalekos GN D GN. Molecular methods as tools for the diagnosis of bacterial infections, useful or useless? Rev Adv in Microbiol 2006;6:23-31.

[107] Tattevin P, Watt G, Revest M, Arvieux C, Fournier P-E. Update on blood culture-negative endocarditis. Med Mal Infect 2015;45:1-8. doi:10.1016/j.medmal.2014.11.003.

[108] Siciliano RF, Mansur AJ, Castelli JB, Arias V, Grinberg M, Levison ME, et al. Community-acquired culture-negative endocarditis: clinical characteristics and risk factors for mortality. Int J Infect Dis IJID Off Publ Int Soc Infect Dis 2014;25:191-5. doi:10.1016/j.ijid.2014.05.005.

[109] Wang A, Gaca JG, Chu VH. Management Considerations in Infective Endocarditis: A Review. JAMA 2018;320:72-83. doi:10.1001/jama.2018.7596.

[110] Blumental S, Reynders M, Willems A, Biarent D, Duttman R, Lepage P, et al. Enteroviral infection of a cardiac prosthetic device. Clin Infect Dis Off Publ Infect Dis Soc Am 2011;52:710-6. doi:10.1093/cid/ciq189.

[111] Vollmer T, Piper C, Horstkotte D, Korfer R, Kleesiek K, Dreier J. 23S rDNA real-time polymerase chain reaction of heart valves: a decisive tool in the diagnosis of infective endocarditis. Eur Heart J 2010;31:1105-13. doi:10.1093/eurheartj/ehp600.

[112] Miller RJH, Chow B, Pillai D, Church D. Development and evaluation of a novel fast broad-range 16S ribosomal DNA PCR and sequencing assay for diagnosis of bacterial infective endocarditis: multi-year experience in a large Canadian healthcare zone and a literature review. BMC Infect Dis 2016;16:146. doi:10.1186/s12879-016-1476-4.

[113] Marin M, Munoz P, Sanchez M, del Rosal M, Alcala L, Rodriguez-Creixems M, et al. Molecular diagnosis of infective endocarditis by real-time broad-range polymerase chain reaction (PCR) and sequencing directly from heart valve tissue. Medicine (Baltimore) 2007;86:195-202. doi:10.1097/MD.0b013e31811f44ec.

126


[114] Lang S, Watkin RW, Lambert PA, Bonser RS, Littler WA, Elliott TSJ. Evaluation of PCR in the molecular diagnosis of endocarditis. J Infect 2004;48:269-75. doi:10.1016/S0163 -4453(03)00102-6.

[115] Bosshard PP, Kronenberg A, Zbinden R, Ruef C, Bottger EC, Altwegg M. Etiologic diagnosis of infective endocarditis by broad-range polymerase chain reaction: a 3-year experience. Clin Infect Dis Off Publ Infect Dis Soc Am 2003;37:167-72. doi:10.1086/375592.

[116] Le Guern R, Loi'ez C, Armand S, Marceau L, Courcol R, Wallet F. Infective endocarditis: does a new 16S rDNA set of primers improve the microbiological diagnosis? Infect Dis Lond Engl 2015;47:896-901. doi:10.3109/23744235.2015.1075661.

[117] Kuhn C, Disque C, Muhl H, Orszag P, Stiesch M, Haverich A. Evaluation of commercial universal rRNA gene PCR plus sequencing tests for identification of bacteria and fungi associated with infectious endocarditis. J Clin Microbiol 2011;49:2919-23. doi:10.1128/JCM.00830-11.

[118] Saravolatz LD, Manzor O, VanderVelde N, Pawlak J, Belian B. Broad-range bacterial polymerase chain reaction for early detection of bacterial meningitis. Clin Infect Dis Off Publ Infect Dis Soc Am 2003;36:40-5. doi:10.1086/345438.

[119] Deutch S, Pedersen LN, P0denphant L, Olesen R, Schmidt MB, M0ller JK, et al. Broad-range real time PCR and DNA sequencing for the diagnosis of bacterial meningitis. Scand J Infect Dis 2006;38:27-35. doi:10.1080/00365540500372861.

[120] Wang Y, Guo G, Wang H, Yang X, Shao F, Yang C, et al. Comparative study of bacteriological culture and real-time fluorescence quantitative PCR (RT- PCR) and multiplex PCR-based reverse line blot (mPCR/RLB) hybridization assay in the diagnosis of bacterial neonatal meningitis. BMC Pediatr 2014;14:224. doi:10.1186/1471-2431-14-224.

[121] Piccirilli G, Chiereghin A, Gabrielli L, Giannella M, Squarzoni D, Turello G, et al. Infectious meningitis/encephalitis: evaluation of a rapid and fully automated multiplex PCR in the microbiological diagnostic workup. New Microbiol 2018;41:118-25.

[122] Liesman RM, Strasburg AP, Heitman AK, Theel ES, Patel R, Binnicker MJ. Evaluation of a Commercial Multiplex Molecular Panel for Diagnosis of Infectious Meningitis and Encephalitis. J Clin Microbiol 2018;56. doi:10.1128/JCM.01927-17.

[123] Such J, Frances R, Munoz C, Zapater P, Casellas JA, Cifuentes A, et al. Detection and identification of bacterial DNA in patients with cirrhosis and culture-negative, nonneutrocytic ascites. Hepatol Baltim Md 2002;36:135-41. doi:10.1053/jhep.2002.33715.

[124] Zapater P, Frances R, Gonzalez-Navajas JM, de la Hoz MA, Moreu R, Pascual S, et al. Serum and ascitic fluid bacterial DNA: a new independent prognostic factor in noninfected patients with cirrhosis. Hepatol Baltim Md 2008;48:1924- 31. doi:10.1002/hep.22564.

[125] Vieira SMG, da Silveira TR, Matte U, Kieling CO, Ferreira CT, Taniguchi A, et al. Amplification of bacterial DNA does not distinguish patients with ascitic fluid infection from those colonized by bacteria. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2007;44:603-7. doi:10.1097/MPG.0b013e318031d602.

[126] Bruns T, Sachse S, Straube E, Assefa S, Herrmann A, Hagel S, et al. Identification of bacterial DNA in neutrocytic and non-neutrocytic cirrhotic

127


ascites by means of a multiplex polymerase chain reaction. Liver Int Off J Int Assoc Study Liver 2009;29:1206-14. doi:10.1111/j .1478-3231.2009.02073.x.

[127] Bruns T, Reuken PA, Stengel S, Gerber L, Appenrodt B, Schade JH, et al. The prognostic significance of bacterial DNA in patients with decompensated cirrhosis and suspected infection. Liver Int Off J Int Assoc Study Liver 2016;36:1133-42. doi:10.1m/liv.13095.

[128] Rogers GB, Russell LE, Preston PG, Marsh P, Collins JE, Saunders J, et al. Characterisation of bacteria in ascites--reporting the potential of culture- independent, molecular analysis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis Off Publ Eur Soc Clin Microbiol 2010;29:533-41. doi:10.1007/s10096-010-0891 -5.

[129] Soriano G, Esparcia O, Montemayor M, Guarner-Argente C, Pericas R, Torras X, et al. Bacterial DNA in the diagnosis of spontaneous bacterial peritonitis. Aliment Pharmacol Ther 2011;33:275-84. doi:10.1111/j.1365- 2036.2010.04506.x.

[130] Bellot P, Garcia-Pagan JC, Frances R, Abraldes JG, Navasa M, Perez-Mateo M, et al. Bacterial DNA translocation is associated with systemic circulatory abnormalities and intrahepatic endothelial dysfunction in patients with cirrhosis. Hepatol Baltim Md 2010;52:2044-52. doi:10.1002/hep.23918.

[131] Rantakokko-Jalava K, Nikkari S, Jalava J, Eerola E, Skurnik M, Meurman O, et al. Direct amplification of rRNA genes in diagnosis of bacterial infections. J Clin Microbiol 2000;38:32-9.

[132] Relman, D.A. Universal Bacterial 16S rRNA Amplification and Sequencing. Diagn. Mol. Microbiol. Princ. Appl. Persing, D.H., Smith, T.F., Tenover, F.C. and White, T.J., ASM Press, Washington DC; 1993, p. 489-95.

[133] Llovet JM, Bartoli R, Planas R, Cabre E, Jimenez M, Urban A, et al. Bacterial translocation in cirrhotic rats. Its role in the development of spontaneous bacterial peritonitis. Gut 1994;35:1648-52.

[134] Mostafa MS, El-Seidi EA, Kassem AM, Shemis MA, Saber M, Michael MN. Detection of ascitic fluid infections in patients with liver cirrhosis and ascites. Arab J Gastroenterol Off Publ Pan-Arab Assoc Gastroenterol 2011;12:20-4. doi:10.1016/j.ajg.2011.01.004.

[135] Ferreira AO, Martins LN, Marinho RT, Velosa J. Spontaneous bacterial peritonitis by Brucella in a cirrhotic patient. BMJ Case Rep 2013;2013. doi:10.1136/bcr-2013-008629.

[136] Makaritsis KP, Liaskos C, Papadamou G, Dalekos GN. Spontaneous bacterial peritonitis: an unusual manifestation of brucellosis in a previous healthy male patient. BMJ Case Rep 2015;2015. doi:10.1136/bcr-2015-209387.

[137] Bourantas KL, Christou LG, Dalekos GN, Barbati K, Tsianos EV. A 54-year- old stockbreeder with ascites. Lancet Lond Engl 1997;349:994.

128


129


130


Date post:	11-Jan-2023
Category:	Documents
Upload:	khangminh22
View:	0 times
Download:	0 times

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΙΑΣ - Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας

Documents