Neuropharmacology, Vol. 35, No. 9/10, 1425–1444, 1996Copyright 01996 Elsevier Science Ltd. All rights reserved

Printed in Great Britain0028-3908/96 $15.00 + 0.00

P I I :S O 0 2 8 - 3 9 0 8 ( 9 6 ) O O 0 8 6 - X

The y2 Subunit of the GABAAReceptor is Concentrated inSynaptic Junctions Containing the al and f12/3Subunits

in Hippocampus, Cerebellum and Globus Pallidus

p S O M O G Y 11 *F R I T S C H Y , ZD B E N K EJ D B R O B E Ra W S I E G

a

2

~

T h ey 2s u b u n i to ft h eG A B A Ar e c e p t o ri r e q u i r ef o1 9 9G u n t1 9 9T hs uh bn o r m a lc h a n n e lc o n d u c t a n c ea n dt hf o r m a t i oo e s t i m at c o n t r it a l e84Y0 ob e n z o d i a z e p i n es i t e si na n di nv i v( P r i t c h e t( D u g ge a l1 9 9B ee a l1 9M ca

1 9 8 9 ;S i g e lM O S SW a f f o rwhiting,1996),makingitone o t m a bs u b u n iI m m u n o p r e c i ps t us ut t ys u b u nc ab c o - a s s ew it a a a a u

* T ow h o mc o r r e s p o n d e n c es h o u l db ea d d r e s s e dT e l+ 4f i 2~ 3y a nb s u b u( D ua S t e p1( 0 ) 1 8 6 52 7 1 8 9 8 ;F a x :+ 4 4( 0 ) 1 8 6 52 7 1 6 4 8 .B e n1 9 91 9 91 9 91 9D u

1 9 9 1 ;M c K e r n a n1 9 9 1 ;M e r t e n s1 9 9 3P o l l a r d1 9 9 3 ;K h a n1 9 9 4 a ,1 9 9 4 bQ u i r

1 9 9 4 a ,1 9 9 4 b ;f o rr e v i e w s ,s e eM o h l e r1 9 9 5S i e g h a r t ,1 9 9 5 ;S t e p h e n s o n ,1 9 9 5 ) ,b u tt hr e c e p t os t o i c h i o m e t r yi nt h eb r a i nh a sn o tb e e ne s t a b l i s h e dT hs o l u b i l i z e dr e c e p t o r ss t u d i e di ni m m u n o p u r i f i c a t i o ne x p e r i m e n t sm a yb ed e r i v e df r o mr e c e p t o r se x t r a c t ef r o mt h es y n a p t i cj u n c t i o n s ,t h ee x t r a s y n a p t i cp l a s mm e m b r a n eo rf r o mt h ei n t r a c e l l u l a rp o o l .T he x t r as y n a p t i cp o o li ss i g n i f i c a n ta n di nm o s ta r e ao t hc e n t r a ln e r v o u ss y s t e m ,l i g h tm i c r o s c o p i ci m m u n o c y t oc h e m i s t r yh a sr e v e a l e da c o n t i n u o u sd i f f u s ei m m u n oI a b e l l i n go fc e l lb o d i e sa n dp r o c e s s e sf oG A B Ar e c e p t o r s( R i c h a r d s1 9 8 7 ;d eB i a s1 9 8 8H o u s e r1 9 8 8 ;S o m o g y i1 9 8 9 ;S o l t e s1 9 9 0 ;W a l d v o g e l1 9 9 0 ;F r i t s c h y1 9 9 21 9 9 4G a o1 9 9 3 ;G r e f e r a t h1 9 9 3 ;S p r e a f i c1 9 9 3 ;F r i t s c h ya n dM o h l e r ,1 9 9 5 ) .I n d e e d ,i h ab e ec a l c u l a t e dt h a t ,o nc e r e b e l l ag r a n u l ec e l l st he x t r as y n a p t i cp l a s m am e m b r a n er e c e p t o rp o o lm ae x c e et hs y n a p t i cp o o ls e v e r a l - f o l d( N u s s e r1 9 9b )F u r t h e r m o r e ,d i f f e r e n tc e l lt y p e si nt h es a mb r a ia r em a yc o n t a i nd i s t i n c tc o m p l e m e n t so fs u b u n i t s( L a u r i

1 9 9 2 ;P e r s o h n1 9 9 2 ;W i s d e n1 9 9 2G a1 9 9 3 ,1 9 9 5 ;F r i t s c h ya n dM o h l e r ,1 9 9 5 )R e c e n

r e p o r t sa l s os u g g e s tt h a t ,e v e nw i t h i nt h es a mc e l ls o mc h a n n e l s ,c o n t a i n i n gd i f f e r e n ts u b u n i t s ,m ab t a r g e t es e l e c t i v e l yt od i s t i n c ts i t e si nt h ep l a s m am e m b r a n( K o u l e n1 9 9 6 ;N u s s e r1 9 9 6 a ,1 9 9 6 b )a nr e c e p t o r sc a nb ec l u s t e r e do nt h ec e l ls u r f a c e ,e v ei t ha b s e n c eo fG A B A e r g i ci n n e r v a t i o n( C a r u n c h o1 9 9 3 ) .A c c o r d i n g l y ,e s t a b l i s h i n gw h e t h e rc h a n n e li nc o r p o r a t i n gp a r t i c u l a rs u b u n i t sp a r t i c i p a t ei s y n a p t it r a n s m i s s i o no nd e f i n e dd o m a i n so fn e u r o n sr e q u i r et hv i s u a l i z a t i o no fs y n a p t i cj u n c t i o n sa n dt h el o c a l i z a t i oor e c e p t o r sw i t hh i g hr e s o l u t i o n .O n eo ft hm o sd i r e cm e t h o d ss a t i s f y i n gt h e s er e q u i r e m e n t si t ha p p l i c a t i oo fs u b u n i t - s p e c i f i ca n t i b o d i e sa n dp o s t e m b e d d i n gi mm u n o c y t o c h e m i s t r yu s i n gp a r t i c u l a t ei m m u n o m a r k e r ss u c ha sg o l dp a r t i c l e s( B a u d e1 9 9 3 ) .

T h ep r e s e n ts t u d yw a su n d e r t a k e ni o r d etd e t e r m i n et h el o c a t i o no ft h ey 2s u b u n i ti r e l a t i oto t h e ra b u n d a n ts u b u n i t so nt h es u r f a c eo n e u r o ni t hc e n t r a ln e r v o u ss y s t e m .W ew e r ep a r t i c u l a r l yi n t e r e s t ea st ow h e t h e rt h e r ew a sa n ys e l e c t i v i t yi nt ht a r g e t i not h ey 2s u b u n i tt os y n a p s e so np a r t i c u l a rd o m a i no t h

kDa

94–

67–

43– l#lil#i

30–

72P+P

.

,

...

~

,

Subunit-antiserum

a

p l a sm e m b ro c et yt ha k nt r eG A Bf r os e v ed i s ti n pI a d dt u op a r t i c u li m m u n o m aa t p o s tm e t h ot he x p ot s e c tu n it ta n t i b o dp r o v ia o p p o rt c od it y p eo c e la ns y n ai t s aa o t b

3 a

a

a

a

F i g

P S o m o g y

M E T H O D S

I m m u n o h i s t o c h e m i s t r yw a sp e r f o r m e da d e s c r i b eiB o h l h a l t e r( 1 9 9 6 ) .F o u rr a t sw e r ed e e p la n e s th e t i z e dw i t hp e n t o b a r b i t a l( 5 0m g / k g ,i . p . )a np e r f u s ew i t h470 p a r a f o r m a l d e h y d ea n dN0 . 2 9 1 0p i c r ia c iip h o s p h a t eb u f f e r .T h eb r a i nw a sr e m o v e di m m e d i a t e la f t e rt h ep e r f u s i o na n dp o s t f i x e df o r4 h i t hs a mf i x a t i v ea t4 “ C .T h e r e a f t e r ,t h et i s s u ew a sp r o c e s s ew i ta m o d i f i e da n t i g e n - r e t r i e v a lp r o t o c o la i m e da o p t i m i z i nt h es i g n a l - t o - n o i s er a t i oi nt h es u b s e q u e n ti m m u n o h i s t oc h e m i c a ls t a i n i n g .B l o c k so ft i s s u ew e r ep r e i n c u b a t eo v e r n i g h ta tr o o mt e m p e r a t u r ei n0 . 1M s o d i uc i t r a tb u f f e r ,p H4 , 5 ,a n di r r a d i a t e dw i t hm i c r o w a v e s( 9 5 ” C1 2 0s e e )a tf u l lp o w e r( 6 5 0W )i nt h es a m eb u f f e rT ht i s s u ew a st h e ns t o r e df o r3 h ri np h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n e( P B S )c o n t a i n i n g1 0 Y od i m e t h y ls u l f o x i df oc r y o p r o t e c t i o n .F r e e - f l o a t i n gs e c t i o n sc u tf r of r o z eb l o c k sw i t ha s l i d i n gm i c r o t o m ew e r ei n c u b a t e do v e rn i g h tw i t ha f f i n i t y - p u r i f i e ds u b u n i t - s p e c i f i ca n t i b o d i er e c o g n i z i n gt h ey 2 - s u b u n i t( 1 . 2 5 – 2 . 5 p g / m l ,i T r i ss a l i n ec o n t a i n i n g0 . 2 $ 7 0t r i t o nX - 1 O Oa n d2 Yn o r m as e r u m ) .

O n es e r i e so fs e c t i o n sw a sp r o c e s s e df o ra v i d i n – b i o t ii m m u n o p e r o x i d a s es t a i n i n g( V e c t a s t a i nE l i tk i t s )ad e s c r i b e di nt h em a n u f a c t u r e r ’ si n s t r u c t i o n s ,u s i nd i a m i n o b e n z i d i n eh y d r o c h l o r i d ea sc h r o m o g e n .A d d it i o n a ls e c t i o n sw e r ep r o c e s s e df o rs i n g l ea nd o u b li m m u n o f l u o r e s c e n c el a b e l l i n gu s i n gt h ea n t i b o d i e st t hy 2s u b u n i ta n da r a b b i ta n t i - m ls u b u n i ta n t i s e r uic o m b i n a t i o nw i t hs e c o n d a r ya n t i b o d i e sc o u p l e dt D T Aa n dC y 3( F r i t s c h ya n dM o h l e r ,1 9 9 5 ) .

T h ea n t i s e r u mt ot h ey 2s u b u n i tw a sr a i s e di g u i n e ap i g sa n da f f i n i t y - p u r i f i e da sd e s c r i b e di nB e n k( 1 9 9 1 c ,1 9 9 6 ) .B r i e f l y ,a s y n t h e t i cp e p t i d ec o r r e s p o n d i nt ot h eN - t e r m i n a l1 – 2 9a m i n oa c i d so ft h er ay s u b u n iw a ss y n t h e s i z e d ,p u r i f i e da n dc o u p l e dt h r o u gaa d d i t i o n a lC - t e r m i n a lc y s t e i n et ok e y h o l el i m p eh e m oc y a n i nu s i n gn - s u c c i n i m i d y l3 - m a l e i m i d o p r o p r i o n a t eaa c r o s s - l i n k e r .G u i n e a - p i g sw e r ei n j e c t e di n t r a d e r m a l lw i t ht h ea n t i g e ne m u l s i f i e d1 : 1i nF r e u n d ’ sc o m p l e ta d j u v a n t .D u et ot h es h a r e dN - t e r m i n a ld o m a i nt h

a n t i b oi e x p e ct r e c o gb ot s ha tl o ns p l iv a r i ao t hy s u b( K o1 9P o s t e m b e d di m m u n o r e aw ia f f i n ia n t i b o d iw ec a r ro a a f ip rc ot r a t io 1 0 -p g /

A r a b ba n t i s et t ha s u bw p rac h a r a c t e r ia d e s c re a r( B1 91 9 9 1 ca ni w au si t l im i c rs tA r a b bp o l y c l oa n t i s( cN P w r at a s y n t h ep e p tc o r r e s pt r e s1 ot hr aa s u b u nA n t is p e ch bd e s c r i be a r l( Z e z1 9P o s ti m m u n o r e a c t iw ia f f i n i t yP a nw e rc a r r io ua a f i np r oc o n co1 . 4 -p g / m

A n t i b os p e c i f ih ab ed e s cf mc l i na n t i b ob d -( H a r1 9S c1 9 8 5t h ah ab es h ot r ew ib t / af 1s u b u n i( E w e1 9 9T h eti m m u n o r e a c t id e t eb t ha n ti r et a ~ 2 /A n t i b ow ed i lt 1 0p p rm l

A c o m m e r cm o n o ca n t( d i1N o v o c a s tL a bN e w c au pT yU K t gf i b r i l l aa c i dp r o t( G Fw u i c oe x p e r i m e( d an os h o wA p o l ya n( k i n dd o n a tb D rH O h ia R S h iK y o tU n i v e r s ir a ii g u i na r e ct hm e t a b o t r og l u t ar e c et y2 a 3 wu s ei c o n t re x p e r i m( dn s h o

A a f f i n i t y - p u rp o l y ca n tr air a b bt a p e p ts e q uc o r r e st r e1 1 1 7 – 1 1a nr e c o g nt m e t a bg lr e c e p tt y pl ( B a1 9 9w u i c oe x p e r i m e( sF i4 )

M e m b r a nf ra d ur b rw p rad e s c r i bb M e r t( 1 9a s ta –u n t iu s eA l i q uo t hw a sm e m( 2 ,p r o t e i n / l aw es u b j et S D S - p o lge l e c t r o p h o r( P Aa W e sb l oa ds c r i bp r e v i o u( B e1 91 9M ee 1 9 9 3u s it ha n t i bt t y 2 -I m m u n o r e a c t iw ad e t eb t l u m i

F i g .D i g i t a lv i d e oi m a g e sf r o mc o n f o c a ls c a n n i n gl a s em i c r o s c oi l l u s t r a tt hc e l l ud i s t r io i m m u nft h ey 2s u b u n i ti nt h ed e n t a t eg y r u s( A ) ,c e r e b e l l u m( Ba ng l o bp a l l i d[ (a n( D )I t hi m as ifi m m u n o f l u o r e s c e n c ea p p e a rw h i t e .( A )I m m u n o l a b e l l i n gi a p p a r ea r o ut hc eb oo g r a nc e( ea r r oa ii n t e n s ei nt h em o l e c u l a rl a y e r ;l a b e l l e dn e u r o n sa np r o c e s s ea ra l se v i d ei t hh i l( l or ic o r( I t c ec o r t e x ,t h es t r o n g e s ti m m u n o l a b e l l i n gi sa r o u n di n t e r n e u r o ni t hm o l e c ul a y( t r i a na a r os g rc( a r r o w h e a d s )a sw e l la si nt h eg l o m e r u l i ,b ui i r e l a t i v e lw e aa r o uP u r k ic es o m( a r r( CD oi m m u n o f l u o r e s c e n c eI a b e l l i n gf o rt h e7 2s u b u n i t( Ca na l - s u b u n( D )i l l u s t r at hn e ai d e nd i s to t ts u b u n i t so nt h es o m aa n dd e n d r i t e so fa l a r g en e u r oi t hg l o b up a l l i dN o t it hp r e so s t rl asi r r e g u l a r l yd i s t r i b u t e da l o n gt h ec e l ls u r f a c e( a r r o w h e a d s )T h e si m a gw e ro b t a ib s u p e r i mo e ic oi m a g e ss p a c e db y0 . 5p m .T h et o pa n dt h eb o t t o mo t hs o mo t hl a r gn e u ra rn oe n t ii n c li t s ea h

a p p e a rp a r t i a l lu n l a b e l eS c ab a r2 , a

S y n a p t i cc o - l o c a l i z a t i o no t h7 2a a n/ 3 2G A Br e c es u b u1

F i g

1 4 3 0P S o m o g y

F i g .4 .D o u b l ei m m u n o g o l dl a b e l l i n gc o n t r o le x p e r i m e n tE l e c t r o nm i c r o g r a p ho ft h em o l e c u l a r

a 2 a

a 1a

m e t h o d( E C L ,A m e r s h a m ,B u c k s ,U .K . )a c c o r d i n gt t hi n s t r u c t i o n so ft h em a n u f a c t u r e r .T h es p e c i f i c i t yo t hy 2 - s u b u n i ta n t i s e r u mw a se s t a b l i s h e db c o m p e t i t i ow i t ht h ep e p t i d eu s e df o ri m m u n i z a t i o n( 1# g / m l )T ha n t i s e r u md i s p l a y sn oc r o s s - r e a c t i v i t yw i t he i t h et hyo ry 3s u b u n i t s ,a n di tr e c o g n i z e sr e c o r i l b i n a n tr e c e p t o rc o n t a i n i n gt h ey 2 - s u b u n i t( B e n k ee ta l .1 9 9 6 )T ha f f i n i t y - p u r i f i e da n t i b o d i e sl a b e l l e da b r o a db a n dc e n t r e

a r o u4 k Da nc o r r e s pt t y s uib l o to c r um e m b rf r a ci s of ea d u lr ab r a( w hb r ao h i p poc e r e b e l l( F i1 )T hi m m u n o rw e l ib p r e i n c u b aw it hp e pa n t( F1

F o ua d uW i s tr aw ea n a e s tw S a( p e n t o b a r b i ts o d i2 m gi .a p et h r o ut hh e aw is a lf o lb f ic o n t a i n i4 ?p a r a f o r m a l0 . 0 5g l uh y da nw O . 2p i ca cf 1 3m Ap e r f u s i ot hb r a iw er e m oa b lft hd o r sh i p p o c a mc e r e ba g lp an e o s t r i aw ec uo ua w a si s ec ho 0 .M p h o s p hb u f( P

s a mp r o c ew u sa d e se a( B a u1 “ 9 9N u s1 9 9B rap e r f u s i ob l o co t i sw ew ai 0 M Pf o l l o wb v i b r a ts e c t i( 5~ t h ia nw a s h ii 0 .M P o v e r nT s ewp l a ci n t1 M s u c rs o l ui 0 M P f 2 h fc r y o p r o t e c tb e f os l a m mf r e e z e - sae m b e d d ii L o w i cH 2 ( C h eW eLG m b HG e r m a n

P o s t e m b e d di m m u n o c y t o cw c aoo 7 0t 8 0 - n m - ts e c to s l a mf rs u b s t i t u tL o w i c r y l - e mm a tf f rT hs e c t i ow ep i cu o p i o l o f ong r i dT h ew et hi n c u bo d ro b ls o l u t if o3 r e if o l lb i n c uo d op r i m aa n t i b o do v e r no f 2 d aW ts u b u n iw e rl o c a lo t s as e ct p ra n t i b o d if rd i f f es p ew em iTb l o c k is o l u t iw h iw a lu sf d itp r i m aa ns e c o na n t i bc o no 0 Mp h o s p h a t e - b u f fs a l( 7 .c o n0o v a l b u m( S i gS L o uM OO .c w fs k ig e l a t i( S i g ma n5 f o ec s eAi n c u b a t ii p r i ma n t i bs e cw w aa ni n c u b ao d r oo g oa n t i -g am o u so g oa n t i - g u i nI c o ut 1 ng o l( d i l u t1 : 1 0N a n o pI nS tB rNo i g o aa n t i - r aI ga d s ot 5 o 1 n c og o l( d i l u t1 :o 1 : 6N a n o pI nf 2 h ar o ot e m p e r a tW ht s u bw l o cot hs a ms e c t it ht wa p p r os e cab o d iw e rm i x eF o l l os e vw as ew e rf i xi a 2 Yg l u t a r a ls o lf 2 m at h et r a n s f e rt d r oo u l t rw ap rt se n h a n c e mi t hd aw ia H S ik f 4

a

a Aa

a aa

2

a

1

1

5 m i n .A f t e rf u r t h e rw a s h i n gi nu l t r ap u rw a t e rt hs e c t i o n sw e r ec o n t r a s t e dw i t hs a t u r a t e da q u e o uu r a n ya c e t a t ea n dt h e nw i t hl e a dc i t r a t e .

C o n t r o l sf o rs p e c i f i c i t yi nt h el i g h tm i c r o s c o p im a t e r i a li n c l u d e dt h eo m i s s i o no ft h ea f f i n i t y - p u r i f i ea n t i b o d i e s ,t h e i rr e p l a c e m e n tb yn o n - i m m u n eg u i n e a - p io rr a b b i tI g Go fa p p r o x i m a t e l yt h es a m ec o n c e n t r a t i o na n dp r e - a b s o r p t i o no ft h ea n t i b o d yw i t ht ha n t i g e( ~ gm l ) .

I nt h ei n c u b a t i o n sf o re l e c t r o nm i c r o s c o p y ,s e l e c t i vl a b e l l i n g ,r e s e m b l i n gt h a to b t a i n e dw i t ht hs p e c i f i

a n t i b o d ic o un ob d e t ew t p ra n t i b o dw ee i to m io r e pb ns e r uU s ip o l y c la n t i bt s y n(a nU e d1 9 8 1n p l am e ml a bwo b s e r vw io um e t hd e m o nt tI a b e l l io b s e ro t p l am e mi d tt ha n t i - r e c ea n t i b o

F ot hd o u bl a b e le x p e ra s o d ia n t i b o dr a i si t hs as p ea t t hp ra n t i b o dt G A Br e c es u bw u ac o n t r o lT hm o n o c la n t it t ~ s uw ar e p l aw ia c o m m ea n ta nT hr a b ba n t i bt t a s u bw r ew

a

A a

a na n t i b o d yt om G l u R l u .T h eg u i n e a - p i ga n t i b o dt t hy 2s u b u n i tw a sr e p l a c e dw i t ha g u i n e a - p i gp o l y c l o n aa n t i b o d yr e c o g n i z i n gm e t a b o t r o p i cg l u t a m a t er e c e p t o rt y p e s2 a n d3 .

S y n a p t i cj u n c t i o n sa r ei d e n t i f i e do nt hb a s io t hs y n a p t i cv e s i c l ea c c u m u l a t i o n ,r i g i dm e m b r a n ea p p o s it i o n sa n d l o rp o s t - s y n a p t i cm e m b r a n es p e c i a l i z a t i o n sS y n a p t i cj u n c t i o n sh a v eb e e nc l a s s i f i e do t hb a s iot h ee x t e n to ft h ep o s t - s y n a p t i cd e n s i t y( G r a y1 9 5 9P e t e r s1 9 9 1 )a st y p e1 ( a l s oc a l l e d“ a s y m m e t r i c a l ”m e a n i n ge x t e n s i v ep o s t s y n a p t i cs p e c i a l i z a t i o n )o t y p2( a l s oc a l l e d“ s y m m e t r i c a l ” ,m e a n i n gs m a l ip o s t s y n a p t is p e c i a l i z a t i o n ) .A l t h o u g hs o m et r a n s i t i o n a lf o r mh a va l s ob e e nd e s c r i b e d ,m o s ts y n a p s e sc l e a r l yf a li n to not h et w oc a t e g o r i e si nt h et h r e ea r e a si n v e s t i g a t e di t hp r e s e n ts t u d y .I nt h em e t h a c r y l a t e - e m b e d d e dm a t e r i a lt h et w ot y p e so fs y n a p s ec a nb er e c o g n i z e db e c a u st hp o s t s y n a p t i cm e m b r a n es p e c i a l i z a t i o n so t y p1 s yn a p s e sb e c o m ev e r yc o n s p i c u o u s .

R E S U L T S

N oi m m u n o l a b e l l i n gw a so b s e r v e di t hl i g hm i c r o s c o p i cm a t e r i a lw h e nt h ea f f i n i t y - p u r i f i e da n t ib o d i e sw e r eo m i t t e do rr e p l a c e db yn o n - i m m u n er a b b iI g Go fa p p r o x i m a t e l yt h es a m ec o n c e n t r a t i o n ,o ba n t i b o d yt h a tw a sp r e i n c u b a t e dw i t ht h ea n t i g e n

I nt h ee l e c t r o nm i c r o s c o p i cc o n t r o li n c u b a t i of od o u b l el a b e l l i n go ft h es a m es e c t i o n s ,r e p l a c e m e n to t hm o n o c l i n a la n t i b o d yt ot h e/ ? 2 / 3s u b u n i t sw i ta a n t iG F A Pa n t i b o d yr e s u l t e di ns e l e c t i v eI a b e l l i n go g l i af i b r i l l a r yb u n d l e s ,b u tn e v e rt h ep l a s m am e m b r a n ew h eu s e da l o n eo ri nc o m b i n a t i o nw i t ht h er a b b ia n t i b o dtt h er x ls u b u n i t .R e p l a c i n gt h er a b b i ta n t i b o d yt t has u b u n i tw i t ha na n t i b o d yt om G l u R l ar e s u l t eis e l e c t i v ep e r i s y n a p t i cl a b e l l i n go ft y p e1 s y n a p s eb o to nP u r k i n j ec e l ls p i n e sa n do nc e r e b e l l ai n t e r n e u r od e n d r i t e s( F i g .4 )a sr e p o r t e de a r l i e r( B a u d e1 9 9 3 )b u tn e v e ro ft h et y p e2 s y n a p t i cj u n c t i o n s ,w h eu s ea l o n eo ri nc o m b i n a t i o nw i t ht h ea n t i b o d i e st t h7 of 1 2 / 3s u b u n i t s .A c o n t r o li n c u b a t i o np e r f o r m ebr e p l a c i n gt h eg u i n e a - p i ga n t i b o d yt ot h ey s u b u n iw i ta g u i n e a - p i gp o l y c l o n a la n t i b o d yr e c o g n i z i n gm e t a b o

t r o pg l u t a mr e c e pt y2 a 3 d n r eiI a b e l l io t y2 s y n aj u n cw u a oi c o m b i n a tw it hr a ba n tt t a s uT h e r e f ow c o n c lt hl a b eo t 2 s yj u n c t i oi d ut t hs p e cp r ia n trt G A Br e c e p( # 2o t t p e p( y Td u al a b e l lo t hs as y n aj u nw ts e to a n t i b o dr e c o g nt d i fs uot hG A Br e c e pa v i s ub t s oi m m u n o p a r t ih a vd i f fs id e m otp r e s e no i m m u n o r e a cf t d i fs ui t hs a ms y n a pj u n ca i n d t a cl a b e l l ia r t e fo t hm e tI m oc aw di m m u n o l a b e lo s i ns e c tw u t r ew e ra l sc o r r o b o rb i n c u bs es e cew i to na n t i bo n lT t e x p e rs tg a vs i m i lr e s u l

W h ee l e c tm i c r o ss e ca i n coa n t i b os o l u t it hw hc s u ro t pm e m b r ai u n i f oe x pt t r e awm e a nt h ac o m p a r ic b m ab ed ip a r to t hm e m b ro t s ac ea d i fcH o w e v et ha n t i b op r o bo nr et e pe x p o so t hs u r fo t s e cw ht io t hs y n a pi f o rf rt w ht h io ts e c t i ow h ii a b o6 0n T h e rs po t hs y n a pj u n c t im e m bt a pi ti m a gm an ob e x p oo t i n cs o ts e c t is u r f aF u r t h e rt a n g ec m er e s ui m oe x p oe p i tt hm e mc a ar i g ha n g lI w aa p p at ht m oh el ac o u lb o b s e ro t a n g e nc s y nTf a c t o rc o n t r i b ut v a r i ai l a b ew ti n ta c c o uw hd r a wc o n c li t p rs t u da na l t h oo b s e r vw em o lp o p u l a t io s y n a po na f c ac bi l l u s t r af ol i m i t ao s p a

T ws e to t wd i f f es e c oa n tl ae i t hw i t1 .o 5 - ro 1 .o 1 0g p aw e ru s eo s i n gs e c t ia d e s ce a( N

1 9 91 9b )T 1 . 4p a ra nd e t e c t aw ic o n v e nt r a n se lm i c r o s c ot h e r e fs i li n t e n sw u t

A

A a

1a a

( At e x t r ai m m u n o p a r t i c l e sa p p e a ro nt h ed e n d r i t i cm e m b r a n eo no t h en e xt t ht y1s y n aj u n c( A l ar a d i a l l yo r i e n t e dd e n d r i t e ,p r o b a b l yf r o ma G o l gc e l lr e c e i va t y p2 s y n al a b ef t y s u b(T w ob o u t o n s( b )f o r mh e a v i l yI a b e l l e ds y n a p s e sO no t hb o u t oh at h rj u n c ts p e c i a lt ot h e mw i t ht h es a m ed e n d r i t e .O n l ys o m eo t hp a r t i c l el a b e l l it h~ 2s u b u n( b aa i n d if c lS i l v e r - i n t e n s i f i e dp o s t e m b e d d i n gi m m u n o r e a c t i o nu s i n1 . 4 -g o ll a b ee x cf ot a s u bi ( a

( C )( 1 0 - n mg o l dl a b e l ) ,a n di n( E )( 5 - r i( A ) - ( C

i n c r e a s ep a r t i c l es i z e s .B e c a u s ef i n a lp a r t i c ls i ziv a r i a b l ea n dc r i t i c a l l yd e p e n d so nt h es i l v ei n t e n s i f i c at i o nc o n d i t i o n s ,p a r t i c l es i z e sc a no n l yb c o m p a r eos e c t i o n sp l a c e do nt h es a m ee l e c t r o nm i c r o s c o p ig r i dT h e r ew a sn e v e ra n yo v e r l a pb e t w e e nt hp a r t i c ls i z er e s u l t i n gf r o mt h eu s eo f1 . 4 -a n d1 0 - n mp a r t i c l e sb ub e c a u s eo ft h e i rl a r g es i z e ,t h el a t t e rm am a st hp r e s e n c eo ft h es m a l l e rp a r t i c l e s .T h e r e f o r e ,t h5 - r ip a r t i c l e sw e r ea l s ou s e di nc o m b i n a t i o nw i tt h1 . 4 - np a r t i c l e s ,b u ti nt h i sc a s e ,i ns o m ei n c u b a t i o n sw h i cw e rn o ti n c l u d e di nt h ep r e s e n ts t u d y ,t h e r ew aa o v e r l ab e t w e e nt h ep a r t i c l es i z e sr e s u l t i n gf r ot ht wp o p u l a t i o n s .

T h en e wa n t i b o d i e st ot h ey 2s u b u n i tr e s u l t ei a v e rs i m i l a ra r e a ld i s t r i b u t i o no fl a b e l l i n gi nt hr o d e nb r a it ot h a tr e p o r t e de a r l i e r( G u t i e r r e z1 9 9 4F r i t s c ha n dM o h l e r ,1 9 9 5 ) .A m o d e r a t et oi n t e n s ey s u b u n ii m m u n o r e a c t i v i t yw a sd e t e c t e dt h r o u g h o u tt hb r a i nT hg l o b u sp a l l i d u s ,h i p p o c a m p a lf o r m a t i o na nc e r e b e l l uw e r ea m o n gt h em o s ti n t e n s e l ys t a i n e da r e a sT hc e l l u l ad i s t r i b u t i o no ft h er e a c t i o np r o d u c tw am a r k e d ld i f f e r e n ti nt h e s et h r e er e g i o n s ,a ss e e ni b o tl i g ha n dc o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y( F i g2 a n3 )t h e r e f o r et h e yw e r ef u r t h e ra n a l y s e do nt hc e l l u l aa ns u b c e l l u l a rl e v e l s .

I nt h eh i p p o c a m p u sa n dd e n t a t eg y r u s[ F i g2 ( Aa n3 ( A ) ]t h es t a i n i n gw a sv e r yl i g h ti nt h ec e lb o dl a y e r sb u ti n t e n s ea n dd i f f u s ei nd e n d r i t i cl a y e r s .T hi m m u n ol a b e l l i n gw a sm o r ei n t e n s ei nt h ei n n e r m o s tr e g i oo t hd e n t a t em o l e c u l a rl a y e r ,a n dt h i sw a sp a r t i c u l a r l ye v i d e ni nt h ec o n f o c a li m a g e s .I na d d i t i o n ,i s o l a t e dc e l lw i tam o r p h o l o g yo fi n t e r n e u r o n sw e r ed i s t i n c t l ya ns t r o n g ll a b e l l e dt h r o u g h o u tt h eh i p p o c a m p a lf o r m a t i o[ F i g2 ( A ) ]a sd e s c r i b e de a r l i e rf o ro t h e rs u b u n i t s( G aa nF r i t s c h y ,1 9 9 4 ;F r i t s c h ya n dM o h l e r ,1 9 9 5 ;N u s s e1 9 9 5 a ) .H o w e v e r ,i nc o n t r a s tt oi n t e r n e u r o n s ,i t hc e lb o d yl a y e r s ,t h el a b e l l i n gc o u l dn o tb u n e q u i v o c a l la l l o c a t e dt oi n d i v i d u a lp r i n c i p a lc e l l si t hl i g hm i c r o s c o p i cm a t e r i a ls i n c ed e n d r i t e sa na x oi n i t i as e g m e n t s ,i n n e r v a t e db yG A B A e r g i ct e r m i n a l sa rk n o w nt op a s sa m o n gt h es o m a t a .T h e r e f o r e ,e l e c t r om i c r o s c o p yw a su s e dt ot e s tt h ep r e s e n c eo t hys u b u n i ti ns y n a p t i cj u n c t i o n so nt h es o m a ta no t h ep a r t so ft h ec e l l si nt h eC A 1a r e aa n dt hd e n t a tg y m s

T h ea p p l i c a t i o no ft h en e wa f f i n i t y - p u r i f i e da n t i b o dit h ep o s t e m b e d d i n gp r o t o c o lr e s u l t e di na c l e as i g n ais y n a p t i cj u n c t i o n sw i t hv e r yl i t t l e ,i fa n yb a c k g r o u nl a b e l l i n g .O n l yt y p e2 ( s y m m e t r i c a l )s y n a p t i cj u n c t i o nw e r el a b e l l e d( F i g s5 ,6 a n d7 ) .T h ep o s t s y n a p t i ct a r g e to fy 2s u b u n i tp o s i t i v es y n a p s e sw e r es o m a t[ F i g5 ( A ,B ) ] ,a p i c a la n db a s a ld e n d r i t e so fp y r a m i d ac e l l[ F i g .5 ( C ) ] ,t h ed e n d r i t e so fg r a n u l ec e l l s[ F i g5 ( DE ) ]t h ed e n d r i t e so fi n t e r n e u r o n s( F i g .6 )a na x oi n i t i a

s e g m e n( F i7 o b op y r aa g rc It hC Aa r et hd e n d ro p y rc ai n t e r n e u ra re a sd i f f e r eb et lr e c e in u m e rt y1 s y n a( F6 w aa b s ef r ot hf o r mI t d e ng yg rcd e n d r i ts h a fm ar e c eo c c at 1 s yb ut h ea rm on u m eo i n t ed eA x oi n i t is e g m ea r e c o go t b o te l e c t r o n - dm e m b ru n d e ra t p ro c i s t e ro r g a n e( F7 S y ni m m uf ot hy s u b uw ef ot c o nt M [ 5B D E )6 (B a n7 ( Aa f 1s u[5 ( DE a n7 ( C )T h ew en o b vr eo ts u r f ao p o s t s y nc el a ct y s uis y n a p s ea l t h oi m m u n o ps y ni s tr a d i a ta nl a c u nm o l eo p yd e n d r i tw ev er aT m oh el as y n a p sw ef o uo i n t e rd e nf at h r es u b u n iT h ew em as y nw wo n ll a b e lf oo no t s u b ub n er ec a n nb t a ka e v i df t a b so t s ua t hd i f f e ra n t i bh aa d i fa fT h e r e f od i f f el a b e li n t eb eab o d ii n on e c e s s ar e lt t r e la bo t hr e s p e c ts u b u n

I t hc e r e b e lt hd i f fc t yc br e c o g n io t hb a so t hi m m u n of ty s u b u nI t hm o l e cl ai n t ewd i s t i n cl a b e lo t hs o ma d e na rw h e r et hl a b e lo P u r kc ew d ita s c e r t aa m ot hp r o m ii n t e r[ 2a n3 ( B )T hs o mo P u r kn e uw l is u r r o u nb v a r i cl a b e lb t p o stt h iw ap a r td ut t p r eo i n td e n d r i tn et hc eb o dc ab e xIt hg r a n uc el a yi n ts t aw o ba r o us o mg r a nc es o m[ F2 a 3 aw e la i g l o m e rw ha p pu n iad e n s el a b e l[ F i2 ( B

T hi m m u n o l a b eo s y nj u nc be s t a b l i st h r ot ha p p l io t p o s ti m m u n o gm e t hO nt y2 s y nw l ai t hm o l e c ul a yo P u r kc d e ns( F i g8 a ni n t e r n ed e n d( F9 T fw e ri d e n t i fu s u af rt p r eo c hi s t ic i s t e rs t a c[ F i8 ( A –t hl as o ot hb a so t h eo r if rt c eb oS yoP u r k i nc ed e n d rw el a bc lt t cb o da w ea n et hp is u ri n dt bb a s ka ns t e l lc es y n ac o nt y s uT hs y n a po t hc eb op r ob b aca x o nw e ro nr a ra l i gl a b[ 8T hy s u b uw af r e q uc o - l ow t as u b u na nt h~ 2s u b u[ F8 (G

I n t e r n e ud e n d rs y n aw eu smm o rh e a v il a b e lf a s u bt s yo

P u r k i n j ec e l l s .B e c a u s eo ft h eh e a v yl a b e l l i n gt hc l u s t e r e dd i s t r i b u t i o no ft h el a b e l l i n gw a sv e ra p p a r e ni ns i n g l es y n a p t i cs p e c i a l i z a t i o n s[ F i g .9 ( A – C ) ]a nt hs a m ep r e s y n a p t i ct e r m i n a l sc o u l da l s op r o v i d em o rt h ao n es y n a p t i cj u n c t i o nt ot h es a m ep o s t s y n a p t i cd e n d r i t[ F i g .9 ( E ) ] .

I nt h eg r a n u l ec e l ll a y e r ,s y n a p t i cl a b e l l i n gf ot hys u b u n i tw a sm u c hm o r ed i f f i c u l tt of i n dt h ai t hm o l e c u l a rl a y e r .I ti sl i k e l yt h a tt h es t r o ni m m u n or e a c t i v i t yd e t e c t e da tt h el i g h tm i c r o s c o p i cl e v er e s u l tf r o mt h eh i g hv o l u m ed e n s i t yo fd e n d r i t i cm e m b r a n ea b u n d a n ti ne x t r a s y n a p t i cr e c e p t o r s( N u s s e1 9 9 5 b ) ,w h i c hw e r er a r e l yd e t e c t e dw i t ht hp o s t e m b e dd i n gm e t h o dt h a ti sl e s ss e n s i t i v et h a nt h ep r e e m b e d d i nm e t h o d s .T h eo c c a s i o n a ls y n a p s e st h a tw e ri m m u n op o s i t i v ef o rt h ey 2s u b u n i tw e r ea l s oi m m u n o p o s i t i v ef ot h ea la n d / o rt h e/ 1 2 / 3s u b u n i t s( F i g .1 0 ) .T ha n t i b o dtt h eM ls u b u n i tl a b e l l e dm a n yG o l g ic e l lt g r a n u lc e ls y n a p s e s ,h a v i n ge i t h e rt h i n( t y p e2 )o rt h i c( t y p1p o s t s y n a p t i cm e m b r a n es p e c i a l i z a t i o n( F i g1 ) c o n s i st e n t l yf r o ms e c t i o nt os e c t i o n ,a n di ta l s or e v e a l et ha b u n d a n te x t r a s y n a p t i cr e c e p t o r sb o t ho t hd e n d r i t ia n do nt h es o m a t i cm e m b r a n e s ,a sr e p o r t ee a r l i e( N u s s e r1 9 9 5b ) .T h em o s s yt e r m i n a ls y n a p s e ss o m eo fw h i c ha r eI a b e l l e df o rt h eU 6s u b u n i t( N u s s e

1 9 9 6 b ) ,w e r en o tl a b e l l e df o ra n yo t hs u b u n i ts t u d i e di nt h ep r e s e n tr e p o r t .

A n e t w o r ko fv e r yi n t e n s e l ys t a i n e dd e n d r i t ea ns o m a t aw a so b s e r v e d[ F i g .2 ( C ) ] ,a n dt h em o r p h o l o goi n d i v i d u a ln e u r o n sc o u l db ea n a l y s e di ng r e ad e t a ibc o n f o c a ls c a n n i n gl a s e rm i c r o s c o p y[ F i g3 ( C ) ]T hs o m aa n dd e n d r i t e sw e r ed i s t i n c t l yo u t l i n e db i m m u n ol a b e l l i n gf o rt h ey 2s u b u n i t ,w i t hl o c a lv a r i a t i o nii n t e n s i t ys u g g e s t i n gr e c e p t o ra g g r e g a t e s .D o u b l e - l a b e lI i n gw i t ht h ea l - s u b u n i ta n t i s e r u mr e v e a l e da n e a r li d e n t i c a ld i s t r i b u t i o no ft h ea l -a n dy 2 - s u b u n i t[ F i g3 ( C – D ) ] ,s u g g e s t i n gt h e i rc o - l o c a l i z a t i o ni s i m i l ar a t it h r o u g h o u tt h en e u r o n a ls u r f a c e .

T h es y n a p t i ce n r i c h m e n ta n dc o - l o c a l i z a t i o no b o taa n dy 2s u b u n i t sw i t ht h ef 1 2 1 3s u b u n i t sw e rr e v e a l ebp o s t e m b e d d i n gi m m u n o g o l dl a b e l l i n g( F i g1 1 )S yn a p s e so nb o t hs m a l la n dl a r g ed i a m e t e rd e n d r i t ew e ri m m u n o p o s i t i v e ,a n de x t r a s y n a p t i cr e c e p t o rl a b e l l i nw a se v i d e n t ,p a r t i c u l a r l yf o rt h ea ls u b u n i[ F i g1

( AF ) ]T hc l u s t ed i s t r io i m m u n oit ha c t iz ow ab es ei t a n g ec s y[ F i g1 ( C )A i t ho ta r eo fo t eo t hs y n a pa c tz o nw el a b[ F1 (

D I S C U

T hs y n a pa c tz o nw hi t ht b ts i to v e s i c ut r a n s mr e la a cir e c o g n ii e l e c tm i c r os p eo tb a s io t hr i gp ra p o s t sm ea p p o s i t it hc l em a t e rt p o s t sm es p e c i a l i z a ta nt hp r e s yg c o nod e n sp r o j e c t( s ef oe x a mF i4 T p rs t u dc o n f ip r e v ir e pf o ts uo tG A B Ar e c e p( N u s1 91 91N u s sa nS o m o g1 9T o1d e m o n s t r a tt ht hy s u bi a lh ie ni t ha c t iz o nw ia s hf ai t d eoi m m u n o l a b e la t he do t m e ms pi z a t i oT hp r e s eo a d e fa ro h r ed e n s ia t ht r a n s mr e ls u n dtr e p r o d u c i b io s y n ac u re vi t ps y n a p tc ef rr e l ee vt r e le vI wa l sn o tt h ai a lt h ra ro t b rs tht hr e c e pl a b e lo t a cz a pc l u s t e ri s os y n a pT hd on a pt ba t e c h n ia r t e fs i ni w o b sw td i f f e r ep r i ma nt hd i f fs e cab o d i eT hs i g n i f io t hs t r ud i s tor e c e p t oi u n k na r e mt b a nq u a n t i t a t i v

I s o mi m m u n o p os y n at l a bwp r e s eo n la t he do t m e ms p e ca s i m i ld i s t r i b ui a p p ai p r e vp ui l l u s t r a t i( N u s1 9 91 91 9fo t h es u b u n iS i nt hp o s t e mm eh al i m i ts e n s i t id ut t r e s t ro t a n tt t hs e c t is u r f ai i l i kt hs a l ar e p r e s ea v i s u a l i zo o nt h id eor e c e p t or a t ht ht ha b so r e cf tm i d do t ha c t iz o nS id e s e n sm pa r o li G A B A e rs y n at r a n s( JaW e s t b r o1 9 9 6t hp o s si n co r ed e n s it o w a rt he do t s y ni s s y

a a

j u n c t i o n sm a yp r o v i d ea m e c h a n i s mf o rt hf i nt u n i nop o s t s y n a p t i cr e s p o n s e s .

T h er e g i o n a lc o - l o c a l i z a t i o no ft h ey 2s u b u n iw i tt ha la n d/ 3 2 / 3s u b u n i t sh a sb e e nr e v e a l e de a r l i e( F r i t s c ha n dM o h l e r ,1 9 9 5 ) .I m m u n o p r e c i p i t a t i o ns t u d i es u g g e st h a tt h ey 2s u b u n i ti sf r e q u e n t l yc o - a s s e m b l e dw i tt haa n dt h e~ 2s u b u n i t s ,a n dt h i st r i p l e tr e p r e s e n t st hm o sa b u n d a n tG A B A A - r e c e p t o rs u b t y p ei nt ha d u lC N( B e n k e1 9 9 4 ,1 9 9 6 ) .T h ep r e s e n c eo t hy 2s u b u n i th a sa l s ob e e nr e p o r t e di nc h a n n e l sc o n t a i n i nt hc t 2 ,u 3 ,u 5 ,u 6 ,f 1 3 ,y 3 ,6 s u b u n i t s( s e eI n t r o d u c t i of or e f e r e n c e s ) .T h eh i g hp r o p o r t i o no fr e c e p t o r sc o n t a i n i nt h ey 2s u b u n i ts u g g e s t st h a ta tl e a s ts o m eo t h ec o u lb ed e r i v e df r o mt h es y n a p t i cp o o l .T hm o sd i r e ce v i d e n c ef o rt h es y n a p t i co c c u r r e n c eo y s u b u n ic o n t a i n i n gc h a n n e l sw a sp r o v i d e ds of a rb t hp o t e n t i at i o no fs y n a p t i cr e s p o n s e sb yb e n z o d i a z e p i n er e c e p t oa g o n i s t s( D eK o n i n c ka n dM o d y ,1 9 9 4 ) ,w h i cp r o b a b lc a ne x e r tt h e i rf u l la g o n i s te f f e c to n l yo c h a n n e lc o n t a i n i n gt h ey 2s u b u n i t( P r i t c h e t t1 9 8 9S i g e

1 9 9 0 ;M o s s1 9 9 1 ;W a f f o r d1 9 9 1G u n t h e r1 9 9 5 ) .S i n c et h es a m ei n d i v i d u a ls y n a p s ec o u l db el a b e l l e df o ra tl e a s tt h r e eo ft h em o sa b u n d a ns u b u n i t si nt h eh i p p o c a m p u s ,c e r e b e l l ac o r t ea ng l o b u sp a l l i d u s ,i ti se v i d e n tt h a tt h e ya lp a r t i c i p a tis y n a p t i ce v e n t s .F u r t h e r m o r e ,m o s ts y n a p t i cj u n c t i o not h ea x o ni n i t i a ls e g m e n to fh i p p o c a m p a lp y r a m i d ac e l lh a v eb e e ns h o w nt oc o n t a i nb o t ht h ea la na s u b u n i t( N u s s e r1 9 9 6 a ) .T h ep r e s e n ts t u d ys h o wt h am a ns y n a p s e so nt h ea x o ni n i t i a ls e g m e n t sl a b e l l e df ot has u b u n i ta l s oc o n t a i nt h ey 2a n d~ 2 / 3s u b u n i t s .T h u st hs y n a p s e se s t a b l i s h e db ya x o - a x o n i cc e l l sa p p e at b t hf i r s tw h i c hc o n t a i na tl e a s tf o u rd i f f e r e n tG A B Ar e c e p t o rs u b u n i t s .

T h er e s o l u t i o no ft h ei m m u n o g o l dl a b e l l i n g(w2 n md o e sn o ta l l o wa n yc o n c l u s i o nt ob ed r a wa b o ut hs u b u n i tc o m p o s i t i o no fs i n g l ec h a n n e l s ;i n s t e a di i av e r yd i r e c tm e t h o dt od e t e r m i n ew h i c hs u b u n i ta ra l l o c a t e db yt h ec e l lt op a r t i c u l a rs y n a p t i ci n p u t s

H i p p o c a m p a lp y r a m i d a la n dg r a n u l ec e l le x p r e sm R N Af o ra tl e a s t1 0 - 1 1s u b u n i t so t hG A B Ar e c e p t o r ,b u to n l yt h r e ed i f f e r e n ts u b u n i t sa rn e c e s s a r

t f o ra f u lf u n c t ip e n t( N1 9 9 4c h a n nE vi m ot ht hd i fs uw e rc o - a s s e m bi w o ub v el it t sc e lw o ub a bt p r or e cc hwd i s t i ns u b uc o m p o s iA t hd i sr et a r g e tt a lG A B A es y n as io a s icH i p p o c a mp r i n cc er e cG A Bif r oo v ef id i s tt yo i n t e rws u b d i v it hs u r fo t p o s t sc eT mo b v i od i v i si b e t wt a x o -a bc e l li n n e r v a tr e s p e c tt a xi ns ea nt hs o m a / p r od e n d( S o1a na c t it h r oG A Br e c e( B1T hy s u b ui p r e si b ot a x oab a s kc e ls y n a ps u p p ot p r ec o nb a s eo t hd i s t r i bo t L a f is uit hd e n t ag y r ut hc h a nc o n tt ss u b u n ic ab t a r g et f u n c td i ss ys i t er e c e i vG Af rd i f fs o p r ec e l l( N u s s1 9 9I c o na rq u a n t i t a ts t uo t hd i s t r io t U s ud e m o n s t r at hs oc h a na p r e ft a r g e tt a p a r t i cs y n ai nI h b ft h at ha x o - a xs y n aw em um f r el a b e l lf ot hm s u b ut ht s y no ts o m a t a / p r o xd e n d ro C p y rc( N u s s1 9 9 6A s e g r ed i s to ta lL Xa na s u b u nh a lb ed e m oi tr e t io s i n gn e u r( K o1 9A lt hy s u b u nd on of o lt d i f f ed i so t ha s u b uo t p r os y ns op y r a m i dc e l lt hd i sd e n dd o mt r eG A B A e ri n pf rs e vi n t e rs a tb i s t r a t i fc e( B u1 9t s o mG A B A - c o n t a ia l vc e( G u1 ao t h ea y ep o od e f ic et yr et ba n a l y si a m a nt ha l lt p r ei d e no t hp r e s y n at e r mi y i m m us y n a p s e

P u r k i nc e la lr e c eG A B Ai nf al e a st wm a js o u rt b a sa s t ec etl a t ti n n e r v at hm od i sd e nd oSb a s kc e lt e r m i nc ab r e c oo t b o tc h a r a c t e r in e u r o f i lc o nw ha pt ba b s ef r os t e l lc et e r m( P e1A lt h rs u b u ns t u dh ea p r ei s yob o tp r o x ia nd i sd e n do P uc

a a

a

p r o v i d i n ga f u r t h e re x a m p l eo fa c e lt h at a r g e tr e c e p t o r sw i t ht h es a m es u b u n i tc o m p o s i t i o nt s y n a p s ei n n e r v a t e db yd i f f e r e n tp r e s y n a p t i cc e lt y p e sS i n cP u r k i n j ec e l l sa p p e a rt oe x p r e s sm R N Ao n lf ot hr x l/ 3 2a n dy 2s u b u n i t s( P e r s o h n1 9 9 2 ) ,a na lt h r es u b u n i t sw e r ef o u n dt ob ec o n c e n t r a t e di s y n a p t ij u n c t i o n s ,t h ec o m p l e t es u b u n i tc o m p o s i t i o no a l e a ss o m eP u r k i n j ec e l ls y n a p s e sh a sb e e ne s t a b l i s h e d

T h ea x o n so fc e r e b e l l ab a s k e tc e l l si n n e r v a tt hp r o x i m a ld e n d r i t e so fP u r k i n j ec e l l sa na l sp r o v i dt h i c kp e r i s o m a t i ca x o n sf o r m i n go c c a s i o n a lc h e m i c as y n a p s e st ot h ep i n c e a ua r o u n dt ha x oi n i t i as e g m e n t ,w h e r et h e yv e r yr a r e l ym a k ea ns y n a p s( S o m o g y ia n dH a m o r i ,1 9 7 6 ) .T h el ol e v eoi m m u n o l a b e l l i n go ft h es o m a t i cs y n a p s e sf ot hys u b u n i to ft h eG A B A Ar e c e p t o r ,i nm a t e r i aw h e rd e n d r i t i cs y n a p s e sw e r ew e l ll a b e l l e d ,i n d i c a t et h as o m a t i cs y n a p s e sm a yc o n t a i na l o w e rd e n s i toc h a n n e l s .D i f f e r e n c e si nr e c e p t o rd e n s i t ya ra l sp r o b a b l yr e s p o n s i b l ef o rt h em u c hs t r o n g e rl a b e l l i nos y n a p s e so ni n t e r n e u r o n si nt h em o l e c u l a rl a y e rac o m p a r e dw i t ht h el a b e l l i n go fP u r k i n j ec e l lo g r a n u lc e l l s .T h ed i f f e r e n t i a ll a b e l l i n go fs y n a p t i cj u n c t i o nod i f f e r e n tc e l lt y p e si nt h ec e r e b e l l u mh a sa l sb e en o t ef o rt h ea ls u b u n i t( N u s s e ra n dS o m o g y i ,1 9 9 6 )H o w e v e rt h ei n t e n s ec o n t i n u o u sl a b e l l i n gf o rG A B A Ar e c e p t o rot h ep l a s m am e m b r a n eo fG A B A e r g i ci n t e r n e u r o na p p a r e n ti nl i g h tm i c r o s c o p i cm a t e r i a li b o tt hc e r e b e l l u ma n dt h eh i p p o c a m p u si sn o tm e r e ld utt h eh i g h e rd e n s i t yo fs y n a p t i cr e c e p t o r sd e t e c t ei t hc e r e b e l l u m ,b e c a u s ei n t e r n e u r o n sd on oa p p e at bi n n e r v a t e db yG A B A e r g i ct e r m i n a l sm o r ed e n s e lt h ap r i n c i p a lc e l l si nt h eh i p p o c a m p u so rP u r k i n j ec e l li t hc e r e b e l l u m .A ss h o w ne a r l i e ri nt h eh i p p o c a m p u su s i ni m m u n o g o l dl a b e l l i n g( N u s s e r1 9 9 5 a )t h e si n t e r n e u r o n sh a v ea m u c hh i g h e rd e n s i t yo e x t r a s y n a p t ir e c e p t o r st h a np r i n c i p a lc e l l s .I nt h ec e r e b e l l u mt ha n t i b o d i e st ot h ea ls u b u n i t ,w h i c hp r o v i d et hs t r o n g e sl a b e l l i n go ft h et h r e ea n t i b o d i e s ,a l s or e v e a l ef r e q u e nI a b e l l i n go fe x t r a s y n a p t i cr e c e p t o r so i n t e r n e u r od e n d r i t e s .T h eh i g h e rd e n s i t yo fb o t hs y n a p t ia ne x t r a s y n a p t i cr e c e p t o r so ns o m et y p e so G A B A e r g ii n t e r n e u r o n sm a yr e n d e rt h e mm o r es e n s i t i v et G A B Aa sw e l la st od r u g sm o d u l a t i n gG A B A e r g i cn e u r o t r a n sm i s s i o n .

A

a

A

a n dt r i p l ei m m u n o f l u o r e s c e n c es t a i n i n gw i t hs u b u n i t - s p e c i f ia n t i b o d i e s .

G a o

a

A

a

a

S a nE .S e rM a nC oE E dp 4 1RP r e sN eY o r

M o sS J .R a v i n dA .M L W aJ B K oPH u g a nR L a nB uD R ( 1C h a r aor e c o m b i nG A Br e c e pp r oi t r acf r om u r iU lP Ia ny s u bc D

a nU eT ( 1 9A f f i n i t ya n tIa n t i b o

a

A M

a

P r i t c h e t tD .B . ,S o n t h e i m e r

a

Q u i r kK . ,G i l l a r dN .P . ,R a g a nC .I . ,W h i t i nP J a nM c K e r n a nR .M .( 1 9 9 4 a )y - a m i n o b u t y r i ca c it y pAr e c e p t o r si nt h er a tb r a i nc a nc o n t a i nb o t hy a ny s u b u n i t sb u ty ld o e sn o te x i s ti nc o m b i n a t i o nw i t ha n o t h eys u b u n i t

Q u i r kK . ,G i l l a r dN .P . ,R a g a nC .I . ,W h i t i nP J a nM c K e r n a nR .M .( 1 9 9 4 b )M o d e lo fs u b u n i tc o m p o s i t i ooG A B A Ar e c e p t o rs u b t y p e se x p r e s s e di nr ac e r e b e l l uw i tr e s p e c tt ot h e i ra a n dy / 8s u b u n i t s .

a C i d A

a nH a mJ ( 1 9A q u a ne lm i c r o s c os t uo t hP u r kc ea i ns e

A

8