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Page 1: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Agatina Alessandrello Liotta

AOU Careggi- FirenzeSOD Malattie Aterotrombotiche CRR per lo Studio della Trombosi

Page 2: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Lupus anticoagulantLupus anticoagulant

• Famiglia eterogenea di immunoglobuline di tipo IgG, IgM, IgA

• In vitro provocano allungamento dei test fosfolipide dipendenti

• Nel nostro organismo sono responsabili di trombosi arteriose e/o venose, di aborti ripetuti, morti fetali

Page 3: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

NUOVA DEFINIZIONE DI SINDROME DA aPL NUOVA DEFINIZIONE DI SINDROME DA aPL Criteri di laboratorioCriteri di laboratorio

(Miyakis S et al, J Thromb Haemost 2006, 4:295(Miyakis S et al, J Thromb Haemost 2006, 4:295--306)306)

Presenza di LAC, determinato secondo le linee guida proposte da SSC

e/o

Medio/alto titolo di anticorpi anticardiolipina β2 glicoproteina I dipendenti (IgG e/o IgM), misurati con tecnica ELISA standardizzata

Conferma in 2 o più occasioni ad almeno 12 settimane di distanza

Page 4: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Intrinsic Pathway Extrinsic PathwayVascular Injury

HMWK Surface HMWK

Tissue Factor

(TF)

FVIITF-FVII

FXaThrombinF VIIaF IXa

Ca++ PLTF-FVIIa

Ca++

F XII

F IXF IXa

F XF Xa

F XI PK

KallikreinF XIIa

F IX

F XIa

F X

F VIIIaCa++ PL

F VIIICa++ PL

Prothrombin Thrombin

F VaCa++ PL

F V

F Xa Ca++ PL

F XIII

F XIIIa

Ca++

Fibrin

Fibrinogen FibrinCross-linked

FibrinCentro Trombosi, Firenze

Page 5: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Antigeni degli aPLAntigeni degli aPL

Centro Trombosi, Firenze

Beta2 glicoproteina 1

Protrombina

Proteina C (attivata)

Proteina S

Trombomodulina

Annessina V

Attivatore tissutale del plasminogeno

Chininogeni a basso ed a alto peso molecolare

Fattore XII

Lipoproteine abassa densità ossidate (ox-LDL)

Beta2 glicoproteina 1

Protrombina

Proteina C (attivata)

Proteina S

Trombomodulina

Annessina V

Attivatore tissutale del plasminogeno

Chininogeni a basso ed a alto peso molecolare

Fattore XII

Lipoproteine a bassa densità ossidate (ox-LDL)

Page 6: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

CRITERI PER LA DIAGNOSI

DI LUPUS ANTICOAGULANT

PROPOSTI DAI SSC (1995)

• Prolungamento di 1 o più test di screening PL dipendenti (aPTT, KCT, dRVVT, dPT o TTI)

• Studi di mixing (1:1) per dimostrare la presenza di un inibitore ed escludere eventuali carenze di fattori

• Test di conferma per dimostrare che l’inibitore è diretto contro i PL

• Esclusione di altre coagulopatie (es. inibitore del fattore VIII o presenza di eparina)

Page 7: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

DIAGNOSTICA DEL LAC DIAGNOSTICA DEL LAC aPTTaPTT

Un aPTT di routine nei limiti della norma, non è sufficiente per

escludere la presenza del LAC

I reagenti contengono fosfolipidi piuttosto

concentrati, quindi l’aPTT può essere normale nei

pazienti con LAC medio/debole

Un aumento del fibrinogeno o fattore VIII (fase

acuta, gravidanza) può accorciare l’aPTT e

mascherare la presenza di un LAC debole

Possono però essere utilizzati reagenti diluiti

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0,5

1

1,5

2

2,5

3

A B C D

AP

TT

Rati

o

PTT LA Roche

(n=21)

Actin FSL Dade

(n=6)

Pathromtin SL Dade

(n=8)

Synthasil IL (n=5)

APTT LT Roche

(n=6)

APTT SP IL (n=9)

KPTT Stago (n=5)

Plasmas

APTT ResponsivenessTripodi et al, Clin Chem 2003

Page 9: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Semin Thromb Hemost 2012

aPTTaPTT REAGENT

Kershaw G

Page 10: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

DIAGNOSTICA DEL LACDIAGNOSTICA DEL LACKaolinKaolin e e SilicaSilica ClottingClotting TimeTime (KCT, SCT)(KCT, SCT)

• Non contengono PL

• Sono molto sensibili

• Molto influenzati dalla presenza di piastrine residue

• Specificità ridotta dalla presenza di carenza di fattori

• Il SCT è una modificazione del KCT che ne consente

l’impiego su tutti gli strumenti

Page 11: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

DIAGNOSTICA DEL LACDIAGNOSTICA DEL LACdRVVTdRVVT

• Il veleno di vipera Russell attiva il fattore X in presenza

di ioni Ca, FV,e PL.

• Esistono molti reagenti commerciali che sono però molto

diversi per sensibilità e specificità

• Molti kit commerciali forniscono anche un reagente di

conferma (fosfolipidi concentrati)

Page 12: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

0,5

1

1,5

2

2,5

A B C D

dR

VV

T R

ati

o

Am. Diagnostica(n=23)

LAC Screen IL(n=27)

LA1 Dade (n=17)

Plasmas

dRVVT ResponsivenessTripodi et al, Clin Chem 2003

Page 13: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

DIAGNOSTICA DEL LACDIAGNOSTICA DEL LACTissue Thromboplastin Inhbition Test ( Tissue Thromboplastin Inhbition Test ( TTI)TTI)

• Il PT è generalmente normale in soggetti con LAC (la tromboplastina contiene elevate concentrazioni di PL)

• Se però il reagente è diluito, la concentrazione dei PL può diventare fattore limitante

• Il TTI viene in genere eseguito con due o più diluizioni di tromboplastina

• Alcune tromboplastine ricombinanti sono particolarmente sensibili al LAC (Innovin, Dade Behring)

Page 14: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

MODALITA’ DI ESPRESSIONE

DEI RISULTATI

- SECONDI

- RATIO R = SEC Tempo di coagulazione campione

SEC Tempo di coagulazione pool

plasmi normali

TEST DI SCREENING

Page 15: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

I risultati sono considerati positivi

quando i tempi di coagulazione sono

più lunghi o la Ratio è maggiore del

valore Cut-off stabilito per il test e

calcolato al 99° percentile della

distribuzione normale ( SSC 2009)

TEST DI SCREENING

Page 16: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Possibili cause dell’allungamento

del tempo del campione in esame

• Carenza fattoriale o presenza di

terapia farmacologica interferente

(eparina , warfarin)

• Inibitore di tipo anticorpale:

•Lupus anticoagulante

•Inibitore specifico

STEP I: TEMPO DEL CAMPIONE

Page 17: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Studi di “mixing”

2.4

2.0

1.6

1.2

0.8

P P+N

Cut-off

Ripetere il test sulla

miscela:

plasma del paziente e

plasma di un pool di

soggetti sani in rapporto

1:1

(La miscela comunemente non è

incubata a 37°C)

dR

VV

T (

rati

o)

INIBITORE

Carenza fattoriale

Carenza fattoriale Centro Trombosi Fi

Page 18: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

TEST DI “MIXING”

MODALITA’ DI ESPRESSIONE DEI RISULTATI

RATIO SEC Tempo di coagulazione miscela (paziente/pool plasmi normali V/V)

R =

SEC Tempo di coagulazione pool plasmi normali

ICA % = (sec tempo di miscela-sec tempo pool normale) x 100

sec tempo del paziente

ICA = (Indice di anticoagulante circolante)

Page 19: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

TEST DI “MIXING”:

INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI

Risultati sono suggestivi per la presenza

di LAC quando ratio o ICA maggiori

del valore Cut-off stabilito per il Test e

calcolato al 99° percentile della

distribuzione normale

Page 20: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Cause dell’allungamento del Cause dell’allungamento del tempo della miscela in esametempo della miscela in esame

•• Inibitore di tipo anticorpaleInibitore di tipo anticorpale

•Lupus anticoagulante

•Inibitore specifico

•• Eparina?Eparina?

STEP II: TEMPO DELLA MISCELA

Page 21: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

STEP III: TEST DI CONFERMA

Tempo di coagulazione in presenza di fosfolipidi in eccesso:

• PNP

•Triplett, Am J Clin Pathol, 1983

• Fosfolipidi in fase esagonale

•Rauch, Thromb Haemost, 1989

•Triplett, Thromb Haemost, 1993

(Questo tipo di conformazione rende i PL più disponibili a legare il LA : maggiore specificità)

• valore assoluto - delta - ratio

Page 22: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Test di conferma

2.4

2.0

1.6

1.2

0.8

P P+fosfolipidi

Cut-offdR

VV

T (

rati

o)

Centro Trombosi Fi

Page 23: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

TEST DI CONFERMATEST DI CONFERMAFALSI POSITIVIFALSI POSITIVI

•• LISATILISATI PIASTRINICIPIASTRINICI

Eparina Eparina

Inibitori del fattore VInibitori del fattore V

a basso titoloa basso titolo

(rilascio di fattore V dai granuli (rilascio di fattore V dai granuli piastrinici)piastrinici)

•• FOSFOLIPIDI ESAGONALIFOSFOLIPIDI ESAGONALI

Inibitori del fattore VIIIInibitori del fattore VIII

Centro Trombosi Fi

Page 24: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

ANAMNESI POSITIVA PER SOSPETTA DIATESI EMORRAGICAANAMNESI POSITIVA PER SOSPETTA DIATESI EMORRAGICA

AntiAnti--fattore VIII, II, IX, X, XIfattore VIII, II, IX, X, XI

AntiAnti--fibrinogeno/fibrinafibrinogeno/fibrina

Anticoagulanti eparinoAnticoagulanti eparino--similisimili

AntiAnti--fattore Vfattore V

ANAMNESI POSITIVA PER EVENTI TROMBOTICIANAMNESI POSITIVA PER EVENTI TROMBOTICI

Lupus Anticoagulant Lupus Anticoagulant

AntiAnti--fattore XIIfattore XII

Centro Trombosi Fi

DIAGNOSI DIFFERENZIALE PER LA PRESENZA DI DIAGNOSI DIFFERENZIALE PER LA PRESENZA DI INIBITORI DELLA COAGULAZIONEINIBITORI DELLA COAGULAZIONE

Page 25: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

DOSAGGIO DEI FATTORIDOSAGGIO DEI FATTORI

RIDUZIONERIDUZIONE MARCATAMARCATA DELDEL

SINGOLOSINGOLO FATTOREFATTORE

CHECHE NONNON SISI MODIFICAMODIFICA CONCON

LALA DILUIZIONEDILUIZIONE DELDEL CAMPIONECAMPIONE

INIBITORE SPECIFICOINIBITORE SPECIFICO

RIDUZIONERIDUZIONE APPARENTEAPPARENTE DIDI

PIU’PIU’ FATTORIFATTORI

CHECHE SISI NORMALIZZANORMALIZZA CONCON

LALA DILUIZIONEDILUIZIONE DELDEL CAMPIONECAMPIONE

INIBITORE INIBITORE DIDI TIPO : TIPO : LUPUSLUPUS

Page 26: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

J Thromb Haemost 2009

Page 27: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

SCELTA DEI TEST

L’utilizzo di più di due test fosfolipide dipendenti aumenta il rischio di risultati falsamente positivi

I due test devono basarsi su principi diversi I test raccomandati sono : dRVVT, SCT

Page 28: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

aP

TT

SC

T

dR

VV

T

dR

VV

T/S

CT

dR

VV

T/a

PT

T

aP

TT

SC

T

dR

VV

T

dR

VV

T/S

CT

dR

VV

T/a

PT

T

Page 29: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

SC

Page 30: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

STANDARDIZZAZIONE STANDARDIZZAZIONE DELLA FASE PREANALITICADELLA FASE PREANALITICA

-- PRELIEVOPRELIEVO -- Tipo : venosoTipo : venoso-- Sede : vena cubitale della piega del gomitoSede : vena cubitale della piega del gomito-- Evitare laccio emostatico o ridurne la presenza, la

stasi ematica provoca:variazioni di pH ed aumenti della CO2 con perdita del fattore V; danno tissutale con conseguente liberazione di fattore tissutale e attivazione del fattore VII

-- TRATTAMENTO DELTRATTAMENTO DELCAMPIONE DI SANGUECAMPIONE DI SANGUE -- Centrifugazione a 2800 gCentrifugazione a 2800 g

per 15 minuti a temp. per 15 minuti a temp. ambienteambiente

-- Separazione del plasmaSeparazione del plasma-- 22 centrifugazione a centrifugazione a

12000 rpm per 312000 rpm per 3--5 minuti5 minuti* E’ importante ridurre le * E’ importante ridurre le

piastrine piastrine al di sotto di 1x10al di sotto di 1x10 99/L/L

-- CONSERVAZIONECONSERVAZIONE -- Congelamento rapido e Congelamento rapido e conservazione a conservazione a --8080 CC

Page 31: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

CARATTERISTICHE DEL POOL di PLASMA CARATTERISTICHE DEL POOL di PLASMA NORMALE PER I TEST NORMALE PER I TEST DIDI MISCELAZIONEMISCELAZIONE

* * PRIVO PRIVO DIDI PIASTRINEPIASTRINE

* NORMALE CONTENUTO * NORMALE CONTENUTO DIDI TUTTI I FATTORI DELLA TUTTI I FATTORI DELLA COAGULAZIONECOAGULAZIONE

* NORMALE CONTENUTO * NORMALE CONTENUTO DIDI FIBRINOGENO FIBRINOGENO ( per escludere processi infiammatori o infettivi in atto)( per escludere processi infiammatori o infettivi in atto)

IL POOL IL POOL DIDI PLASMA NORMALE DEVE ESSERE PLASMA NORMALE DEVE ESSERE CONGELATO RAPIDAMENTE E CONSERVATO A CONGELATO RAPIDAMENTE E CONSERVATO A --7070°° CC

Centro Trombosi Fi

Page 32: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

SOSPETTO SOSPETTO DIDI EPARINA NEL EPARINA NEL CAMPIONECAMPIONE

PrimaPrima didi eseguireeseguire testtest didi miscelazionemiscelazione ee didiconferma,conferma, procedureprocedure lunghelunghe ee costosecostose

ESEGUIRE TEST TEMPO ESEGUIRE TEST TEMPO DIDI TROMBINATROMBINA

Page 33: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Effect of Lupus Anticoagulant and Anticoagulant

Therapies on commonly used clinical laboratories

assays

Ortel TL, 2012, mod

Page 34: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

LAC nei Pazienti anticoagulati

Terapia eparinica: neutralizzare l’eparina con sostanze

antiepariniche(polibrene o eparinasi) oppure mediante l’uso

di una resina (ecteola) che mescolata al plasma, dopo

idonea incubazione, è capace di adsorbire l’eparina

Anticoagulanti orali:

Esecuzione dei test previa miscela del plasma del paziente

con plasma normale (v/v);

Esecuzione del test di conferma a due diverse concentrazioni

di fosfolipidi, senza preventiva miscelazione con plasma

normale. L’entità della correzione rispetto ai valori di base del

test consente di effettuare la diagnosi (Tripodi A et al )

Page 35: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

LAC e Sospensione terapia

anticoagulante

VKA: 1-2 settimane dalla sospensione della terapia

o quando INR < 1.5

LMWH: l’effetto dipende dal tipo di eparina

utilizzata, dal momento in cui viene

eseguito il prelievo

attendere almeno 12 h

dall’ultima somministrazione

Page 36: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

0

0.5

1.0

1.5

1.16

No

rmalized

Rati

o

2.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

SILICA CLOTTING TIMESILICA CLOTTING TIMEbefore surgery

5 days after surgery, 2-

3 hours of rivaroxaban

administration

PatientsAlessandrello Liotta A.

Page 37: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

0

0.5

1.0

1.5

2.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

1.26

Rati

o

2.5

3.0

Patients

DILUTED RUSSELL VIPER VENOM TESTbefore surgery 5 days after surgery ,2-3 hours of rivaroxaban

administration

Alessandrello Liotta A.

Page 38: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

DILUTED RUSSELL VENOM VIPER: DILUTED RUSSELL VENOM VIPER: mixing normal plasma (V/V) test five days after surgery

0

0.5

1.0

1.5

2.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 15 16 18

1.21Rati

o

2.5

Patients on RivaroxabanAlessandrello Liotta A.

Page 39: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

DILUTED RUSSELL VIPER VENOM TEST: DILUTED RUSSELL VIPER VENOM TEST: Confirm Test five days after surgery

0

0.5

1.0

1.5

2.0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 15 16 18

1.21Rati

o

2.5

Patients on RivaroxabanAlessandrello Liotta A.

Page 40: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

STACLOT® LA test by usinghexagonal phospholipids

After DRVVT confirmation test (byadding phospholipids) 6 patients werepositive at LA testing, in the other 10patients the DRVVT confirmation was stillprolonged. For this reason, we performedSTACLOT® LA test by using hexagonalphospholipids and LA was not confirmed.

Page 41: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio
Page 42: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Test Integrati per la rilevazione del

LUPUS ANTICOAGULANT

Modalità di espressione dei risultati:

% Correzione =

[(Screening ratio-Confirmation ratio)/Screening

ratio] x 100

Ratio Normalizzata (TR)=

Screening Ratio/ Confirmation Ratio

Page 43: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

To Mix or Not To Mix in Lupus Anticoagulant Testing ?

That is the Question

Armando Tripodi

Seminars Thrombosis and Hemostasis, 2012 ; 38: 385-389

Lupus Anticoagulant: I test integrati

Page 44: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Lupus Anticoagulant: I test integrati

L’esperienza del Centro Trombosi- Firenze

Test mix effettuati su campioni negativi: 127Allungamento del tempo di miscela: 0

L’allungamento del tempo di miscela è stato rilevato su un solo caso positivo

N.M.

DRVVT –S sec.47,2 R=1,51 SCT –S sec 60,3 R=1,61

DRVVT –C sec.29,7 R= 0,98 TR= 1,55 SCT-C sec 26,4 R= 0,86 TR= 1.88

DRVVT Mix sec. 47.2 R= 1,51 SCT-Mix sec 84,2 R = 2,21 TR =2,56

[DRVVT cut-off TR< 1.12] [SCT cut-off TR< 1.16]

Page 45: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Da fare

Page 46: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

aPTT allungato…………….?

Test Integrati

LAC Presente LAC assente

Test di Miscelazione v/v

dRVVT S R= 1.49 (cut off R <1.16)dRVVT C R=1.64 (cut off R <1.11)dRVVT Mix R= 1.07 (cut off R <1.09)

SCT S R= 1.58 (cut off R <1.33)SCT C R= 1.86 (cut off R <1.45)SCT Mix R= 0.98 (cut off R <1.16)

Campione 1 : aPTT 51 sec (V.N.26-38 sec)

Carenza fattoriale: Fatt X = 20%

dRVVT S R= 1.21 (cut off R <1.16)dRVVT C R= 1.23 (cut off R <1.11)dRVVT Mix R= 1.32 (cut off R <1.09)

SCT S R= 2.11 (cut off R <1.33)SCT C R= 2.09 (cut off R <1.45)SCT Mix R= 1.50 (cut off R <1.16)

Campione 2: aPTT 56 sec (V.N.26-38sec)

Inibitore Fatt VIII = 2.8 U/mL

Page 47: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Nuova definizione di Sindrome da Nuova definizione di Sindrome da aPLaPL(Miyakis S et al, J Thromb Haemost 2006, 4:295(Miyakis S et al, J Thromb Haemost 2006, 4:295--306)306)

CRITERI DI LABORATORIOCRITERI DI LABORATORIO

LupusLupus anticoagulantanticoagulant determinatodeterminato inin basebase aa quantoquanto stabilitostabilito nellenellelineelinee guidaguida proposteproposte daldal SSC,SSC, positivopositivo inin 22 oo piùpiù occasionioccasioni adadalmenoalmeno 1212 settimanesettimane didi distanzadistanza..

AnticorpiAnticorpi anticardiolipinaanticardiolipina--ββ22 glicoproteinaglicoproteina II dipendentidipendentiqualificatiqualificati concon tecnicatecnica ELISAELISA standardizzata,standardizzata, didi classeclasse IgGIgG e/oe/oIgM,IgM, presentipresenti aa mediomedio oo altoalto titolotitolo inin 22 oo piùpiù occasionioccasioni aa distanzadistanzadidi almenoalmeno 1212 settimanesettimane..

Centro Trombosi Fi

Page 48: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Schouwers Thrombosis Research 2010

Page 49: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

Lupus AnticoagulantAppropriatezza della richiesta

Alta: -Tromboembolismo venoso spontaneo

-Tromboembolismo arterioso inspiegabile in pz. età <50 anni

-Trombosi in sedi inusuali

-Morti fetali

-Trombosi o patologia gravidica in pz. con malattie

autoimmuni

Moderata: -Rilievo casuale di aPTT allungato in pz. asintomatico

-Più aborti spontanei precoci

-Tromboembolismo venoso secondario in pz. giovani

Bassa: -Tromboembolismo venoso o arterioso in pz. Anziani

Thrombosis Research 2012 Pengo

Page 50: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

REFERTOREFERTO

Risultati analitici accompagnati da un commentosulla loro compatibilità con la presenza o meno dilupus anticoagulant

Per i casi positivi alla prima determinazioneconsigliare di ripetere il test dopo almeno 12settimane

Page 51: Lupus Anticoagulant: Diagnostica di laboratorio

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