Det nya blodgruppsystemet FORS
Annika Hult1,2
BMA, PhD
Equalis användarmöte, Transfusionsmedicin 131023
Lola Svensson3, Robert Stamps4, Jill R
Storry1,2, René Jørgensen5, Lennart Rydberg3,
Stephen M Henry6 och Martin L Olsson1,2
1. Dept. of Laboratory Medicine, Lund University, Lund, Sweden.
2. Dept. of Clinical Immunology and Transfusion Medicine, University and Regional Laboratories of
Region Skåne, Lund, Sweden.
3. Dept. of Clinical Chemistry and Transfusion Medicine, University of Gothenburg, Gothenburg, Sweden.
4. Red Cell Immunohaematology Laboratory, NHS Blood and Transplant, Sheffield, United Kingdom.
5. Carlsberg Laboratories, Copenhagen, Denmark.
6. Auckland University of Technology, Auckland, New Zealand.
Transfusionsmedicin, den moderna erans början
Landsteiner K. Zur Kenntnis der antifermentativen, lytischen und
agglutinierenden Wirkungen des Blutserums und der Lymphe. Zbl Bakt.
1900;27:357-362.
Landsteiner K. über Agglutinationserscheinungen normalen Menschlichen
Blutes. Wiener Klinische Wochenschrift. 1901;14:1132-1134.
Upptäckten av ABO-blodgruppsystemet
Blandade blod från kollegor i labbet och
såg ett mönster
A, B, O (och senare även AB)
Fick Nobelpriset 1930 för denna upptäckt
Karl Landsteiner (1868-1943)
Vad är ett kriterierna för ett blodgruppssystem?
Antigenet ska finnas på erytrocyter
Någon ska ha gjort en antikropp mot antigenet (human alloantikropp)
Ärftlighet ska vara visad
Genetiska bakgrunden ska vara definierad ”controlled at a single gene locus, or by two or more very
closely linked homologous genes”
Godkänns av ISBT (International Society of Blood Transfusion)
http://www.isbtweb.org/working-parties/red-cell-immunogenetics-and-blood-group-terminology/blood-
group-terminology/
Hur många blodgrupper finns det?
Idag finns 33 blodgruppssystem, t.ex. ABO, Rh, Kell, Duffy
(vilket totalt inkluderar 297 antigen)
Dessutom finns 42 antigen som inte uppfyller kriterierna för
blodgruppssystem och därför hamnar i….
Blood group collection
700 serien (lågfrekvensantigen, <1%)
901 serien (högfrekvensantigen, >90%)
http://www.isbtweb.org/working-parties/red-cell-
immunogenetics-and-blood-group-terminology/blood-
group-terminology/
ABO
P1Pk
Lewis
GLOB
FORS
H
I
Host defence/
innate immunity
Glycoproteins of
structural or
unknown function
Complement
regulation
Adhesion molecules
Transporters
and channels
Enzymes
LW
Xg
Duffy
Lutheran
Indian
Scianna
Raph
JMH
Oka
Blodgrupper
Figur lånad av Jill Storry
Genen Genetisk nivå
Glycosyltransferas (GT) Enzymnivå
Kolhydratantigen Glykokonjugatnivå
Antikroppar Immunologisk nivå
Kolhydratantigen, fyra nivåer
Antikropparna är inblandade i
Hemolytiska transfusionsreaktioner
Hemolytisk sjukdom hos nyfödda
Upprepade missfall
Antigenen kan vara Receptorer för olika patogener
Förändrat uttryck vid malignitet
Förändrat uttryck under graviditet
Varför är kolhydratblodgrupper viktiga?
Blodgrupp/
antigen Microorganism Sjukdom
ABO, MNS Plasmodium falciparum Malaria
P1, Pk Escherichia coli UTI
P Escherichia coli UTI
Leb Helicobacter pylori Gastritis
H, Leb Burkholderia ambifaria Lung infection
ABO, LE Vibrio cholerae Cholera
P Parvovirus B19 Fifth disease
Pk HIV AIDS
H/Leb Norovirus Gastroenteritis
ABO LE H Rotavirus Infantile
gastroenteritis
Serologin – en paradox
Pab (anti-A, anti-A,B) pos/neg
Mab (anti-A)
neg
Helix Pomatia pos
Anti-A detekterbart i plasma
Applied Blood Group Serology
P. Issit & D. Anstee
Vår hypotes var att detta skulle kunna vara en
A-lik men unik glykolipid-struktur.
Apae#1
Apae#2
Borde inte
A-subgrupper vara
heterozygota för en
A-allel….?
Första ABO-subgruppen
utan ett funktionellt ABO
transferas?! Njaaee…
O1O1
O1O1v
ABO-genotypning av Apae-individer
Avsaknad av A-specifika band när man testar med anti-A
Band motsvarande Forssman (Fs) glycolipiden när man testar med Helix pomatia
Fs-glycolipiden verifierad med Mab anti-Fs
Strukturanalys av glycolipider med MS/MS och NMR identifierar Forssmanstrukturen som Apae-antigenet
Tunnskiktskromatografi
H Prekursor
Donator
socker
Antigen
På
erytrocyter
P
α3GalNAc α3GalNAc
A Fs
Däggdjur (ej primater)
A glykosyl-
transferas Forssman-
syntas
Människa/
Apor
GalNAcα3GalNAcβ3Galα4Galβ4Glcβ1Cer GalNAcα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer
Vad är Forssman i jämförelse med ABO?
Forssman ABO
a b MAb Anti-Fs X-test
Grupp B plasma
Apae #1 Apae #2
O Får
Hund
A1
Apae #1
Apae #2
O
Fs-antigen finns på Apae-erytrocyter Anti-Fs i plasma från icke-Apae-givare
Korstest med eluat från Apae#2
O A2 A1 Apae#1 Hund Får
Flödescytometrisk karaktärisering av
erytrocyter från Apae-individer
Turcot-Dubois A-L et al. Glycobiology, 2007;17(5):516-28.
ABO Homo sapiens
GBGT1
Homo
sapiens
GBGT1
Canine
ABO-kluster FS-kluster
Fylogenetiskt dendrogram av ABO (GT6) gen-superfamiljen
Human
konsensus 887G*
Human Apae#1
887G>A
(Arg296Gln)
Gorilla
konsensus 887G**
Apae#1 pos neg H2O M
PCR-ASP 887G>A
Arginin = human +
primat
konsensus
Glutamin = hund
konsensus
GBGT1, en förmodad pseudogen, ändras till
hundvarianten i Apae-individer!
* >250 givare med normal ABO-grupp **fem andra primater var också negativa *** hittad i 7 av 104 givare
Apae#1-
familjen Apae#1
O1O1
GBGT1
887G/A
A
A
A1O1
GBGT1
887G/G
Apae
O1O1
GBGT1
887G/A
O
O
O1O1
GBGT1
887G/G
nt
A
A1O1
GBGT1
887G/G
nt
A A
A1O1
GBGT1
887G/G
I
II
III A
A1O1
GBGT1
887G/G
Apae#2-
familjen Apae#2
O1O1v
GBGT1
887G/A
Apae
O1O1v
GBGT1
887G/A
O
†
O
O1O2
GBGT1
887G/G
O
O1O1v
GBGT1
887G/G
O
O1vO1v
GBGT1
887G/G
I
II
Apae
III
nt O
O1O1v
GBGT1
887G/G
?
O1O1
GBGT1
887G/A
887G>A
detekterades i
olika alleler hos
dessa två familjer!
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
BM n=1 Blood n=4
%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Blood n=4 Apae#1 Apae#2
%
GBGT1-mRNA från perifert blod i vanliga vs. Apae-fenotyper
GBGT1-mRNA från benmärg vs. perifert blod
% o
f h
igh
est e
xp
ressio
n
% o
f h
igh
est e
xp
ressio
n
GBGT1-mRNA uttrycks i blod och benmärg
ABO
hFS
Acceptor
ABO:
His301
Donator
socker
3D-modell av Forssman-syntaset baserat på
kristallstrukturen av ABO-transferaset
O A2 A1 O
3 2 1
– – –
+ + +
+ + +
– – – –
+ + + +
– – – –
Parent
Strain, K12
(HB101)
P-fimbriated
strain, papG
(HB101.AD110)
Fs-binding
strain, prsG
(HB101.JFK102)
Sheep Apae#2 Apae#1
Neg kont.
Pos kont.
Negativ Positiv
Fs-positiv
Fs-bindande E.Coli agglutinerar får- och Apae-erytrocyter
Vidare studier….
Expressionsstudier
- Kan (887G>A) Arg296Gln aminosyraskiftet
göra enzymet aktivt?
Hemolysintest
- Är anti-Fs en kliniskt signifikant antikropp?
VEKTOR VEKTOR MED INSERT
+
Transfektion av MEG-01
GBGT1 vildtyp 887G
GBGT1 mutant 887A
B3GALNT1 P-transferas
DNA Mutation introducerad via mutagenes
+
ELEKTROPORERING
Transfektion av MEG-01
P Fs
P Fs
Odlar cellerna i
ytterligare 48h
Glc Gal GalNAc
P
Fs
P-antigenet
Nomenklatur enligt Consortium for Functional Glycomics
P
Fs
P-antigenet
Fs-antigenet
GBGT1 887G
vildtyp GBGT1 887A
mutant
Transfektion av MEG-01
Pk-antigenet Pk-antigenet β3
β3 α3
***
Resultat av transfektion av MEG-01
- Tre experiment
- Trippelprover i varje experiment
887A 887G inget
Forssman-negativitet i människa
Hemolysintest
Metod modifierad från Mollison (Blood Transfusion in Clinical Medicine, 10th edition 1997)
- Färskt serum från blodgrupp O och B givare med starkt anti-Fs
- Apae erytrocyter
- ABO-kompatibla och icke-kompatibla erytrocyter
- Både nativa och papainiserade erytrocyter användes
- Hemoglobin-nivåer lästa på HemoCue Low
Anti-Forssman, en naturligt förekommande antikropp
Hemolysin test; group B serum
Apae#1 Apae#2 O O A1 B
0
2
4
6
8
10
12
Apae
#1
Apae
#2
O O A1 B
Hem
oglo
bin
g/l
Apae#1 Apae#2 O O A1 B
Hemolysin test; group O serum
0
2
4
6
8
10
12
Apae
#1
Apae
#2
O O A1 B
Hem
oglo
bin
g/l
Apae#1 Apae#2 O O A1 B
Apae#1 Apae#2 O O A1 B
Hemolysintest - Resultat
Konklusion
Hemolysintest
- Indikerar att anti-Fs kan binda komplement
- Vilket potentiellt kan orsaka intravaskulär hemolys av
Fs-positiva erytrocyter
Bör dessa individer vara blodgivare?
BAS-test? MG-test?
Expressionsstudier
- Signifikant skillnad av Fs-antigenuttryck vid transfektion av
vildtyp och mutant
- Detta indikerar att bytet 887G>A (Arg296Gln) ger upphov
till aktivering av Forssman-syntaset
Lactosylceramide
Pk, Gb3 (CD77) Lactotriaosylceramide
P1
4-α-galactosyltransferase (A4GALT)
4-β-galactosyltransferase 3-β-N-acetylgalactosaminyltransferase
(B3GALNT1)
3-β-galactosyl- transferase
(B3GALT5)
3-α-galactosyl- transferase
(ABO)
3-α-N-acetylgalactos-aminyltransferase
(ABO)
3-β-N-acetylglucosaminyltransferase
Paragloboside, nLc4
Gb5 (SSEA-3)
2-α-fucosyl- transferase
(FUT1)
A B
H
Globo-H
A type 3
4-α-galactosyl-transferase (A4GALT)
3-α-N-acetylgalactosaminyltransferase (ABO)
LKE (SSEA-4)
3-α-galactosyl- transferase
(ABO)
3-α-N-acetylgalactos-aminyltransferase
(ABO)
Globo-A Globo-B
2-α-fucosyltransferase (FUT1)
α-sialyltransferase (?)
NOR 1
4-α-galactosyl- transferase
(A4GALT)
PX2
3-β-N-acetylgalactos-aminyltransferase
(?)
2-α-fucosyltransferase (FUT1)
P, Gb4 (globoside)
Forssman 3-α-N-acetylgalactos-
aminyltransferase (GBGT1)
…till ära av John Forssman (1868-1947), som 1911 beskrev antigenet
Professor i Mikrobiologi, Patologi och Allmän Medicin Lunds Universitet, Lund
Vi föreslog att Forssman-antigenet blir godkänt av ISBT som ett nytt histo-blodgruppssystem, FORS (031)….
Vid 32nd International Congress of the ISBT, Cancun, Mexico
godkändes Forssman som ett eget blodgruppsystem
Nummer 031
Systemnamn FORS
Systemsymbol FORS
Antigen FORS1
Gen GBGT1
Blodgruppsystem 031
“ABO-subgruppen” Apae visades vara ABO-oberoende
Forssman-antigen påvisades för första gången i normal hematopoetisk vävnad
Strukturen av Forssman-antigenet konfirmerades med MS/MS och NMR
I GBGT1-genen hos alla Apae-individer påvisades en djur-associerad mutation som
ej fanns hos icke-Apae familjemedlemmar, normala givare och sex andra primater.
Signifikant skillnad av Fs-antigenuttryck vid transfektion av vildtyp och mutant
Den kliniska signifikansen av anti-Fs är ej känd men Apae-givare kan bli
korstestpositiva med patientplasma
Hemolysintest indikerar att anti-Fs kan binda komplement vilket potentiellt kan
orsaka intravaskulär hemolys av Fs-positiva erytrocyter
Konklusion
FORS
Transfusion cover, 2010
Fs, 1911
JR
LAN
VEL
Blodgruppsystem 031
Tack till:
Göteborgs Universitet, Göteborg
Lola Svensson
Lennart Rydberg
Susann Teneberg
Jonas Ångström
Bo Samuelsson
Michael Breimer
Gunnar Hansson
Göran Larsson
Jonas Nilsson
Auckland University of Technology,
Auckland, New Zealand
Steve Henry
Lunds Universitet, Lund
Martin L Olsson
Jill R Storry
Britt Thuresson
Maj-Lis Svensson
Catharina Svanborg
NHSBT, Sheffield, UK
Robert Stamps
Carlsberg Research Laboratory,
Copenhagen, Denmark
René Jørgensen
Och naturligtvis Apae-familjerna!