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Primeros pasos hacia la criopreservación de embriones de pezcebra por vitrificación con descongelación ultra rápida

Por Estefanía Paredes

Antecedentes

Se llama Vitrificación a la criopreservación que usa tasas de congelación rápidas, normalmente sobre50.000°C/min. Cuando la tasa de congelación es tan alta, el agua se congela sin formar cristales dehielo, en su lugar se forma un sólido amorfo no-cristalino.

Ésta podría ser una técnica especialmente útil para conseguir la criopreservación de célulasespecialmente sensibles a la exposición a bajas temperaturas o a las altas concentraciones decrioprotectores, y que por tanto no han podido ser preservadas hasta ahora o su tasa desupervivencia es muy limitada.

Criopreservación de embriones de teleósteos

Desde que se comenzó a aplicar la criopreservación en el medio marino, una de las grandes líneas deinvestigación ha sido la criopreservación de huevos o embriones de teleósteos, para su utilización enacuicultura e investigación.

En acuicultura supondría un gran avance ya que permitiría tener un stock de los mejores reproductoresposibilitando la obtención de cruces entre generaciones de reproductores separadas temporal ogeográficamente.

Asímismo la investigación se vería exponencialmente beneficiada del diseño de un protocolo adecuadode criopreservación ya que se podrían mantener a las cientos de líneas mutantes y transgénicas que sehan desarrollado para el pez cebra; éste es uno de los modelos de vertebrado más empleado en cienciadebido a que comparte muchas características de desarrollo con los humanos a nivel celular, genético ymolecular (Dooley y Zon 2000). El mantenimiento a largo plazo de todas estas líneas de interés se estáconvirtiendo en un problema grave.

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Hasta el momento ha habido algunos éxitos en relación con la criopreservación de esperma de peces,sin embargo no se ha conseguido la criopreservación de huevos o embriones de pez.

Hay muchas razones por las cuales los huevos o embriones de pez son especialmente difíciles decriopreservar, (1) la permeabilidad de sus membranas es reducida lo cual dificulta el uso de agentescrioprotectores, (2) la existencia de varias barreras o membranas internas de permeabilidad diferenteimpide la distribución uniforme de los crioprotectores una vez dentro del embrión, (3) sufren sensibilidada las bajas temperaturas, de tal forma que si se intenta la congelación lenta, los embriones estaránmuertos mucho antes de que se llegue a temperaturas criogénicas y (4) su tamaño es muy superior alde otras células para las que sí se han desarrollado protocolos de congelación.

Aún a pesar de todos estos factores, hace varias décadas que se estudia la criopreservación deteleósteos de forma intensiva y se ha reunido una gran cantidad de información sobre la permeabilidadde las membranas y sensibilidad a la exposición de crioprotectores.

Hasta hace poco se pensaba que para una vitrificación exitosa era crítico tener una tasa de congelaciónmuy rápida y una concentración alta de sustancias crioprotectoras.

Desde el laboratorio de criopreservación teórica y aplicada de Peter Mazur (Fig. 1) en la Universidad deTennessee se ha estado estudiando la vitrificación de forma detallada. Los resultados obtenidoscontradicen la visión establecida en varios aspectos.

En primer lugar, los datos publicados han establecido claramente que para lograr una buenasupervivencia en vitrificación el factor clave es la tasa de descongelación y no tanto la tasa decongelación (Seki y Mazur 2008, Seki et al. 2012, Paredes y Mazur 2013). De hecho es fundamentalrealizar una descongelación rápida que prevenga la re-cristalización y crecimiento de cristales de hielodurante el proceso. En segundo lugar, se ha demostrado que no es necesario el uso deconcentraciones altas de crioprotectores mientras que la tasa de descongelación sea suficientementealta (Jin et al. 2014, Jin y Mazur 2015).

Fig. 1. Laboratorio de Mazur en la Universidad de Tennessee. De derecha a izda., Dr. Mazur, Dr. Kleinhans,Dra. Paredes y Dra. Connolly.

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Primeros pasos para la vitrificación con descongelación ultrarrápida por láser de embriones depez cebra

Aunque se ha avanzado mucho en el entendimiento de cómo afecta la criopreservación a los huevos oembriones de pez cebra (Danio rerio), todavía se desconocen muchos factores necesarios para eldiseño de un protocolo adecuado

Durante mi estancia posdoctoral, con el equipo de Peter Mazur, en el que me encuentro realizando miestancia posdoctoral desde 2014, se planteó abordar si los embriones de pez cebra son buenoscandidatos para la aplicación de la vitrificación con descongelación ultrarrápida por láser. Para ellodurante este período se investigó (1) si era posible aplicar la vitrificación directamente a estosembriones, (2) el efecto de la deshidratación en los diferentes estados de desarrollo del pez cebra, (3) elefecto de la conducción del calor en este modelo y (4) el efecto de la exposición a crioprotectores ypigmento de carbón.

Mantenimiento de los peces y obtención de los embriones

Para la realización de estos experimentos se obtuvo una colonia reproductiva de 30 peces cebra.Dichos peces de agua dulce, que alcanzan un tamaño máximo de 5 cm , se mantuvieron separados porsexo en 4 acuarios (Fig. 2). Su separación fue fundamental para facilitar cruces diferentes y por tantoobtener huevos genéticamente diversos para aportar más heterogeneidad y en último término mayorrepresentatividad en los resultados. Aunque, presentan dimorfismo sexual en tamaño y color (Fig. 3),diferenciar machos de hembras es una tarea que requiere experiencia sobre todo tras la puesta ocuando son muy jóvenes.

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Un poco más sobre la vitrificación con descongelación ultrarrápida por láser

El objetivo de la descongelación ultrarrápida consiste en pasar la muestra de sólido a líquido evitandoque exista tiempo suficiente para el crecimiento y reorganización de cristales en el interior de las células(Kleinhans et al. 2015).

El primer paso consiste es realizar la congelación de las células. Para ello, se mezclan las células conuna solución de partículas de carbón (crioprotectores), se depositan (0.1 µL) en una pequeña lámina deplástico transparente (Criotop), y se introducen en una plataforma (Cryo-jig), que tiene uncompartimento lleno de nitrógeno líquido (Fig. 4; Fig. 5). Debido al pequeño tamaño de la muestra, seconsigue una la tasa de congelación muy alta (69.000°C/min).

Fig. 2. La colonia de peces cebra fue establecida porla Dra. Michelle Connolli investigadora posdoctoralasociada en el laboratorio de criobiología teórica yaplicada de la Universidad de Tennessee.

Fig. 3. Hembra de pez cebra; en este caso se puede ver el abdomen abultado antes de la puesta. Engeneral, éstas suelen ser más grandes que los machos y tienen las tonalidades plateadas más marcadas.

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En el momento en que la muestra sale del nitrógeno líquido, el láser se dispara calentando la muestra auna tasa de 10 millones de °C/min. La clave del proceso es que el calentamiento se hace de formaindirecta ya que el láser emite una longitud de onda susceptible de ser absorbida por loscrioprotectores y no por el agua o componentes celulares de la muestra, de tal forma que la energía noafectará a las células.

Fig. 4. Prototipo Cryo-jig diseñado por Kleinhans, Jin y Mazur, y patentado por la Universidad de Tennessee.

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Para aplicar esta técnica es fundamental la protección ocular con gafas específicas (Fig. 6).

Fig. 5. Láser de Infrarrojos emite a 1064 nm (produce una tasa de descongelación de 107 °C/min). Dentro semuestra el prototipo de Cryo-Jig diseñado en el laboratorio de la Universidad de Tennessee.

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Resultados, respuestas y más preguntas

A falta de datos específicos sobre otras células, para las células del pez cebra, se tuvo en cuenta cómoguía, el protocolo empleado para la vitrificación ultrarrápida láser de embriones de ratón, es decir, laaplicación de crioprotectores en el exterior, y que por tanto, no entren en el embrión, y la reducciónhasta el 15% del contenido inicial de agua en la muestra, previa a la vitrificación.

Tras numerosas pruebas con varios estados de desarrollo, se ha podido establecer que en las célulasdel pez cebra hay un estado de desarrollo que soporta la deshidratación gradual del 85% del contenidoen agua y el regreso gradual a su volumen osmótico con una supervivencia del 50%.

También se ha calculado la difusión del calor generado por el láser a través de las membranas delembrión de pez cebra para calcular si la tasa de descongelación del embrión es suficiente para evitar lare-cristalización durante la descongelación. Tras los cálculos se determinó que la temperatura en elinterior del vitelo no es suficiente para asegurar la supervivencia y esto supone que en el futuro serealice un reajuste de la metodología y se evalúe la utilización de las partículas de carbono comoconductores del calor.

Como casi siempre, generando las respuestas a las preguntas iniciales se han generado tambiéntoda una nueva serie de preguntas que aún están por responder.

En que más estamos trabajando

Además de los estudios con el pez cebra, el equipo ha realizado un estudio exhaustivo de la posibilidadde utilizar esta metodología con esperma de ratón, ya que por los métodos de congelación lenta el

Fig. 6. Dr. Mazur, Dr. Kleinhans y Dr. Jin usando sus gafas protectoras mientras trabajan con el láser

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porcentaje de éxito es reducido y muy variable.

Los estudios sobre los efectos de la deshidratación hasta el 15%, del contenido en agua de losespermatozoides de ratón, han permitido confirmar, como ya indicaban otros estudios, que estascélulas son extraordinariamente sensibles a este proceso, incluso durante periodos de tiempo muyreducidos, produciéndose una reducción en la movilidad y una distorsión de la morfología que impidenla posibilidad de fertilización.

En estudios futuros el equipo se platea probar la eficacia de la vitrificación con descongelación ultra-rápida láser con levaduras y microalgas. A pesar de que se ha conseguido congelar con bastante éxitomuchas levaduras y microalgas, la supervivencia es variable y a veces muy limitada. Hay especies demicroalgas de gran interés en investigación como las diatomeas y los dinoflagelados que son muydifíciles de criopreservar. La vitrificación con descongelación láser permitiría prescindir decrioprotectores y posiblemente incrementar su supervivencia.

La pérdida de un mentor

El Dr. Peter Mazur además de ser uno de los padres de la criopreservación, ha sido siempre muy activoen la formación de jóvenes investigadores. Todos los que hemos tenido la oportunidad de trabajar conél hemos sentido mucho la pérdida de un mentor.

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Con su gran interés por compartir su conocimiento, su pasión por la ciencia y el trato familiar se haganado los corazones de todos aquellos que hemos pasado por su laboratorio. El Dr. Mazur falleció elpasado diciembre a pocos meses de cumplir los 88 años, satisfaciendo su deseo de permanecer enactivo hasta el último momento. Su dedicación a la criopreservación nos ha dejado un legado de 60años de trabajo, más de 200 artículos y una sucesión de investigadores posdoctorales apasionados porla criobiología.

http://coroh.oakridgetn.gov/corohfiles/Transcripts_and_photos/ORNL/ORNL_Mazur_Peter_transcript.pdf

Bibliografía

Dooley, K. y Zon, L.I. (2000) Zebrafish: a model system for the study of human disease. Curr. Opin.Genet. Dev.10 (3): 252–256.

Jin, B. y Mazur, P. (2015). High survival of mouse oocytes/embryos after vitrification without permeating

Peter Mazur 1928-2015

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01/04/2016 Leave a reply

cryoprotectants followed by ultra-rapid warming with an IR laser pulse. Sci. Rep. 5, 9271. doi:10.1038/SREP09271.

Jin, B., Kleinhans, F. W. y Mazur, P. (2014). Survivals of mouse oocytes approach 100% after vitrificationin 3-fold diluted media and ultra-rapid warming by an IR laser pulse. Cryobiology 68, 419–430. doi:10.1016/J. CRYOBIOL.2014.03.005.

Kleinhans, F. W. y Mazur, P. (2015). Physical parameters, modeling, and methodological details in usingIR laser pulses to warm frozen or vitrified cells ultra-rapidly. Cryobiology 70, 195–203. doi: 10.1016/J.CRYOBIOL.2015.02.003.

Paredes, E. y Mazur, P. (2013). The survival of mouse oocytes shows little or no correlation with thevitrification or freezing of the external medium, but the ability of the medium to vitrify is affected by itssolute concentration and by the cooling rate. Cryobiology 67, 386–390.

Seki, S. y Mazur, P. (2008). Effect of warming rate on the survival of vitrified mouse oocytes and on therecrystallization of intracellular ice. Biol. Reprod. 79, 727–737. doi: 10.1095/BIOLREPROD.108.069401.

Seki, S. y Mazur, P. (2012). Ultra-rapid warming yields high survival of mouse oocytes cooled to 1968Cin dilute vitrification solutions. PLoS One 7, e36058. doi:10.1371/JOURNAL.PONE.0036058

Diseño de una herramienta de utilidad para determinar si lasparalarvas de pulpo se alimentan

Por Raquel Fernández Gago

Quien no ha comido un buen “pulpo a feira”, con su pimentón y aceite, en “caldeirada” a la plancha oen empanada. Esta especie conocida comúnmente como el pulpo de roca y científicamente comoOctopus vulgaris presenta una de las pesquerías mundiales más importante de cefalópodos. En Galiciala captura de esta especie se realiza mediante una pesquería artesanal de nasas, la cual da trabajo a ungran número de pescadores.

Desde hace años ya muchos investigadores se han dedicado al estudio de la acuicultura de estaespecie (Fig. 1). Por sus características biológicas y fisiológicas es un candidato ideal para laacuicultura. Presenta un crecimiento muy rápido, una gran fecundidad y una muy buena adaptación a lacautividad. A pesar de los esfuerzos realizados por investigadores de todo el mundo la acuicultura deesta especie sigue viéndose limitada por la elevada mortalidad de los primeros días de vida. Duranteeste periodo la paralarva de esta especie es planctónica y presenta mortalidades de hasta el 99% en elprimer mes durante el cultivo.

Esta problemática ha sido estudiada mediante el proyecto OCTOPHYS (AGL-2010-22120-C02-01)centrándose éste en las necesidades metabólicas de esta especie. Este proyecto ha dado lugar a lacreación de “un protocolo de enriquecimiento que permitió una mejoría en el crecimiento de laparalarva”. En la actualidad el estudio del cultivo continúa mediante el proyecto OCTOWELF (AGL2013-

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