Cooperazione tra determinanti
citoplasmatici e reazioni
induttive per specificare il
destino dell’embrione
….allo stadio a 32 blastomeri ogni singola
cellula uccisa porta alla mancanza della
discendenza
C. elegans
1974: Sydney Brenner first introduced
Caenorhabditis elegans in the scientific community
as a model organism.
The nematode has been extensively used as a
model system to study cellular biology. One of the
most intriguing fields of molecular biology that
have been investigated using this model host and
that led to the 2002 Nobel Prize in Physiology or
Medicine, is programmed cell death.
Caenorhabditis elegans
Kuranaga, 2011: evolutionarily conserved
method employed by multicellular
organisms to maintain tissue homeostasis
during development and differentiation;
Bailly and Gartner, 2013: it can also serve
as a way to prevent growth of cells mutated
due to DNA damage.
Apoptosis
Vogt, 1842: la morte cellulare è parte del normale sviluppo.
Lockshin and Williams, 1965: propongono il termine
morte cellulare programmata (Programmed Cell Death)
osservando che alcune cellule destinate a morire durante
la metamorfosi di anfibi e insetti sembrano essere guidate
da un programma intrinseco alla cellula stessa.
Kerr, Wyllie and Currie, 1972: introducono il termine
apoptosi (dal greco antico: come il cadere delle foglie) per
descrivere la morte cellulare associata con una serie di
caratteristiche morfologiche comuni e ben definite.
Horvitz and Sulston, fine degli anni 70: caratterizzazione
genetica dei componenti critici che regolano i meccanismi
apoptotici utilizzando il nematode C. elegans.
Apoptosi
Apoptosis in C. elegansAbout half of all neurons born will die through a pre-programmed “suicide” mechanism called apoptosis
Motor neuron expressing different colored fluorescent proteins in a C. elegans larva.Image courtesy of David Miller, Ph.D., Vanderbilt Department of Cell & Developmental Biology
Apoptosis in C. elegans
Seven Apoptotic cells (arrows) which appear as “raised button” objects in a C. elegans embryo are shown.Some apoptotic cells are not visible at this focus plane.
Confocal fluorescent image of a wild-type C. elegans embryo (anterior to the left) apoptotic cells with condensed DNA
La caratteristica …..…unica di questo organismo è rappresentata da un
numero costante di cellule: 959
1090 cells
Ced 9 agisce come freno
Ricerca di mutazioni in cui il pattern di morte cellulare è alterato: identificazione di regolatori apoptotici poi ritrovati anche in mammiferi
La clonazione dei geni apoptotici di
C. elegans e la loro caratterizzazione
hanno permesso di comprendere gli
eventi molecolari dell’apoptosi e di
identificare gli effettori omologhi dei
mammiferi
ced 4 Apaf 1
ced 9 Bcl-2
Ced-3 e ced-4: mutazioni che li inattivano portano alla conservazione di tutte e 131 le cellule “condannate a morte”
Ced-9: mutazioni che inattivano ced-9 portano a morte cellulare estesa a tutte le cellule, livelli aumentati di espressione di ced-9 bloccano l’apoptosi.
C. elegansapoptotic genes
Nei doppi mutanti ced-9/ced-3 la morte cellulare non si verifica: CED-9 agisce a monte di CED-3 inibendo la via apoptotica.
Studi genetici in C. elegans
Larva appena schiusa con mutazione del gene ced-1 che impedisce la fagocitosi delle cellule morte.
Studi genetici in C. elegans
Larva appena schiusa con mutazione del gene ced-1 e ced-3. L’assenza di cellule morte dimostra che l’apoptosi non avviene. La proteina CED-3 è necessaria per l’apoptosi.
Evolutionary conservation of apoptotic patrhways
EGL-1 funziona da attivatore a monte del processo di morte cellulare programmata regolandola positivamente: interagisce direttamente con CED-9 per indurre il rilascio CED-4
Il gene bcl-2 è stato isolato in tumori umani
Il primo gene per l’apoptosi clonato nei
mammiferi è stato il gene bcl-2
Promuove la sopravvivenza delle cellule
Le proteine Bcl-2 e CED-9 sono
omologhe e fungono da proteine
regolatrici che inibiscono la via
apoptotica
La famiglia Bcl-2:
regolazione della sopravvivenza e
dell’apoptosi
Adams, J. & Cory, S. (1998). Science 281: 1322-1326.
Queste proteine possono essere localizzate sulla membrana nucleare, su quella mitocondriale esterna e su quelle del reticolo endoplasmatico
Bcl-2 family
Geni anti apoptotici
Geni proapoptotici
Bcl-2
Bcl-XL
Bax
Bad
La sensibilità della cellula agli stimoli apoptotici dipende
dall’equilibrio dei due gruppi
Perché una cellula dovrebbe
suicidarsi?
A volte la morte cellulare rappresenta un
evento positivo per l’organismo
1. L’apoptosi é richiesta per un normale
sviluppo embrionale
2. L’apoptosi é necessaria per la distruzione di
cellule che rappresentano una minaccia per l’integrità dell’organismo
Vari processi dello sviluppo
coinvolgono l’apoptosi
A. Eliminazione di organi transitori e di tessuti
Pronefro e mesonefro nei vertebrati superiori
Chiusura del tubo neurale, loop cardiaco
Coda e branchie degli anuri
Organi larvali negli insetti olometaboli
B. Rimodellamento tissutale
Sviluppo degli arti
C. Omeostasi cellulare
turnover fisiologico delle cellule “mature” in tessuti
continuamente proliferanti
Sindattilia
1/2500 nascite
L’apoptosi è il risultato di un
equilibrio
Aumento Apoptosi
AIDS
Malattie neurodegenerative
Malattia di Alzeheimer,
Morbo di Parkinson,
Malattia di Huntington
Inhibizione Apoptosi
Cancro
linfoma Follicolare
carcinomi con mutazione di p53
Malattie Autoimmuni
Lupus erytematoso sistemico
Infezioni Virali
Herpesvirus, poxvirus, adenovirus
Il processo apoptotico
NECROSI
APOPTOSI
For every cell, there is a time to live and a time to die.
Apoptosi vs necrosi
Richiede alcune ore
Irreversibilità
Fisiologico
Riduzione dei contatti
Processo controllato
Evento acuto che si
completa in pochi minuti
Può regredire e la cellula
recuperare funzionalità
Trauma
Lisi cellulare
Rilascio di citoplasma
Risposta infiammatoria
Fasi dell’apoptosi
Death signals
condensation
fragmentation
engulfment
Induzione
Esecuzione
Riconoscimento e Fagocitosi
Degradazione
Eventi molecolari, biochimici e morfologici
FASI DELL’APOPTOSI- 1
FASE DI INDUZIONE
I diversi stimoli ed eventi apoptogeni seguono due
(o forse più) distinte pathways: una attivata dai
"segnali di morte" che giungono ai recettori di
superficie, l'altra attivata da segnali endogeni e
regolata dal mitocondrio.
Si ritiene che tali pathways siano regolabili e
reversibili fino al momento in cui convergono
nell'attivazione delle caspasi.
Fattori che scatenano
l‘apoptosi
Stimoli apoptoticiestrinseci
1. Legame (di ligandi che
inducono morte) ai recettori
di superficie
2. Recettori che si legano ai
linfociti T citotossici (4)
intrinseciseguono ad uno stress cellulare
coinvolgimento dei mitocondri
1. Esposizione a radiazioni
2. Esposizione a sostanze chimiche
3. Esposizione ad agenti virali
4. Mancanza del fattore di crescita
5. Stress ossidativo
Death receptors
Recettori specifici sulla superficie cellulare trasmettono il
segnale apoptotico, grazie a specifici ligandi
Questi recettori appartengono alla superfamiglia
dei TNF, svolgono anche altre funzioni
Recettori della morte meglio caratterizzati: CD95 (or
Fas), TNFR1 (TNF receptor-1) e i recettori DR4 and
DR5 TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand).
Tumour Necrosis Factor Receptor-1 (TNFR1)
Il legame porta ad una
trimerizzazione del recettore
che lega TRADD e FADD
(molecole adattatrici) e la pro-
caspasi 8
Attivazione dell’apoptosi attraverso CD95/Fas
Il ligando per CD95 è un trimero, legato al recettore promuove l’associazione del DD (Death Domain) con altre molecole
FADD= Fas associate death domain
Il complesso CD95/FADD lega
la pro-caspasi 8
Caspasi 8
Caspasi 9
La via di segnalazione mitocondriale
Ruolo dei mitocondri
Proteine antiapoptotiche della
famiglia di Bcl2 si trovano sulla
membrana esterna e promuovono la
sopravvivenza della cellula
I mitocondri possono favorire
l’apoptosi attraverso il rilascio di
citocromo C
Citocromo c + Apaf- 1+ ATP + pro-caspasi 9
Caspasi 9 Cascata delle caspasiBax e bad= pore forming protein
FASI DELL’APOPTOSI- 2
FASE DI ESECUZIONE
L'attivazione delle caspasi è determinata da un evento
proteolitico e determina a sua volta un'ulteriore cascata di
eventi proteolitici e nucleolitici preordinati, che amplificano
il segnale e portano alle tipiche modificazioni morfologiche
dell'apoptosi.
La finalità è quella di predisporre la cellula ad essere
facilmente fagocitata
Attivazione delle caspasi
(cysteinyl aspartate-specific proteinases )
Proteine che tagliano specifici substrati: proteine
strutturali del citoscheletro e proteine nucleari
(enzimi che riparano il DNA)
Nell’uomo sono state identificate più di 10
proteine
Cistein proteasi
-Nella cellula si trovano nella forma inattiva
(zimogeno).
-Passano nella forma attiva in seguito all’induzione
del processo apoptotico.
Le caspasi possono essere suddivise in due classi
principali:
1. iniziatrici (o di avvio)
2. effettrici.
Le caspasi di avvio sono responsabili
dell’attivazione delle caspasi effettrici.
Nuclear activation
Un evento tipico dell’apoptosi
è la suddivisione del DNA in
nucleosomi
E’ un evento che segue
l’attivazione delle caspasi
Poly(ADB ribosio) polimerasi
Ripara il DNA
Substrato per le caspasi, è coinvolta nei processi
di riparazione del DNA
caspase activated DnaseICAD normalmente inattiva, durante l’apoptosi diventa
CAD (nucleasi)
La cellula in apoptosi subisce modificazioni
morfologiche e biochimiche che portano alla
sua frammentazione e ne favoriscono la
fagocitosi
CELLULA APOPTOTICA AL
MICROSCOPIO ELETTRONICO
Elettroforesi del DNA di cellule in apoptosi
1- DNA di cellule in apoptosi: si può osservare il ladder (scaletta),
formato da frammenti di peso molecolare discreto (multipli
di nucleosomi)
2- DNA ad alto peso molecolare di cellule integre
3- DNA di cellule in necrosi: i frammenti sono di peso molecolare
vario, per lo più piccolo
Fagocitosi: segnali “eat-me” nelle
cellule di mammifero
Fagocitosi di cellule apoptotiche
Cell surface modifications:
phosphatidylserine exposure