BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mikroorganisme dapat tumbuh dan berkembang biak

dengan cara mengoksidasi zat-zat hara yang ada di

lingkungan untuk menghasilkan energi dan senyawa awal

untuk sintesis komponen-komponen sel. Penggunaan zat

hara dipengaruhi oleh aktivitas metabolisme

mikroorganisme dalam memecah molekul kompleks, seperti

karbohidrat, protein, lemak, dan asam nukleat menjadi

komponen yang lebih sederhana sehingga dapat diangkut

sel ke sitoplasma sebagai sumber energi dan senyawa

awal.

Proses pemecahan karbohidrat dan asam amino secara

anaerobik disebut dengan fermentasi sedangkan proses

penguraian makromolekul menjadi molekul yang lebih

sederhana dengan penambahan air disebut juga dengan

hidrolisis. Mikroorganisme dapat menghasilkan enzim

yang dapat mengkatalis reaksi hidrolisis.

Mikroorganisme amilolitik dapat memproduksi enzim

amilase untuk memecah pati menjadi gula yang lebih

sederhana yang dapat dipecah lagi menjadi asam, gas,

alkohol, dan energi. Mikroorganisme proteolitik dapat

menghidrolisis protein dan menghasilkan peptida serta

asam amino. Mikroorganisme lipolitik dapat memecah

1

lemak menjadi asam lemak dan gliserol, sedangkan

mikroorganisme pektolitik dapat memecah pektin dan

menyebabkan hilangnya kemampuan membentuk gel.

Mikroorganisme di lingkungan aerob juga dapat

menghasilkan enzim katalase untuk menguraikan hidrogen

peroksida (H2O2) menjadi air dan O2. H2O2 bersifat toksik

terhadap sel karena dapat menginaktivasi enzim yang ada

di dalam sel.

Pewarnaan Gram dapat digunakan untuk membedakan

antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.

Adanya perbedaan pada tahap pewarnaan Gram disebabkan

oleh perbedaan struktur dinding sel yang dimiliki

bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Komponen

utama bakteri Gram positif adalah peptidoglikan

sedangkan sebagian besar dinding sel bakteri Gram

negatif tersusun dari lipid.

1.2 Tujuan

Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari sifat-

sifat pemecahan komponen kimia di dalam makanan oleh

mikroorganisme, seperti bakteri, kapang, dan khamir,

menguji dan membedakan reaksi pemecahan karbohidrat,

protein, dan lemak oleh kultur jasad renik murni dan

mikroorganisme yang ada di makanan, mengetahui adanya

enzim katalase pada mikroorganisme melalui uji

katalase, dan dapat mengamati bentuk dan ciri-ciri dari

bakteri melalui pewarnaan Gram.

2

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

3

Menurut Lay (1994), mikroorganisme dapat tumbuh,

berkembang biak, dan membentuk sel baru dengan

menggunakan zat hara yang ada di lingkungannya, yaitu

molekul sederhana, seperti H2S dan NH4+ atau molekul

organik kompleks, seperti polisakarida dan protein.

Zat-zat hara ini akan dioksidasikan oleh mikroorganisme

untuk mendapatkan energi dan senyawa awal agar dapat

melakukan sintesis dinding sel, membran sel, dan

flagela.

Penggunaan zat hara ditentukan dari aktivitas

metabolisme mikroorganisme. Metabolisme dapat

memberikan hasil sampingan yang dapat dipakai untuk

mengidentifikasi mikroorganisme. Salah satu jalur

metabolisme adalah fermentasi yang pemindahan

elektronnya berlangsung di antara senyawa-senyawa

organik (Volk dan Wheeler, 1993).

2.1 Fermentasi

Menurut Fardiaz (1992), fermentasi adalah proses

pemecahan komponen karbohidrat dan asam amino oleh

enzim mikroorganisme secara anaerobik untuk

menghasilkan energi. Proses ini tidak memerlukan adanya

oksigen dan pada saat fermentasi berlangsung, senyawa

organik berperan sebagai penerima elektron terakhir

sehingga hasil fermentasinya lebih stabil. Pada proses

fermentasi, hanya sebagian bahan baku energi yang

dipecah sehingga hanya dihasilkan sejumlah kecil

4

energi, CO2, air, dan beberapa produk akhir, seperti

asam laktat, asam asetat, etanol, serta asam organik

volatil lainnya (Buckle et al., 1987). Karbohidrat

merupakan senyawa utama yang dipecah dalam proses

fermentasi sedangkan asam amino hanya dapat dipecah

oleh beberapa jenis bakteri tertentu (Fardiaz, 1992).

2.1.1 Fermentasi Karbohidrat

Karbohidrat merupakan komponen utama yang dipecah di

dalam proses fermentasi. Pertama, polisakarida akan

dipecah menjadi gula-gula sederhana sebelum dilakukan

fermentasi, contohnya pati dipecah menjadi glukosa-

glukosa. Selanjutnya, glukosa dipecah lagi menjadi

senyawa-senyawa lain yang lebih sederhana tergantung

pada jenis fermentasinya (Fardiaz, 1992).

Selain itu, hasil akhir produk fermentasi juga

dipengaruhi dari sifat mikroorganisme, media biakan

yang dipakai, dan faktor-faktor lingkungan, seperti pH

dan suhu. Media yang digunakan harus mengandung

senyawa-senyawa yang dapat dengan mudah difermentasikan

dan dioksidasikan oleh mikroorganisme. Glukosa sendiri

merupakan senyawa karbohidrat yang paling banyak

dipakai oleh mikroorganisme dalam proses fermentasi.

Kemampuan mikroorganisme untuk memfermentasikan

berbagai macam karbohidrat dan produk yang dihasilkan

dari fermentasi merupakan ciri-ciri yang dapat

digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme.

Identifikasi ini berkaitan erat dengan aktivitas

5

metabolisme mikroorganisme dalam menggunakan dan

menguraikan senyawa kompleks, seperti pati, lemak,

protein, dan asam nukleat (Lay, 1994).

Minimal ada tujuh proses fermentasi glukosa yang

berbeda-beda pada bakteri. Masing-masing proses

fermentasi sendiri akan membentuk produk akhir yang

berbeda dan spesifik untuk kelompok bakteri tertentu.

Ada dua tahap fermentasi glukosa, yaitu:

1. Rantai karbon dipecah dari glukosa dan dilepaskan

dua pasang atom hidrogen untuk memperoleh senyawa

karbon yang akan lebih mudah teroksidasi daripada

glukosa.

2. Senyawa yang teroksidasi dapat direduksi kembali

dengan menggunakan atom hidrogen dari tahap

pertama untuk membentuk produk fermentasi. Reaksi

oksidasi harus seimbang dengan reaksi reduksi yang

berlangsung.

Asam piruvat akan selalu dihasilkan pada tahap

pertama fermentasi glukosa (Fardiaz, 1992). Ada empat

jalur pemecahan glukosa menjadi asam piruvat, yaitu:

1. Jalur Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP) atau

glikolisis

Jalur EMP merupakan mekanisme yang paling umum

digunakan bakteri, fungi, hewan, dan manusia

untuk mengubah glukosa menjadi asam piruvat (Volk

dan Wheeler, 1993). Tahap pertama adalah tahap

pembentukan fruktosa difosfat. Tahap selanjutnya,

6

fruktosa difosfat dipecah menjadi dua molekul

gliseraldehida fosfat yang dikatalis oleh enzim

aldolase, lalu diteruskan dengan reaksi

dehidrogenasi gliseraldehida fosfat yang juga

termasuk reaksi oksidasi yang memproduksi ATP dan

dikatalis oleh enzim gliseraldehida fosfat

dehidrogenase.

NAD (Nikotinamida Adenin Dinukleotida) akan

menangkap atom hidrogen yang dilepas untuk

membentuk NADH2. Jika NADH2 dioksidasi kembali

pada tahap kedua fermentasi sehingga atom

hidrogen dapat dilepas kembali, maka proses

fermentasi dapat berlangsung terus. Pada proses

fermentasi, NAD berperan sebagai pembawa

hidrogen.

Energi yang dihasilkan pada tahap oksidasi

gliseraldehida fosfat akan membentuk dua ATP.

Satu molekul glukosa dapat membentuk dua molekul

gliseraldehida fosfat sehingga seluruhnya

dihasilkan empat ATP. Namun, karena dua ATP

digunakan untuk mengubah glukosa menjadi fruktosa

difosfat sehingga hanya tinggal dua ATP yang

dipakai untuk pertumbuhan tiap molekul glukosa

(Fardiaz, 1992). Reaksinya:

Glukosa + 2(ADP + 2NAD+ → 2 piruvat + 2

ATP +

7

+ Pi)

2 (NADH + H+)

2. Jalur Entner Doudoroff (ED)

Pada jalur ED, akan dihasilkan senyawa antara

unik, yaitu 2-keto-3-deoksi-6-fosfoglukonat

(KDFG). Senyawa ini kemudian dipecah menjadi dua

triosa, yaitu piruvat dan gliseraldehida-3-fosfat

oleh enzim aldolase. Selanjutnya, kedua triosa

ini memasuki jalur EMP untuk menghasilkan molekul

piruvat kedua dengan cara melepas dua mol ATP,

satu mol NADH, dan H+ (Fardiaz, 1992). Reaksinya:

Glukosa + NADP+ + NAD+ + → 2 piruvat + NADP + H+

+

(ADP+Pi)

NADH + H+ + ATP

3. Jalur Heksosamonofosfat (HMF)

Jalur yang dapat ditemui pada berbagai macam

organisme ini berperan penting di dalam

metabolisme mikroorganisme agar dapat membentuk

pentosa yang dibutuhkan untuk melakukan sintesis

asam nukleat, asam amino aromatik, vitamin, dan

sumber NADP+H+ untuk reaksi biosintesis. Jalur HMF

disebut juga dengan siklus pentosa karena energi

tidak diperoleh secara langsung, tetapi NADP + H+

yang dihasilkan ketika dimasukkan ke dalam sistem

transpor elektron akan menjadi sumber energi

potensial. Enzim yang digunakan di dalam jalur

8

ini adalah transaldolase dan transketolase

(Fardiaz, 1992). Reaksinya:

Glukosa + 12 NADP+ + ATP → 6 CO2 + 12 (NADPH +

H+) + ADP + Pi

4. Jalur Fosfoketolase (FK)

Jalur ini hanya dapat ditemui pada kelompok

bakteri laktobasili heterofermentatif. Jalur FK

merupakan cabang dari jalur HMF karena bakteri

jenis ini tidak memiliki enzim aldolase yang

digunakan untuk memecah fruktosa 1,6-difosfat

menjadi dua triosa-fosfat dan juga tidak memiliki

enzim transaldolase dan transketolase yang

berperan penting di dalam jalur HMF. Ketika

asetil-fosfat diubah menjadi asetat, maka akan

dihasilkan 2 ATP yang memiliki ikatan energi

tinggi. Reaksinya:

Glukosa + NAD+ + 2 NADP+ + → piruvat +

asetat + CO2 + NADH

2 ADP + P

+ H + + 2 NADPH + H+ + 2 ATP

Namun jika asetil-fosfat diubah menjadi etanol,

maka ikatan energinya akan hilang sehingga hanya

dihasilkan satu mol ATP per mol glukosa (Fardiaz,

1992). Reaksinya:

Glukosa + NAD+ + ADP + Pi → piruvat +

asetat + CO2 +

9

NADH + H + +

ATP

Pada tahap kedua fermentasi, asam piruvat dipecah

menjadi hasil produk akhir yang spesifik untuk

digunakan dalam berbagai proses fermentasi dengan

memakai atom hidrogen yang dihasilkan dari tahap

pertama fermentasi. Produk akhir ini dihasilkan dari

reaksi yang dikatalis oleh enzim-enzim tertentu.

Contohnya, glukosa yang difermentasi oleh khamir

melalui jalur EMP sehingga menghasilkan alkohol dan

CO2.

Glukosa dapat difermentasi menjadi alkohol maupun

asam laktat. Pada fermentasi alkohol, terjadi

regenerasi NAD+ sehingga enzim mengubah piruvat menjadi

asetaldehida yang berperan sebagai penerima hidrogen

dan CO2. NADH kemudian membawa elektron dan ion H+ ke

dua molekul asetaldehida sehingga dihasilkan produk

akhir berupa alkohol (Fardiaz, 1992). Reaksinya:

Glukosa → 2 Etanol + 2 CO2

Sedangkan pada fermentasi asam laktat, terjadi

regenerasi NAD+. Dua NADH membawa elektron dan ion H+

ke 2 molekul piruvat yang berperan sebagai penerima

hidrogen sehingga dihasilkan asam laktat sebagai produk

akhirnya. Reaksinya:

Glukosa → 2 Asam laktat

10

Fermentasi di atas disebut juga dengan fermentasi

homolaktat karena hanya dihasilkan asam laktat sebagai

satu-satunya hasil fermentasi. Bakteri yang melakukan

fermentasi ini disebut bakteri asam laktat

homofermentatif, contohnya Streptococcus, Pediococcus. Ada

juga bakteri asam laktat heterofermentatif yang tidak

hanya membentuk asam laktat, tapi juga senyawa-senyawa

lainnya, seperti etanol, asam asetat, dan CO2. Contoh

bakteri ini adalah Leuconostoc, Lactobacillus (Fardiaz,

1992). Reaksinya:

Glukosa → Asam laktat + etanol/asam asetat + CO2

Untuk menguji adanya proses fermentasi, dapat

dilihat dari pembentukan asam dan gas. Adanya gas dapat

dilihat dengan menggunakan tabung durham atau tabung

smith. Tabung smith dipakai jika harus menentukan jumlah

dan jenis gas sedangkan tabung durham dipakai jika

jenis dan jumlah gas tidak perlu diketahui. Bila ada

gas, maka gas tersebut akan masuk ke dalam tabung dan

tampak sebagai gelembung udara yang terperangkap di

dalam tabung sehingga mendorong cairan yang ada di

tabung durham.

Media yang digunakan mengandung karbohidrat berupa

glukosa, manitol, laktosa, sukrosa, atau maltosa serta

ekstrak sapi dan pepton sebagai sumber nitrogen,

mineral, dan vitamin. Asam yang terbentuk dapat

diketahui dengan menambahkan indikator ke dalam media

yang digunakan. Jika pada proses fermentasi bakteri

11

ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa, maka

akan terbentuk asam sebagai produk fermentasi yang

ditandai dengan perubahan warna menjadi kuning yang

dapat dilihat pada gambar 2.1. Asam ini akan menurunkan

pH media. Indikator yang umumnya dipakai adalah merah

fenol yang berwarna merah atau BCP(Brom Crescol Purple)

yang berwarna ungu pada pH>7 (Lay, 1994).

Gambar 2.1 Hasil fermentasi karbohidratSumber : Johnson (1998)

2.1.2 Fermentasi Asam Amino

Asam amino hanya dapat difermentasi oleh beberapa

bakteri tertentu, terutama Clostridia. Protein awalnya

akan dipecah menjadi asam amino, selanjutnya asam amino

difermentasi menjadi senyawa lain berupa asam. Asam

amino yang dihasilkan dapat sepasang ataupun satu asam

amino saja. Pada fermentasi sepasang asam amino, satu

asam amino akan menjadi oksidan sedangkan satunya lagi

akan menjadi reduktan (Fardiaz, 1992). Jalur fermentasi

sendiri dapat dilihat pada gambar 2.2. Reaksi

fermentasi asam amino:

3 Alanin + 2 H2O → 2 asam propionat + asam asetat +

CO2 + 3 NH3

12

Gambar 2.2 Jalur fermentasiSumber : Madigan (1997)

Bakteri-bakteri yang biasanya berperan dalam proses

fermentasi adalah bakteri asam laktat, contohnya

Streptococcus thermophilus yang berguna dalam industri susu,

Pediococcus cerevisiae berperan dalam fermentasi sayuran dan

daging, Leuconostoc mesentroides dipakai dalam fermentasi

sayuran, dan Lactobacillus lactis penting dalam industri susu

dan sayuran; bakteri asam asetat, contohnya Acetobacter

aceti yang dipakai dalam industri cuka; khamir,

contohnya Saccharomyces cerevisiae dalam industri bir,

anggur, roti; kapang, contohnya Aspergillus oryzae untuk

membuat minuman beralkohol dan Aspergillus wentii digunakan

dalam fermentasi kecap, tauco, sake (Buckle et al.,

1987).

13

2.2 Jenis Bakteri Berdasarkan Sifat Pertumbuhannya

pada Makanan

2.2.1 Bakteri Asam Laktat

Bakteri asam laktat bergram positif, berbentuk

batang atau bulat, dan dapat memfermentasikan gula

menjadi asam laktat yang sering digunakan dalam proses

fermentasi sayur-sayuran (pikel, sauerkraut), fermentasi

susu (yogurt, keju, susu asam), dan fermentasi ikan.

Bakteri asam laktat menghasilkan asam secara cepat

sehingga dapat menurunkan pH lingkungan dan mencegah

pertumbuhan mikroorganisme lain yang tidak diinginkan.

Contoh bakteri asam laktat adalah beberapa Lactobacillus,

Streptococcus, dan Pediococcus yang bersifat

homofermentatif serta Leuconostoc dan beberapa Lactobacillus

yang bersifat heterofermentatif (Fardiaz, 1992).

2.2.2 Bakteri Asam Asetat

Bakteri asam asetat berbentuk batang, bergram

negatif, contohnya Gluconobacter dan Acetobacter yang dapat

mengoksidasi alkohol menjadi asam asetat. Asam asetat

dapat dioksidasi lebih lanjut menjadi CO2 oleh bakteri

Acetobacter. Spesies yang sering dipakai dalam industri

cuka adalah A. Aceti dan G. Suboxydans (Fardiaz, 1992).

2.2.3 Bakteri Proteolitik

Bakteri ini akan menghasilkan enzim proteinase

ekstraseluler yang merupakan enzim pemecah protein yang

dibentuk di dalam sel dan dikeluarkan dari sel setelah

14

enzim selesai bekerja. Enzim proteinase terdapat pada

semua bakteri, tetapi tidak semua bakteri memiliki

enzim proteinase ekstraseluler. Ada tiga macam bakteri

proteolitik, yaitu:

a. Bakteri aerobik atau anaerobik fakultatif yang

tidak membentuk spora, contohnya Proteus dan

Pseudomonas.

b. Bakteri aerobik dan anerobik fakultatif pembentuk

spora, contohnya Bacillus.

c. Bakteri anaerobik pembentuk spora, contohnya

beberapa Clostridium.

Ada bakteri yang bersifat proteolitik asam yang

dapat menghidrolisis protein dan memfermentasi asam,

contohnya Streptococcus faecalis dan ada juga bakteri yang

bersifat putrefaktif yang memecah protein secara

anaerobik dan menghasilkan senyawa berbau busuk,

contohnya Pseudomonas (Fardiaz, 1992).

2.2.4 Bakteri Lipolitik

Bakteri ini menghasilkan enzim lipase yang berfungsi

sebagai katalis reaksi hidrolisis lemak menjadi asam-

asam lemak dan gliserol. Produk akhir dari hidrolisis

lemak dapat dioksidasi lagi menjadi energi di dalam

kondisi aerob. Kebanyakan bakteri aerobik dan

proteolitik aktif juga merupakan bakteri lipolitik.

Contoh bakteri lipolitik adalah Pseudomonas, Alcaligenes,

Serratia, dan Micrococcus (Fardiaz, 1992).

2.2.5 Bakteri Sakarolitik

15

Bakteri ini memecah disakarida dan polisakarida

menjadi gula-gula sederhana. Hanya sedikit bakteri

amilolitik yang dapat menghasilkan enzim amilase dan

menghidrolisis pati di luar sel, contohnya Bacillus subtilis

dan Clostridium butyricum. Ada juga bakteri yang dapat

memecah selulosa (Fardiaz, 1992).

2.2.6 Bakteri Pektolitik

Pektin merupakan karbohidrat kompleks yang dapat

ditemui pada buah dan sayuran. Pektinase (campuran

enzim pektolitik) dapat digunakan untuk memecah pektin

dan mengakibatkan busuk lunak atau busuk air pada buah

dan sayur serta hilangnya kemampuan memproduksi gel

pada sari buah. Contoh bakteri pektolitik adalah

Erwinia, Bacillus, dan Clostridium (Fardiaz, 1992).

2.2.7 Bakteri Osmofilik

Bakteri osmofilik atau sakarofilik dapat ditemui

pada media yang memiliki kandungan gula tinggi, namun

sebenarnya bakteri osmofilik hanya bersifat osmotoleran

sehingga masih dapat tumbuh dengan atau tanpa kandungan

gula yang tinggi, contohnya Leuconostoc (Fardiaz, 1992).

2.3 Produk-Produk Pangan Hasil Fermentasi

Produk pangan adalah media yang baik bagi

pertumbuhan mikroorganisme. Fermentasi sendiri

merupakan perubahan kimiawi yang terjadi pada bahan

pangan yang disebabkan oleh enzim. Sifat produk pangan

hasil fermentasi sangat dipengaruhi oleh mutu dan sifat

16

asli produk pangan itu sendiri. Fermentasi dari

mikroorganisme yang diinginkan akan memberikan bentuk,

rasa, dan tekstur yang bagus.

2.3.1 Sayuran

Bakteri asam laktat dapat memfermentasi hampir semua

jenis sayuran dan buah-buahan yang menyerupai sayuran,

seperti tomat, mentimum, dan olive. Sayuran dan buah

mengandung gula yang tinggi dan bergizi untuk

pertumbuhan bakteri asam laktat. Faktor-faktor

lingkungan yang akan mempengaruhi proses fermentasi

sayuran adalah:

a. Kondiri anaerobik.

b. Kadar garam yang dapat digunakan untuk menyerap

cairan dan zat-zat gizi dari produk.

c. Suhu yang sesuai untuk proses fermentasi.

d. Tersedianya bakteri asam laktat yang diperlukan.

Pada fermentasi sayuran akan terjadi perubahan-

perubahan kompleks yang ditimbulkan dari pertumbuhan

serangkaian bakteri asam laktat, contohnya fermentasi

ini akan dimulai oleh Leuconostoc mesenteroides dan

dilanjutkan oleh Lactobacillus (Buckle et al., 1987).

2.3.2 Sauerkraut (Sayur Asin)

Sauerkraut merupakan kobis asam. Kobis dibersihkan,

dicuci, dan diiris kecil-kecil selebar 1 m, lalu irisan

kubis dimasukkan ke dalam tangki dan ditambahkan garam

untuk menyerap cairan dari irisan kobis, kemudian

diaduk serata mungkin. Selanjutnya, tangki ditutup

17

dengan plastik dan air dimasukkan ke dalam plastik

sebagai pemberat dan penutup sehingga irisan kobis akan

terendam. Tidak tercelupnya kobis di dalam larutan

garam akan menyebabkan pertumbuhan khamir dan kapang

sehingga mengakibatkan rasa yang tidak dikehendaki.

Garam menarik air dan zat gizi dari jaringan sayuran

sehingga zat gizi tersebut akan melengkapi substrat

yang digunakan untuk pertumbuhan bakteri asam laktat.

Garam dan asam yang diproduksi dari fermentasi dapat

mencegah pertumbuhan mikroorganisme yang tidak

dikehendaki dan memperlambat pelunakan jaringan kobis.

Kandungan garamnya harus cukup agar dapat menumbuhkan

bakteri asam laktat dan dapat menghasilkan kraut yang

seimbang dengan garamnya.

Fermentasi dimulai oleh bakteri Leuconostoc mesenteroides

dan dilanjutkan oleh Lactobacillus sp. yang lebih tahan

terhadap asam. Suhu berpengaruh besar terhadap

kecepatan fermentasi, mutu produk pangan, dan

perkembangan jenis mikroorganisme. Suhu antara 25-300C

adalah suhu optimal untuk fermentasi dan mutu produk

pangan yang sempurna dan dapat terjadi dalam waktu 2-3

minggu. Suhu di atas 300C akan memungkinkan pertumbuhan

bakteri homofermentatif dan menghasilkan produk yang

terlalu asam serta flavornya kurang sedangkan suhu di

bawah 250C akan meningkatkan keseluruhan waktu yang

diperlukan untuk fermentasi dan dapat mencapai waktu

satu tahun (Buckle et al., 1987).

18

2.3.3 Miso (Air Tajin)

Miso merupakan hasil fermentasi beras atau kedelai.

Bahan ini digunakan untuk membuat sup dan memberi

tambahan rasa pada produk pangan. Tahap pertama

fermentasi aeobik dilakukan oleh Aspergillus oryzae dan

tahap fermentasi kedua oleh Saccharomyces rouxii secara

anaerobik.

Untuk membuat miso, pertama beras dicuci, direndam,

dan direbus, kemudian diinokulasi dengan Aspergillus oryzae

sehingga terjadi proses fermentasi pada suhu 400C.

Beras harus dalam kondisi basah untuk pertumbuhan

kapang, namun harus cukup kering untuk menghambat

pertumbuhan bakteri lainnya. Pertumbuhan miselia kapang

harus dihentikan sebelum terjadi pembentukan spora.

Beras yang telah berkapang disebut juga dengan koji

yang merupakan kultur stater untuk fermentasi.

Selanjutnya, kedelai dicuci, direndam, dan direbus,

kemudian didinginkan. Bahan ini dihancurkan bersama

garam dengan perbandingan 4 bagian koji, 10 bagian

kedelai, 2 bagian garam, dan 1 bagian miso lama serta

air. Campuran ini difermentasi pada suhu 280C selama

seminggu secara aerobik, lalu dimasukkan ke dalam tong

untuk memulai fermentasi kedua pada kondisi anaerobik.

Fermentasi kedua akan menggunakan khamir pada suhu 350C

selama 2 bulan. Setelah itu, campuran dimatangkan pada

suhu kamar untuk beberapa minggu. Produk akhir kemudian

dihaluskan menjadi adonan atau tepung basah untuk

19

dipakai pada campuran bahan pangan lainnya. Pada

fermentasi ini, akan ikut berperan bakteri-bakteri asam

laktat (Buckle et al., 1987).

2.3.4 Air Rendaman Tahu

Dalam fermentasi tahu, pertama kacang kedelai

direndam di dalam air dan didedak hingga menjadi suatu

campuran. Campuran ini kemudian disaring dan diambil

filtratnya, yaitu susu kedelai. Selanjutnya, susu

kedelai diberi garam, seperti magnesium klorida atau

kalsium sulfat agar dapat menggumpal. Setelah cukup

lunak, gumpalan ini di-press menjadi potongan tahu.

Bakteri yang umumnya berperan dalam fermentasi tahu

adalah Bacillus cereus (Ewald, 1997).

2.4 Pemecahan Makanan oleh Mikroorganisme

Mikroorganisme menggunakan zat-zat hara untuk dapat

melakukan sintesis sel dan memperoleh energi (Fardiaz,

1992). Zat-zat hara ini biasanya berupa molekul besar,

seperti karbohidrat, protein, lemak, dan asam nukleat

(Lay, 1994). Karbohidrat dan protein merupakan sumber

energi untuk dapat menghasilkan ATP sedangkan asam

amino dari protein, purin dan pirimidian dari asam

nukleat, vitamin, serta mineral sebagai faktor-faktor

pertumbuhan. Zat-zat lainnya yang diperlukan

mikroorganisme adalah unsur-unsur makro, seperti C, O,

N, H, P, dan S serta unsur-unsur mikro, yaitu Ca, K,

Mg, Fe, Mn, Cl, Cu (Fardiaz, 1992).

20

Agar dapat digunakan oleh sel, maka makromolekul

harus dihidrolisis terlebih dahulu. Hidrolisis sendiri

merupakan proses penguraian molekul dengan menambahkan

air. Mikroorganisme dapat menghasilkan enzim

(eksoenzim) yang dapat mengkatalis pemecahan makanan

menjadi molekul-molekul sederhana. Molekul kecil ini

akan dibawa ke sitoplasma untuk dipakai sebagai sumber

energi dan senyawa awal dalam sintesis sel (Lay, 1994).

Umumnya makanan mengandung karbohidrat mulai dari

monosakarida sampai polisakarida, tetapi tidak semua

mikroorganisme dapat menghidrolisis karbohidrat,

terutama pati. Hanya mikroorganisme yang bersifat

amilolitik saja yang dapat memecah pati sedangkan

monosakarida dan disakarida dapat dengan mudah dipecah

oleh mikroorganisme.

Pada buah-buahan yang banyak mengandung

monosakarida, sering terjadi fermentasi spontan yang

menghasilkan asam dan gas sedangkan pada susu yang

banyak mengandung disakarida (laktosa), sering terjadi

fermentasi asam laktat. Asam yang dihasilkan

mikroorganisme sering ditemui pada makanan yang banyak

mengandung karbohidrat, namun kapang dan khamir

biasanya tidak menghasilkan asam.

Perubahan biokimia juga terjadi pada makanan yang

banyak mengandung protein, namun karena molekul protein

lebih kompleks daripada karbohidrat sehingga hanya

mikroorganisme yang memiliki sistem enzim yang kompleks

21

saja yang dapat memecah protein, yaitu mikroorganisme

proteolitik. Protein akan dipecah menjadi asam amino

yang dapat dipakai sebagai sumber energi sel. Selain

asam amino, pemecahan protein juga akan menghasilkan

gas, asam, dan produk-produk akhir lainnya yang tidak

diinginkan, seperti bau busuk.

Makanan juga banyak mengandung lemak yang bermacam-

macam komposisinya. Komponen penyusun lemak adalah

asam-asam lemak dan gliserol. Asam-asam lemak berantai

pendek lebih mudah dipecah dibandingkan asam-asam lemak

berantai panjang. Asam lemak berantai pendek dapat

ditemui pada lemak hewani sedangkan asam lemak berantai

panjang banyak terdapat pada minyak nabati. Lemak lebih

sulit dipecah daripada karbohidrat dan protein.

Pemecahan lemak kadang-kadang merugikan karena

menyebabkan bau tengik dan tidak dikehendaki pada

pematangan keju (Fardiaz, 1992).

2.4.1 Pemecahan Karbohidrat

Karbohidrat terdiri dari atom-atom C, H, dan O.

Karbohidrat dapat dibagi menjadi lima macam, yaitu

monosakarida (glukosa, fruktosa, galaktosa) yang

tersusun dari aldehid dan keton dari alkohol

polihidrat, disakarida yang tersusun dari dua

monosakarida (laktosa, maltosa, sukrosa, selobiase),

trisakarida (rafinose), oligosakarida (dekstrin,

tetrasakarida), dan polisakarida (pati, glikogen,

selulosa).

22

Karena karbohidrat lebih mudah dipecah, maka makanan

yang banyak mengandung karbohidrat lebih mudah diserang

oleh mikroorganisme. Karbohidrat akan dipecah menjadi

asam, gas, dan produk-produk lainnya. Pemecahan gula

bersifat spesifik untuk mikroorganisme tertentu,

contohnya glukosa, laktosa, dan sukrosa akan dipecah

menjadi asam dan gas oleh bakteri Enterobacter aerogenes,

Staphylococcuc aureus akan memecah gula-gula tersebut

menjadi asam, sedangkan bakteri Alcaligenes faecalis tidak

akan menghasilkan asam dan gas.

Pati dapat digunakan oleh bakteri tertentu untuk

menghasilkan energi dan komponen gum agar dapat

melindungi sel dari pembentukan asam berlebih yang

dapat mengakibatkan pembusukkan makanan, contohnya

kerusakan roti yang disebut juga roti berlendir karena

ketika pati dan protein pada roti dipecah, terbentuk

bau dan tekstur yang berbeda dari roti yang masih

berkualitas bagus.

Asam laktat adalah asam yang paling banyak

dihasilkan dalam proses fermentasi makanan, contohnya

fermentasi sayur asin dan susu. Konsentrasi asam yang

dihasilkan sangat tinggi sehingga dapat mencegah

pertumbuhan mikroorganisme yang memproduksinya maupun

bakteri yang tahan asam. Pertumbuhan bakteri akan

terhambat apabila asam yang dihasilkan mencapai pH 3-

4,3. Jenis mikroorganisme, kandungan gula, dan jenis

23

makanan akan mempengaruhi produksi asam yang

dihasilkan.

Produk-produk yang dihasilkan dari pemecahan gula

akan dipengaruhi oleh jenis organisme. Enzim-enzim yang

ada di sel mikroorganisme akan memecah komponen

karbohidrat kompleks menjadi lebih sederhana, yaitu:

Sukrosa −─invertase

→ glukosa + fruktosa

Maltosa −─maltase

→ glukosa + glukosa

Laktosa −─β-galaktosidase

→ glukosa + galaktosa

Karena pati merupakan karbohidrat kompleks yang

sulit untuk dipecah, maka pembentukan asam dari pati

lebih lama dibandingkan pembentukan asam dari

karohidrat lainnya karena pati harus dipecah terlebih

dahulu menjadi glukosa oleh enzim amilase yang hanya

dihasilkan mikroorganisme amilolitik (Fardiaz, 1992).

Enzim amilase terdiri dari β–amilase dan α–amilase yang

memiliki kemampuan menghidrolisis lebih kuat daripada

β-amilase (Winarno, 1995). Aktivitas enzim amilase akan

mempengaruhi jumlah asam dan gula yang dihasilkan dari

pati (Fardiaz, 1992).

Yodium akan bereaksi secara kimiawi dengan pati dan

masuk ke dalam bagian pati yang kosong dan berbentuk

spiral sehingga terbentuk warna biru-kehitaman. Proses

yodinisasi ini akan membentuk molekul yang dapat

menyerap semua cahaya, kecuali warna biru. Jika pati

telah dipecah menjadi maltosa atau glukosa, maka warna

birunya akan hilang karena bentuk spiralnya sudah tidak

24

ada. Tidak terbentuknya warna pada saat larutan yodium

ditambahkan ke dalam media menunjukkan terjadinya

hidrolisis pati.

Pada media yang mengandung pati, maka pati di

sekitar pertumbuhan bakteri akan dihidrolisis oleh

enzim amilase yang dihasilkan bakteri. Jika zat pati

dihidrolisis, maka pada media agar yang diteteskan

larutan yodium akan timbul daerah transparan di sekitar

pertumbuhan bakteri yang ditunjukkan pada gambar 2.3.

Sebaliknya, jika pati tidak dihidrolisis, maka akan

timbul warna biru-kehitaman di sekitar pertumbuhan

(Lay, 1994).

Media yang biasa digunakan pada uji hidrolisis

karbohidrat adalah media Starch Agar (SA) yang mengandung

tripton, ekstrak khamir, K2HPO4, pati terlarut, agar,

dan air. Ekstrak khamir sebagai sumber vitamin B

kompleks, tripton dipakai untuk menyediakan nitrogen,

karbohidrat, dan garam mineral, air untuk menyalurkan

nutrient yang dibutuhkan mikroba, sedangkan pati

berfungsi sebagai komponen karbohidrat yang akan

dihidrolisis pada uji ini (Fardiaz, 1992).

Gambar 2.3 Daerah transparan pada uji hidrolisis patiSumber : Rossbach (2004)

25

2.4.2 Pemecahan Protein

Komponen utama protein adalah asam amino yang

terdiri dari unsur C, O, N, dan H. Ada tiga macam

protein yaitu protein sederhana (albumin, globulin,

gultelin, prolamin, dan albuminioid), protein

terkonjugasi (glikoprotein, fosfoprotein,

nukleoprotein), dan turunan protein (protein

terkoagulasi, metaprotein, pepton, peptide). Contoh-

contoh makanan yang mengandung protein adalah telur,

daging, susu, serelia, dan kacang-kacangan.

Pemecahan protein lebih kompleks dibandingkan

pemecahan karbohidrat. Produk akhir yang dihasilkan

juga lebih bervariasi karena protein memiliki struktur

yang lebih kompleks. Oleh karena itu, hanya

mikroorganisme yang memiliki sistem enzim yang kompleks

saja yang dapat mendekomposisi protein menjadi senyawa-

senyawa sederhana, yaitu:

Protein → proteosa → pepton → polipeptida →

peptida → asam amino → NH3 dan N

Produk akhir dan senyawa antara yang terbentuk

sangat bervariasi. Pemecahan protein juga akan

menghasilkan alkohol, beberapa gas, seperti CO2,

hidrogen, metana, amonia, dan komponen-komponen yang

berbau busuk, seperti indol, skatol, hidrogen sulfida,

kadaverin.

Dekomposisi protein oleh mikroorganisme disebut juga

dengan proses putrefaksi (Fardiaz, 1992) yang

26

menggunakan enzim protease untuk menghidrolisis ikatan

peptida di protein dan melepas asam amino (Volk dan

Wheeler, 1993). Selain terjadi pemecahan asam amino,

pada proses ini juga akan dihasilkan komponen-komponen

sederhana yang berbau busuk, contohnya Clostridium

memecah protein menjadi senyawa-senyawa sulfur berbau

busuk secara anaerobik. Pemecahan protein secara

anaerobik menghasilkan produk akhir yang lebih stabil

sehingga berbau busuk dan menyengat. Sebaliknya,

pemecahan protein yang terdiri dari asam-asam amino

sulfur secara aerobik tidak akan menyebabkan bau busuk

karena produk akhirnya lebih stabil dan dioksidasi

secara sempurna.

Walaupun dekomposisi protein sering mengakibatkan

bau busuk, namun pemecahan protein tetap merupakan

tahap yang penting dan dikehendaki dalam beberapa

proses pengolahan pangan, terutama pengembangan daging

dan pengolahan keju. Di dalam proses tersebut, akan

terjadi hidrolisis atau denaturasi protein agar dapat

mengempukkan protein daging dan mengumpulkan protein

susu (Fardiaz, 1992).

Pada hidrolisis protein, jika susu yang mengandung

kasein dicampur dengan media, maka akan timbul warna

keruh pada media akibat reaksi kasein dengan ion Ca2+

sehingga membentuk Ca-kasein. Kompleks Ca-kasein tidak

dapat larut di dalam media sehingga kompleks ini akan

27

membentuk larutan koloidal yang menyebabkan media

menjadi keruh.

Jika mikroorganisme memproduksi enzim kaseinase yang

dapat menghidrolisis kasein, maka daerah di sekitar

koloni bakteri akan berwarna jernih yang dapat dilihat

pada gambar 2.4. Kejernihan ini akibat penguraian

molekul kasein menjadi asam amino yang larut di dalam

media sehingga kekeruhan di sekitar koloni bakteri

menjadi hilang. Enzim yang digunakan untuk

menghidrolisis protein disebut juga enzim proteinase

(Lay, 1994).

Media untuk uji hidrolisis protein adalah media SMA

(Skim Milk Agar) yang tersusun dari tripton, dekstrosa,

ekstrak khamir, agar, air destilata, dan 20% susu skim

bubuk. Biasanya media ini dapat bekerja pada pH netral,

yaitu pH 7. Tripton sebagai sumber sumber N dan

mineral, ekstrak khamir sebagai sumber vitamin B

kompleks, dekstrosa sebagai sumber energi, sedangkan

susu skim bubuk mengandung kasein yang akan dipecah

pada uji hidrolisis ini (Fardiaz, 1992).

Gambar 2.4 Areal bening pada uji hidrolisis proteinSumber : Tugmon (2003)

2.4.3 Pemecahan Lemak

28

Lemak yang terdiri dari asam-asam lemak dan gliserol

merupakan komponen pangan yang sering ditemui pada

tanaman dan hewan. Jenis asam-asam lemaknya akan

mempengaruhi sifat lemak. Asam lemak yang terdiri dari

ikatan rangkap dan tidak memiliki jumlah atom H

maksimum disebut asam lemak tidak jenuh yang mudah

dipecah oleh mikroorganisme dan banyak ditemukan pada

minyak tumbuhan sedangkan asam lemak yang mempunyai

jumlah atom H maksimum disebut asam lemak jenuh dan

banyak ditemui pada minyak hewani.

Jika asam-asam lemak berantai pendek (asam butirat)

dihidrolisis, maka akan timbul bau yang menyengat.

Sebaliknya, asam-asam lemak berantai panjang (asam

oleat dan palmitat) bila dihidrolisis tidak akan

menyebabkan bau yang menyengat karena asam lemak

berantai panjang dan jenuh memiliki titik cair yang

lebih tinggi daripada asam lemak tidak jenuh berantai

pendek.

Lemak lebih sulit dipecah oleh mikrooganisme

daripada karbohidrat dan protein sehingga hanya

mikrooganisme lipolitik yang menghasilkan enzim lipase

saja yang dapat memecah lemak menjadi asam-asam lemak

bebas dan gliserol dengan bantuan air (Fardiaz, 1992),

selanjutnya gliserol dimetabolisasi melalui jalur EMP

dan asam lemaknya diuraikan melalui asetat pada siklus

asam sitrat (Volk dan Wheeler, 1993). Reaksi hidrolisis

ini akan dipercepat lagi dengan adanya asam, basa, dan

29

enzim-enzim (Winarno, 1995). Kapang dapat menghasilkan

enzim lipase dalam jumlah yang banyak sehingga sering

menyerang makanan yang kaya akan lemak dan menyebabkan

bau tengik (Fardiaz, 1992).

Jika lemak di dalam media dihidrolisis oleh enzim

lipase, maka daerah di sekitar koloni bakteri menjadi

asam akibat terbentuknya asam lemak. Indikator pH yang

ditambahkan ke dalam media akan membantu menunjukkan

adanya proses hidrolisis yang ditandai dengan perubahan

warna yang dintujukkan pada gambar 2.5. Indikator pH

yang dipakai akan mempengaruhi perubahan warna (Lay,

1994).

Media NA (Nutrient Agar) merupakan media yang dipakai

untuk hidrolisis lemak. Agar dapat digunakan untuk

menguji adanya mikroba lipolitik, maka pada media ini

ditambahkan lemak 1%. Komponen-komponen media ini

adalah ekstrak sapi sebagai zat hara untuk menyediakan

karbohidrat, nitrogen, vitamin, dan garam mineral,

pepton untuk mengontrol pH, agar, air untuk

transportasi nutrient yang dibutuhkan bagi pertumbuhan

mikroba, dan merah netral sebagai indikator (Fardiaz,

1992).

Gambar 2.5 Warna merah yang terbentuk pada uji hidrolisis lemak

30

Sumber : Engsterhold (1991)2.5 Uji Katalase

Menurut Lay (1994), katalase merupakan enzim yang

digunakan untuk mengkatalis reaksi penguraian H2O2

(hidrogen peroksida) menjadi H2O dan O2. Hidrogen

peroksida yang dihasilkan dari metabolisme aerob ini

bersifat toksik terhadap sel karena dapat

menginaktivasi enzim yang ada di dalam sel. Oleh karena

itu, senyawa toksik ini harus diuraikan oleh

mikroorganisme yang hidup di lingkungan aerob dengan

menggunakan enzim katalase. Enzim peroksidase juga

dapat digunakan untuk menguraikan H2O2, namun tidak

akan terbentuk O2 pada penguraian ini.

Uji katalase dapat digunakan untuk mengidentifikasi

kelompok bakteri tertentu, contohnya uji katalase

dipakai untuk membedakan Staphylococcus dan Streptococcus

pada kelompok bakteri kokus karena kelompok bakteri

Staphylococcus bersifat katalase positif sedangkan

Streptococcus bersifat katalase negatif.

Uji katalase dapat dilakukan dengan menggunakan

larutan H2O2 3% pada koloni yang terpisah. Jika bakteri

bersifat katalase positif, maka akan timbul gelembung

udara di sekitar koloni. Reaksi yang dikatalisasi oleh

enzim katalase adalah sebagai berikut:

H2O2 → H2O + ½ O2

katalase

gelembung udara

31

2.6 Pewarnaan Gram

Menurut Lay (1994), pewarnaan Gram biasanya

digunakan untuk membedakan bakteri Gram positif dan

bakteri Gram negatif. Biakan yang dipakai hendaknya

yang masih segar dan berumur 24-48 jam sehingga dapat

memberikan hasil yang baik dan tepat. Pada saat kultur

bakteri diberi kristal violet sebagai pewarna primer,

maka baik bakteri Gram positif dan negatif akan sama-

sama berwarna ungu.

Tahap selanjutnya adalah pemberian larutan lugol

sebagai mordan yang berfungsi untuk meningkatkan

afinitas pengikatan zat warna oleh bakteri sehingga

pengikatannya menjadi lebih kuat. Kristal violet dan

lugol akan membentuk kompleks yang berwarna ungu.

Setelah ditambahkan larutan mordan, zat warna akan

lebih jelas dan sulit untuk dilarutkan.

Ketika bakteri diberi larutan pemucat (aseton

alkohol), maka bakteri Gram negatif menjadi tidak

berwarna karena lipidnya larut di dalam larutan pemucat

sehingga pori-pori dinding sel menjadi besar dan

kompleks kristal violet-yodium dapat lepas sedangkan

bakteri Gram positif tetap berwarna ungu karena

kompleks kristal violet-yodium dapat dipertahankan dan

tetap melekat pada dinding sel.

Penambahan safranin sebagai zat warna sekunder

mengakibatkan bakteri Gram negatif menjadi berwarna

merah karena kompleks kristal violet-yodium telah larut

32

dan dinding selnya mengikat safranin sedangkan bakteri

Gram postif tetap berwarna ungu karena dinding selnya

sudah mengikat kristal violet sehingga tidak bisa

mengikat safranin lagi. Fungsi safranin adalah sebagai

zat warna pembeda terhadap pewarna primer.

Adanya perbedaan pada tahap perwarnaan Gram

disebabkan perbedaan struktur dinding sel yang dimiliki

bakteri Gram positif dan negatif. Sebagian besar

dinding sel bakteri Gram positif tersusun dari

peptidoglikan sedangkan komponen utama dinding sel

bakteri Gram negatif adalah lipid yang dapat larut di

dalam alkohol dan aseton sehingga dinding selnya

menjadi besar dan kompleks kristal violet-yodium dapat

keluar.

2.7 Bacillus cereus

Menurut Fardiaz (1992), Bacillus cereus termasuk bakteri

pembentuk spora yang berbentuk silinder dan tidak

membengkak. Bakteri ini berkatalase positif, bergram

positif, aerob sampai anaerob fakultatif, dan sering

menghasilkan asam tanpa gas yang sering merusak makanan

kaleng. Spesies ini juga bersifat proteolitik yang

dapat menghasilkan enzim proteinase yang digunakan

untuk memecah protein menjadi polipeptida dan asam

amino. Enzim yang diproduksi ini menyerupai rennin

sehingga sering mengumpalkan susu. Bakteri ini juga

termasuk bakteri lipolitik yang dapat memecah lemak

33

menjadi asam lemak dan gliserol. Bakteri Bacillus cereus

dapat dilihat pada gambar 2.6.

Gambar 2.6 Bacillus cereusSumber : Loi (2007)

2.8 Fusarium moniliforme

Kapang ini banyak ditemui pada makanan dan sulit

untuk dikenali karena penampakan pertumbuhannya yang

bervariasi. Ciri utama dari Fusarium sp. adalah adanya

makrokonidia yang berbentuk pedang, multisel, dan

berwarna. Kadang-kadang juga terdapat mikrokonidia yang

berbentuk oval. Biasanya kapang ini menghasilkan enzim

hidrolitik, seperti amilase, lipase, dan proteinase

yang dapat digunakan untuk memecah makromolekul menjadi

komponen yang lebih sederhana sehingga Fusarium sp. dapat

dtumbuh pada media yang mengandung pati, lipid, pektin,

dan protein.

Kapang ini dapat memproduksi asam giberelat yang

dapat digunakan untuk memproduksi benih dan mengganti

hormon pertumbuhan. Selain itu, Fusarium sp. sering

dipakai dalam fermenatsi makanan, namun kelemahan

fermentasi kapang adalah adanya miselium yang dapat

menganggu penampakan makanan.

Kapang ini juga dapat menghasilkan antibiotik,

enzim, dan asam. Enzim amilase dan proteinase merupakan

enzim utama dalam fermentasi makanan oleh kapang.

34

Hidrolisis pati digunakan dalam industri yang memakai

tape, ragi, dan koji sebagai starternya, hidrolisis

proein dalam industri kecap dan tauco, sedangkan

hidrolisis lemak dalam industri susu (Fardiaz, 1992).

Fusarium miniliforme dapat dilihat pada gambar 2.7.

Gambar 2.7 Fusarium moniliforme Sumber : Rohmhaas (2006)

2.9 Candida tropicalis

Khamir ini bersifat oksidatif, tetapi bersifat

fermentatif lemah atau negatif juga dan sering ditemui

pada makanan yang mengandung kadar garam dan asam dalam

jumlah yang tinggi. Spesies ini dapat membentuk film

pada permukaan bahan pangan dan sering merusak produk

pangan berkadar garam dan asam tinggi. C. tropicalis dapat

memfermentasi monosakarida dan disakarida, seperti

galaktosa, glukosa, maltosa, sukrosa, laktosa, dan

raffinosa, tetapi jarang yang dapat memfermentasi pati

karena jumlah enzim pemecah polisakaridanya sangat

rendah. Dari proses fermenatsi, khamir dapat

menghasilkan alkohol, CO2, dan produk-produk lain

(Fardiaz, 1992). C. tropicalis dapat dilihat pada gambar

2.8.

35

Gambar 2.8 Candida tropicalisSumber : Doctorfungus (2007)

BAB III

METODE KERJA

3.1 Alat dan Bahan

36

Alat-alat yang digunakan pada percobaan ini adalah

gelas benda, gelas penutup, jarum ose, lampu spiritus,

mikroskop, penjepit, hair dryer, hand counter, inkubator

dengan suhu 30-320C, dan vortex.

Bahan-bahan yang dipakai adalah cat Gram A yang

berupa larutan cat Hucker’s crystal violet, larutan Gram B

berupa larutan mordan lugol’s iodine, larutan Gram C berupa

larutan aseton-alkohol, cat Gram D berupa larutan cat

safranin, alkohol, tabung Glucose Broth (GB) + indikator

Brom Cresol Purple (BCP) + tabung durham, tabung Sucrose

Broth (SB) + indikator BCP + tabung durham, tabung

Lactose Broth (LB) + indikator BCP + tabung durham, cawan

Starch Agar (SA), cawan Skim Milk Agar (SMA), cawan Nutrient

Agar (NA) + 1% lemak + neutral red, tabung dan cawan

kontrol untuk masing-masing media, larutan lugol

(yodium), larutan H2O2 3%, kultur murni Candida tropicalis,

Fusarium moniliforme, dan bakteri Bacillus cereus, serta sampel

erlenmeyer air sayur asin, air rendaman tahu, air

asinan, dan air tajin.

3.2 Prosedur Kerja

3.2.1 Uji Fermentasi

1. Empat tabung berisi GB + indikator BCP + tabung

durham, empat tabung berisi SB + indikator BCP +

tabung durham, dan empat tabung berisi LB +

indikator BCP + tabung durham disiapkan.

37

2. Satu tabung dari masing-masing media diinokulasi

dengan satu ose kultur murni dari khamir Candida

tropicalis, satu tabung diinokulasi dengan satu ose

kultur murni Fusarium moniliforme, satu tabung lagi

diinokulasi dengan satu ose kultur murni bakteri

Bacillus cereus, dan satu tabung lainnya dengan satu

ose sampel air tajin.

3. Tabung-tabung yang telah diinokulasi tersebut

diinkubasi pada suhu 30-320C selama 2 hari.

4. Gas yang terbentuk pada tabung durham dan asam

yang terbentuk pada media yang ditandai dengan

perubahan warna media dari ungu menjadi kuning

diamati dan dibandingkan dengan tabung kontrol.

3.2.2 Uji Hidrolisis Pati

1. Setengah bagian cawan SA digores langsung dengan

ose yang telah dipijarkan dari kultur murni

Candida tropicalis sedangkan setengah bagian lagi

tidak diinokulasi, satu cawan digores dengan ose

dari kultur murni Fusarium moniliforme, satu cawan

lagi digores dengan ose dari kultur murni bakteri

Bacillus cereus, dan satu cawan lainnya digores dengan

ose dari sampel air tajin.

2. Cawan-cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30-320C

selama 2 hari.

3. Larutan yodium diteteskan pada semua cawan SA

sehingga semua bagian terendam.

38

4. Bagian transparan (kuning) yang mengelilingi

koloni yang menunjukkan adanya hidrolisis pati

diamati dan dibandingkan dengan cawan kontrol.

3.2.3 Uji Hidrolisis Protein

1. Setengah bagian cawan SMA digores langsung dengan

ose yang telah dipijarkan dari kultur murni

Candida tropicalis sedangkan setengah bagian lagi

tidak diinokulasi, satu cawan digores dengan ose

dari kultur murni Fusarium moniliforme, satu cawan

lagi digores dengan ose dari kultur murni bakteri

Bacillus cereus, dan satu cawan lainnya digores dengan

ose dari sampel air tajin.

2. Cawan-cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30-320C

selama 2 hari.

3. Areal bening yang mengelilingi koloni mikroba

proteolitik yang menunjukkan adanya hidrolisis

protein diamati dan dibandingkan dengan cawan

kontrol.

3.2.4 Uji Hidrolisis Lemak

1. Setengah bagian cawan NA yang mengandung 1% lemak

dan neutral red digores langsung dengan ose yang

telah dipijarkan dari kultur murni Candida tropicalis

sedangkan setengah bagian lagi tidak diinokulasi,

satu cawan digores dengan ose dari kultur murni

Fusarium moniliforme, satu cawan lagi digores dengan

39

ose dari kultur murni bakteri Bacillus cereus, dan

satu cawan lainnya digores dengan ose dari sampel

air tajin.

2. Cawan-cawan tersebut diinkubasi pada suhu 30-320C

selama 2 hari.

3. Warna merah yang terbentuk di bagian bawah koloni

yang menunjukkan adanya hidrolisis lemak diamati

dan dibandingkan dengan cawan kontrol.

3.2.5 Uji Katalase

1. Air steril diteteskan di atas gelas objek,

kemudian dua ose pertumbuhan kultur Candida tropicalis

diambil dan diletakkan di atas air steril pada

gelas objek.

2. Dua tetes larutan 3% H2O2 diteteskan di atas gelas

objek tersebut.

3. Langkah di atas diulangi untuk kultur Fusarium

moniliforme, Bacillus cereus, dan sampel air tajin.

4. Gelembung-gelembung kecil oksigen yang terbentuk

yang menandakan adanya enzim katalase diamati.

3.2.6 Pewarnaan Gram

1. Pewarnaan Gram dilakukan pada sampel air tajin

yang digunakan.

2. Hasil pewarnaan tersebut diamati.

3. Jumlah bakteri Gram positif dan bakteri Gram

negatif dinyatakan kira-kira dalam persen.

40

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Bakteri Bacillus cereus

Tabel 4.1 Hasil uji yang dilakukan terhadap bakteri Bacillus cereus PertumbuhanBakteri

UjiFermentasi

GB gasasam

-+

LB gasasam

-+

SB gasasam

-+

Uji Hidrolisis Pati -Uji Hidrolisis Protein +Uji Hidrolisis Lemak +

Uji Katalase SA +SMA -

NA + lemak +

Fermentasi merupakan proses pemecahan molekul-

molekul, seperti karbohidrat dan asam amino tanpa

membutuhkan oksigen agar dapat memproduksi energi yang

41

dibutuhkan bagi pertumbuhan mikroba. Proses fermentasi

sering terjadi pada komponen karbohidrat, yaitu

sukrosa, laktosa, glukosa, maltosa, dan sebagainya.

Pada uji fermentasi, media yang digunakan harus

mengandung karbohidrat agar dapat difermentasi oleh

mikroba yang ada. Dalam percobaan ini, media yang

dipakai adalah Glucose Broth, Sucrose Broth, dan Lactose Broth.

Media-media ini mengandung ekstrak sapi, pepton, air

destilata, dan yang paling utama adalah glukosa,

sukrosa, dan laktosa untuk masing-masing media. Pepton

dan ekstrak sapi berperan sebagai sumber nitrogen,

vitamin, dan mineral untuk pertumbuhan mikroba

(Fardiaz, 1992).

Indikator BCP yang ditambahkan ke dalam media

berfungsi untuk mengetahui terbentuknya asam yang

ditandai dengan perubahan warna media dari ungu menjadi

kuning karena indikator BCP akan berwarna ungu pada

pH>7 dan berwarna kuning pada pH asam sedangkan tabung

durham digunakan untuk menangkap gas yang terbentuk

pada proses fermentasi. Tabung durham biasanya dipakai

bila jenis dan jumlah gas tidak perlu diketahui. Gas

yang masuk ke dalam tabung ini akan tampak sebagai

gelembung-gelembung udara yang terperangkap dan

mendorong cairan yang ada di dalam tabung (Lay, 1994).

Bacillus cereus banyak terdapat pada makanan. Bakteri

ini berkatalase positif, aerobik sampai anaerobik

fakultatif, bergram positif, dan dapat membentuk spora.

42

B. cereus dapat memproduksi asam tanpa gas jika

ditumbuhkan pada makanan dan memiliki sifat proteolitik

kuat yang menghasilkan enzim proteolitik yang bersifat

menyerupai rennin sehingga mampu menggumpalkan susu.

Spesies ini juga termasuk bakteri lipolitik yang mampu

memecah lemak (Fardiaz, 1992).

Dari hasil percobaan uji fermentasi, diketahui bahwa

B. cereus dapat memecah glukosa menjadi asam yang

ditunjukkan dengan perubahan warna media GB dari coklat

menjadi kuning, namun tidak terbentuk gas pada

fermentasi ini. Asam yang dihasilkan ini akan

menurunkan pH media sehingga mengubah warna

indikatornya karena BCP akan berwarna kuning pada pH

asam.

Ada dua tahap pada proses fermentasi glukosa, yaitu

proses pemecahan rantai karbon glukosa dan pelepasan

atom hidrogen untuk memproduksi asam piruvat serta

pereduksian asam piruvat oleh atom hidrogen untuk

menghasilkan senyawa-senyawa, seperti asam dan gas

sebagai produk fermentasi. Reaksi ini merupakan reaksi

redoks yang harus seimbang (Fardiaz, 1992).

B. cereus memecah glukosa menjadi asam piruvat melalui

jalur EMP (Embden Meyerhoff Parnas). Bakteri ini akan

menghasilkan enzim aldolase untuk memecah fruktosa

difosfat menjadi dua molekul gliseraldehida fosfat dan

enzim gliseraldehida fosfat dehidrogenase untuk

43

mengkatalis reaksi fosfogliseraldehida yang akan

memproduksi ATP.

Asam piruvat yang dihasilkan pada jalur glikolisis

(EMP) akan direduksi oleh NADH2 untuk memproduksi asam

laktat. Karena B. cereus hanya memproduksi asam laktat

saja sebagai satu-satunya hasil akhir fermentasi, maka

bakteri ini dapat digolongkan sebagai bakteri asam

laktat homofermentatif yang dapat menghasilkan asam

laktat dalam jumlah yang tinggi. Reaksi yang terjadi

adalah:

Glukosa → 2 Asam laktat

B. cereus juga dapat memproduksi enzim yang dapat

memecah sukrosa dan laktosa menjadi monosakarida. Enzim

yang dihasilkan adalah β-galaktosidase yang akan

memecah laktosa menjadi galaktosa dan glukosa serta

enzim invertase yang memecah sukrosa menjadi glukosa

dan fruktosa. Uji fermentasi yang dilakukan menujukkan

bahwa terbentuk asam laktat sebagai produk fermentasi

pada media SB yang berubah warna dari merah menjadi

kuning dan LB yang berubah warna dari biru keunguan

menjadi kuning akibat penurunan pH media.

Zat-zat nutrient di alam biasanya masih berupa

makromolekul, seperti karbohidrat, protein, lipid, dan

asam nukleat. Agar dapat dipakai oleh sel untuk

mensintesis komponen-komponennya, maka makromolekul

tersebut harus dihidrolisis terlebih dahulu. Proses

hidrolisis sendiri merupakan pemutusan ikatan molekul

44

dengan menambahkan air (Lay, 1994). Protein lebih sulit

dihidrolisis dibandingkan dengan karbohidrat karena

strukturnya yang kompleks sedangkan lemak merupakan

komponen yang paling sulit dihidrolisis.

Karbohidrat akan dihidrolisis menjadi komponen yang

lebih sederhana, seperti disakarida atau monosakarida,

asam, gas, dan produk-produk akhir lainnya. Asam laktat

merupakan asam utama yang dihasilkan pada proses

pemecahan ini. Protein akan dipecah menjadi asam amino,

alkohol, beberapa gas, contohnya CO2, hidrogen, amonia,

dan senyawa berbau busuk, seperti indol dan skatol

sedangkan lemak akan dihidrolisis menjadi asam lemak

dan gliserol (Fardiaz, 1992).

Dari uji hidrolisis pati, lemak, dan protein, dapat

diketahui bahwa B. cereus merupakan bakteri proteolitik

dan lipolitik tetapi tidak termasuk bakteri amilolitik.

Hasil ini tidak cocok dengan teori yang ada. Menurut

Kim (2004), B. cereus merupakan bakteri amilolitik yang

dapat memecah pati. Hal ini dapat dilihat karena tidak

terbentuknya daerah transparan pada media SA setelah

ditetesi lugol yang menunjukkan adanya hidrolisis pati.

Kesalahan ini dapat terjadi karena koloni yang tumbuh

terlalu sedikit atau lugol yang ditambahkan kurang

banyak.

B. cereus termasuk bakteri proteolitik kuat dan juga

bakteri lipolitik yang dapat memecah lemak (Fardiaz,

1992). Bakteri ini termasuk bakteri proteolitik

45

ditunjukkan dengan terbentuknya daerah bening yang

mengelilingi koloni pada media SMA. Daerah yang jernih

ini dapat terbentuk karena kasein di dalam susu pada

media telah dihidrolisis oleh enzim kaseinase yang

diproduksi bakteri B. cereus menjadi asam-asam amino yang

mudah larut di dalam media sehingga kekeruhan yang

disebabkan kompleks Ca-kasein menjadi hilang (Lay,

1994).

B. cereus juga termasuk bakteri lipolitik yang ditandai

dengan terbentuknya area yang berwarna merah di bagian

bawah koloni. Indikator neutral red yang ditambahkan ke

dalam media akan membantu untuk menunjukkan adanya

proses hidrolisis lemak melalui perubahan warna menjadi

merah. B. cereus akan memproduksi enzim lipase untuk

menghidrolisis lemak menjadi asam lemak dan gliserol.

Asam lemak yang dihasilkan dari proses hidrolisis ini

akan menurunkan pH media (Lay, 1994).

Media yang digunakan untuk hidrolisis karbohidrat

adalah media SA (Starch Agar) yang terdiri dari tripton,

ekstrak khamir, K2HPO4, pati terlarut, agar, dan air.

Tripton berfungsi sebagai sumber karbohidrat, N, dan

mineral, ekstrak khamir untuk sumber vitamin B, air

untuk transport zat-zat nutrient, sedangkan pati

sebagai komponen yang akan dipecah pada hidrolisis

karbohidrat.

Media untuk hidrolisis protein adalah media SMA

(Skim Milk Agar) yang mengandung tripton, ekstrak khamir,

46

dekstrosa, agar, air destilata, dan 20% susu skim

bubuk. Ekstrak khamir sebagai sumber vitamin B

kompleks, tripton dipakai untuk menyediakan nitrogen

dan mineral, sedangkan kasein yang ada di dalam susu

akan menyebabkan media menjadi berwarna keruh.

Media untuk hidrolisis lemak adalah media NA (Nutrient

Agar) yang terdiri dari ekstrak sapi, pepton, 1%

margarin, agar, air destilata, dan ditambah dengan

indikator neutral red. Ekstrak sapi sebagai sumber

nitrogen, karbohidrat, vitamin, dan mineral, pepton

untuk mengatur pH, air untuk menyalurkan nutrient,

neutral red sebagi indikator (Fardiaz, 1992).

Pada saat uji hidrolisis karbohidrat pada media SA

dan uji hidrolisis lemak pada media NA+lemak, bakteri

B. cereus bersifat katalase positif sedangkan pada uji

hidrolisis protein pada media SMA, bakteri ini bersifat

katalase negatif. Katalase sendiri merupakan enzim yang

dapat digunakan untuk mengkatalis reaksi penguraian

H2O2 menjadi O2 dan air. H2O2 sendiri bersifat toksik

karena dapat menginaktivasi enzim. Adanya enzim

katalase dapat ditunjukkan dengan terbentuknya

gelembung-gelembung kecil O2 di sekitar koloni setelah

ditetesi H2O2. B. cereus termasuk bakteri berkatalase

positif (Fardiaz, 1992). Namun bakteri ini berkatalase

negatif pada saat uji hidrolisis protein padahal

seharusnya berkatalase positif. Hal ini dapat terjadi

47

karena kurangnya larutan H2O2 yang ditambahkan atau

koloni B. cereus yang diambil kurang banyak.

4.2 Kapang Fusarium moniliforme

Tabel 4.2 Hasil uji yang dilakukan terhadap kapang Fusariummoniliforme

Pertumbuhan KapangUji

FermentasiGB gas

asam--

LB gasasam

-+

SB gasasam

-+

Uji Hidrolisis Pati +Uji Hidrolisis Protein 0Uji Hidrolisis Lemak 0

Uji Katalase SA +SMA 0

NA + lemak 0

Kapang banyak digunakan di dalam fermentasi makanan

tradisional dan pembuatan keju, namun fermentasi oleh

kapang memiliki kelemahan, yaitu pada permukaan makanan

yang difermentasi dapat tumbuh miselium yang

mempengaruhi penampakan dari makanan. Pada proses

fermentasi, kapang akan menghasilkan asam, enzim, dan

antibiotik. Enzim utama yang berperan dalam fermentasi

makanan oleh kapang adalah enzim amilase dan

proteinase. Pemecahan pati oleh enzim amilase banyak

digunakan dalam industri pembuatan produk yang memakai

ragi, tape, dan koji sebagai starternya, pemecahan

protein oleh enzim proteinase digunakan dalam industri

pembuatan kecap dan tauco, sedangkan pemecahan lemak

dipakai untuk industri keju.

48

Fusarium sp. termasuk kapang bersekat dan tidak

memiliki spora seksual. Kapang ini sering ditemukan

pada makanan dan sulit diidentifikasi karena penampakan

pertumbuhannya bervariasi. Ciri utama yang membedakan

Fusarium sp. dari kapang lainnya adalah adanya

makrokonidia yang tampak sebagai pedang dan tersusun

dari beberapa sel serta berwarna. Fusarium sp. biasanya

dipakai untuk mengganti hormon pertumbuhan dan

memproduksi benih (Fardiaz, 1992).

Dari hasil uji fermentasi, didapat bahwa Fusarium sp.

hanya dapat memecah laktosa dan sukrosa menjadi asam

yang ditandai dengan perubahan warna media dari ungu

menjadi kuning, namun tidak terbentuk gas pada tabung

durham. Fusarium sp. akan memproduksi enzim β-

galaktosidase yang digunakan untuk memecah laktosa

menjadi galaktosa dan glukosa serta enzim invertase

yang memecah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa.

Monosakarida-monosakarida ini kemudian dipecah lagi

untuk menghasilkan produk akhir lainnya, seperti ragi

tape, koji. Proses fermentasi oleh kapang banyak

digunakan untuk pembuatan produk-produk yang memakai

ragi, tape, dan koji sebagai starternya.

Pada uji hidrolisis karbohidrat, dapat dilihat bahwa

Fusarium sp. termasuk mikroba amilolitik yang dapat

memecah karbohidrat menjadi komponen yang lebih

sederhana dengan menggunakan enzim amilase yang

diproduksi kapang ini dan ditandai dengan terbentuknya

49

daerah transparan yang mengelilingi koloni setelah

diteteskan dengan yodium. Yodium akan bereaksi dengan

pati dan masuk ke bagian pati yang kosong dan berbentuk

spiral sehingga membentuk warna biru kehitaman. Jika

pati telah dihidrolisis menjadi disakarida maupun

monosakarida, maka warna biru ini akan hilang karena

bentuk spiralnya sudah tidak ada. Hal ini cocok dengan

teori yang ada. Menurut Mader (2007), Fusarium sp. dapat

menghasilkan enzim amilase pada pati.

Pada uji hidrolisis protein dan lipid, kapang

Fusarium sp. tidak dapat tumbuh pada media SMA dan

NA+lemak. Hal ini disebabkan karena penggoresan yang

tidak menyentuh permukaan agar sehingga tidak ada

kapang Fusarium sp. yang tumbuh pada media tersebut.

Umumnya, kapang dapat tumbuh pada makanan yang

mengandung pati, protein, dan lipid karena kapang dapat

menghasilkan enzim hidrolitik, yaitu enzim amilase,

proteinase, dan lipase untuk memecah komponen makanan

kompleks menjadi sederhana (Fardiaz, 1992). Sebenarnya

mungkin ada sedikit Fusarium sp. yang tumbuh, namun

karena penampakan pertumbuhan kapang ini bervariasi

sehingga sulit untuk diidentifikasi. Menurut Rodier

(1996), Fusarium sp. termasuk mikroorganisme proteolitik

dan lipolitik yang dapat memecah protein dan lemak.

Pada uji katalase, Fusarium sp. dapat menghasilkan

enzim katalase untuk memecah senyawa beracun H2O2 pada

media SA menjadi air dan oksigen yang ditandai dengan

50

terbentuknya gelembung-gelembung oksigen di sekitar

koloni setelah ditetesi H2O2, tetapi karena pada media

SMA dan NA+lemak tidak ada kapang yang tumbuh sehingga

tidak dapat dilakukan uji katalase. Namun sebenarnya

Fusarium sp. termasuk mikroba berkatalase positif dan

juga mikroba aerob karena H2O2 biasanya terbentuk pada

metabolisme aerob.

4.3 Khamir Candida tropicalis

Tabel 4.3 Hasil uji yang dilakukan terhadap khamir Candida tropicalisPertumbuhan Khamir

UjiFermentasi

GB gasasam

++

LB gasasam

--

SB gasasam

++

Uji Hidrolisis Pati -Uji Hidrolisis Protein -Uji Hidrolisis Lemak +

Uji Katalase SA +SMA +

NA + lemak +

Berdasarkan sifat metabolismenya, ada dua kelompok

khamir yaitu khamir fermentatif yang dapat memecah

glukosa menjadi alkohol dan CO2 melalui jalur

glikolisis EMP dan khamir oksidatif yang membutuhkan

oksigen untuk pertumbuhannya. Beberapa spesies Candida

sp. bersifat oksidatif tetapi dapat melakukan fermentasi

secara lemah atau negatif juga.

Pada proses fermentasi oleh khamir, khamir yang

ditumbuhkan pada media glukosa umumnya mengandung

jumlah enzim penghidrolisis disakarida dan polisakarida

51

yang sangat rendah. Banyak khamir yang dapat melakukan

fermentasi terhadap disakarida dan trisakarida, namun

hanya beberapa spesies khamir yang dapat memfermentasi

polisakarida. Gula yang biasanya difermentasi oleh

khamir adalah galaktosa, glukosa, maltosa, sukrosa, dan

laktosa.

C. tropicalis umumnya membentuk film pada permukaan

makanan dan sering merusak makanan yang berkadar garam

dan asam tinggi. Khamir ini biasanya digunakan untuk

memecah gula dan memproduksi massa sel dari molase tebu

(Fardiaz, 1992).

Pada uji fermentasi, dapat diketahui bahwa C. tropicalis

dapat memfermentasi glukosa dan sukrosa serta

menghasilkan asam dan gas yang ditandai dengan

perubahan warna media GB dari coklat menjadi kuning dan

perubahan warna media SB dari merah menjadi kuning

serta terbentuknya gelembung gas di tabung durham pada

kedua media. Glukosa akan dipecah menjadi asam piruvat

yang dipecah lagi menjadi asam laktat, asam asetat,

etanol, CO2, dan metabolit-metabolit lain sedangkan

sukrosa dipecah menajdi fruktosa dan glukosa oleh enzim

invertase yang diproduksi C. tropicalis. Laktosa sendiri

tidak bisa difermentasi oleh C. tropicalis karena tidak ada

perubahan warna pada media LB yang telah diberi

indikator dan tidak ada gelembung gas yang terbentuk

pada tabung durham.

52

Pada uji hidrolisis, diketahui bahwa C. tropicalis

termasuk mikroba lipolitik, amilolitik, dan

proteolitik. C. tropicalis termasuk mikroba lipolitik

karena dapat memproduksi asam secara lemah yang

ditandai dengan terbentuknya sedikit warna merah di

sekitar koloni. Hal ini menunjukkan bahwa khamir ini

dapat menghasilkan enzim lipase yang memecah lemak

menjadi asam lemak dan gliserol. Asam yang terbentuk

akan menurunkan pH media.

C. tropicalis juga termasuk mikroba amilolitik yang

dapat menghasilkan enzim α-amilase untuk memecah pati

menjadi komponen yang lebih sederhana, yaitu disakarida

maupun monosakarida. Hal ini ditunjukkan dengan

terbentuknya daerah transparan yang mengelilingi koloni

setelah ditetesi dengan yodium karena sudah tidak

adanya kompleks pati-yodium yang berbentuk biru

kehitaman. Hal ini sesuai dengan teori. Menurut Azoulay

(1980), C. tropicalis mengeluarkan enzim yang dapat

digunakan untuk menghidrolisis pati, yaitu α-amylase

menjadi komponen-komponen yang lebih sederhana,

terutama gula.

C. tropicalis juga menunjukkan hasil yang positif pada

uji hidrolisis protein yang ditunjukkan dengan

terbentuknya areal bening yang mengelilingi koloni C.

tropicalis karena asam amino hasil hidrolisis protein

dapat larut di dalam media SMA. Hal ini cocok dengan

teori yang ada. Menurut Okumura (2006), C. tropicalis

53

termasuk mikroba proteolitik yang dapat memecah protein

menjadi peptida dan asam amino.

Pada uji katalase, C. tropicalis bersifat katalase

positif untuk semua media yang ada. Hal ini menunjukkan

bahwa khamir ini memiliki enzim katalase yang dapat

digunakan untuk menguraikan hidrogen peroksida menjadi

air dan oksigen yang ditandai dengan terbentuknya

gelembung-gelembung gas di sekitar koloni setelah

diteteskan H2O2.

4.4 Air TajinTabel 4.4 Hasil uji yang dilakukan terhadap air tajin

PertumbuhanMikroba

UjiFermentasi

GB gasasam

++

LB gasasam

++

SB gasasam

++

Uji Hidrolisis Pati +Uji Hidrolisis Protein +Uji Hidrolisis Lemak +

Uji Katalase SA +SMA +

NA + lemak +

Beras yang difermentasi akan menghasilkan miso yang

biasanya digunakan untuk membuat sup dan memberi

tambahan rasa makanan. Pertama-tama, air beras

diinokulasi dengan Aspergillus oryzae sehingga terjadi

proses fermentasi pada suhu 400C secara aerobik. Agar

dapat ditumbuhi kapang, beras ini harus daalm keadaan

54

basah. Beras berkapang disebut koji yang merupakan

stater untuk fermentasi.

Campuran bahan dengan garam, koji, kedelai, miso,

dan air difermentasi pada suhu 280C selama seminggu

secara aerobik, lalu campuran ini dimasukkan ke dalam

tong untuk memulai fermentasi kedua dengan menggunakan

khamir Saccharomyces rouxii pada suhu 350C selama 2 bulan

secara anaerobik. Pada fermentasi ini, bakteri-bakteri

asam laktat akan ikut berperan (Buckle et al., 1987).

Dari hasil percobaan, diketahui bahwa mikroba-

mikroba yang tumbuh di air tajin dapat memecah glukosa,

sukrosa, laktosa menjadi asam dan gas yang ditandai

dengan perubahan warna media dari ungu menjadi kuning

dan terbentuknya gas pada tabung durham. Hasil

pemecahan komponen karbohidrat di air tajin akan

menghasilkan produk akhir, berupa miso yang dapat

dipakai untuk membuat sup dan memberi tambahan rasa

pada makanan. Selain itu, juga dihasilkan asam laktat,

alkohol, enzim, CO2, dan produk-produk lainnya.

Mikroba-mikroba yang ada di dalam air tajin adalah

bakteri-bakteri asam laktat, kapang Aspergillus oryzae, dan

khamir Saccharomyces rouxii.

Bakteri asam laktat akan memecah gula dan

menghasilkan asam laktat sebagai produk akhir serta

menurunkan pH lingkungan pertumbuhannya akibat

terbentuknya asam. Aspergillus oryzae dapat menghasilkan

enzim protease untuk membuat minuman beralkohol dari

55

nasi sedangkan S. rouxii bersifat osmofilik dan tahan

dengan kandungan gula yang tinggi (Fardiaz, 1992).

Mikroba-mikroba di air tajin juga menunjukkan hasil

yang positif pada uji hidrolisis karbohidrat, protein,

dan lemak. Mikroba-mikroba ini termasuk mikroba

amilolitik, proteolitik, dan lipolitik. Hal ini

ditunjukkan dengan terbentuknya daerah transparan yang

mengelilingi koloni pada media SA, koloni yang

dikelilingi areal bening pada media SMA, dan

terbentuknya daerah yang berwarna merah di bagian bawah

koloni pada media NA.

Pada uji katalase, mikroba-mikroba ini juga termasuk

katalase positif yang ditandai dengan terbentuknya

gelembung-gelembung kecil O2 pada koloni. Hal ini

berarti mikroba-mikroba ini memiliki enzim katalase

yang dapat memecah hidrogen peroksida menjadi air dan

oksigen.

4.5 Air Rendaman TahuTabel 4.5 Hasil uji yang dilakukan terhadap air rendaman tahu

PertumbuhanMikroba

UjiFermentasi

GB gasasam

++

LB gasasam

++

SB gasasam

++

Uji Hidrolisis Pati +Uji Hidrolisis Protein +Uji Hidrolisis Lemak +

Uji Katalase SA +SMA +

56

NA + lemak +

Tahu dibuat dari kacang kedelai yang direndam dan

didedak hingga menjadi suatu campuran antara air dengan

kacang kedelai. Campuran ini disaring sehingga hanya

susu kedelai yang dapat lewat. Susu kedelai kemudian

diberi garam, seperti magnesium klorida atau kalsium

sulfat agar menggumpal. Selanjutnya, gumpalan ini di-

press menjadi potongan tahu. Menurut Ewald (1997),

bakteri yang biasa berperan di dalam fermentasi tahu

adalah Bacillus cereus.

Pada percobaan uji fermentasi, diketahui bahwa

mikroba di air tahu dapat melakukan fermentasi terhadap

semua komponen karbohidrat yang ada, baik glukosa,

sukrosa, maupun laktosa. Fermentasi glukosa, laktosa,

dan sukrosa ditandai dengan terbentuknya asam pada

media yang dilihat dari perubahan indikator pada media

menjadi kuning dan gas yang terdapat pada tabung

durham. Glukosa akan dipecah menajdi asam piruvat yang

dipecah lagi menjadi asam laktat dan CO2 atau etanol

sedangkan enzim invertase memecah sukrosa menjadi

fruktosa dan glukosa. Laktosa dipecah oleh enzim β-

galaktosidase menjadi galaktosa dan glukosa.

Pada uji hidrolisis, mikroba yang ada di air tahu

termasuk mikroba amilolitik, proteolitik, dan lipolitik

yang ditandai dengan terbentuknya daerah transparan

yang mengelilingi koloni pada media SA, areal bening di

sekitar koloni pada media SMA, dan terbentuknya warna

57

merah di bawah koloni pada media NA+lemak. Hal ini

sesuai dengan teori yang ada. B. cereus termasuk bakteri

lipolitik dan proteolitik (Fardiaz, 1992) dan juga

bakteri amilolitik (Kim, 2004).

Dari uji katalase, diketahui bahwa mikroba di air

tahu termasuk mikroba aerob yang dapat memecah hidrogen

peroksida menjadi air dan oksigen. Mikroba ini dapat

menghasilkan enzim katalase untuk semua media yang ada.

Hal ini cocok dengan teori yang ada. B. cereus berkatalase

positif (Fardiaz, 1992).

4.6 Air Sayur AsinTabel 4.6 Hasil uji yang dilakukan terhadap air sayur asin

PertumbuhanMikroba

UjiFermentasi

GB gasasam

-+

LB gasasam

-+

SB gasasam

-+

Uji Hidrolisis Pati +Uji Hidrolisis Protein +Uji Hidrolisis Lemak +

Uji Katalase SA +SMA +

NA + lemak +

Sayur asin terbuat dari kobis yang diasamkan. Kobis

yang telah diiris-iris dimasukkan ke dalam tangki yang

berisi air garam. Air dan nutrisi di jaringan sayuran

akan ditarik oleh garam sebagai substrat untuk

pertumbuhan bakteri asam laktat. Garam dan asam yang

dihasilkan dari proses fermentasi dapat menghambat

58

pertumbuhan mikroba lain. Fermentasi diawali oleh

bakteri Leuconostoc mesenteroides dan diteruskan oleh

Lactobacillus delbrückii yang lebih tahan terhadap asam.

Fermentasi dilakukan pada suhu antara 25-300C dalam

waktu 2-3 minggu (Buckle et al., 1987). Pada sayur asin,

juga dapat tumbuh khamir (Fardiaz, 1992).

Dari hasil percobaan uji fermentasi, dapat diketahui

bahwa mikroba-mikroba yang ada di air sayur asin dapat

memecah glukosa, laktosa, dan sukrosa menjadi asam.

Asam ini dapat berupa asam laktat yang merupakan asam

utama pada proses fermentasi ini. Terbentuknya asam

ditandai dengan perubahan warna media LB dari biru

keunguan menjadi kuning, media SB yang berubah warna

dari merah menjadi kuning, dan media GB yang berubah

warna dari coklat menjadi kuning. Seharusnya, pada

percobaan fermentasi ini dihasilkan gas pada tabung

durham karena bakteri Leuconostoc sp. dapat memfermentasi

gula menjadi asam laktat dan CO2 atau asam asetat

(Fardiaz, 1992). Hal ini dapat terjadi karena gas yang

terbentuk kurang banyak sehingga sulit untuk diamati.

Leuconostoc sp. bersifat heterofermentatif yang dapat

memfermentasikan gula menjadi asam laktat dan CO2 atau

etanol. Bakteri ini juga bersifat halofilik sehingga

dapat tahan dengan kadar garam yang tinggi dan berperan

penting dalam fermentasi awal bahan pangan yang

mengandung kadar garam tinggi, seperi pikel dan

sauerkraut. Selain itu, bakteri ini dapat melakukan

59

fermentasi secara cepat sehingga dapat mencegah

pertumbuhan bakteri lain. Pada fermentasi sukrosa, akan

dihasilkan juga lendir berlebih.

Lactobacillus delbrückii bersifat homofermentatif dan

sering ditemui pada fermentasi pikel. Bakteri ini akan

memecah gula menjadi asam laktat sebagai produk

akhirnya (Fardiaz, 1992).

Pada uji hidrolisis pati, mikroba-mikroba yang ada

di sayur asin menunjukkan hasil yang positif yang

ditandai dengan terbentuknya daerah transparan di

sekitar koloni. Mikroba-mikroba ini dapat menghasilkan

enzim amilase yang dapat digunakan untuk memecah pati

menjadi komponen yang lebih sederhana. Mikroba-mikroba

ini juga termasuk mikroba lipolitik dan proteolitik

yang masing-masing dapat digunakan untuk memecah lemak

dan protein. Hal ini ditunjukkan dengan terbentuknya

warna merah di bawah koloni pada media NA+lemak dan

areal bening di sekitar koloni pada media SMA.

Mikroba ini juga termasuk mikroba yang dapat

menghasilkan enzim katalase untuk memecah hidrogen

peroksida (H2O2) menjadi air dan oksigen yang

ditunjukkan dengan terbentuknya gelembung-gelembung gas

O2 di sekitar koloni setelah diteteskan dengan H2O2.

Walaupun sebagian besar mikroba yang ada di air sayur

asin merupakan bakteri berkatalase negatif, tetapi

mungkin ada mikroba lain seperti khamir yang dapat

menghasilkan enzim katalase.

60

4.7 Air AsinanTabel 4.7 Hasil uji yang dilakukan terhadap air asinan

PertumbuhanMikroba

UjiFermentasi

GB gasasam

++

LB gasasam

++

SB gasasam

++

Uji Hidrolisis Pati +Uji Hidrolisis Protein +Uji Hidrolisis Lemak +

Uji Katalase SA +SMA +

NA + lemak +

Asinan biasanya terbuat dari sayur-sayuran atau

buah-buahan. Sayuran dan buah-buahan biasanya berkadar

gula tinggi dan dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri

asam laktat. Ada empat faktor yang mempengaruhi

fermentasi sayuran, yaitu kondisi anaerobik, kadar

garam yang cukup untuk menyerap nutrient, suhu yang

sesuai, dan adanya bakteri asam laktat yang dibutuhkan.

Bakteri asam laktat yang sering dipakai dalam

fermentasi syuran adalah Leuconostoc mesenteroides dan

Lactobacillus (Buckle et al., 1987).

Pada uji fermentasi, bakteri-bakteri asam laktat

pada air asinan dapat memfermentasikan komponen-

komponen karbohidrat, seperti sukrosa, laktosa, dan

glukosa menjadi asam dan gas. Asam yang dihasilkan akan

menurunkan pH media sehingga media yang mengandung

indikator BCP akan mengalami perubahan warna menjadi

61

kuning bila terbentuk asam. Hal ini ditandai dengan

perubahan warna media LB dari biru keunguan menjadi

kuning, media GB yang berubah warna dari cokelat

menjadi kuning, dan media SB yang berubah warna dari

merah menjadi kuning. Asam yang dihasilkan dapat berupa

asam laktat atau asam asetat. Pada percobaan ini, juga

dihasilkan gas yang ditangkap oleh tabung durham dan

tampak sebagai gelembung udara. Gas tersebut merupakan

CO2 sebagai produk samping hasil fermentasi.

Bakteri Leuconostoc sp. bersifat heterofermentatif yang

akan memecah gula menjadi asam laktat dan CO2 atau

etanol/asam asetat. Bakteri ini juga termasuk bakteri

halofilik yang tahan kadar garam tinggi dan dapat

melakukan fermentasi secara cepat dan dapat menghambat

pertumbuhan bakteri lain sedangkan Lactobacillus sp.

bersifat homofermentatif dan memecah gula menjadi asam

laktat (Fardiaz, 1992).

Pada uji hidrolisis pati, bakteri-bakteri di air

asinan akan membentuk daerah transparan yang

mengeliling koloni setelah diteteskan dengan lugol. Hal

ini menunjukkan bahwa baketri-bakteri di air asinan

memiliki enzim amilase yang dapat memecah pati menjadi

komponen karbohidrat yang lebih sederhana, terutama

glukosa.

Pad uji hidrolisis protein, terbentuk areal bening

yang mengelilingi koloni pada media SMA. Hal ini

berarti bakteri-bakteri di air sayuran termasuk bakteri

62

proteolitik yang memiliki enzim proteinase yang dapat

digunakan untuk memecah protein menjadi peptida dan

asam amino. Bakteri-bakteri ini juga termasuk bakteri

lipolitik yang ditandai dengan terbentuknya warna merah

di bagian bawah koloni pada media NA+lemak sehingga

dapat diketahui bahwa bakteri ini memiliki enzim lipase

yang dapat memecah lemak menjadi gliserol dan asam

lemak yang akan menurunkan pH medium.

Bakteri-bakteri ini juga menunjukkan hasil yang

positif pada uji katalase. Namun sebenarnya, bakteri-

bakteri yang ada di sayuran berkatalase negatif,

seperti Leuconostoc sp. dan Lactobacillus sp. Hal ini mungkin

disebabkan kontaminasi dari mikroorganisme lain yang

berkatalase positif atau hidrogen peroksida (H2O2) yang

ditambahkan terlalu banyak sehingga reaksinya menjadi

berlebihan.

4.8 Pewarnaan GramTabel 4.8 Hasil pewarnaan Gram pada sampelKelompo

kSampel Gram +

(%)Bentuk

Gram –(%)

Bentuk

12

Air tajin 79,4164,84

kokuskokus

20,5935,16

kokuskokus

34

Air rendamantahu

81,35100

kokuskokus

18,65-

kokus-

56

Air sayur asin 100100

kokuskokus

--

--

78

Air asinan 86,145,18

kokusbasil

13,955,82

kokuskokus

Pada pewarnaan Gram air tajin, dapat dilihat bahwa

kebanyakan bakteri-bakteri yang ada di air tajin

63

merupakan bakteri asam laktat, seperti Lactobacillus,

Leuconostoc, Streptococcus, dan Pediococcus yang bergram

positif dengan persentase antara 65-80% dan sisanya

yaitu antara 20-35% merupakan bakteri Gram negatif. Hal

ini menunjukkan bakteri di air tajin memiliki dinding

sel yang sebagian besar tersusun dari peptidoglikan,

kebutuhan akan nutrient relatif kompleks, dan lebih

tahan terhadap perlakuan fisik.

Kebanyakan bakterinya berbentuk kokus, yaitu

Streptococcus dan Pediococcus yang homofermentatif serta

Leuconostoc yang bersifat heterofermentatif, namun ada

satu bakteri bergram positif yang berbentuk diplobasil,

yaitu Lactobacillus yang bisa bersifat homofermentatif

atau heterofermentatif.

Dari pewarnaan Gram air rendaman tahu, bahwa bakteri

utama di air tahu adalah bakteri Gram positif dengan

persentase 80-100%, yaitu bakteri Bacillus cereus dan

sisanya merupakan bakteri Gram negatif dengan

persentase 0-18,65%. Semua bakterinya berbentuk kokus

pada saat pengamatan, padahal Bacillus cereus sendiri

berbentuk batang. Hal ini dapat terjadi karena adanya

kesalahan pengamatan mikroskopik.

Pada percobaan pewarnaan Gram air sayur asin,

diketahui bahwa bakteri-bakteri di sayur asin 100%

merupakan bakteri Gram positif yang ditunjukkan dengan

koloni yang semua berwarna ungu pada saat pengamatan

mikroskopik. Hal ini cocok dengan teori yang ada karena

64

Leuconostoc sp. dan Lactobacillus sp. bergram positif (Fardiaz,

1992). Dari pengamatan, diketahui bahwa semua bakteri

di sayur asin berbentuk kokus, yaitu Leuconostoc sp.,

tetapi pada air sayur asin masih ada bakteri Lactobacillus

sp. yang berbentuk batang. Hal ini dapat terjadi karena

areal pandang yang diambil terlalu sedikit sehingga

bakteri yang berbentuk batang tidak kelihatan.

Pada pewarnaan Gram air asinan, diketahui bahwa

bakteri-bakteri di sayuran 45-86% merupakan bakteri

Gram positif sedangkan 14-56% merupakan bakteri gram

negatif. Hal ini tidak sesuai dengan teori yang ada

karena Leuconostoc sp. dan Lactobacillus sp. bergram positif

(Fardiaz, 1992). Kesalahan ini mungkin disebabkan

kontaminan bakteri lain yang bergram negatif atau

kesalahan pengamatan mikroskopik. Bentuk bakterinya

kebanyakan kokus, yaitu Leuconostoc sp. dan ada juga yang

berbentuk basil, yaitu Lactobacillus sp.

65

BAB V

KESIMPULAN

Fermentasi adalah proses pemecahan molekul, seperti

karbohidrat dan asam amino tanpa membutuhkan oksigen

sedangkan hidrolisis adalah proses pemutusan ikatan

molekul dengan penambahan air. Berdasarkan sifat

pemecahan komponen makanan, ada mikroba amilolitik,

proteolitik, lipolitik, pektinolitik, dan osmofilik.

Mikroba aerob juga dapat memecah H2O2 menjadi air dan

O2.

66

Bacillus cereus dapat melakukan fermentasi terhadap

komponen karbohidrat dan menghasilkan asam, termasuk

bakteri amilolitik, proteolitik, lipolitik, berkatalase

positif, dan bergram positif. Fusarium moniliforme hanya

dapat memfermentasi laktosa dan sukrosa menjadi asam,

merupakan mikroba amilolitik, proteolitik, lipolitik,

dan berkatalase positif. Candida tropicalis hanya dapat

memfermentasi glukosa dan sukrosa serta termasuk

mikroba amilolitik, proteolitik, lipolitik dan

berkatalase positif.

Air tajin mengandung bakteri asam laktat, Aspergillus

oryzae, dan Saccharomyces rouxii yang dapat memfermentasi

sukrosa, laktosa, dan glukosa, termasuk mikroba

amilolitik, proteolitik, lipolitik, berkatalase

positif, kebanyakan bergram positif, dan berbentuk

kokus. Pada air rendaman tahu, terdapat bakteri Bacillus

cereus yang dapat memfermentasi sukrosa, laktosa, dan

glukosa, termasuk mikroba amilolitik, proteolitik,

lipolitik, berkatalase positif, dan kebanyakan bergram

positif.

Air sayur asin dan air sayuran mengandung Leuconostoc

mesenteroides dan Lactobacillus delbrückii yang dapat

memfermentasi sukrosa, laktosa, dan glukosa, termasuk

mikroba amilolitik, proteolitik, lipolitik, berkatalase

negatif, kebanyakan bergram positif dan berbentuk

kokus, tetapi ada juga yang berbentuk basil.

67

LAMPIRAN

Areal Pandang Jumlah bakteri Gram+

Jumlah bakteri Gram-

1 7 -2 12 43 34 144 26 75 57 12

Rata-rata 27 7

% Bakteri Gram + = 27 × 100 % = 79,41%

27+7

% Bakteri Gram - = 7 × 100 % = 20,59%

27+7

68

DAFTAR PUSTAKA

Azoulay, Edgard. “Fermentation Methods for ProteinEnrichment of Cassava and Corn with Candidatropicalis,” AEM Online. Home pageon-line. Availablefromhttp://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=291281; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Buckle, K. A., dkk. Ilmu Pangan. Jakarta: UI Press,1987.

Doctorfungus. “Candida sp.,” Doctorfungus Online. Homepageon-line. Available fromhttp://www.doctorfungus.org/thefungi/candida_spp.htm; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Engsterhold, Robert. “Untersucht Bacteria Gruppe: E.coli,” UL Online. Home page on-line. Available fromhttp://wwwstud.uni-leipzig.de/~mai03kbz/bioinfprak/mainFrame.htm ; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

69

Ewald, Heather T. “Micro-organisms for Education,”TCWM Online. Home pageon-line. Available fromhttp://www.science-projects.com/safemicrobes.htm;Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Fardiaz, Srikandi. Analisis Mikrobiologi Pangan. Jakarta: PTRaja Garfindo Persada, 1992.

Fardiaz, Srikandi. Mikrobiologi Pangan 1. Jakarta: PTGramedia Pustaka Utama, 1992.

Fardiaz, Srikandi. Mikrobiologi Pengolahan Pangan Lanjut.Bogor: IPB Press, 1992.

Johnson. “Carbohydrate Fermentation,” MicroVision Online.Home page on-line. Available fromhttp://www.mc.maricopa.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/cho.html ; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Kim, H, J., dkk. “Characterization of Bacillus cereusIsolates from Raw Soybean Sprouts,” Sproutnet Online.Home page on-line. Available fromhttp://www.sproutnet.com/Research/characterization_of_bacillus_cer.html ; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Lay, Bibiana W. Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: PTRaja Grafindo Persada, 1994.

Loi, Enrico. “Batteri,” ECplanet Online. Home page on-line. Available fromhttp://www.ecplanet.com/canale/scienza-1/batteri-66/0/0/6855/it/ecplanet.rxdf ; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Mader, Algacyr M. “Culture Medium for AmylaseProduction by Toxigenic Fungi,” Scielo Online. Home pageon-line. Available fromhttp://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1516-8913200 0000 500003 ;Internet; accessed 18 Agustus 2007.

70

Madigan, Michael T., John M. Martinko, and Jack Parker.Brock Biology of Microrganisms. USA: Prentice HallInternational, 1997.

Okumura, Yoshiyuki, dkk. “Isolation & Characterizationof aNovel Acid Proteinase, Tropiase from CandidaTropicalis IFO 0589,” JSMM Online. Home page on-line.Available from http://www.jsmm.org/common/jjmm48-1_019.pdf; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Rodier, M. H, dkk. “Purification of an intracellularmetallopeptidase of Mr 45000 in Fusarium moniliforme,”Cambridge Online. Home page on-line. Available fromhttp://journals.cambridge.org/action/displayAbstract?fromPage=online&aid=41943; Internet; accessed 18Agustus 2007.

Rohmhaas. “Fusarium,” Rohmhaas Online. Home page on-line. Available fromhttp://www.rohmhaas.com/rhcis/markets_and_products/images/microorganisms/Gallery/fusarium_mycelium.jpg&imgrefurl ; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Rossbach. “Starch Hydrolysis Medium,” Bios Online. Homepage on-line. Available fromhttp://homepages.wmich.edu/~rossbach/bios312/LabProcedures/Starch%20Hydrolysis%20Medium.html ; Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Tugmon, Cathy R. “Skim Milk Agar,” Biol Online. Home pageon-line. Available fromhttp://www.aug.edu/biology/skimmilkpage2.htm;Internet; accessed 18 Agustus 2007.

Volk, Wesley A. dan Margaret F. Wheeler. MikrobiologiDasar. Jilid 1. Edisi kelima. Jakarta: Erlangga,1993.

71

Winarno, F. G. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT GramediaPustaka Utama, 1995.

72