+ All Categories
Home > Documents > Targeting the replication of adenovirus to p53-defective thyroid carcinoma with a p53-regulated...

Targeting the replication of adenovirus to p53-defective thyroid carcinoma with a p53-regulated...

Date post: 10-Dec-2023
Category:
Upload: independent
View: 0 times
Download: 0 times
Share this document with a friend
9
Targeting the replication of adenovirus to p53 -defective thyroid carcinoma with a p53 -regulated Cre/ loxP system Yuji Nagayama, 1 Eijun Nishihara, 2 Hiroyuki Namba, 2 Haruhiko Yokoi, 3 Mamoru Hasegawa, 3 Hiroyuki Mizuguchi, 4 Takao Hayakawa, 4 Hirofumi Hamada, 5 Shunichi Yamashita, 2 and Masami Niwa 1 Departments of 1 Pharmacology 1 and 2 Nature Medicine, Nagasaki University School of Medicine, Nagasaki, Japan; 3 DNAVEC Research Inc., Ibaraki, Japan; 4 Division of Biological Chemistry and Biologicals, National Institute of Health Sciences, Tokyo, Japan; and 5 Department of Molecular Medicine, Sapporo Medical University, Sapporo, Japan. In this article, we evaluated the feasibility of the restricted replication - competent adenoviruses for treatment of anaplastic thyroid carcinomas ( ATCs ) , which are very aggressive and difficult to treat. Because ATCs very often harbor p53 mutations, we used wt - p53 as a regulatory factor to restrict virus replication and cytopathic effect to p53 - mutated cells. The recently reported ``gene inactivation strategy'' using p53 - regulated Cre / loxP system was employed; this system consists of two recombinant adenoviruses. One has an expression unit of the synthetic p53 - responsive promoter and the Cre recombinase gene ( Axyp53RECre ) , and another contains two expression units; the first consists of E1A gene flanked by a pair of loxP sites downstream of the constitutive CAG promoter and the second E1B19K gene under the control of the CMV promoter ( AdCALE1AL ) . We expected that coinfection of these two adenoviruses into the cells with wt - p53 would lead to expression of the Cre, which excises E1A gene and switches off E1A expression resulting in no virus replication, whereas in the cells with mutant p53 E1A could be expressed that leads to virus replication and cell lysis. Our in vitro data demonstrate that although infection of AdCALE1AL alone led to E1A expression, viral replication and cytolysis in all the thyroid cells examined irrespective of their p53 status, the double infection did so in FRO cells ( p53 - null ATC ) but not in FRO cells stably expressing wt - p53 and normal thyroid cells with wt - p53. These data indicate that our double infection method may have a potential for treatment of ATC and probably also other p53 - defective cancer cells. Cancer Gene Therapy ( 2001 ) 8, 36 ± 44 Key words: Anaplastic thyroid carcinoma; p53 mutation; p53 - responsive promoter; replication - competent adenovirus; Cre / loxP system. T hyroid carcinomas, the most common endocrine malig- nancy, 1 are classified pathologically into differentiated and anaplastic ( undifferentiated ) types of thyroid follicular epithelial cell origin. Differentiated thyroid carcinomas generally show good long - term prognosis, whereas anaplas- tic thyroid carcinomas ( ATC ) , albeit rare, are aggressive and difficult to treat. 1 We have recently focused our interest toward the development of gene therapy for these two types of thyroid carcinomas. 2±6 Specific and efficient expression of a therapeutic gene is a critical factor for successful gene therapy. The use of replication - defective viruses have proven ineffective for treatment of large solid tumors, because of relatively low levels of vector delivery and gene transfer. To overcome this problem, replication -competent viruses have recently been utilized. 7 For such viruses, appropriate tumor targeting is a major challenge. Tumor- or tissue - specific promoters, such as alpha - fetoprotein ( AFP ) and carcinoembryonic antigen, have been shown to be useful tools for selective expression of a therapeutic gene in cancer cells. 8 Our recent studies have also demonstrated the feasibility of thyroglobulin (TG) promoter, a thyroid- specific promoter, for transcriptionally targeted gene therapy of differentiated thyroid carcinomas expressing TG. 2,3 How- ever, ATCs express little or no TG, 1 indicating that use of thyroid-specific promoter(s) is only applicable to a limited type of thyroid carcinoma. Instead, as for cancer of any tissue origin, 9 ATCs very often harbor the mutations in tumor suppressor gene p53. 10 ± 12 Several approaches for gene therapy targeting tumors with mutant p53 have been described. Restoration of wt- p53 expression by introducing wt - p53 gene is probably the simplest and most straightforward approach for such tumors. Viral -mediated wt- p53 gene introduction has widely been used as a cancer gene therapy in numerous experimental cancer models and also in human clinical trials. 13,14 The efficacy of wt - p53 gene therapy for ATC has recently been shown by us 6 and other groups. 15 Further- Received June 29, 2000; accepted October 21, 2000. Address correspondence and reprint requests to Dr. Yuji Nagayama, MD, Department of Pharmacology 1, Nagasaki University School of Medicine, 1-12-4 Sakamoto, Nagasaki 852 - 8523, Japan. E-mail address: [email protected] - u.ac.jp D 2001 Nature Publishing Group 0929-1903/01/$17.00/+0 www.nature.com/cgt 36 Cancer Gene Therapy, Vol 8, No 1, 2001: pp 36±44
Transcript

��������� �� �������� � � ���� ����� � ������������� ��� �������� �� ��� � ������������� �������� ������

���� ���������� ����� ��������� �� ��!� ���"��� ����! � ! ��#

$�� �� ��������# �� ��!� $�%������& ��!� ���!����& �� ���� ������'

(����� ���������� ��� $����� �����

���������� � � ��������� � ��� ������� ��������� ������� ��������� ���� � ��������� �������������� ��!"#$ %������ &��'� &(������ ������ )������ � *������� $������� ��� *�������� �������&������� � +����� �������� ,��� ������ ��� -���������� � �������� ��������� ����� ����������������� ������ �����'

�� ���� ������ � �������� ��� ���������� �� ��� ��������� ������������������ ������������ ��� ��������� �� �������� �������

�������� ������ � ��� ��� ���� ���������� ��� ������� �� ������ ������ ���� ���� ����� ������ ��� ���������� � ���� ��� !

�� � ��������� ����� �� ������� ����� ��������� ��� �������� ����� �� ��� �������� ��� ��� ������ �������� ""���� �����������

��������## ����� � !� �������� ���$ ���� ������ �� �������% ���� ������ ������� �� � � ���������� ������������� &�� ��� ��

�'�������� ���� �� ��� �������� � !� ���������� �������� ��� ��� ��� ���������� ���� ��'�� !()��� � � ��� ������� ������� � �

�'�������� �����% ��� ����� ������� �� )*� ���� ���+�� �� � ���� �� ���� ����� �� ������� �� ��� ����������� ��, �������� ��� ���

����� )*�*-. ���� ����� ��� ����� �� ��� �/0 �������� �������� � � 1� �'����� ���� ��������� �� ����� � � ������������

���� ��� �� ��� ����� ��� ��� �� �'�������� �� ��� ���� ��� �'���� )*� ���� ��� � ����� ��� )*� �'�������� �������� ��

�� ����� ���������� ������ �� ��� �� ��� ������ ��� )*� ��� �� �'������� ���� ���� �� ����� ��������� ��� � ����� &�� �

����� ���� ����������� ���� ������� �������� �� ������� ���� �� �� )*� �'��������� ���� ��������� ��� ������� �� � ���

������� �� �'������ ����������� �� ����� ��� ������� ��� ����� �������� ��� �� �� 2(& �� ���� ��� ���� ��� ��� �� 2(& ��

����� �'�������� ����� ��� ����� ������� �� ��� ������ ����� ���� ������� ���� ��� ����� �������� ������ ��� ���� �

�������� ��� ��������� �� ��� ��� ������� ��� ����� ��� ��������� ���� ��� ������ ���� ����� � ���� �� �����

��� ����� �� ������ ������� ���������� �� ��������� ������ ������ �������� �� ������������ ����� ����������� ���� �����������

������� ������� ��� ���� ����� ������� ������� � �� ��������� ������������ ��� ������������� ������ ��������������� ����� �� ������� ������������������ ���� ������ ������������ ������� �������������� ���� ���� �������� �������� ������ ������� ������� ������� ����� ����� ��� �� ��������� ���������� �� ������

� ��� ������� ������� ��� ������� ����� ������������� �� ��� ������ ��� ����� ��� ����� �� ���������������!"# $������� � �������� �%������� �� ���������� ��� �� ������� ����� ��� ���������� ���������� ��� ��� �� ������������������� ������� �������� ���������� ��� ������� �� ���� ����� ������ ������ �� ��������� ��� ������ �� ������ �������� � ���������� �� �������� ���� ������� ������������������������� ��� ������� ��� �����&���' (�� ���� �������

��������� ����� ������� �� �)�� �������� ������ ����������������� ��������� ���� � �������������� ��(*�� ������������� ���� ��� ��� ���� �� �� ����������� ��� ��������� �%������� �� ���������� ��� � ����������+ ,�� ����� ������� ��� ��� ���������� ������������� �� ������������ ��-� �������� ���������������� �������� ��� ������������� ������� ��� �������� ������������ ������� ������� �%������� �-�! . /������� ���� �%����� ������ �� � �- � ������� ��� ��� ������������������ �������� �� � �� ��� �������� �� ����������� �� ������� �������0���� � ��� ���� �� � ������ ����� 1 ���� ����

���� ����� ��� ������� � ����� ���������� ����- ��2"�! $����� �������� ��� ��� ������ ������������� ���� ���� �- ��� ��� ���������� 3�������� ������- �%������� �� ��������� ����- ��� �� ���������� �������� � ���� ������������� ������ ��� ����������� 4��� �������� ����- ��� ���������� �������� ��� ���� � ���� ��� ������ � ��������%�������� ���� ������ � ��� � ��� �������������. �5 ��� ������� �� ����- ��� ������ ��� ��� ��������� ��� ���� �� ��# � ����� ��������6 (�������

%������� ���� �.� �///� �������� 0��(�� ��� �///'

!���� ����������� ��� ������� ��1��� � ��' 2�3� ��������� ���

���������� � ��������� �� ������� ��������� ���� � ���������

� 4 �� 4 ) ������� ������� 5-� 4 5-� � �����' #4���� �����6

��������7���'������� 4�'��'3�

��//� ������ �(������ 8��� /.�.4�./ 9/�9:�;'//9</==='������'��9���

�� �� ��� �� � �������� 0� 3� 4� *� 566*7 �� !89::

���� ���� ������������ �� 7�� �������� � ��� �� ������� ����������� ������ ���� � ���� ������ ���� ���� ��������� ��� ��� ������ �� �- ������� ��������� ��� ��� ������� ���������� ��������� ��7��#�*--> �� ���� �%���� ����� �� ��� ������������ ������������ �������� � � ���� ����� ��������� �- ������� �#"�+ ������� ���� ����� ���������� ��������� ��� ����������� ����1"!6 (���������� 88���� �������� �������99 ���� 88�6.��������� ���:�? ������99 �� ��� ��� ������� �������� � ����� ����6.���������� �������� � ���: �? ������ ���� ���� ������� ��� �%������� �� ���������� ��� �� ����� ����� �����- ��������!#

��� ������ ������� ���� ������� �� �������� ������������� ��� ������ ��� ��� ���� ������������������� ����������� � ����� ��������� ��� ����������������� �� �������� ��7�� #�*--> ��� ���� ,�� �� ������� ���������� �6.� �������� ��������� �������� �������� ��7�� #�*-->!' � ���� � �������������� ����� ���� ���������� ��� � ��������� �� �%����7 ����� �� ��� ������������ 88���� ���������������99 ���� �6.��������� ���: �? ������ �� ���������������� ��� ��������� �� �������� �� ��� ����� �������������� �6.�

��������� ��� ��� !��

����� ����

� ��� ��� ���� ��� �%������� � ��������� �6.�(3,� �� �������� �� ;� �� (�� �<�������� �������� ������� �� =������ ������ ,/� ����� � 3*=0 �#52 ������ ����������� ���� �2>���� ����� ����� �(?$� � �������� :������������(3, ����� ����� �%������� ����- �(3,��6.� ������������ ��� �����������!+ ������� ������ ������ ���������� �� ������� ������������� ���� ������ ����-����9 ������ � ���� ��� ������� ��������� ������ ������ ������� ���� ������� � ���������� ���������!1

� ������ � /�9� (�! ������ ���� 6> (?$ ����������� 0������ ����� �� ������ ���� ��������� !1. ��� �������� 7���� �!1. /@A� ��������� ������ ���� ������ ���� ������� �������������� =��� 4�� � ���� �������� � ���������9� �������� @���9� ������ ���� �2> (?$ �����������

������� � � ��� ��������

��� �������� ���������� ���� � ��� ������ ����� ������ � (����� �� ��� �������� �������� �����@#�!@ �(�� �� � ����� @�� ��� �� ��7�� �� ��� ���? ��� ����� ���� ��� ������ �� ��� ����������� ��-�������� .2 � @�?�1A ��� �� ���� ��� ������ �� �=4�������� �� ���������� � ���������� ����������.� .!

?������ @�� ��� � �?���$����� �� �%����� ����#�30:*��/0 �������� �� ���� ����� � ������ ������ �=�0 ���� �� ���@�@.. �� ����� ���@#�!@������������ �� ��� ����� �� �������� �� ���������� �&������������� ��=4�.>.5 �� �������� �� $��0 :*��/0 �������� ��� �B� ������ ������ �=4 ��������

@�?�1A ��� � $452 ����������� ����� �����B� ������ �� ���� ����� � ������ ��� ����@#�!@ ��� �� ��� �������� ���� �0 � ���� ����� �������� � ���@#�!@�=4�.>� ���0 :+���000 ������������@#�!@�=4�.> �� ������ ��� ���0 :+���000 ��������� �/=6�.� ��� ������� ������ �/=6���@#�!@�=4�.> �� ��� �������� ���� 0�$��0 :*0 ����0� ������ ��� 0�$��0 :*0����0"�������� ���/=5�.!

���/=5��@#�!@�=4�.> �� �����&�� ���� ��0

������ �� ��������� ��������� � � ���� ���� ���� � �������� ������� � �� ������� ���� ���� ���� � ���� �� ���� ���������� ��� �� �� ������� ����� ������ ���� ������ �����

��������� ������ ����� ���� ��� ����� ���� � � �������!������

�� � ������ � ��!����� ����� �� ����� ��� ������� "#$������ ������ � ��� � ��� � ������� "#�������� ��%�����!�&'(

� ��� �� ����������� � ������� ) � ��*� � ������ � +���������� � , ���������� � ���� �� ��� "# � �������� �� , ��

������� � ���� � ������� -�.�/ ������� �� � �� � �� ����� ��������� �� ��� ����� *��� �� ������ ��� "#� ��� �� ������� �� ��� ��

�� ������� �� ��� ����� *��� *� �����

�� ��� �� � �������� 0� 3� 4� *� 566*

4�,�;�/�� 4�<=�=�(�� 4�/��� )� �>7 �4�?>�<��� �=;(&�@ ��4�)( ,)4) �=)(�?; �"

� ��������� ��� !1. ����� ���� $����(��� �C��� ��7�� ;�� ������� �� ��� ���������9� �����������3������� �������� �� ��� ��D����������������������� �� ������������������ #�9# ��������

�������� �������� ������� �%���$�� �%���6.3@$�� �%����- �%���@@A@ �%���@,>@ ��%��@��A ��� ��� ��� ���������� ����������!# ..

�%���$�� �%����- � �%��@��A ���� ��� ������������ ��� ����6. ��B� � @��A ��� ������������ ���� ��� ����������� ������ �� ��� ��-��������� �%��6.3@$�� �� ��� ��� ��������� ������� ��� ����������� ������ �� ����� ���� ������ ����� ������� �6.������ ��D���� ��6.3@E 6� �--���� -�� �-- ��� �-� ���.� � �������� �� ��� $452���� ��������� �%���@@A@ � �%���@,>@ ���� ���@��A ��� � ������ ������% ����� �������� 7���

�+�"4,> � ��� ������������ ����� �� ������� ��������� �? ��D����� ������ �������� �� ��� ��-������������������ �� �������� � !1. /@A ����� � ��������

������� ��� ����� �� ���� ������ ������ ������������.6

��� ������������ �� ������� �=,0� �� ������ � ��� ������ ���� ����� �� ��D��������� ���� ����� ���� � �������� ������� ��� ����� �� ������ ��������� ���������� ��������� �� ��D�� ������� ���� ������� ��� !1./@A ������

����� ����������

��� ����� ���� ������ � �!����� ������� ����� � ������ �� �6"�2���25 ����� :���� � ���� ������� �������������� � ��� =,0 �������� ��� ����� � ������

������ �� ���� ������ � ��� � ������� ������ �������� �� ��� ����� �������� *��� ��������� �� �� �� � ������� � *��� ���"#$ ���

��������� +�� ����� *�� � ��� �������� �������� *��� ��������� �� �� -0.�12(/ �� � ������� � *��� ���"#$ ��� ��������

-0.�1#3#(/ � +* ���� ����� � ������� ������ �������� *�� ��������� � ��� ����� *�� ������� *��� � ���� �� � �� � � ���� ���������� ��� ���� � �* ������ ��������� ��������� �� �������� ��� �� ������� �� � �������� ������� � ����� *��� �� ���"#$ ��

������� ��

�� ��� �� � ������� 0� 3� 4� *� 566*

�� 4�,�;�/�� 4�<=�=�(�� 4�/��� )� �>7 �4�?>�<��� �=;(&�@ ��4�)( ,)4) �=)(�?;

��� ���� ��������� 6 ��� ����� ��� ����� �� ���������� ��������� �� ��� ��D��������� ��� ���� !1./@A ������

!"#�� ���� � #

��� ����� ������ � �� �� .���26 ����� :���� � !5������������ ����� ���� ������� ���� ���������� � ��� =,0�������� ��� ��� ���� ��� ����� ���� ����� ���� 6�������5�������� ������ �� ���������������� �%��� �� ���������� ����������.

� "������������� ��������

��� ����� ������ � �6 �� '���26 ����� :���� � ��%������������ ����� ���� ������� ���� ���������� � ��� =,0�������� ��� ��� ���� ��� ����� ���� �������� ��������� ���� ����������������� ���� ����� ����� � ������������� ���� 2�!6 = ����"/�� ��/ '�+� � (�������������� ���� �������� � ����������� � �! 222�� ���6 ������ ��� � ����������� ������� �� ������� ����������.# ���� ���������� �� ���������������� � ���������

���������� �$$���

��� ����� ������ � ������ �� �� �� !���2.:���� � 1#��������������� ����� ���� ������� ���� ���������� � ��� =,0�������� ���� �������� �� D������� � . � 6 ��� �������� $������ ����� �������7��E 7� ,�7 ;�� �

�� �������� %���& ������������

��� ����� ������ � �� �� .���2. ����� :���� � 1#��������������� ����� ���� ������� ���� ���������� � ��� =,0�������� ��� ��� ����� ���� ������ ���� ���������������� �� -�4 �/�����F 3���� ?��� $����&����� � �22 �F �� ������ ��� 5 ���� ���� ������� ��D������� � ��������� �����

'��� ����� $�� � ������ ���������

� ���� �� 6��26 ����� � ��%����� ������� ����� ����������� ���� ���������� � ��� =,0 �������� ����������� ������� ����� ��� ���� ���� ����� �� �������� 52 �� ������ �� ���)����� �� ��������� ����� ��2> ������ ������� ������ ������������ ��� ���������������� �$�$�*�-@� ���� ������� � ��������������� ���� �� �@�� ������� ������ �='. $� ���& ?����������� $� ���& ��� � �7����������� �?� 7�� �4������ �?� 7�� 4����� F��������� ?������� ����

���#���

$$����� �$ ���"��#������ ���( ���� ������

88-��� �������� �������99 ���� �6.��������� ���: �? ������ !# �� ������� ��� ���������� �� �%����������%����� ��� �� ������� �-,0� � �- ��������� ������ ����������� ������� �� ��� �������� ���������� �(�� �?� �,� �������� ���������� ��������� �%������� ��� ������������ ��� ���� ��� ����������� ������ �� �6.���������� �������� ������ ���� ������ �� ������������ �6.������ ����� � $452 ���� ��������������� �������� ��%������� ��������� ����� -,0��7�� �� ��� �� �? ��D����� �������� �� �������������� ��- ��������� ��������� �� ����� ������������� ������ �- � ���� ����� �� ������� ��� ������������ ����� �%����� -,0 ��7�� �� ��� �? ����� ����� �� ���� ���� �� ��� �%������� �� -,0� 0 ������ ����� ����� ������� ������� �6. ��� �� ������� ��� ������������ � �%����� -,0� � ����� �������� ��� ������� �� 88���� ��������

�������99 ���� �6.��������� ���: �? ������ �����%���@@A@ �%��6.3@$�� � �%���$�� �(�� �� � ��� �� ������� ���� ���� ��� ������� ��� � ����� �6.

������ �� ��� � ��� ������ � ��&� +�� ����� �������� *��� �������� �� �� �� � ������� � *��� ���"#$ ��� �� 0.� ��������� *��

��������� *��� ��� �� � �������� �� � ��& � ' ����� � �� *�� �� ���� ������� %��������� � �� �������� ���������� ��� �������� ��� ���������� ��� ����4� -�1'/ � � �� � �* ������ ��������� ��� �� ������� �� � �������� ������� � �������� ������ -�/ 0 ������������ -�/ 0.� � ( ,2( -���"#$ ��� ,�������� / � -� / 0.� � 2( ,2(� -� / 0.� � #( ,2(� -� / 0.� � 2(( ,2(� -� / 0.� � #(( ,2(�

�� ��� �� � �������� 0� 3� 4� *� 566*

4�,�;�/�� 4�<=�=�(�� 4�/��� )� �>7 �4�?>�<��� �=;(&�@ ��4�)( ,)4) �=)(�?; �$

����� G(3, ���� ��� ����� ��������� � �- �%��������� (3,��6. �(3, ����� �%������� ����- �!+ H ����� ��� ������� ����� ���� ����- � �%���@@A@ ��������� ��� �� � �������� ���� �%��6.3@��� ���%���$�� ��� ������� ����� � @��A �%������� ���������� ������� �� %��� ����� � � ����������� ����(�� !� � ?�� 0 (3,��6. � ���� ������� ����� � ����������� ������� �� ������ �������� �� ������������� �%��6.3@$�� � ������������ ���� 0������ � ��������� (3, ����� � ����������� ��������� ������� �������� ��� ��� ��� ���� =,0 � I.2� ��

�%��6.3@$�� �� ����� /������ ��������� ���%���$�� � �%���@@A@ ������ ���� ���������� ����� ����� � (3, ������

+�"4,> ��� �� ��� ���� ��� ������� ��� ��������� ���� �������� ��� ����� ���� ��������� ���� �%���6.3@$�� � �%���@,>@ � ������ ����� � ���������� -�4� �� ���� � (����� . ������� ���%���@,>@ ��� ������� (3, � ���� ������������ �������� �� -�4� ��������� ���� �%��6.3@$��� �%���@,>@ ������ ������ �� � ������� ����������� �� -�4 � (3, ������ /������ ���������� ��

������ �� ����� �� � � 2� ������ �� +�� ����� *�� � ��� �������� �������� *��� ����5 2�5 �� �� �� � ������� � *��� �������� � *��� ���"#$ ��� �� � ���� ��������� ������ '( �� � ��� ���� ������� *�� ���6����� � ����� �� � �� 2(7 �8��9�� �� ��������� ���������� � ����� �� *��� � � �� ��� ���� � 2� ����� ��� - ! / ��������� �� ������� � � �* ���� ������� -� *�/ ���"#$ �� ������� �

� �� *�� �� ��������� ������� � �� � :'�� � ��������

�� ��� �� � ������� 0� 3� 4� *� 566*

�� 4�,�;�/�� 4�<=�=�(�� 4�/��� )� �>7 �4�?>�<��� �=;(&�@ ��4�)( ,)4) �=)(�?;

���� ������� ����� �� -�4 �� ������ �������� ����������� ���� �%��6.3@$�� � ���������������� ����� �� ������ �- ������������� �%�������� �� ��� ��� ��������� � ��� �������� �%����� ��-,0 �� ��� ����

����������� �$$����� �$ �������

�� ��� 88���� �������� �������99 ���� �6.������������: �? ������ ��� ������� ��� ��������� �� ��������� �� �- ���������� ��� �� ���������� ��� ���������� ������ ����@#�!@ � ����� @�� ��� ������� ������ ��� �� �? ��D����� ��������������� �� ���� ��� ������ �� ��� ��- ��������� � �%������ ��� ������ ������� �� ����@#�!@ ��%��6.3@$�� ��� ��� ����� ���� ����- ����� ��� ���%������� �� ��� ��� ��������� ����� �%����� @����� � ����� ��� @�� �%������� �������� � � �������������� ������ � ��� ����� ���� ���� �- @������� �� �%������� ����� ���� �� ����� ��������� ����� �������� ������ ��� �������� �� @�� ��� �%������� ����

����@#�!@ �� ��� ��� ��������� (3, ����� ���� ������������ ���� ����@#�!@ ��� �� � �������� �����%���$��� �� ����@#�!@ �� ���� ��� @���%������� �� �������� + ����� ���� ������� � ������ ����� !5 ����� ���� ������� �(�� 5� ��� ! �� #� �/������ ��� ��� ����� ���� ������� ���� ����� ������������� � ���� �� �2J�2 �=,0� ������������� ��� ' �� ��� �� ������� ����� ���� �%���$�� � �������@#�!@ � !5����� ������ � ��� �! �� �#� @���%������� �� ����� ���������� ���������� ������� ������� ������� �� ��� �6.��������� ���: �? ������ ��������� @�� �%���������%��6.3@$�� �� ���� � ��� �%� �%��������� 0

��������� �� ����@#�!@ � �%��6.3@$�� � ���� ���2J�22 �=,0� ��� (3, ����� @�� �%������� ����� �� ����� � ��� � ��� ����� ������� ���� ����@#�!@ ��� � =,0 �� �2 �(�� 5? ��� � �� 5� � 0 ������ @���%������� �� ���������� �� �%��6.3@$�� ��������� � ������������ ��� � (3,��6. ����� � ��� 6 �� �!� �/������ ��� ���������� �� ��������� ��� ����%��6.3@$�� ������� �� ��������� � �� ������ � ���� ���� �� �%��6.3@$�� �� ����@#�!@ ��22J�2� � ������ ������� ������ �%������� ����� �� ��� ��� ���������������� ��� �6.���������� �������� �� ��7�� �� ���������� ��� ����������� ��- ���������3�������� �� ����@#�!@ �� ��� ������� �� ���

����� �� ����J �� ����� �������� � ��� � ����������� ���� ����@#�!@ ��������� ���� � ����� ����� ���� �662� �� �122����� ������ � ����� ������� 6��� ������� ����� �� ������ �������� ������������ ������� ���� �%���$�� � �� ��� ������(�� 6��� �������� ���� @�� ��������� ������������ �� �%��6.3@$�� �������� ��� ����� ���������� ������������ ��� � (3,"�6. � ��������� ��� �� � (3, ������ $������� � � �������������� �(�� 6?� ������ ������� �� �%��@��A �����@#�!@ ���������� ������� ��� �&��� �������������� �� ����� ������� �� �%��@��A� ����

������ �� ����� ���������� ���������� �� ����������� ������� �� �%���$�� ��2J�2� � �� ��� ����� ������ ������������ ���������� �� ��� �&���������� �� ����� ������� �� �%��6.3@$�� �� ����������� � (3,"�6. � ���� ������� ������(���� ��� ��������� ������ �� ����@#�!@ �������

�� ��������� �(�� #� � 0������ �� ����@#�!@ � =,0 �� �2 ��� 6 ��� 7����� �������� ���� (3, ����� ������ ��� ���� 7����� ������ �� ������������������ �� ��������� �� �%���$�� � ���� ����� ��������������� �������� �� �%��6.3@$�� �� ����������� � ���� ������� ����������� �� �� �������� ������ ��� ��������� ���������

� ������� �� ��������� ������ �� ��������� ��

������ �� $������� � � ���������� ; ��� ������� �� �����

����� ������ +�� ����� *�� �������� *��� ��������� �� �� �� ��

0.� � 2( �� � ������� � *��� �������� ���"#$ �� �� 0.������������ &��� ����� � *�� ��������� " ���� ���� �� ��������

�� �������� ��� �������� ��� ��� ������� ��� ����4�

-�1'/ � �* ������ ��������� ��������� �� ��������� � � ������� ������ ��������� +�� ����� *�� �������� *��� �������� �� ���� �� 0.� � 2( �� � ������� � *��� ��������� �� �� 0.� � 2(

���, �������� ���"#$ ��� �� 0.�� ���������� +* ����

����� � ������� ������ �������� *�� ���������� ��� ��� �������� ��� ����4� -�1'/ � �* ������ ��������� ���������

�� �������� ��� �� ������� �� � � �� � ������� ������� � ;$. �����

�������� *��� �������� �� ���

�� ��� �� � �������� 0� 3� 4� *� 566*

4�,�;�/�� 4�<=�=�(�� 4�/��� )� �>7 �4�?>�<��� �=;(&�@ ��4�)( ,)4) �=)(�?; ��

����@#�!@ � �%��6.3@$�� � ��� ����� �������������� �6.�

����#���!�

��� ������ ������� ���� ������� �� ������ ��� ����������������� �� ��� ���������� ������������������ ������������� ������� �� ���� 0� �� ���� 7�� ��� '2"+6> �� ������ ��� ������� � ����� ���������� ��� �- ��2"�! ����� ���� ����6. � ��������� ����� �� � ������������� ��� ���������� ����� ��������� �� �- ������� ��������� ����� �������������������� �������� �������� ������ �� �������� ��7�� #�*--> ����� ������� ������ �- � �������� ��������� ������ � ������� ���������������� ��� ���������� 88��� �������� �������99 ���� �6.������

���� ���: �? ������!# �� ���� �� �������� ����� �������� ��������� �� �- ������� ������ ?����� ��� ���������� �%�������� ���� �%���@@A@ �%���@,>@ ��%��6.3@$�� ������� ��� �������� �������� �� �%�������� �� @��A � +�"4,> ���� �� �6. ���� (�� ! � .��� �������� �� �������� �� ���������� � �����@�� ��� �� ����� ������ ��� �� �? ��D����� �88�%������� ��������99 ���� (�� �� � ,�� �� ��������������� ����6."������� ���������� �� ���������� ��������� ������ �� ����@#�!@ � ��� ����� ���� ����- � �������� ��� �������� �6.���������� �������� ������ ���� �� �� ���������� ����� � �- ���� (3, ������������ ���� ��� ���� =,0 �� �%��6.3@$�� ���� (�� !��� ��� ���������� �� �%��6.3@$�� �� ������� ����������� ������� �� ��� �� �%���$�� � ��� ����� ��������- ���� (�� 5� ������� ������ ��� �6.������������������ �� ���� �� �� ����� ����� �� ����� ������������ ����� �� ��� ��� ��������� ��� �� ������

��������� ��� ���������� �� ����@#�!@ � �%���6.3@$�� ������� ������� ������ ��� ��� ��� �������?������ ����������������� ��������� ����� ���

��� �� ��� ��� �� ������������������ �������� ���%������� �� @�� ������ ����� �� �������� �� �%������������� ������ �� ������ �������� ���� �����.' .+

(���������� ������������� ����� �� ����� ����� �� ����������� ����� ������� ������� ������� ��������.1

/������ ����� ������� �� ��� ������ ���� ������������������ �������� ��� �� �� ������ ����� ��������������52 ?����� ���������� �������� �� ������������������ �������� � ����� ��������������� �����' 5� 5! �� ������� :����7�� ��� ��������!' 5."56 �� ����������� ������� ������� ���� �� ����� ��� ����� ��� �������������� �������� ��� ������� �� ����3����������������� �������������� ���� �������

�������� ��� ������� ���� ���� �������' �������� �� ��������� �� �������� �� ��� ������� ����� �� #�*--> ������� ��� ��� �� ���� ������ ���������� ��������� ��������� ���� � �(* �������������������� � 7���7��� !�5#"5+ (������ K�� �� �51 ��������������� ���� ��� ��� ����7 ������ '2 ��� �������� ����� ������� �� ���������� �� ����6. �� ����� ����%������� �� ���������� ��� �� ����� ����� ���� �- ��������/������ � ��� ������ ����� � ��� ��� ������ �� K�� ��

� 51 ��������� �� ��� ������� ��� ��� ���� �� ���������� ��� ��� ������ �� ������ ��������� *��������� � ����� ������� �- � ���� ���� ����� �� �� ������� �����%��6.3@$�� ����� ������� ��������� �� �%��@#�!@� ��� ������� ���� ����� ����� ���� ��� ���� ��� ������������ �� ��������� �)����� �� �������� ��������� �� ������� ��� �� ��� � ��� ��� �������� =,0�������� �������� ��������� �)����� �� �������� ���� ����� �� ����� ���� � ���� ������ �������� �� ���

������ �� ��� ����� ������ � ���������� +�� ����� *�� � ��� �������� �������� *��� ���� ������ �� ��� �� � ������� ��� +�� ���� �������*�� ��������� 2� #� ��� " ���� ���� �� �������� �� �������� ��� �������� ��� ��� ������� ��� ����4� -�1"/ � � �� � �*

������ ���������� -�/ 0 ��� ��������� -�/ ��� ����� �������� *��� ��������� �� �� �� �� 0.� � 2(� -� / �� �� �������� *��� ���������

��� �������� ��������� ���� �� 0.� � 2(<2(� -� / �� �� �������� ���� *��� ���"#$ ��� ��� ���� *��� ��������� �� 0.� � 2(<2(� -� / �� ���������� ���� *��� ���"#$ �� ��� ���� *��� ��������� �� 0.� � #(<2(� -� / �� �� �������� ���� *��� ���"#$ ��� ��� ���� *���

��������� �� 0.� � 2((<2(�

�� ��� �� � ������� 0� 3� 4� *� 566*

� 4�,�;�/�� 4�<=�=�(�� 4�/��� )� �>7 �4�?>�<��� �=;(&�@ ��4�)( ,)4) �=)(�?;

���������� ���������� �� ��� ��������� �� 88���������� �������99 ���� ���: �? ������ � �-�������� � ������������ ������ ����� . �� ���� �� ��D������� ������ �� ��� ������� �� ���� 88��� ���������������99 ���� �6.��������� ���: �? �������(���� �� ���� ���� ��� �� ���� ���������� ������� ��

��� �- ������� ���� ��������� ������������������ ��������� � ���� /������ �� �� ������ ���� ��� ����������� � �� ������ �� �� �- ������� ������������ ���� ������ ������� ������ �- ������� ���������� � ���� ��� �� ��� ����� � ���� ������������1

��%�!&���������

� ��7 ��� 0� $��� � ��7�� <�������� ��� �%��@��A� ���@�@ ��� ;� =��&7� � ,�7 <�������� ��� ���������� ���@� ���� � 3������ <�������� ��� ��=4�.> � 30A@B �B� ?7 � $��� ;� ��� ���@�@� ��� ��� ������� �� /���� F�3���� ?��� $���&������� -�4� ���� ���7 �� ��������� � ��� �� -��� � �������� $�������� 3������ ���� ��� ;���� =������ ��@������ $����� � ������� ��!#'�212� � ���*����������� 3������ (������ ��7�� ;��

��'�������

�� ?����� F@ <����� 3�� B����� ��� &��(��C ,�� ,�����'! D���������� ��� $������� ,�?� '�� ��� *��������� *�JF�������� 3��E �11#J12!"1�6�!� ?���� 4 B��� L 0��7 = �� �� 3��������� ��������������� ��� :������� ������ ������� ������� ���������� ������� ��������� ��������� #���������� �11+E�.1J.11#".111�.� B��� L B������ @ 0��7 = �� �� @���� ����������������� �� ������������� ������� ������� ��� :������������� ��� ������� ������ ���� ��� ���" �? �������$����� %�� �111E61J.251".26!�5� B������ = B��� L �7�� A �� �� ������������������� �� ���� � ���� �6. ��� ���������� � �6.���������� ������� ������ ���� ���� � $��� #�����������(� �11+E+.J.##+".#'!�6� B��� L $�������� A B�� / �� �� 0������� ����������� � ������������ � ������� �� ������ ������ � ���� ����� ���������� �6. � %������� �� �6.����������� ������ ���� ���� !��������� %�� !222E!2J!'!."!'!+�#� B��� L L�7�� / �7�� A �� �� ��������� ������������� ���������� �6. ��� ������ ��� ������ ������������� �� ���� � �� ���� � $��� #������� ����(� 0������'� A�� �/� 3�������� ���������� �������������� ����J �������� ���� ���� ������� ���� ������ � $��� &�����!222E�26J+.'"+.1�+� =����� B ��� ;� *������� � ������������� ������� ���������� ������� ��� ������ ������� +�� 8��� ,�����11'E+J+2."+�6�1� /������� = 3��� A -������� =$ �� �� ����� �� �6.��� ������ ������� � ��� ������ � ���� ����� �������!��� %�� �115E!!J.66�".666�

�2� (�� ;� =���� A A��7� � �� �� /��� �������� ��������� �� ��� �- ��� � ������ ������������ ���������� �������� � $��� &����� �11.E1�J�'1"�+5�

��� ����� 3 F���� � *������ $ �� �� -�� �- ������� ������������ �� ������ ������������ � ������������� �������� �� ��� ������� ���� � $��� &����� �11.E1�J�'6."�'#2�

�!� 0�� � $��� � =�&�� � �� �� <�D�� �������� �� �6.������� ���� ������������� ��� �� ���� ������������������� �� ��� �������� $����� %�� �11!E6!J�.#1"�.'��

�.� B����� FF =��� ��� �6. ����� ���������� ��� ��������� ����� $����� 8��� ,���� �11+E6J6!"#.�

�5� -������ = ?��� 3� �6.�,������ ���� ��������J������ ��������� !�� 0���� �111E�2J�.1"�62�

�6� ?����7��� =4 -�77�� * �)�����& = �� �� @�������� �6.��%������� �������� � ��� ��������������� ������������� �� ������ ������� ���� ������ � $���#������� ����(� �11+E+.J!6�#"!6!!�

�#� ?������� ;3 A�� �/ ������ � �� �� � �������� ������� ��������� ����������� � �6.��������� ��� ����� �������������� �11#E!'5J.'.".'#�

�'� /���� � $�����;���� � ������ �= �� �� ,BLM�2�6 @�? ����������� �������� ����� �������������� ��������� � �������� ������� ��� � ��������� �� ����� ��������������� ����� ��� �����11'E.J#.1"#56�

�+� A�� � /������� � =�������7 (� ,BLM�2�6J ������ ���� ��������� ��� ���� �11+E5J�.5�"�.5!�

�1� -������ (� ,������ ��� ��� ���� ����� �? 66�7���������������� �� �������� �������� ������ ����������� �������� ���� ��������� �� ��� ���� ������ � "���� �11'E'�J65+"6#��

!2� 3���� � /������� � ���7�� B; �� �� 3���������� ,BLM�2�6 ������� ������ �������� �� ��������� �� �6. ����� � ����� ������ � "���� �11+E'!J15'2"15'+�

!�� /� ;- $����� B $������ / �� �� ������� ��� ����������� �������� ��� ������ ������� �� ��� ���� �����J ����������� �� ��� �������� @���667� ���� +�� 8���,���� �111E�2J6'1"612�

!!� /�� �3 ��% ?3 ,9������ $; �� �� �6.�������� �������� : �������� �� ��D����� ��� ���������� ���������������� ��� ���� �11+E5J�2#+"�2'!�

!.� /�� ;B ?��7 �;� �6.� 0������� � ����������D������� ��� @�?�66A � �������� ���� 6 ���������� �"���� �111E'J6..."6.55�

!5� ������ � -�� 3 -������� *� ��� ���������� �������� ������ @�?���� ����� � � � ���������� �� �������� ������ ���� �6. ������ � "���� �111E'.J!2'5"!2+.�

!6� $������ � 3����� B ?�� ;F� 0��������� � �%������� ����� ���� �������� ������� �� ������� ��������� �� ���� ����� � �@�? �������� ��������� � ��� ������0������� �111E�+J62.!"625.�

!#� L�7�� / /���� < �7�� A �� �� ���������� �� ������������������ ��� �%������� ������ ���� �6.� ������������������ 0 ,�� )�� !����� ������� � ��� ����� ������ �8��� ,������ ��7��E �11+J��6�

!'� =���� ( $���� = ��� F �� �� @�������� ��� ������ ���������� ���� �� ����7��� ������� �� ���������� ���������� ��������� ��������� +�� 8��� ,���� !222E��J!!."!.6�

!+� K�7� A �7 L =������� 0 �� �� 0������ �� �%������� ��=/������ � 00 ���� � ��� ������� ������ �� ���� ����� �6.� &�� � $������ �11+E'6J.1�".16�

!1� B��� L 0&��� = ����&� A �� �� 0�������� ������ �������������� � ��� ������� �� ��� ���������� ������������ ��$/� ���������J ���������� ������ ���������� �� �$/ � ��� �%������� �� �3 ����� � $���#������� ����(� �1+'E#5J151"16.�

�� ��� �� � �������� 0� 3� 4� *� 566*

4�,�;�/�� 4�<=�=�(�� 4�/��� )� �>7 �4�?>�<��� �=;(&�@ ��4�)( ,)4) �=)(�?; ��

.2� B�� / L���� A =��&7� ;� @������� �������� ���������%������� ��������� ���� ���� ��7������ �������8���� �11�E�2+J�1."!22�

.�� =�&������ / A� =�� @������� ���������� �� ��������������� ������ �� �������� �� ���� ������ �������+�� 8��� ,���� �11+E1J!6''"!6+.�

.!� =�&������ / A� =�� � ������ ������ ��� ���������� @��� @5�������� �������� ������� ������� +�� 8���,���� �111E�2J!2�."!2�'�

..� A��� L F�� - $�� L �� �� @������� ��� ������� ������ ����� �� ���� �������� �������� �%����������� � �������� ��� ���������� ������� !��� %�� �116E!.J.+�#".+!��

.5� ���� @ ������ 3� 3��� �� �������� @�? ������� �����������J ������ ����&��� �� ���������� �������� ��������� ����� ��� �%����� ��� �1�7������� ���������� $��� *��� �112E�2J�!2"�.2�

.6� =��7� $ =7���� = A��� L �� �� @������� ��������� �������� ���������� ���� �������� �B�������������� ������% � ������ ����� ��� ���� � ����� ����������� �� ���� !��� ��� ��!� �11#E1.J�.!2"�.!5�

.#� $�����7 ; (������ @( =���� �� �������� $�����6 !@�(����� ������ !� ��� ���� $���� /���� BLJ ����$���� /���� F������� *����E �1+1J�#�##"�#�#'�

.'� (����� $=� ���������� ������ �� �������� @�� � �������� ������ �� ���� !��� ��� ��!� �11�E++J12''"12+��

.+� $���&�*����� 3 C������ = =��� * �� �� &� ���������� ������ �� ���������� �������� ��� ������ �� ����������� @� ���� $����� 8��� ,���� �11+E6J!�6"!!5�

.1� ��� = 3�7� $� A�)�� / �� �� /����� ������% ����� � �� ��� ���� ����� ��� ��� ������� �� �������� ��������������� +�� 8��� ,���� �111E�2J.+6".1.�

52� /���� � A�� �/� 3�������� ���������� ���������� ��������� ����� � $��� &����� !222E�26J+5'"++6�

5�� 4������ �= 3��� � ?���������� F/ �� �� �6. $�������� ����������� ��������� �� @�?�������� �������� ������������� ������� $����� %�� �111E61J5.#1"5.'5�

5!� L�� F L� ��� ;���� �=� ,BLM�2�6 ���7� �������������� ���� ����������� � ��� ���� ���� ���� � �������������� ������� ��� ���� ��� ���� ������� $����� %��!222E#2J�221"�2�.�

5.� (����� $, 3�����7� A3 *����� �F �� �� � ���� ����� ������� ������ �� 7��� ���� ����� �����������J ������������ ������ ������� ��� � ����������� +�� 8��� ,�����11+E1J�.!."�...�

55� � M -������� A ,7�� 4 �� �� ����������� 88������������� ��������99 ������ @�� � ����������������� ,��� ,��������� �111E5J�'2"�'+�

56� ����� , ?���� 3= =����� ;�� ������ �� ���� �������� �������� �������� �� ����� �� ��� ������ �� ������������% ����� � �������� 7���� $����� %�� �111E61J5�2"5�.�

5#� 3�������& 3 $����� @3 F�� /L �� �� *������ ���������������� �������� �������� ��3��� �B'2#J ���������������%�� ��� ������� � �������� ������������� ������� ���������� $����� %�� �11'E6'J!661"!6#.�

5'� L� ��� $7���� -� /������ �3� 0���������� �� �������������� ��������� ��D����� �� ��� 7���7��� ! ������ ��� � ��� ���������� �� ����� ����� '#5 ���������������� �������� �������� ��� ������� ���� �������$����� %�� �111E61J�51+"�625�

5+� /������7 *; ��� L�B /� � �� �� � ���� �������������� ��������� � ���������� ������� ������ ��� ��������� �� ������������ ������� +�� 8��� ,�����111E�2J�'!�"�'..�

51� K�� ; -� ? K�� ; �� �� ������� ��� �%������� �� ���������� ���� ���� �� ���� � ���� �6. ������� $����� 8��� ,����!222E'J5"�!�

�� ��� �� � ������� 0� 3� 4� *� 566*

�� 4�,�;�/�� 4�<=�=�(�� 4�/��� )� �>7 �4�?>�<��� �=;(&�@ ��4�)( ,)4) �=)(�?;


Recommended