Cold-PCR &Droplet Digital PCR
”Fortynding” af cancer med normale celler
Cancercelle ”fortyndet” i normale celler
Cold-PCR vs konventionel PCR
Lightscanner & heteroduplex princip
Homoduplexer
G CA C G T A T
HeteroduplexerA T
G C
Fortyndinger og LightScanner resultater
Ved forbrug af 50ng DNA/reaktion vil forholdet mellem WT kopier og variant DNA kopier være følgende: 1:1 - 50% - 8325/8325 kopier1:10 - 10% - 14985/1665 kopier1:20 - 5% - 15818/833 kopier1:40 - 2,5% - 16234/416 kopier1:80 - 1,25% - 16442/208 kopier1:160 - 0,625% - 16546/104 kopier1:320 - 0,3125% - 16598/52 kopier
Sekventering af fortyndingerKonventionel vs Cold-PCR
Konventionel PCR – heterozygot 1:1
Konventionel PCR – fortynding 1:20
Cold-PCR – diverse fortyndinger
10%
5%
2,5%
1,25%
0,625%
Reference-artikel Coren A. Milbury et al. Clin.Chem.
Droplet Digital PCR Introduktion
Taqman-prober til detektion (1)
FRET FRET
Match Mismatch
FRET
FRET
Taqman-prober til detektion (2)
SNP: A T
VIC
AT
FRET
FAM
TA
FRET
Taqman kromatogram (3)
Droplet Digital PCR – 3rd Generation af PCR
PCRKvantificering
1st 2nd 3rd
Real-time PCRRelativ Kvantificering
Droplet Digital PCRAbsolut Kvantificering
Droplet Digital PCR Workflow
1. Mix reagenser og prøver i 20,000 droplets2. Udfør PCR på termocycler 3. Kvantificer target DNA/RNA ved at tælle prøve-droplets via
fluorescence-signal 4. Digital aflæsning giver absolut måling af target DNA
Lav Droplets PCR Droplets Aflæs Droplets
Produktion af DropletsPlacer engangs cartridge med prøver og droplet-olie i QX100 Droplet Generator20,000 droplets per prøve, 2 ½ min for 8 prøver
Ensartede droplets
Droplets på PCR maskine
Forskellige experimenter på samme plade Er ikke låst fast i specifikke PCR protokoller, men kan tilpasses det ønskede target
Overfør emulsion til 96-brønds PCR plade
Aflæsning af Droplets Load 96-pladen i QX100 Droplet Readeren
Autosampler håndterer den enkelte prøve uafhængigtDroplets ledes forbi optisk detector, der detekterer flourescenssignal fra hver droplet (32 brønde / time)
Precision fra 10% fortyndinger
1.1-fold fortyndingsrække af S. aureusKonstant humant gDNA
DNA fra 7 cellelinier med kendt copy number variationResultaterne er normaliseret overfor en kopi af
RNase P
Copy Number Variation
ddPCR individual wells ddPCR merged wells
BRAF V600E fortynding af DNA