+ All Categories
Home > Documents > The Slayer Protein of Lactobacillus acidophilus ATCC 4356: Identification and Characterisation of...

The Slayer Protein of Lactobacillus acidophilus ATCC 4356: Identification and Characterisation of...

Date post: 21-Feb-2023
Category:
Upload: independent
View: 0 times
Download: 0 times
Share this document with a friend
13
The S-layer Protein of Lactobacillus acidophilus ATCC 4356: Identification and Characterisation of Domains Responsible for S-protein Assembly and Cell Wall Binding Egbert Smit 1 , Frank Oling 2 , Rudy Demel 3 , Beatriz Martinez 1 and Peter H. Pouwels 1 * 1 Department of Applied Microbiology and Gene Technology, TNO Nutrition and Food Research Institute Utrechtseweg 48, 3700, AJ Zeist, The Netherlands 2 Department of Biophysical Chemistry, GBB, University of Groningen, Nijenborg 4 9747 AG Groningen, The Netherlands 3 Department Biochemistry of Membranes, Centre for Biomembranes and Lipid Enzymology, Utrecht University, Padualaan 8 3584, CH Utrecht, The Netherlands Lactobacillus acidophilus, like many other bacteria, harbors a surface layer consisting of a protein (S A -protein) of 43 kDa. S A -protein could be readily extracted and crystallized in vitro into large crystalline patches on lipid monolayers with a net negative charge but not on lipids with a net neutral charge. Reconstruction of the S-layer from crystals grown on dioleoylphosphatidylserine indicated an oblique lattice with unit cell dimensions (a 118 A Ê ; b 53 A Ê , and g 102 ) resembling those deter- mined for the S-layer of Lactobacillus helveticus ATCC 12046. Sequence comparison of S A -protein with S-proteins from L. helveticus, Lactobacillus crispatus and the S-proteins encoded by the silent S-protein genes from L. acidophilus and L. crispatus suggested the presence of two domains, one comprising the N-terminal two-thirds (SAN), and another made up of the C-terminal one-third (SAC) of S A -protein. The sequence of the N-terminal domains is variable, while that of the C-terminal domain is highly conserved in the S-proteins of these organisms and contains a tan- dem repeat. Proteolytic digestion of S A -protein showed that SAN was protease-resistant, suggesting a compact structure. SAC was rapidly degraded by proteases and therefore probably has a more accessible structure. DNA sequences encoding SAN or Green Fluorescent Protein fused to SAC (GFP-SAC) were ef®ciently expressed in Escherichia coli. Puri®ed SAN could crystallize into mono and multi-layered crystals with the same lattice parameters as those found for authentic S A -protein. A calculated S A -protein minus SAN density-difference map revealed the probable location, in projection, of the SAC domain, which is missing from the truncated SAN peptide. The GFP-SAC fusion product was shown to bind to the surface of L. acidophilus, L. helveticus and L. crispatus cells from which the S-layer had been removed, but not to non-stripped cells or to Lactobacillus casei. # 2001 Academic Press Keywords: S-layer protein; Lactobacillus acidophilus; domain; crystallization; cell wall binding *Corresponding author Introduction Crystalline surface (S-)layers are cell envelope structures that can be found in many Gram- positive and Gram-negative bacteria, and in Archaea, in which they are almost universally pre- sent. S-layers exist as two-dimensional regular arrays completely covering the bacterial surface. They are composed of only one (glyco) protein subunit, the S-protein, varying in mass from 40 to 200 kDa, and are assembled into arrays with either Present address: B. Martinez, Instituto de Productos Lacteos de Asturias, CSIC, Apdo. 85, 33300 Villaviciosa, Spain. Abbreviations used: S, crystalline surface; SLH, S-layer homology region; DS, dialyzate supernatant; DP, dialyzate pellet. E-mail address of the corresponding author: [email protected] doi:10.1006/jmbi.2000.4258 available online at http://www.idealibrary.com on J. Mol. Biol. (2001) 305, 245±257 0022-2836/01/020245±13 $35.00/0 # 2001 Academic Press
Transcript

��������������� ����� �� ��������� ������ �� ������������������������ �� �� ���� ����� � ���� �1�� �� �!

��� ������ ��� � �� ����������� ������ �� ��������� ����� � ��� �� ��� ������� ��� �� �� ���� ��������� ��� �� ������ � �������� ��� ���� ��� ! �� �"

#"��� �� �$% &��' (� �")% �*�� ������% !��� + ,�� ��+$

��� ��� -. �*/���$0

����������� ���� ��� ��� ��� ��� ������������� ��� ���� � ���� �� �������� ���� ������������� �� !"� #$%%� �&'� ��� ��� ���������������������� ( ���� ���)��� ����� �((� �� *��� �� ��� ����� � +����� !,$!$ �� ��� ����� ������������������������� ( ���� ���� ���������� )����� �( ��������� ��� - � �.�/������ ��������� *��� ��� 0�������� "#1"!� )2 �������� ��������������

0������ ����5 6� 7�����"� 8���9��� � � �������� -�8-� �� � '����������$��� �� ��� 5 �� ����������

������ � � �� ���� �) ��� ���"�0� ���"�� �������<��� ���� � ��� � ����� �

0 �#���=$ � ������ ���

++����'�.>+�>+�+��*?�� @�*�++>+

-������ ���� �� ��� ���� ���� �� ���� ������� ��� �� ������ ����� �������� � �� ���� ������ ����� � �� ��� ����� ���� � �� �� �� ����!����� � ��������"� � * �� ��� ���� ���������� ������ � ���� � ����� #��� ��� �����$� ����� ��� � � � ���� � #��� ��������� ������ %�� �������� � � ��� ������ �� ������� �� #� � � �� ���� ����� �������� �� ���� � ���&�� ������ #��� ���� ���� ����� �� �� � ��' �( ) � � *� �( � � � � �+� �� ��������� �� �� �������� � � ��� ������ � -������ ���� ���*�� ��� �,-- ��+�.� ��&������ ���� � � ����� ���� #��� ���� ����� �� -3 ���*�� ���� -������ ������ ������ � ��� ���� ����� ��� � �� ��� ������ ���� ���� ����� �� -3 �� ��� ��� � -3 �� ������ �������� ��� �������� � �# ���� ��� ������� ��� /������� �# ����� � ���/�� � � ���� � �� ���� -������� ������� ���-� � ����� ����� ,�� ��&����� � ���/������� ��� �� $������ #���� ��� � ��� -������� �� �������� � ����$� �� ��� ���� ����� � ����� ������ � � ����� ��� � ������ 0� �� ����� ������ � � ����� ���� �� #� ��� ��/ #��� �������������� ���������� � ��� ���������� ��- #� ��� �� ��� � �� �� ����� � ������ �� �� ���� �� �� ������������������� �/� ��&������ ��� ��� ��/ � 1���� 2�� ������� 0� �������� � ��- �120���-� #��� ��3������� �!������ �� .����� �� � �� �0���3� ��/ � �� ��������"� ��� � � ���������� ������� #������ �� ������ ������� � �� �� � �� � � �������� ����� ����� �������� ����� ���� ���� ��/ ������� ��������� � ��$��� ����� ���� � ��� �� �� �� 4���� �� � ��� ��- ��� #���� �� �������� ��� ������� ��/ ����� �� ,�� 120���- ���� � �� ��� #��� #� � ��� � ��� ������ � -3 �� ��� ���� -3 ���*�� ��� � -3 �� ����������� �� #���� ��� ������ � ���� �� $� � ��� � � � � ��������� ����� � � -������ ���� ���� �

� �++� �� ��� 0����

4�� ���5 ������ �� ����) -������ ���� �� ��� ���) ��) ��������"�� �)���� #�� ��� ���

6)������� �� �����

���� � 0� ��� �*� ���++ :���$��� ��

������) �9;��� ���������)

��� ��� �5

�����*�� ��

-��������� ������ ��������� �� ���� ��$�� ������������ ��� �� �� � �� �� �� 1��� ����$� � 1�������$� ������� � ���������� �� #���� ���� �� � �� ���$������ ��������� ������� �!��� � �# � ����� �� ���������� � ������� � $����� ��� ������� �������,��� �� � � �� � ��� �� ����� � �� ������������ ��� ���� ����� $����� �� �� �� �+ � �++ ��� � �� ������ ��� ���� #��� ������

� �++� �� ��� 0����

�� ����� �� ��� ��� ���� �� "� ���������#$ ��������

���&��� �&��� � ��!� �� ������ ������� A7������� �B'��� ������� �� ���� ��� ��$�������� ������ �� #���� �� ��� ��� � � ���������"�� � ��� ������ ��� ���� �� #�������� � ���� C� �� ��� ����� � � ��� �� � ��� �� �������� �� � ���� � � � � �� ���� ��� ��� ����������� ���������� #��� ��� ��������� ������ ������ ������� A 1������ �BD*��6� � ���� ������ �� � ������� ����� �5 ��� ��������� � � �������� � ���� ����) ���� ���� ���� � � ������� �) ����� ������ ���$�) � ��$� ���� � ��� � � ��"��� �6�$��� ��� �BB�) E�A ,����� �BB�) �� A ������� �B'D) <������ � A0������ �BB') 6������� �� ���� �BBB��7 �� ���� ����� �� �� �� ��8 � � .� � � ����

� �� �+F �� � �� ��� �� �� � ��� $��� ��#�� �� ��������� ������� �� �� �� ���� ����� ����� ��� �� �� ����� ����� ���������� � ��� $��� � # ��$��� � � � �� �$� ���� � �� ���#��� ���� ����� �� �������� �������� 2� ��� � �� ��������� � � ���� ����� �� #� � �� �� #� � ���� � ��� ���� ����� ��� �� �������� � � �� � ������� ������ #��� � ����������� ; # ����� ��� � �� ��������� � �� ����� �� ����"� ��� ������� ���������� ���� #� �� ���� �� ��� ��# �������� �� � ��$��#� ��� <������ � A 0������ �BB'��<����� � ��� �� �� � ��� ������ �� �

�� ���� �$� ���� ����� � ���� ������������ ��� � � ������� #� � ��� �� ��������� ,���� ������������� ��� ��� �$� �� #���� �� ���� ����� ���"� � �� ���� � �������� ��� �������� � �# ��� � ���� ��� �6������� �� ���� �B'B) �!� � A6�������� �B'.��6� ������ � ������ � ��� �� ��� �<7� ����

��� �$� �� ���� ��� ��� �# ��� �����$� �������� ������ �� �-�� �� ���� �BB�) ,� ��� ���� �BB�) <������� �� ���� �BB.�� <$� ���� � � � �� � �� � ��� ��� �� �������� � #��� ���� #��� � ����� #� �� $� � �� ��� ��� �� #��� ��� ��������� � ������� � ���� � � ����$� ��&������ ��� ������ � � �� ���� � ��9;�� ������ ����� �� �������� ������� �9��� �� �����BB��� ��&����� ������ �$� �� ���� ����� ������ #�� ������� � �!��������� ��"���� ������ ������� 0��6 � 0��; �� -������ ����������� ����"��� �BBB�� 6�� ��� ��� ��� �$� � ��3�� ��� �� ����� � �9;�� ������� ����� ���� #�� ��� ��� �G����HI� �BB.) 9���� �� �����BB') 7����� �� ���� �BBB�� 8� � ������ ����� �� � � ������$� �$� ���� ��� ������ �� ��������� ��� �������� � ���#��� ���� ���� � ������������ �$� ���� � �� �� ��$��� -������ ����

������� �7�� � �BB�) J ��� � �� ���� �B'+)7�� A E#�� �B'��� ���� ��� ��� ������ � ����� ����� �� ��� ������ �� � � �� #�� ���� ���� � �� ���� � �� �� ���� ���� � �, � �� �����BB*�� ������ �� ����� � -������ ���� ������� �� �� ��� ������ ���� ����� �� #� � �� �������� �� ���� ���� ����� ������ ���� �������� ���� ��8 K B� ����� � �� �� �� ������

-������ ���� �� ��� ��� �,-- ��*. � ������� ������� � � �� � ������ ��� �� �� � ��� ���� � ������ ����� �� ����� ����� ���� �6 ��� ���� �BB��� ����� ���� �� #� � ��� ����� ��������� � ��� �����$� �� ��� � ���( ��� � �� ������ ���� ���� ���� � -3 �� ��� ���� � � ���� ������ �� -������ ���� ���*�� ��� � -������ ������ ������� ��� � � � ���� ���� ����� �6 � �� �����BB*� �BB.�� ,�� -������� ������� � ��� �������� �� #� D+F�B+F ��������� 2� ���� � � � �� #� ����$� � � ��� /������� �# ����� � � ��� ���� ������ L�+F �6 � �� ���� �BB�) -�������� ���� �BB'�� ,���� ������� �������� ��� ��� /������� � -������� ���� � ����� ���� ������ � �������� �������� ����,��� # �� �������� ��� �� ��������� � ��� �����

������ ������ � -3 �� ��� ��� �,-- ��*. � ���� ����3��� � �� ����� ���� � �# ������� ���� ,�� 3��� ��� ��/� #���� � ��������� /������� �# ����� � � ��� �� ����� #�� ����3� � ��� ��������"�� � ��� ����� ��� �� �������� � * �� �� ��� ������ � ���-������� ��� ,�� -������� ������� ������ ����� ��-� #� � �� � �� ��� ���� #����� ��� ��� ����� �� � �� ��� �����3���� � -3 �� ��� ��� ����� ������� � ���� ���� �� ��������� � ��� /������� ��� 2������ ����� ��������� � ����� ���� ���� ��/ ������� ��������� � ��� � ��� �� ���������� ������ ���� � ��/� #� #��� ��� � ���������� �� ���� � ��� � � ��� ��- �� �� ���#�� ����� �� ���� �� 4���� � ��

���*���

#2���� �� �� ������� � ��� ������ � �������3#

8� �� ���� �� #� � � � �� ��� ��� ������ � ��� -3 �� ��� ��� � �� �� ��� � � �������J ��� � �� ���� �B'+) 7�� A E#�� �B'�� ������ �� ��������� � ��� ������ � ����� ������ ��� � ���$� ���� ���� ��$������� � C���� ����"������������ � ��� �� ��� #� ����$� ��� ��� ������ � ���� ����� #� ����� �� ������� � ��� �-3 ���*�� ��� #���� �� � ���&�� ������ ����������6 � �� ���� �BB.) 9 ��� �� ���� �BB��� , ���� � ������������ ������ � ��� ���� ���� � ��� -3 �� �7�� ��� ���� ������ ����� ���� #� �!����� �� #� �� ����� �� �# ����� �� �� ���� ����� � 79�-� � * 7 9�-� � �������$���� M��� � 7 9�-����$��� -3 �� ��� ��� ��������� ���� �� �����#��� ������ � ����� ��� � � ����� ����� 7 �� ���� ����� ����� � #�$��� ����� � ��� ���� ������� � � �� �� �!����� �� $��� ���� � �#��� * 7 9�-� �2����� ���

�� ����� ������� +�� �� �� ������� � � ���*� ����� �� � � � ���������

����� ���� �!����� �� ����� #��� * 7 9�-�������� �� ��� �� � �� $� � ��� ��� �� ������� � ���� #���� ����������� ������� �

������ �� ����0�1< � ���"� ����� ���� 9�-��!����� �� -3 �� ��� ���� 9�� �� � 7 9�-� �!���� ����"�� ��������� ����� �) ��� �� � 7 9�-� �!���� ����"�� ������ ����� �) ��� �� * 7 9�-� �!���� ���"����������� ����� �) ��� �� * 7 9�-� �!���� ���"�������� ����� �� 9�� 7� �� ���� ���� ��� �� ���� ����� ���� ������

������ � <����� � ��� ������ � ��� �� �������� �� �� ���� � -3 �� ��� ��� �,-- ��*. ����� ����� ������� ��� -��������� ������� ����� � ��/�9 #� �� ��� ���� � �����$��� ����� ������������ � ����� ���� � �� �G0�� � ��� ��/ �� ���� � ��� � ���� �� 3� ��� ���������� �+ ��� 0 #��������� � ��� ���� � �����$��� ����� ��� ����� ���� � ��� ��/ �� ������� �� #��� ��� ���&�������� �� ������� ,�� ������ �� ������ !�� �� �� ���� �� � � �� ��� � ��� � �>���. �( �� ��� ���� � �������� � - �� �� �� � � ��� ��� ����� ���� � ��� ��/������� � � �� �D �( ��� ���� �� G�� �������� ������� �� �� ��� � ����� ���� �� �����"� � ,# ��� � ����� ����� ���� ���� ��/ ������� ������������� �� �� ���� �� � � ������� �� ���� ,�� �� �� �4���� � ������ �� � � � ����� ���� � ��� ��/� ,������ ���� �� �#� �� � � �� � ��' �( � � � *� �( � � � �+� ���� ������ #��� ��� �� ������ �������� ,�� �������� #� � #� � ��� � ����� ���� � �� ��� ���������� ���� ������ ��

����� �� ��� ��� ���� �� "� ���������#$ �������� �!

���� ���������� �� <7 �� #� ��� �� #� � �� �� �!�����$��� � ���� � ������������� ������ � ����� ���� 7 � ����� ������ #��� � � ����$� �� �� ����� � � ��� ��� - ���� � ���� * 7 9�-� �!���� ���"�� ��������� ����� ������ ��0� ����� �� �� ����0�1< �� #� ��� ���� ����� � � ����� ���� ����� �� � ����� �� 2 �� #��� ��4���� � � ���� � ����� ����� ��������� � ��� # �� ��� ���� � ����� ��� �� ����� #� � �� � ����� ��������"� � ��� �� ��� ����� ������� ,�� ����� ���� � �� ���������������� � $����� ������ � ��$��� �&��� ����������� � �G0� �2����� ���� � � �00�� �G0<� �G01 � ����� � � � � �� #��� ; #��$��� � �00- � ������ ��� ��� ���������������� #��� � �� � ������� � � ���� � �� #�� ������ � ��� ������� � �� � ��� ��������� ���� � � ������ ��� ����� ���� ��������"� #��� ��� �� ������� � �� �� ����� - ���� � � ��� � #�� ������ � ����� ���� ������� � �� � �G0� #��� ��� � ��� ������ � �� � -3 �� �7�� ��� ����� �� #� ��� ��� ������ #� ������ #��� ��� ����� ��� � #� � ��� ���� �� �� ����G� � ���#��� ��������� ����� ���� � �� ������ �������� 2� ��� � #�� ������ �� #� � ����� � ��� ���� � ��� �� ���� ������� � #���������� � ��� ��� � ��� � ������� � �� ���� ���� � ������ ,���� ������� ������� ��� ��� ���� ��� � ��� ���� ���� �� �����$��� �� � �� ���#���� ��� ����� ��� �� �� �� � �������

�4��� �� ��� �� ������� � ��*�� �� ��(� ��������

����� � ����� ��� � #�� ������ � ��� ������ � �����$��� ����� �� ������� � �� �$�� �� ���� � ������ #� � �� ��� ����� ������ ������� #��� ���� � ��� � �G0�� � ����#��� ��� � � ��������� �� 4���� � ��

�� ����� �� ��� ��� ���� �� "� ���������#$ ��������

2����� ��� �� #� ��� ���&�� ������ � 2����� ���� �� #� � #�� �������� 9����� �������� �$���� $�� ��$��� ����� ��� � ��' �( � � � *� �( � � � �+� � ����� �� �� � ����0��� �� � ��� ���� � � �D �( #��� ����� � � �������� � � ��� �� 4���� � �� ,�� � #�������"� �� � ��� � �� � �� �� #� � � �� �� �� � �2����� ����� � � ������ �� ��2����� �� ��� G�� �������� ����� #���� � �������� � ����� ����� �� �����"� �� 2����� �����<�� ��� �� #� �������� � �� �� ���� ������� G�� ���� ���� #��� �� ������ ��������� �#� �� 2����� �� ���

,*�� ��� ��5*���� �� "����� ��� � ����� �� �� � ��5*���� ������ � �� ����������������� ���� ��

��&����� �������� ��� � �� ��������� ��� ����� �� �� � ��������� �������� � � 3���������� � ��� ��������� � � ����� �� �� ���� ��� ��$��� ��� ����� ���� �� � � �� ��# ���� �� #��� &���� �������� ���������������������� � � �� -������ ���� ���� ���� ��&�������� #� ������ � ����$� ����� ��&����� � ���� �� ���� ���� � /������� ���� � ���B+�� �� ���� ���� � $����� �� �� � �� ���� � ����D�F � ������� � -������� ���� ������ �� �� ���� ���� � � ����$� � � ����� � �DD�BBF � ������) 2����� ��� � ��������� ��� ��� /������� ���� �� � ��� � �� �� ������ $�� ������ �� $���� ����� ��&��������$��� ��������� � �� �� ����$� �� #��� ������3��� � ����$�� � ��� �� ���� ��� ��' � ��� � �.� � �+' �� ��� �������� 2����� ���� ���� � �� �� ������ ������������ ��� � �� ���������� ��� ���� � �2����� ���� �� #� ��� ���������� ��� /������� ���� � � ������ � � ����������#����� ��� -������� ���� � � ����� ��������� �� ,�� �� � ��������� �� � � ����� �����2����� ����� �� #� ��� ��� /������� ���� �� ������ � ��������� ��������� � �� � ������ � �� � �� ��� �� �� ���� ���� #���� ��� -������� ���� � �� � �� �!�����$��� � ����� ��� � ������ �� �� ���� ���� ,��� ��������� ���� � ��������� �� �� ��N���� �� ��� ��������� � � � ����$��� � �����$��� ����� �� �� ���� ��� �2����� �� ��� ,�� /������� ���� � � ������ � �� � �� �����$��� � � ����$�������� ���� ���� ��� ��� -������� ���� � �� ������� � � ����$� ������ ������ 7������� �������� � ��� -������� ���� �� � ��� � �������� �� ����� � � ��� ���� ��������� ���� �� ������� 0��6 � 0��; �1������ �� ���� �BB.)0� ��� � �� ���� �BBB� �� #� ��� �������� � ��� ��� ������ ��&����� #��� �# � ����$� � 4���� ��� ���� ���� ��� � ����� � ���� �� ����� ������ ��&������ ,�� ��� ������ ����������� � �� #� ��� �� �������� � � ���������&������ ������� � � ��������$� -���������� �� ������� ��� ����� � �� ���� �� � !��� � ������ � ��� ���� ������������� �$ � <�������������� �� ���� �BB�) M���� �BB�� �2����� ���

������� � ��� ���� ��� ���'��/� ��������� � ��� 6���� ��� ��5*��� �"

����� ���� ���� #� �� �� �������� � �������� ������ � ���"� �� ����0�1< � M�������� ����� �2����� *�� �� 4� �� �� ����0�1<� �������� � ����� ���� #��� ������� � ��� ����������� � ���� ����� � ������ #��� �����$� ������ �� ���� � ��. �� � �� ���������� �� #��� �� $���� � ��� �* � �' ���,������ #��� :' �� ���� ���� � ���� ������� #��� � �� � ��. �� � � �� ��� �� ���������� ����� ������ � � � ������� ������ ��� �. ��� M������ ������ ��$��� �� � � ������� ����� ��� �� �� �� � �� #���,�� / ������ � ��� ����� �. �� �� ���� �������� #��� ������� � � �� � �� ��� ����,,8/� ,��� � ����� � � � ��� / ������� ����� ����� ���� �6 � �� ���� �BB*�� ,�� ������:'������ � � ��� �� / �������� #���� ��� /������ � �# ����� :'������ �� #��� /�,8,� ,/:�,� � ����� � ��� � �� �� ���� ���.' � D� � ��� � ��D � ����� �����-/6� ������� � ����� ���� ������ ���� � ��

���� ������ 7�� ���� �� � � ���� � �B�� ���� � �# �������� � �!����� � � �B�D �� � ���' �� �� ����� � ��� � ��� /������� �# ����� � � ��� -������� ������� � ����� �������������$����� ����� ��� ���� ����� ����� ��������� ��� ���� �� M������ �� �� #��� ��� ������� � � #��� ��� ��� ������� 8� �� �������������� ��� �B�D �� -/6� ������ � �����$� ������ �� �� ����0�1< � ��. ��� ,��-������� -/6� ������ � ���' �� �� #� � ������ ������ �2����� *��, ������� ��� ������������ � ������ ���� ���

�� ����� ���� � ��� ������� ������� -3 �� ��� ���#� �� ����� #��� ����� #��� ������� � 9���-�#���� �$� � ����� �����3���� ��� �������������$� ������ �� ����* *����� �+ �����������$����� ������� � #��� ������� ������� ����� � #��� � ������ ������ �� ��. �� �� ����0�1<� �� #��� ��� ���� �� ���� ����� � ���$� ����� ���� � #� �� ����� � ����� � ���� � � �� ����3� ����� ����� ������� �#��� 9���- � � � �� ��� �� $������ ���� #��� ���� � ����$� �� - ���� ������� � M������ ������ �������� � � �� #��� <!����� ����� ����� � #�$�� #� ��� � �� 9��-�

���� �� �� 6���� ��� ��� ����� ���������� � ��"����� ������� +�� � �� ����

,���� ��� ����� ���� � #��� � �������� � �� ��� ��� ��� /������� �# ����� � ������ � ����� ���� ���/�� �� ��� ��� ��� -������������� ���-� ���� � 1���� 2�� ������� 0� �����120� � �� � ������� 120 ���� ,�� �� �����#��� ��3������� �!������ �� .����� �� � �� #���� /������� ;����� � #��� ����3� �� ����3���� ��� � ������ / ����� ��� � �� �� ����� ��� �!������ ��� -������� ���� � ���� ,��� � �� �� � ��� $��� ���� �� �������

����� �� ��� ��� ���� �� "� ���������#$ �������� �%

� ��- ��� ���� ��������� #��� ������� �� ���������������$���� � �!������ ��- ������ � � ��� �������� �� � ��� �������$��� � �� �� ����������,�� ��/ ����� � #� � �� � ������� � � ���

� � �� �� ����3� ��� �� �� �������� � �� ��� ��� ������ ������ ���������� #� � �� � � �� �!�����$��� � ��/ � �� #� �� ����0�1< �2����� .�� 0���3� ��/ ���� � � � � ��������� �� ������� � ��� � ����� ������� #��� ��� � � ��������� ������� ��/� �� �� ������� #��� ������ ������� � ������� #��� �� �� � ����� ���� ���� �2����� ���� � ����� �� ����� ���� ���� ��/ ������� ���������� #� ������� � �� #� �� ���� ������ �� ������� �� � ��� ��/ � �� �� �� �� 8�2����� ���� �# � �������� � ��������� ���� ���� #�� ,�� �� �� ���� ������ � �������� ��� �� ������ ���� �� � ���� �� ��/ ��� �� ����� ���� �2����� ���� � �����,�� 120���- ����� � #� ������� �� .3 �� ��

� ����� � � � � �� �� ����3� �� �� ���$�� � ��� �� ������ 2����� D�� 120���- #� �� #� � ��� � -3 �� ��� ��� ����� �� #���� ��� ������#� �� $� �� ������� #��� * 7 9�-�� ��� � �� ������� -3 �� ��� ���� � � -3 ���� �2����� D��2�� �������� ��� �� �� ��� ��� �� #� ��� ��������� #��� ������ � $��� #��� 120���- �� ��� #��� 120���- #� �� �� #� � ��� � 9�-������� -3 ���*�� ��� � -3 �� ������� /������ �����3� /������� ������ ���/� � � 120 � �� � ������� -3 �� ��� ��� � � -3 ���� �� � �� #���

� ��*�� ��

������� � �������� ������ ����� ������������� � ������ ������ ��� �� ���� ����� ��$�������� � �� �$� �� � � ��� ���� �� � �� �� � �# ��� � ���� ��� �6��������� ���� �B'B�� 8� ��� ������� ��� � #� �� # ��� ��������� � -3 �� ��� ��� �,-- ��*. � ����� ������ ���� �� �� ������ ���������� M� �� �� #��� ����� ���� � ������ � �# ���������� ���������� ��� #��� �������� ������ ��� ���������"�� � �� � �������� � ��� /������� �# ����� � � ���� #�� ��� ��� �� � �� ����� -������� ������� � ��� ������� , ���� #�� �� ���� �� ��� 3��� ���� ���� � � #���� � ����� ��������"�� � � ���� #�� ��� ��� ���$� ���� � ����3� �<����� � ��� ������ � ����� ���� �������

�� #� � �G0� �� #� ��� ��� ������ �� �����"� �� � ���&�� ������ #��� �� ������� ,�������� ������� � ����� � � �� �� � �� � ���� ������ ������� � -3 ���*�� ��� �,-- ��+�D����� �9 ��� �� ���� �BB��� ,�� ������ ������ ���� � ��� ������ � -3 ���* � �� ��������� � #�$��� � ���� ��������� � ����� � � #��� ��� ������ � �������� ��&����� �������� ���#��� ������� ����� � ����� ������� �:� ���I� �� ���� �BB���,�� �������� � �# ��� �� ����� ���� #�

������� �� � ������� � � �� ���� ����

��&������ �� ����� ��� ������� ����� ������� ����� � /������� ���� � ���B+ �� �� ���� ���� ��� �� ������ $����� �� ���� �� ���� ����� � � ������ � ��������� ���� �� � �� � ������ � �� � �� ��� �� �� �� � ������ � ����$� -������� ���� � ����� �� �� ���� ���� ��� �� � �� �!�����$��� � ����� � �� � ������� ���� ����� �� �� ���� ����2����� ���6� �� �� ����� ������� #� #��� ��� � �$� �

����� ���� ��� �# ���� �� #��� ���� � ������ � ��� � �� �� ��� ���� �� �� � ����� �������� ,������ � ����� ���� #��� ������� ���� ������� ������� �� ��� � ����� �� $� ���� -������� ���� �� ���� ��� ��+ �� ����� ��������� � ������� ��� �� �� ������ ��� ��������� � �� � ������ ������� � ��� ����������$�� ������ ,���� ����� �� ��� -������� ���� ��������� �� ������ ��������� � ����� �� �� �������"���� ����� ������� ��� -������� ������������ � � ��� �� � �� ���� � �� �� ������ �� M������ �� ��� �$�� ���� �� ��"������������,�� -������� ���� � #� ������ �� �������

��� � � �� 9���-� #��� ����� ���� #� ������� ���� ������� ������� ,��� ������ �������� ��� ���-������� �� �� ����� ��� # ��� /������� �� � �� ��������� ��� � ������� ����� ��� � ��� ��� ��� ��� � ��� � ��� �������,�� �������� � �� ���������������� � �� �������������� ���� �� �� ���� � ������ � � ��$���� ���� ����� �;���� A 6���� �� �BDB) -�� �� �����BB�) ,� � �� ���� �BB�) -�� �� ���� �BBD)<������� �� ���� �BB'�� 8� ������� �� ����������������� ���� �� � � ��� ��� ���������� ����� ������� ��� �� ������� ���� ���� #����� ����������� ���� �� � � ��� � ��� ����������� ,��/������� �# ����� � � ����� ���� ���� �� ����� �� �� #��� � ��� ��������� �� #��������� ���� ��� �� �� ����� �� �� �� ���������� #���� ��� ����� ���� ��� �� ��� -������� �� �� �� ���� � ��� � ��� �� ������� � �� �� ����������� � �� �� ����� �����2��� �� � � � ��� �������� � �# ��� #�

����� �� ������ �� ������ � ��� �# ���� ��� � ������� ����� ����� � ������� ��� /������� �B+ �� �� ���� ���� ��������"� ��.3 �� � �� ����� � � � ��������� ����������� ���� #��� ��� �� ������ ������� ��� �� � ����� ����� �� ������ ��� �� ��� ��� ��������� � � ��� � ��� � � ������ ������� ��� ����� #����� ��� /������� ��� ,�� � ��� �� �� � � ��/ �� #� �������� � ���� ���� ������ ��� ���� ��������� �# ��/��� ��� �2����� ���� � ����� ,�� �� ���� ��/ ��� �� �� ������ ���� �� � ���� ������ �� ����� ����� �� ������ ��� ��� ��- ���� ����� ���� �� � ��� � $� � ��� #� ��� �������� ��� #� ���� ��� ���������� � � ��� ���� ���� � (3 ������������ ���

�,-- ��B'+ #��� 1���- � � (�� ���� ������ ���/,-- B.+� �� ���� ���� � �� ���� ����������� � �� �������� � * �� ��� ������ �!��������

������ ������� ��� ���

�� ����� �� ��� ��� ���� �� "� ���������#$ ��������

� � ��� �� ���������� ����� ��� ������� �$�� � ���� ��������"� � ��� � ������ � ��� ���������"�� � �� � �� � � �� ������� � ��� � � ������ �� � �� �� �#� � �� #������ ��������� � �������� ���� �� �� ������� ��������� �� ��� ��� � � � ���� #�� �������<������� �� ���� �BB') ;���� A 6���� �� �BDB��

,�� ������ � �� � ��� -������� �� ������ ���� �� ���� #�� ������� #� ������ ����� ��� �!��������� ,�� -������� ��� �� �� ���� ��� � ����� ���� ���-� ���� #��� 120��3������� � �� � -3 �� ��� ���� -3 ���*�� ��� � -3 �� ������ ����� �� #���� ��� ������ � ����������� � ��� � � � � ��������� -3 �� ��� ��� �

7

������ � �� �������� � ��� � �� ��������� ��� ���� � ��� � ��� ������� � � �� -������ ���� ���� ������&������� �� � ���� ��� �� ���� � � ������ � D*F � ������� 0�� ���� ��������� �� �� ���� #��� P � ������ � #��� �� ,�� ����� ��&����� ���$�� ����� �� �� ���� �� ��� $������ �� #� ,�� ������ � ����$� �������&������ � -������� ���� �� �� � !� #��� � ����� �� ���� � �# ���� �� � �����$��� ���� � ����$�� ��� ��� $����� /������� ���� � �� � !� #��� �� ��� ����) ��� ��� ���������� � � ������ ���#��� ��� ���������� ���� ��&������ � � ��� /������� � -������� ���� � ��������) ��� �� � ��������� � ����� ���� �� � ��� � E����� ������ ������� #��� #�� # � ��$�� �� �� ���� ���) � � ����� ��������� � � � ����� ���� $���� $�� #�� # � 3$� �� �� ���� ���) ����� ��&����� �� �� � #��� � � ����� � �� ���� ��� � � �� �������� ���� � -3 �� ��� ��� �,-- ��*.) �6� �6��� ���� � -3 �� ��� ��� �,-- ��*.) �;� ���� ���� � -3 ���*�� ���-/%O 'B�) -�>-���� ���� ���� � -3 �� ������ J-7 *'�+�

����� �� ��� ��� ���� �� "� ���������#$ �������� ��

-3 ���� � 2� ����� ������� #� � ���� � ��� ���-������� ���� � � ����� ���� �� �������� � ���3����� � � ���� #�� ��� ����� 8������������� ���-������� ���� � �M� ��� � ��� ���� ��$�� ���� ������� 0��; � -3 ���*�� ��� -/%O �� � 0��6 � -3 ��������8 ������ ��������� �� #� ��� ���������� � ��� -������� ���� � � -������ �������� ����� �1������ �� ���� �BB.) 0� ��� � �� �����BBB�� ,��� ���� �� ��� �� ������� ��� ������ �� � � ������� � ��� ���� ����������"��� �BBB�� ,�� ��- �� � � ����� � ��� ��� � ����� ���� ����� � ������ � �� ������ � #� � �� � � 0��6 � 0��;� 8� �������� �# 4���� ��� ���� ���� ��� �� ��������� ���� ����� ��$��� ��� ��� ��� ������ ������� ���� �� �� ������ � ����$� �� ������ �� ������� ��� ��� � �!��������� ����� �������������� �� )���� � �� � 9� �� � !�� � � �� ������������� �� ���� ;�0*+ �� -3 �� �7�� ��� �$ � <�������������� �� ���� �BB�) M���� �BB�)1����� �2�*+��B�� ,�� ������ � ��� � �� ,������ ��� �� � �� ��� ��� ���������� ��� ��� ��� � �� �� ���� ������� �� G�� � �� ����

���� ���� �9;�� ������� ���� ���� �� ����������$�� 8� �� �� ���� ��� ��� �� �� ����� ���� ����� ��� � ������ � ��� �� � �� ��� ���� ��� �� ��$ �$� �� ���� #�� ��� ����2������ ����� 3� ���� ������� ��� ��� �� ������� ��� ���� �� �� ���� �� ���� #�� ������� � -������ ���� ������ �� �������� �� ���� ��������� ���#��� ���� ����� �

��� ������ � �� �� � ���� ������ �� ��� ���������� �� $���� ������ ���� ����� � ��� ������ �������� ���� ��8 K B���� #���� ���� ����� � �� ���� ������� ����� ��� ������ �� �� �� ��8 ��.��G�� ���� ����� ��������"�� � �!�������� ���������� � ����$��� ����� �� �� ���� ��� ������ ���� ������� #��� �����$� ������ � ������� �� �� ���� / �$���� ��� �� #����������� � � ��������"�� �� ����� � ����$�������� �� �� ���� ��� ����� ������ � � � �������� #��� ��� ������ � �� �� ���-������� ���� � � ����� ����� ����� 3� ���� ����� �� ��� ��� ������ ���� ���� �� ��� �� ������� ���� ������ ����� �������� �� ��� � �� ����� ��� � ��� -������� ���� � � ����� ���� �

������ �� �������� � �# 4����� ������ ������� �� ��� -�������� ���� � � � �� ���� �������� ������� 0��; � 0��6� � ������������� ������ ������ ���� ;�0*+� C�������� ��������� ���� ���� ��� #��� � � ������ � *+F � �� � � #�� ���������� � ������ ���� ��� *+F� ,��� ������� �� ��$�� �� ��� ��� ������ � � ���� ,# � ���������&������ � ��������$� -���������� �� ������� ��� ����� � �� ����� �� � !��� � ������ � ��� ����� ������������� �� �� #�� 8� ���

3��� � ������� ��&����� �$ � <��������������� ��������� ������� �� ���� ������ � ����$� ���� ���� ,�� � � # ���� ������ �� & � �� ��������$���� 8� ��� ��� � � ������� ��&����� �M���� ����� ��� ������� �� ���� � � ������ � *+F � ������ � ��� � ���� �� ��� �� ! �� $������ �� ����� ���� � -3 �� ��� ��� �,-- ��*.) ��� �6��� ����� � -3 �� ��� ��� �,-- ��*.) ��� �;��� ���� � -3 ���*�� ��� -/%O 'B�) -��� ���� ���� � -3 �� ������ J-7 *'�+)0���� ���� ������ �� ���� �� ������ 0��; � -3 ���*�� ��� -/%O ��) 0���� ���� ������ �� ���� �� ������ 0��6 �-3 ��������8 ������ ������ ���) ;�*+� ������������� ������ ���� �� ���� ;�0*+ � -3 �� ��� ��� J-7 �+�'� ����3!�� � � � �� ���� ����� � � �� ��������$����

� ����� �� ��� ��� ���� �� "� ���������#$ ��������

� � ����� � ��� ���� #��� ,�� ���� ��$�� �� ���� ������ � � �� ���� 1��� ����$������� � ����� �� ��� � ������ ���� ���� #������� �� �� � ��� ����� �� �� �9,��� 9,� �������3���� ��� �� ����� � #� �������� ��� ��� � � - ���� � ���������� �J �&���Q��� �� ���� �BBB��,�� � � ������� �� ��� ���� #�� � -3 �� ��� 7

��� ���������� #��� ����� ���� ��>�� � ������ ����3� ��� �� � ���� ��� ���� ����� $��� ����� �� � � � ������ �� -3 �� ��� ����-3 ���*�� ��� � -3 �� ������� ����� ��� -��������� � � ����� ���� ����� ����� ��� ��������� ,������ ������ �� ���� ��� �� �!�������� �� #������ ��� -������� ������ � ����� ���� ��� � �

������ �� M������ ������ ����� ����� � - ���� ��� ������ ������ � � ����� ����� ����� ���� #� ������ :/6� �-/�� 0���� �� #��� ������ #��� ������ � ���� ������� ,�� �� # �� ����� ��� � ���� � � ����� ���� ��� �

������� -3 ���*�� ��� � -3 �� ������ ������ 8� ��� �� ��� ���� ���� ��� � �� -3 �� ������ ��������� ����� � ��� ���� #�� #��� ���������"� �� -3 �� ��� ��� ��� #� ������� ��� ���������� � �� �� -3 ���� �7��HI��" �� ���� �+++��,�� ��������� �� ����� ��������� � ���

/������� ���� � � ��� ���� ����� � -3 �� ��� 7���� -3 �� ������ � -3 ���*�� ��� ��� ���� ��� ��������� �� ������� � ����� ������ �� ���������G�� 3� ��� ��� ���� ��� ����� ����� ���� � � ���� #��� ���� ���� � -������ ���� �� ���������� ��� ���� $��#� 7 �� $��� ���� ���� � -3 �� �7����� �� � ��� ������� ���� � � � �����"� � ����� ���� 8:� #����� ���� ���� ��

����� ������ ����� � ����� �� ����� ���� �� �� ������ #��� :'��� ���� �:'�� ��� ������� �-�� ������� �,��� �������� 7� ��������� �� ����� ��� �� ���� �� ������

������ � ����0�1< � ���"� ����� �� � ����3� ��/ ����� �� 0� ������ ����� �) �� ��������� ����� �)7� ��������� �� ����� ��� �� ���� �� ��� ���� ������

����� �� ��� ��� ���� �� "� ���������#$ �������� �&

-3 �� ��� ��� ���� ���� �� ����� �, � �� ���� �BB*��,�� ������ � ��� � � ����� #� � �� � ���� � �� �� �� ���� ��� � � �'D � ���-3 �� ������ ���� ����� ������� ��� ��� /������� �� �� �!� �� � ��� �!����� ����� �������RR�� ���� �+++�� ������� ���� ���������� �� ��������������� � � �� �� ��&������ �� !� #��� �� ��� ���� �� 2����� ���� �� ��� /������� �� #��� � �� � �� � ����$� � ,���� �� �� ���� ��� � ��� ������ � �� �� ���� ���������� � �� �������� ��� ������� ��������� ����� �����8� � ������ �� �� � �� # ��� ����� ���� ��

� � �� � �# ��������� ���� 8������� ����#��� � ��� � ��� -3 �� ��� ��� ������ �� ������� �� ��� /������� ��B+ �� �� ���� ��� ���� #���� ��� -������� ���� �� �� ���� ��� �3�� ��� ������ � ���� � ������� #��� <����� � ��� ������ �� #� ��� �� ����� � ��� � �� �� 4���� � � ��� ��- �� ����� ����� ���� �� ���������� ,�� /������� �� ���� ��� ��$�� ���� � ���� � ���������� ��� ������� � ������ �� �� ������� � ����������� ,�� -������� ��� � #�$��� �� � ��!� �� � ��� ��$�� �����

,��� ��� ��� ,������

!���� �� ��� ��% 7����� ��� "�/�� ���� � ���

-3 �� ��� ��� �,--��*. � -3 ���� �,-- �B� #��������$�� ��� ������ �� 7%� �� �� ����� � � �D �-� 8�������� *++ � � ���#�� 7%� � �� #� �� ���

��� �5�++ �$>$� #��� � $������� ������� � ������#��� ��$���� ����� ��� �!� ������ �� #�� ������.B* � +�D�� ������ �� ���� ����#���� .3 �� 7�*S�%<0�T �U����� � .3 �� �;*� �0������ ,��/������� �� #��� �����$�� �� ������ �� 9��� 6������ �� �96 � ��� � �D �-� M��� ��������� � �#��� ���������� #��� ��*F �#>$� �� �� � � �.3 �� #��� �������� ��++ ��>�� � > � ��������* ��>���

�6� ��� �*��� ��

0��� �/� #� �� ��� ����� ��� ������ ������� �� ��� ������� �� 6���� � A � �� ��BDB� � ��������� ,����+ � ,����++ � ���� �U����� �� � ���� ��� ��������� �� � ��� ��������� %�������� � �� ���������� ���� ,� �/� � ������ � ,� �/� �����#��� ��� �� � ��� � ��� ��������� �� � ��� ����������� �1��� 6%9 9��� ,���� � ���� � /�# <���� 6� ����� ������ � � �/� ������� �� �� �� ��������� �� ������ ����� � � �/� ������� � ������������ ��� � #��� ���� �� � ������� ����� � �� ��� ��B'B�� �/� ������� #��� �� ��� �� �� �� ���� #��� U�&���� 1�� <!����� � E���U������ 0-% #� ���� �� #��� �����,& �/� � ������� �� � ��� � ��� � �� �� ����� ��� 0-% �� � ���� #��� ������ �� �/� ��&��������

��� � ������ �

0� ���� ����� #��� ���"� �� ����0�1< ����� �� �� � ��� � 9��� ��BD+� ����� ������ ������ �6� � � � 0�������� �0������ 0� ����� #���$�����"� �� - ���� �������� ���� ������������� ���� #� ��������� � ���� ������ �� ������� ������ #��� ��� � ���� �� �������� � ������� �� 6 � �� ��� ��BB��� ;���� �������� �� �����#��� ������ #��� ��� %1��;�� ��� � ���� �� �������� �U������ 0� ���� � �������� �� #��� ������� �� ��������� ����� 6�� � ��� � �9 #��� �B*���

#2���� �� �� ������� � ��� ������ �� ��������� � ������������� ���*���

����� ���� #� �!����� �� -3 �� ��� ��� ���� ���$������ � ����� �� ����������� � ��+�+++ �� �+ �������� �-�� ,�� ���� ������ #� #��� ��� #��� �� $ ��� � ������ ������� #��� �#>$�� �!����� #��� +��$ ��� � � 7 9�-� � ���� � � � �+ ������ � � ���������� � ���������� � ,�� ���� ������ #� �����!����� #��� +�� $ ��� � * 7 9�-� � � �� � �� �� ��������� � ���������� ��� ��� 6 �� 9�-��!����� #��� 3����� ��� ��� � +�� � 3���� � �!�����$��� ���"� ����� *+ 7 ,����;-� ��; D�*��,�� ���"� �!����� #��� ���������� ��+�+++ �� �+ �������� � �-� � �0 � �� #��� ���� � � �- ����� �����������

������� +�� �� �� ������� � �� �������� � � ���� �/��� ��������

9��� � ����� #��� � �� � ��� � ��������*+ 7 ,����;-� ��; D�*�� � � ������ ������ �������� � � �� �* /> ����� �BB��� -�������"�� � ����� ������� #� ���� �� #��� ��� �� ����� ��������� � � �������� � D++ ��>�� ����� ���� � ���� �#� � � ��� ������� ��� ��� � ��4���� � � �� � 3�� �� ���� � �������� � � *+ ��>�� -�������"�� �

������ �� -��� #�� ��� ��� � 120���- � 9�-������� �� -3 �� ��� ���� ��� -3 ���� � ��� -3 ���*�� ��� � � �-3 �� ������� 1� . ;�� 120) 1�� . ;�� 120���-) 7� ��������� �� ����� ��� �� ���� �� ��� ���� � ��� -3 �� ��� �������� ��� ,�� ���� ����� ����0�1< � ����� ����� M������ �� �� #��� ��� . ;�� ���� ���� ,�� �� #� �� ���� ���� � � � �� 120���-� 8����5 ����0�1< � ����3� 120���- �1��� ,�� �� # �� ����� ��� ����� 120���-���� � �� ���� ��� � �� ���� 7� ��������� �� ����� ��� �� ���� �� ��� ����� ������

�� ����� �� ��� ��� ���� �� "� ���������#$ ��������

#� ���� �� � � �� ���� ����� ���������� � �� ���� ����� �� ���� ����� � �� ���� ������ �� ������ �� ����� ���� ����� �� �� ���� � ����� ���� ����� �� ������ � ������ ����� ����#� �� �� #� � ��������"� � ��� ���#��� ���������

#������ � ������� ��� ����*�� ��"� ������ �"

����� � � ������ � ��� �� �� #��� ����� �� ���� ���� ��������"�� � �!�������� �� �� ������ ���� � � �� � � �$�>��� ��� �� ������ � ��� �� ����� ��� � � ��� ���� ������ � � ��" ����� ���������� ���� �� ������ ������ ��� #� ���� � ������ ��� �� ������� � � ��� ��� ����� ������� ������ � ��� �� ��� ��� ���� ����� #��� ����� ������� � ��� ��� �� ����� #��� #��� ��� #����� � ���� ����� #��� �F �#>$� ����� ����� � ��# ������� ��������� � ��� � � � ����� ���� � ��/������� #� ���� �� #��� 0������ -7�+ ��������� � ������ � ��� �� �� ����� � '+ �:� <����� ���� �� �� � � ��������� ������ #� ���� �� #��� 0������ -7��+ �������� � ������ � ��� �� �� ������ � ��+ �:� 7��� ����� #��� ��� � � �� �� � #� �� � � ��� �� #��� �� # ��� --� ��� �1�,�/���� DB�� #��� ������� ���� ��"� � �� � �� ������ � ��� � ��!�� ��"� � * �( � ��� ������� ��$��� � � ��� ���3��� � � �*���*�� <����� � ��� ������� #� ���� �� #��� �3� 8��� � ��#������� �E������ A 6���� �� ���������� ���������

������� � ��� ���� ��� ��"���� �� �� ������� ���� 6���� ��� ��5*��� �"

-/6� ������ � � ����� ���� #� ���� �� � � ��� �� � � ��������� �� � � � . 7 1�;-�� +�� 7;-� � ������� � � � �� ���� � *+ � � -/6������� ������ � ��� � ���� � #� ���"� ����� ����$ ��� � *+ 7 ,����;-� ��; D�*�� ����� ���� ��� ��#� �� �� �������� ������ � � �� � �� � �D �- #����+ �� � ������� ������ * �� � 9���- �6 �����������+ �� � ��� ������� ����� �� �* 7 ,����;-� ��; '� � �+ �� � :' �� ���� ����� �� �* 7 ������ ��� ��; D�'�� ������� � #� ������ �� � ����� � ���� ������� -3 �� ��� ��� ����� �� � � � � � ����������� #��� #��� #��� *+ 7 ,����;-� ��; D�*� � �������� � �� �++ �� � ������ � ������ � ������������� * �� � ������� � * �� � 9���-� ,�� �������� �#� ������� � � �� � �� � �D �- � �� #� �� ��������� � ����� � �����$�� ��� ��"���� ������� � �� � ���� #��� ���"� �� ����0�1<� /������� ��&�������� �� < � ��� �� � #� ���� �� � ����� ����� #��� ������ �� ����0�1<� �� ��� � 0:�2�7����� ��� �� -��>/G; ������ � ����� #���- ���� �������� ���� %��*+�

������ � �� � ��� �� �� �� � ��5*������ �*�� �����5*���� �� "����� ��� ����������*��*� ��� �� ��

7������� ��&����� �������� � ���$� �� �� ��&������ � ���� � ���( �-3 �� ��� ��� �,-- ��*.�1����� VD���� � V'B�D.�� ���2 �-3 ���*�� ��� -/%O

����� �� ��� ��� ���� �� "� ���������#$ �������� ��

'B�� VB��BB�� ���� �-3 �� ������ J-7 *'�+� �2++���������2 �-3 ���*�� ��� -/%O ��� �2���D�D�� ���( �-3 ���7�����8 ������ ��������� -/%O �BD� 9�'�'D� � ���;�0*+ �� ���� �-3 �� ��� ��� J-7 �+�'� �2�*+��B� � ������ � �� � ��������� ������ #��� ���� �� #������ 1������� - ����� 1� �� �7 �� �� M8� ��&����������� � ��#��� ��������� � � ��� � �� ������������ ���� � #��� ���� �� � ������� �� % �� A�� �� ��BB�� � % �� ��BB.��

�� ���� � ��� �� ��� ���� �" �� �/� ������� ���"����� � �� ����

�/� ������� ��� ��� ��� ����� ���� /��������# ����� � ���/5 ����� ���� /������� ������� � -������� ������� ���-5 ����� ���� -�������������� � ���� ����� ���� #��� ���3� �� 0-%�G��� ����� �� �� -<�� �*��111111�,--11,�--1�-,�-,�-,�,,��-1-��1,,-���� � �#� � � ��/� �*��----1��,,-��1-,,,,�,,���,,-,-�,,1-,,�1-,11-,�-���� ��$����� #��� ��� � ������ ��� ��/ ������ � ��� ����� �� �� ��-��*��1�,-11�,---,-1�1�,1-�-��-1-�,�-,��-,�-1���� � �#� � � -<�� �*��---11�,--���1-,,�,-1��,�,-�1��1�,--,�,,���� ��$�����#��� ��� � ����� ��� ��- ������ #��� ���� �,��+� � �6%��� ���$��$� � ������� �/� ������� ��� ��� ���� ����� ����� � ������� �120#� ���3� �� �<120�-� ���������� ����� ��� ������ �� �� 1206�� �*��111111�,--�,11,1�1�-��111-1�1-���� � �#� � � 120��,G0;V�*��----,-1�1��1-,,,,�-,,1,�-�1-,-1,-�-�,1--���� ��$����� � 120V��$� �*��-----�,-1�1-,,1,�-�1-,-1,--�,1--���� ��$������%�������� � �� ������� ����� #��� ���� ��� � �(��;8 �*� � ��/ � �120�� :�8 �*� � ��- � �� ��120� � 2 � 888 ����� ��� � ��/� ��- � �120� � �������� �� ����� 0-% #� ���� �� �� ���������� ������ � �!����� #��� � �� � ����3� �� ��� � ������ #��� ��� ����� ��������� � �� ��������� ,����/ � �120 ������� #��� ����� ������� ���U<�+ V/ � ���$��$� � �U<�+ �U����� �� #������� :�8 � ��8 ����� #��� ����� � � ��� ��- ������� #� ����� #��� ��� �120 ������ �� ��� ��$��� � ��������� � ������ 120���- ���� �� 8� ����#� ��� �!������ � ���� � �;��/� �;120��- � �;120 #��� ����� �

(7��2���� �� ��� �* � ��� �� �� -��6%-3&��� ��� -3&

G$���!������ � � ��� ;��/� ;120��- � ;120�� ����� #� ���� �� � ������� ��� #� .3 �� 7�*������ � ������� ��� �!������ � ���� � #��� �� #� $������� � �� ����� �5*+ �$>$� ��� *+ � � ��������#�� � �� � ������� � �D �-� �� � �.B*

� +�D 80,1 #� � � 3�� � �������� � � � 7� ������� � #� � ������ � � � ���� � �� � �D �-�� � ;��/ � ;120� � � �* �- �� � ;120��-�� 2 ��� #��� �!������ �� ����� #��� � ������ �� ����������� ���+++ �� �+ ������� � �-� � �� "�� � ��+ �-� ;��/�� ���� #� ����3� �� ��� �������� � . 7 1�;-� � ;120��- � ;120 #��� ����3� �� �� ���$� � �� ��� �� �� � ��� � ��� ��������� �� � ��� ��������� , ����"� �� �� ����� ��� �� � � ;120��-� +�� 707�2 #� ����� � �� ��� �!������ � � �� � ������3��� � �������� ����� ����3��� � ;��/�� ������������ �� #��� ���"� $������� � � �- ����� *+ 7

,����;-� ��; D�*�� 2 � ;120��- � ;120 ����� � ������� #� �!����� � � *+ 7 ,����;-� ��; D�*� �����<� � �0� �+�1 � ���� �6� � ��

! �� �" �� -3&���% -3& ��� -��6 ���� ������ ��% �� �������% �� ��������� �� ����

-������� ��++ �� #��� �� #� � � �.B* � +�D � ��$���� ���++ �� �* ������� � �-�� ,�� ������� #����������� � �� �+ � � �+F ������ � � �� "�� �� � ���&� �� � �'+ �-� 0�� � � ��� ��� ��� ��� �� ��&� � � ��� ����� #� �!����� �#��� #��� +�� $ ��� �* 7 9�-� � � �� � �� � � ��������� � �� ���&� � #� ���� ������� � 9�-� �!����� � ������� ����� #��� #��� ����� ���� #��� � � � *+ 7 ,����;-� ��; D�*� � 3���� �������� � �� +�* � � ,����;-� ������ ��; D�*�5 *+ �� � ���� �������� � #� �!� #��� *+ �� � ����3� ;120��- �� �>��� ;120�� �>�� � ;��/ �+��* �>�� � ������� � � �� � �� � � ���������� ����� ������� � ��� �����#��� � ������ �� ����������� � � #��� ����� ����#��� *+ 7 ,����;-� ��; D�*� ���� ��� #�� ����������� #��� +�� ��>� �� �� �� � � ��� -���� #������"� � � ��� �������� � ������ �� ;120��-�;120 � ;��/ �� ��� N� �������� � N� ����������� �� �� � ����0�1< � �� #� �� M�������������

��'��/���"������

M� ���� , � 7��4���� � � ���� ���� ��� /���������&������� � ���� 6���� � � � �� $� ��� <7 ���������� ������� �� ��� � ��� ���������

���������

6�������� M�� M�� ����� 8� A 0������ 6� 7� ��B'B��0��������� � ����"�� � �� ��������� � ������������ ������ �� ������ )����3 &3 � ��� �3 ����*���D�

6�$��� ��� ,� J� ��BB��� 6������ �������� )���3 �� �3;�����3 ( �3 �� �+������

6���� �� ;� -� A � ��� J� ��BDB�� � ��� �������!����� � �� �� ��� � � ��������� ��� ��������� �/�� ����3 �� �� ���3 �� �*����*���

6 �� ;� J� ��BB.�� ,�� ������ ���� �� ���� ����� � -��7���� ���� �� ��� ���� 0�� ������� C��$������ ������ �

6 �� ;� J� A 0 �#���� 0� ;� ��BB.�� <!������ �� ������� �� �������� $���� � � ������� ������ �� ��������3 � ��� �3 �� ��+B������

6 �� ;� J�� E ���� -� 0� �� 7�� $� / ��� J� 7� A0 �#���� 0� ;� ��BB��� ������ �� ���� � -������ ������ ��� ��� �,-- ��*.5 ����3��� �� �!������ � ��.����� �� � �� � � ����� �� � ��&����� � ��� � ������ � ��� ����� &3 (����� �3 ���� .+'B�.+B.�

6 �� ;� J�� E ���� -� 0� �� 7� A 0 �#���� 0� ;� ��BB*��8 ����3��� �� �� ���� � ����� �� � ��&����� � ������ ������ �� ���� ���� � -������ ���� �� ��� ����,-- ��*. #���� �� �!�����$� �������� #��� ��������� �� ���� ���� � ���� �������� &3 (����� �3 ����D����D��+�

6 �� ;� J�� E ���� -� 0� �� 7�� 0 �� 6�� E�������� E� A0 �#���� 0� ;� ��BB.�� ,�� �������� � �# �������� ���� ��� ��� ����� �� � ����$� �� �������

�� ����� �� ��� ��� ���� �� "� ���������#$ ��������

����� � -������ ���� �� ��� ���� � ��� ���� �����D*���'��

6�������� <�� 7�������� 7�� ;�������� ��� <�������� <� 7������ � %� A 6��� ;� ��BBB�� -��� #�� � �����7����������� �� ���������� ����� <7�5 �� ��� � ���� � � ����� � ������� � ��� !�����V���� ����3 � ��� �3 ���� �*B��.*�

-������� 7� 9�� %�� ��� 6�� �� ���� J� M�� - �� �������0� ��� E �� J�� :���� 1� A 7 ������ 9� ��BB'�� ,�������� ���� � -������ ���� ���*�� ��� -/%O 'B�5�� ����� ��&����� � ����� � � �� �!������ ��� ��� ���� ���� D�B�D�.�

-��� 7�� 6��� /�� 0������ J� 9�� 1������"�#����� ,��9��� �� 1� A ��������� <� ��BBD�� ,�� ������ �� ���� � )���������� �� ������ ��� �� ��� �� � ������� #�� �� ��� -������� �� � �� ��� �����3 � ��� �3 � �'���B��

-��� ��� -$����� ��� 2�������� J�� 0������ 6� 7��E ���"����� 7�� E�� M� M� A ,����� ,� J� ��BB������������ � ��� ����� �� ������ $�������� ����� ���� � ���� � ������� ����� � ��� &3 ( �3)���3 � �*�*'��*�.*�

����� %� �� ��BB��� 7 � ������ ����� �� ��� ��� � � �� ������� ;������3 ( ����3 � '����+�

<�������� <� 7�� 9������� E�� J� ���� 7�� ; �"�� -��O���� ��� ������� C� 6� A ��� 7� ��BB'�� ,�������� �� ����� � �# (�� ���� ������������ ���#�� ����� ������ �� � �� * � ����� /����������� � � ��� � �� ���� #�� � ���� � � ������������ � � ���� �� &3 (����� �3 ���� ��''���B*�

<�������� <� 7�� ��� ����� 8�� ������� C� 6� A ��� 7���BB.�� <$� ���� ��� � /������� � ���� �� ���������� �������� ��� ������ � ������� ���� ����� �������#����� ���� �� (�� ���� ���������7��� ��� �,-- ��B'+� &3 (����� �3 ���� *.+��*.+B�

<������ �� ;� A 0������ J� ��BB'�� ��������� ������� ������� �����5 � ��� � ��������� ������ ����� � �� ���� � ������ ��������� #���������� ��� &3 ;�����3 ( �3 ��� �D.��+��

1������� -�� ����� ��� 6���� 6�� 0 ������� %�� 1�� � �J� <�� 9������� 9� A 7 ����� 6� ��BB.�� � ��# ���������� �� ������5 ��&������� � ������ ���� ���6 ���� �� -������ ���� ��������� ���������������� &3 (����� �3 ���� �+*B��+.*�

;����� �� ,� A 6���� �� -� -� ��BDB�� �����3� ������� �� � ��� ����� ���� ���� �� ���� ���� � (�� ���������� ��� #��� ��� ����� ����� ��������&3 (����� �3 ��� �+�+��+���

J ��� �� J� 9�� 0������ -� 2�� -����� -� ��� 9 � �� J�A 1����� 2� ��B'+�� ,! � � � ��� -������ ������ ��� ��� �� ��� ���3 &3 ;���3 (����� �3 �� *��.'�

J �&���Q���� %�� 6������ ;�� 2�� ���� 2�� 1 �� �� 0� A- ����� 0� ��BBB�� 8������� � ���#��� ��� �� ����8�886 � - ���� � ���������� � ��� ����� �� �� 5 � $�� ������ � �� ���� �� ���� � � ��������� � 1��� ����$� ������� ��3 � ��� �3 ��B+��B���

E�� M� M� A ,����� ,� J� ��BB��� 2 � � ������ �� � ��� ������ ������ ��� �������� � ������������ � ��� .<��� ��� �� ��� ��������

9���� C� E� ��BD+�� -��$�� � ��������� �� ����� ����� ��� ������ � ��� �� � ������ ����,�� ������� �� .'+�.'*�

9����� 7�� 7���� 8�� 1 �� �� 0� A 6������ 0� ��BB'��8 ����3��� � � ���� � ���� ������ � � ��� ��� � ��� ���� #�� #����� ��� ������ �� ���� � )���� 7� �� ������������ � ��� ���� ���� ������D�

9 ���� ��� :�;��4�� ��� J�� 1������ E� A ������� C� 6���BB��� ������ � -������ ���� ���*�� ��� �,--

��+�.5 �� ��� �� ������ ��������"�� � � ���� ��� � ���� �!����� � #��� ������ ��� �� ��&3 ���3 � ��� �3 ��� .���.�'�

9 #��� G� ;�� % ���� ���� /� J�� 2��� �� 9� A %� ���%� J� ��B*��� 0� ���� �������� #��� ��� � ������� � �������� &3 ( �3 )���3 ��� �.*��D*�

9���� ��� <������ �� ;�� 0������ J�� �������� C��: ����� �� A 6�������� M� ��BB��� � �� ���������� � ��� ������� �� 8 *� ������ ���� ��$��� �� ������ � ������� ����� � ��&����� �������&3 (����� �3 �� � ����������

7��HI��"� 6�� ������RR � J�� ���� <�� E �� ���� ,� E� A0 �#���� 0� ;� ��+++�� <!������ � � ���� ��� ������ � ��������� ��� ���� ���� � -������ ���� �� ���7��� J-7 *'�+ �� -������ ���� ���� �,-- �B�,�&3 (����� �3 ��� .'*D�.'.��

7�� � E� ��BB��� ;���� ������� � ������ �� ����� �-������ ���� �� ��� ��� ������� � ��� �3 ������3 � �BD��+��

7�� � E� A E#�� ,� ��B'��� ���������� � � ������ ��������"�� � � ������ ���� �� ������� #��� � ������ � ��� ����� -������ ����� �.�;� ��� �3 -������� �� ��*��*+�

7������ ��� , ���- ������ <�� 7 ��� 7� A 2 ���� ����BBB�� ,�� ������ � � �� �� � ���� � ��� ���� ����� � � �� �� ����� � ��� ���������� � (�� ���� ������� �� &3 ����3 � ��� �3 ����*.��.+�

G����HI� 1�� -���� �� J� 9�� 0� � � 7� �� A �6��������� J� ��BB.�� � � ����$� ��� �� �������� ����� �� ��$ �$� �� ����� ����� ��� ��� ��������� ������� ���� &3 (����� �3 ���� �D.*��DD��

0� ��� �� J� ��� 7������� 1� J�� M����� 6� -� A �������J� 9� ��BBB�� 1������ ��������"�� � � ������$�� ����� ���� �� ������ �� -������ �������*�� ��� -/%O��� &3 (����� �3 ���� �*B���*BD�

% ��� 6� ��BB.�� 0;�5 0�� ������ ��� ����� �� �� ������������� �� �� 3�� ��� ����� ���# ���� ������.�/���3 � *�*�*�B�

% ��� 6� A �� ��� -� ��BB��� 0�� ���� � � �� ���� ���������� � ������ ��� D+F ������� &3 ��3 ( �3 �*'��*BB�

��� �� J�� 2������� <� 2� A 7������ ,� ��B'B�� �����7��� )�� ��5 � -������� ������ �2 � � /�� / ���-� A 2����� �� 7�� � ��� �� � ���� - � ������;�� � 9� �� �� 0����� - � ������ ;�� �� /W�

��� 7� A ������� C� 6� ��B'D�� 7 ������ ���$������ ��� ������� � (�� ���� ������������ ���������� &3 (����� �3 � �� �+B���+B'�

�!� �� M� G� A 6�������� M� ��B'.�� 0��������� � ����"�� � �� � ������ &3 ��3 ( �3 ���� �*���*��

���"��� %� J� ��BBB�� 7����� ��� �������$�� �� �� �������� � ����� �� ������� ���� � *�� -��� ����8�� � ��B��**�

������RR � J�� 7�����"� 6�� ���������� J�� , �� ,��E�������� /� A ,���� ��� �� ��� ��+++�� -��������"�� � � ��� � ��������� ��� ������ �� ���� -��� � -������ ���� �� ������� &3 (����� �3 ��� .��+�.�*+�

������� C� 6� A 1������ �� 7� ��BD*�� ������� � ���������� � �������� � ������� �������) �$� ����� � ���� �� ���� � ������� &3 �����������3���3 ��� �+����.�

������� C� 6� A 7������� 0� ��B'��� -��������� ����������� � ������� ����3 ��*3 � ��� �3 �� ������B�

,� �� ��� ������� J� M�� 7�-������ M� ��� E�� -� 7�A ,����� ,� J� ��BB��� % ��� � ��������� ��� ����� ��� � �� � ������ ��� ���� � ��� ������ �� ������������ ��� � ������� ������ ���&3 ��3 ( �3 �� .*��..��

����� �� ��� ��� ���� �� "� ���������#$ �������� �!

, �� ,�� :��� �� %�� M�������� � 6�� 64 R ���� W��������RR � J�� :��� � ,�� E�������� /� A E �� ����,� E� ��BB*�� � � ��������� ��� ������ �� ���� ��-������ ���� �� ������� ����3 .�* ��3 � ��� �3 ����.D���D��

:� ���I�� 1�� 0�$� 8�� 0������ %�� 9 ���� E� A0�$� �� ��BB��� ������ �� ���� ���� � -������ �������* �5 �� ���� �� � �������� ���� ����� � � �������� � � ��� ����� �� � ��&������ &3 (����� �3���� D��B�D��D�

$ � <��������������� -�� ����� ��� 7� A E�������;� E� ��BB��� <$� ���� � � ��� ��������� ���� � � � �� ��������$� -������� ��� �� ������� ��� ����� � )���� � �� � 9� �� � !��� � ������� � ���� ���� ���� �������������� &3 (����� �3���� .D+D�.D�+�

M���� 6� M� ��BB��� � ���� � �� ���� �� � ������ �� ��� ���� ���� ��� �� ����� #��� � ����$� -������� ����� ��&������� ��3 � ��� �3 ��DBD�'+��

������ �� �� �������

=���� *�� ># ��� >%%%? ���� *�� � ��* ��� �� >" ������ >%%%? �������� >, ������ >%%%@


Recommended