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Tecnología e información del ADN
Schematic illustration of DNA cloning
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Algunas enzimas usadas en tecnología de ADN recombinante
Secuencias de reconocimiento para algunas endonucleasas tipo II
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3 sistemas de enzimas de restricción:
Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restricción (corta) y
modificación (metila). Al reconocer la secuencia específica de DNA corta al azar en sitios
distintos al sitio de reconocimiento, ya sea corriente arriba o corriente abajo. El corte dejaextremos cohesivos. Necesitan de ATP para moverse en el DNA, desde el lugar de
reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases aproximadamente), además
de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg++ como cofactores.
Tipo 2: Solo tienen actividad de restricción. Otras enzimas llevan a cabo la metilación. El
corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de él, por lo que el corte es
resistente y predecible. Por esta característica es que son muy utilizadas para clonación de
genes, ya que al cortar en sitios específicos se pueden recuperar secuencias conocidas. Sólo
requieren Mg++ como cofactor, no necesitan de ATP...
Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas.
Tienen función de restricción y modificación. Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio
de reconocimiento, dejando extremos cohesivos. Requieren dos secuencias de
reconocimiento en orientación opuesta en la misma cadena de DNA. Necesitan ATP, Mg++ y
SAM (S-adenosil-metionina) como cofactores.
Hay otros sistemas de restricción descubiertos actualmente, como el sistema tipo 4 de E. coli ( Eco571) que consta de una sola enzima que corta únicamente DNA metilado en una
secuencia específica, y que además metila.
http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima_de_restricci%C3%B3n
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Trabajo in silico / bioinformático
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DNA sequences in a
typical E. coli
expression vector
Use of pBR322 to clone foreign DNA in E. coli and identify cells containing it
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Use of pBR322 to clone foreign DNA in E. coli and identify cells containing it
Use of pBR322 to clone foreign DNA in E. coli and identify cells containing it
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X gal
En experimentos de clonación génica, este compuesto es usado como indicador de aquellas células que
expresan la enzima β-galactosidasa, codificada en el gen lacZ del operón lac.
X-gal es hidrolizado por la β-galactosidasa a galactosa y 5-bromo-4-cloro-3-hidroxindol.
Este último es oxidado a 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-índigo, un compuesto azul insoluble. De estemodo, si X-gal y un inductor de la β-galactosidasa (normalmente IPTG) son disueltos en el medio de
agar de una placa de cultivo, las colonias crecidas en la placa que posean un gen lacZ funcional podrán
ser claramente distinguidas por su coloración azul. Además de su color característico, la volatilización
del grupo indol produce un mal olor característico
http://www.esacademic.com/dic.nsf/eswiki/1255017
5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-índigo
http://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_6//commons.wikimedia.org/w/index.php?title=File:X-Gal.svg&page=1
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Bacteriophage cloning vectors
Bacteriophage cloning vectors
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Bacteriophage cloning vectors
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Yeast Artificial Chromosome (Yac)
The yeast artificial chromosome, which is often shortened to YAC, is anartificially constructed system that can undergo replication. The design of a
YAC allows extremely large segments of genetic material to be inserted.
Subsequent rounds of replication produce many copies of the inserted
sequence, in a genetic procedure known as cloning.
The reason the cloning vector is called a yeast artificial chromosome has to do
with the structure of the vector. The YAC is constructed using specific regions
of the yeast chromosome. Yeast cells contain a number of chromosomes;
organized collections of deoxyribonucleic acid (DNA). For example, the
yeast Saccharomyces cerevisae contains 16 chromosomes that contain
varying amounts of DNA. Each chromosome consists of two arms of DNA
that are linked by a region known as the centromere. As the DNA in each armis duplicated, the centromere provides a region of common linkage.
http://www.bookrags.com/research/yeast-artificial-chromosome-yac-wmi/
Construction
of a yeast
artificial
chromosom
e (YAC).
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Use of hybridization to identify a clone with a particular DNA segment
Use of hybridization to identify a clone with a particular DNA segment
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Use of hybridization to identify a clone with a particular DNA segment
Probe to detect the gene for a protein of known amino
acid sequence
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Two approaches to site-directed mutagenesis
Mutagénisis
sitio-dirigidas
Proteínas usadas como etiqueta (tag protein/peptide)
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The use of tagged proteins in protein purification
The use of tagged proteins in protein purification
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The use of tagged proteins in protein purification
The use of tagged proteins in protein purification
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Construction of a cDNA library from mRNA
Construction of a cDNA library from mRNA
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Construction of a cDNA library from mRNA
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PCR
Amplification of a DNA segment by
the polymerase chain reaction
PCR
“Polymerase
Chain Reaction”
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HistoriaPCR es una invención, no un descubrimiento.
Kary Mullis, el inventor del PCR, obtuvo el Premio Nobel en
Química en 1993.
Revolucionó el clonamiento molecular.
1983, Cetus Corporation, California.
1. Múltiples rondas de replicación in vitro agregando
DNA Polimerasa
2. Incorporación de Taq Polimerasa (Thermus
aquaticus)
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Que permite el PCR:
Genera múltiples copias de un DNA templado
Partiendo con una copia (teórica) puede amplificar sunúmero infinitas veces
Fragmentos de DNA amplificado pueden sersecuenciados, clonados, usados como sondas oanalizados por electroforesis
Genes defectuosos pueden ser amplificados paradiagnosticar enfermedades
Amplificación de secuencias de patógenos para su
identificación (p. ej., HIV)Fragmentos amplificados pueden usarse como
marcadores identificatorios en forénsica(“fingerprints”).
Como funciona el PCR
Replicación artificial, in vitro
No se replica todo el DNA presente en lamuestra templado sino que solo unpequeño fragmento (1-20000 bases).
Al igual que en replicación, el PCRinvolucra:
– Denaturación del DNA
– “Priming”
– Polimerización
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Iniciación - Formación del “ojo” de replicación
3’ 5’
3’ 5’
5’
5’
3’
3’
Origen of Replicación
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
3’
3’ 3’
Funciones de replicación y las enzimasasociadas
LigasaUnión de
DNA PolimerasaPolymerización
PrimasaPrimer
EnzimaFunción
Helicasa
Proteínas SSB
Topisomerasa
Denat. DNA
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Las funciones de replicación son reemplazadas en el
PCR
N/A ya que sonfragmentos cortos
Unión de frag.
Taq DNAPolimerasa
Pol. DNA
Primers se
agregan a lareacción
Fuente del primer
PCRFunción
CalorDenat. DNA
Componentes de una reacción de PCR
Buffer (contiene Mg++), pH 8.2
DNA templado
2 Primers que flanquean el fragmento deDNA a ser amplificado
dNTPs
Taq DNA Polimerasa (u otra DNApolimerasa termoestable)
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PCRMelting
94 oC
5’ 3’ 3’ 5’
T e m p
e r a t u r a
100
0
50
Tiempo•RAMP
•HOLD
Melting
94 oC
T e m p e r a t u r a
100
0
50
Tiempo
3’ 5’
5’ 3’
To
PCR
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Melting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension
72o
C
T e m p
e r a t u r a
100
0
50
Tiempo
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’
Melting
94 oC
Extensión:
1 min./Kb
Annealing:
Depende de
Tm de primers
PCR
PCR
Melting
94 oC
Melting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
T e m p e r a t u r a
100
0
50
30x
3’ 5’
5’ 3’
To
To
5’
5’
5’
Tiempo
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PCR
Melting
94 oC
Melting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension
72o
C
T e m p
e r a t u r a
100
0
50
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
Tiempo
PCR
Melting
94 oC
Melting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
T e m p e r a t u r a
100
0
50
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
To
To
Tiempo
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PCR
Melting
94 oC
Melting
94 oCAnnealing
Primers50 oC
Extension
72o
C
T e m p
e r a t u r a
100
0
50
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
Tiempo
Fragmentos de
largo definido
PCR
Melting
94 oC
Melting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
T e m p e r a t u r a
100
0
50
30x
3’ 5’
5’ 3’ 5’
5’ 5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
Tiempo
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DNA entre los partidores se duplica con cada ciclo
térmico
0
Ciclos
Número1
3
8
2
4
1
2
4
16
5
32
6
64
Más Ciclos = Más DNA Número de ciclos
0 10 15 20 25 30Marcador
De tam.
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Amplificación teórica del PCR
Copias = 2n x y
donde y = número inicial de copiasn = número de ciclos térmicos
= 107,374,182,400
Si se parte con 100 copias, ¿cuantas copias se hacen
en 30 ciclos?
2n x y
= 230 x 100
= 1,073,741,824 x 100
¿Porque no se alcanza esta eficiencia?
General: componentes, ciclos, viales
Partidores, diseño, cantidad
Volúmenes de reacción
Buffers, sales, dNTPs, MgCl2 Programa: tiempos, Tos.
Taq: tipo, cantidad
Optimización del PCR
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Sensibilidad.
Contaminación de muestras con DNA no deseado.
Siempre tener control negativo y positivo
Usar reactivos y condiciones óptimas
Sector dedicado, puntas con filtro, etc.
Principal problema del PCR
TA Cloning
Taq tiene actividad de transferasa terminal; deja As
extras en extremos 3’OH
QuickTime™ and a
TIFF (LZW) decompressor are needed to see this pi cture.
GATAC…………………………………………GGTTCTA
ACTATG…………………………………………CCAAGA
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Tipos de PCR
Anidado (nested)
Mismatch (mutación, sitio de restricción)
Deleción/Inserción
Asimétrico (secuenciación)
Inverso
Ligation-mediated
RT-PCR
5’ y 3’ RACE
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The Human Genome Project strategy
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https://www.google.com.pa/search?q=humano&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=6IDYUbSbFKHc0QHFkoCwCA&ved=0CAcQ_AUoAQ&biw=1422&bih=636#facrc=_&imgdii=_&imgrc=o2pd9RySl1B0XM%3A%3BizBU2qWP90OMJM%3Bhttp%253A%252F%252Fus.123rf.com%252F400wm%252F400%252F400%252Feraxion%252
Feraxion0804%252Feraxion080400807%252F2891069-esqueleto-humano.jpg%3Bhttp%253A%252F%252Fes.123rf.com%252Fphoto_2891069_esqueleto-humano.html%3B900%3B1200
Revisión del genoma Humano
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Synteny in the mouse and human genomes
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DNA microarray
DNA microarray
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DNA microarray
DNA microarray
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Organismos transgénicos
Organismos transgénicos
http://lightyears.blogs.cnn.com/2012/07/12/genetically-modified-mosquitoes-fight-dengue-fever/
Genetically modified mosquitoes fight dengue fever
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Alison Van Eenennaam, Ph.D. //// Cooperative Extension Specialist///Animal Biotechnology and Genomics
http://animalscience.ucdavis.edu/animalbiotech/Outreach/Overview_of_transgenic_fish_slide_show.pdf
Alison Van Eenennaam, Ph.D. //// Cooperative Extension Specialist///Animal Biotechnology and Genomics
http://animalscience.ucdavis.edu/animalbiotech/Outreach/Overview_of_transgenic_fish_slide_show.pdf
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Transfer of DNA to plant cells by a bacterial parasite
The Ti (tumor-inducing) plasmid of Agrobacterium tumefaciens.
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