UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DA
RELAÇÃO PARASITO-HOSPEDEIRO
HUGO CÉSAR PEREIRA SANTOS
Monitoramento e caracterização molecular de adenovírus humanos em amostras provenientes de pacientes submetidos ao transplante de células progenitoras
hematopoiéticas
Goiânia
2015
HUGO CÉSAR PEREIRA SANTOS
Monitoramento e caracterização molecular de adenovírus humanos em amostras provenientes de pacientes submetidos ao transplante de
células progenitoras hematopoiéticas
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre.
Orientadora: Profª. Drª. Menira Borges de Lima Dias e Souza
Goiânia
2015
ii
Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno (a): Hugo César Pereira Santos
Orientador (a): Profª. Drª. Menira Borges de Lima Dias e Souza
Membros:
1. Profª. Drª. Menira Borges de Lima Dias e Souza
2. Profª. Drª. Patricia Resende Alo Nagib Loyola
3. Prof. Dr. Paulo Sérgio Sucasas da Costa
Data: 19/03/2015
iii
Aos meus pais, exemplos de vida, pela preocupação, esforço e incentivo incessantes em minha educação e, principalmente, em minha formação moral.
iv
AGRADECIMENTOS
À professora e orientadora Drª. Menira Souza, pela paciência, incentivo,
auxílio e inspiradora dedicação à pesquisa e aos seus alunos. A oportunidade única
de trabalhar no Laboratório de Virologia propiciou ensinamentos e experiências que
vão muito além do universo dos vírus.
Ao Dr. Adriano de Moraes Arantes, que apesar do admirável e exaustivo
trabalho dedicado ao Hospital Araújo Jorge, prontamente se dispôs a ajudar na
pesquisa sempre que necessário.
À Larissa Pereira e Silva, sempre disposta à auxiliar no andamento do
projeto, pela imensa cooperação na coleta das amostras clínicas.
À Tâmera Almeida, pessoa ímpar, pela amizade e disposição para ajudar a
todos do laboratório sempre que necessário, e em especial pelo auxílio na análise
filogenética das amostras.
Ao Dr. Hugo Delleon, do laboratório de Genética Molecular e Citogenética,
sempre tranquilo e solícito, pela realização da quantificação das amostras positivas.
Às professoras Drª. Fabiola Fiaccadori e Drª. Keili Souza, pelos
ensinamentos e auxílio em todas as atividades do laboratório.
Aos grandes amigos Ítalo de Araújo Castro e Marielton dos Passos Cunha,
companheiros de jornada, pela amizade e auxílio nas mais diversas tarefas do
laboratório, e em especial ao bioinformata Tom pela assistência no sequenciamento
das amostras e análise das sequências genômicas.
Aos amigos, Anniely, Charles, Dayane, Francielly, Ivana, Kareem,
Lucianna, Nathânia, Romário, Thainara, Thais Corrêa, Thais Santana e Marina, pela
amizade, companheirismo e cooperação no desenvolvimento das atividades,
tornando o laboratório um local extremamente saudável e prazeroso de se trabalhar.
Aos meus pais, por todo amor e pelo trabalho árduo diário, incentivo e apoio
em prol de meu crescimento.
Aos meus irmãos, João Paulo, Marília e Sheila, pela sólida estrutura familiar
construída, e por estarem sempre ao meu lado, me apoiando.
À Nayche, minha base emocional em toda essa jornada, por todo carinho,
incentivo e dedicação.
À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de Goiás (FAPEG) e ao
Programa de Pós-Graduação em Biologia da Relação Parasito-Hospedeiro, pelo
apoio financeiro ao trabalho.
v
SUMÁRIO
TABELAS, FIGURAS, APÊNDICES E ANEXOS .................................................. vii
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS ............................................................ viii
RESUMO ......................................................................................................................... x
ABSTRACT ................................................................................................................... xi
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 1
1.1 Considerações gerais ......................................................................................... 1
1.2 Transplante de medula óssea ............................................................................ 2
1.2.1 Doença do enxerto contra o hospedeiro ................................................ 5
1.3 Histórico dos adenovírus ................................................................................... 6
1.4 Taxonomia e classificação dos adenovírus ....................................................... 7
1.5 Estrutura e replicação viral ............................................................................... 8
1.6 Propriedades biológicas dos adenovírus ......................................................... 11
1.7 Patogenia viral e quadro clínico de indivíduos infectados .............................. 12
1.8 Imunidade aos adenovírus ............................................................................... 14
1.9 Métodos diagnósticos ...................................................................................... 15
1.10 Epidemiologia dos adenovírus humanos ......................................................... 17
1.11 Adenovírus em pacientes submetidos ao TACPH .......................................... 18
1.12 Prevenção e tratamento ................................................................................... 22
2 JUSTIFICATIVA ....................................................................................................... 24
3 OBJETIVOS .............................................................................................................. 26
3.1 Objetivo Geral ................................................................................................. 26
3.2 Objetivos Específicos ...................................................................................... 26
4 MÉTODOS ................................................................................................................. 27
4.1 Delineamento do estudo .................................................................................. 27
4.2 Local e material de estudo .............................................................................. 27
4.3 Preparo das amostras clínicas ......................................................................... 28
4.4 Pesquisa de HAdV por ensaio imunoenzimático ............................................ 29
vi
4.5 Extração do DNA viral ................................................................................... 29
4.6 Pesquisa de HAdV por PCR e Nested-PCR .................................................... 30
4.7 Determinação da carga viral ........................................................................... 31
4.8 Purificação e sequenciamento genômico das amostras positivas para HAdV 32
4.9 Análise das sequências obtidas no sequenciamento genômico ....................... 32
4.10 Análise estatística ............................................................................................ 33
5 RESULTADOS .......................................................................................................... 34
6 DISCUSSÃO ............................................................................................................. 41
7 CONCLUSÕES ......................................................................................................... 52
REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 53
APÊNDICES E ANEXOS ........................................................................................... 66
vii
TABELAS, FIGURAS, APÊNDICES E ANEXOS
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação esquemática da partícula de adenovírus .................................... 9
Figura 2. Representação esquemática da organização genômica dos adenovírus do
gênero Mastadenovirus ................................................................................... 10
Figura 3. Árvore filogenética das sequências parciais do hexon dos adenovírus
detectados no estudo ....................................................................................... 40
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Graduação clínico-laboratorial da DECH aguda............................................... 5
Tabela 2. Infecções associadas às espécies e sorotipos de Adenovírus ......................... 13
Tabela 3. Características gerais da população de estudo e resultados da pesquisa de
HAdV nas amostras clínicas ........................................................................... 38
Tabela 4. Características das amostras positivas para HAdV ......................................... 39
LISTA DE APÊNDICES
Apêndice 1. Termo de consentimento livre e esclarecido ................................................ 66
Apêndice 2. Ficha de investigação clínica ....................................................................... 68
LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFG .......................................... 69
Anexo 2. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do HAJ/ACCG ............................... 72
Anexo 3. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFG, referente ao primeiro pedido
de emenda ao projeto inicial ........................................................................... 74
Anexo 4. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFG, referente ao segundo pedido
de emenda ao projeto incial ............................................................................ 75
viii
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
ACCG Associação de Combate ao Câncer em Goiás
AM Aplasia medular
AVC Acidente vascular cerebral
CDC Centers for Disease Control and Prevention – Centro de Controle e
Prevenção de Doenças
CMV Citomegalovírus
CPH Células progenitoras hematopoiéticas
CPSP Células progenitoras de sangue periférico
CG Cópias genômicas
DECH Doença do enxerto contra o hospedeiro
DNA Deoxyribonucleic acid – ácido desoxirribonucleico
DPT Dias pós-transplante
EIE Ensaio imunoenzimático
FMO Falência múltipla de orgãos
HAdV Adenovírus humano
HAJ Hospital Araújo Jorge
HLA Human Leucocitary Antigen – Antígeno Leucocitário Humano
HP Haplótipo
HPN Hemoglobinúria paroxística noturna
ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses – Comitê Internacional
de Taxonomia de Vírus
IPTSP Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública
LLA Leucemia linfoide aguda
LMA Leucemia mieloide aguda
LMC Leucemia mieloide crônica
ME Microscopia eletrônica
MFI Mielofibrose idiopática
mL Mililitro
MO Medula óssea
NK Natural killer
ix
nm Nanômetro
NoV Norovírus
pb Pares de bases
PBS Phosphate buffered saline – tampão fosfato salina
PCR Polymerase chain reaction – Reação em cadeia pela polimerase
pH Potencial hidrogeniônico
PoV Poliomavírus
PTT Púrpura trombocitopênica trombótica
qPCR Real time polymerase chain reaction – Reação em cadeia pela polimerase
em tempo real
RFLP Polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição
rpm Rotações por minuto
SMD Síndrome mielodisplásica
TACPH Transplante alogênico de células progenitoras hematopoiéticas
TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido
TCPH Transplante de células progenitoras hematopoiéticas
TMO Transplante de medula óssea
UFG Universidade Federal de Goiás
UTMO Unidade de Transplante de Medula Óssea
UV Ultravioleta
μL Microlitro
x
RESUMO
Os adenovírus humanos (HAdV) podem infectar pessoas de todas as idades,
causando uma ampla gama de quadros clínicos. Em pacientes imunocomprometidos,
como os indivíduos que receberam transplante, a infecção por esses vírus pode
resultar em pior prognóstico para o paciente. Determinados aspectos da patogenia
viral, como a associação entre viremia e/ou carga viral com a doença disseminada,
bem como o melhor momento para o início da terapia, não estão ainda bem
esclarecidos em pacientes que foram submetidos ao transplante de células
progenitoras hematopoiéticas (TACPH), principalmente em indivíduos adultos.
Dessa forma, o principal objetivo deste estudo foi realizar o monitoramento da
infecção por HAdV e a caracterização molecular das variantes virais em pacientes
submetidos ao TACPH, bem como determinar a carga viral e correlacionar a
infecção com o quadro clínico e prognóstico dos pacientes. Foram analisadas
amostras de soro e fezes de 21 pacientes submetidos ao TACPH no período de dois
anos (de outubro/2012 a outubro/2014). As amostras de fezes foram triadas por
ensaio imunoenzimático e por Nested-PCR, enquanto as amostras de soro foram
triadas somente por Nested-PCR de uma região parcial do gene hexon (produto
esperado de 143 pb). Foram detectadas amostras positivas de soro e/ou fezes de 57%
dos pacientes. De forma geral, os pacientes do presente estudo apresentaram elevadas
cargas virais (variando de 7,7x103 à 2x108 CG/mL), que foram mais elevadas nas
fezes. As amostras positivas foram submetidas ao sequenciamento genômico e
resultados revelaram a ocorrência de adenovírus das espécies C, D e F. O principal
quadro clínico apresentado pelos pacientes foi a diarreia e a principal intercorrência
observada, a doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH). Dez pacientes foram a
óbito durante o período de estudo, entretanto, não foi possível associar a infecção por
HAdV diretamente à causa mortis. Esperamos que os dados obtidos possam auxiliar
no melhor entendimento do padrão da infecção dos HAdVs em pacientes submetidos
ao TACPH, de forma a contribuir para que a pesquisa de adenovírus seja incluída na
rotina de exames desses pacientes.
Palavras-chave: Adenovírus Humanos; Monitoramento; Transplante Alogênico de
Células Progenitoras Hematopoiéticas; Viremia
xi
ABSTRACT
The human adenoviruses (HAdV) infect people of all ages worldwide, causing a
wide range of clinical syndromes, depending on the viral type. In
immunocompromised hosts, as transplanted patients, HAdV infection can result in a
bad prognosis. Some aspects of viral pathogenesis, such as the association between
viremia and/or viral load with disseminated disease and the optimal moment to start
the therapy, are still not well established in adult patients that have undergone
allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (ASCT). Therefore, the main
objective of this study was to monitor ASCT recipients for HAdV occurrence, and
also correlate viral positivity, viral load and molecular variant with clinical
symptoms and patients’ prognosis. For this, stool and serum from 21 patients were
monitored in a 2 years period (from October/2012 to October/2014). Serum and fecal
samples were screened by Nested-PCR, using primers targeting a partial region of
the hexon gene (143bp). Fecal samples were further screened by a commercial
enzyme immunoassay (EIA). In total, 57% of the patients had at least one positive
sample (serum or stool) for HAdV. Patients presented high viral load (varying from
7,7x103 to 2x108 copies/mL), with a higher viral load in stool when compared to
serum. Positive samples were submitted to genomic sequencing, revealing the
occurrence of HAdV from C, D and F species. The main clinical symptom presented
by infected patients was diarrhea, and graft-versus-host disease was the main
intercurrence; however it was not possible to directly associate viral positivity to
cause of death. We hope to contribute for a better understanding of the HAdV
infection pattern in patients submitted to ASCT. Our data highlights the importance
of the inclusion of HAdV testing in the routine laboratory exams of this group of
patients.
Keywords: Bone Marrow Transplant; HAdV Monitoring; Human Adenovirus;
Viremia
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Considerações gerais
As infecções virais constituem uma das mais importantes intercorrências em
indivíduos submetidos a transplantes. O prognóstico do paciente
imunocomprometido, seja devido à doença debilitante ou ao tratamento com drogas
imunossupressoras, depende da implementação de medidas preventivas e de um
rápido diagnóstico para o controle de infecções oportunistas (Hierholzer 1992,
Ohrmalm et al. 2011).
Dentre os agentes virais mais frequentes entre pacientes
imunocomprometidos, destacam-se os vírus da família Herpesviridae, como o
citomegalovírus, herpesvírus 6 e o vírus varicela zoster, os vírus da família
Polyomaviridae, os adenovírus humanos (HAdV), o vírus influenza, dentre outros
(Marr 2012).
Os adenovírus comumente infectam humanos, causando uma variedade de
sintomas clínicos. De um modo geral, os sintomas podem ser brandos, como no caso
de infecções gastroentéricas ou no trato respiratório superior, ou mais graves e menos
frequentes, como hepatite ou meningoencefalite (Ljungman et al. 2003, Centers for
Disease Control and Prevention - CDC 2011, Ferreira et al. 2012), o que depende de
fatores como variante viral e características intrínsecas aos indivíduos infectados,
como a idade e status imunológico. Em indivíduos imunocompetentes, a infecção por
HAdV é geralmente bem controlada pelo sistema imunológico (Ljungman et al.
2003, CDC 2011).
Apesar dos HAdVs serem reconhecidos como importantes agentes
oportunistas em pacientes transplantados desde os anos 70 (Myerowitz et al. 1975),
poucos estudos têm sido realizados tendo como alvo a ocorrência de HAdVs em
determinados tipos de populações de transplantados, como os pacientes adultos
submetidos ao transplante de células progenitoras hematopoiéticas (TCPH); a
maioria das pesquisas são realizadas com pacientes pediátricos (Baldwin et al. 2000,
Lion et al. 2010, Lo et al. 2013).
2
Em pacientes imunocomprometidos, geralmente ocorre disseminação viral,
o que pode levar a um agravamento do quadro clínico e contribuindo para uma maior
taxa de mortalidade nesta população (Leen & Rooney 2005, Ganzenmueller et al.
2011, Ohrmalm et al. 2011). Outro fator que também contribui para um pior
prognóstico desses pacientes é que em parte considerável dos casos, a infecção por
HAdV não é diagnosticada ou é diagnosticada equivocadamente como doença do
enxerto contra o hospedeiro (DECH). Nesses casos, uso de terapia imunossupressora
utilizada agrava ainda mais o quadro clínico do paciente (Walls et al. 2003,
Ganzenmueller et al. 2011, Marr 2012). Ademais, o tratamento de escolha contra
esses agentes permanece ainda controverso, não estando ainda bem definido o
momento certo para o início da terapia (Kojaoghlanian et al. 2003, Chakrabarti 2007,
Ohrmalm et al. 2011, Marr 2012, Mynarek et al. 2014).
1.2 Transplante de medula óssea
O transplante de medula óssea (TMO) é um meio de reestabelecer a
hematopoese defeituosa em pacientes com doenças hematológicas malignas, tais
como leucemias e linfomas, ou não-malignas, como aplasia de medula óssea ou
anemia de Fanconi, bem como tumores sólidos e imunodeficiências que afetam a
formação e manutenção do tecido sanguíneo (Amos & Gordon 1995, Seber et al.
2010). O TMO é caracterizado pela coleta das células-tronco da medula do doador,
que pode ser o próprio paciente (transplante autólogo) ou um doador compatível
(transplante alogênico, aparentado ou não), seguida da infusão dessas células no
paciente após um período de condicionamento (Lima et al. 2012). As células
progenitoras hematopoiéticas (CPH) da medula óssea infundidas são capazes de se
implantar na medula óssea do paciente e se diferenciarem em todas as células
sanguíneas maduras, mantendo a capacidade de autorrenovação (Mendrone Junior
2009).
O primeiro relato de infusão de medula óssea data de 1939, quando um
paciente recebeu as células de seu irmão na tentativa de tratar uma aplasia medular
(Osgood et al. 1939). Entretanto, somente nas décadas de 50 e 60 começaram a se
3
formar as bases científicas do TMO, com estudos envolvendo a irradiação corporal
total de doses mieloablastivas em cães e roedores, seguidas de posterior recuperação
por meio da infusão de medula de doadores aparentados (Lorenz et al. 1951, Thomas
et al. 1962). Em 1969, o primeiro TMO bem sucedido foi realizado nos Estados
Unidos por Thomas e colaboradores, em um paciente com leucemia que recebeu
doses letais de irradiação corporal total, seguido da infusão de células da medula de
seu irmão (Thomas et al. 1975).
O grau de compatibilidade imunológica entre o doador e o paciente é
essencial para o sucesso do transplante. Os antígenos leucocitários humanos (HLA),
codificados pelo complexo de histocompatibilidade principal, são as proteínas que
mais influenciam na compatibilidade do enxerto, e há maior probabilidade de irmãos
serem HLA idênticos. Nesse contexto, quanto maior a divergência entre paciente e
doador, maior a probabilidade de desenvolvimento de DECH; entretanto, a doação de
enxertos HLA idênticos não exclui a probabilidade de desenvolver essa complicação
(Castro Junior et al. 2001, Harris et al. 2013). A incompatibilidade do grupo
sanguíneo, embora não esteja relacionada à DECH, está associada a um aumento da
mortalidade dos pacientes transplantados (Jagasia et al. 2012).
A medula óssea é a principal fonte de células hematopoiéticas. Entretanto, o
sangue periférico, após tratamento com quimioterápicos e/ou fatores de crescimento
hematopoético que mobilizam as células do compartimento medular para a periferia,
possibilita também a coleta de CPH suficientes para o transplante, porém em
números menores (Mendrone Junior 2009). O fato das células periféricas possuírem
grandes quantidades de linfócitos maduros e células natural killer diminui o risco de
recidiva da malignidade devido ao efeito ‘enxerto contra leucemia’, em que o enxerto
reconhece antígenos tumor-específicos expressos pelas células malignas,
estimulando a sua eliminação; há, porém, um aumento da frequência de DECH
crônica nesses pacientes (Vigorito & Souza 2009). O sangue de cordão umbilical
possui também células transplantáveis, com a vantagem de haver menor incidência
de DECH nesse tipo de transplante; entretanto, a reconstituição de determinadas
subpopulações de células, como os neutrófilos e plaquetas, é mais lenta, além do
número limitado de células que podem ser recuperadas do sangue de cordão
(Vigorito & Souza 2009).
4
No transplante alogênico de células progenitoras hematopoiéticas (TACPH),
o paciente deve passar por um período de condicionamento pré-transplante, onde o
sistema imune deve sofrer uma ablação praticamente total, a fim de se erradicar a
doença residual do paciente, assim como evitar o estabelecimento de uma resposta de
rejeição às CPH transplantadas (Reis & Visentainer 2004). Nessa fase, os receptores
ficam vulneráveis a uma série de infecções. O reestabelecimento funcional dos
linfócitos e células imunes efetoras é um processo lento e gradual, processo que pode
durar mais de um ano (Mir & Battiwalla 2009).
A frequência de pacientes que obtiveram sucesso com o TACPH tem
aumentado exponencialmente devido ao crescente conhecimento do sistema de
histocompatibilidade humano; entretanto, a doença do enxerto contra o hospedeiro e
as infecções ainda representam as mais comuns complicações após o transplante
alogênico, sendo as principais causas de morbidade e mortalidade (Naoum et al.
2002, Lima et al. 2012).
Após o período de condicionamento, os pacientes ficam muito susceptíveis
a infecções, pois nessa fase a memória imunológica, bem como a ativação da
resposta imune, estão prejudicadas, sendo importante uma vigilância constante e o
desenvolvimento de estratégias de tratamento preventivo contra as infecções (Luke et
al. 2013). A profilaxia contra bactérias é realizada com antibióticos de largo espectro,
considerando-se os patógenos mais frequentes do local onde o transplante é
realizado. O uso profilático de fluconazol contra fungos tem também um impacto
positivo nesses pacientes (Castro Junior et al. 2001). Para a profilaxia contra
infecções virais, recomenda-se o uso de aciclovir, prevenindo principalmente a
reativação dos herpesvírus (Nucci & Maiolino 2000, Castro Junior et al. 2001).
Entretanto, estudos recentes têm demonstrado que outros vírus, tais como
citomegalovírus, poliomavírus, adenovírus, norovírus, dentre outros, podem causar
infecções nesses pacientes, podendo contribuir para um pior prognóstico, inclusive
resultando em óbito (Marr 2012, Lemes et al. 2014)
5
1.2.1 Doença do enxerto contra o hospedeiro
A DECH é uma complicação decorrente da ativação de células T do doador,
que reconhecem como estranho o tecido do receptor, podendo se apresentar na forma
aguda ou crônica. Todos os pacientes que receberam CPH alogênicas estão sujeitos a
desenvolver a DECH. As manifestações clínicas podem afetar principalmente a pele,
o fígado, o trato gastrointestinal, os olhos e o sistema linfoide (Azevedo 2010,
Bouzas et al. 2010). Mesmo em transplantes com enxertos HLA idênticos, a
ocorrência de DECH moderada a grave acontece em cerca de 40% dos casos, devido
à presença de determinados antígenos incompatíveis e que não são detectados pelos
métodos tradicionais de tipagem (Castro Junior et al. 2001, Jagasia et al. 2012).
Por definição, a DECH aguda manifesta-se até cem dias após o transplante,
a partir da data da enxertia (Castro Junior et al 2001). A graduação clínica da DECH
aguda ocorre de acordo com a gravidade e porcentagem da pele atingida, dos níveis
de bilirrubina no sangue e do volume diário de diarreia, variando de I (leve) a IV
(risco de vida) (Tabela 1). O tratamento é realizado somente em DECH grau II ou
superior, com o uso de diferentes combinações de metotrexato, ciclosporina,
corticoides, tacrolimus e micofenolato-mofetil. Entretanto, o tratamento leva a uma
supressão do sistema imunológico, propiciando o aparecimento de infecções
oportunistas (Balman et al. 2009).
Tabela 1. Graduação clínico-laboratorial da DECH aguda.
Fonte: Castro Junior et al. 2001.
6
A DECH crônica se expressa como uma doença crônica auto-imune, a partir
de cem dias após o transplante. Sua graduação pode ser em limitada ou extensa, de
forma que a DECH limitada ocorre quando envolve porções localizadas da pele ou
disfunção hepática. A DECH extensa é caracterizada quando há envolvimento
generalizado da pele, e/ou disfunção hepática, associadas à necrose e cirrose,
envolvimento ocular, envolvimento das glândulas salivares ou mucosa oral e/ou
envolvimento de outros órgãos alvo (Castro Junior et al. 2001). Na maioria das
vezes, trata-se a DECH crônica com o uso de diferentes combinações de
prednisolona e ciclosporina. Nos casos de DECH extensa onde não há resultado
satisfatório com esses fármacos, são exigidos tratamentos prolongados com
talidomida, azatioprina, tacrolimus, micofenolato-monofetil ou psoraleno associado à
radiação ultravioleta (Peters et al. 2000, Castro Junior et al. 2001, Bouzas et al.
2010).
1.3 Histórico dos adenovírus
Em 1953, Rowe e colaboradores tentavam estabelecer culturas a partir de
tecidos de adenoides e amigdalas para utilizarem em estudos sobre vírus
responsáveis pelo resfriado comum, quando perceberam que um agente transmissível
causava degeneração das células em cultura (Rowe et al. 1953). No ano seguinte,
foram relatados casos de doença febril respiratória em militares americanos,
inicialmente com suspeita de infecção pelo vírus influenza. Entretanto, como esse
não foi identificado em ambos os casos, percebeu-se que o agente em questão
tratava-se de um novo vírus (Hilleman & Werner 1954, apud Ginsberg 1999).
Inicialmente estes agentes foram chamados de ‘vírus da degeneração da adenoide’,
‘vírus adenoide-faríngeo’ e ‘vírus da doença respiratória aguda’, até que em 1956
adotou-se o nome adenovírus, em razão do tipo de células em que o vírus foi
originalmente isolado (Enders et al. 1956).
Desde sua descoberta, vários estudos foram realizados inoculando-se
diferentes variantes de HAdV em voluntários humanos para uma melhor
compreensão da patogênese viral (Lichtenstein & Wold 2004). Desta forma, uma
7
ampla gama de sintomas, além dos relacionados ao trato respiratório, foi aos poucos
sendo associada à infecção por esses vírus em humanos, como queratoconjuntivite,
gastroenterite, hepatite, miocardite, cistite hemorrágica, dentre outros (Lichtenstein
& Wold 2004, Wold & Ison 2013).
Em 1962, um estudo demonstrou que determinado tipo de adenovírus era
capaz de induzir a formação de tumores malignos em roedores, e pela primeira vez o
potencial oncogênico foi associado a um vírus patogênico em humanos (Trentin et al.
1992). Ainda não há evidências da relação entre nenhum HAdV e o desenvolvimento
de tumores malignos em humanos. Entretanto, a capacidade de induzir tumores em
roedores atribuiu aos adenovírus grande importância como modelo de estudo para a
análise dos mecanismos da oncogênese (Wold & Ison 2013).
Em 1966, a baixa imunidade de um paciente pediátrico foi associada à
infecção disseminada por HAdV, resultando no óbito da criança (Wigger & Blank
1966). Posteriormente, em 1975, foi relatado pela primeira vez um caso fatal de
HAdV em um paciente transplantado, cuja fonte de infecção foi atribuída à uma
infecção no rim do doador (Myerowitz et al. 1975). A partir da década de 80, com o
desenvolvimento de métodos moleculares para o estudo dos vírus, a emergência da
síndrome da imunodeficiência adquirida e o aumento crescente da realização de
transplantes, foi sendo cada vez mais estabelecida a relação entre infecção por HAdV
e complicações em pacientes imunocomprometidos (Kojaoghlanian et al. 2003).
1.4 Taxonomia e classificação dos adenovírus
Os adenovírus pertencem à família Adenoviridae, a qual é composta por
cinco gêneros: Atadenovirus, Aviadenovirus, Ichtadenovirus, Mastadenovirus e
Siadenovirus. Somente os adenovírus pertencentes ao gênero Mastadenovirus
possuem importância patogênica para humanos, podendo ainda infectar diversos
mamíferos como morcegos, bovinos, equinos, caninos, murinos, ovinos, porcinos e
símios (International Committee on Taxonomy of Viruses – ICTV 2013).
Os HAdV são subdivididos em sete espécies, de A à G, classificados de
acordo com suas características biológicas, imunológicas, genéticas e bioquímicas.
8
Foram oficialmente reconhecidos, até o momento, 57 sorotipos, classificados por
meio de reações de hemaglutinação e soroneutralização, e agrupados da seguinte
forma: espécie A (Ad12, 18, 31), espécie B (Ad3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50, 55),
espécie C (Ad1, 2, 5, 6, 57), espécie D (Ad8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-
39, 42-49, 51, 53, 54, 56), espécie E (Ad4), espécie F (Ad40 e 41) e espécie G
(Ad52) (De Jong et al. 1999, Jones et al. 2007, ICTV 2013, Wold & Ison 2013).
Recentemente, uma nova classificação baseada em análises da sequência
genômica completa dos adenovírus utilizando bioinformática foi proposta, sugerindo
a existência de 68 diferentes tipos de HAdV, incluindo novos vírus emergentes e
recombinantes (Seto et al. 2011, Buckwalter et al. 2012, Ghebremedhin 2014).
1.5 Estrutura e replicação viral
As partículas de adenovírus não possuem envelope, têm capsídeo com
simetria icosaédrica e diâmetro de aproximadamente 90 nm (Figura 1) (Leen &
Rooney 2005, Nemerow et al. 2012). O capsídeo viral é formado por 252
capsômeros, sendo 240 hexagonais designados de hexons, que formam as 20 faces
triangulares do icosaedro, e 12 pentagonais denominados pentons, que formam os
vértices do icosaedro (Maizel et al. 1968, Stewart et al. 1993). De cada penton
projeta-se uma fibra, que apresenta em sua extremidade uma esférula que possui
propriedades imunogênicas e função de adsorção da partícula à célula alvo (Henaff et
al. 2011).
9
Figura 1. Representação esquemática da partícula de adenovírus.
Adaptado de Martin (2012).
A partícula viral infecciosa (Figura 1), ou vírion, é composta por 11
proteínas estruturais, sendo sete formadoras do capsídeo e quatro que, circundadas
pelas proteínas do capsídeo, juntamente com o genoma formam o core viral. O
capsídeo viral é formado pelos polipeptídios II, III, IIIa, IV, VI, VIII e IX. O hexon é
formado por três moléculas da proteína II, sendo o mais abundante do vírion, e
possui quatro regiões conservadas (C1 a C4) e três regiões variáveis (V1 a V3)
(Ebner et al. 2005). O penton é formado por cinco moléculas da proteína III, sendo
cada um a base de uma fibra, formada por três cópias da proteína IV. A proteína IIIa
é associada ao hexon que circunda o penton, e funciona como uma ponte entre o
hexon e a proteína VII do core. As proteínas VI, VIII e IX conferem estabilidade ao
10
hexon, sendo que as proteínas VI e VIII funcionam ainda como uma ponte entre
elementos do capsídeo e do core viral (Everitt et al. 1973, 1975, Martin 2012,
Nemerow et al. 2012).
O core viral é formado pelas proteínas V, VII, X e TP. A proteína V forma
uma ponte entre o core e o capsídeo, ligando-se na base do penton. A proteína VII
tem função análoga às histonas, condensando e empacotando o genoma viral. A
proteína TP (terminal protein), localizada na extremidade 5´ do genoma viral,
funciona como um iniciador na replicação (Everitt et al. 1975, Fredman & Engler
1993). A proteína X não tem função bem conhecida, apesar de ter sido provado in
vitro que ela precipita o DNA, o que sugere uma função de condensação do genoma
no core viral (Anderson et al. 1989).
O genoma dos adenovírus consiste de uma molécula de ácido
desoxirribonucleico de fita dupla linear (dsDNA) (Figura 2). Em 1984, o genoma
completo do adenovírus (Ad2) foi sequenciado pela primeira vez (Roberts et al.
1984) e, desde então, diversos outros têm sido sequenciados, revelando genomas de
aproximadamente 35000 pares de bases (Davison et al. 2003, Berk 2013). O hexon,
que possui aproximadamente 2800 pares de bases, apresenta relativamente pouca
variação entre os diferentes sorotipos de HAdV, sendo a região mais conservada do
genoma, propiciando o estabelecimento de testes altamente específicos que detectam
todos os sorotipos virais (Ebner et al. 2005).
Figura 2. Representação esquemática da organização genômica dos adenovírus
do gênero Mastadenovirus (adaptado de Davison et al. 2003)
11
O ciclo replicativo é dividido em duas fases, separadas pelo início da
replicação do DNA viral. Os eventos iniciais incluem a adsorção, penetração,
transporte do DNA viral ao núcleo e expressão dos genes imediatos. O genoma
contém cinco unidades transcricionais imediatas, relacionados com a ativação da
transcrição e indução da célula hospedeira a entrar na fase S da replicação (E1A),
bloqueio da apoptose (E1B), replicação do DNA (E2), modulação da resposta imune
do hospedeiro contra a infecção (E3) e modulação da replicação do DNA, apoptose e
exportação do mRNA (E4). São quatro as unidades intermediárias, relacionadas com
a expressão de IX do capsídeo (IX), montagem do capsídeo (IVa2 e L4
intermediário) e replicação (E2 tardio). Por fim, a unidade transcricional tardia
codifica principalmente proteínas que estão envolvidas no capsídeo e montagem
viral. Ao final do ciclo, aproximadamente 104 partículas virais são produzidas por
célula (Berk 2013).
1.6 Propriedades biológicas dos adenovírus
Por não possuírem envelope, apresentarem capsídeo bem organizado e
genoma composto por DNA, os adenovírus são bastante estáveis em condições
ambientais, resistindo por longos períodos em meio líquido ou em superfícies em
estado dessecado, resistindo até mesmo a agentes químicos desnaturantes,
dependendo de suas concentrações e tempo de incubação (Gordon et al. 1993,
Mattner et al. 2008). Alguns sorotipos de adenovírus apresentam resistência também
ao processo de tratamento de águas de esgoto (Mena & Gerba 2009). Constatou-se
ainda que esses vírus são mais resistentes à luz ultravioleta quando comparados com
outros vírus transmitidos pela água (Nwachuku et al. 2005).
Essas características fazem dos adenovírus candidatos em potencial para
serem utilizados, juntamente com parâmetros físico-químicos e bacteriológicos,
como agentes indicadores de qualidade das águas (Tavares et al. 2005, Gibson 2014).
Para a inativação dos HAdV, recomenda-se a desinfecção de superfícies ou
equipamentos com álcool etílico a 70% ou soluções de cloro à 5000 partes por
milhão (Rutala et al. 2006).
12
1.7 Patogenia viral e quadro clínico de indivíduos infectados
Os HAdVs podem ser transmitidos pela via fecal-oral, principalmente
através do contato direto de indivíduo susceptível com fezes ou objetos
contaminados contendo partículas virais viáveis; pela via respiratória; através do
contato do vírus com a conjuntiva ocular; ou até mesmo por transplante de órgãos
que contém os vírus na forma latente (Runde et al. 2001, CDC 2011, Wold & Ison
2013).
Existem várias moléculas na superfície de células de humanos que
funcionam como receptores para os HAdVs, tornando estes agentes
consideravelmente ubíquos quanto ao sítio de entrada no organismo. São atualmente
reconhecidos como receptores de adenovírus: receptor de coxsackie e adenovírus
(CAR – diversos sorotipos das espécies A, C, D, E e F); CD46 (diversos sorotipos da
espécie B e um sorotipo da espécie C); CD80 e CD86 (adenovírus tipo 3); ácido
siálico (diversos sorotipos da espécie D); algumas integrinas, dentre outros
receptores (Zhang & Bergelson 2005).
O período de incubação dos HAdVs em indivíduos saudáveis varia de dois a
quatorze dias, sendo a doença geralmente autolimitada (CDC 2011, Tebruegge &
Curtis 2012). Os HAdVs se replicam inicialmente, principalmente, em células do
epitélio respiratório não-ciliado, como nas tonsilas e adenoides, além de poderem se
replicar de forma limitada em linfócitos, ou em células maduras das vilosidades do
intestino delgado, dependendo do sorotipo viral (Lukashok & Horwitz 2006). A
partir dos sítios primários de infecção, os adenovírus podem atingir as vias
circulatórias e produzir infecções em diversos tecidos do organismo, de forma que
esses vírus já foram detectados em praticamente todos os órgãos dos humanos. Em
pacientes que receberam órgãos sólidos, os adenovírus comumente atingem o órgão
transplantado (Hierholzer 1992). Os HAdVs são excretados em elevado número de
partículas virais nas fezes e pelas vias respiratórias de indivíduos infectados,
atingindo também as vias urinárias de alguns indivíduos, dependendo da espécie e
sorotipo (Wold & Ison 2013).
De uma forma geral, a maioria dos adenovírus podem provocar infecções do
gastrointestinais e respiratórias, podendo causar também infecções oculares ou
13
urinárias, dependendo da espécie e sorotipo (Wadell 1984, Wold & Ison 2013)
(Tabela 2). Entretanto, deve-se ressaltar que os adenovírus podem ser excretados
pelas fezes de indivíduos infectados, independentemente do sítio primário de
replicação viral e quadro clínico, mesmo após uma resposta humoral efetiva, e essa
excreção pode perdurar por meses (Roy et al. 2011, Wold & Ison 2013).
Tabela 2. Infecções associadas às espécies e sorotipos de Adenovírus. Adaptado
de Wold & Ison 2013
Espécie Sorotipos Principais sítios de infecção
A 12, 18, 31 Respiratório, urinário, GI
B 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, 50, 55 Respiratório, ocular, urinário, GI
C 1, 2, 5, 6, 57 Respiratório, urinário, GI
D 8-10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32,
33, 36-39, 42-49, 51, 53, 54, 56
Ocular, GI
E 4 Ocular, respiratório
F 40, 41 GI
G 52 GI
GI - Gastrointestinal
Os HAdVs podem estar associados a diversas síndromes como: resfriado,
faringite, bronquite, doença respiratória aguda, pneumonia, conjuntivite,
gastroenterite, intussuscepção, cistite, doenças exantemáticas e febre. Os vírus
podem ainda atingir o sistema nervoso central, causando meningite asséptica,
meningoencefalite e encefalite, principalmente em imunocomprometidos
(Kojaoghlanian et al. 2003, Lema et al. 2005, CDC 2011, Tebruegge & Curtis 2012).
Esses vírus podem ainda causar infecções persistentes assintomáticas nas tonsilas,
adenoides e intestino, podendo ser excretados por meses e até por anos (CDC 2011,
Roy et al. 2011), o que facilitaria ocorrência de infecções nosocomiais (Leruez-Ville
et al. 2006, Mattner et al. 2008). A excreção prolongada aliada à elevada resistência
viral propicia a ocorrência de surtos de adenovírus principalmente em hospitais, onde
a infecção por esses vírus pode levar a quadros clínicos mais graves (Paris et al.
2014).
14
1.8 Imunidade aos adenovírus
O principal mecanismo de proteção aos HAdVs consiste da imunidade
mediada por anticorpos, que é sorotipo-específica, protegendo o indivíduo de
reinfecções por um mesmo sorotipo viral. Os anticorpos aparecem cerca de sete dias
após o aparecimento dos sintomas. Os principais epítopos reconhecidos pelos
anticorpos neutralizantes estão localizados no hexon e na fibra viral, de forma que os
anticorpos específicos e neutralizantes para a fibra e penton inibem a sua adsorção
aos receptores do hospedeiro, impedindo assim o estabelecimento da infecção
(Norrby 1969, Kojaoghlanian et al. 2003, Wold & Ison 2013).
A imunidade celular também é importante para a resolução da infecção, e as
células Natural Killer (NK) são uma das primeiras a agir contra células infectadas
pelo vírus, de forma que sua deficiência foi relatada em casos de infecção grave e
fatal por HAdV. Valores elevados das interleucinas 6 e 8 e do fator de necrose
tumoral alfa no soro, produzidas no processo de resposta celular, estão associados à
infecção grave e fatal por adenovírus (Mistchenko et al. 1994, 1998).
O desenvolvimento de linfócitos CD4+ e CD8+ específicos são importantes
para limitar a produção de novas partículas de HAdVs, agindo de forma coordenada
principalmente contra epítopos da região mais conservada, o hexon, sendo observada
certa reação cruzada na resposta contra diferentes sorotipos (Wold & Ison 2013).
Entretanto, os adenovírus codificam para proteínas imunorregulatórias que podem
atenuar a resposta imune, sendo estas principalmente codificadas pelo gene E3
(Kojaoghlanian et al. 2003). Essas proteínas ligam-se às moléculas do complexo
principal de histocompatibilidade (MHC), impedindo o seu transporte à superfície
celular e, consequentemente, dificultando o reconhecimento de antígenos virais e a
destruição de células infectadas por HAdV (Wold & Ison 2013).
Na maioria dos indivíduos imunocompetentes ocorre a proliferação de
células T CD4+ após a infecção por HAdV, principalmente do subtipo Th1
(Chirmule et al. 1999). Nos casos de infecção com manifestações clínicas graves e
até fatais por HAdV em pacientes pediátricos, foi observada uma depleção
significativa de células T CD4+, células T CD8+, células NK efetoras e células B1,
dentre outros subtipos (Mistchenko et al. 1998). Estes dados sugerem que, em
15
pacientes que foram submetidos ao TACPH, um dos fatores que podem estar
associados à maior gravidade da infecção seja a deficiência da resposta imune
mediada por células T (Feuchtinger et al. 2004).
1.9 Métodos diagnósticos
As infecções por HAdV são muitas vezes difíceis de serem diferenciadas de
outras viroses respiratórias, de algumas infecções bacterianas, e de infecções
gastrointestinais por outros patógenos, em função da semelhança dos sintomas que
podem ser apresentados pelos pacientes no curso da infecção. Atualmente, vários
métodos diagnósticos estão disponíveis para a detecção dos adenovírus. Esse vírus
pode ser detectado em uma variedade de espécimes clínicos, como aspirado
nasofaríngeo, swab de garganta, nariz ou conjuntiva, líquor, sangue, urina, fezes e
biópsias de diferentes órgãos ou tecidos, de forma que a obtenção da amostra mais
adequada depende do quadro clínico apresentado pelo paciente (Wold & Ison 2013,
Tebruegge & Curtis 2012).
O isolamento viral por meio de cultura celular pode ser utilizado no
diagnóstico dos HAdVs, visto que estes se replicam bem em uma variedade de
células, produzindo efeito citopático típico geralmente em dois a cinco dias. As
células mais utilizadas para este fim são as células de rim de embrião humano (HEK)
(Kojaoghlanian 2003). Para o cultivo dos adenovírus Ad40 e 41, considerados mais
fastidiosos, tem-se utilizado células conjuntivais Chang, HEp-2, células terciárias de
rim de macaco Cynomolgus, células de rim de embrião humano transformadas com
DNA de Ad5 (HEK-293) e células derivadas de adenocarcinoma de pulmão humano
(A-549) (De Jong et al. 1983). A detecção do vírus após o cultivo in vitro pode ser
realizada através das técnicas de imunofluorescência, teste de fixação do
complemento, inibição da hemaglutinação e soroneutralização, além de métodos
moleculares como PCR ou PCR em tempo real (Wold & Ison 2013).
A microscopia eletrônica (ME) pode ser utilizada na detecção de HAdV
diretamente no espécime clínico ou em material proveniente da replicação viral in
vitro. Esta metodologia permite que se observe a morfologia característica destes
16
agentes de forma rápida e específica, entretanto uma das desvantagens é a baixa
sensibilidade, que permite a observação de partículas a partir de amostras clínicas
contendo mais que 106 partículas por mL de amostra (Wold & Ison 2013). Uma
forma de se aumentar a sensibilidade de detecção seria a utilização da
Imunomicroscopia eletrônica, que preconiza a incubação prévia da amostra com um
soro hiperimune, permitindo assim a detecção do vírus em amostras que tenham um
menor número de partículas de HAdV (Cardoso et al. 1992).
Os testes de imunocromatografia e ensaios imunoenzimáticos (EIE) podem
também ser utilizados para a detecção de antígeno viral ou anticorpos de maneira
específica e sensível, sendo utilizado principalmente para a detecção dos adenovírus
Ad40 e Ad41, tendo como alvo, geralmente, antígenos da proteína do hexon.
Entretanto, dependendo do momento da infecção ou quando a replicação viral ocorre
em outro sítio diferente do intestino, a carga viral nas fezes pode ser insuficiente para
a detecção por estes métodos (Raboni et al. 2003b, Walls et al. 2003, Zlateva et al.
2005).
Os métodos moleculares são bastante eficientes na detecção do material
genético dos HAdVs, especialmente em amostras nas quais a carga viral é bastante
reduzida para a detecção por outros métodos. Na reação em cadeia pela polimerase
(Polymerase Chain Reaction - PCR), tem-se utilizado, para a triagem de amostras,
pares de iniciadores que têm como alvo regiões parciais do hexon, que são bastante
conservadas entre as variantes de adenovírus (Allard et al. 1990, Watanabe et al.
2005). Os HAdVs podem ainda ser caracterizados utilizando-se a Nested-PCR, com
pares de iniciadores que têm como alvo sequencias mais internas aos iniciadores
consensuais, que apesar de flanquearem uma região conservada, podem ser
heterogêneas o suficiente para permitir a diferenciação de sorotipos (Allard et al.
1992, Puig et al. 1994, Ebner et al. 2005).
Recentemente, diversos protocolos de reações de PCR em tempo real têm
sido desenvolvidos com o intuito de determinar a carga viral em amostras clínicas.
Esta metodologia possui a grande vantagem de permitir a quantificação de cópias
genômicas do agente em questão, é rápida e bastante sensível e específica, e dentre
as desvantagens estão o custo elevado, a necessidade de pessoal treinado e
17
equipamento adequado (Heim et al. 2003, Ganzenmueller & Heim 2012, Henke-
Gendo et al. 2012).
Pode-se ainda utilizar a técnica de Polimorfismo de Comprimento de
Fragmentos de Restrição (Restriction Length Fragment Polymorphysm - RFLP) que
utiliza enzimas de restrição, de origem bacteriana, para a clivagem de fragmentos
obtidos da reação de Nested-PCR, permitindo assim a classificação dos adenovírus
em sorotipos (Saitoh-Inagawa et al. 1996).
O sequenciamento genômico, seguido de análise filogenética, é também
utilizado para a caracterização molecular, através da determinação da sequência
nucleotídica de regiões parciais ou do genoma viral completo, podendo assim ser
feita uma análise comparativa das amostras caracterizadas com outros isolados de
diferentes partes do mundo (Shimada et al. 2004).
Apesar da variedade de métodos diagnósticos disponíveis para a detecção
dos HAdV, a eficácia da detecção depende muito do tipo de amostra analisada, visto
que esses vírus podem se replicar em diversos sítios diferentes, do tempo da
infecção, apesar da excreção que pode ser prolongada nas fezes ou secreções
respiratórias, e principalmente das técnicas utilizadas, que podem possuir
sensibilidade variada (Wold & Ison 2013).
1.10 Epidemiologia dos adenovírus humanos
Infecções causadas por HAdV ocorrem em indivíduos de todas as idades e
em diversas partes do mundo (Ramani & Kang, 2009, CDC 2011, Luksic et al. 2013,
Walker & Ison 2014). Devido à inespecificidade dos sintomas, o estudo da
epidemiologia dos adenovírus depende de técnicas laboratoriais específicas para sua
detecção e caracterização, de forma que talvez sua ocorrência seja subestimada
(Walls et al. 2003, Wold & Ison 2013). Os percentuais de detecção de HAdV variam
de acordo com o local e tipo de amostra clínica analisada, entretanto estima-se que
sejam responsáveis por aproximadamente 8% de todas as infecções virais
clinicamente relevantes em todo o mundo (Wold & Ison 2013).
18
Dados epidemiológicos sugerem que a maioria dos casos de infecção por
HAdV no mundo ocorra nos primeiros cinco anos de vida, sendo responsável por 5 a
15% das infecções no trato respiratório superior e 5% das infecções no trato
respiratório inferior (Tebrugge & Curtis 2012). Esses vírus são também importantes
causadores de gastroenterite. Dados da Ásia demonstraram que aproximadamente
4,4% dos pacientes pediátricos com gastroenterite apresentavam adenovírus nas
fezes (Li et al. 2005). No mundo, a frequência dos HAdVs entéricos varia de 1,4 a
10%, dependendo do local avaliado (Ramani & Kang 2009).
No Brasil, os índices de positividade apresentam grandes variações. Um
estudo realizado com amostras diarreicas de crianças do Rio de Janeiro, Niterói, Juiz
de Fora e Londrina verificou a prevalência dos HAdVs entéricos em 1,5% dos casos
(Soares et al. 2002). Um levantamento envolveu estudos em todo o país em um
período de 10 anos, com pacientes de diversas idades apresentando doença
semelhante à influenza. Nesse estudo, 37.120 amostras de secreção nasofaríngea
foram analisadas, verificando-se a positividade paras adenovírus em 2% das amostras
(Freitas 2013). Outro estudo realizado no Rio de Janeiro envolvendo pacientes com
conjuntivite constatou a prevalência do vírus em 60% das amostras de secreção
ocular (Maranhão et al. 2009).
No Centro-Oeste, um trabalho envolvendo crianças hospitalizadas com
gastroenterite aguda verificou a positividade dos adenovírus em 3,6% das amostras
fecais (Andreasi et al. 2008). Em Goiânia, um estudo detectou positividade em 1,6%
das amostras fecais de crianças menores de 11 anos assintomáticas (Camarota et al.
1992), enquanto outro estudo detectou adenovírus em 2,1% de amostras fecais de
crianças menores de 5 anos hospitalizadas (Cardoso et al. 1992).
1.11 Adenovírus em pacientes submetidos ao TACPH
Os pacientes imunocomprometidos, de uma forma geral, apresentam
duração dos sintomas mais prolongada quando comparados com indivíduos
saudáveis, e desenvolvem mais facilmente manifestações mais graves e
disseminadas, em decorrência de viremia, como cistite hemorrágica, gastroenterite
19
hemorrágica, encefalite, pneumonia, hepatite e falência múltipla dos órgãos
(Hierholzer 1992, Chakrabarti 2007, Tebruegge & Curtis 2012).
No caso de pacientes que foram submetidos ao TACPH, a infecção por
HAdV pode ser consequência de diferentes situações: da reativação viral em
células previamente infectadas do próprio hospedeiro, da infecção recente antes
do período de condicionamento, do transplante de células infectadas, ou ainda em
razão de infecção nosocomial. Tem-se relatado que a infecção é mais comum em
pacientes apresentando a doença do enxerto contra o hospedeiro, que pode ter a
infecção agravada pelo tratamento imunossupressivo utilizado nesses casos
(Chakrabarti 2007). Além dos sintomas anteriormente citados, verificam-se os
sintomas gastrointestinais como uma das mais comuns manifestações clínicas nos
pacientes infectados (Lion et al. 2003, Mynarek et al. 2014).
Alguns estudos sugerem que a detecção de DNA dos HAdV nas fezes
pode preceder a viremia ou infecção disseminada (Lion et al. 2003, Lion et al.
2010, Mynarek et al. 2014). A confirmação desta hipótese, através de mais
estudos que realizassem a triagem de amostras de soro e fezes de pacientes, antes
e após o transplante, poderia ser utilizada como potencial forma de se evitar a
doença disseminada, iniciando-se o tratamento no momento adequado.
Dentre os fatores de risco associados à infecção por adenovírus em
pacientes submetidos ao TACPH estão a idade, principalmente nos pacientes
pediátricos, a depleção de células T, o próprio transplante alogênico, a ocorrência de
doença do enxerto contra o hospedeiro, a irradiação de corpo inteiro e a medula óssea
como fonte das células progenitoras. A infecção disseminada, por sua vez, está
relacionada com a terapia imunossupressora, linfocitopenia, o número de sítios de
detecção de HAdV e a detecção de carga viral crescente no sangue (Watson et al.
2012).
A reconstituição imune, que deve ocorrer após a ablação do sistema imune
em decorrência do preparo para o transplante, é um processo gradual, de forma que a
recuperação da imunidade inata ocorre rapidamente, dentro de cem dias após o
transplante. Entretanto, a recuperação da imunidade adquirida é lenta, de forma que
células T CD4 podem permanecer em baixa quantidade mesmo dois anos após o
transplante (Puissant-Lubrano et al. 2014). Nesse contexto, estudos têm relatado que
20
a linfopenia severa em pacientes submetidos ao TACPH (menos de 300 células/mm³)
está associada à progressão da infecção por adenovírus à doença disseminada e
frequentemente fatal (Suparno et al. 2004, Erard et al. 2007, Lindemans et al. 2010).
Ainda, estudos observaram que a infecção por HAdV é mais comum antes do dia 50
após o transplante, estando essa infecção relacionada à maior carga viral no soro e
piora do quadro clínico (Baldwin et al. 2000, George et al. 2011, Mynarek et al.
2014, Rynans et al. 2014).
Um estudo com pacientes submetidos ao TACPH envolvendo
transplantados com ou sem depleção de células T verificou que a depleção, além de
tornar os pacientes mais susceptíveis à infecção viral, era um fator de risco para
infecção com sintomas clínicos mais graves por HAdV, além da presença de viremia
(Lee et al. 2013). A persistência viral pode também resultar em patogenia nos
pacientes imunocomprometidos, os quais podem eventualmente apresentar
manifestações clínicas associadas à reativação de vírus pré-existentes, como
consequência da imunossupressão (Kojaoghlanian et al. 2003). Entretanto, os
mecanismos da infecção latente por HAdV precisam ainda ser elucidados (Wold &
Ison 2013).
A incidência dos adenovírus em pacientes imunocomprometidos varia de
acordo com a idade e o tipo de população estudada, o grau da imunossupressão e os
métodos utilizados no diagnóstico. Entretanto, os maiores índices de detecção foram
reportados em pacientes submetidos ao transplante alogênico de células progenitoras
hematopoiéticas (Kojaoghlanian 2003). A grande maioria dos estudos com pacientes
submetidos ao TACPH foi realizada com pacientes pediátricos, nos quais a
incidência reportada varia de 8-50% (Walls et al. 2003, Pagter et al. 2009,
Gazenmueller et al. 2011, Watson et al. 2012).
Em um estudo de oito anos realizado nos Estados Unidos envolvendo
pacientes adultos que receberam transplante de medula, 3% dos pacientes foram
diagnosticados com adenovírus, de forma que esses pacientes quase sempre
apresentaram infecções sintomáticas, com uma maior taxa de mortalidade, quando
comparado a outros pacientes não infectados (La Rosa et al. 2001). Um outro estudo
de treze anos envolvendo pacientes pediátricos que receberam o TACPH nos Estados
Unidos relatou que, dos pacientes que apresentaram infecção respiratória, 19% foram
21
causados pelo adenovírus, sendo esse vírus o maior associado à mortalidade dos
pacientes dentre os vírus analisados (Lo et al. 2013). Em um estudo também com
crianças transplantadas, verificou-se que a probabilidade de sobrevivência de
pacientes submetidos ao TACPH era de 15,4% em pacientes infectados por HAdV,
em comparação com a probabilidade de sobrevivência de 50% em pacientes não
infectados, sendo, portanto, a infecção por HAdV o maior fator de risco ao óbito
destes pacientes (George et al. 2011).
Na Alemanha, um estudo de Runde et al. (2001) constatou que, em
pacientes pediátricos e adultos submetidos ao TACPH, o risco cumulativo da
infecção por adenovírus no período de seis meses foi de 29%. Na Inglaterra, um
estudo retrospectivo envolvendo principalmente crianças relatou que de 527
pacientes submetidos ao transplante de células progenitoras hematopoiéticas, 100
apresentaram algum episódio de infecção por adenovírus, sendo este o responsável
direto pela morte de seis pacientes (Baldwin et al. 2000). Os HAdV das espécies A,
B, C, D, E e F já foram detectados em amostras sorológicas e fecais de pacientes
submetidos ao TACPH, com prevalência dos adenovírus da espécie C (Baldwin et al.
2000, Lion et al. 2010, Kajon et al. 2014, Mynarek et al. 2014).
No Brasil, existem poucos estudos envolvendo a detecção dos HAdVs em
pacientes que foram submetidos ao transplante de medula (Machado et al. 2003,
Raboni et al. 2003a, Raboni et al. 2003b, Watanabe et al. 2013). Raboni et al.
(2003a), em um estudo retrospectivo com pacientes que realizaram TACPH no
Paraná que apresentaram infecção no trato respiratório superior, constataram a
positividade para HAdV somente em dois pacientes, de um total de 722
transplantados.
Machado et al. (2003), em um estudo prospectivo com 179 pacientes
submetidos ao TACPH que apresentaram infecção respiratória, em São Paulo, não
detectaram positividade para HAdV. Em um estudo prospectivo envolvendo
diferentes grupos de pacientes (transplantados, internados e funcionários de um
hospital de São Paulo), foi observada uma taxa de positividade de 29,5% entre os
pacientes submetidos ao TACPH apresentando infecção respiratória aguda. Estes
pacientes apresentaram 12 vezes mais chance de se infectarem pelo adenovírus
quando comparados com os profissionais da saúde do hospital, sendo este o grupo
22
onde houve a maior positividade (Watanabe et al. 2013). Por fim, um estudo
prospectivo do Paraná envolvendo 75 pacientes submetidos ao TACPH que
apresentaram cistite hemorrágica, detectou o HAdV na urina de quatro pacientes,
sendo um antes do transplante e três após o transplante (Raboni et al. 2003b).
Nenhum dos estudos do Brasil, porém, realizou o monitoramento da positividade
para HAdV em amostras fecais ou séricas, tampouco a caracterização molecular dos
HAdVs encontrados na população de pacientes submetidos ao TACPH. No Centro-
Oeste, não há dados referentes ao adenovírus nessa população.
1.12 Prevenção e tratamento
Medidas de saneamento básico, educação e higiene pessoal, embora
auxiliem na diminuição da transmissão, não são suficientes para se evitar por
completo a transmissão desses agentes. Medidas gerais de prevenção da transmissão
ou infecção por HAdV consiste em medidas que impeçam o contato do vírus com a
boca, nasofaringe e mucosa ocular, como lavar as mãos com frequência, evitar
contado das mãos com o rosto, cobrir a boca e nariz ao espirrar ou tossir, e evitar o
contato com doentes. Não existe tratamento específico para a infecção por HAdV. A
maioria das infecções por estes agentes são brandas e autolimitadas, e alguns casos
mais graves requerem apenas tratamentos paliativos contra os sintomas (CDC 2011).
Atualmente existe uma vacina oral contra os HAdVs dos sorotipos 4 e 7,
aprovada em março de 2011 para os militares dos Estados Unidos. A vacina é
administrada em dois comprimidos, contendo vírus vivo atenuado. No entanto, não é
disponibilizada para o público em geral. (CDC 2011).
A resistência dos adenovírus, associada à excreção prolongada dos
pacientes, é especialmente preocupante em ambientes hospitalares, justamente onde
esses vírus estão mais propensos a causar severas consequências clínicas (Paris et al.
2014). A infecção nosocomial por adenovírus tem sido associada ao aumento da
morbidade e mortalidade de pacientes imunocomprometidos, reforçando a
importância da adoção de boas medidas de controle de infecção nesses ambientes
(Choi et al. 2013, Lonngren et al. 2014).
23
Em alguns casos de infecção por HAdV com manifestações clínicas graves
em pacientes imunocomprometidos, tem-se administrado com certo sucesso o
cidofovir, um fármaco antiviral que age principalmente contra vírus DNA, inibindo a
replicação viral, mas com resultados ainda controversos (Legrand et al. 2001,
Ljungman et al. 2003, Matthes-Martin et al. 2012, Lugthart et al. 2015). O uso de
cidofovir tem sido relacionado com um decréscimo na mortalidade por HAdV em
pacientes que foram submetidos ao TACPH, e recomenda-se o seu uso em pacientes
com depleção de células T ou em casos de tratamento de doença do enxerto contra o
hospedeiro com altas doses de imunossupressores (Neofytos et al. 2007). A terapia
deve ser considerada em casos de viremia com mais de 100 000 cópias/mL. No caso
de pacientes em que o sistema imune não é totalmente reconstituído, ou que não
toleram o cidofovir, intervenções imunoterápicas como a infusão de linfócitos do
doador devem ser consideradas (Neofytos et al. 2007). Em um estudo envolvendo
pacientes transplantados com ausência da reconstituição de células T, o cidofovir
controlou a viremia de HAdV na maioria dos pacientes, entretanto o fármaco não foi
capaz de impedir a progressão da viremia em 17% dos casos. Foi constatado que a
reconstituição das células T é o mais importante no combate à infecção por HAdV, e
que o monitoramento da carga viral e da reconstituição de linfócitos são essenciais
para evitar uma exposição desnecessária a tratamentos potencialmente tóxicos
(Lugthart et al. 2015).
24
2 JUSTIFICATIVA
Os adenovírus humanos (HAdV) estão associados a elevados índices
de morbidade e mortalidade em indivíduos imunocomprometidos (George et al.
2011). Apesar da importância desses agentes em pacientes pediátricos
submetidos a transplante de células progenitoras hematopoiéticas ter sido
relatada na literatura (Baldwin et al. 2000, Lion et al. 2010, Lo et al. 2013),
determinados aspectos da patogenia viral, como a associação entre viremia ou
carga viral com a doença disseminada (Ohrmalm et al. 2011), bem como o
melhor momento para o início da terapia, principalmente em indivíduos
adultos, não estão ainda bem esclarecidos (Chakrabarti 2007). A infecção por
adenovírus pode ainda mimetizar a DECH, e seria essencial que fosse
estabelecido o diagnóstico diferencial por meio do monitoramento da infecção
por adenovírus. Ademais, não existe consenso quanto a melhor amostra clínica
para a triagem desses agentes. Portanto, é de extrema relevância a realização de
pesquisas relacionada a este agente na referida população a fim de que tais
aspectos sejam melhor compreendidos.
Além da análise dos índices de positividade para estes vírus, a
caracterização molecular das amostras positivas é fundamental para que se
possa avaliar quais as espécies e subtipos virais acometem mais
frequentemente estes indivíduos, associando as variantes virais com o quadro
clínico apresentado. Somente desta forma, uma melhor compreensão da
epidemiologia molecular desses agentes na referida população poderá ser
estabelecida.
O diagnóstico da infecção por HAdVs não faz parte da rotina de
acompanhamento de pacientes submetidos a transplante, atendidos pelo
Sistema Único de Saúde, em nenhum centro de referência do Brasil.
Esperamos, portanto, que os dados obtidos com o presente estudo possam
auxiliar na determinação da melhor amostra clínica (soro ou fezes) para a
pesquisa dos HAdV, bem como na padronização e implementação de testes
diagnósticos sensíveis e específicos para que estes possam, num futuro
25
próximo, ser incluídos na rotina de exames destes pacientes. Desta forma, o
esquema terapêutico mais eficaz e o melhor momento de sua prescrição
poderão ser definidos e implementados.
Finalmente, ao nosso conhecimento, nenhum estudo foi ainda
realizado no Brasil envolvendo o acompanhamento de pacientes adultos
submetidos ao TACPH que tenham tido como foco a detecção, determinação
da carga viral e caracterização molecular dos adenovírus, em associação com
as características clínicas apresentadas pelos pacientes.
26
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Monitorar a ocorrência de infecção por adenovírus humanos (HAdV) em
pacientes submetidos ao transplante alogênico de células progenitoras
hematopoiéticas (TACPH) em um dos centros de referência de transplantes de
medula óssea do Brasil.
3.2 Objetivos Específicos
Pesquisar HAdVs em amostras fecais e sanguíneas de pacientes submetidos ao
TACPH;
Determinar a carga viral das amostras positivas para adenovírus;
Realizar a caracterização molecular das amostras de HAdV identificadas;
Avaliar o padrão de infecção por HAdV nos pacientes submetidos a TACPH,
correlacionando: quadro clínico, carga viral, excreção viral nas fezes, viremia,
variante viral e prognóstico dos pacientes.
27
4 MÉTODOS
4.1 Delineamento do estudo
Trata-se de um estudo prospectivo descritivo de monitoramento da infecção
por HAdV em pacientes que foram submetidos ao transplante alogênico de células
progenitoras hematopoiéticas (TACPH). Foi utilizado como critério de inclusão no
estudo o tipo de transplante: alogênico e aparentado. Como critério de exclusão foi
definido o transplante ser do tipo autólogo. O estudo foi aprovado pelo Comitê de
Ética em Pesquisa da UFG e do Hospital Araújo Jorge (protocolo 429/11) (Anexos 1
e 2).
4.2 Local e material de estudo
A Unidade de Transplante de Medula Óssea (UTMO) do Hospital Araújo
Jorge/Associação de Combate ao Câncer em Goiás (HAJ/ACCG) foi criada em 2000
e é o primeiro e único serviço credenciado pelo Ministério da Saúde para este tipo de
procedimento em todo Centro-Oeste e Distrito Federal pelo Sistema Único de Saúde.
Nos últimos três anos, a UTMO/HAJ/ACCG realizou uma média anual de 14
TACPH e 29 transplantes autólogos de células progenitoras hematopoiéticas.
A UTMO/HAJ possui quatro quartos (217-220) para o atendimento de
transplantados, com um leito em cada quarto, interligados por um corredor comum.
Os quartos são equipados com filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air),
garantindo a filtragem do ar. Cada quarto possui um banheiro individual como
medida de prevenção de contaminação entre os pacientes, que não podem circular
livremente no corredor da unidade. O contato com os pacientes só é permitido
mediante higienização das mãos em uma antessala e utilização de capote estéril e
máscara descartável. A alimentação dos pacientes é realizada nos quartos de
internação da UTMO, não sendo permitida a entrada de nenhum alimento trazido de
fora do hospital, e os pacientes só podem consumir água mineral disponibilizada pelo
hospital.
28
A população de estudo foi constituída por 21 pacientes, com idades entre 4 e
61 anos (média de 37 anos), que foram submetidos a TACPH na
UTMO/HAJ/ACCG. O material de estudo para a pesquisa de adenovírus consistiu de
amostras de sangue e de fezes dos pacientes que aceitaram participar da pesquisa. As
amostras clínicas dos pacientes foram coletadas somente após o preenchimento e
assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) (Apêndice 1). A
coleta teve início em outubro de 2012, e foi finalizada em outubro de 2014.
Antes da realização do transplante, foram obtidas uma amostra de sangue e
uma de fezes dos pacientes. Após o transplante, as amostras de fezes e soro foram
coletadas, na medida do possível, semanalmente, e sempre que houvesse suspeita
clínica de infecção por vírus gastroentérico ou suspeita de doença do enxerto contra
hospedeiro, até a alta do paciente. Após a alta, a coleta foi realizada nas consultas
ambulatoriais no HAJ. Todo o material biológico coletado foi imediatamente
encaminhado ao Laboratório de Virologia Humana do Instituto de Patologia Tropical
e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás (IPTSP/UFG) para processamento
e armazenamento adequados.
A partir da ficha de investigação clínica (Apêndice 2), preenchida por
médicos e enfermeiros responsáveis, foram obtidas informações sobre os principais
sintomas e sinais clínicos apresentados pelos pacientes durante o período da
pesquisa. Os prontuários médicos foram revisados para a obtenção de informações
clínicas e dados laboratoriais utilizados neste estudo.
4.3 Preparo das amostras clínicas
As amostras de sangue total foram submetidas à centrifugação a 1500g por
10 minutos, e o soro foi separado e dividido em três alíquotas, sendo duas
armazenadas a -80 e uma a -20°C, até o momento do uso.
As amostras de fezes foram inicialmente processadas para a obtenção de
uma suspensão fecal a 20% em tampão salina fosfato (PBS) pH 7,4. Os
sobrenadantes foram separados e as alíquotas estocadas a -20°C e -80°C até o uso.
29
4.4 Pesquisa de HAdV por ensaio imunoenzimático
Para a realização da triagem inicial das amostras de fezes, foi realizado um
ensaio imunoenzimático, utilizando-se um kit comercial (RIDASCREEN®
Adenovirus test, R-Biopharm, Germany). O teste RIDASCREEN® Adenovirus
utiliza micropoços sensibilizados com anticorpos monoclonais, específicos para
antígenos da proteína hexon dos adenovírus.
De forma breve, as amostras a serem analisadas foram pipetadas juntamente
com anticorpos monoclonais biotinilados anti-adenovírus (conjugado 1) nos
respectivos poços da placa de microtitulação para incubação por uma hora a
temperatura ambiente. Soluções controle positivo e negativo, fornecidos pelo kit,
foram utilizadas em triplicata. A placa foi então lavada com tampão de lavagem
(solução de NaCl fosfatada) por cinco vezes e, em seguida foi pipetado o conjugado
de estreptavidina-peroxidase (conjugado 2) e realizada mais uma incubação e
lavagem. Na presença de antígenos de adenovírus nas amostras de fezes, formava-se
um complexo tipo sanduíche dos anticorpos imobilizados, antígenos de adenovírus e
os anticorpos conjugados com o complexo biotina-estreptavidina-peroxidase. Após a
adição de substrato (peróxido de hidrogênio + tetrametilbenzina), foi desenvolvida
coloração azulada nas amostras positivas. Através da adição da solução de paragem
(ácido sulfúrico a 0,5 M) foi observada uma mudança de cor de azul para amarelo,
sendo a intensidade da coloração proporcional à concentração de antígenos presentes
na amostra. A densidade óptica de cada amostra foi determinada através da leitura da
absorbância em leitora de ELISA (ST-360 Microplate Reader, KHB) utilizando-se
comprimento de onda de 450 nm. O valor do cut-off foi determinado pela média dos
valores obtidos pelo controle negativo acrescido de 0,15. Foram consideradas
positivas as amostras com valor 10% acima do valor marginal obtido.
4.5 Extração do DNA viral
O DNA viral foi extraído utilizando-se kits comerciais, a partir de
aproximadamente 100 µg de fezes in natura (QIAamp Stool Mini Kit, QIAGEN), e
de 200 µL de soro (QIAamp MinElute Spin Kit, QIAGEN), de acordo com os
30
protocolos fornecidos pelo fabricante. A extração do DNA viral foi padronizada
utilizando-se amostras controle positivas para adenovírus, previamente armazenadas
no Laboratório de Virologia Humana da UFG. De modo breve, as amostras foram
inicialmente submetidas a incubações utilizando-se tampões de lise fornecidos pelo
kit. Em seguida, foram adicionados 500µL de etanol às amostras, que foram
aplicadas em colunas contendo membrana de sílica enquanto o lisado foi descartado
por centrifugação. A etapa seguinte consistiu de sucessivas etapas de lavagem
utilizando 500µL dos tampões fornecidos pelos kits. Por fim, 80µL do tampão de
eluição fornecido pelo kit foi utilizado para promover a eluição das amostras, que
foram posteriormente armazenadas a -20°C até o momento do uso.
4.6 Pesquisa de HAdV por PCR e Nested-PCR
Para a pesquisa do ácido nucleico de adenovírus foram utilizados protocolos
de PCR e Nested-PCR descritos por Allard et al. (1992) e Puig et al. (1994). Os
iniciadores utilizados têm como alvo uma região parcial conservada do hexon. As
sequências dos iniciadores consenso que foram utilizados são: 5'-
GCCGCAGTGGTCTTACATGCACATC-3′ (hexAA1885) e 5'-
CAGCACGCCGCGGATGTCAAAGT-3′ (hexAA1913), flanqueando um produto
de 300 pares de bases.
Para a reação de PCR, 5μL do DNA viral extraído foi adicionado à uma
mistura com volume final de 25μL, contendo 20mM Tris-HCL pH 8,4, 0,2mM de
dATP, dCTP, dTTP e dGTP, 1,5mM de MgCL2, 10pM dos iniciadores externos e 1U
de Taq DNA polimerase. A amplificação ocorreu em 40 ciclos de 94°C
(desnaturação) por um minuto, 56°C (anelamento) por um minuto e 72°C (extensão)
por 45 segundos, e uma extensão final de 7 minutos a 72°C.
Na reação de Nested-PCR, foram utilizados iniciadores com as seguintes
sequências: 5’-GCCACCGAGACGTACTTCAGCCTG-3’ (nexAA1893) e 5’-
TTGTACGAGTACGCGGTATCCTCGCGGTC-3’ (nexAA1905), flanqueando um
produto de 143 pares de bases. Para a reação, 1 μL do produto de PCR foi adicionado
a uma mistura de volume final de 25μL, contendo 20mM de Tris-HCL pH 8,4,
0,2mM de dATP, dCTP, dTTP e dGTP, 1,5mM de MgCL2, 20pM dos iniciadores
31
externos e 1U de Taq DNA polimerase. A amplificação ocorreu em 25 ciclos de
94°C (desnaturação) por um minuto, 56°C (anelamento) por um minuto e 72°C
(extensão) por 45 segundos, e uma extensão final de 5 minutos a 72°C.
Os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de
agarose (2%), corado com brometo de etídio à 0,5μg/mL, utilizando-se como padrão
de tamanho molecular o 100pb DNA ladder (Invitrogen). Em seguida, os produtos
foram visualizados e registrados em transluminador com luz UV.
Em cada reação foram incluídos controles positivos (amostras positivas para
adenovírus previamente caracterizadas por sequenciamento genômico) e negativos
(água MiliQ estéril). As amostras de soro e fezes de cada paciente foram
manipuladas separadamente e todas as etapas dos ensaios moleculares foram
conduzidas em diferentes cabines de fluxo laminar.
4.7 Determinação da carga viral
As amostras positivas para HAdV foram submetidas à PCR em tempo real
(qPCR) para determinação da carga viral, em parceria com o Laboratório de Genética
e Citogenética/UFG. Primeiramente as amostras foram diluídas a 1:10 a fim de
minimizar inibições. A reação consistiu no uso de 10μL de DNA em um volume
final de reação de 25μL contendo 1x de Master Mix (Applied Biosystems), 0,9μM de
cada iniciador e 0,225μM de sonda TaqMan, marcada com FAM-TAMRA: HAdV F
(5´-CWTACATGCACATCKCSGG -3´) e HAdV R (5´-
CRCGGGCRAAYTGCACCAG -3´), flanqueando uma região de 72 pb. O programa
de ciclagem foi de 50 °C por 1 minuto, 95 °C por 10 minutos, seguido de 45 ciclos
de 95 °C por 15 segundos e 60 °C por 1 minuto, com coleta de dados na última
temperatura, conforme protocolo descrito por Hernroth et al. (2002). As
amplificações foram feitas em duplicata no aparelho StepOnePlusTM Real-Time PCR
System (Applied Biosystems), utilizando como padrão o plasmídeo pBR322
contendo parte do gene hexon, em diluições seriadas com concentração de 10-2 a 108
CG/mL, gerando uma curva padrão (R > 0.98) com resultado sendo expresso em
cópias genômicas por mililitro (CG/mL).
32
4.8 Purificação e sequenciamento genômico das amostras positivas para
HAdV
Todas as amostras positivas para HAdV foram purificadas a partir dos
produtos resultantes da Nested-PCR, utilizando-se isopropanol a 65% e etanol a
70%. De forma breve, foram adicionados dois volumes de isopropanol a 65% no
produto obtido, seguido de centrifugação por quinze minutos a 12.000 rpm/10°C. Em
seguida, o sobrenadante foi desprezado e o tubo foi invertido em papel toalha.
Adicionou-se mais dois volumes de etanol a 70% e centrifugou-se por quinze
minutos a 12.000 rpm/10°C. O sobrenadante foi desprezado novamente e os tubos
foram invertidos em papel toalha durante uma hora ou até ficarem completamente
secos e, após esta etapa, foram adicionados 15μL de água milliQ.
As amostras purificadas foram submetidas ao sequenciamento genômico,
utilizando-se as mesmas condições e pares de iniciadores da reação de Nested-PCR,
em sequenciador automático (DNA ABI PRISM 3130, Applied Biosystems), e o
sistema de reação de sequenciamento Big Dye Terminator Cycle Sequencing
(Applied Biosystems, Foster City, CA).
4.9 Análise das sequências obtidas no sequenciamento genômico
As sequências obtidas no sequenciamento foram alinhadas e cortadas
utilizando-se o programa CodonCode Aligner para a obtenção dos contigs, com o
valor mínimo de qualidade de PHRED igual a 20. As sequencias obtidas foram
comparadas com sequências de referência depositadas no banco de dados de
sequências genéticas (Genbank) do National Center for Biotechnology Information
(NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) para a caracterização das espécies
de HAdV, utilizando-se o programa Clustal X2 (Thompson et al. 1997). A árvore
filogenética foi construída utilizando-se o programa MEGA 6.0 (Molecular
Evolutionary Genetics Analysis), pelo método neighbor-joining (Tamura et al. 2013).
33
4.10 Análise estatística
A análise estatística dos dados foi realizada utilizando-se o programa Epi
Info versão 6.0, disponível em <http://wwwn.cdc.gov/epiinfo/>. Quando apropriado,
o teste exato de Fisher foi aplicado, sendo considerados estatisticamente
significativos valores de p<0,05.
34
5 RESULTADOS
Vinte e um pacientes, submetidos ao TACPH, foram incluídos no estudo,
correspondendo a 100% dos pacientes submetidos a esse procedimento no Hospital
Araújo Jorge no período de outubro/2012 a outubro/2014. Os pacientes participantes
eram predominantemente adultos, sendo onze pacientes do sexo masculino e dez do
sexo feminino, com idade variando de 4 a 61 anos, com média de 35 anos, sendo dois
pacientes pediátricos (Tabela 3).
A maioria dos pacientes (57%) apresentava leucemia mielóide (aguda ou
crônica) como doença primária. Para o condicionamento dos pacientes, foram
utilizadas diferentes combinações dos quimioterápicos: bussulfano (76% dos
pacientes), fludarabina (52% dos pacientes), ciclofosfamida (48% dos pacientes) e
melfalano (14% dos pacientes). Como profilaxia para a doença do enxerto contra o
hospedeiro, os pacientes receberam ciclosporina associada ao metrotexato. A
profilaxia antimicrobiana teve início no período de condicionamento, utilizando-se
os fármacos trimetoprima sulfametoxazol (antibacteriano de amplo espectro),
fluconazol (antifúngico de amplo espectro), albendazol (antiparasitário de amplo
espectro) e aciclovir (antiviral ativo principalmente contra vírus da família
Herpesviridae). Foram utilizadas como fonte de células progenitoras hematopoiéticas
a medula óssea (55%) e o sangue periférico (45%). Dados detalhados de cada
paciente participante do estudo estão apresentados na Tabela 3.
O período médio de acompanhamento dos pacientes foi de 163 dias,
variando de 4 a 586 dias. No total, foram coletadas e analisadas 250 amostras, sendo
105 amostras fecais (média de cinco por paciente, variando de zero a 12 amostras por
paciente) e 145 amostras de soro (média de sete por paciente, variando de uma a 18
amostras por paciente). A coleta de fezes de dois pacientes não pôde ser realizada.
Antes do transplante, foi possível realizar a coleta de amostras clínicas de soro e/ou
fezes de 19 pacientes.
Dentre as amostras de fezes, nenhuma foi positiva por EIE para a pesquisa
de antígenos de HAdV. Entretanto, 16 amostras (15,24%) foram positivas para
HAdV por Nested-PCR, sendo essas provenientes de oito pacientes diferentes,
correspondendo a 42% dos pacientes que tiveram amostras fecais analisadas (8/19).
35
Dentre as amostras séricas, onze (7,59%) foram positivas para HAdV por
Nested-PCR, sendo essas provenientes de sete pacientes diferentes, correspondendo a
33% dos pacientes analisados (7/21).
Dentre as amostras de pacientes que apresentaram linfopenia severa (<300
células/mm³), 39% foram positivas para HAdV, enquanto somente 16% foram
positivas para o vírus dentre as amostras dos pacientes que não apresentaram essa
condição. Valores semelhantes foram encontrados quando considerada a leucopenia
severa (<1000 células/mm³), de forma que 38,5% das amostras dos pacientes nessa
condição foram positivas para HAdV, contra 18% positivas dentre os pacientes sem
leucopenia severa (p=0,1829).
Vinte e sete amostras clínicas de soro ou fezes (10,8%) foram positivas para
HAdV (Tabela 4). No total, 57% (12/21) dos pacientes apresentaram pelo menos
uma amostra positiva de soro ou fezes em algum momento do estudo. Quatro
pacientes apresentaram amostras de soro ou fezes positivas antes do transplante.
Com exceção dos meses de janeiro e junho, foram encontradas amostras positivas em
todos os meses do ano. As amostras positivas para HAdV por Nested-PCR foram
também testadas por qPCR, sendo possível determinar a carga viral em 25 amostras.
A carga viral no soro variou de 7,7x103 à 2,1x106 CG/mL, enquanto que nas fezes
variou de 2,6x106 à 2x108 CG/mL (Tabela 4).
As amostras clínicas positivas para adenovírus foram ainda submetidas ao
sequenciamento genômico, sendo possível obter sequencias de qualidade de 26
amostras, encontrando-se similaridade com sequencias de HAdV das espécies C, D e
F (Tabela 4). Um paciente (001) apresentou positividade para as três espécies de
adenovírus durante o período de monitoramento. As amostras positivas para HAdV
com sequências parciais idênticas foram agrupadas em haplótipos, e comparadas com
sequências de referência depositadas no Genbank (Figura 3). Ao final da análise,
foram designados quatro haplótipos e duas sequencias únicas, que foram depositados
no Genbank. O haplótipo (HP) 1 representa amostras de adenovírus C detectadas nas
fezes do paciente 003, 006, 015 e no soro do paciente 018 (número de acesso:
KP894101); o HP2 representa amostras detectadas no soro dos pacientes 001, 003 e
013 (número de acesso: KP894102); o HP3 representa amostras detectadas nas fezes
dos pacientes 006, 019 e 021 (número de acesso: KP894105); o HP4 representa
36
amostras detectadas no soro dos pacientes 001, 003, 008, 010, 013, 014 e nas fezes
do paciente 009 (número de acesso: KP894106). As amostras 1.3 (número de acesso:
KP894104) e 15.1 (número de acesso: KP894103) foram sequencias únicas
encontradas nas fezes dos pacientes 001 e 015, respectivamente. Foram encontradas
amostras positivas para HAdV de pacientes internados em todos os quartos da
UTMO do HAJ. Com exceção dos pacientes que ficaram internados no quarto 218,
dos quais só foi possível sequenciar uma única amostra (HAdV C), as três espécies
(C, D e F) foram detectadas em amostras de pacientes que ficaram internados em
todos os quartos da UTMO do HAJ/ACCG.
A análise dos prontuários médicos e fichas laboratoriais dos pacientes
indicou que os principais sintomas clínicos apresentados pelos pacientes foram
gastrointestinais, dentre eles: mucosite, vômito, dor abdominal, diarreia e
constipação intestinal. A diarreia foi o sintoma mais frequente, afetando 16
pacientes, dos quais nove (56,2%) apresentaram positividade para HAdV no
momento da sintomatologia. Somente um paciente que excretou HAdV nas fezes não
apresentou diarreia. Outros sintomas apresentados pelos pacientes com positividade
estão descritos na Tabela 4.
A complicação mais frequente entre os pacientes foi a DECH, de forma que
onze pacientes apresentaram DECH aguda em algum momento do estudo. Seis
desses pacientes apresentaram positividade para HAdV (Tabela 2). A DECH crônica
manifestou-se somente nos pacientes 001 (oral e hepática), 004 (hepática e ocular) e
006 (oral) no período do estudo. Os pacientes 001 e 006 manifestaram essa
complicação somente 49 e 245 dias após a última amostra positiva para HAdV,
respectivamente.
Intercorrências bacterianas ocorreram em seis pacientes (28,6%), entretanto
sem causar grandes complicações. Infecções fúngicas ocorreram também em seis
pacientes, sendo responsáveis pelo óbito de quatro deles (011, 012, 014 e 021), que
apresentaram infecção pulmonar. A reativação de citomegalovírus foi frequente,
ocorrendo em 10 pacientes (47,6%), dos quais três apresentaram coinfecção com
adenovírus. Os pacientes positivos para CMV foram tratados com ganciclovir. O
poliomavírus foi também detectado em três pacientes, provocando infecções
urinárias, dos quais dois apresentaram coinfecção com HAdV. Por fim, a infecção
37
por norovírus acometeu seis pacientes dentre os dez que tiveram amostras testadas
(Lemes et al. 2014), dos quais dois apresentaram coinfecção com HAdV. Pacientes
diagnosticados com a infecção por HAdV não foram tratados com nenhum antiviral
específico para esse vírus durante o período do estudo.
Dez pacientes (47,6%) foram a óbito no decorrer do estudo, dos quais seis
(60%) apresentaram positividade para HAdV, dois dos quais apresentaram viremia.
A causa mortis de cada paciente está descrita na Tabela 3.
38
Tabela 3. Características gerais da população de estudo e resultados da pesquisa de HAdV nas amostras clínicas.
Nº do
Paciente Sexo Idade
Tipo de
Neoplasia
Fonte do
Transplante
Período de
acompanhamento
(ano, meses, dias)
Número de amostras
analisadas (Soro /
Fezes)
Positividade
para HAdV DECH
Aguda (grau)
DECH
Crônica Óbito (DPT e causa
mortis)
001 M 57 LMC MO 1a, 7m, 9d (586d) 14 / 10 + Pele e Fígado (II) Oral, Hepática -
002 F 43 LMA CPSP 7m, 1d (213d) 12 / 11 - Intestino (III) - 407, DECH, Sepse
003 F 33 AM MO 2m, 18d (78d) 7 / 12 + Intestino (IV) - 101, DECH, FMO
004 F 35 LMA CPSP 1a, 3m, 12d (468d) 18 / 12 - Pele (II) Hepática, Ocular -
005 F 51 LMA MO 1m, 2d (33d) 2 / 4 - - - -
006 M 23 LMA MO 1a, 3m, 26d (482d) 11 / 8 + Intestino (IV) Oral -
007 M 37 LLA CPSP 3m, 12d (104d) 4 / 3 - Pele (II) - 142, Recidiva, Sepse
008 M 21 LLA CPSP 1a, 1m, 10d (405d) 13 / 12 + Pele (II) - -
009 F 46 LMA MO 1m, 24d (56d) 6 / 6 + Pele e Fígado (III) - 62, PTT e AVC
010 F 26 SMD MO 4m, 9d (134d) 6 / 4 + - - -
011 M 61 LMC MO 4d 1 / 2 - - - 18, IR por quadro
séptico fúngico
012 F 49 SMD MO/CPSP 22d 3 / 2 - Intestino e pele (III) - 23, Aspergilose
pulmonar
013 M 39 MFI CPSP 26d 4 / 5 + - - -
014 F 52 LMA MO 2m, 15d (74d) 4 / 3 + - - 102, Aspergilose
pulmonar, Recidiva
015 M 4 LMC CPSP 3m (89d) 7 / 4 + Fígado, Pele,
Intestino (IV)
- 113, PTT e AVC
hemorrágico
016 M 27 LMA CPSP 6m, 20d (203d) 5 / 1 - Fígado, Intestino
(IV)
- -
017 M 32 LMA CPSP 4m, 23d (147d) 6 / 0 - - - -
018 F 41 HPN MO 4m, 4d (126d) 8 / 3 + - - -
019 M 33 AM MO 11d 2 / 2 + - - 61, encefalopatia
pós-PCR
020 M 17 LLA CSPS 3m, 26d (121d) 4 / 0 - - - -
021 F 9 LMC MO 1m, 18d (52d) 8 / 1 + - - 158, Sepse pulmonar
AM= Aplasia medular; AVC= Acidente vascular cerebral; CPSP= Células progenitoras de sangue periférico; DECH= Doença do enxerto contra o hospedeiro; DPT= Dia pós-
transplante; FMO= Falência múltipla dos orgãos; HPN= Hemoglobinúria paroxística noturna; IR = Insuficiência Respiratória; LLA= Leucemia Linfóide Aguda; LMA=
Leucemia mielóide aguda; LMC= Leucemia mielóide crônica; MFI= Mielofibrose idiopática; MO= Medula óssea; PCR= Parada Cardiorrespiratória; PTT= Púrpura
trombocitopênica trombótica; SMD= Síndrome mielodisplásica.
39
Tabela 4. Características das amostras positivas para HAdV.
Nº do
Paciente
Amostra
Clínica DPT
qPCR
(CG/mL) Espécie Sintomatologia do Paciente na Data da Positividade
DPT DECH
aguda (grau) Óbito (DPT e causa mortis)
001
Soro 9 2,07x106 F Vômito, Dor abdominal, Mucosite, Diarreia, NoV+
41-76 Pele e
Fígado (II) -
Fezes 17 1,97x108 D Vômito, Diarreia, NoV+
Soro 76 3,78x104 F Rash cutâneo
Soro 153 5,79x104 C Diarreia
003
Fezes 21 8,78x107 C Diarreia, Dor abdominal, Rash cutâneo, NoV+
82-101, Intestino
(IV) 101, DECH, FMO
Fezes 24 4,34x106 C Diarreia, Dor abdominal, Rash cutâneo, NoV+
Fezes 31 3,14x106 C Diarreia, Dor abdominal, NoV+
Soro 45 7,11x104 C Diarreia, Dor abdominal, NoV+
Soro 60 3,75x104 F Diarreia, Obstrução nasal, Cefaleia, Vertigem, NoV+
006
Fezes 8 5,45x107 D Diarreia, Amigdalite, Disúria, Hematúria
69-103, Intestino
(IV) -
Fezes 21 4,55x106 D Diarreia
Fezes 103 2,68x107 C Diarreia
Fezes 117 4,65x107 C Diarreia, Amigdalite, Adenopatia
008 Soro 86 2,68x105 F Diarreia, Rash cutâneo, CMV+ 38-86, Pele (II) -
009 Fezes 28 7,89x106 F Obstrução Nasal, CMV+ 13-55, Pele e
Fígado (III) 62, PTT e AVC
Fezes 53 2,57x106 F Diarreia
010 Soro -1 3,5x105 F Diarreia, Rash cutâneo - -
013
Soro -4 1,26x104 C Náuseas
- Soro 6 6,59x105 F Dor abdominal, Distensão gasosa, Febre -
Fezes 18 7,45x106 - Diarreia, infecção fúngica oral
014 Soro 37 7,73x103 F Mucosite, Rash cutâneo, Tosse, Pneumonia - 102, Aspergilose pulmonar,
Recidiva
015
Fezes -2 2,67x106 C Diarreia, Febre 39-61, Fígado,
Pele e Intestino
(IV)
113, PTT e AVC hemorrágico Fezes 5 6,79x106 C Vômito, Náuseas, Diarreia, Dor abd, Cistite hemorrágica (PoV+)
Fezes 59 - C Diarreia, Hematúria (PoV+)
018 Soro 20 3,98x104 C Assintomático; CMV+ - -
019 Fezes -1 - D Febre, Pneumonia - 61, encefalopatia pós-PCR
021 Fezes 4 3,42x107 D Náuseas, Vômito, Diarreia, Febre, Disúria e Hematúria (PoV+) - 158, Sepse pulmonar
AVC = Acidente Vascular Cerebral; CMV = Citomegalovírus; DECH = Doença do Enxerto contra o Hospedeiro; DPT = Dia pós-transplante; FMO = Falência Múltipla dos
Órgãos; NoV = Norovírus; PoV = Poliomavírus; PCR = Parada Cardiorrespiratória; PPT = Purpura Trombocitopênica Trombótica; qPCR = Reação em Cadeia pela
Polimerase em tempo real.
40
Figura 3. Árvore filogenética das sequências parciais do hexon dos adenovírus
detectados no estudo. As amostras caracterizadas nesse estudo estão marcadas
com um quadrado. Os nós internos foram representados por valores de
bootstrap obtidos em 1000 replicatas.
41
6 DISCUSSÃO
Neste estudo de monitoramento da ocorrência de infecção por adenovírus
em pacientes submetidos ao TACPH na UTMO/HAJ/ACCG foi observado um
considerável índice de positividade para esses agentes, além de cargas virais elevadas
nas fezes e soro de alguns pacientes, sendo possível ainda realizar a identificação de
diferentes espécies de HAdV nas amostras analisadas.
Os adenovírus são reconhecidos como potencialmente fatais em pacientes
imunocomprometidos desde a década de 70 (Myerowitz et al. 1975). Esses pacientes
estão mais susceptíveis à infecção viral disseminada e ao agravamento do quadro
clínico causado pela infecção. Esses fatores, muitas vezes associados à falta de
diagnóstico da infecção por HAdV, resultam em uma maior taxa de mortalidade na
população de transplantados (Leen & Rooney 2005, Ganzenmueller et al. 2011,
Ohrmalm et al. 2011).
Apesar da reconhecida importância dos adenovírus em pacientes submetidos
ao transplante de células progenitoras hematopoiéticas (Hierholzer 1992,
Kojaoghlanian et al. 2003), sua pesquisa, neste grupo populacional, ainda é
negligenciada no Brasil. No mundo, a grande maioria dos estudos têm sido
realizados somente em pacientes pediátricos (Walls et al. 2003, Pagter et al. 2009,
Gazenmueller et al. 2011, Watson et al. 2012).
Não foram encontradas diferenças significantes quanto à positividade para
HAdV em relação ao sexo, idade, fonte de enxerto ou tipo de condicionamento dos
pacientes. Foram detectados adenovírus em pacientes acometidos por diversos tipos
de neoplasia. Dentre os pacientes que receberam células progenitoras
hematopoiéticas provenientes da medula óssea, 63% apresentaram positividade para
adenovírus após o transplante, enquanto somente 30% dos pacientes que receberam
células progenitoras de sangue periférico foram positivos para o vírus após o
transplante (p=0,135). Esse dado pode estar relacionado ao menor número de células
T que são transplantadas quando a fonte de células progenitoras é a medula óssea,
uma vez que estudos mostraram que os linfócitos maduros presentes no enxerto
contribuem funcionalmente para a imunidade do receptor no período pós-transplante
(Reis & Visentainer 2004, Vigorito & Souza 2009). Estudos anteriores verificaram
42
que o enxerto de medula óssea constituía um fator de risco para a infecção por HAdV
(Schonberger et al. 2010, Ohrmalm et al. 2011).
Amostras de pacientes apresentando linfopenia ou leucopenia severa foram
mais positivas para HAdV (39% e 38,5%, respectivamente) quando comparadas com
amostras de pacientes que não apresentavam essa condição (16% e 18%,
respectivamente), entretanto esses dados não foram estatisticamente significativos
(p=0,1332). Apesar de estudos associarem a menor contagem de leucócitos com a
doença disseminada e/ou fatal por HAdV (Suparno et al. 2004, Erard et al. 2007,
Lindemans et al. 2010), em nosso estudo a leucopenia não esteve associada à um pior
prognóstico da infecção por HAdV.
Os HAdVs foram detectados em amostras de fezes e/ou soro de 57%
(12/21) dos pacientes participantes do estudo. As amostras de fezes positivas por
Nested-PCR não foram detectadas por EIE, o que pode ser justificado pela menor
sensibilidade do ensaio imunoenzimático quando comparado com métodos
moleculares (Raboni et al. 2003b).
Quatro pacientes apresentaram uma amostra positiva para adenovírus no
soro ou nas fezes antes do transplante. Nesses casos, o paciente pode ter sido
infectado antes da internação para o condicionamento pré-transplante, ou o vírus
pode ter sido reativado durante o período de condicionamento (Garnett et al. 2009,
Roy et al. 2011, Hiwarkar et al. 2013), ou ainda adquirido no hospital (Ganime et al.
2014, Silva et al. 2014). Pacientes positivos após esse período podem, ainda, ter
recebido enxerto infectado no transplante (Rynans et al. 2014)
A positividade para adenovírus em pacientes que foram submetidos ao
transplante alogênico de medula óssea é bastante variável, com taxas de positividade
entre 3 e 57% (Hale et al. 1999, Baldwin et al. 2000, Schilham et al. 2002, Lion et al.
2003, Raboni et al. 2003a, Symeonidis et al. 2006, Lion et al. 2010, Mynarek et al.
2014, Rynans et al. 2014). No Brasil, um estudo realizado em São Paulo com
pacientes que foram submetidos ao TACPH detectou a presença do vírus em 29,5%
das amostras de aspirado nasofaríngeo testadas, sendo que todos os pacientes
apresentavam quadro clínico de infecção respiratória (Watanabe et al. 2013). Outro
estudo conduzido no Paraná verificou, a partir de aspirado nasofaríngeo ou lavado
broncoalveolar, que os HAdV eram responsáveis por 3% das infecções respiratórias
43
virais dos pacientes submetidos ao transplante de medula óssea (Raboni et al. 2003a).
Ainda no Paraná, um estudo envolvendo 75 pacientes submetidos ao TACPH que
apresentaram cistite hemorrágica detectou o HAdV na urina de quatro pacientes
(5,3%) sendo um antes do transplante e três após o transplante (Raboni et al. 2003b).
Por fim, um estudo realizado em São Paulo não detectou amostras positivas para
HAdV em lavados nasais de pacientes submetidos ao transplante de medula óssea
(Machado et al. 2003). Entretanto, ao nosso conhecimento nenhum estudo prévio
conduzido em pacientes transplantados em Centros de Transplantes do Brasil havia
realizado a pesquisa nas fezes ou no soro dos pacientes, a determinação da carga
viral e nem a caracterização molecular das amostras positivas. Ademais, não há
dados referentes à positividade para adenovírus em pacientes submetidos ao TACPH
na região Centro-Oeste.
Não foi observada sazonalidade definida para a infecção pelo HAdV em
nosso estudo, de forma que o vírus não foi detectado somente nos meses de janeiro e
junho, corroborando dados encontrados em uma pesquisa realizada com pacientes
adultos submetidos à TACPH na Polônia, que também não verificou variação
sazonal (Rynans et al. 2014). Estudos anteriores realizados em outras populações no
Brasil sugerem que os adenovírus circulam durante todo o ano (Cardoso et al. 1992,
Andreasi et al. 2008, Maranhão et al. 2009).
O monitoramento da presença do DNA dos adenovírus no soro (viremia)
nos pacientes submetidos ao TACPH é de extrema importância, visto que esta
conduta poderia auxiliar na tomada de medidas preventivas a fim de se evitar
elevadas cargas virais com consequente disseminação viral no organismo, o que
poderia resultar em doença sistêmica e potencialmente fatal por adenovírus (Lion et
al. 2010, Rynans et al. 2014).
De uma forma geral, não houve relação entre a presença de viremia e a
positividade para HAdV nas fezes, de forma que somente três pacientes
apresentaram amostras positivas tanto no soro quanto nas fezes, mas nunca
concomitantemente. Um estudo realizado na Holanda com pacientes pediátricos
submetidos ao TACPH verificou também fraca correlação entre a positividade no
soro e a positividade em amostras de fezes inoculadas em cultura de células
(Schilham et al. 2002). Em contrapartida, Mynarek et al. (2014) observaram
44
concordância entre a detecção de HAdV no soro e nas fezes. Dados da literatura
revelam que, em pacientes pediátricos, a detecção de adenovírus em mais de dois
sítios foi associada à presença de vírus no sangue periférico, indicando a ocorrência
de infecção invasiva (Baldwin et al. 2000). Entretanto no estudo de Lion et al. (2003)
foi observado que pacientes pediátricos que desenvolveram doença disseminada e
fatal por HAdV apresentaram positividade para o vírus somente no sangue periférico.
A positividade para HAdV foi um evento único em 50% dos pacientes
(6/12), sendo encontrado em duas ou mais amostras de fezes e/ou soro dos outros
seis pacientes. Em um estudo conduzido na Polônia, a detecção de HAdV no soro de
pacientes adultos submetidos ao TACPH foi também um evento único em 34% dos
casos (Rynans et al. 2014).
Em nossa pesquisa, foi possível observar que 70,4% das amostras positivas
foram detectadas antes do dia 50 após o transplante, com média de 37 dias após o
transplante. De forma semelhante, o tempo médio para o início da positividade para
HAdV no trabalho de Rynans et al. (2014) em adultos foi de 47 dias após o
transplante. No estudo de George et al. (2011), esse tempo foi de 42 dias em
pacientes pediátricos, e no estudo de Baldwin et al. (2000), também com pacientes
pediátricos, a data média da positividade foi 18 dias após o transplante. Já na
pesquisa de Schonberger et al. (2010), a viremia por HAdV foi observada
predominantemente nos três primeiros meses após o transplante. A maior
positividade para HAdV nos primeiros dias após o transplante pode estar relacionada
ao fato dos pacientes sofrerem ablação praticamente total da medula, com uma lenta
e gradual recuperação da resposta imune nos primeiros meses, estando, portanto,
mais susceptíveis a infecções oportunistas (Nucci & Maiolino 2000, Reis &
Visentainer 2004).
Mynarek e colaboradores verificaram que os pacientes apresentando
positividade no soro antes de 50 dias após o transplante tinham maior risco de
apresentar carga viral superior a 10.000 cópias/mL, e consequentemente maior risco
de óbito (Mynarek et al. 2014). Em nosso estudo, somente uma amostra apresentou
carga viral inferior a 104 cópias genômicas/mL, sendo, portanto, observadas elevadas
cargas virais nas amostras de pacientes infectados por HAdV.
45
Os HAdV foram mais detectados nas fezes do que no soro em nosso estudo,
sugerindo que a pesquisa desse vírus nas fezes poderia ser mais eficiente que no soro.
A carga viral em nosso estudo, de forma geral, foi alta, sendo nitidamente mais
elevada nas fezes, o que sugere que este tipo de amostra clínica, cuja coleta é não
invasiva, poderia potencialmente ser utilizado como uma amostra de mais fácil
obtenção para pesquisa do vírus, pelo menos em alguns casos, quando comparada ao
soro. A pesquisa de HAdV nas fezes poderia também ser indicada para se diferenciar
os casos de DECH da infecção localizada no intestino por HAdV, uma vez que a
infecção por vírus gastroentéricos podem mimetizar o quadro clínico apresentado por
pacientes que manifestam a DECH (Marr 2012).
Na Polônia, a média da carga viral (618 cópias/mL) no soro dos pacientes
adultos submetidos ao TACPH foi muito inferior à média detectada em nosso estudo
(3,28x105 cópias genômicas/mL) (Rynans et al. 2014). Entretanto, em um estudo na
Holanda envolvendo crianças e adultos que receberam o TACPH, um paciente adulto
foi a óbito apresentando doença disseminada por HAdV, com um pico de 1x1010
cópias/mL de plasma (Kalpoe et al. 2007). Outro estudo, realizado na Inglaterra,
encontrou cargas virais maiores que 108 cópias/g de fezes e 107 cópias/mL no sangue
periférico, sendo corroborado pelas altas taxas encontradas em nosso estudo (Lion et
al. 2003). Variações na carga viral entre diferentes estudos podem ser influenciadas
pelo tipo de amostra analisada e por diferenças metodológicas de padronização e de
execução, sendo, portanto, de extrema importância a realização de diferentes estudos
para que se possa chegar a um consenso quanto ao monitoramento da carga viral de
HAdV na referida população.
A excreção de um grande número de partículas virais nas fezes de
indivíduos que se encontram em ambiente hospitalar pode propiciar a ocorrência de
infecções nosocomiais, o que contribuiria para um pior prognostico dos pacientes
transplantados (Silva et al. 2014). Em um estudo realizado em Paris, um adenovírus
do sorotipo 31 (espécie A) foi responsável por um surto nosocomial em uma unidade
de TACPH, onde os pacientes afetados apresentaram predominantemente diarreia e
febre (Leruez-Ville et al. 2006).
Em nosso estudo, a média da carga viral dos pacientes que sobreviveram foi
mais alta quando comparada à carga viral dos pacientes que vieram a óbito.
46
Entretanto, um estudo realizado na Alemanha com pacientes pediátricos submetidos
ao TACPH detectou que as crianças que apresentavam carga viral no sangue acima
de 10x104 cópias/mL tinham menor sobrevida quando comparadas com pacientes
com menor carga viral ou negativas para HAdV (Mynarek et al. 2014).
Ainda na Alemanha, verificou-se que a detecção no soro em pacientes
adultos submetidos ao TACPH de mais de 1,3x107 cópias de HAdV por mL estava
altamente associada ao óbito (Ganzenmueller et al. 2011). No estudo de Claas et al.
(2005), os pacientes pediátricos submetidos ao TACPH que apresentaram carga viral
no sangue superior a 106 cópias/mL tenderam a ter um maior risco de apresentar
complicações fatais; entretanto, alguns pacientes que apresentaram carga viral no
sangue de até 107 cópias/mL estiveram assintomáticos, demonstrando que altas
cargas virais não resultam necessariamente em doença.
É importante ressaltar que ainda não há consenso quanto ao melhor método
e amostras clinica a serem utilizados para a pesquisa de HAdV nos pacientes
submetidos ao TACPH; alguns estudos recomendam a pesquisa quantitativa semanal
de HAdV no sangue a fim de se evitar complicações por esse vírus (Lankester et al.
2002, Claas et al. 2005, Schonberger et al. 2010, Rynans et al. 2014, Schilham et al.
2014, Lugthart et al. 2015), e outros estudos sugerem que a pesquisa nas fezes é
importante para se monitorar esses pacientes (Jeulin et al. 2011, van Montfrans et al.
2015), podendo inclusive predizer a viremia (Lion et al. 2003, Lion et al. 2010,
Mynarek et al. 2014). Essas pesquisas, porém, são eventos recentes e escassos em
pacientes adultos (Jeulin et al. 2011, Ohrmalm et al. 2011, Taniguchi et al. 2012,
Rynans et al. 2014)
Os adenovírus das espécies C, D e F foram detectados em nosso estudo,
com predominância do HAdV C, corroborando diversos estudos realizados
anteriormente em ambiente hospitalar (Baldwin et al. 2000, Lion et al. 2003, Lion et
al. 2010, Mynarek et al. 2014). Os pacientes que apresentaram adenovírus da espécie
C, com exceção do paciente 018 que foi assintomático, apresentaram sintomas
respiratórios e gastrointestinais, o que pode ter relação com a infecção. O paciente
015, apesar de seus sintomas urinários terem sido relacionados ao poliomavírus, pôde
ter esse quadro agravado em decorrência da infecção por HAdV C. O paciente
paciente 003 apresentou amigdalite, que é compatível com a da infecção por
47
adenovírus C. Os pacientes infectados por HAdV D apresentaram diarreia (exceto o
paciente 019), que pode ser provocada por vírus dessa espécie, entretanto nenhum
apresentou sintomas oculares, que são os mais característicos dessa infecção. Por
fim, a presença de adenovírus F, que geralmente está associada à diarreia (Wold &
Ison 2013), não foi associada a quadros de gastroenterite no caso dos pacientes 001,
009 e 014.
Foi observado ainda que o paciente 001 apresentou positividade, em
amostras consecutivas, para as três espécies de adenovírus. Em um estudo realizado
na Alemanha, promovendo o acompanhamento de 238 crianças submetidas ao
TACPH, foram encontradas amostras das espécies A, B, C e F, sendo a C
predominante (Mynarek et al. 2014). Na Áustria, pacientes submetidos ao TACPH
apresentaram amostras positivas para adenovírus das espécies A, B, C, D e F, com
prevalência da espécie C (Lion et al. 2003, Lion et al. 2010). Na Inglaterra, dentre os
pacientes pediátricos e adultos que receberam o transplante, foram encontrados
adenovírus das espécies B, C, D e E, com maior predominância da espécie C
(Baldwin et al. 2000). Em estudo recente foi ainda detectado uma nova variante de
adenovírus espécie D em um paciente pediátrico (Kajon et al. 2014).
Dados da literatura sugerem ainda que os adenovírus de qualquer espécie
podem causar infecções com risco de mortalidade em pacientes que receberam o
TACPH (Lion et al. 2003). Essas evidências reforçam a variabilidade genética dos
HAdV e sugerem a circulação concomitante de diferentes espécies em ambiente
nosocomial. Entretanto, como não existem estudos referentes à caracterização
molecular dos adenovírus em pacientes submetidos ao TACPH no Brasil, não foi
possível realizarmos comparações com estudos conduzidos no país.
Nove pacientes HAdV positivos (75%) apresentaram diarreia, sendo esse o
principal sintoma associado à positividade para HAdV. A presença de HAdV nas
fezes esteve mais associada à diarreia quando comparada com a viremia, de forma
que somente um paciente que excretou HAdV não apresentou esse quadro. A
presença de viremia, por outro lado, não esteve associada à diarreia em três
pacientes. Na maioria dos estudos, a gastroenterite foi o principal sintoma
apresentado por pacientes infectados por HAdV (Baldwin et al. 2000, Lion et al.
2003, Symeonidis et al. 2006, Mynarek et al. 2014) o que é corroborado por nosso
48
trabalho. Entretanto, o estudo de Rynans et al. (2014) detectou sintomas respiratórios
como os mais comuns nos pacientes infectados, seguido da cistite hemorrágica, que
só foi encontrada em um paciente de nosso estudo, e ainda assim atribuída à infecção
por poliomavírus. Um estudo realizado nos Estados Unidos detectou a cistite
hemorrágica como sendo o principal sintoma associado à infecção por HAdV (Hale
et al. 1999).
Os pacientes 001 e 003, que apresentaram amostras positivas de soro e
fezes, apresentaram coinfecção com norovírus (NoV), detectado em estudo realizado
previamente em nosso laboratório (Lemes et al. 2014), o que pode ter contribuído
para a ocorrência de diarreia aguda. Ademais, o paciente 001 apresentou vômito,
sintoma também característico da infecção por NoV (Green 2013).
O paciente 003 apresentou excreção de HAdV C nas fezes por um período
de dez dias, e em seguida o vírus passou a ser detectado somente no soro das
amostras subsequentes, indicando que a positividade nas fezes precedeu a viremia.
Alguns estudos sugerem que a presença do DNA dos HAdV nas fezes pode preceder
a viremia ou infecção disseminada, sendo sua pesquisa nas fezes, portanto, uma
potencial forma de prever a infecção disseminada, permitindo assim iniciar o
tratamento antes que o paciente desenvolva uma elevada viremia (Lion et al. 2003,
Lion et al. 2010, Mynarek et al. 2014, Schilham et al. 2014). O fato, porém, não foi
observado em outros pacientes do nosso estudo. Mynarek e colaboradores
observaram, ainda, que a detecção de uma carga viral no sangue acima de 10.000
cópias/mL estava associada à detecção simultânea dos vírus nas fezes, o que não foi
observado em nosso estudo.
Os sintomas respiratórios foram observados em quatro pacientes positivos
para HAdV, sendo eles: obstrução nasal (pacientes 003 e 009), amigdalite (paciente
006) e pneumonia (paciente 14), sendo essa atribuída à infecção por Aspergillus sp.
Entretanto, atribuir os sintomas respiratórios aos HAdV é difícil, em vista do elevado
número de vírus respiratórios que podem estar associados a esses sintomas, além de
outros microorganismos (Ljungman et al. 2001). Em um estudo realizado com
pacientes predominantemente adultos submetidos ao TACPH na França, a infecção
por HAdV foi responsável por 9,6% (16/166) das infecções respiratórias virais
(Wolfromm et al. 2014). No Brasil, dois estudos envolvendo pacientes que
49
receberam o transplante de medula detectaram HAdV em 3% e 29,5% das amostras
respiratórias (Raboni et al. 2003a, Watanabe et al. 2013, respectivamente).
Dentre os onze pacientes que foram diagnosticados com DECH, seis (54%)
apresentaram positividade para HAdV no momento do diagnóstico. Estudos
anteriores demonstraram que a detecção do vírus é mais comum em pacientes que
apresentam a DECH aguda quando comparado com pacientes sem essa complicação
(Chakrabarti 2007, Watson et al. 2012, Rynans et al. 2014). No estudo de Rynans et
al. (2014), a DECH foi significativamente mais frequente entre os pacientes adultos
positivos para HAdV, com média de carga viral mais alta nesses pacientes,
corroborando dados de nosso estudo, onde tanto no soro quanto nas fezes a média da
carga viral foi mais alta nos pacientes que apresentaram DECH aguda. Em outro
estudo, a positividade nas fezes para vírus gastroentéricos (adenovírus, norovírus,
parechovírus e astrovírus) antes do TACPH foi associado à maior probabilidade de
desenvolver DECH aguda intestinal (van Montfrans et al. 2015). Em nosso estudo,
porém, somente um paciente que apresentou amostra positiva antes do transplante
desenvolveu DECH intestinal.
A DECH crônica manifestou-se somente em dois pacientes que
apresentaram amostras positivas para HAdV em nossa pesquisa, mas em um período
posterior ao da positividade, não sendo relacionado, portanto, ao vírus. Os sintomas
provocados pelo adenovírus podem mimetizar a DECH em pacientes
imunocomprometidos (febre, diarreia, hepatite e rash), e a imunossupressão desses
pacientes pode piorar o quadro do paciente. Nesses casos, seria importante realizar a
pesquisa desse e de outros vírus oportunistas para diferenciar a DECH da infecção
(Marr 2012)
Os pacientes do nosso estudo que apresentaram amostras positivas para
HAdV não receberam tratamento específico; o cidofovir, fármaco que tem sido
indicado para o tratamento de HAdV, não é vendido no Brasil, sendo importado
somente em casos emergenciais. No estudo de Mynarek et al. (2014), o tratamento
com cidofovir diminuiu os níveis de HAdV no sangue da maioria das crianças
transplantadas. Os autores alertam, porém, que os resultados foram controversos,
visto que a carga de alguns pacientes aumentou durante o tratamento, enquanto
outros pacientes tiveram a carga diminuída concomitantemente com o aumento do
50
número de linfócitos no sangue, não podendo atribuir o clearance do vírus
unicamente ao fármaco.
Em um outro estudo, também com pacientes pediátricos submetidos ao
TACPH, a viremia de HAdV foi controlada em 75% dos pacientes tratados com
cidofovir, apesar da reconstituição de células Natural Killer poder ter também
influenciado na recuperação (Lugthart et al. 2015). Um tratamento alternativo contra
a infecção por HAdV foi proposto por Feuchtinger et al. (2006), que consiste na
infusão de células T específicas ao vírus do doador no paciente infectado. Mynarek
et al. (2014), em seu estudo, sugerem o uso dessa alternativa nos casos onde os
pacientes não responderem ao tratamento com o cidofovir.
Em nosso estudo, corroborando dados encontrados por Schonberger et al.
(2010), a viremia não esteve associada ao óbito, e não foi possível atribuir o óbito de
nenhum paciente diretamente ao HAdV. Entretanto, por não ter sido realizada a
pesquisa de HAdV em amostras do trato respiratório, de tecidos ou de órgãos, não se
pode descartar completamente a influência dos adenovírus no prognóstico desses
pacientes. O HAdV já foi associado à mortalidade de pacientes submetidos ao
TACPH em diversos estudos (Lion et al. 2003, Kalpoe et al. 2007, Omar et al. 2010,
Ganzenmueller et al. 2011, Jeulin et al. 2011, Mynarek et al. 2014). O estudo de
George et al. (2011) verificou que a sobrevivência dos pacientes submetidos ao
TACPH positivos para HAdV era somente de 15,4%, significativamente menor
quando comparada com pacientes que não foram infectados pelo adenovírus (50%).
Apesar do presente estudo envolver todos os pacientes que foram
submetidos ao transplante nesse hospital no período de dois anos, são necessários
mais estudos envolvendo o acompanhamento de um maior número de pacientes, com
a coleta de amostras de diversos sítios do organismo, para obter resultados mais
consistentes e conclusivos em relação ao prognóstico e à sintomatologia; os
resultados obtidos foram de difícil correlação, em parte pelo número reduzido de
pacientes. Acreditamos que os dados obtidos podem auxiliar na tomada de medidas
relativas ao tratamento da infecção por adenovírus e no fornecimento de subsídios
para que a detecção de adenovírus seja incluída nos testes rotineiros durante o
acompanhamento de pacientes que receberam o TACPH. Esperamos ainda que
nossos resultados contribuam para que a infecção por agentes virais seja considerada
51
no diagnóstico diferencial da doença do enxerto contra hospedeiro, a fim de que se
previna o agravamento do quadro de imunossupressão destes pacientes, diminuindo
assim a morbidade e mortalidade no referido grupo populacional.
52
7 CONCLUSÕES
Os dados do presente estudo revelam a ocorrência de HAdV em pacientes
submetidos ao transplante alogênico de células progenitoras hematopoiéticas em
um dos centros de referência de transplantes de medula óssea do Brasil.
o Foi observada positividade para HAdVs em amostras de fezes e soro dos
pacientes submetidos ao TACPH, não sendo observada, entretanto, uma
concordância na detecção entre os dois tipos de amostras clínicas;
o Os pacientes do presente estudo apresentaram elevadas cargas virais, quando
comparados a carga viral detectada em pacientes adultos de outros estudos,
tendo sido ainda observadas cargas virais mais elevadas em amostras de fezes
quando comparadas as de soro, o que sugere que o monitoramento de HAdV
nas fezes poderia ser potencialmente utilizado para o diagnóstico precoce da
infecção;
o Foram detectados adenovírus das espécies C, D e F, revelando a ocorrência
de diferentes espécies de HAdV na população avaliada;
o O principal quadro clínico apresentado pelos pacientes foi a diarreia e a
principal intercorrência observada a DECH, entretanto, não foi possível
estabelecer uma associação direta entre a positividade para HAdV e a causa
mortis.
53
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APÊNDICES E ANEXOS
Apêndice 1. Termo de consentimento livre e esclarecido.
67
68
Apêndice 2. Ficha de investigação clínica.
69
Anexo 1. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFG.
70
71
72
Anexo 2. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa do HAJ/ACCG.
73
74
Anexo 3. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFG, referente ao primeiro
pedido de emenda ao projeto inicial.
75
Anexo 4. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa da UFG, referente ao segundo
pedido de emenda ao projeto inicial.
76