1

UTILIZACIÓN DE MARCADORES MOLECULARES PARA LA DETECCIÓN 1

DE MICROCYSTIS POTENCIALMENTE TOXICAS EN CUERPOS DE AGUA 2

DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES. PRIMER REPORTE 3

4

(Applied of molecular marker for detection of potential toxic Microcystis in water 5

supply from Argentina. First report). 6

7

8

Oteiza, Juan Martín*1, Ouahid, Youness2, Baron, Angel2, Andrinolo, Darío1, 9

Echenique, Ricardo3, Giannuzzi, Leda1, Caneo Mariela1 y Fernández del 10

Campo, Francisca2 11

12

1Centro de Investigación y Desarrollo en Criotecnología de Alimentos (CIDCA). 13

CONICET - Fac. Ciencias Exactas. Universidad Nacional de La Plata. Calle 47 y 116. 14

CP 1900. Argentina Tel/Fax: (54-221) 425-4853/ 424-9287. 15

16

2Departamento de Biología. Universidad Autónoma de Madrid (UAM), Cantoblanco 17

28049, Madrid, España. 18

19

3Departamento de Ficología, Facultad de Ciencias Naturales y Museo, Universidad 20

Nacional de La Plata. 21

22

4Facultad de Ingeniería, Universidad Nacional de La Plata. 23

24

25

E-mail: jmoteiza@cidca.org.ar 26

2

Resumen 1

Las Cianobacterias, son bacterias Gram-negativas, foto-autotróficas, que 2

bajo condiciones ambientales apropiadas, pueden desarrollarse masivamente 3

dando lugar a formaciones conocidas como florecimientos. Varios géneros de 4

cianobacterias producen toxinas, como las microcistinas (MCs), reconocidas 5

hepatotoxinas, producidas por cianobacterias del género Microcystis entre 6

otros. 7

Los objetivos de presente trabajo son: a) Detectar e identificar las principales 8

especies de cianobacterias potencialmente tóxicas, b) identificar estirpes del 9

género Microcystis potencialmente productoras de MCs y c) confirmar la 10

presencia de MCs en cuerpos de agua de la provincia de Buenos Aires. Los 11

ensayos se llevaron a cabo con muestras de florecimientos ocurridos durante el 12

mes de enero de 2006 en el Rio de la Plata, Provincia de Buenos Aires, 13

Argentina. Se realizó la identificación cualitativa y cuantitativa de 14

cianobacterias. Posteriormente, se realizó la detección molecular de 15

fragmentos de los genes de la Microcistina Sintetasa de Microcystis (genes 16

mcyB, G y D), empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El 17

análisis de las toxinas (MCs) se realizó mediante HPLC. 18

En todas las muestras analizadas, M. aeruginosa resultó ser la 19

cianobacteria más abundante, con valores de entre 10.200 y 458.400 cel.ml-1. 20

Asimismo, en todas las muestras se obtuvieron los amplicones esperados; 21

indicando la presencia de cianobacterias del género Microcystis potencialmente 22

productoras de MCs. Los ensayos de HPLC revelaron la presencia de distintos 23

tipos de MCs, tales como la MCLR, MCYR y MCRR, MCFR, MCWR, y MCLA 24

3

(siendo las tres últimas descriptas por primera vez en cuerpos de agua de 1

Argentina). 2

La identificación de genes mcy resultó ser una metodología útil y 3

aplicable para conocer con la máxima antelación posible el carácter 4

toxicogénico de las cianobacterias presentes en cuerpos de aguas. 5

6

Palabras clave: cianobacterias, Microcystis aeruginosa, microcistina, PCR, 7

florecimientos, HPLC. 8

9

Abstract 10

The Cyanobacteria are Gram-negative bacteria, that under appropriate 11

environmental conditions, can be developed massively giving rise known to 12

formation like blooms. Several genera of Cyanobacteria produce toxins, like the 13

Microcystins (MCs), recognized hepatotoxins, produced by Microcystis genera 14

among others. 15

The objetive of the present work a) to detect and to identify the main potentially 16

toxic species of Cyanobacteria, b) to identify potentially producing species of 17

the Microcystis genera of MCs, and c) to confirm the presence of MCs in water 18

bodies of the Province of Buenos Aires, Argentina. The tests were carried out 19

with samples of blooms during the month of January of 2006. The qualitative 20

and quantitative identification of Cyanobacteria was made. Molecular detection 21

of the genes of the Microcystins sintetasa of Microcystis was made (genes 22

mcyB, G and D) using the chain reaction of the polymerase (PCR). The analysis 23

of toxins (MCs) was made by means of HPLC. In all the analyzed samples, M. 24

4

aeruginosa turned out to be Cyanobacteria more abundant, with values of 1

between 10.200 and 458.400 cel.ml-1. Also, in all the awaited samples they 2

obtained amplicones; indicating the presence of Cyanobacteria of the 3

Microcystis genera potentially producing of MCs. The HPLC tests revealed the 4

presence of different types from MCs, such as the MCLR, MCYR and MCRR, 5

MCFR, MCWR, and MCLA (being the three last ones the first time descript in 6

water bodies of Argentina). 7

Identification of genes mcy can be a useful and applicable methodology to know 8

with advance the toxicogenic character from Cyanobacteria in water. 9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

5

Introducción 1

Las cianobacterias son bacterias Gram-negativas, fotoautotróficas, capaces de 2

realizar fotosíntesis oxigénica. Normalmente son integrantes del fitoplancton, 3

aunque en algunas ocasiones se agregan, dando lugar a formaciones típicas, 4

conocidas como floraciones o “blooms”, frecuentemente situados en la 5

superficie de las aguas. Algunas cianobacterias producen potentes toxinas, lo 6

que supone un gran problema de contaminación de diversos ecosistemas 7

acuáticos, ya sea embalses destinados al consumo humano y de animales, o 8

para fines recreativos, riego industrial, piscifactorías, etc. (1). Asimismo, se 9

comprobó que varios géneros de cianobacterias producen toxinas letales para 10

vertebrados. Dentro de estos grupos, las hepatotoxinas, y especialmente las de 11

naturaleza peptídica (cianopéptidotoxinas, CPTs), son las más abundantes y 12

extendidas en los florecimientos. Las CPTs mejor caracterizadas son las 13

microcistinas (MCs), producidas por cianobacterias del Género Microcystis, 14

entre otros. 15

Las MCs son las únicas toxinas identificadas hasta el momento en la cuenca 16

del Plata y asociadas a la presencia de Microcystis aeruginosa (2, 3, 4). Dicha 17

especie es la más extendida en el territorio y está siempre presente en los 18

florecimientos ocasionando inconvenientes en el abastecimiento de agua 19

potable en importantes ciudades del país. 20

Uno de los problemas importantes con el que se enfrentan las empresas y 21

organismos de control encargados de la vigilancia de cuerpos de agua 22

destinados al consumo humano y al uso recreacional, es conocer con la 23

máxima antelación posible el carácter toxigénico de las cianobacterias. Es por 24

6

esto, que la detección temprana de cianobacterias toxigénicas en cuerpos de 1

agua es indispensable para la prevención de riesgos asociados con la salud. 2

La diferenciación de cianobacterias toxigénicas y no toxigénicas solo puede 3

realizarse por métodos moleculares, entre los cuales se describieron diferentes 4

técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) basadas en la 5

detección de los genes responsables de la biosíntesis de MCs 6

(mcyABCDEFGHIJ). El empleo de marcadores moleculares aplicados a la 7

detección de cepas de Microcystis aeruginosa potencialmente productoras de 8

MCs constituye una herramienta de suma utilidad para conocer con la mayor 9

antelación posible el carácter toxigénico de las cianobacterias. 10

11

Objetivos 12

Los objetivos del trabajo fueron: i) Detectar e identificar las principales especies 13

de cianobacterias potencialmente tóxicas en cuerpos de agua de la provincia 14

de Buenos Aires, ii) Identificar estirpes del Género Microcystis potencialmente 15

productoras de MCs mediante PCR y iii) Confirmar la presencia de MCs en 16

diversas muestras de agua mediante cromatografía líquida de alta resolución 17

(HPLC). 18

19

Materiales y Métodos 20

Toma de muestra 21

Las muestras (n: 8) fueron colectadas entre diciembre de 2005 y enero de 22

2006, a partir de florecimientos producidos en cuerpos de agua dulce. Los 23

muestreos se realizaron en estaciones fijas pertenecientes al Partido de 24

7

Ensenada, Provincia de Buenos Aires, Argentina. Se establecieron 5 puntos de 1

muestreo en sitios destinados a uso recreacional, pesca deportiva y toma de 2

agua para consumo humano. Estas fueron: toma de agua A y B; Río de la 3

Plata; Laguna Aeroclub e Isla Santiago. 4

Las muestras fueron recolectadas manualmente de la superficie de cada uno 5

de los cuerpos de agua utilizando botellas colectoras tipo Van Dorn. En todos 6

los casos se tomaron muestras para análisis cuali y cuantitativos 7

(determinación de géneros y especies de cianobacterias y conteo celular de 8

fitoplancton respectivamente), estudios moleculares, y determinación cualitativa 9

de MCs. En aquellos casos en los que se observó una abundancia de 10

cianobacterias, se concentró la biomasa acumulada con una red de plancton 11

(30 µm de tamaño de poro), lo que permitió disponer de suficiente masa para el 12

análisis de MCs. Todas las muestras fueron conservadas inmediatamente a 13

4ºC, con el fin de evitar su deterioro. En la Tabla 1 se presenta las 14

características de las muestras analizadas en este trabajo. 15

16

Tabla 1: Fecha de recolección, lugar y utilización de los cuerpos de agua estudiados. 17

Muestra Fecha de recolección

Lugar Uso del cuerpo de agua

1 20/12/05 Toma de Agua (A) Consumo Humano

2 17/01/06 Toma de Agua (A) Consumo Humano

3 24/01/06 Toma de Agua (A) Consumo Humano

4 24/01/06 Toma de Agua (B) Consumo Humano

6 17/01/06 Río de la Plata Recreacional/Pesca deportiva

6 17/01/06 Laguna Aeroclub Recreacional/Pesca deportiva

7 24/01/06 Laguna Aeroclub Recreacional/Pesca deportiva

8 24/01/06 Isla Santiago Recreacional/Pesca deportiva

18

8

Cabe destacar que la estación de muestreo denominada Toma de Agua 1

corresponde al punto de entrada a la planta potabilizadora, la cual distribuye el 2

agua a la zona de La Plata y alrededores. En dicho punto se tomaron dos tipos 3

de muestras diferentes: situadas en la boca de entrada a la planta (A) y 4

situadas a 50 mt. de la misma (B). 5

6

Identificación cualitativa y cuantitativa de cianobacterias. Análisis 7

taxonómico 8

Las muestras para análisis cualitativos fueron colectadas utilizando redes de 9

plancton, y las muestras para análisis cuantitativos fueron colectadas con 10

botellas tipo Van Dorn. Las muestras cualitativas se estudiaron “in vivo” con la 11

ayuda de un microscopio óptico (Leica, DMLB), provista de cámara de dibujo y 12

cámara fotográfica. Posteriormente, las mismas fueron fijadas con solución de 13

Transeau al 50%. Las muestras destinadas para análisis cuantitativos fueron 14

fijadas “in situ” con solución de lugol al 1% para su posterior análisis con 15

microscopio invertido (Carl Zeiss), siguiendo la metodología Utermöhl (5). 16

17

Identificación molecular de cianobacterias 18

La identificación molecular de las cepas potencialmente toxigénicas, se basó 19

en la detección de los genes mcy (codificadores del complejo enzimático 20

responsable de la síntesis de MCs, la Microcistina Sintetasa). Mediante PCR 21

múltiple, se realizó la amplificación simultánea de fragmentos de los genes de 22

la Microcistina Sintetasa de cianobacterias del Género Microcystis (mcyB, G y 23

D) empleando como molde el ADN total extraído de muestras de florecimientos 24

9

(6). Se centrifugaron 5 ml de cada una de las muestras (correspondiente a 1

aproximadamente 0.1 mg de peso seco) a 14.000 rpm, a 4ºC, durante 3 min y 2

el precipitado se lavó con 1ml de agua destilada. Este procedimiento se realizó 3

dos veces y finalmente el mismo, fue resuspendido y concentrado en 300 µl de 4

agua destilada. Las muestras fueron congeladas a -20ºC hasta el momento de 5

su uso. Posteriormente las mismas se sometieron a una lisis celular mediante 2 6

ciclos de congelado / descongelado. Se emplearon los cebadores descriptos 7

por Ouahid et al. (6) los cuales amplifican regiones de los genes mcyD y G, y 8

los descriptos por Mikalsen et al. (7) que amplifican regiones de los genes 9

mcyB, los cuales se describen en la Tabla 2. 10

11

Tabla 2: Características de los cebadores empleados en los ensayos de PCR. 12

Genes Cebadores Secuencia (5’ a 3’) Producto esperado (pb)

Referencia

2156-F ATCACTTCAATCTAACGACT mcyB

3111-R AGTTGCTGCTGTAAGAAA 955

Mikalsen y col. (2003)

PKDF1 GACGCTCAAATGATGAAAC mcyD

PKDR1 GCAACCGATAAAAACTCCC 859

Ouahid y col. (2005)

PKDF2 AGTTATTCTCCTCAAGCC mcyG PKDR2 CATTCGTTCCACTAAATCC

425 Ouahid y col. (2005)

13

Se utilizaron 25 µl finales de mezcla por reacción de PCR, conteniendo 1.5 µL 14

de los cebadores mcyB, 2 µL de mcyD y 0.8 µL de mcyG, (todos con una 15

concentración de 1.5 µM); 0.5 µL de mezcla de dNTPs (10 mM), 2.5 µL de 16

buffer de PCR (10X), 0.40 µL de MgCl2 (50mM); 0.25 µL de seroalbumina 17

bovina (BSA, 10 mg/ml), 0.2 µL de Taq polimerasa (1U); y 6 µl de ADN molde. 18

Todos los reactivos empleados pertenecen a la empresa Biotools. Como 19

control positivo y negativo se utilizó el ADN molde de la cepa M. aeruginosa 20

10

productora de MCs (UTEX 2666), mientras que la mezcla sin ADN se utilizó 1

como control negativo. La reacción de PCR se llevó a cabo, en un 2

termociclador Applied Biosystems, modelo 2700, con el programa siguiente: 3

desnaturalización a 94°C por 1 min, seguido de 35 ciclos a 94°C por 30 seg, 4

52°C por 30 seg y 72°C por 1 min. La extensión final fue a 72°C por 5 min. 5

Para la siembra: se agregaron 10 µl de una solución de xilene cyanol 0,25% y 6

glicerol en agua 30% (Loading buffer A) a 50 µl del ADN amplificado; 7

sembrándose 10 µl en un gel de agarosa (Invitrogen Life Technologies, Brasil) 8

al 1,7 % en buffer TAE 0,5X y adicionado con 0,5 µg de bromuro de etidio/ml 9

(Promega, Madison, WI, EE.UU.). La electroforesis se realizó a 80V durante 30 10

min. Se utilizó un marcador de peso molecular 1000-pb (Biotools, España). 11

Para documentar los geles se utilizó un transiluminador modelo 2000 (BioRad) 12

y el sistema Kodak Digital Science DC 290 (Easteman Kodak Company, 13

Rochester, NY, EE.UU.). El análisis de los geles se realizó con el programa 14

EDAS 290. Para el registro de las bandas se utilizó una cámara digital (Kodak, 15

DC 290). El procesamiento de las fotos se llevó a cabo mediante el programa 16

EDAS 290. Se utilizó como control positivo de la reacción, el ADN de una cepa 17

de M. aeruginosa productora de MCs (cepa de referencia, UTEX 2666), 18

mientras que la mezcla sin templado se utilizó como control negativo. 19

20

Análisis de toxinas (MCs) mediante HPLC 21

El análisis de Mcs se realizó mediante cromatografía líquida de alta resolución 22

(HPLC). Las muestras se filtraron con filtros de fibra de vidrio (TCLP Glass, 23

Gelman Laboratory) de 47 mm de diámetro y 0.7 µm de tamaño de poro, 24

11

posteriormente se extrajeron las MCs empleando metanol al 90%. Las 1

muestras se centrifugaron a 12.500 g a temperatura ambiente durante 10 min. 2

El extracto metanólico se evaporó y se resuspendió en 500 µl de metanol 70% 3

y se filtró a través de un filtro de teflón (PTFE), de 4 mm de diámetro y 0.5 µm 4

de tamaño de poro. Para las determinaciones, se empleó un equipo Waters 5

(modelo 2690 “Allience”), dotado de un inyector automático y conectado en 6

serie con un detector con arreglo de diodos (modelo 996). Este sistema 7

permitió registrar simultáneamente el tiempo de retención de los distintos 8

compuestos fraccionados y su espectro de absorción, las dos características 9

utilizadas para la identificación de las MCs. Como éstas presentan un máximo 10

de absorción a 238-239.2 nm, se eligió como longitud de onda (λ) de referencia 11

en los cromatogramas 238 nm. Las características de la columna empleada 12

fueron: Kromasil C-18 (Phenomenex), de 4,6 x 150 mm, con partículas de 5 µm 13

de diámetro. La separación cromatográfica se realizó empleando un gradiente 14

con velocidad de flujo fue 1ml min-1, empleando como fase móvil agua + 0.05% 15

ácido trifluoroacético (solvente A) y acetonitrilo + 0.05% ácido trifluoroacético 16

(solvente B), siendo el tiempo de cromatografía 60 min. 17

Con el objeto de determinar los tipos de MCs presentes en las muestras 18

analizadas, se emplearon patrones comerciales (Calbiochem) de diferentes 19

variedades de MCs tales como: MCLR, MCRR, MCYR y patrónes no 20

comerciales de MCLA, MCFR y MCWR previamente purificados y 21

caracterizados mediante el empleo de cromatografía líquida de alta resolución 22

(HPLC) y espectrometría de masas con ionización por desorción de láser 23

asistida por matriz en tiempo de vuelo (MALDI-TOF) a partir de cepas 24

12

toxigénicas de M. aeruginosa a fin de determinar el tiempo de retención y las 1

propiedades espectrales de cada una de las toxinas. 2

3

Resultados y Discusión 4

Análisis taxonómico 5

Durante el período de estudio el total fitoplanctónico en los cuerpos de agua 6

analizados fluctuó en promedio entre 20.850 y 459.000 cel.ml-1. Asimismo, en 7

todas las muestras analizadas, la cianobacteria más abundante fue M. 8

aeruginosa (Figura 1) con valores de entre 10.200 y 458.400 cel. ml-1. En la 9

mayoría de éstas, M. aeruginosa presentó una abundancia relativa mayor al 10

80%, observándose en varios casos la presencia de florecimientos 11

uniespecíficos. Otros Géneros de cianobacterias tales como Anabaena, 12

Aphanizomenon, Pseudoanabaena, Snowella, Rhaphidiopsis, Sphaerocavum, 13

Nodularia y Cilindrospermopsis fueron identificados en menor proporción (< 14

10%) en la mayoría de los cuerpos de agua. 15

16

17

18

Figura 1: Colonia de Microcystis aeruginosa proveniente de muestras de agua del Río 19

de la Plata observada empleando microscopía óptica (40x). 20

13

Identificación molecular de cianobacterias 1

La identificación molecular de cepas potencialmente toxigénicas, se basó en la 2

detección de genes mcy. La Figura 2 muestra los productos de amplificación 3

obtenidos para cada una de las muestras analizadas, empleando como molde 4

ADN total, proveniente de muestras de florecimientos. 5

6

7

8

9

10

Figura 2: Productos de amplificación para la detección simultánea (PCR Multiplex) de 11

los genes mcyB, D y G, empleando como molde ADN total, proveniente de muestras 12

de florecimientos. Línea 1: marcador de tamaño molecular (1000-pb), Líneas 2-9: 13

muestras de florecimientos provenientes de diferente origen, Línea 10: control positivo 14

(Microcystis aeruginosa productora de Mcs, cepa de referencia), Línea 11: control 15

negativo (muestra sin templado). 16

17

En todas las muestras analizadas, se obtuvieron productos de amplificación de 18

955pb, 859pb y 425pb, correspondientes al tamaño molecular de los 19

fragmentos de los genes mcyB, D y G respectivamente. Por lo tanto, se 20

demostró que las muestras analizadas contenían cianobacterias del género 21

Microcystis potencialmente productoras de MCs. 22

23

En todas ellas, los cromatogramas obtenidos por HPLC revelaron la presencia 24

de distintos tipos de MCs, entre ellas la MCLR, MCRR e MCYR, anteriormente 25

mcyB (955pb)

mcyD (859pb)

mcyG (425pb)

mcyB (955pb)

mcyD (859pb)

mcyG (425pb)

14

descriptas en la literatura como presentes en cuerpos de agua de Argentina (8, 1

9) (Figura 3). Sin embargo en varias de las muestras se detectó la presencia de 2

MCs no descriptas hasta el presente en cuerpos de agua de Argentina como la 3

MCFR, MCWR, MCLA, así como otros picos que presentan propiedades 4

espectrales similares al de las MCs, aunque esto no pudo ser comprobado por 5

falta de estándares analíticos. 6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

Figura 3: Perfil cromatográfico (HPLC) obtenido a partir de la muestra 8 (Origen: Isla 16

Santiago) en el que se muestran los tiempos de retención (min) y los espectros de 17

absorción de diferentes tipos de Microcistinas presentes en el florecimiento 18

determinados a una λ de 238 nm. a): Perfil cromatográfico de terminado al valor 19

máximo de de absorción de MCs (238-239.2 nm). 20

21

Asimismo, para el caso de las muestras provenientes de la Toma de agua A 22

(muestras 1, 2 y 3) y de la Laguna Aeroclub (muestras 6 y 7) puede observarse 23

una variación estacional en el tipo de MCs halladas dependiendo de la fecha de 24

muestreo (Tabla 3). 25

MCRR

MCXZ MCYRMCLA

MCLR

MCRR

MCXZ MCYRMCLA

MCLRa

15

Tabla 3: Principales tipos de microcistinas (MCs) determinados en los cuerpos de 1

agua analizados. En color negro se resaltan las MCs no descriptas hasta el presente 2

en cuerpos de agua de Argentina. MCXZ: corresponde a toxinas que presentan 3

propiedades espectrales similares al de las MCs. 4

Muestra Fecha de recolección

Lugar MCs detectada

1 20/12/05 Toma de Agua (A) MCRR, MCXZ, MCYR, MCLR, MCXZ, MCLA

2 17/01/06 Toma de Agua (A) MCLR, MCLA

3 24/01/06 Toma de Agua (A) MCRR, MCXZ, MCYR, MCLR, MCLA

4 24/01/06 Toma de Agua (B) MCRR, MCYR, MCLR, MCLA

6 17/01/06 Río de la Plata MCLA

6 17/01/06 Laguna Aeroclub MCLR, MCFR, MCWR, MCLY

7 24/01/06 Laguna Aeroclub MCRR, MCYR, MCLR

8 24/01/06 Isla Santiago MCRR, MCXZ, MCYR, MCLR, MCLA

5

Del análisis conjunto de la identificación taxonómica, el análisis molecular, y la 6

detección de MCs, se desprende que todas las muestras analizadas contenían 7

M. aeruginosa productor de distintos tipos de MCs, así como otros géneros 8

reportados en la bibliografía como toxigénicos. M. aeruginosa, es mencionada 9

frecuentemente en la literatura como productora de hepatotoxinas 10

principalmente MCs (10). Los valores encontrados en las muestras analizadas 11

indicarían un alto nivel de riesgo toxicológico de acuerdo a lo sugerido por la 12

OMS (11). Según estas sugerencias, existe una probabilidad de producir 13

efectos adversos moderados (riesgo moderado) para la salud cuando la 14

concentración de cianobacterias se encuentra entre 20.000-100.000 cél. ml-1 y 15

una probabilidad de producir efectos de alto riesgo para la salud humana 16

cuando supera las 100.000 cél. ml-1, valor superado en varias de las muestras 17

analizadas. 18

16

En la Argentina son escasas las investigaciones básicas y estudios de toxicidad 1

en áreas relacionadas a floraciones de algas (12). La falta de laboratorios y 2

equipos especializados causa dificultades para el desarrollo de investigaciones 3

y por lo tanto, de las posibles consecuencias para el ambiente y la salud 4

pública. En el Litoral Fluvial Argentino, por ejemplo, hay referencias de 5

floraciones de diferentes especies de cianofíceas para las provincias de Santa 6

Fe (13), Misiones (14) y Corrientes (15). En Córdoba, trabajos realizados por 7

Amé y col (8) reflejan el carácter toxigénico de ciertas cianobacterias presentes 8

en el embalse San Roque. En el caso del Río de la Plata, las microcistinas, son 9

las únicas toxinas identificadas hasta el momento en dicha cuenca y asociadas 10

a la presencia de Microcystys aeruginosa (2, 3, 4). 11

12

La presencia de cianobacterias productoras de MCs en los diferentes cuerpos 13

de agua analizados debería servir de alerta a los organismos de control ya que 14

las toxinas, ya sea las que se encuentran disueltas en el agua o las liberadas 15

por lisis celular mediante los procesos de cloración, podrían pasar al agua de 16

bebida que se distribuye a la red potable de La Plata, Berisso y Ensenada, 17

aumentando el riesgo de exposición por parte de la población de dichas zonas. 18

La posibilidad de diagnosticar precozmente la toxicogenicidad en 19

cianobacterias empezó a vislumbrarse como algo posible desde mediados y 20

finales de la década de los 90, cuando varios grupos identificaron y analizaron 21

los genes mcy de Microcystis, codificadores de la microcistina sintetasa (16). 22

La identificación de secuencias específicas de genes mcy indica la presencia 23

de dichos genes y, por tanto, de la posibilidad de la síntesis de MCs. 24

17

Existen registros bibliográficos de autores que han empleado la detección de 1

genes mcy para la detección de M. aeruginosa en cuerpos de agua. Trabajos 2

realizados en países como Alemania (17), Portugal (18), EE.UU (19), Australia 3

(20) y Brasil (21) entre otros, basan la detección de cianobacterias del género 4

Microcystis mediante la aplicación de marcadores moleculares, sin embargo 5

ninguno de ellos ha logrado detectar la presencia de 3 genes en forma 6

simultánea a excepción del trabajo realizado por Ouahid et al. (6). Asimismo, la 7

mayoría de los trabajos realizados, la detección de genes se realiza sobre 8

cepas previamente aisladas de florecimientos. En el presente trabajo, dicha 9

detección, se realizó a partir de muestras tomadas directamente de los 10

florecimientos, lo que permite determinar en forma directa el carácter 11

potencialmente toxico de un florecimiento sin necesidad de aislar las cepas 12

previamente. 13

Cabe destacar que este es el primer trabajo realizado, empleando muestras 14

provenientes de cuerpos de agua de la Provincia de Buenos Aires, sobre la 15

detección molecular de cepas de M. aeruginosa potencialmente productoras de 16

MCs. Es evidente que para tener una mayor información de la situación de un 17

cuerpo de agua, es indispensable la detección temprana de la posible 18

presencia de cianobacterias potencialmente productoras de MCs mediante 19

PCR, luego en una segunda etapa es imprescindible la aplicación de 20

herramientas analíticas para la cuantificación y detección de diferentes tipos de 21

MCs. 22

23

24

18

Conclusiones 1

Se detectaron secuencias de genes mcy en muestras de florecimientos algales 2

mediante el empleo de marcadores moleculares (PCR múltiplex). Esta 3

metodología resulta útil para conocer con la máxima antelación posible el 4

potencial toxicogénico de las cianobacterias presentes en cuerpos de aguas. 5

Dicha metodología presentó una buena correlación con los datos obtenidos por 6

HPLC a pesar que la producción de MCs puede variar con el tiempo pudiendo 7

no ser detectadas por HPLC. Asimismo en varias de las muestras se detectó la 8

presencia de MCs no descriptas hasta el presente como la MCFR, MCWR, 9

MCLA en Argentina. 10

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Como citar este trabajo: 1

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Oteiza, JM.; Ouahid, Y.; Baron, A.; Andrinolo D.; Echenique, R.; Giannuzzi, L.; 3

Caneo M.; y Fernández del Campo, F. 2007. Utilización de marcadores 4

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cuerpos de agua de la provincia de Buenos Aires. Primer reporte. Ciencia 6

Forense Latinoamericana. Vol 1, Nº1, .pág 24-31. 7