LA DECISIONE 2015/495/EU (WATCH LIST):
DETERMINAZIONE DI MICROINQUINANTI EMERGENTI IN
ACQUE SUPERFICIALI MEDIANTE TECNICA
UHPLC-QQLIT-MS
Matteo Vitelli, Maddalena Busetto, Laura Clerici, Luisa Colzani, Maria
Giovanna Guiso, Simona Prosperini, Mauro Donzelli, Pierluisa Dellavedova
Michele Matiussi, Ivan Martinuzzi, Stefano De Martin
(ARPA Friuli Venezia Giulia)
Contaminanti emergenti: Contaminants of Emerging Concern (CECs)
La presenza di questa classe di sostanze nelle acque naturali a livelli compresi tra le frazioni
di ng/L e i µg/L nell’ambiente è stata riportata in letteratura, e comprende:
pesticidi, additivi in processi industriali, composti farmaceutici ed altri «personal care»
(PPCPs), metaboliti, estrogeni etc….
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LA DECISIONE 2015/495/EU (WATCH LIST)
Sviluppo di Metodi Analitici
Monitoraggio
Ricerca delle sorgenti di contaminazione
Trasporto e Destino ambientale “Enviromental fate”
Effetti ecologici e sanitari
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CONTAMINANTI EMERGENTI
Standard di Qualità
Ambientale (SQA)
RISK
ASSESMENT
I cosiddetti «contaminanti emergenti» includono, ad esempio:
• interferenti endocrini (Endocrine disrupting compounds - EDCs): tra gli effetti
riscontrati sul biota acquatico vi è la capacità degli estrogeni di indurre
l’ermafroditismo o modifiche nelle capacità riproduttive e nel comportamento di
alcune specie di pesci già a livelli di concentrazione intorno a 1 ng/L.
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CONTAMINANTI EMERGENTI: INTERFERENTI ENDOCRINI
• Antibiotici: gruppo di sostanze farmaceutiche utilizzate in grande quantità anche in
ambito veterinario (allevamenti). Sebbene biodegradabili, la continua immissione
nelle acque di tali sostanze ne provoca una «pseudo-persistenza». Tali sostanze sono
ritenute responsabili dello sviluppo di una resistenza degli agenti patogeni rispetto
all’azione degli antibiotici stessi.
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CONTAMINANTI EMERGENTI: ANTIBIOTICI
Tra gli obiettivi attualmente più sfidanti per i laboratori ARPA vi è quello derivante
dall’introduzione, da parte della normativa europea, di nuove molecole da
monitorare nel settore della politica delle acque in attuazione della direttiva
2008/105/EC (modificata dalla Direttiva 2013/39/EU, quest’ultima recepita in
Italia con il D.Lgs.172/2015).
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QUADRO NORMATIVO
All’elenco delle 45 sostanze/gruppi di sostanze da monitorare nelle acque
superficiali viene ad aggiungersi una «watch list» o lista di controllo di 10
sostanze/gruppi di sostanze con la recente Decisione 2015/495/EU.
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QUADRO NORMATIVO
Decisione 2015/495/EU
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SOSTANZE «WATCH LIST»
1. 17-Alpha-ethinylestradiol (EE2) (estrogeno sintetico contraccetivo)
2. 17-Beta-estradiol (E2), Estrone (E1) (ormoni naturali)
3. Diclofenac (antinfiammatorio, analgesico)
4. 2,6-diter-butil-4-metilfenolo (BHT - Butilidrossitoluene) (antiossidante)
5. 2-Etilhesil 4-metossicinnamato (EHMC) (filtro UV utilizzato in Cosmesi)
6. Antibiotici Macrolidi (Eritromicina, Claritromicina, Azitromicina)
7. Methiocarb (acaricida)
8. Neonicotinoidi (Imidacloprid, Thiacloprid, Thiamethoxam, Clothianidin, Acetamiprid)
(pesticidi)
9. Ossadiazone (pesticida)
10.Tri-allato (erbicida)
Le sostanze incluse in questo elenco sono
candidate ad entrare nell’elenco di priorità sulla
base di una valutazione del rischio e degli esiti
dei monitoraggi.
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PROBLEMATICHE ANALITICHE
Notevole differenza tra i diversi composti delle concentrazioni richieste.
EVOLUZIONE DELLE TECNOLOGIE DISPONIBILI
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In questo contesto normativo, è necessaria la disponibilità di metodi multiresiduo
molto sensibili, selettivi e accurati che permettano di determinare nel comparto
acque una grande varietà di sostanze, con caratteristiche chimico-fisiche tra loro
differenti e solitamente a livelli di concentrazione molto bassi.
Tra le varie metodologie, la tecnica strumentale per eccellenza oggi disponibile è la
cromatografia liquida accoppiata con la spettrometria di massa (LC-MS) nelle sue
forme più avanzate:
UHPLC – MS/MS oppure UHPLC – HRMS
UHPLC: Ultra High Liquid Performance Chromatography
(evoluzione dei materiali costituenti la fase stazionaria:
miglioramento della separazione dei picchi e rapidità della
corsa cromatografica (fino a 9 volte), oggi associata ad una
più rapida capacità di acquisizione e di processamento dei
segnali.
SPETTROMETRIA DI MASSA “TANDEM”
Q1
Q3
Q
2
823
502
226
226 502
200 1200
Selezione ione “precursore”
Frammentazionedello ione
“precursore”
Ioni “prodotto”
TRIPLO QUADRUPOLO – TRAPPOLA IONICA
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Q3Q2Q1
Trappola ionica
Triplo Quadrupolo
NUOVE TECNOLOGIE
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Analizzatori ad
alta risoluzioneAnalizzatore ad alta risoluzione:
possibilità di effettuare esperimenti di
MSn in cicli molto rapidi e ad alta
risoluzione (R=60000-100000) fornendo
informazioni strutturali ad elevata
sensibilità.
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NUOVE TECNOLOGIE : SPETTROMETRIA DI MASSA AD ALTA RISOLUZIONE
Tempo di volo (Time Of Flight): strumenti caratterizzati da accuratezza di massa
(<3ppm), risoluzione (20.000 a masse elevate), velocità di scansione (fino a 20000
scansioni/sec).
Possibilità di riconoscimento di strutture incognite mediante determinazione della
massa esatta.
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NUOVE TECNOLOGIE
SISTEMA IBRIDO: TRIPLO QUADRUPOLO/TRAPPOLA LINEARE
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PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
PREPARAZIONE DEL CAMPIONE: Solid Phase Extraction (SPE)
E’ spesso indispensabile la
concentrazione e la purificazione
del campione, al fine di limitare gli
effetti matrice. Si parte da volumi
d’acqua dell’ordine di alcune
centinaia di mL.
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SPE OFF-LINE
SVANTAGGI:
• Elevato volume di campione necessario
• Costi trasporto ????
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on-line SPE
E’ l’evoluzione della SPE off line: consiste nel prelievo diretto del campione d’acqua (es. 5
mL), arricchimento, purificazione e analisi HPLC-MS on-line.
(a) – Fase di caricamento del campione.
(b) - Fase di eluizione e separazione cromatografica.
SPE ON-LINE
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METODO «A»: ORMONI
Parametro Intervallo di taratura
“Limite massimo ammissibile del
metodo di rilevazione (ng/L)” (Decisione
495/2015)
Ripetibilità in matrice
(RSD%)
Recupero in matrice (%)
17-alfa-
etinilestradiolo
0,035 – 1,12
ng/L0,035 10,54 97,1
17-beta-
estradiolo 0,07 – 2,24 ng/L 0,4 17,20 98,6
Estrone 0,07 -2,24 ng/L 0,4 17,43 105,7
� Stabilizzazione del campione a pH=2
� Concentrazione 1:500 con cartucce SPE, stirene/divinilbenzene
� Eluato (5mL) iniettati in SPE on-line + LC-MS/MS
Separazione cromatografica:
Loading Pump: 100% H2O milliQ. Lavaggio SPE: Acetone: 2-propanolo: Acetonitrile 1:1:1
Fase A: 0,02% v/v Ammoniaca (pH=8)
Fase B: Acetonitrile: Metanolo 70:30 + 0,02% Ammoniaca
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METODO «A»: ORMONI
17 beta estradiolo
0.035 ng/L
17 alfa etinil estradiolo
0.1 ng/L
Estrone
0.1 ng/L
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METODO «B»: PESTICIDI MULTIRESIDUO
� Filtrazione con filtro 0,20µm
� Iniezione diretta
ParametroIntervallo di
taratura
“Limite massimo
ammissibile del metodo di
rilevazione (ng/L)”
(Decisione 495/2015)
Ripetibilità in matrice
(RSD%)
Recupero in matrice (%)
Diclofenac 5 – 500 ng/L 10 11,6 82,0
Metiocarb 5 – 500 ng/L 10 24,4 83,3
Imidacloprid 5 – 500 ng/L 9 12,3 100,8
Tiacloprid 5 – 500 ng/L 9 3,0 107,5
Tiametoxam 5 – 500 ng/L 9 9,3 72,1
Acetamiprid 5 – 500 ng/L 9 4,2 112,1
Clotianidin 5 – 500 ng/L 9 9,7 86,8
Ossadiazone 5 – 500 ng/L 88 11,4 101,1
Triallato 5 – 500 ng/L 670 4,1 90,5
4-metossicinnammato
di 2-etilesile(EHMC)5 – 500 ng/L 6000 10,9 90,6
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METODO «C»: ANTIBIOTICI
� Stabilizzazione del campione a pH=2
� Concentrazione 1:500 con cartucce SPE, stirene/divinilbenzene
� Eluato (5mL) iniettati in SPE on-line + LC-MS/MS
Separazione cromatografica:
Loading Pump: 100% H2O milliQ. Lavaggio SPE: Acetone: 2-propanolo: Acetonitrile 1:1:1
Fase A: 0,02% v/v Ammoniaca (pH=8)
Fase B: Acetonitrile: Metanolo 70:30 + 0,02% Ammoniaca
Parametro Intervallo di taratura
“Limite massimo ammissibile del
metodo di rilevazione (ng/L)”
(Decisione 495/2015)
Ripetibilità in matrice
(RSD%)
Recupero in
matrice (%)
Eritromicina 50 – 1000 ng/L 90 5,2% 127%
Claritromicina 50 – 1000 ng/L 90 5,3% 106%
Azitromicina 50 – 1000 ng/L 90 9,0% 90,1%
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ARPA FVG - METODO «C»: ANTIBIOTICI
Concentrazione di 100 ng/L dei tre macrolidi
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ARPA FVG - METODO «C»: ANTIBIOTICI
� Iniezione diretta di 40 uL di campione
� Colonna cromatografica «Bifenilica»
Separazione cromatografica:
Fase A: Tampone formiato 0.0033 M
Fase B: Acetonitrile
Parametro Intervallo di taratura
“Limite massimo ammissibile del
metodo di rilevazione (ng/L)”
(Decisione 495/2015)
Ripetibilità in matrice
(RSD%)
valutata a 0,1 µg/L
Recupero in
matrice (%)
Eritromicina 10 – 1000 µg/L 90 9,16% 103%
Claritromicina 10 – 1000 µg/L 90 2,38% 99%
Azitromicina 10 – 1000 µg/L 90 4,90% 104%
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CRITERI DI RICONOSCIMENTO
(SELETTIVITA’ DEL METODO)
Una Decisione della Commissione europea [1] definisce i criteri di
identificazione per l’analisi SRM (Selected Reaction Monitoring):
� Tempi di ritenzione entro il 2,5% del tempo di ritenzione dello standard di
riferimento
� Siano presenti lo ione precursore e due frammenti e che il rapporto
d’intensità dei frammenti rispetto allo ione molecolare sia all’interno del
50-20% rispetto allo standard di riferimento.
[2] European Commision (2002) Commission Decision 2002/657/EC implementing Council Directive 96/23/EC
concerning performance of analytical methods and the interpretation of results. Off J Eur Commun L221/8.
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RECUPERO DEL METODO
L’»effetto matrice» costituisce il principale inconveniente associato con l’ESI-
MS (Electro Spray Ionization-Mass Spectrometry), dovuto alla suscettibilità del
della sorgente ionica rispetto alla presenza di sostanze coeluenti, presenti
nella matrice. Tale effetto si manifesta come soppressione o esaltazione del
segnale relativo all’analita secondo i componenti presenti nella matrice.
[1] Journal of Chromatography A, 1418 (2015) 140-149
Impiego di standard isotopici (deuterati o C13), che seguono l’intero processo
analitico.
E’ dunque importante che le sostanze elencate nella «watch-list», come per le sostanze
classificate pericolose e pericolose-prioritarie ( EU - water framework directives) possano essere
determinate accuratamente ai livelli specificati nella Decisione.
E’ richiesto che ogni metodo :
• Sia validato secondo la ISO/IEC 17025:2005 (accreditamento)
• Abbia un limite di rilevabilità LOD < LOD tabellato
• Fornisca una incertezza di misura ≤ 50%
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LE PRESTAZIONI DEI METODI
28
VALIDAZIONE
Tra le principali criticità incontrate nella messa a punto di questi metodi vi
sono:
- Assenza di Matrici Certificate di riferimento.
(Prove di recupero e ripetibilità su matrici fortificate «in house»)
- Assenza di circuiti interlaboratorio e di collaborative trial.
(manca una valutazione completa della riproducibilità per questi analiti)
- Assenza di Metodi Normati (es. norme ISO) per molte delle sostanze
ricercate.
Necessità di una completa validazione da parte del laboratorio.
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INCERTEZZA DI MISURA
• Documenti di riferimento:– Handbook for Calculation of Measurement Uncertainty in Environmental
Laboratories ( NORDTEST Technical Report TR 537)
– Norma ISO 11352:2012 – Water quality- estimation of measurement uncertainty based on validation and quality control data.
� � ��
�� ��
��Incertezza
composta
Bias e Ripetibilità intermedia
CONCLUSIONI
30
Quanto riportato in questa breve relazione, indica che allo stato attuale si possono
ancora incontrare alcune difficoltà tecnico-analitiche nel determinare le sostanze
individuate dalla watch list ai livelli di concentrazione richiesti.
L’obiettivo di determinare le sostanze elencate nella «watch list» ai livelli richiesti, pur
con i migliori standard tecnologici oggi disponibili, richiede quindi una complessa
attività di sviluppo e validazione dei metodi analitici che non può certamente
prescindere da una elevata qualificazione, dall’aggiornamento e da una forte
motivazione del personale coinvolto.
GRAZIE PER L’ATTENZIONE
31
