7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
1/20
Metode PCR (Polymerase chainreaction)dalam mendekteksiisolat klinisMycobacterium
tuberculosispada Anakdr. Putu Ayunda Trisna
dr. Ni Putu Wirantari
dr. Putu Diah Pratiwi
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
2/20
PENDAHULUAN
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
3/20
PENDAHULUAN
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
4/20
Baku emas dalam penegakan diagnosis adalah adanyamikobakterium pada biakan sampel cairan tubuh atau
jaringan PERLU WAKTU
pengecatan bakteri tahan asam akan tetapi cara ini kurang sensitifdibandingkan kultur
PENDAHULUAN
aat ini mulai berkembang pemeriksaanmolekular dimana sensitifitas lebih baikdibandingkan pengecatan bakteri tahan asam
dengan hasil lebih cepat dibanding pemeriksaankultur
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
5/20
Tuberkulosis
Penyakit akibat infeksi kumanMycobacteriumtuberkulosissistemis sehingga dapat mengenai
hampir semua organ tubuh! dengan lokasiterbanyak di paru yang biasanya merupakan
lokasi infeksi primer
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
6/20
Patogenesis TBC1
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
7/20
Parameter 0 ! "Kontak T#$ tidak "elas - laporan keluarga
- BTA#$% atau tidaktahu
- ka&itas #'%- BTA tidak
"elas
BTA #'%
Uji Tuberkulin Negati&e Positif ( )* mm!atau ( + mmpada keadaanimunosupresi
##%keadaan gi&i BB,TB - */ atau
BB,0 -1*/
2linis gi3i buruk
atau BB,TB - 4*/atau BB,0 -5*/
'emam tanpa sebabyang jelas
( 6 minggu
#atuk ( 7 mingguPembesaran kelenjarlim(e koli) aksila)
inguinal
( ) cm! "umlah ( )!tidak nyeri
Pembengkakantulang%sendi panggul)lutut) (alang
Ada pembengkakan
*oto rontgen toraks Normal,tidak "elas
8nfiltrate! pembesarankelen"ar! konsolidasisegmental,lobar
2lasifikasi'infiltrate! pembesarankelen"ar '
infiltrate
+koring Tuberkulosis
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
8/20
Petunuk diagnosis TBC menurut !H"
'icurigai tuberkulosis9 Anak sakit dengan riwayat kontak penderita tuberkulosis dengandiagnosis pasti #BTA Positif%
9 terdapat reaksi kemerahan cepat setelah penyuntikan B:;#dalam 7$4 hari%!
9 terdapat ge"ala umum TB:,ungkin tuberkulosis
Anak dicurigai tuberkulosis dengan tambahan NA% suatu patogen
- Ekstrasi Asam Nukleat : Proses ekstrasi harus dilakukan di
- Amplifikasi: Asam Nukleat pada sampel ataupun kultur di amplfikasi.
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan salah satu metode
amplifikasi.
- Deteksi: Metode yang digunakan untuk mendeteksi asam nukleat yang
telah di amplifikasi dapat dengan cara elektroporesis line probe assay
atau real time detection
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
11/20
Alur sampel pada pemeriksaan molekuler tuberkulosis
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
12/20
#agan prookol pemeriksaan biomolekular pada pasien Tuberkulosis
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
13/20
Mengidentifikasi M.tuberkulosis menggunakan PCR
Prinsip prosedur P:> adalah denaturasi thermal DNA sampel!diikuti hibridisasiprimeroligonukleotida #annealing% ke utas DNA
Pada proses P:> khususnya dalam mendeteksi . Tuberkulosisdiperlukan beberapa komponen yang memegang peranan penting
). DNA cetakan
2.Primer7. Proses amplifikasi DNA
C.Analisis DNA hasil amplifikasi
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
14/20
DNA Cetakan
Perlu diperhatikan kemurnian dan "umlah DNA sasaranmenurunkan efesiensi P:>
Dalam hal mendeteksi kumat Tuberkulosis ekstrasi nyadengan cara! bakteri yang sudah tumbuh! dibuat
suspensi dengan menambahkan larutan Na:l *!/ #b,&%ke dalam kultur tersebut
uspensi kemudian dipanaskan! disentrifugasi! dandicuci sebanyak 6 kali
Pelet bakteri kemudian dilarutkan dengan larutanpenyangga T@,Tris$@DTA p 1!*.
@kstraksi DNA dilakukan sesuai dengan prosedur
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
15/20
Primer
Primeradalah oligonukleotida dengan pan"ang 6* E 7*basa yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksipeman"angan rantai atau polimerisasi DNA.
Primermerupakan basa komplemen dari masing$
masing u"ung +F fragmen DNA yang akan diperbanyak. P:> diperlukan sepasangprimer.
Primerpertama sebagai upstream primer danprimerkedua sebagai downstreamprimer
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
16/20
Proses ampli#ikasi DNA
Amplifikasi DNA dilakukan dengan metode P:> menggunakanprimer oligonukleotida Pt1 #+G$;T;:;;AT;;T:;:;A;AT$7G% danPt #+G$:T;;AT;:: :T: A:; ;TT:A$7G%
larutan penyangga #)*m Tris$:l p 1!7 ' +* m 2:l%! 6!* mg:l6! *!*)/ #b,&% gelatin! dNTP #dATP! d:TP! d;TP! dTTP%
Proses P:> dilakukan dalam DNA thermocycler #Perkin$@lmer%dengan tahapdenaturasi )!+ menit pada suhu Co:! annealingpadasuhu 5+o:! 6 menit! tahap extension7 menit pada suhu 46o:! danextended extensionpada suhu 46o: selama 4 menit! untuk tiapsiklus.
Humlah siklus yang diperlukan C* siklus.
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
17/20
Analisis DNA $asil ampli#ikasi
Teknik elektroforesis gel agarosa digunakan untuk menganalisisDNA hasil amplifikasi dengan konsentrasi agarosa )!+/ #b,&%
Pewarnaan DNA hasil elektroforesis dilakukan denganmenggunakan larutan etidium bromida
;el kemudian di&isualisasi melalui ultraviolet transilluminator
enentukanukuran fragmen DNA! digunakan penanda beratmolekul ae888 I)4C yang dinyatakan dengan pasangan basa#basepairJ bp%.
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
18/20
Analisis DNA $asil ampli#ikasi
Batas deteksi u"i P:>! yaitu "umlah DNA minimum yangmemberikan hasil positi( dengan metode P:> dan elektroforesisgel agarosa! ditun"ukkan dengan adanya pita DNA pada gel dariisolatM. tuberkulosis
ensiti&itas u"i P:> yang ditun"ukkan dengan batas deteksi tersebut
untuk 5 isolat yang digunakan dalam penelitian ini ber&ariasi. Padaumumnya makin tinggi tingkat kemurnian '-A) sensiti.itasuji P$R makin meningkat
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
19/20
Tahap Reaksi P$R
7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1
20/20