Laboratorio de Microbiología
General II
Equipo 3, 2752
•Adiestrar al alumno en el manejo
de la técnica inoculación de
embrión de pollo por las vías más
utilizadas.
•El alumno conocerá las diversas
partes del embrión de pollo de 9
días de inoculación.
• Se denomina efecto citopático a los cambiosbioquímicos y moleculares, morfológicos y deviabilidad celular, visibles a microscopíaóptica, causados durante el ciclo dereplicación viral.
• Aunque todos los virus líticos producenefecto citopático, puede observarse una grandiversidad de manifestaciones
• La mayor parte de las observaciones del ECPse han realizado en células infectadas encultivo, en las que se aprecia: pérdida deadherencia al sustrato, inhibición porcontacto, redondeamiento celular, formaciónde sincitios, cuerpos de inclusión citosólicos,transformación celular, lisis, etc.
• Es la conclusión delconjunto dealteraciones celularesque se producen,secuencial osimultáneamente en lacélula infectada,liberando finalmente almedio las nuevaspartículas virales.
• Muchos tipos de virusinducen la aparición deestructurasmembranosas en elcitoplasma, en algunoscasos en forma degrandes vacuolascitoplasmáticas opequeñas.
• Los sincicios songrupos de célulasfusionadasapreciables comouna masa celularmultinucleada
• Es una alteración en el crecimiento normal delas células en cultivo con evidentesmanifestaciones morfológicas.
• Se asocia a una serie de cambio moleculares yestá especialmente ligada a virus que insertansu genoma en el de la célula infectada, pudiendocausar mutagénesis insercional al interrumpirantioncogenes o activar pro-oncogenes, oalterando la correcta regulación de la expresióngénica celular.
• Las alteraciones bioquímicas son muy diversas yespecíficas de cada virus, si bien puedenseñalarse las más importantes a nivel general.
• Algunos virus son capaces de mostrar estainhibición en etapas tempranas de la infecciónpero la mayoría de los virus animales lo hacenen etapas tardías. El efecto más drástico sueleproducirse en la inhibición de la expresión deproteínas celulares por traducción preferente ocasi exclusiva de proteínas virales.
• 1.- Inhibición de la síntesis de proteínas celulares
• 2.- Inhibición de la síntesis de DNA celular
• 3.- Inhibición de la síntesis de RNA celular
• Cambios en la actividad de enzimaspresentes en las membranas.
• Modificaciones en la funcionalidad delsistema vesicular.
• Aumento de la permeabilidad de lamembrana plasmática.
Los sistemas celulares utilizados para propagar los virus en el laboratorio son:
1.Animales de experimentación
2.Embriones animales
3.Cultivos celulares artificiales
La inoculación en animales de experimentación de muestrasclínicas o de virus para su aislamiento o propagación.
Poco usada
Se emplea únicamente cuando se trata de propagar virus cuyareplicación en los otros sistemas no es posible.
Los animales más utilizados:monos, los cobayos y los ratoneslactantes
Los más utilizados son los embriones de pollo
los huevos fecundados se incuban hasta el momento de suinoculación que suele oscilar entre 6 y 14 días.
Las inoculaciones, que pueden realizarse en diversas zonas delembrión (cavidad amniótica, saco vitelinol etc.).
Se cultivan células de mamífero en una sola capa (monocapa)sobre la superficie de un recipiente de plástico y son inoculadascon la muestra estudiada.
Después se observan a diario los cambios inducidos por virus(efectos citopáticos), a veces tan característicos que no serequiere de más investigación para informarlos, sin embargo, amenudo son necesarias algunas pruebas confirmativas, comoinmunofluorescencia.
Líneas celulares semicontinuas : Estas células derivan de tejido fetal humano oanimal. Poseen el cariotipo diplode normal y, por tanto, es posible utilizarlas en laproducción de vacunas. Tienen un periodo de vida limitado y sólo es posible hacersubcultivos de unas 50 generaciones.
Líneas celulares continuas: Las más utilizadas para el diagnostico. Derivan de untumor o de células normales que, después de cultivos repetidos, se transformantanto que actúan como células derivadas de tumor, es decir, poseen un númeroanormal de cromosomas, Estas células pueden propagarse de manera indefinida.
Cultivos de linfocitos: Los linfocitos B se dividen y continúan la división de maneraindefinida cuando están infectados por VEB. Esta característica es conocida comoinmortalización y se puede aprovechar como marcador del aislamiento de VEB.Los linfocitos T crecen en presencia de una linfocina, IL-2, el descubrimiento de estefenómeno ha sido fundamental para el estudio de los retrovirus humanos (VIH yHTLV) que logran propagarse en cultivos celulares con la formación de célulasgigantes sincitiales.
Tipo de cultivo Características Ejemplos Uso primario
Primario Diploide: Tipos celulares mezclados;
1ó 2 pasajes
Primario de riñon de mono
Influenza; parainfluenza;
algunos enterovirus
Líneas celulares Diploides: fibroblastos; pasajes limitados. (< 50-70)
Fobroblastosdipliodes humanos
(WI-38, MRC-5 o HRL)
Herpes simplex: citomegalovirus;varicela zoster,
rinovirus.
Líneas celulares establecidas
Heteroploides: pasajes continuos in
vitro.
GeLa; Hep-2 Tadenovirus: RSV
La inoculación animal siguesiendo un método de granvalor para estudiar:
La oncogénesis viralLa patología de lospadecimientos viralesLa respuesta inmune a losvirusEl efecto de los factoresambientales sobreinfecciones virales
Corpúsculos hallados por Negri en las células delsistema nervioso central de los animales muertos derabia; son específicos de esta enfermedad. Se trata dereacciones de la célula contra el virus. No se hallan enlos animales inoculados con la rabia experimental.
El virus de la Rabia en el cerebro de animales infectadosproduce Cuerpos de Negri de varias formas (menoresde 1 micrómetro de diámetro, con masas redondas uovales, y cintas de 2 a 10 micras de diámetro).
Estos son inclusiones eosinofílicas intracitoplasmáticasformadas por agregados de nucleocápside en lasneuronas de cerca de 50 a 80% de los humanosinfectados.
Histopatología de la rabia, cerebro. Cuerpos de Negri característicos están presentes con una célula
de Purkinje del cerebelo en este paciente que falleció por rabiaHistopatología de la rabia,
cerebro. Cuerpos de Negri característicos están presentes con una célula de Purkinje del cerebelo
en este paciente que falleció por rabiaVVV
• Se reconoce el embrión que esta vivo porqueen la transiluminación se ven como telaraña
venas que forman la membranacorioalantoidea y se observa que se desplazaun punto negro intermitente (el ojo).
• Al morir, los vasos sedesintegran y este yace fijoal polo superior del huevo.
• A medida que aumenta detamaño disminuye elvolumen de los líquidosextraembrionarios
Se emplean huevos con 5 a 14 días de incubación, según lavía de inoculación:
Membrana corioalantoideaCavidades alantoidea y amnióticaSaco vitelinoIntracerebralEndovenosa.
UTILIDAD: Es una fuente de tejido vivo conveniente y fácil de manipular
que se utiliza en la propagación, titulación e identificación de virus, así como
en la preparación de algunas vacunas virales.
MIXOVIRUS-Influenza
-Parotiditis
POXVIRUSViruela
HERPESVIRUSHerpes simplex
• Con colorante se observa: liquido alantoideo,albumina y cámara de aire teñidos
• Liquido alantoideo: virus hemaglutinantes oproducción de hemaglutininas
• Embrión de 9-12 días, inoculo de 0.1-0.2ml
• Con colorante: líquido amniótico, cámara deaire
• Primoaislamiento de cepas de influenza
• Embrión de 7-15 días, inoculo de 0.1-0.2ml
• Con colorante: Saco vitelino, Cámara de aire
• Cultivo de clamidias y ricketsias
• Embriones de 5-8días, inoculo de 0.2-1ml
Inoculación en saco vitelino
• Con colorante: membrana corioalantoidea
• Permite cuantificar aquellos grupos viralesque producen lesiones localizadas
• Embrion de 10-12 días, inoculo de 0.1-0.5ml
• La infección puede producir una lesión tisular localconocida como pústula (característico de virus)
• A veces se inyecta el virus directamente en el embriónen desarrollo: IV, intraperitoneal, o intracerebral.
• Tambien influye: la dilución, la cantidad del inóculo, latemperatura y tiempo de incubación tras lainoculación
MEMBRANA VIRUS TIPO DE EMBRIÓN
CANTIDAD DE INOCULACIÓN
SIGNOS DE CRECIMIENTO
Saco vitelino Herpes simpleNeumonía y Rickettsias
Se emplean embriones de
5 – 8 días
0.2 – 1 ml Muerte
Cariolantoíes Herpes simplePoxvirus
Sarcoma de RousVaricelaVirus de
Laringotraqueitisaviar
Enfermedad de Beyer
Se emplean embriones de 10 – 12
días
0.1 – 0.5 ml MuertePústulasPústulas
Focos o pústulas fácilmente visibles
Alantoides InfluenzaNew Castle
Virus de la bronquitis infecciosa
Se emplean embriones de
9 – 12 días
0.1 – 0.2 ml Hemoglutinación
Amniótica ParotiditisVirus de la Gripe
7 – 15 días 0.1 – 0.2 ml Muerte
Intravenosa Virus de la Leucemia 10 - 15 días 0.02 - 0.05 ml. Pústulas
Intracerebral Virus del herpesRabia
8 – 14 días 0.01 – 0.02 ml Alteraciones cerebrales
VENTAJAS DESVENTAJAS
Control preciso y fino del medio ambiente (fácilmanipulación)
Caracterización y homogeneidad de la muestra
Economía
No es necesario el espacio ni el cuidado querequieren los animales.
Mantenimiento de los cultivos celulares.
Se pueden cuantificar aveces al correlacionar elnumero de pustulas con la dilución viral inoculada.(Herpes y vaccinia).
Se emplea para preparar vacunas (influenza, fiebreamarilla)
Aislamiento para diagnostico (viruela, herpes,influenza)
Hacer ensayos de nuevos agentes virales
técnica sensible
calidad y costos
Inestabilidad
Apreciación difícil durante los tresprimeros días de edad del embrión
Estructura normal
• Iluminar con ovoscopio
• Identificar y marcar cámara de aire y mancha ocular
• Cortar cascara a nivel de cámara de aire
• Depositar en caja petri
Iluminar con ovoscopio(cámara de
aire)
Dividir imaginariam
ente (3 partes)
Señalar punto de inoculación
(a final de primer tercio)
Perforar (entre cámara
de aire y punto de
inoculación
Succionar en cámara de
aire
Aguja del 27, depositar
0.1ml colorante
Iluminar y marcar cámara de aire
Colocar embrión horizontal y encontrar saco vitelino (mancha
oscura y densa)
Introducir aguja larga del 22 con 0.1ml de
colorante
Marcar cámara y
Punto en la cima
iluminar
• Localizar zona libre de vasos
•Marcar punto de lado opuesto
Aprox. 5 mm por debajo de
camara
•Perforar puntos marcados
• Inocular 0.1 ml con aguja 27 corta
•O 22 larga en camara
Iluminar Marcar camara y punto en la cima
Marcar punto de inoculación (donde
esta embrion)
Inocular con aguja 22, 0.1ml
• Jean D. Acton. «Virología». Interamerica.Mexico. 1977 pp. 13-17
