Aııbra Uııı\ Veı Fak Dcrg46.93-104.1')')9

TAVŞAN EMBRİYOLARININ GELİşME HızLARıNı VEX KROMOZOMUNA BAGLI ENZİM AKTİv ASYONLARıN}

ÖLÇEREK CİNSİYETLERİNİ SAPTAMA ÜZERİNDEÇALIŞMALARI

Murat FINDIK2

Studies O/l sexi/lg ofrabbit embryos by measuri/lg ofgrowth rate a/ldX-lillked enzyme activity.

Summary: This study was perlormed with the pul,JOse ol' determining oj there{({tionship between sex ({nd growth rate as well X-/inked enzyme ({divitv ofrabbit embrvos and to investigate to usefillness ol these features pır dererminingthe embrymıic sex in early periodı'.

/n the study, 40female and /0 male New Zealand white rabbits were used ({S

({ m({reri({/. Twenty out ol 40 female rabbits have be en operated ({t postcoir({l 9(j'/ı

hour ({nd the other twenty at 12(yt' hour. Em/JI)'os were co!lected by j/ushingovidud ({nd uterus. Then, embryos were examined microscopiuı!ly ({nd theirs{((ges H.'ere determined. Next, morphologica!ly nonnal embryos have be en put inpetri dishes ({ccording to the stage ol embryos and their enzyme activities wereme({sured /n orderj(ır sex identification by detennining X-Iinked enzyme ({ctivitv.Bri/tim1r eresyl Blue (Sigma) and readion mixture (PBS + 0.3% BS;\ + 0.05 mMf3-NAf)P + 0.5 mM Na-G6P; Sigma) was used. So as to specif)' l1'hich sex rheypossess rhe k({ryot'rpe ol embryos ol which their .itage and en7.yme ({ctivitiesderennined was prepared

/n rhis study //3 female and /22 male embryos h({ve been obr({ined v({ri({!JIein stage. According to GoPD (glucose-6-phosphate dehydrogenase) a('{ivir.",60. J 8% oflemale embryos and 5R.2% ol male embryos were correctly identified ({S

to sex (p>O,05). As a result ol chromosome alwlysis, in 53.7% oL male embn'os({nd 50% o/f£'male embryos sex identilication was correct as to their srages.

/n rhe srudy, 119 embryos have be en determined as fe17wle and //6 embrvosh({ve been derermined as maIl' according ro enzyme aetivity. Finallv, 55.320/c of119fel1wle embryos and 60(10 ol//6 male embryos were correctlv derermined. In92 ol /47 embryos (62.59%) used for chromosome l/Iwlysis embryonic se.ringspnified OL these el7lbryos. 48 (52.17%) and 44 (47. 83%) wae fllUnd to be17w/ew1df£'17wle respectively (17)0,05).

As a consequence, as to embıyo stage, correct embryo sexing r({te w({S 53.7%in males and 50% infemales. Asfıır G(jPD activity this rate was 60% in m({/es aııd

i Alj. Ar;ı~ıırıııd Foıııı ıarafından desteklenen (94-3(J-(J(J-27) doktora tezinden iil.etlcnıııi~ıir.2. Ara~.Gör.J)I'. A.U. Veteriner Fakiiltesi Doğum ve Jinekoloji Anahilim Dalı. Ankara.

M FINDIK

55.32% in !i'/1U1/es. /n both techniques. m(//e~fem(//e ratio ı.vas {(JUnd to be simi/ur

(p>0.05).Key words: Rabbit, embıyo sexinK, Kmwth nLle, X-/inked emyme activitv.

Özet: Bu {'altŞlna, tav,wn embriyolannın Kelişme hızlan ve X kromozoJnUlJ({bo'!:f/ı enzim aktivusyonlan ile cinsiyetIeri arasmdoki ili,ı'kiyi belirlemek ve buiizelliklerin erken diinemde embriyonik cinsiyet saptan/1UlSlııda kullonılobilirli!!,ini

omy ttmUlk wnacıvla yaptldl.Çalışmaııın huyvan //Ulteryalini 40 di,l'i ve /0 erkek Yeni Zelanda bewc

tav,wl1l olu,ı.turdu. Dişilerden 20'si ç:iftleşmeden sonraki 96. ve di/fer 20'si ise J 20.watk operasyona almdl. Oviduct ve uterus yıkanarak elde edilen el7lbri,volartnge!i,lI11C evreleri belirlendi ve dÜZKün morj(Jlojik ya/n lı embri)'olar gefi,mU'a,l'ullUlillrt/W Kiire ayn ayn petri kurulanna konularak ell7.im aktivas)'onlartii/p:ildü. X kromozol7luna balflt emim aktivasyonunu belirleyerek cinsiyetisaptamak iç'in Brillimıt eres)'l Blue ve Reaksiyon Kan,wnt kullmııldl. GeliYl17eoşo/1ut/art ve enzim aktivasyonlan belirlenen embriyolaruı gerçekte fUlI/gicinsivette olduklannı saptamak için karyotipleri hm.ırlmıdl.

Çaltlll1Ulda geli,l'IJ1e a,wmalanna Kiire J J 3 di,l'i ve /22 erkek embrivo elde

edildi. G6PD (Klikoz.-6~j(J.ıfat dehidmjenaz.) aktivitesine giire di,l'i el7lbriyolardmı1((;60.J S'inin, erkek embriyolardan ise %58,2 'sinin tanısı dolfru yapıldı (p>0.05).KrIııI'lO?OI7l analizi sonucunda, Ke!i,l'IJıe aşamaslıUl giire erkek olarak 0\'1'I1alıcl17briyo/ardan %53, Tsinde ve di,çi olarak aynlan el17briyolardon o/c50'sindecinsivet tWll.ımlıı do{frulu/fu belirlendi.

Çall,ı'ma .ımısıııda enzim aktivitesine Kiire dişi olduklart belirlenen //9cl17brivodolı o/c55,32'sinin di,çi; erkek olduklan belirlenen //6 embrivodon ise'((;60'1I1In erkek oldulfu dolfrulandl. Kmmozom analiz.i iç:in kullanılan /47embriyoııun 92'sinde (%62,59) embriyonik cinsiyet belirlendi. Bu embriyo/artn4X'inin erkek (%52, /7) ve 44 'ünün (%47.83) di,l'i oldulfu saptandı (p>O,05).

Ça/ı,ıma sonucunda geli,mıe aşamaslıUl giire cinsiyetin erkeklerde %53,7.di.yilerde Cfe50; G6PD aktivitesi sonU!,:laruUl Kiire de erkeklerde %60, dişi/erde%55.32 orwlIIıda dolfmlulfu belirlendi. Her iki yiintemde de erkek:di,1'i oranlortgenelde birbirine yakııı bulundu (p>O,05),

Anahtar Sözcükler: Tav,wn, embriyonik cinsiyeti saptwna, Kelişme /7171, Xkromo7.oJnUlıa ba.!flı emim aktivitesi.

Giriş

lnsanuğlu yU/yıllar hoyunca hem kendi ço-Luklarının ve hem de heslediklcri hayvanlarınyavrularının cinsiyetierini, yavrular doğmadan<ince çok çe~itli yöntemlerle belirlemeye ça-lı~ını~ıardır. GUnUmUz dUnyasında pekçokhekim, çocuğunun cinsiyetini önceden sap-tamak isteyen insanlara çe~itli gıda rejimieri,cinsel ili~ki takvimieri ve teknikleri önermektc,ayrıca halk arasında da birçok ampirik yöntem

bulunmaktadır (i O, II, 15, 22, 46) Son 15-20yılda gelişen spermatolojik ve emhriyolnjik tek-nikler sonucunda, hirçok bilimsel yi)l1tem kul-lanılarak, cinsiyet saptama çalışmaları yapılmışve bunların bir bölümünden iyi sonuçlar eldeedilmiştir. Özellikle son yıllarda daha da ge-lişen laboratuvar ko~ulları ve yeni kUltür or-tamları sayesinde bu konuda önemli gcli~mckrsağlanmıştır (22, 40, 46). GünümU/e değin hay-van embriyolarında yapılan cinsiyeı belirlemeçalışmalarının ınsan embriyolarına uy-

TAVŞAN EMBRIYOLARININ GELIŞME HızLARıNı VE X KROMOZOMCNA BAGU ENZIM .. 0)

gulanahilirliği tüm dünyada tartışılmakta~ır(i 0, 22)

Memeli hayvanlarda cinsiyetin genetik te-meli X ve Y kromozomlarına dayanmakta, YkromoZOll1lınun varlığı ya da yokluğu yavrununcinsiyetini helirlemektedir (30). Cinsiyeti bi-linen yavruların elde edilebilmesi için, ya to-humlamada kullanılacak spermatozoonlarınhangi cinsiyet homozamunu taşıdığını be-lirlemek ve tohumlamaları istenilen cinsiyetkroınolOmunu ta~ıyan sperınatozoonlarla yap-mak ya da in vivo veya in vitro koşullarda eldeedilen emhriyoların cinsiyetierini helirleyerekistenilen cinsiyellekileri alıcı hayvanlara trans-fer etmek gerekmektedir (i I, 12). Bundanha~k<ı, gehe hayvanlarda da fötal cinsiyet, ult-rasonografi ve amniosentez gibi yöntemlerlebelirlenebilmektedir (I, 9, 24, 29). Emhriyonikcinsiyet saptama çalı~ması, ilk olarak Hare veark. (21) tarafından sığır emhriyolarında ger-çe kleştirilm iştir.

Testislerde üretilen X ve Y homozamu ta-~ıyan spermatozoonları hirhirinden ayırıp, farklıtnhumlama payetlerine toplayarak yapılacakcinsiyet saptama işleminin, en ideal cinsiyetisaptama yimtemİ olacağı (2, 33, 44), ancak gü-nümüzde ticari kullanım için pra-tikleştirilcbilmi~ ekonomik hir ayırma yön-teminin bulunmadığı hildirilmektedir (12, 23).Spermada cinsiyeti saptama teknikleri, X ve Ykromozomu ta~ıyan spermatozoonların kiitle,haeim, yoğunluk, hareket ve motilite gibi fi-ı.iksel karakterleri arasındaki farklılıklara da-)anmaktadır (3, i 1, iS, 30,46). Bu karakterlerarasındakİ farklılıkları saptayabilmek için de-nenmekte olan yöntemler ise spermatozoonlarıhasınç ve pH değişikliği, milipor filtrasyon,sephadex jel filtrasyon. elektroforezis, santrifüj,sedimentasyon, selektif imha ve now sitometriile ayırma. H- Y antijenine kar~ı im-munil.asyoııla, immunomanyetik teknikle veyaalbüınin süııınları üzerinde fraksiyonlanı ayır-ma olarak hildirilmi~tir (LS, 17,23,43).

Emhriyonik cinsiyeti sap tama yön-temlerinin ticari kullanım potansiyeline sahipolduğu, verici hayvanlardan toplanan veya invitro koşullarda üretilen implantasyon öncesieınhriyoların cinsiyetierinin helirlenmesiyle,

alıcı hayvanlara sadece istenilen cinsiyeııckiembriyolar nakledilerek, istenilen cinsiyellen is-tenildiği kadar gebelik oluştunılahileceği hil-dirilmektedir (S, 6, 14, 40). Hücresel analizlericHaIT cisimciğinin, cinsiyet homozomlarının,erkeklere özel antijenlerin, erkek ve di~i eınh-riyolar arasındaki gelişme hızı ve gidişindekifarklılıkların, erkek ve dişi emhriyolar ara-sındaki metaholik aktivite farklılıklarının he-lirlenmesi veya Y homozamuna özel DNA zin-cirlcrini kullanarak embriyonik cinsiyet tanısıgibi yöntemler implantasyon öncesi emh-riyolarda cinsiyeti saptamak ıçın kul-lanılmaktadır (22, 43).

Emhriyonik cinsiyeti saptama yön-temlerinin etkinliğinin değerlendi ri lmes iııdeyöntemin doğruluk derecesi, embriynnun ya-şama giicii üzerine yaptığı etki, uygulanan tek-niğin toplam maliyeti, tekniğin çalı~ma hııı vegereksinim duyulan teknik uzmanlık derecesigihi parametreler kullanılmaktadır (3, 22. 32,33,43).

Hücresel analizIeric cinsiyeti saplama yada karyotiplendirme yönteminin tavşan. inek vekoyunlarda gerçekleştirilen ilk cinsiyeti sap-tama yöntemi olduğu hildirilmektedir (22, 25.43). Bu teknikte, iki X homozomunun ya dabir Y kromozamunun tanınanilmesiyle veyaBaIT cisimciğinin belirlenmesiyle cinsiyet sap-tanmaktadır.

Araştırıcılar (I 7,25, 32,43), hücresel ana-lizler kullanılarak yapılan cinsiyet tanılarınındoğruluk oranlarının % iOO'e yakın olduğunu:ancak, tanının doğruluğuna karşın. cinsiyeti he-lirlenen embriyoların çoğunun analizden et-kilenerek ya~ama güçlerini kayhettiklerini hil-dirmektedirler.

Gates (I 6), çiftleşme sonrası değişik za-manlarda toplanan emhriyolann gelişme aşd-malarının büyük farklılıklar gösterdiğini vebunun 3 değişik faktör (fcrtilizasyon ıa-manındaki farklılıklar, emhriyonun hölünmeoranı, gelişmenin duraklaması veya tamamendurması) nedeniyle olu~ahileceğini bil-dirmektedir. Emhriyonun cinsiyeti ilc gelişmehızı arasındaki ilişki ilk olarak Tsunoda ve ark.(41) tarafından fare emhriyolarıncla İn-

')Cı

celenmi~tir. Ara~tırıcılar hızlı gelişen ve hlas-tnsölü daha önce oluşan embriyoların transferedildiği alıcı hayvanlardan doğan canlı yav-ruların cr; 71 'inin erkek olduğunu be-lirlemişlerdi r.

İn vitro üretilen sığır emhriyolarındanerkek olanların, fertilizasyonu izleyen 8 gün bo-yunca kü ltür ortamında dişilerden daha hızlı bö-lündüğü ve hüyüdüğü hildirilmekte ve buntınL~mhriyonik genomun aktivasyona haşlamasınınhemen ardından cinsiyete hağlı genler etkisiyleoluştuğu öne sürülmektedir (5, 6, 7, 8). Yadavve ark (48) ise, sığır embriyolarında seksüel di-morfizmin embriyonik genom aktivasyonundaniince bile görülehildiğini bildirmektedirler.

Xu vc ark. (47), tohumlamayı izleyen 8.glinde açılmış blastosist evresine ulaşan emb-riyoların büyük çoğunluğunun erkek olduğunuve erkek emhriyoların dişilerden önemli orandafazla hlicreye sahip olduklarını, diğer araş-tırıcılar ise (34. 39. 42) aynı şekilde erken bö-lünen embriyoların blastosist evresine ulaşmaolasllıklarınll1 yavaş hölünen embriyolardand,ıha yühek olduğunu hildirmektedirler.

Peippo ve Bredbacka (38), çiftleşmeyi iz-leyen 3. ve 4. günlerde topladıkları fare emb-riyolarını 24 saat süreyle in vitro kültüre et-mhler ve her iki grupta da cinsiyete hağlı birgelişme farklılığı belirlemişler, ayrıca uzun in\ivo periyotla dişilerin, kısa in vivo periyodutakiben in vitm kültür sonrasında ise erkekemhriyoların ağırlıkta olduklarını sap-tamışlardır.

Araştırıcılar (I 9, 26) mikromaniplasyon,kültür ve/veya dondurma sonrası sığır ve fareembriyolarının yaşama gücündeki değişimlerincinsiyetic ilgili olabileceğini ve erkek emb-riyoların olumsuz küıtür ortamlarına dişilerdendaha dayanıklı olduklarını huna karşılık diğeraraştırıcılar ise (18.28) farklı in vitro kültür or-tamlarında geliştirdikleri emhriyolarda cinsiyetoranlarında bir fark görülmediğini bil-dirıncktedirlcr.

Güniimlize değin yapılan çalışmalar son-raQnda, erkek emhriyoların, dişi emhriyolar-dan daha hıılı geliştiği ve hepsi aynı anda döl-knen emhriyoların gelişme hızlarına hakılarak

MFINDIK

erkek veya dişi olarak ayırahilmenin mümkünolabileceği kanısına varılmıştır (6,14.47.48).

Süperovulasyon yaptırılan hay\',ınlarda.ovulasyonlar helirli bir zaman peri yodu içindeoluşmaktadır. Bu nedenle, tüm ovulasyonlaraynı zamanda şekiııenmemektedir. Dah,ı öııceovule olan ve X kromozomu taşıyan hir sper-matozoon tarafından döııenen bir oosil. dahasonra ovule olan ve Y kromozomu taşıyan hirspermatozoon tarafından döııenen oositleıı dahaönce gelişebilmekte ve yanlış olarak erkek biryavru gibi değerlendirilehilmektcdir (5. n, 7. 8.41 ).

Emhriyonun taşıdığı X kromowmu sayısı,aktivasyonu X homozamuna bağlı bulunan en-zimlerin hücresel konsantrasyonuna ve ak-tivitesine aksetmektedir. Bu enzimlerin hüc-resel konsantrasyonu ve aktivitesi iki Xkromozomu taşıyan dişilerde. bİr X krn-mozomu taşıyan erkeklerdekinin iki katı ol-maktadır (33.35,36.43,45).

Gelişimin erken dönemlerinde. HCPRT(Hypoxanthine guanine phosphoribosyl trans-ferase), HPRT (Hypoxanthine phosphorib()~yl

transferase), a-gal (a-galactosidase) ve GnPD(Glucose-6-phosphatc dehydrogenase) gihi cn-zimlerin hücresel konsantrasyonu. hüereni nsahip olduğu X kromolOmu sayısına bağlıdır(45). Monk ve Harper (36), dişi embriyolarclakiHGPRT seviyesinin, erkek embriyolardakininiki katı olduğunu bildirınektedirler. Eınhriyometaholizmasındaki bireysel farklılıkların he-sabını yapabilmek için, X kromolOımına hağlıenzim aktivitesi hem dişilerde ve hem de er-keklerde, otozomal kromo7.0mlara hağlı en-zimlerin aktiviteleriyle kıyaslanabilil' X kro-mozomuna bağlı enzim akti\'itesiyle, otomınalkromozomlara bağlı enzim aktiviteleri ara-sındaki oranın, dişi cmbriyolarda, er-keklcrdekinden daha yüksek olacağı hirote/inedayanan araştırıcılar (35, 45), süperovııiasyonyaptırılan ve tohumlanan farelerden elde edilenimplantasyon öncesi cmhriyolarda cinsiyetisaptayabilmişlerdir.

Araştırıcılar (30. 35, 36. 45). bu yiin-temlerin embriyolar için belirli bir düzeyde tok-sik etkili olduğunu, yüksek enzim aktivitesi ya

Ti\VŞA\! EMBRIYOlARININ GELlŞ\IIE HızLARıNı VE X KROMOZO\llUNA BAGU ENZtM.. '17

da emhriyo üzerinde kalan hoya artıkları ne-deniyle emhriyonik ölümlerin oluşabildiğini,memeli hayvanlarda, (Ii~i hücrelerinde hulunanikinei X kromozomunun inaktivasyon za-manının kesin olarak bilinmediğini ve bu ne-denle haıalı sonuçların olu~ahilcceğini, emb-riyonik genomun aktivasyon zamanının türlereg(irc değişiklik gösıerebildiğini, her enzim ak-ıiviıesi düzeyinin, loplam hücresel ak-ıivasyonun hir parçası olduğunu ve bu nedenle,doğru sonuçlar elde elmek için toplam hücreselakıivasyonun da değerlendirilmesi gerektiğinihcl irtmektedirler.

Sunulan bilgilerin ı~ığı aııında bu çalı~ma,lav~an emhriyolarının geli~me hızları ve X kro-mozomuna hağlı enzim akıivasyonları ile ein-siyctleri arasındaki ili~kiyi belirlemek, bu yön-temlerin el11hriyonik cinsiyet saptanmasındakullanılabilirliklerini, hilinen hir yöntemle kar-~ıla~tırmak amacıyla yapıldı.

Materyal ve Metot

Çalı~manın hayvan materyalini 8- i2 aylık,doğum yapınamı~, 40 di~i ve iO erkek Yeni Ze-landa heyaz ıav~anı olu~ıurdu. Tavşanlar ça-lışmadan önceki 3 hafta ve çalışma süresinceA.Ü. Veteriner Fakültcsi, Doğum ve JinekolojiAnahilim Dalında hazırlanan tekli kafeslcrdeharındırıldı. Tav~anların hulunduğu ortamın 12saal aydınlık ve 12 saat karanlık olması sağ-landı

Çalışma maıeryalindeki 40 di~i tav~anın ta-ı;ıamı embriyo elde elmek için kullanıldı. Ça-11~l11adaçok sayıda follikül geli~imini sağlamakamacıyla PMSG (Folligon@, lntervet); ovu-lasyonu uyarmak amacıyla da hCG (Pregnyl@,Organon) hormonları kullanıldı. Di~i tav~anlaı'aPMSG i..2. ve 3. gün SO LU. im., hCG ise 4.gün öğleden sonra SO ıu. iv. verildi. HCG en-jeksiyonundan sonra tav~anlar çiftleştirildi.Çiftleştirme için her uygulama grubunda farklıerkek ıavşanlar seçildi ve erkek tavşanlar din-lendirilerek kullanıldı. Dişi tavşanlardan20'sine hCG uygulamasını izleyen 96. ve diğer20' sine ise ı20. saatle meclian çizgiden la-paralomi yapılarak, her iki ovaryum üzerindekicorrus !uıeııııı, patlamamış follikül ve he-morajik folliküller sayılarak not edildi. La-

paratomi işlemi S mg/kg xylazjne (Rompun@.Bayer) ve 35 mg/kg ketamin HCl (Ketalar@,Parke-Davis) ile sağlanan genel anesıai altıııdagerçekle~tirildi. Oviduct ve utertısu yıkamakiçin S- LO ml kadar 37"C'de steril PBS kul-lanıldı. Tav~anlar operasyon sonrası 1 ay sü-reyle gözlem altında tutuldular.

Elde edilen emhriyolar stereo mikroskopaııında IOx40 hüyüımede incelenerek uıa~-tıkları gelişme aşamaları Avery ve ark. (7)'nınbildirdiği ~ekilde helirlendi. Düzgün morfolojikyapılı embriyolar gcli~me aşamaları na g()re ayrıayrı petri kutu ları na konularak en/.İm ak-tivasyonumı ölçmek için kullanıldı. Emh-riyoların glukoz-6-fosfat dehidrojena/. enzım!aktivitelerini helirlemek amacıyla, Williams(4S)'ın tarif ettiği kolorimetrik ölçüm ıekniğimodelolarak alındı. Bu amaçla emhriyolar 0,05mg/ml BCB (Briııiant Cresyl Blue, Sigına) s{)-lusyomı içinde iS- 20 dakika hoyandılar ve dahasonra Reaksiyon Karı~ımı (PBS + (}H),3 BSA +0,05 mM 13-NADP + 0,5 mM Na-GoP: Sigma)içinde 37°C'de 30 dakika süreyle İnkiihe edil-diler. lnkubasyondan sonra her emhriyo içer-diği boya miktarına göre değerlendirildi ve budeğerlendirme i~leminde skala "O" ile "S" ara-sında tutuldu. Hiç boya içermeyen, yani yüksekenzim aktivasyonu na sahip olan emhriyolarınskalası "O", çok hoya içeren yani düşUk en/imakıivasyonuna sahip olan embriyolann skalasıise "S" olarak değerlendirildi. "O", "I" ve "2"skalada değerlendirilen emhriyoların di~i, "3"."4" ve "S" skaladaki embriyoların ise erkek ol-dukları kabul edildi. Değerlendirınelcr iOx iObUyütmeele stereo mikroskorıa yapıldı.

Gelişme aşamaları ve enzim aktivasyonlarıhelirlenen embriyoların gerçekte hangi cin-siyete sahip olduklarını belirlemek için ta-şıdıkları kromozomları görmek amacıyla da huembriyolar King (2S)'jn hildirdiği şekilde 4-0saat süreyle FCS ile desteklcnmh Ham'" F- ı()mcdyumu içinde 37"C'de kUlliire edildiler. Bukülliir i~lcminin son 2 saati içinde kiilıiır or-tamına O,OS mg/ml demecoleine (Sigma) ilaveedildi. KüILUr sonrasında emhriyolar U,c)S !vlKCl içinde i0- iS dakika hekletildilcr ve hunutakiben methanol: asetik asit O: 1) karışımı ilctespit edildiler. Son olarak tespit edilen hu emh-riyolar %4 giemsa ile boyandı ve immersiyoııobjektini mikroskopta kromozomları hel İrlcndi.

M.FJNDIK

T,ıhlü i. T,ıv~anlarda PMSG + hCG uygulamasıııdan sonra ovaryumJardaki fonksiyonel yapıleır veutenıs yıkantısıııdaki oosıt ve embriyo sayıları.

Table i. Funetional stnıctmes on ovaries and ooeytcs and embryo eounts in the uterineflush following the PMSG + hCG applicaııon

i Opcr'L'V"n 'aaI i

96.saat (n=20) 12ll. ,aat (n=2ll) Topl;ım (n=40)

Onalama :t Std. Sapma (n) Ortalama:t Std. Sapıııa (n) Ortalaıııa:t Std. S;lpl1la (n)

i Corpus IUlculıı ,;ıyısı IS,4S:t 4.7" (3ll9) 13.0:t 5.13" (260) 14.22:t S.O (5(,'))

Heıııoraıık follıktıl s;ıyısı 10.15 :t 3,4h (203) Ill.7:t 3.4h (214) IOA2:t 3.4 (417)

I';ıılanı;l\nı~ follikııl .,ayısı lS.2:t 3.3" (304) IS.6 :t 9,6' (372) 16.9:t 7.31(76)

Tnplanan eıııbrıyo ,ayı,ı 8.1 :t 4.Sd (162) 6.6 :t 4,4d (132) 7.35:t 4.6 12')4)

Toplandn oo'ıı saYL'1 J .35 :t 1.3" (27) I.7S:t I.sc (35) 1.55 :t lA (62)

Elele edılıne oranı ('l) 61.17 64.23 62.57

I\vlll "11]](1<1 aynı harflerle göstcrilen değerler arasındaki fark öneııısizdir (p>ll.OS).

Elde edilen sonuçlar SPSS bilgisayar prog-ramı kullanılarak değerlendirildi.

Bulgular

Ta\~anlarda yapılan laparatomide ovar-yumlarda sayılan corpus luteum ve follikül gibiyapılar ile embrİyo elde edilme oranları tabloI'de sunulmuştur. Tüm tavşanlarda ortalama14,22:t5.0 adet corpus luteum, 1O,42:t3,4 adethemorajik folliktil ve i6,9:t 7,3 adet patlamamışfolliktil sayılmıştır. Çiftleşmeyi izleyen 96. ve

120. saatlerde yapılan gözlemlerde ovar-yumlardaki corpus luteum, hemorajik follikülve patlamanıı~ folliktil sayıları karşılaştırılmışve aralarında önemli hir fark bulunmadığı be-lirlenmiştir (P>0,05).

Çiftle~mcyi takip eden 96. saatte yapılanllushing sonucunda embriyo ve oosit elde edil-me oranı '/('6 ı, ı7 (ıH9/309) ol urken, bu oranı20. saatle yapılan l1ushingde %64,23 (167/2(0) olarak helirlenmiştir. Bu çalışmada kul-lanılan 4() tavşandan 34'tinde flushing sonucucmhriyn ve oosit elde edilebilmiş vc toplamelde edilme oranı i/v62,57 (356/569) olmuştur.Çiftleşme sonrası 96. ve 120. saatte elde edilenemhriyo ve oosit sayıları karşılaştırılmış ve ara-larında imenıli hir fark hulunmadığı be-lirlenmiştir (P>O,O:,)).

Çalışmada elde edilen embriyoların mor-folojik değerlendirme sonuçları tahlo 2'de sll-mdmuştur. Çiftleşme sonrası 96. saatle yapılanIlushing işleminde toplam 162 emhrİyo eldeedilmiş, hunlardan 44'ünün erken hlastosİst,46'slnın blastosist, 37'sinin gelişen hlastosist,ı:rünün genişlemiş hlastosist ve 22'sİnin de-jenere emhriyo olduğu belirlenmi~tir Çifı-leşmeyi izleyen ı20. saatte yapılan llushing İ~-leminde ise 6'sl erken blastosist, lX'i hlastosist,39'u gelişen blastosist, 22'sİ geni~lemış hlas-tosİst ve 37'si dejenere olmak üzere toplam 132embriyo elde edilmi~tir. Çiftleşme sonrası <.]6.

ve ı20. saatte elde edilen erkek ve dişi cıııbriyosayıları arasındaki fark önemli bulunmuştur(p<O,OOi). Doksanaltıncı ve 120. saatlerde eldeedilen erken blastosist, genişleyen hlaQosİst vegelişmi~ blastosist aşamasındaki eıııhriyo sa-yıları arasındaki fark önemli (sırasıyla p<O.()() I.p<0,05 ve p<O,O i) bulunurken. blastnsist aşa-masındaki embriyo sayıları arasındaki fark iseönemsiz (p>O,05) bulunmuştur.

Elde edilen emhriyoların morfolojik de-ğerlendirme sonuçları ilc enıim aktivitesi skor-ları ve kromozom analiıi değerlcrinin kar-~ı1aştırıml sonuçları tablo Jde sunulımıştur.Erken hlastosisı evresindeki enıbriyoların tümügelişme aşamaları na giire dişi olarak hc-Iirlenirken G6PD aktİvİtesi sonuçlarına göre

TAVŞAN EMBRIYOLi\RININ GELIŞME HızLARıNı VE X KROMOl-OMUN;\ BAGLI ENZIM ..

Tablo 2. LJtcnls yıkaması sonucu elde edilen eınbriyolann morfolojik değerlendinne sonuçları'Tahlc 2. Morphologiea! exaıninaıion rcsulıs of eınbryos thaı obtained af ter uıerine Ilushmg.

TES Gcli~me Eınbriyo Erkek embriyo Di~ı emhrıyo%

evresi sayısı Sayısı (0;,,) Sayısı (%)

FR 44" 31,43 o' O 44Y 100

96 saat IJ 46g 32.86 17' 36.95 29' 63.05(ıı=17)

140XIJ 37" 26.43 36x 97.3 i Y 2.7

GR 13c 9.28 13' 100 ()J O

i:R 6h 6.32 o' O 6' 100i

120. saat IJ 28g 29.47 2x 7.14 26' 92.86

(ıı=17)95

39JXIJ 41.0S 32x 82.ll5 7Y iF))

GR 22' 23.16 22' 100 lll' II

Toplaııı (11=34) 23S 235 122 113

Emhrıyo sayısı sütununda farklı harflerle gösterilen değerler arasındaki fark ünemli (a:b=p<ll.llll I. cd=p<ll.llS ycef=p<ll.ll i) bulunurken ayııı harfle gösterilen değerıcı' arasıııdaki fark ünemsiz (g:g=p>ll.05).Aynı s~Hırd,1 farklı harflerle (x:y) gösterilen değerler arasındaki fark önemlidir (p<O.Olll).

TES: Toplam eıııbriyo sayısı (deJenere eınbriyolar hariç). EB: Erken blastosist. B: Bla.sıosisl, XB: Geli~en blasıosısı. GB' Ge-

ııışleıııi~ hlasıosısı.

htmların rj,,60'lnın di~i olduğu saptandı. Ge-lişme aşamasına göre belirlenen oran ile enzimaktivitesi ilc helirlenen oran arasındaki farkönemli hulundu (p<O,OOI). Bu emhriyolardan'1r53.85'inin dhi olduğu kromozam analizi iledoğrulandı. Enzim aktivitesi ilc helirlenen oranile kmmozom analizi ile elde edilen oran ara-,ındaki fark ise önemsiz bulundu (p>O,OS).

Blastosist evresindeki emhriyoların ge-lişme aşamalarına göre %74,32'si dişi veck'2:'i,68'i erkek olarak belirlendi. G6PD ak-tivitesi sonuçlarına göre ise hu embriyoların'It :'i4,O)'i dişi ve 'Y<45,9S'i erkek olarak ayrıldı.Bu oranlar arasındaki fark önemli bulundu(p<O.O I). Blastosist evresindeki embriyolar içinenzim aktivitesi ile helirlenen oran ile kro-mozom analizi ile elde edilen oran arasındakifark ise linemsiz hulundu (p>0,05).

Geli~en blastosist evresindeki embriyolarıngelişme aşamalarına göre % iO,53'ü dişi ve

%89,47'si erkek olarak helirlendi. G6P!) ak-tivitesi sonuçlarına göre ise hu embriyoların'k46.05'i dişi ve %S3.9S'i erkek olarak ayrıldı.Bu oranlar arasındaki fark önemli hulundu(p<O,ooı). Bu evredeki emhriyolar için enıimaktivitesi ile belirlenen oran ile kromoıom ana-Iiıi ile elde edilen oran arasındaki fark iseönemsiz bulundu (p>0,05).

Genişlemiş blastosist evresindeki eınh-riyoların tümü gelişme aşamalarına göre erkekolarak helirlendi. G6PD aktivitesi sonuçlarınagöre ise bu embriyoların %40'1 dişi ve %60'ıerkek olarak ayrıldı. Bu oranlar arasındaki farkönemli bulundu (p<O,OOI). Geni~lcmiş blas-tosİst evresindeki embriyolarda enzim aktivİtesiilc helirlenen oran ile kromozom analizi ilc eldeedilen oran arasındaki fark önemsiz hulundu(p>O,05).

Bu çalışmada elde edilen embriyoların(n=235) gelişme aşamalarına göre i 13 adeti(%48,09) dişi ve 122 adeti ('1<'::; i,9 i) erkek ola-

IIH)\ııYINDIK

Tıhlı) 3. Eınbııyoların morfolojik değerlendirme sonuçlarının. glikoz-6-fosfaı dehıclıo.lenaz enzımı ,ıkli"iıesı skorLıı. Vı:

kram()zoın analııi sonuçları ilc kar~ı1a~ıırılması.T,ıhk :ı. ('O[npdnSOn of morphulugıea! cXdmination results wıth gluc()sc.6-phosph'lle c1ehydrogenase cnıynıe deliı ııy ',cuıes

,ınci ehromosume analysıs resıılts of embryos.

G6PD aktivitesi Kramozom Analııı

GL'lı~lnc Cl'ıcsi_._-

Doğrıılıık Kıılıanılan Cinsiyeti be-Emhıiyonık cınsıye!

LS: embnyu Siıyısı) Skala ES-----

oranı ES lirlenen ES (Ok) Eıkek (%) Dı~ı (Si i

EH li-o-ıj D (iO) 0-1-2 30 °k6014 8 (57.14) 3 (37.5) i i(ı2.i)

3-4i 20 12 5 (41.67) 3 ((,O) 2(40) _.-

0- ı -2 7 4 2 (50) i (SO) 1(50) __E (IL)) 'Yr63.16

34-5 12 6 4 (66.67) 3 (75) i (25)13 (74) --

O-I -2 33 18 13 (72.22) 6 (46.15) 7(5Us..~D (55) %60

3-4-S 22 17 L)(52.94) 5 (55.56) 4144.44)-_ .. .-

O-I -2 30 23 15 (65.22) 6 (40) i) (60)E (68) 'Y,,55.88

i 3-4-5 38 25 17 (68) ı0(58.82) 7141.1:-;)XB (76)

---'------O-I -2 5 2 2 ( 1(0) i (SO) i iSO)

D (8) "i(62.5 .--

345 3 3 J (33.33) i (i (0) Oill)

O-I 2 14 ii 7 (63.64) 4 (57.14) 3 (.C.86) __(iB (35) E ns) o,i{,O

345 21 12 9 (75) 51.SS.S6) , 4144.44 )--

Tupldlll i D (lll) O-I -2 68 °k60.18 66 38 (S7.58) 19 (50) i i) iSO i

(235) i E (122) 3-4-S 71 '1('S8.2 81 54 (66.67) 2L) (53.7) 25 (46.:;).. --

D D[~ı. E Eıkck. EB: Erken blastosİst. B: Hlasıosisı. XB: Gcli~en blastosist. GB: Geni~leınl~ bl,ısiosısı

rak helirlendi. G6PD aktivitesi sonuçlarına göredi1i olarak ayrı lan emhriyolardan 0/1,,60,iR'inin(n=6H) di1i. erkek olarak ayrılan embriyolardanise lYi5H.2\inin (n=7 i) erkek olduğu belirlendi.Bu oranlar arasındaki fark önemli bulunmadı([1>0.05). Bu embriyoların 92 adetinde kro-mü mm analizi ilc cinsiyet belirlenebiIdi (44di~i. %47.R3 ve 48 erkek (fr;52.17). Enzim ak-ıivitesi ile belirlenen oran ile kromozom analiziilc e1dc edilen oran arasındaki fark önemsiz bu-lundu (p>O.05)

Geli1me aşamasına göre erkek olarak ay-rılan 122 embriyodan Hi tanesi (%66,39) kro-mOlOm analizi için kullanıldı ve hunlardan54'iindc (1;;'66.67) cinsiyet helirlendi. Gelişmei1~amasına göre erkek oldukları belirlenen bu 54cmhriymbn 29'unun (';;53,7) erkek olduğu km-moznın analizi ile doğrulandı. Gelişme a~a-masına göre dhi olarak ayrılan i 13 embriyodan66 tanesi (I;; 58,41) kromnzom analizi için kul-lanıldı ve hunlardan 38'inde (Ok57,58) cinsiyethclirlendi. Gelişme a~amasına göre dişi 01-

duklan helirlenen bu 38 emhriyodan ı9'unun(0/150) di~i olduğu kromozom analiıi ile doğ-nılandı.

Bu çalışmada elde edilen 235 emhriyonunglikoz-6-fosfat dehidrojenaz enzimi akıi'./iıesisonuçlarına göre i i <)'unun (%50,64) di~i vei i 6'slnın (%49,36) erkek olduğu helirlendi.Enzim aktivitesine güre di1i oldukları be-lirlenen 119 embriyodan 72'si (llr6(),)) kro-mozom analizi için kullanıldı ve 47 cmh-riyonun (%65.28) cinsiyeti belirlendi. Bu 47embıiyodan 26'slnın (%55,32) dişi olduğu doğ-nılandı. Enzim aktivitesine göre erkek olduklarıbelirlenen 116 emhriyodan 7S'i (0/(,64.66) km-mozom analizi için kullanıldı ve 45 cınh-riyonun (%60) cinsiyeti helirlendi. Bu 45 cmh-riyodan 2Tsinin (%60) erkek olduğu doğrulandı(Tahlo 4).

Elde edilen 235 embriyodan 14Tsi(£'k62,55) kromozom analizi için kullanıldı.Bunların n'sinde (%62.59) embriyoııik cimiyet

T.-\VŞAN L\18RIYOLARIl\'IN GELlŞ\1E HIZI.ARI!'JI VE X KROMOZOMUNA BAGLI ENZl\1 ..

Tablo 4. Eıııbrıyoların glikoz-o-fosfat dehidrojenaz enziıııi aktivitesı skorları ile kmıııozoııı analizısonuçlarının karşılaştırılması.

Table 4. Coıııparısoıı of glucose-(ı-phosphate dehydrogenase enzyıııe activiıy scores wıth chroıııosoıııcanalysıs resııl!s of eıııbryos.

ıoı

i(;(jPD aktivitesi Kroıııozoııı Analizı

--..-

Skala ES %)Kullanılan Cinsiyeti belirlenen Emhriyoııik cinsiyeı Dogrıılıık

i ES(%) ES(%) Erkek Dişi oranı

i Tophıııı ()- i -2 11915().64)" 72 (6().5) 47(65.27) 21 26 '/'.55.32"i (n5) .._--

L ;34-5 116 (49.36)h 75 (64.66) 45 «(i()) 27 Iii oj, (j()h

!

Ayııı qtırda ayııı harrıerle (,Gl / h:b) giislerilen değerler arasındakı fark öneımizelır (p>().())). ES Eıııbrıyo'ayı"

helirlcnehildi. Bu embriyoların 48'inin erkek('i; 52. i7) ve 44'linlin (o/tı47.83) dişi olduğu be-lirlendi. Enzim aktivasyonu ve kromozom ana-lizi ilc helirlenen erkek ve dişi embriyo oranlarıarasındaki fark iinemsiz hulundu (p>0.05).

Tartışma ve Sonuç

Bu çalışmada kolay hir şekilde, kısa sliredcve dlişlik maliyetle emhriyonik cinsiyeti sap-tayahilecek hir yöntem araştırılmıştır. Materyalolarak tavşanların seçilme nedeni. embriyo üze-rinde gcn,:ekleştirilecek çalışmalar için en idealhayvanlardan birisi olmasıdır. Tavşan emb-riyosu diğer emhriyolara oranla daha büyüktür(-140 ı..ını) ve 40-47 saat içinde 16 hücre aşa-masına. 75-96 saat içinde de blastosit evresineulaşmaktadır. Dördüncü güne kadar uterusainen tavşan emhriyoları 7-8. günlerde implanteolmaktadır cı I). Tavşanların seksücl sikluslarıdeğhkendir ve gebelik süreleri kısadır. Tavşan,kolayca hulunahilcn. hesIcnehilen ve ba-kılabilen hir hayvandır. Bir defada çok sayıdaemhriyo elde edilehilir. Tavşan. bu çalışmalariçin en uygun hayvan türlerinden biridir (4. 20,27. 37) Bu çalışmada kullanılan hiçbir tavşaniildürülmemiştir. Embriyolar cerrahi yöntemletoplanmış ve hütlin tavşanlar operasyon son-rasında iyileşineeye dek barındırılmıştır.

Çi ftleşme sonrası değişik zamanlarda top-lanan emhriyoların gelişme aşamalarının hüyükfarklılıklar gösterdiği ve hu farklılıkların. fer-tilizasyon zamanındaki farklılıklar, gelişmeninduraklaması veya tamamen durması, emb-riyonun hiillinnıe oranı. embriyoların genetikolarak sahip olduğu hüyüme kapasitesi ve cin-

siyetc bağlı büyüme farklılıkları gi bi değişikfaktörler nedeniyle oluşahileceği öne .sü-rlilmektedir (6. 16). Bu çalışmada da çi ftlc~mcsonrası 96. ve i20. saatlerde toplanan cmh-riyoların gelişmc aşamalarının hUyiik fark-lılıklar gösterdiği helirlenmi~tir. 96. saatte 44erken blastosist, 46 hlastosist, 37 gelhen hlas-tosist, 13 genişlemi~ hlastosist ve 22 dejencrccmbriyo elde edilirken, 120. saatte 6 crkcn hlas-tosist, 28 hlastosist. 39 gelişen hlastosist. 22 gc-nişlemi~ blastosİst ve 37 dcjenerc emhriyo eldcedilmiştir.

Gelişme hızına görc emhriyonik cinsiyettanısı gerçekten çok hızlı bir yöntemdir. İn vitmkoşullarda üretilen ya da canlı hayvanlardantoplanan emhriyolar kısa bir sUreçtc geliş mcaşamalarına göre hirhirlerinden ayrılahilmckteve farklı gclişme aşamalarındaki cmhriyolarfarklı alıcılara transfer edilerek cinsiyet .sap-taması yapılmaktadır. Ancak. hu teknikle ya-pılacak cinsiyet tanısının doğrulıık oranı dahadUşüktür. Çünkü emhriyoların değerlendirilme-sinde kişisel deneyime gerek.sininı du-yulmaktadır.

Bu çalışmada, gelişme hızına görc cin-siyeti belirlenen 92 emhriyonun karyotipleri ha-zırlanmış ve hunların 48'inde (%52. ı7) cinsiyetdoğru teşhis edilmiştir. Bu oran. Tsunoda veark. (41)'nın belirlediği ';.(.71 doğruluk oranınınçok altında kalmıştır. ancak ineklerde (I X). do-muzlarda (13) ve tavşanlarda (20) yapılan ça-lışma sonuçları ilc uyumluelur. Bu sonuçlarerkek ve dişi embriyolar arasında geli~me h1l.1baklınından önemli bir fark bulunmadığını giis-termektedir.

1112

Sunulan çalı~mada emhriyoların gelişmehızları ile viabiliteleri arasındaki ilişkiyi be-lirlemek mlimklin olamamıştır. Çlinkü elde edi-len embriyoların gelişme aşamaları be-lirlendikten hemen sonra enzim aktivasyonlarıiil~lilmliştlir Bu ilişkiyi doğru olarak sap-tayahilmek i~in geli~me a~aması belirlenenembriyoları daha uygun hesi yerlerinde kültüreetmek veya alıcı hayvanlara transfer etmek ge-rekmektedir

Erkek embriyoların neden dişilerden dahahızlı gel iştiği tam olarak anlaşılamamıştır (19,41). Bununla birlikte, gcli~me hızındaki hufarklılığın en erken tohumlamayı izleyen 3.glinde göriilmesi, hunun emhriyonun ilk ge-nomik ekspresyonu ile ilgili olduğunu dü-şündürmektedir (5, 6, 7, 8). Erken embriyonikgelişimin uldukça kompleks bir i~lem olduğuve in viım üretilmiş emhriyolarda gelişme hı-I.ının. innrganik iyonlar, buflcr'lar, gaz kom-pozisyunu, aminoasitler, büyüme faktörleri, vi-l<ıminlcr ve makromoleküııer gihi hirbirindenfarklı pek çok faktör tarafından etkilenehilcceğikahul edilmektedir (12, 19).

Bu çalışmada emhriyoların glukoz-6-fosfatdehidmjenaz enıimi aktivitelerini belirlemekamacıyla. Wiııiams (45)'ın tarif ettiği ko-lnrimetrik iilçlim tekniği modelolarak alın-mıştır ve indikatür olarak reaksiyona katılanboya miktarındaki azalma ölçLilmüş ve de-ğerlendirme işleminde skala "O" ilc "5" arasındaıutulmuştur. Çalışmada tuplam olarak 235 emb-riyonun enzim aktivasyonu incelenmiş ve bun-ların (j,,] 7,RTsi "O", % i6,6\1 "I", o/r16, iTsi"2", CIi i7AYi 'T. (/()16,1Tsi "4" ve o/£ıl5,74'iide ")" skala ularak değerlendirilmiştir. "O", "I"ve "2" skaladaki emhriyolar (%50,64) dişi ola-rak. "3". "4" ve "5" skaladaki emhriyolar(ii 4Y.36) ise erkek olarak ayıılmıştır. Bu oranWilliams (45) 'ın (k50 oranı ile uyumludur.

Sunulan çalışmada embriyolar alıcı hay-vanlara lranslcr ı'dilmedikleri için gebelik so-nuçlarına ulaşılamamış ancak, embriyolarınkınmı)ıom analizleri yapılarak yünternin doğ-nıluğu belirlenmeye çalışılmıştır. Enzim ak-ıiVcısYlll1una giire dişi ularak belirlenen 47 emb-riymbn 26\ının (Iı,55,32) ve erkek olarakbelirlenen 4.'1 embriyodan 2Tsinin (%60) cin-

,\1 Fli\DIK

siyetinin doğru teşhis edildiği ve yöntemin top-lam doğruluk oranının %57,6 i olduğu be-lirlenmiştir. Bu oranları Williams (45) dişilerde%72, erkeklerde %57 ve toplamda (;U14 ıılarakbildirmektedir. G6PD aktivitesi ile belirlenenerkek ve dişi embriyo oranları ile kmmozomanalizi ilc elde edilen oranlar arasında iinemlidüzeyde fark belirlenememiştir (p>(),()5).

HPRT ve APRT (adenin phosphorıhosyltransferase) aktivitelerini belirleyen ve bunlararasındaki oranı cinsiyet tanısı için kull<ınarakemhriyolar arasındaki hücresel aktivasyun lark-Iılıklarını da hesaha katan Monk ve Handyside(35) ise dişi embriyolarda (7,91. erkek cmb-riyolarda ise %100 doğrulukla cinsiyeti teşhisedebilmişlerdir. Elde edilen sonuçlar vc Wil-liams (45)'ın bulguları bu sonuçlar ilc kar-şılaştırıldığında, daha yüksek doğruluk oranlarıelde edehilmek için her embriyonun toplamenzim aktivasyonunun belirlenmesi gerekıiğıgörülmektedir.

Bu çalışmada hücresel analizler diğer ıkiyöntemin sonuçlarını doğrulamak amacıyla kul-lanıldı. Kromozom analizi yapılan toplam 147cmbriyonun 92'sinde (%62,59) cmbriyonik cin-siyet helirlenchildi. Bu oran araştırıcıların (21.25) hildirdikleri sonuçlar ile uyumludur ancak,bu oranın düşük olmasında enzim akıivasyunuiçin kullanılan hesi yerinin emhriyo ü/(:rindeyaptığı olumsuz etkinin rolü olahileeeği dü-şünülmektedir. Hücresel analiz sonucunda cmb-riyoların %52, lTsinin erkek ve (j,,47Jn'iinündişi olduğu ve erkek:dişi oranının i.()l): i utduğubelirlendi.

Çalışma sonucunda. G6PD en/iıııı ak-tivasyonunu belirleyerek yapılan cinsiyeı la-nısındaki doğruluk oranlarının, gelişmc hı/ınabakarak yapılan cinsiyet tanısındakindcn dahayüksek olduğu görülmüştür.

Kaynaklar

Alaçam, E.. Tekeli, '1'., Güven, B., Dinç. IL\.,Özsar. S., GliIer. '\1. (i '.ll) i). "wk/e,,/,' (ıil,,/ .1/-

ı.t/"rel"hi lesluslerıın hıınllll/1l1 eI"~n/ellıl/l! "m,.'-/I'l/117"1ן1 tle cıl/sn el "'"hiıı I-Lıy i\rd~ Deı,;. ı il)-: ı

2. Anderson, Co.B. (i '.l~7). Idenlı/iCl/ııl1n u! ı'Iıi/JlTUlllı

sex by "efr:,uitlll til H- Y (1ııIi,ı:elıs. Tlıcrwgcf)ul,lgy 27R ~-<)7

TAVŞ/\'\I ı::MBI~IYOL\RINI'\I (iELl~ME HızLARıNı VE X KROvıOZOMl~NABACiu ENZIM.. i (i~

.'. Anderson. (;.B. (J 9<)I). Fl'rıili7(1/iml. mr/\, de-

:'eIIlIJllıelıl ılııtI el11hr\,1ı IrWlSIN 279-313. In: Rep-

mduclJun ın Duıııc'iic /\niıııals, Ed.: Cupps. P.T .. 41h

Edılıun. ACddcınıl' Prcs-s. San Diegu.4. Aral, S. (i '.)<)3). I'MSe iiI' SÜIJNOl'lIll' I'dill'lI 1(/1'.

5(/IIIi/rdi/ hCe 1'1' GııRIl'1ı1 ovul((syoıı 11/"(//11 lll' I'lIlhriw)

/-i/II/I'SI lItenlıl' eıkisl. Doktora Tezi. l.sıanhul eııı-ver-sıle-sıSdg!ık Bilimleri Enstitüsil.

5. Avery, B., Bak, A., Sehmidl, \1. (198'.»). Dijl'Nelıli((1

cll'IIl'(/ge mles ((ııd sex detemıiıııııioıı iıı Iım'llıl' 1'1Il1ı-

rms. Therıngenology. 32: 139147.

(ı Avery. B.• .lorgensen, CB., \1adison, V., Greve, T.f 1<)92).H(}/pholııgıwl dl'vI'Iofll71e1l1 ııııd sn o/ bOl'ilıl'

LLL vtlm./I'rtihz.ed I'mhnııs. Mo! Reprod Dev, 32: 265-27ll.

7. Avery. B.. \1adison, V.• Greve, T. (1991). Sex (/ııd

devl'lııl'I11('IIII11 hm'ıııe iii. l'l/rlı/i,rtiliz.ed emlJrl'os. The-rıogenology. 35 953-%3.

~. Avery, B.. Sehmidl. M .. Greve, T. (1989) Sn de-ı,'mlllli/ıiıııı 0/ IıOl'iılf' eıııhrros hi/sl'd iili eI!'i/Iı(/g!'

mın Acl,ı Veı SeııııL. 3LL: 147-153.

'J Basrur. B.K.. Bongsn, A.T. ( 1981l). Aıııııiocl'lıll'Sls/iJrIm'Il,II"1 dl'leelıolı 11/ Sl'X i/ııd crlogellf'llc de/n:ıs iıı

Ci/Ille 1185-1189. In: Curreııı Therapy in The-rıngenology. Ed. \1ormw. 0 ..1'1" W.B. Saııııders Com-p,m)'. I'hilddelphl~1.

i II Belteridge, K ..I. ( j '.)84) The /olklıır!' ot sniııg. The-rıogcııolugy. 21 3-(ı.

i i Belteridge. K ..I.• Hare, W.CD, Singh, E.L. (1981).

Aflflmilthe' iıı sn seleelıoıı ilı /iınn ilııimills. ! ll9-125.

In: New Technolo[.:ies in Aniıııal Breeding, Eds: B.G.Araekeıı. Cl.E. ScıdeL. S.M. Seidel. Al'ddemıl' Press.New York.

12. Carvalho. R.V., Del Campo, \1.R., Palasz, A.T ..Plantc. Y.. Maplcloft. R..I. (J '.)<)6). Surııiliiii /'iIles wıd

l'I'.ı mılıı lll Iım'iııe IVF I'ıııhn()sli'o~eıı iiI di/Yereııı de-

\TI(}I'lııelll"I"Ii/,~eS (}ii dur 7. Thertugcnology, 45: 489.4')~

i~. Cassar'. (; .. Dc La Fııenle, R., Yu, Z .. King, G ..T.,King, \V.A. (1'1'15). Sn ,,/ırı!1110solııt' cıııııplemeııı ııııd

dt'l'el(}pııı('ııwl diveniıy iii pre- ilııd posı-hulchiııg por-

ciııe ı'mlın(}s Ttıeriogenology. 44: 879-884.

14. Cılt, S.L., O'Bricn, .I.K .. Maxwell. W.M.C., Evans,(;. ( 1<)'.)7). n1nls o/I'II/(' 0/ dl'l'eloIJmelll (}r iıı I'ilm.

I'JDdull'" (}1'OIe eıııhr."os iili SI'.1' ruıio ilııd iıı l'ilıO sur-

\'J""i "lıer f'/lıhnD ImllSl"r Thel'ıogcnoiogy. 48: ı369-1~7R

15 Danicll . .1.1'. (! '183). Se.r.sell:'uioıı pmCl'durn. J Rep-IlllI Mcd. 28. 235-237.

16 Gates. A.H. ( 10(5). Rule ot o\'lllilr del'elojJmelıl as ii

liiCi(}1 LLL ('mlın'lJlıic IWTil'iI/. 27ll-288. In: Pre-

InıpLuııdlJun Sld[.:es or Prt'gnanl'Y. Ed: Wols(cnhoime,G.EW .. W B. S,ıunders Cu" London.

17. Gorelon, i. (i '.)<)4). L(Jhorl/l(}I'I' Produııııııı 11/ Ci/Illı'Emhn'o5. 399--t 13. CAB InternationaL. Londoı\

18. Grisart, B., Massip, A., eollete, L.. Dessy. F. ( 1<)<)5)Th!' sex rıılio or hoııiııl' I'mhr\,os l,rodUlı'd iii 1'/11'11 iii

s/"rum-li'!'!' Ol'idııel eell-cııııdiıilJlınl medııııı/ 1.1 ii(}i "i.

lere£! Therıogcnology. 43 i ()'.)7 -I 1116.

19. Gutierrez, A.. Behhoodi. E .. Medrano • .1.1'.• \1ur-ray, ,LO. ( 1996). Relilııoııshıps IJI'{\-l'el'lI .ı/(l~e uııd dı"

l'elolJIIWIII "ııd .Wl' or hOl'ilı1' IVM/IVF ,'mlırms iili'

lur"d iii I'ilro ı'!'/'Sus iii ıhe shl'l'p !!I'ıdu,,/.

Theriogenology. 46: 515525.

2ll. Harez, LS.E. (1962). Difl"relllwl eleil\'(/ge mIl' iii 2.dııy Iiller ııwle I'IIhhil emhrms. Pmc Sol' Exp Bıol.HO: 142- ı45.

21. Hare, W.C.D .• Mitchell. D.. Betleridge. K ..I.• Eag-lesome, M.D., Randeli. G.C.B. (197(ı) Sn/lig 2.

week-old hl)J'iııe eıııhrr(}s hı, chl'lJllwsoııwl (///(//\'IIS

ı,rior lo suri'icul Il'IIııs/er: Prl'ltmillillT 111e/I/ııds oııd

rl:'suIıs. Theriogenology. 5: 243.253.

22 . .Tarar, S.I., Flint. A.P.F. ( 19l)(ı). Sn sel('cll(}lıl1/ lIIi1m-

/J1i1ls.'A review. Theriogcnology. 46: !'.)1-2Il1)

23. Johnson, L.A. (19'.)5).Sn lırl'Sl'leclilJll In' .il-,.n/ııן11meiri" S!'I"II'lIIiIJlI ot Xiiııd Y chromol(}lIl(' Iı('uriııg

spI'I'm hilsed iili DNA dWI'I'I'llı:e' A rnlt'II. Rl'prodFertil Dev. 7 893-903.

24. Kamimura. S., "iishiyama. 1\.• Ookutsu. S., (;010.

K., Hamana, K. (ı '.)<)7). Delermillilıioıı Iıth(}liııell'/ill

sex hı' PCR usiııl.: 11'1(/1 /lu id ilslJil'll/ed Iıl Il'IIıısı'u,~III"1

ulıra.I(}Ll/1d-guided wnııioc!'lılesis. Therıugenolugy. 471563 156<).

25. King. W.A. (1')84). Sniııg emhrms ı". c\I(}log"ul

meıh(}ds. Theriogenology. 21: 7-17.

26. King, W.A., Yadav, B.R. Xu, K.P .. PicarCı, L.. Si-rard. M-A, Verini Supplizi A .. Helteridge. K ..I.(ı991). The .11'.1' mlios ot h(}I'iııe elıılın'(}.I' 1,,(}duLI'I1 {ii

I'il'o w/(i iıı I'ilm. Theriogcnol[Jgy, 36: 77'J-/X';',

27. Kılıçoğlu, ç.. Tekeli, T. ( 1'.)81). l'/I',wllli/rdu mılmı'(}

Il'llııs/eri. Ankara Üniv Ve( Fak Derg. 28 2~.~5.28. Lazzari, G., Landriscina, R., Duehi. R.. (;alli. C

(1995). Sn shifi iıı cillı.'es deril'l'd/mm IVM.IVI-' 1'1ıı1ı.

rl'os culıured iii i/li' sheeı' olıidlıCI \'('r.ı/ls Ci/hı" .(I'lן1

duced hı, C(}III'I'III/IJIIUI sul)('r(}I'Ulilliolı uııd ('mlınD

Il'llııs!"r. Theriogenology. 43 263.

29. Leiho, S.P .• Rall, W.F. (IIJ9ll). frelı(ll,,1 "/(J.~Iı{1\i.1 11/

sex lll hm'iııe li'ıuses hı, (i/l111 iııceıı le LLS. The-

riogeııology, 32: 531-551.

3ll. MeEvoy, .I.D. (1992). AllemıiOlI ııııhe sn r"l/o Anı-nıal Breeding Ahs(rae(s. 60: 97 -II i.

31. MeLaren, A. (1972). ltıe Emhl'w i 42. III Rep-roduction iıı Maıııınai.". Auuk 2 Enıhryoıııc "ii(i Fel,,1

Dcvc!opmclll. hı'. Aus(lll. CR" Shurl. R.V. i ,i cd:.(ion, Camhrıdgc University Prc"s. Cınılmd!-,c

1114

T2 Miller~ .i.R. (I 091). l::nıhryn s~xinj.;. A hrood SUr\'t'Y.

Reprol! Duııı Aıııııı. 2(): 54-57.

.'-'. Millcr . .I.R. (199 i). Isolurum ot Y-chmmosome sıw-

<:ı/ıc I('lll.I('II(I'I. uııd r/1t'lr USeiii emhryo sexiilI'. Rcprod

Doııı ..\111111. 26 5X-Cı5.:ı-ı Millcr. (;.F., Glicdt, D.W .• Rakes • .1.1'1.,Rovi, R.W.

( 19'J-l), Addıı({)ıı ot l)eııu:il/ul17ilıl'. hvpo((luriııe uııd

l'pın"/,i7l11l" !PUt:) or /ıoviııe ovidUc.1all'pirheliul Cl'l/s

(!Jore) ((10111'or comh(lwnoıı ro /ıov(lıt' (ıi ı'irm .ticr-

ııliz((rUJII /11/'<1ill/l1(lıı:rl'({SI'S ro su/,seqlıellT emhryıı ci,,-

((ı,((gl' mre Therıogcııology. 41: 6X'J-696.:ıs :Vlonk. M., Handyside, H. (1'J88). Spxiııg ot ı,rp-

Implwll((nOIl IIl11l1St'pnıhrros hr nıeaSlırell1t'lır ot X-iınked ,~t'II(, doı((g" iıı u sıııgle hlasromere. J Reprol!

FertıL. 82 :ıü5-36836 Monk, \1., Harpcr, MJ. (1978). X chmmosoll1e uc-

nl'lIs iii pr"ınıpiwırmioıı enıhrros li.ml1 XX aııd XOmıı/hers. J Lllıbryul Exr Morrh. 46 53-64.

37. Pahuççuoğlu. S. (10'J i). 7ilı'şun emhrtrolartlllll ku-

:((IııII11U.l1H' külrüre elillm,,/,'rinlieıı sonra IrWl.l/f.-rlt'ri

ı"enııdl' um,ırırnıalur Doktora TezI. Istaııhul Üni-

ıersııesı S<tğlık Hilıınıeri Enstıliısil.

:ıX. Pcippo . .I.. Bredhaeka, P. (1095). S<'X-relurl:'d Rmwrh

rale dıllereııces iıı /lliilisi:' preimplaTlıarioTl emhr\'os iıı

vim uııli iii ı.llm. Mol Reprod Dcv. 40: 56-61.30. Rotlmann. 0 ..1.. Lampeter, W.W. (19R i). DI:'-

I."/O/JIIWIII o/ eur/\. IIl11l1SI:'anli ruhhiı enıhrros wirhoıır

:iiiiu /Jd/u<:ıd(( .i Reprot! FertiL. 61: 303-306.-ıo. Thihier. M .. Nihart, \1. (1995). Thl:' .Wtfııg ot hoviııl:'

emhnııı ın IhelıeM Therıogenology. 43: 71-80.

-ll. Tsunoda. Y., Tokunaga, T., Sugie, T. (1985). Alraed

Wf mn" "jleuve yoU/ıg alrn ııwısln oUiısr wıd slow

deve/"/Jln,~ molıli:' I:'mhryos. Gaıncte Rcs. 12: 301-304.-l2. Van Soon. A.• Van Vlaenderen, 1., '\1ahmoudzadeh,

A.R .. Deluyher. H., Dekruif. A. (1992). COl17puCriml

roı" "j iii ,.ıım .fnıili~eli hm'ıne emhrws rplıııed lo rhe

M FINDIK

iıırervııl .froll1 iıısemiıııırioıı ro linı ı:/ı'ıımgı. Thc-

riogcnology. 38: 905-920

43. Van Viict, R.A .• Verrindcr Gihhins. A.M .. Wa1tlln..I.S. (1989). !,il'PSlod enıhrw sning: A r",,,ın ot Ll/i-

rl:'ıır II1dhods. wiıh ell1/,/wsıS 011 Y-s/'nt/ic f)NA pro.

bl:'s. Theriogenology. 32: 421-438.

44. Vanderhoom, R.J., MeCauley, T.C., Tappan, R.•Ax, R.L. (1097). Roviılt' lepmliUCril'e hiornlın%gr

457-473. In: Current Thcrapy in Lırgc 1\lllln;ı1 The

riogcııology. I" ediıion. Ed: Y,)ungquısl. R5.. W.B

Saunders Comrany. Philadelphı;\.

45. Williams, T ..J. (1086). A reclıllllfue .foı ıcwıg Illoul,'emhryos hr a visulıl colorimeıric U.ISUl. oııhe X-Iıııked

1:'117.1'1111:"ı:lucose-(j-phospu/wıe delırdmg/'1/(lw. The-

riogcnology. 25: 7)3-739.46. Windsor, DJ'., Evans, G., White, LG. (1993 l. Se.\

prl:'deıerıııiııulioıı hı' sepurarioıı oj X aııri Y ,lım-lIlosomt'-hpuritıg spenn: A revıew Rern)(! Ferlll De\'.

5 155-17147. Xu, K.P .• Yadav. B.R., King, W.A, Betteridge. KJ.

(1'J92). Se.\-reluIl:'d dlltNelıCt's III del'elo/'lJ1enıırl mIn

o(hoviııe t'lIlbrws pmduced 1111£1clIlıııred iıı nliD \'101

Rerrod Dev. 31: 249-252.

48. Yadav, B.R., King, W.A., Betleridge, K..I. (10')3)Relıırioııship herwl:'l:'lI rlıe complerwıı ol 111-.11cI,'umge

uııd rili' clıroıııos(lll1111 compluneııı. 'e.f. und de-

l'eloı)nıl:'1I1 nill:'s oll){}I.lIle emhrnl.l gel/enıınl in ,'IIU,

Mol Reprod Dcv. 36: 434-439

Yazışma Adresi:Dr. Murar FI/ıdıkAııkuru Olıil'I:'Tsiresi Verl:'rinN Faküllesi

DO,i(ulI1VP.Iiııekol,,;i AIlII/Jllim Dıılt

OM LO - AnkaraITürki\'<'

Tel +90(312)31703/5/270Fax. +(,10(312) 3178381

E-muil.- jil/(lik({ı) vereri/li/ITaııkıımedu rr