TESTI UTILI
GENETICA MOLECOLARE•Strachan T., Read A.P Genetica Umana Molecolare (UTET)
(Human Molecular Genetics 3, Gardland Science)
GENETICA STATISTICA•Ott J (1999) Analysis of human genetic linkage. Johns Hopkins University Press, Baltimore
•Sham P (1997) Statistics in human genetics. Arnold; Wiley, London, New York
VARIABILITA’ DEL GENOMA E MUTAZIONI•Replicazione del DNA -> errori -> meccanismi di riparo (non effic. al 100%)Tasso di mutazione per nucleotide nell’ordine di 1/109
•Agenti esterni (mutageni, radiazioni etc)
MUTAZIONIcambiamenti stabili (ereditabili) nella sequenza del DNASe una mutazione insorge in una porzione del DNA codificante o funzionalmente importante può avere un effetto sul fenotipo.
variabilità -> evoluzioneMutazioni patogeniche -> malattie genetiche
Possono insorgere a livello di:• cellule somatiche (-> cancro, invecchiamento)• cellule germinali
POLIMORFISMIpresenza nella popolazione di 2 o piú varianti alleliche, con una frequenza significativamente alta (> 1%)
MUTAZIONI SEMPLICI (puntiformi)causate per lo più da errori spontanei nella replicazione del DNA e riparo
EFFETTI PATOGENI DELLE MUTAZIONI PUNTIFORMI
Nella regione codificante di un gene
Sostituzioni sinonime (silenti) La > parte sono neutrali. Talvolta possono creare degli errori di splicingSostituzioni non sinonime (missense) Spesso deleterie. Nonsense: quasi sempre deleterie.
proteina troncatamRNA instabile (nonsense-mediated mRNA decay)exon skipping (raro)
Inserzioni/delezioni -> Framshift -> in genere introducono un codone di stop
Introni• mutazioni di splicing
• assenza di splicing dell’introne• uso di un sito di splicing illegittimo (criptico)• exon skipping
Mutaz nel 5’ o 3’ non tradottoes: nel segnale di poliadenilazione AAUAA siti target di microRNA
Mutazioni in regioni regolatorie
Riarrangiamenti mediati dalla presenza di SEQUENZE RIPETUTE
• Slipped strand mispairing
• Crossing-over ineguale
SEQUENZE RIPETUTE
DNA CODIFICANTE:•Famiglie multigeniche•Motivi strutturali conservati•Ripetizioni in tandem di geni per rRNA e istoni
DNA NON CODIFICANTE•In tandem•Sequenze ripetute intersperse
1) Famiglie geniche• duplicazione e divergenza da un gene ancestralees. geni globinici• Famiglie di geni con regioni conservate che codificano per domini funzionaliEs fattori di trascrizione (Homeobox, Zinc-finger etc)
PSEUDOGENI copie non funzionaliNon-processati (espressi/non espressi)Processati
2) Sequenze ripetute extrageniche•Ripetizioni in tandem
1)Altamente ripetuto -> DNA satellite2) Polimorfiche:minisatellitimicrosatelliti
•Seq ripetute intersperse
Alu
DNA SATELLITE
LINEs (L1)
LINEs> 5 kb104
Kpn o L1- 6.1kb, molte sono forme troncate al 5’2 ORF, ORF1 = RNA binding prot, ORF2 = RT e endonucleasi
SINEs <500 bp105
Alu - 2 ripetizioni di una seq di ~120 bp~ ogni 4 kbomologia con 7SL RNA-> propagate tramite retrotrasposizione
Propagazione delle LINEs e SINEs tramite retrotrasposizione
1)SLIPPED STRAND MISPAIRINGAppaiamento sfasato di corte sequenze ripetute in tandemCausa piccole delezioni/inserzioni (che possono essere patogene o generare polimorfismi STR )
Crossing-over ineguale (NAHR: non-allelic homologous recombination)
Direct repeats :deletion and/or duplication
Inverted repeats :inversion
Segmental duplicationsLCR (low copy repeat)Sequenziamento del genoma -> presenza di duplicazioni di sequenze 10-400Kb, con alta similarità (>95-97%).Rappresentano almeno il 5% genoma Inter-cromosomiche (soprattutto in reg pericentrom e subtelomeriche Intra-cromosomiche (cromosoma specifiche)
Causa di riarrangiamenti genomici associati a malattie geneticheSmith Magenis Syndrome, Charcot-Marie-Tooth (crom 17) Prader-Willi/Angelman Syndrome (crom 15).
•Regioni pericentromeriche e subtelomeriche contengono alto num di segmental duplications
1) Membri di famiglie geniche/peudogeni ripetuti in tandemEs: Talassemia alfa-globina Daltonismo pigmenti rosso/verde dei coni
2) Sequenze ripetute che fiancheggiano geniCharcot Marie Tooth (CMT-1A) PMP22Ittiosi X-linked STSSmith MagenisWilliams Syndrome
3) Sequenze ripetute inverseEmofilia A Fattore VIII
Genomic DisordersPatologie che derivano da riarrangiamenti di una regione di DNA, causati da ricombinazione omologa ineguale tra LCR-> delezione o duplicazione di 1 o + geni sensibili al dosaggio, o inattivazione di uno specifico gene
Polimorfismi•Presenza nella popolazione di 2 o piú varianti alleliche di un gene o una determinata sequenza di DNA•Allele più raro frequenza maggiore 1%•La > parte di polimorfismi sono neutrali, non hanno un effetto sul fenotipo
TIPI DI POLIMORFISMI PIU’ COMUNI•Cambiamenti di una singola base (SNPs)•Inserzioni o delezioni di piccole dimensioni•Variazione nel numero di sequenze ripetute in tandem •microsatelliti (Short Tandem Repeats)•minisatelliti (VNTR)
SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms)
•Differenze di singola base•Biallelici•Più frequenti varianti di DNA (circa 1/300 bp) •Sviluppo di tecniche di genotyping automatizzate e in larga scala•Basso tasso di mutazione in confronto ai microsatelliti
VariantiSeq DNA
Variabilità fenotipica
Predisposizione a malattieCaratteristiche fisicheRisposta a influenze ambientaliRisposta a farmaci
DbSNP http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/
SNP variation in humansNumber of SNPs in dbSNP
~ 10 million common SNPs in the human
genome
double hit
validated by genotyping
total non-redundant SNPs
Nature 437:1299 (2005)
•Microsatelliti (STR Short Tandem Repeats)
Classe di sequenze ripetute, costituite da ripetizioni in tandem di 2-3-4 pbFiancheggiate da sequenze uniche
Es: Ripetiz di dinucleotidi CA/GT CT/AG
Molto polimorfici e uniformemente distribuiti nel genoma (1/50-100 Kb)-> utili come marcatori genetici •Minisatelliti •ripetizioni in tandem di una corta sequenza (10-100 bp)•distribuzione non omogenea (vicino ai telomeri)•sequenza comune (core) GGGCAGGAXG + seq specifiche
Molto polimorfici : utili come marcatori per mappe genetiche ma distribuz non omogeneaUtilizzati in passato per DNA FINGERPRINTING(descritti da Jeffreys)
Genetic variation in the human genome
Tecniche citogenetiche -> anomalie cromosomiche (> 3 Mb)Tecniche molecolari (sequenziamento) -> varianti del DNA di piccole dimensioni (< 1-10 Kb)
Nuove tecnologie hanno recentemente permesso di individuare varianti del DNA di dimensioni intermedie:
Varianti strutturali submicroscopiche•Copy Number Variants (CNVs) (inserzioni, duplicazioni, delezioni)•Inversioni
ARRAY CGH (Comparative Genome Hybridization)
Rivela le differenze tra 2 genomiArrays: BAC
Oligonucleotidi (60-100 bp)
ROMA (representational oligonuclotide microarray analysis)
AGTGGGTCGAGCTGATCGATCGGTCG
AGTGGGTCGAGCCGATCGATCGGTCG
AGTGGGTCGAGCAGATCGATCGGTCG
AGTGGGTCGAGCGGATCGATCGGTCG
Allele AAllele B PM-A
MM-APM-BMM-B
mismatch
Affymetrix SNP arraysAB BB AA
mismatch
analisi su 270 individui 1400 CNVs 12% (360 Mb) genoma
Effetti delle varianti strutturali sul fenotipo:• dosaggio genico• position effect
•285 geni in OMIM morbid map -> overlap con CNVs•Alta densità di CNVs vicino ai breakpoint di genomic disorders•Difficoltà nel risolvere le correlazioni genotipo-fenotipo
Database of genomic variantshttp://projects.tcag.ca/variation