UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
CARACTERIZAÇÃO DOS FATORES DE RISCO DE NATUREZA VIRAL E
IMUNOLÓGICA RELACIONADOS AO PERFIL DE PROGRESSÃO À AIDS EM
PORTADORES DO HIV-1
SAMARA TATIELLE MONTEIRO GOMES
BELÉM – PARÁ
2017
SAMARA TATIELLE MONTEIRO GOMES
CARACTERIZAÇÃO DOS FATORES DE RISCO DE NATUREZA VIRAL E
IMUNOLÓGICA RELACIONADOS AO PERFIL DE PROGRESSÃO À AIDS EM
PORTADORES DO HIV-1
BELÉM – PARÁ
2017
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto
de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará
como requisito para a obtenção do grau de Doutor em
Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto.
1
SAMARA TATIELLE MONTEIRO GOMES
CARACTERIZAÇÃO DOS FATORES DE RISCO DE NATUREZA VIRAL E
IMUNOLÓGICA RELACIONADOS AO PERFIL DE PROGRESSÃO À AIDS EM
PORTADORES DO HIV-1
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como
requisito para a obtenção do grau de Doutor em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários.
Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto
Laboratório de Virologia, ICB-UFPA.
Banca Examinadora: Profª. Drª. Rita Catarina Medeiros de Sousa
Universidade Federal do Pará, UFPA.
Drª. Maria Alice Freitas Queiroz
Laboratório de Virologia, ICB, UFPA.
Profª. Drª. Rosimar Neris Martins Feitosa
Laboratório de Virologia, ICB, UFPA.
Dr. Felipe Bonfim Freitas
Seção de Virologia, Instituto Evandro Chagas, MS.
Drª. Ednelza da Silva Graça Amoras (Suplente)
Laboratório de Virologia, ICB, UFPA.
BELÉM – PARÁ
2017
2
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota
no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.
Madre Teresa de Calcutá
3
Dedico este trabalho à minha família.
Mãe (in memoriam), irmãos, sobrinhos, tios e esposo por acreditarem que isso seria possível.
4
AGRADECIMENTOS
Gostaria inicialmente de agradecer a todos os pacientes envolvidos nesta pesquisa, já
que sem eles nada disso teria sido possível. Agradecer ao programa de pós-graduação
Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários (BAIP) e ao Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio ao desenvolvimento desta tese.
Agradeço a todos que contribuíram e apoiaram o desenvolvimento deste trabalho. No
entanto, os agradecimentos vão muito além desta tese. Preciso agradecer pela paciência em
ensinar, competência, amizade e carinho que foi a mim endereçada nesses nove anos de
Laboratório de Virologia, minha segunda casa.
Agradeço a todos os professores do laboratório por me acolher e ensinar. Ao professor
Ricardo Ishak por ter confiado a mim este trabalho que lhe é tão caro, mas também por tanto
ter contribuído na minha formação acadêmica.
Ao meu querido orientador, professor Antonio Vallinoto, pelo acolhimento no
mestrado e doutorado. Pela confiança e fé na minha capacidade, pela amizade, paciência e por
incentivar a sempre melhorar. Não poderia ter orientador melhor.
Aos muitos amigos que já saíram do laboratório Felipe, Caroline, Di Paula, Ethienne,
Renata, Rogério, Izete e Helena que foram verdadeiros professores, ensinando que trabalhar
com pesquisa não é só saber aplicar uma técnica, mas também é ter companheirismo e
cordialidade para com o outro.
Agradeço aos demais amigos Bárbara, Mike, Edilson, Cinthia, Leonn, Tuane,
Angélica, William, Larissa, Leonardo, Mauro, Orlando e Suzanne pela ajuda em tudo e pelas
boas risadas.
Aos colaboradores, Edivaldo Sousa, Janaína Vasconcelos Massafra, Poliana da Silva
Lemos e João Lídio Vianez por se disponibilizarem em realizar o sequenciamento e análise
molecular das amostras deste trabalho.
E por fim e não menos importante, agradeço a Alice e a Ednelza, que poderiam muito
bem se incluir na dedicatória deste trabalho por serem muito mais que colegas de trabalho,
mas membros honorários da minha linda família. Obrigada por acreditarem na minha
capacidade, por me defenderem antes de qualquer pessoa, por enxergarem algo melhor em
mim e pelo amor.
Aqui se encerra uma longa etapa na minha vida pessoal e acadêmica, mas logo
se iniciará outra, tão desafiadora quanto.
Obrigada a todos!
5
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS 7
LISTA DE SIGLAS 8
RESUMO 9
ABSTRACT 10
1 INTRODUÇÂO............................................................................................................ 11
1.1 HISTÓRICO.................................................................................................................. 11
1.2 CLASSIFICAÇÃO E ESTRUTURA VIRAL............................................................... 12
1.3 CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA.............................................................................. 13
1.3.1 Gene gag....................................................................................................................... 13
1.3.2 Gene pol........................................................................................................................ 14
1.3.3 Gene env........................................................................................................................ 14
1.3.4 Gene vif......................................................................................................................... 14
1.3.5 Gene vpr........................................................................................................................ 15
1.3.6 Gene nef........................................................................................................................ 15
1.3.7 Gene tat......................................................................................................................... 15
1.3.8 Gene rev........................................................................................................................ 16
1.3.9 Gene vpu....................................................................................................................... 16
1.4 CICLO REPLICATIVO................................................................................................ 16
1.5 FILOGENIA.................................................................................................................. 19
1.6 EPIDEMIOLOGIA........................................................................................................ 22
1.6.1 Modos de transmissão.................................................................................................... 22
1.6.2 Prevalência..................................................................................................................... 23
1.7 DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO................................................................................ 24
1.8 PATOGÊNESE.............................................................................................................. 24
1.8.1 Progressão.................................................................................................................... 27
1.9 RESPOSTA IMUNOLÓGICA...................................................................................... 31
1.9.1 Mutações de escape da resposta imunológica........................................................... 33
1.10 TERAPIA ANTIRRETROVIRAL................................................................................ 35
1.11 OBJETIVOS.................................................................................................................. 38
1.11.1 OBJETIVO GERAL...................................................................................................... 38
1.11.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS........................................................................................ 38
2 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................ 39
2.1 TIPO DE ESTUDO E CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS............................... 39
2.2 GRUPO CONTROLE NÃO INFECTADO COM O HIV-1......................................... 41
2.3 COLETA, PROCESSAMENTO E ARMAZENAMENTO DAS AMOSTRAS.......... 41
2.4 QUANTIFICAÇÃO DE LINFÓCITOS TCD4+ e TCD8
+ E DA CARGA VIRAL
PLASMÁTICA DO HIV-1............................................................................................ 41
2.5 DOSAGEM DE CITOCINAS....................................................................................... 42
2.6 MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR............................................................... 42
6
2.6.1 Extração do DNA......................................................................................................... 42
2.6.2 Amplificação do genoma viral.................................................................................... 42
2.6.3 Eletroforese.................................................................................................................. 42
2.6.4 Purificação dos produtos amplificados...................................................................... 43
2.7 SEQUENCIAMENTO.................................................................................................. 43
2.8 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS.................................................. 43
2.8.1 Edição e alinhamento das sequências........................................................................ 43
2.8.2 Análise filogenética...................................................................................................... 45
2.8.3 Identificação de mutações de escape.......................................................................... 45
2.8.4 Modelagem tridimensional de proteínas................................................................... 45
2.9 MÉTODOS ESTATÍSTICOS....................................................................................... 48
2.10 ASPECTOS ÉTICOS.................................................................................................... 48
3 RESULTADOS............................................................................................................ 49
3.1 CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA DOS PORTADORES DE HIV-1............... 49
3.1.1 Avaliação das quantificações de linfócitos TCD4+ e TCD8
+ e da carga viral
plasmática..................................................................................................................... 49
3.1.2 Avaliação dos níveis plasmáticos das citocinas ........................................................ 52
3.2 CARACTERIZAÇÃO VIROLÓGICA DOS PORTADORES DE HIV-1................... 55
3.2.1 Análise filogenética...................................................................................................... 55
3.2.2 Avaliação das mutações de escape imunológico........................................................ 56
4 DISCUSSÃO................................................................................................................ 61
4.1 FATORES IMUNOLÓGICOS DOS PROGRESSORES E NÃO PROGRESSORES. 61
4.2 CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DOS PROGRESSORES E NÃO
PROGRESSORES........................................................................................................... 64
4.2.1 Análise filogenética........................................................................................................ 64
4.2.2 Mutações de escape imunológico.................................................................................. 65
5 CONCLUSÕES.............................................................................................................. 72
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 74
APÊNDICE.................................................................................................................. 102
ANEXOS....................................................................................................................... 115
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Morfologia do HIV-1............................................................................................. 12
Figura 2 Mapa genético do HIV-1....................................................................................... 13
Figura 3 Reconhecimento dos receptores virais gp120 e gp41 a membrana de linfócitos
T CD4+ durante a replicação do HIV.................................................................... 17
Figura 4 Ciclo replicativo do HIV....................................................................................... 19
Figura 5 Distribuição dos subtipos e CRFs de HIV-1 no Brasil.......................................... 21
Figura 6 Estimativa da prevalência de adultos e crianças vivendo com HIV em 2015 no
mundo..................................................................................................................... 23
Figura 7 Evolução da infecção pelo HIV-1 em função da contagem de linfócitos T CD4+
e carga viral................................................................................................. 25
Figura 8 Estabelecimento e manutenção de reservatório de células TCD4+ infectadas em
latência do HIV...................................................................................................... 26
Figura 9 Características dos fenótipos de progressão à AIDS referidas por diferentes
termos na literatura................................................................................................ 29
Figura 10 Sítios de ação dos antirretrovirais durante as diversas fases do ciclo replicativo
do HIV.................................................................................................................... 36
Figura 11 Quantificação de LTCD4+, LTCD8
+ e a relação de LTCD4
+/TCD8
+ entre os
grupos investigados............................................................................................... 51
Figura 12 Concentração plasmática e comparação das citocinas Th1, Th2 e Th17 nos
grupos investigados............................................................................................... 54
Figura 13 Distribuição filogenética das amostras dos grupos CV e NCV............................. 55
Figura 14 Localização da mutação A146T na proteína P24 do gene gag do HIV-1............. 58
8
LISTA DE SIGLAS
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
AIDS/SIDA Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
SIV Vírus da Imunodeficiência Símia
DNA Ácido Desoxirribonucleico
cDNA Ácido Desoxirribonucleico complementar
RNA Ácido Ribonucleico
LTCD4+ Linfócito T CD4
+
LTCD8+ Linfócito T CD8
+
CTL Linfócitos TCD8+ citotóxicos
HLA Antígenos Leucocitários Humanos/Human Leukocytes Antigens
MHC Complexo de Histocompatibilidade Principal/Major Histocompatibility
Complex TARV Terapia antirretroviral
LTNP long-term nonprogressors / Não progressores de longo prazo
CE Controlador de elite
CV Controlador de viremia
CV1 Controlador de viremia 1
CV2 Controlador de viremia 2
NCV Não controlador de viremia
9
RESUMO
A infecção pelo HIV-1 acarreta uma disfunção progressiva do sistema imunológico, associada
a infecções oportunistas e/ou neoplasias. Para a maioria dos portadores de HIV, a infecção é
marcada por alta replicação viral e o declínio de linfócitos TCD4+ (LTCD4
+), desencadeando
a AIDS, que na ausência de TARV pode conduzir à morte. Entretanto, o fenótipo LTNP
(Long-term nonprogressors), controlador de elite ou controlador de viremia, compreendem
indivíduos que naturalmente controlam a replicação viral sem TARV, mantendo níveis
aceitáveis de LTCD4+. Assim, o objetivo foi descrever os fatores de risco virológico e
imunológico entre portadores do HIV-1, de acordo com suas características de progressão
para a AIDS. Para isso, 30 pacientes, virgens de tratamento, foram selecionados e distribuídos
em três grupos considerando o tempo de infecção >6 anos, contagem de LTCD4+ e carga
viral, sendo: (i) 2 controladores de viremia 1 (CV1), (ii) 7 contoladores de viremia 2 (CV2) e
(iii) 21 não controladores de viremia (NCV). Foi utilizado, ainda, um grupo controle não
infectado pareados em relação ao sexo e idade. Foram dosadas as citocinas IFN-γ, IL-2, 4, 5,
9, 10, 13 e 17. O genoma do vírus foi amplificado por nested-PCR e, posteriormente
sequenciado para a subtipagem e análise de mutações de escape imunológico. As
quantificações de LTCD4+, LTCD8
+, LTCD4
+/LTCD8
+ e carga viral, mostraram diferenças
significantes entre os grupos de portadores de HIV, assim como, com os controles saudáveis,
com exceção do LTCD8+. O grupo CV mostrou maiores quantificações de LTCD4
+ e
LTCD8+. As quantificações de carga viral entre 1001 a 10000 e >10000 cópias/mL
apresentaram diferença estatística entre o grupo CV e NCV. A concentração da citocinas IFN-
γ de perfil Th1 foi maior nos CV em relação aos NCV e de forma inversa para as de perfil
Th2 com maiores níveis em NCV. O grupo dos NCV apresentou níveis mais altos de todas as
citocinas analisadas com significância estatística, com exceção para o IFN-γ que apresentou
níveis mais baixos em comparação com o grupo CV. As amostras pertenciam aos subtipos B e
F. Foi observada pressão seletiva maior no grupo de controladores de viremia que apresentou
maior frequência das mutações de escape imunológico pesquisadas para todos os genes
analisados, sendo encontradas duas mutações novas no gene gag. Apesar de não conseguir
detectar uma associação entre o número de mutações e a progressão da doença, a associação
de altas frequências de mutações de escape, níveis elevados de LTCD8+ e o predominante
perfil Th1 observadas em CV, sugerem que nesses indivíduos a resposta CTL exerce maior
pressão de seleção sobre o vírus, contribuindo para o acúmulo de mutações que,
consequentemente levam a um controle efetivo da viremia pela diminuição do fitness viral.
10
ABSTRACT
HIV-1 infection leads to progressive immune system dysfunction associated with
opportunistic infections and / or neoplasms. For most HIV carriers, the infection is marked by
high viral replication and the decline of TCD4+ lymphocytes (LTCD4
+), triggering AIDS,
which in the absence of ART can lead to death. However, the LTNP (Long-term
nonprogressors) phenotype, elite controller or viremia controller, comprise individuals who
naturally control viral replication without ART while maintaining acceptable LTCD4+ levels.
Thus, the objective was to describe the virological and immunological risk factors among
HIV-1 carriers, according to their characteristics of progression to AIDS. To this end, 30
treatment-naive patients were selected and distributed in three groups considering the time of
infection> 6 years, LTCD4 + count and viral load, being: (i) 2 viremia controllers 1 (CV1) 7
viremia controllers 2 (CV2) and (iii) 21 non-viremia controllers (NCV). We also used an
uninfected control group matched for sex and age. The cytokines IFN-γ, IL-2, 4, 5, 9, 10, 13,
and 17 were dosed. The virus genome was amplified by nested-PCR and subsequently
sequenced for subtyping and analysis of immunological escape mutations. The quantifications
of LTCD4+, LTCD8
+, LTCD4
+/LTCD8
+ and viral load, showed significant differences
between groups of HIV patients, as well as healthy controls, with the exception of LTCD8+.
The CV group showed higher quantifications of LTCD4+ and LTCD8
+. Viral load
quantifications between 1001 and 10,000 and > 10,000 copies/mL presented a statistical
difference between the CV and NCV groups. The Th1 profile IFN-γ cytokines concentration
was higher in the CV in relation to the NCV and inversely in the Th2 profile with higher
levels in NCV. The NCV group had higher levels of all cytokines analyzed with statistical
significance, except for IFN-γ, which presented lower levels compared to the CV group. The
highest selective pressure was observed in the viremia control group, which showed a higher
frequency of the immunological escape mutations studied for all genes analyzed, and two new
mutations were found in the gag gene. Although it is not possible to detect an association
between the number of mutations and the progression of the disease, the association of high
frequencies of escape mutations, high levels of LTCD8+ and the predominant Th1 profile
observed in CV, suggest that in these individuals the CTL response exerts greater selection
pressure on the virus, contributing to the accumulation of mutations that, consequently, lead
to an effective control of viremia by the decrease of viral fitness.
11
1 INTRODUÇÃO
1.1 HISTÓRICO
Os retrovírus são designados pela sua capacidade de transcrição reversa, sintetizando
uma molécula de cDNA a partir de um RNA (Cullen, 1992). Estes vírus estão amplamente
distribuídos entre os vertebrados, principalmente aves, primatas não humanos e humanos e até
entre os invertebrados como descrito no gênero Drosophila (Varmus, 1988; Knipe, 2001). O
primeiro registro dos retrovírus ocorreu a partir do isolamento do vírus transmissor do
sarcoma das aves, descrito por Peyton Rous em 1911 (Rous & Murphy, 1913; Bishop, 1978).
Entretanto, em 1983, esse grupo de vírus ganhou grande notoriedade com o isolamento do
Vírus da imunodeficiência humana (Human immunodeficiency virus - HIV) pelo grupo do
virologista Luc Montagnier do Instituto Pasteur, em Paris (Barre-Sinoussi et al., 1983).
O HIV é o agente etiológico da Síndrome da imunodeficiência adquirida
(SIDA/AIDS), sendo os primeiros casos registrados na década de 1980 principalmente entre
indivíduos jovens, do sexo masculino, de comportamento homossexual e muitas vezes
usuários de drogas endovenosas, que manifestavam quadros infecciosos causados por
Pneumocystis jiroveci, Citomegalovírus, Toxoplasma gondii, além de linfomas e Sarcoma de
Kaposi (CDC, 1981). Esta síndrome é caracterizada pela disfunção progressiva do sistema
imunológico, sobretudo mediante a depleção dos linfócitos TCD4+, encontrando-se
geralmente associada ao aparecimento de infecções oportunistas e/ou neoplasias (Pantaleo &
Fauci, 1996; Sáez-Cirión et al., 2013).
O isolamento do HIV ocorreu em 1983, quando foi observada a presença de um
retrovírus causador de efeito citopático em amostras de gânglios linfáticos provenientes de
paciente com linfoadenopatias generalizadas e baixo número de linfócitos TCD4+, recebendo
à denominação de Vírus associado à linfadenopatia (Lymphadenopathy-associated virus -
LAV) (Barre-Sinoussi et al., 1983). No entanto, no ano seguinte, Broder & Gallo, (1984)
conseguiram isolar um vírus idêntico a partir de linhagens de células T de pessoas com AIDS
do estado de São Francisco, nos Estados Unidos, denominando-o Vírus linfotrópico de células
T humanas III (Human T-cell lymphotropic virus III - HTLV-III). Em razão da discordância
de nomenclatura, a partir de 1986, o vírus causador da AIDS recebe a denominação de HIV,
proposta pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral – ICTV.
12
1.2 CLASSIFICAÇÃO E ESTRUTURA VIRAL
De acordo com o ICTV, o HIV pertence à família Retroviridae, subfamília
Orthoretrovirinae, gênero Lentivirus (ICTV, 2016). O gênero Lentivirus compreende várias
espécies, entre elas as duas espécies de HIV: o HIV-1 e o HIV-2. A morfologia do HIV-1
caracteriza-se por uma partícula medindo 100 nm de diâmetro com a presença de um
envelope lipoproteico derivado da membrana celular do hospedeiro, com as glicoproteínas
como a gp120 (superfície) e gp41 (transmembranar), que são responsáveis pela ligação da
partícula viral ao receptor TCD4+ da célula-alvo (Turner & Summers, 1999).
O HIV possui uma matriz estrutural formada pela proteína p17 que circunda o
nucleocapsídeo viral, formado pela proteína p24, a qual envolve as duas cópias idênticas de
RNA de polaridade positiva, medindo aproximadamente 10 Kilobase (Kb). No interior do
nucleocapsídeo estão presentes as enzimas protease, transcriptase reversa e integrase,
importantes para a replicação do vírus (Vaishnav & Wong-Staal, 1991; Figura 1).
Figura 1 – Morfologia do HIV-1. gp120: glicoproteína 120; gp41: glicoproteína 41; p17:
proteína 17; p24: proteína 24; TR: transcriptase reversa; ssRNA+: RNA de fita simples de
polaridade positiva. (Fonte: Autoral).
13
1.3 CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA
O genoma do HIV-1 é constituído de nove genes, sendo gag, pol e env denominados
genes estruturais e responsáveis pela codificação de poliproteínas, que são posteriormente
clivadas em proteínas individuais. Além dos genes estruturais, o genoma do HIV-1 é
constituído por mais seis genes adicionais, também chamados de acessórios, vif, vpr e nef que
constituem a partícula viral, tat e rev que realizam funções de regulação gênica e, por fim,
vpu, que atua indiretamente na montagem da partícula viral (Cullen, 1992; Frankel & Young,
1998; Watts et al., 2009; Figura 2).
Figura 2 – Mapa genético do HIV-1 (Adaptado de Sierra, Kupfer, Kaiser, 2005).
1.3.1 Gene gag
O gene gag codifica uma poliproteína precursora Pr55Gag, denominada com base em
seu peso molecular de 55 kDa, sendo composta por quatro grandes domínios estruturais que
são clivados durante ou após o brotamento das novas partículas virais pela protease viral,
dando origem a proteína de matriz (p17), a do capsídeo (p24), a do nucleocapsídeo (p7) e a
p6, importante para a liberação de partículas virais a partir da superfície da célula. Antes da
clivagem, a p17 constitui o domínio N-terminal da proteína e é essencial para a ligação e
localização da proteína precursora à membrana plasmática (Freed,1998; Inlora et al., 2011).
O processamento proteolítico da proteína precursora Pr55Gag induz uma mudança
conformacional na estrutura da nova partícula viral formada, em que a p17 permanece
associada à parte interna do envelope do vírus, enquanto que a p24 forma um arranjo
estrutural em torno do RNA viral, formando o capsídeo (Freed,1998, Figura 1).
14
1.3.2 Gene pol
O gene pol codifica uma poliproteína precursora de 160 kDa (Pr 160GagPol), a qual é
clivada em produtos que irão dar origem as enzimas virais, tais como a transcriptase reversa
(TR), integrase (IN) e protease (PR; Freed & Martin, 1995). Essas enzimas apresentam função
direta no ciclo replicativo viral, sendo a TR responsável pela transcrição da fita de RNA viral
em uma de cDNA que será posteriormente integrada, pela ação da IN, ao genoma da célula
hospedeira. Já a PR tem como função catalisar a formação da estrutura de um novo vírus,
através da clivagem das proteínas precursoras formadas no final do processo replicativo
(Jacks & Varmus, 1985; Panganiban & Fiore, 1988).
1.3.3 Gene env
O gene estrutural env é transcrito em uma glicoproteína de 160 kDa (gp160) que, ao
final do ciclo replicativo viral é processada pela protease viral gerando duas glicoproteínas
menores, a gp120 de superfície e a gp41 transmembranar, que têm como função intermediar o
reconhecimento e ligação do vírus à célula alvo (Hope & Trono, 2000; Barbour & Grant,
2005).
A evolução de env está relacionada ao surgimento de mutações em consequência da
pressão seletiva do sistema imunológico sobre o gene que é alvo dos anticorpos neutralizantes
específicos contra a infecção. Assim, a resposta desses anticorpos do hospedeiro impulsiona a
evolução através da resposta inicial ao vírus e, posteriormente, às variantes de escape (Arrildt
et al., 2012).
1.3.4 Gene vif
O gene vif codifica uma proteína de 23 kDa com função importante na produção de
partículas altamente infecciosas. Esta proteína está localizada no citoplasma da célula
infectada, sendo expressa tardiamente como um componente do complexo de transcrição
reversa, com função de co-factor para a atividade da enzima transcriptase reversa (Seelamgari
et al., 2004; De Maio et al., 2012).
A presença de mutações em vif tem como consequência a diminuição do potencial
infeccioso do vírus gerado, prejudicando a sua propagação e atenuando as suas propriedades
patológicas (Hassaïne et al., 2001).
15
1.3.5 Gene vpr
O gene vpr codifica uma proteína de 96 aminoácidos (14 kDa) que de acordo com
alguns estudos desempenha um papel crucial na patogênese viral, com função de ativação
viral (Levy et al., 1994), supressão de funções imunológicas (Poon et al., 1998) e a
diminuição dos níveis de linfócitos TCD4+ (Stewart et al., 1997).
A expressão do gene vpr, conduz a parada do ciclo celular na fase G2, seguido por
apoptose. A importância do bloqueio do ciclo celular em G2 se explica pela alta atividade
transcricional da região LTR viral durante essa fase do ciclo celular, aumentando a expressão
gênica. Da mesma maneira, a regulação da apoptose por meio da proteína Vpr ocorre pela
interação direta com a mitocôndria da célula, alterando o equilíbrio entre fatores pró-
apoptóticos e anti-apoptóticos, que contribui para a supressão imunológica e afeta a
patogênese do HIV tanto in vitro quanto in vivo (Andersen et al., 2008; Murakami & Aida,
2014).
A presença de polimorfismo no gene vpr está associado a níveis mais elevados de
oligomerização e um aumento da replicação do vírus em indivíduos com progressão rápida
para a AIDS (Hadi et al., 2014).
1.3.6 Gene nef
O gene nef codifica a proteína citoplasmática Nef de 27 kDa, que se liga à superfície
interna da membrana plasmática, tendo como função a diminuição da expressão de receptores
CD4 na superfície celular, inibindo a re-infecção das células e facilitando a disseminação do
vírus (Delassus et al., 1991; Greenway et al., 2003; Jere et al., 2004).
A proteína Nef também está relacionada com a capacidade de promover a evasão
imune, através da regulação negativa da expressão do Complexo de Histocompatibilidade
classe I (MHC-I), resultando em uma diminuição do reconhecimento das células TCD4+
infectadas pela resposta citotóxica mediada pelos linfócitos T CD8+
(Dirk et al., 2016).
1.3.7 Gene tat
A proteína Tat é transcrita a partir do gene tat, sendo composta por 101 aminoácidos.
Apresenta função de transativador viral potente, essencial para a replicação viral in vitro e in
vivo, atuando no controle da produção e processamento dos genes virais durante a transcrição,
16
aumentando os níveis de transcrição do promotor situado nas sequências LTR do HIV-1
(Liang & Wainberg, 2002).
É uma região imunogênica altamente conservada entre subtipos de HIV, o que a torna
uma excelente candidata para o desenvolvimento de vacinas preventivas e terapêuticas contra
a infecção (Ensoli et al., 2006).
1.3.8 Gene rev
A proteína transcrita pelo gene rev apresenta 19 kDa e é essencial para a replicação
viral (Gergerfelt et al., 2002). Atua na fase após a transcrição do RNA viral, direcionando o
transporte das moléculas de mRNA do núcleo para o citoplasma para a sua subsequente
tradução (Pollard & Malim, 1998; Fernandes et al., 2012).
Mutações no gene rev do HIV-1 implicam na incapacidade de induzir a síntese e
regulação das proteínas virais, portanto, apresentam uma replicação comprometida (Cullen,
1992).
1.3.9 Gene vpu
O gene vpu codifica uma proteína de 16 kDa com função relacionada ao aumento da
taxa de liberação do vírus da célula infectada, facilitando a maturação e montagem do vírus,
além de regular negativamente a expressão do receptor CD4 na superfície celular (Janvier et
al., 2000; González, 2015).
Este gene está presente somente em HIV-1 e não em HIV-2, fato relacionado a uma
patogênese mais branda, com sintomas menos severos na espécie 2 (Strebel et al., 1988).
Além do que mutações nesse gene parecem influenciar numa progressão mais lenta para a
AIDS (González, 2015).
1.4 CICLO REPLICATIVO
O HIV-1 tem tropismo por células que apresentam a molécula CD4 em sua superfície,
sendo que as principais células-alvo do vírus no organismo são os linfócitos TCD4+, além de
macrófagos, monócitos e células dendríticas (Douek et al., 2002, Turville et al., 2002).
A primeira etapa da replicação viral compreende a adsorção do HIV à célula-alvo.
Esse processo de reconhecimento consiste na ligação do vírus ao receptor da célula,
17
permitindo a sua entrada, através da ligação entre duas regiões conservadas da gp120 (C3 e
C4) do HIV ao receptor celular CD4. A ligação gp120/CD4 gera uma mudança
conformacional na proteína do vírus, que permite a exposição do peptídeo de fusão gp41 e a
sua ligação aos correceptores da superfície celular. Dependendo do tropismo viral, os
correceptores celulares podem ser o CCR5 ou o CXCR4 (Freed & Martin, 1995; Gomez &
Hope, 2005; Figura 3).
Figura 3 – Reconhecimento dos receptores virais gp120 e gp41 a membrana de linfócitos T
CD4+ durante a replicação do HIV (Adaptado de Abbas, 2011).
O HIV apresenta uma diferenciação no tropismo celular quanto aos correceptores
utilizados dependendo da cepa. Cepas que infectam, preferencialmente, células com CXCR4,
são denominadas T-trópicas (X4), enquanto que aquelas que infectam células com CCR5 são
denominadas M-trópicas (R5). Assim, as cepas X4 infectam preferencialmente linfócitos T,
enquanto que as cepas R5 infectam preferencialmente macrófagos e a células dendríticas.
Entre essas duas formas as cepas quiméricas X4R5 podem infectar ambas as populações
celulares (Seelamgari et al., 2004; Hoffmann et al., 2007).
Após a fusão do envelope viral com a membrana da célula, ocorre a dissociação do
capsídeo viral e a liberação do genoma e das enzimas virais no citoplasma da célula, alguns
componentes virais liberados se associam e formam um complexo enzimático denominado
Complexo de Pré-integração, composto pela enzima RT, o RNA viral, o RNA transportador
(tRNA), a integrase, p24, p17, p7 e Vpr (Fassati & Goff, 2001). Nesse momento ocorrerá a
transcrição do RNA viral, com a formação de uma molécula híbrida de RNA/DNA e
18
posteriormente uma molécula de DNA complementar (cDNA) pela ação da enzima RT,
utilizando o tRNA como iniciador da transcrição reversa das duas fitas de RNA viral, sendo
ambas degradadas, ao final processo, pela atividade de RNAse H da RT (Miller et al., 1997;
Frankel & Young, 1998; Hu & Hughes, 2012; Figura 4).
A nova fita de dsDNA viral é transportada para o núcleo da célula hospedeira, através
da ação das proteínas Vpr e Vif, que estão associadas ao transporte do complexo de pré-
integração ao núcleo e ao aumento do potencial infeccioso, respectivamente (Frankel &
Young, 1998). Dentro do núcleo, o DNA viral pode permanecer na forma circular não-
integrada ou na forma proviral, sendo essa última resultado da ação da enzima integrase, a
qual irá promover a integração do DNA viral ao DNA da célula hospedeira, caracterizando o
início da fase tardia da replicação do HIV. O provírus gerado pode permanecer na célula
hospedeira em um estado de latência durante meses ou anos ou na forma transcricional ativa
(Miller et al., 1997; Santos, 2008).
A integração do DNA viral é importante para que ocorra a síntese de novas fitas de
RNA viral pela maquinaria celular. O mRNA viral formado é transportado para o citoplasma
e traduzido nas suas poliproteínas. As glicoproteínas do envelope são sintetizadas pelos
ribossomos no retículo endoplasmático e transportadas para a membrana plasmática. As
poliproteínas precursoras Gag e Gag-Pol são sintetizadas e transportadas para a membrana
plasmática por um mecanismo não muito bem elucidado. Nesse momento, a poliproteína Gag-
Pol se associa a duas cópias de fita simples de RNA genômico que constituirá o ácido
nucléico da partícula viral nascente (Freed, 1998). Posteriormente, as glicoproteínas virais do
envelope, são incorporadas nas partículas virais nascentes, ocorrendo o brotamento. Após o
brotamento, a protease viral cliva a poliproteína precursora Gag-Pol e Gag para originar as
suas proteínas individuais, gerando a formação do core e a formaçãode um vírus completo e
infeccioso, capaz de infectar novas células (Freed, 1998; Figura 4).
19
Figura 4 – Ciclo replicativo do HIV (Adaptado de Engelman & Cherepanov, 2012).
1.5 FILOGENIA
Análises filogenéticas apontam a existência de duas espécies antigênicas de HIV: o
HIV-1 e o HIV-2. Estudos sobre o surgimento do HIV sugerem que o vírus entrou na
população humana através de múltiplas infecções zoonóticas, estando intimamente
relacionado com um vírus correlato encontrado em primatas não-humanos, o Vírus da
imunodeficiência símia (Simian immunodeficiency virus - SIV) de linhagens ancestrais
distintas para as espécies do vírus em humanos (Hahn et al., 2000; Sharp et al., 2001).
Para fundamentar a origem filogenética dos vírus, cinco linhas de evidências são
consideradas para a origem zoonótica das duas espécies de HIV, que são: semelhanças na
organização do genoma viral, relações filogenéticas, a prevalência no hospedeiro natural,
coincidência geográfica entre as espécies, e as rotas plausíveis de transmissão. O HIV-2 foi a
primeira espécie de HIV a ter a sua origem zoonótica confirmada, apresentando identificação
evolutiva de acordo com os critérios citados acima: (i) o HIV-2 e o SIV encontrado em
primatas Sooty Mangabei (SIVsm) compartilham uma estrutura de genoma idênticos, com
cada um dos vírus codificando uma proteína acessória, denominadas Vpx, encontrada
somente nesses lentivírus, (ii) cepas de SIVsm e HIV-2 apresentam origem ancestral comum,
não podendo ser separados em linhagens filogenéticas distintas, (iii) os primatas mangabei
20
são numerosos em muitos países do oeste africano e estão infectados com SIVsm com uma
frequência de 22%, (iv) existe uma coincidência geográfica entre o habitat natural de uma
espécie mangabei com as áreas onde HIV-2 é endêmico. Essa espécie de mangabei localiza-se
a oeste do litoral da África do sul no território entre o Rio Casamansa, no Senegal e o Rio
Sassandra na Costa do Marfim, correspondendo com a faixa territorial próxima aos epicentros
de epidemias do HIV-2, (v) Essa espécie de mangabei é frequentemente utilizada como
alimentos, e os animais órfãos são mantidos como animais de estimação, o que aumenta a
frequência de contato com animais possivelmente infectados (Gao et al., 1999; Hahn et al.,
2000).
Hahn e colaboradores (2000) defenderam a origem filogenética de HIV-1 a partir de
linhagem viral de SIVcpz isolada de uma espécie de chimpanzé (Pan troglodytes) que
apresenta evidências de coincidência geográfica com os grupos de HIV-1 (M, N e O), sendo a
transmissão zoonótica favorecida pela prática da caça, comum no oeste da África central.
Além disso, a similaridade da região env de SIVcpz indica que essa espécie esteja
intimamente relacionada com o HIV-1 do grupo N, revelando uma relação filogeográfica
muito próxima entre o vírus de humano e do chimpanzé, sugerindo que o evento de
transmissão ocorreu nos arredores de Camarões, já que ambos são endêmicos dessa região,
reforçando ainda mais essa hipótese.
Devido à elevada taxa de replicação e ao fato da transcriptase reversa não ter
mecanismos de correção na incorporação das bases nitrogenadas, o HIV-1 acumulou uma
considerável taxa de diversidade em seres humanos, originando quatro grupos filogenéticos
distintos: o grupo M (major), de distribuição cosmopolita, grupo N (new), descrito em
Camarões, grupo O (outlier), comumente encontrados no oeste da África e o grupo P (Hahn et
al., 2000, Baesi et al., 2014). Dentro do grupo M, responsável pela maioria de casos de AIDS
em todo o mundo, existem nove subtipos designados pelas letras A, B, C, D, F, G, H, J e K,
juntamente com 61 formas recombinantes circulantes (Baesi et al., 2014).
As formas recombinantes (RF - Recombinant Forms) são o resultado da transferência
de material genético entre dois ou mais vírus de subtipos diferentes em um indivíduo com
infecção mista. Caso a ocorrência de uma forma recombinante tenha sido documentada em
mais de três indivíduos não relacionados, passa a ser denominada como CRF (forma
recombinante circulante - Circulating Recombinant Form; Sharp et al., 2001; Hemelaar et al.,
2006).
21
A divisão em grupos, subtipos e CRF permitiu acompanhar o curso da pandemia do
HIV-1 e evidencia uma distribuição heterogênea dos diferentes subtipos genéticos,
dependendo do país analisado (Vidal et al., 2000). A subtipagem do HIV-1 é um instrumento
epidemiológico útil para o rastreamento da transmissão do vírus e fornece informações sobre
os padrões de divergência genética que pode ter ocorrido durante a evolução viral (Sanabani
et al., 2011).
No Brasil, o subtipo B é o mais prevalente, tendo sido introduzido no Brasil por
indivíduos norte-americanos, estabelecendo-se no grupo de homens que fazem sexo com
homens (HSH). O subtipo F1 foi identificado principalmente em profissionais do sexo e
usuários de drogas, e provavelmente introduzido no Brasil no início de 1980 (Bello et al.,
2006). Embora a maioria das infecções pelo HIV-1 no Brasil seja pelo subtipo B, na região
sul do país o principal foco de infecção é pelo subtipo C, assim como nos Estados de Espírito
Santo, Goiás e Rio de Janeiro (Soares et al., 2003; Almeida et al., 2011; Figura 5).
No norte do País, Machado e colaboradores (2009), analisando as regiões gênicas env
e pol do HIV-1, descreveram a ocorrência do subtipo B e F em amostras de indivíduos
provenientes das cidades de Belém (Pará) e de Macapá (Amapá). Além de descrever pela
primeira vez a ocorrência do subtipo D na região norte (Figura 5).
Figura 5 – Distribuição dos subtipos e CRFs de HIV-1 no Brasil (Adaptado de Brasil, 2014).
22
1.6. EPIDEMIOLOGIA
1.6.1 Modos de transmissão
O HIV pode ser transmitido por meio da troca de fluídos corporais infectados tais
como sangue, sêmen, secreção vaginal e leite materno.
A transmissão sexual pode ocorrer através do contato de secreções contendo o vírus
com membranas mucosas ou pele lesionada durante a relação sexual (Schwartz & Nair,
1999). No Brasil, entre o período de 2007 a 2015 em indivíduos do sexo masculino maiores
de 13 anos de idade, verificou-se que 50,4% dos casos notificados no SINAN (Sistema de
Informação de Agravos de Notificação) estavam na categoria de exposição homossexual,
36,8% heterossexual e 9,0% bissexual. Já entre as mulheres na mesma faixa etária, observou-
se que a categoria de exposição heterossexual foi a responsável pela maioria dos casos
(96,4%; Brasil, 2016, Boletim epidemiológico).
A exposição a sangue contaminado abrange os indivíduos usuários de drogas
injetáveis que compartilham seringas e agulhas, os hemofílicos e os politransfundidos
(Gonçalves, 2006). No entanto, a participação da via transfusional na transmissão do HIV
vem diminuindo, principalmente, com o avanço das metodologias de detecção do vírus nos
bancos de sangue com a incorporação de técnicas mais sensíveis como a biologia molecular,
contribuindo para o aumento da segurança transfusional (Lajolo et al., 2008). A transmissão
pode ocorrer ainda através dos acidentes ocupacionais, tais como acidentes de trabalho em
profissionais da saúde, através de ferimento com material perfuro-cortante contendo sangue
contaminado (Shimoji et al., 2010).
No Brasil, a prevalência do HIV entre usuários de drogas injetáveis tende a diminuir
com o incentivo de política de conscientização mundial para o não compartilhamento de
seringas, correspondendo a 2%. Entretanto, em regiões como Europa Oriental e Ásia Central é
a forma de transmissão mais importante, com índices em torno de 51% (UNAIDS, 2016).
A transmissão vertical ou materno-infantil pode ocorrer durante a gravidez, no
momento do parto ou aleitamento materno e é responsável por 93% das infecções em menores
de 13 anos (Schwartz & Nair, 1999). Segundo o Boletim epidemiológico do Ministério da
saúde de 2016, no período de 2000 até junho de 2016, foram notificados 99.804 casos de
gestantes infectadas pelo HIV, com uma taxa de detecção crescente nos últimos dez anos de
2,1 casos/1.000 nascidos vivos em 2006 para 2,7 em 2015.
23
1.6.2 Prevalência
Estima-se que 36,7 milhões de pessoas viviam com o HIV até 2015 no mundo, com
diferentes prevalências entre as regiões e com um número de 2,1 milhões de novas infecções
pelo HIV em todo o mundo, mostrando um pequeno declínio em comparação ao ano de
2010 que apresentava 2,2 milhões de novas infecções (Figura 6). Ao mesmo tempo, o
número de mortes por AIDS também demonstra declínio, passando de 1,5 milhões em 2010
para 1,1 milhão de mortes por AIDS em 2015 (UNAIDS, 2016).
Figura 6 – Estimativa da prevalência de adultos e crianças vivendo com HIV em 2015 no
mundo (Fonte de dados: UNAIDS, 2016).
O aumento da frequência do comportamentos sexuais de risco em vários países como
Congo, Costa do Marfim, Etiópia, Gabão, Guiana, Ruanda, África do Sul, Uganda, República
Unida da Tanzânia e Zimbabwe estão relacionados com um aumento significativo no número
de parceiros sexuais, assim como um declínio no uso do preservativo na Costa do Marfim,
Nigéria, Senegal e Uganda (UNAIDS, 2013).
No Brasil, 136.945 casos de HIV/AIDS foram notificados no SINAN de 2007 a 2016,
com a maioria dos casos encontrados (52,3%) de infecção nas faixas de 20 a 34 anos (Brasil,
2016, Boletim epidemiológico). Um estudo de prevalência realizado com soldados do
24
Exército Brasileiro, com idade de 17 a 21 anos, detectou o aumento da infecção pelo HIV de
0,09% em 2002 para 0,12% em 2007, com aumento mais significativo entre os HSH, cuja
prevalência subiu de 0,56% em 2002 para 1,2% em 2007 (Szwarcwald et al., 2011).
Do início da epidemia de HIV/AIDS na década de 1980 até dezembro de 2014, foram
identificados 303.353 óbitos no Brasil cuja causa notificada foi a AIDS, com maiores
números na região Sudeste (60,3%), região Sul (17,5%), Nordeste (12,6%), Centro-Oeste
(5,1%) e Norte (4,4%; Brasil, 2016, Boletim Epidemiológico).
1.7 DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO
Segundo o último Manual técnico para o diagnóstico da infecção pelo HIV do
Ministério da saúde (2016), o esquema considerado padrão-ouro para a testagem das amostras
de indivíduos com idade acima de 18 meses com suspeita de infecção é composto por dois
testes sorológicos: um de triagem (etapa I) e um confirmatório (etapa II). Esse esquema de
combinação de dois testes tem o objetivo de aumentar a confiabilidade do resultado da
amostra testada.
Os testes da etapa I e II variam de acordo como fluxograma do Manual técnico para o
diagnóstico da infecção pelo HIV (2016). De acordo com o fluxograma 1 do Manual de
diagnóstico do Ministério da Saúde, os testes rápidos são utilizados, principalmente em locais
que apresentam rotinas reduzidas com pequeno número de testagem e em ações de testagem
fora do ambiente laboratorial. Em casos de dois testes rápidos positivos, o indivíduo é
encaminhado para atendimento em uma Unidade Básica de Saúde ou para um Serviço de
Assistência Especializada. Para as amostras com resultado reagente ou indeterminado, é
realizado o exame de carga viral que além de demonstrar a situação atual do paciente, compõe
um terceiro teste e cujo resultado ratifica a presença da infecção (Brasil, 2016, Manual técnico
para o diagnóstico).
1.8 PATOGÊNESE
A história natural da infecção pelo HIV é caracterizada por uma infecção aguda com
altos níveis de carga viral e danos irreversíveis para o sistema imunológico, em particular, o
tecido linfóide associado ao intestino (Moir et al., 2011). Posteriormente, segue um período
de baixa replicação e aumento dos níveis de linfócitos, acompanhada por uma fase crônica
25
com ativação imune persistente e esgotamento dos linfócitos T CD4+, resultando, finalmente,
na progressiva exaustão do sistema imunológico e profunda imunodeficiência, levando a
morte por complicações decorrentes de infecções oportunistas (Berg et al., 2012; Hill et al.,
2012; Olson et al., 2014; Figura 7).
Figura 7 – Evolução natural da infecção pelo HIV-1 em função da contagem de linfócitos T
CD4+ e carga viral (Adaptado de: Kogan & Rappaport, 2011).
Após a entrada, o vírus se estabelece no local primário da infecção, invadindo as
células-alvo presentes no local. A partir dessa população de células infectadas, o vírus é
disseminado para os linfonodos locais e depois para os tecidos linfóides subjacentes,
estabelecendo um reservatório viral, principalmente nos tecidos linfóides (Schwartz & Nair,
1999; Moir et al., 2011; figura 8).
Na fase inicial da infecção, o indivíduo desenvolve um quadro semelhante à
mononucleose aguda ou síndrome gripal dentro de 3 a 6 semanas após o primeiro contato com
o vírus. O seu quadro clínico é caracterizado por níveis elevados de carga viral e uma queda
significativa no número absoluto de linfócitos T CD4+. Em seguida, ocorre a ativação de
linfócitos T CD8+, como uma tentativa de controle da replicação do vírus através da sua ação
26
de citotoxicidade. Durante esta fase, o HIV apresenta uma alta taxa de replicação nos
linfonodos com a liberação contínua de partículas virais e de linfócitos infectados (Kahn &
Walker, 1998, Schwartz & Nair, 1999).
Figura 8 - Estabelecimento e manutenção de reservatório de células TCD4+ infectadas em
latência do HIV. Processo de infecção de células TCD4+
em repouso, com posterior
integração do DNA viral no genoma da célula e replicação, resultando na morte celular por
apoptose natural ou induzida por citotoxidade e formação de reservatório (células TCD4+
em
latência) nos tecidos linfoides (Adaptado de: Moir et al., 2011).
A fase inicial da infecção é seguida por um estado estacionário de replicação viral ou
etapa de latência, com duração de meses a anos dependendo do indivíduo. Essa fase,
geralmente assintomática, é a tentativa de controle através de uma resposta imunológica
específica contra o vírus, limitando em níveis baixos ou indetectáveis de partículas virais
infecciosas no sangue periférico pelo aumento dos títulos de anticorpos neutralizantes contra
o vírus, e também pela ação dos linfócitos TCD8+ (Kahn & Walker, 1998, Schwartz & Nair,
1999). No entanto, apesar dos níveis de vírus circulante serem baixos ainda ocorre, nesta fase,
uma replicação contínua do vírus nos tecidos linfóides, mostrando que o HIV provoca uma
infecção persistente nos indivíduos acometidos (Schwartz & Nair, 1999; Moir et al., 2011).
27
A fase final da infecção pelo HIV é caracterizada por uma profunda imunodeficiência,
com a diminuição acentuada de linfócitos TCD4+ e CD8
+, com o rompimento dos centros
germinativos e dos gânglios linfáticos e, consequentemente, com uma intensa liberação de
partículas virais. Nesse estágio da infecção é estabelecida a AIDS. Seus sinais e sintomas
incluem desde infecções oportunistas de origem bacterianas, virais e fúngicas, febre,
caquexia, prurido maculopapular, suores noturnos, até manifestações clínicas mais severas
como meningite, demência e neoplasias (Kahn & Walker, 1998, Schwartz & Nair, 1999).
1.8.1 Progressão
Para a maioria dos portadores de HIV, a infecção é caracterizada por alta replicação
viral e o declínio de linfócitos TCD4+, provocando o desenvolvimento da AIDS, que na
ausência de terapia antirretroviral pode conduzir o indivíduo a morte (Okulicz et al, 2009).
Esse grupo de indivíduos com progressão normal, ou seja, que desenvolvem AIDS em um
período de, aproximadamente, de 2 a 4 anos após a infecção são denominado de progressores
típicos ou não controladores. No entanto, outros perfis de progressão podem ser observados.
Além disso, dependendo dos critérios adotados para a classificação e análise dos perfis de
progressão, estes podem receber denominações diferentes (Gurdasani et al., 2014) (Figura 9).
Um grupo de portadores de HIV que não segue o curso normal de progressão em
direção à AIDS é denominado de “Não progressores de longo prazo” (LTNP - long-term
nonprogressors) e são definidos com base na sua capacidade de manter níveis de linfócitos
TCD4+ acima de 500 células/mm
3 e baixos níveis de carga viral espontaneamente na ausência
de antirretroviral, durante 7 a 15 anos dependendo da definição usada (Saag & Deeks, 2010).
Dentro dos LTNP existem vários grupos distintos, tais como os controladores de
viremia, que apresentam baixos níveis detectáveis do RNA viral no plasma e os chamados
controladores de elite (CE), que representa o extremo da capacidade de contenção da
progressão à AIDS, mantendo baixos níveis de RNA viral plasmático indetectáveis pelos
métodos convencionais de quantificação (Pereyra et al., 2008).
Nos CE não ocorre progressão clinicamente ou o progresso ocorre em taxas muito
lentas. Estima-se que menos de 1% dos pacientes portadores de HIV-1 pertença a esse grupo,
porém, essa prevalência pode sofrer alterações, influenciada por fatores, como idade, sexo,
histórico de tratamento, etnia e, principalmente, por fatores virais e genéticos do hospedeiro
(Phair et al., 1992; Sheppard et al., 1993; Cao et al., 1995; Paxton et al., 1996; Miura et al.,
28
2009; Abdel-mohsen et al., 2013). Além disso, os critérios empregados para sua classificação
variam de acordo com a fonte utilizada (Saag & Deeks, 2010, Olson et al., 2014; Quadro 1).
Quadro 1 – Definições de controladores de elite encontradas na literatura (Adaptado de Olson
et al., 2014).
Definições
1
HIV ≥ 6 meses, com ≥ 2 contagens consecutivas de <75 cópias/ml de HIV/RNA
(Owen et al., 2010)
2 HIV ≥ 1 ano, com ≥ 1 contagem de <50 cópias/ml de HIV/RNA (Walker, 2007)
3
HIV ≥ 1 ano, com ≥ 1 contagem de <75 cópias/ml de HIV/RNA (Pereyra et al.,
2008)
4
HIV ≥ 1 ano, com ≥ 3 contagens de <2000 cópias/ml de HIV/RNA (Okullicz et
al., 2010)
5
HIV ≥ 1 ano, com ≥ 3 contagens consecutivas de <75 cópias/ml de HIV/RNA
(Deeks & Walker, 2007)
6
HIV ≥ 1 ano, com ≥ 3 contagens consecutivas de <75 cópias/ml de HIV/RNA,
sem episódios anteriores ≥ 1000 cópias/ml (Okullcz et al., 2009)
7
HIV ≥ 2 anos, com ≥ 2 contagens de <75 cópias/ml de HIV/RNA (Eriksson et al.,
2012)
8
HIV ≥ 5 anos, com ≥ 5 contagens consecutivas de <500 cópias/ml de HIV/RNA
(Saez-Cirion et al., 2011)
9
HIV ≥ 10 anos, com todas as contagens <50 cópias/ml de HIV/RNA (Lopez et
al., 2011)
10
HIV ≥ 10 anos, com ≥ 90% das contagens <400 cópias/ml de HIV/RNA
(Lambotte et al., 2005)
29
Figura 9 – Características dos fenótipos de progressão à AIDS referidas por diferentes termos na literatura. HIC-1 e HIC-2 referem-se a
definições para controladores de HIV mais utilizadas. TARV, terapia antirretroviral; LTNP, não progressor de longo prazo; LTS, sobrevivência
de longo prazo; NP, não progressor; SP, progressor lento; RP, progressor rápida; EC, controlador de elite; HIC, controlador de HIV; VC,
controlador de viremia; NC, não controlador (Adaptado de Gurdasani et al., 2014).
30
Uma a cada 300 pessoas infectadas, aparentemente, são capazes de controlar o vírus
sem fazer uso de drogas antirretrovirais. Evidências de diferenças na resposta imunológica do
hospedeiro, já foram propostas (Carrington & Walker, 2012). Entretanto, pouco se tem
avaliado acerca do agente viral em sua diversidade. Um estudo com um grupo limitado de
crianças, mostrou substituições nucleotídicas na sequência de vif, que podem contribuir para a
melhor resposta imunológica do hospedeiro, quanto na atenuação do HIV-1 (De Maio et al.,
2012).
Como esperado, indivíduos com carga viral elevada apresentam uma progressão mais
rápida da doença quando comparados com aqueles com menor carga. Assim, os mecanismos
de supressão da infecção nesses indivíduos ainda não são bem compreendidos e podem ser
atribuídos a uma série de características virológicas, imunológicas e genéticas. As explicações
para essa progressão envolvem mecanismos de controle da replicação do HIV que incluem (1)
a baixa suscetibilidade à infecção viral pelos linfócitos TCD4+, (2) infecção por variantes
virais com replicação ineficiente, (3) eficiente controle da replicação viral pelo sistema
imunológico do portador, e/ou (4) regulação da inflamação induzida pelo vírus que limita a
disponibilidade de células-alvos suscetíveis à infecção (Abdel-Mohsen et al., 2013).
Alguns trabalhos foram desenvolvidos para tentar entender esse fenótipo progressor.
Julg et al., (2010) demonstraram dados indicativos de que os linfócitos TCD4+ de
controladores de elite são facilmente infectados com HIV ex vivo, indicando que essas células
não apresentam resistência a infecção e que o vírus isolado desses indivíduos parece ter
replicação competente. Outro trabalho isolando partículas virais de CE observou que os vírus
desses indivíduos apresentam cinética de replicação normal in vitro, mostrando que cepas
virais defeituosas não são a principal causa desse fenômeno (Blankson et al., 2007).
Além disso, fatores genéticos do hospedeiro podem influenciar na eficácia da resposta
imunológica, afetando assim a progressão para a AIDS. Variantes nos genes dos Antígenos
Leucocitários Humanos (HLA) podem estar fortemente associados com o fenótipo LTNP,
como demonstrado no trabalho de Balana et al., (2012). Os genes de HLA de classe I
codificam moléculas da superfície celular de apresentação de antígeno para os linfócitos
TCD8+, assim, as variantes desse gene têm sido relacionadas a níveis elevados de expressão
dessa molécula na superfície da célula, contribuindo para uma apresentação de antígeno mais
eficaz e, consequentemente, um melhor controle da ação viral pelo indivíduo portador de
HIV.
31
Outro fator genético encontrado no hospedeiro é uma deleção de 32 pares de base no
gene que codifica o receptor CCR5 (CCR532). Esta mutação age como um fator limitante
no curso da infecção pelo HIV ao produzir uma proteína defeituosa, que impede a ligação da
gp120 viral com o correceptor na membrana celular, impossibilitando a entrada na célula. A
CCR532 em homozigose reduz o risco de infecção pelo HIV-1, não tendo sido observada
qualquer alteração imunológica para o portador da mutação. A deleção em heterozigose para
este polimorfismo está fortemente associada a uma progressão mais lenta para o estado de
AIDS (Liu et al., 1996; Zimmerman, 1997; Hütter et al., 2009).
Desta forma, o entendimento dos mecanismos de controle da progressão para a AIDS
nos LTNP revela-se um caminho promissor para o desenvolvimento de novos antirretrovirais,
assim como, a elaboração de vacinas que impeçam a progressão ou o estabelecimento da
doença e até mesmo fornecendo modelos para a busca da cura efetiva da infecção pelo HIV
(Pereyra et al., 2008, Abdel-Mohsen et al., 2013, Olson et al., 2014).
1.9 RESPOSTA IMUNOLÓGICA
A resposta imunológica inata constitui a primeira linha de defesa contra patógenos e
estimula a ativação e maturação da resposta adaptativa subsequente (Berg et al., 2012,
Carrington & Alter, 2012). As células dendríticas e as natural killer (NK) são os principais
mediadores da resposta imunológica, estimulando a diferenciação das células T específicas
nos diferentes perfis de resposta Th1, Th2 e Th17 contra agentes infecciosos como o HIV
(Altfeld et al., 2011).
O receptor toll-like 3 presente nas células dendríticas é ativado na presença do RNA
viral e estimula a produção de níveis elevados de IFN-α (interferon alfa), o TNF-α (fator de
necrose tumoral alfa) e as interleucinas 6 (IL-6) e 12 (IL-12), que bloqueiam a proliferação
viral, induzindo a ativação e o recrutamento de outras células do sistema imunológico, tais
como os granulócitos, macrófagos e linfócitos (Ferraz, 2011; Carrington & Alter, 2012). As
células NK agem impedindo a propagação dos vírus circulantes também pela produção de
citocinas como o interferon-gamma (IFN-), combatendo as células infectadas, através do seu
mecanismo de citotoxidade (Altfeld et al., 2011).
A ação do sistema imune inato é importante para a contenção das partículas virais
circulantes, no entanto, apesar da consequente diminuição da carga viral e o aumento do
32
número de linfócitos TCD4+, o sistema imunológico do hospedeiro não é capaz de impedir a
propagação da infecção (Mogensen et al, 2010, Berg et al., 2012).
O desenvolvimento de uma resposta mais específica contra o HIV acontece a partir da
terceira semana após o contato e é caracterizada pela expansão de linfócitos TCD8+
específicos contra o vírus, a fim de conter a infecção (Poropatich & Sullivan, 2011). A
imunidade humoral é dirigida contra epítopos virais e trabalha na produção de anticorpos
neutralizantes das partículas virais circulantes e consequentemente, na diminuição da carga
viral plasmática. Porém, a sua ação no controle da infecção se mostra ineficaz, exigindo alta
produção desses anticorpos (Liu et al., 2011).
Clerici & Shearer (1994) propuseram um modelo em que uma mudança na expressão
de citocinas de perfil Th1 têm efeitos protetores contra a infecção pelo HIV, através da
fagocitose e destruição do vírus, ao contrário do perfil Th2, onde uma resposta humoral
aumentada pode ser adversa e ineficaz na contenção da infecção de patógenos intracelulares,
o que levaria a uma rápida progressão para a AIDS, uma vez que a imunidade celular parece
ser mais eficaz contra as infecções por agentes patogênicos intracelulares.
Nesse contexto, as citocinas têm papel fundamental no direcionamento do tipo de
resposta a ser estabelecida, já que apresentam o papel de mediadores solúveis do sistema
imunológico que regulam eventos como inflamações, alergias, e contribuem na regulação do
sistema imunológico (Soufian et al., 2012).
O perfil Th1 é caracterizado pela produção, principalmente, de IFN-, IL-2 e IL-12,
que promovem respostas efetoras no combate a patógenos intracelulares. Em contraste, o
perfil Th2 é marcado pela produção de algumas interleucinas, tais como IL-4, IL-5, IL-9, IL-
10 e IL-13, que influenciam no desenvolvimento de respostas humorais (Clerici et al., 1996).
Os perfis de diferenciação de células T apresentam respostas antagônicas em relação uma as
outras, com IFN- exercendo efeito supressor na expressão de citocinas de perfil Th2, da
mesma maneira que IL-10 parece promover a diminuição da expressão de citocinas Th1
(Clerici & Shearer, 1993; Roff et al., 2014).
No caso dos LTNP, alguns trabalhos mostraram um significativo aumento na
produção de citocinas de perfil Th1 e redução do perfil Th2, quando comparados com
indivíduos com progressão típica para a AIDS (Clerici et al., 1996). Evidenciando que o
balanço dos perfis é essencial para curso da infecção viral (Soufian et al., 2012).
O perfil Th17 é representado pela interleucinas IL-17, IL-20 e IL-21, que estão
envolvidas na resposta pró-inflamatória contra as infecções microbianas nos tecidos linfóides
33
associados ao trato gastrointestinal (GALT). Estas interleucinas estimulam o recrutamento de
neutrófilos para o sítio da infecção, através da secreção de citocinas e quimiocinas que
promovem a fagocitose e a destruição dos patógenos (Harrington et al., 2005). Ndhlovu et al.,
(2008), observaram que crianças portadoras de HIV com carga viral menor que 50 cópias/ml
apresentavam níveis detectáveis de IL-17, em contraste com aquelas com níveis mais
elevados de viremia, evidenciando que a manutenção dos níveis de Th17 podem auxiliar
numa progressão mais lenta da doença. Em outro estudo, a comparação entre LTNP e
progressores típicos também mostrou aumento do número de células Th17 nos LTNP,
demonstrando que esta citocina pode conduzir a uma resposta imune mais preservada,
principalmente contra infecções bacterianas (Salgado et al., 2011).
Apesar da grande diversidade de estudos sobre os mecanismos imunológicos
envolvidos na resposta contra a infecção pelo HIV, a interação entre os tipos de respostas
Th1, Th2 e Th17 envolvidos na patogênese viral, bem como, a sua relação com as mutações
genéticas encontradas nas cepas de HIV, precisam ser mais bem caracterizadas, a fim de
melhora o entendimento sobre a interação desse conjunto de fatores e sua influência no
desenvolvimento de diferentes perfis de progressão para a AIDS.
1.9.1 Mutações de escape da resposta imunológica
O HIV apresenta uma alta taxa de replicação e não possui mecanismos eficientes de
correção durante a sua transcrição reversa, o que pode inserir muitos erros no seu genoma, o
que contribui para a ocorrência de mutações (Coffin, 1995; Dapp et al., 2013). Embora a
maioria das mutações atribua efeitos deletérios sobre a replicação do vírus e sejam eliminadas
por seleção negativa, algumas mutações conferem vantagem, sendo transmitidas e fixadas
(Domingos & Holland, 1997; Roos & Rodrigo, 2002).
Consequentemente, este aumento contínuo da diversidade genética permite com que o
vírus se adapte rapidamente a uma variedade de pressões de seleção impostas pelo ambiente
hostil e flutuante no interior do organismo do hospedeiro, em meio a fatores de defesa
imunológica dos componentes da resposta tanto inata quanto adaptativa, que tentam conter a
propagação do vírus para evitar o estabelecimento de uma infecção crônica (Koup et al.,
1994; Yu et al., 2004; Boutwell et al., 2011). Esse conjunto de fatores da imunidade do
hospedeiro exerce uma grande força seletiva à condução da evolução e diversificação do HIV
em nível individual e populacional (Migueles et al., 2000; Miura et al. 2009; Le et al., 2014).
34
A imunidade antiviral adaptativa é mediada diretamente por dois fatores: os linfócitos
citotóxicos TCD8+
(CTL), que destroem células infectadas que expressam peptídeos virais
ligados ao MHC (Major Histocompatibility Complex) de classe I e pela produção de
anticorpos neutralizantes pelos linfócitos B (Phillips et al.,, 2001). Esses dois fatores quando
somados, contribuem para a diversidade viral, influenciando na seleção de formas virais
capazes de escapar do sistema imune (Price et al., 1997; Frost et al., 2005; Pillay & Phillips,
2005; O´Connor et al., 2002). Alguns trabalhos mostram que, os anticorpos neutralizantes não
contribuem em longo prazo para a contenção de vírus, provavelmente, devido ao rápido
surgimento de mutantes resistentes à neutralização (Wei et al., 2003; Le et al., 2014).
Com isso, a resposta CTL desempenha um papel central no controle da infecção pelo
HIV (Goulder & Watkins, 2004). Diversos estudos mostraram que mutações de escape da
resposta CTL de uma maneira geral levariam a uma rápida progressão para AIDS (Barouch et
al., 2002; Goulder et al., 1997; Koenig et al., 1995). Em contraste, outros estudos
demonstraram que esse escape desencadeava no decorrer da infecção pelo vírus um controle
subsequente de viremia (Fernandez et al., 2005; Friedrich et al., 2004; Leslie et al., 2004;
Matano et al., 2004). Isso pode ser explicado, pois, o surgimento de mutações de escape das
respostas imunológicas confere um benefício físico claro para o vírus, representando custos
na aptidão viral, o que define o “fitness” viral, que seria a habilidade de um dado genótipo
produzir progênie infecciosa em um determinado microambiente, sendo necessário que ocorra
um balanço entre a seleção de genótipos virais que apresentam mutações de escapes
imunológicos e a eficiência de replicação, sendo muita das vezes características inversamente
proporcionais (Troyer et al., 2005; Quiñones-Mateu & Arts, 2006; Sunshine et al., 2015).
Com isso, fatores associados com a genética do hospedeiro são de extrema
importância para o desempenho viral. Além da mutação CCR532 já citada anteriormente, a
presença de HLA protetivo como o HLA-B*57 e o HLA-B*27 estão associados com menores
cargas virais e progressão mais lenta para a AIDS, enquanto que HLA-B*35 está associado a
rápida progressão da doença (Migueles et al., 2000; Kiepiela et al., 2007; Carrington &
O'Brien, 2003; Lobritz et al., 2011; Le et al., 2014). Estudos ao nível populacional revelaram
que algumas substituições de aminoácidos no vírus são mutações adaptadas ao HLA,
destacando o papel fundamental do sistema imunológico na condução da evolução do HIV-1
in vivo (Carlson et al., 2012; Chikata et al., 2014; Kawashima et al., 2009; Moore et al.,
2002). As mutações CTL podem ser revertidas após a transmissão para outro hospedeiro na
35
ausência de pressão seletiva do HLA protetivo, pois, o custo e benefício para o fitness do
vírus em “manter” essas mutações acaba sendo elevado (Friedrich et al., 2004).
1.10 TERAPIA ANTIRRETROVIRAL
Os medicamentos que compõe a terapia antirretroviral altamente ativa (TARV) têm
como objetivo bloquear a maioria das etapas do ciclo replicativo do HIV, impedindo a entrada
do vírus na célula-alvo ou interrompendo os passos da replicação (Diaz & Vázquez, 2012;
Cohen et al., 2011; Figura 10).
A TARV é uma combinação de medicamentos de diferentes classes, visando aumentar
a eficácia no bloqueio da infecção pelo HIV e diminuindo os níveis plasmáticos do vírus
(Ferreira et al, 2010). Esses antirretrovirais podem ser divididos em cinco diferentes classes:
os inibidores da transcriptase reversa análogos de nucleosídeos (ITRN), os inibidores da
transcriptase reversa não análogos de nucleosídeos (ITRNN), os inibidores da protease (IP),
os inibidores de fusão (IF) e os inibidores da integrase (INI) (Ferreira et al., 2010; Diaz &
Vázquez, 2012) .
Os ITRN foram os primeiros medicamentos desenvolvidos para o tratamento da AIDS
em 1987. Estes fármacos mimetizam os nucleosídeos naturais existentes nas células humanas,
os quais participam do processo de transcrição reversa do HIV no citoplasma da célula
hospedeira. Durante a formação do DNA proviral pelo processo de transcrição reversa, os
ITRN fosforilados irão competir com os nucleosídeos naturais celulares e, ao serem
incorporados, atuam como terminadores de cadeia, impossibilitando as ligações nucleosídicas
subsequentes, desestabilizando a cadeia e, consequentemente, interrompem o ciclo replicativo
do vírus (Farias et al., 2006). A maioria dos esquemas de TARV utilizam dois ITRN em sua
composição, sendo os principais tipos disponíveis zidovudina, azidotimidina e estavudina,
análogos de timidina, didanosina, lamivudina, entricitabina e o tenofovir (Diaz & Vázquez,
2012).
36
Figura 10 – Sítios de ação dos antirretrovirais durante as diversas fases do ciclo replicativo do
HIV (Gonzalo-Gil et al., 2017).
Já os ITRNN se ligam próximo ao sítio ativo da RT, fazendo com que uma alteração
alostérica na enzima interfira na polimerização, inibindo diretamente a ação da enzima RT.
Os representantes dessa classe são nevirapina (NVP), efavirenz (EFV), etravirina (ETR) e
rilpivirina (RPV) (Diaz & Vázquez, 2012; Günthard et al., 2014).
Os IP foram desenvolvidos em 1995 e possibilitaram a primeira combinação de
medicamentos de classes diferentes para o tratamento da infecção pelo HIV. Esses
medicamentos atuam bloqueando o processo final de clivagem exercido pela protease viral, o
que leva a produção de partículas virais incompletas e que são incapazes de infectar novas
células. Os principais representantes dos IP são o ritonavir, lopinavir, saquinavir e o tipranavir
(Simon et al., 2006; Diaz & Vázquez, 2012).
Os IF atuam antes da entrada do vírus na célula-alvo e tem como função impedir a
ligação do vírus aos receptores celulares, a fim de evitar a entrada da partícula viral no
citoplasma da célula. Um dos representantes desse grupo é a enfuvirtida que consiste em um
37
peptídeo sintético, cuja sequência deriva de uma parte da gp41 do HIV-1. Esta glicoproteína
está envolvida na fusão da membrana viral com a membrana celular do hospedeiro através da
ligação aos correceptores CCR5 e CXCR4. Quando administrado, esse fármaco se liga aos
correceptores de superfície da célula humana, bloqueando a ligação da gp41 viral e
impossibilitando o processo de entrada do vírus e, consequentemente, a sua replicação (Simon
et al., 2006; Diaz & Vázquez, 2012).
Outro IF é o maraviroque, que apresenta a função de bloquear o receptor de
quimiocina CCR5, agindo de forma similar ao enfuvirtida. No entanto, esse fármaco é eficaz
apenas no tratamento de infecções por cepas virais com tropismo para CCR5, sendo assim,
aconselhável a realização de ensaios para determinação do tropismo viral até no máximo três
meses antes do início do tratamento. O uso dos IF é recomendado no caso de indivíduos que
possuem infecção por cepas virais resistentes a múltiplas classes de antirretrovirais (Miranda
et al., 2010; Brasil, 2013, Nota técnica).
Os INI bloqueiam a atividade da integrase que é a enzima responsável pela integração
do DNA viral ao genoma da célula infectada, impedindo com isso a transcrição do DNA viral
pela maquinaria da célula hospedeira. Nesta classe estão inseridos o Raltegravir, Dolutegravir
e o Elvitegravir (Diaz & Vázquez, 2012, Günthard et al., 2014).
A TARV geralmente inicia com a combinação de três fármacos, sendo dois ITRN
associados a um ITRNN ou a um IP. A escolha da TARV deve ser adequada para cada
paciente, levando em consideração o histórico das terapias já utilizadas, histórico de
abandono, perfil de resistência aos antirretrovirais, existência de comorbidades, hábitos e
estilo de vida de cada paciente (Ferreira et al., 2010, Diaz & Vázquez, 2012).
Os critérios recomendados para o início da administração de TARV visam minimizar
os riscos de infecções oportunistas e de transmissão do HIV, promover uma progressão mais
lenta para AIDS e reduzir as chances de óbito (Brasil, 2013, Protocolo terapêutico, Gürthard
et al., 2014). A partir de 2013 o Ministério da Saúde brasileiro tem como política a
abordagem “test and treat”, que enfatiza a utilização dos testes rápidos para o diagnóstico do
HIV e o tratamento antirretroviral nos estágios iniciais da doença, independente da contagem
de linfócitos T CD4+ (Goldman et al., 2014). Essa abordagem visa à redução da
morbimortalidade com o início mais precoce de TARV, além de ser uma importante
ferramenta para a redução da transmissão do HIV, já que a TARV atua diretamente na
diminuição dos níveis plasmáticos da carga viral (Dieffenbach & Fauci, 2009).
38
1.11 OBJETIVOS
1.11.1 Objetivo geral
Descrever fatores de risco virológico e imunológico entre portadores do HIV-1, de
acordo com suas características de progressão para a AIDS, visando relacionar a influência
desses fatores com o desenvolvimento da infecção.
1.11.2 Objetivos específicos
i – Caracterizar os grupos de portadores, quanto ao perfil de progressão de acordo com as
contagens de linfócitos TCD4+, TCD8
+ e a determinação de carga viral plasmática do HIV-1;
ii – Avaliar os níveis de linfócitos TCD4+ e TCD8
+ entre portadores de HIV-1 com diferentes
perfis de progressão e uma população controle não infectada com o vírus;
iii – Associar a progressão da doença com a determinação quantitativa das citocinas Th1
(IFN- e IL-2), Th2 (IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 e IL-13) e Th17 (IL-17);
iv – Identificar os subtipos do HIV-1 nas amostras analisadas;
v – Descrever o perfil das mutações de escape imunológico no genoma viral;
vi – Relacionar as mutações de escape imunológico encontradas com o perfil de progressão.
39
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 TIPO DE ESTUDO E CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS
O presente estudo é do tipo transversal e retrospectivo, sendo utilizadas amostras
pertencentes ao acervo do Laboratório de Virologia, do Instituto de Ciências Biológicas, da
Universidade Federal do Pará que foram coletadas no período de 2007 a 2011 na Unidade de
Referência Especializada em Doenças Infecciosas e Parasitárias Especiais (URE-DIPE) e
encaminhadas ao laboratório para a realização da contagem de linfócitos TCD4+ e TCD8
+ e
carga viral plasmática, através da Rede Nacional de Contagem de Linfócitos CD4+/CD8
+ e
Carga Viral do Ministério da Saúde.
A seleção partiu de um banco contendo 300 amostras de indivíduos portadores de
HIV-1 com o diagnóstico confirmado para a infecção. Para a inclusão dos indivíduos nesta
pesquisa estes deveriam ser maiores de 18 anos, de ambos os sexos, com mais de seis anos de
infecção no momento da coleta da amostra, possuir, no mínimo, três anos de resultados de
quantificação de carga viral e linfócitos TCD4+
e TCD8+ e serem virgens de tratamento
(TARV). Ao final da aplicação dos critérios citados acima descritos, obteve-se um
quantitativo de 30 indivíduos que compuseram o número amostral deste estudo, sendo
divididos em três grupos de progressão para a AIDS, de acordo com os critérios contidos no
quadro 2, onde 2 pertenciam ao grupo controladores de viremia 1 (CV1), 7 ao grupo de
controladores de viremia 2 (CV2) e 21 ao agrupo de não controladores de viremia (NCV).
As informações sobre o uso de TARV e esquema terapêutico foram obtidas através da
análise dos prontuários e dos dados incluídos no Sistema de Controle Logístico de
Medicamentos Antirretrovirais (SICLOM) do Ministério da Saúde.
40
Quadro 2 – Critério de classificação dos indivíduos portadores de HIV quanto a sua progressão para a AIDS.
Grupos de progressão para a AIDS Tempo
de
infecção*
Tempo de coleta
de dados
Uso de
TARV
Quantificação
de LT CD4+
Quantificação de
carga viral
Observações importantes
CV1
Controladores de viremia 1
(Controlador de Elite)
> 6 anos A partir de 2007
(c/ mínimo de 3
anos de dados)
Sem TARV > 500 cel/mm³ < 50 cópias/mL Sem episódios de aumento de CV
e quantificação de LT CD4+ > 500
em 90 % das contagens.
CV2
Controladores de viremia 2
> 6 anos A partir de 2007
(c/ mínimo de 3
anos de dados)
Sem TARV > 500 cel/mm³ ≤ Log 4 (até
10.000
cópias/mL)
Episódios de aumento de CV ou
diminuição de LT CD4+,
independente do nº de
ocorrências, mas c/ remissão
natural, sem intervenção de
TARV e que representem no
máximo 50% das quantificações.
NCV
Não controlador de Viremia
> 6 anos A partir de 2007
(c/ mínimo de 3
anos de dados)
Sem TARV < 500 cel/mm³ > Log 4 (maior
que 10.000
cópias/mL)
*Compreende o período entre a data da primeira sorologia positiva e a data da coleta da amostra.
41
2.2 GRUPO CONTROLE NÃO INFECTADO COM O HIV-1
Foram utilizadas amostras de um grupo controle de 300 indivíduos não infectados com
o HIV-1, doadores de sangue aptos oriundos do Centro de Hemoterapia e Hematologia do
Pará – Fundação HEMOPA com finalidade de comparar as contagens de linfócitos TCD4+ e
TCD8+. O grupo controle foi pareado por sexo e idade com o grupo de HIV-1.
2.3 COLETA, PROCESSAMENTO E ARMAZENAMENTO DAS AMOSTRAS
A coleta das amostras foi realizada no período de 2007 a 2011 na URE-DIPE,
utilizando um sistema de colheita a vácuo, em tubos de 5 mL contendo EDTA como
anticoagulante. A separação do plasma e massa celular foi feita no Laboratório de Virologia
da UFPA por centrifugação a 3.000 rotações por minuto (RPM) durante 10 minutos e
posteriormente estocadas a -20º C até o momento da realização dos testes.
2.4 QUANTIFICAÇÃO DE LINFÓCITOS TCD4+ e TCD8
+ E DA CARGA VIRAL
PLASMÁTICA DO HIV-1
Foi realizado o levantamento do histórico das quantificações de LTCD4+ e TCD8
+ e a
carga viral plasmática dos indivíduos infectados, através do banco de dados do Sistema de
Controle de Exames Laboratoriais da Rede Nacional de Contagem de Linfócitos CD4+/CD8
+
e Carga Viral (SISCEL). Foram considerados todos os resultados de exames realizados pelo
indivíduo desde a sua entrada para acompanhamento na Rede Nacional até o momento de
início de TARV, sendo desconsideradas as quantificações posteriores à data de início de
tratamento.
Foi realizada a quantificação de linfócitos TCD4+ e TCD8
+ do grupo controle não
infectada pelo HIV-1 como parâmetro de comparação.
A determinação da carga viral plasmática foi efetuada seguindo metodologia padrão
da Rede Nacional de Carga Viral do Ministério da Saúde que obedece desde 2013 a
tecnologia de amplificação por PCR em tempo real, utilizando o Kit de Extração Sample
Purific CV HIV-1 (ABBOTT) e o Kit de Amplificação da Carga Viral do HIV-1 (ABBOTT).
As quantificações de carga viral foram trabalhadas em cópias/ml e log10
e divididas em quatro
categorias quantitativas para comparação que são: <50, 51-1.000, 1.001-10.000 e >10.000.
O nível de linfócitos TCD4+ e TCD8
+ foi determinado através da metodologia de
citometria de fluxo utilizando equipamento BD FACSCalibur e os kits de monitoramento
FACSCountTM Reagents e TriTEST™/TruCount (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA),
42
padrão na Rede Nacional do Ministério da Saúde. As quantificações de linfócitos TCD4+ e
TCD8+
foram trabalhadas em cel/mm3.
2.5 DOSAGEM DE CITOCINAS
As dosagens dos níveis plasmáticos das citocinas foram realizadas para determinação
quantitativa das concentrações de IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17A e IFN-γ
no plasma, utilizando o kit Human Th1/Th2/Th17 Magnetic 8-Plex Panel (Novex – Life
Technologies) e leitura em sistema LUMINEX 200 (Luminex), obedecendo aos protocolos do
fabricante. As quantificações das citocinas foram trabalhadas na unidade de pg/L.
2.6 MÉTODOS DE BIOLOGIA MOLECULAR
2.6.1 Extração do DNA
A extração do DNA total foi realizada a partir do sangue total das amostras estocadas
com o kit de extração Biopur Mini Spin Plus (Biometrix, Brasil), seguindo os procedimentos
técnicos recomendados pelo fabricante.
2.6.2 Amplificação do genoma viral
O genoma do HIV-1 foi amplificado por NestedPCR, utilizando os iniciadores
descritos por Sierra, Thomson, Ríos et al. (2005), sendo o genoma viral dividido em quatro
regiões, como demonstrado no Quadro 3. A reação de amplificação foi realizada em um
volume de 50 μL contendo 10 ng de DNA extraído, 200 Mm de cada dNTP, 200 nmol de
cada iniciador, KCl2 50 mM, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl pH 8,3 e 1 U de Taq DNA
polimerase para ambos os rounds.
2.6.3 Eletroforese
Os produtos das amplificações foram visualizados após eletroforese (100 V/45
minutos) em gel de agarose a 1,5% em tampão TAE 1x (TAE 50x estoque – TrisBase 1,6 M,
Acetato de Na 0,8 M e EDTA-Na2 40 mM/1000 mL água deionizada), contendo 5 µl de
corante GelRed™ Nucleic Acid Gel Stain, 10.000X (Biotium, EUA), mediante a utilização de
transluminador com fonte de luz ultra-violeta.
43
2.6.4 Purificação dos produtos amplificados
Os produtos amplificados foram purificados a partir de fragmento do gel de agarose
para a remoção de impurezas e produtos inespecíficos para não interferir no sequenciamento
das amostras. Para isso, foi utilizado o kit de purificação PureLink Quick Gel Extraction Kit
(Thermo Fisher Scientific, USA), seguindo os procedimentos técnicos recomendados pelo
fabricante.
2.7 SEQUENCIAMENTO
A metodologia empregada para o sequenciamento das amostras foi a plataforma Ion
PGM™ System (Life Technologies) baseado no protocolo para a preparação de amostra Ion
Xpress Plus gDNA Fragment Library Preparation (Life Technologies), capaz de processar
sequências longas de DNA e gerar altas taxas de cobertura no sequenciamento. Para o
sequenciamento foram realizadas as seguintes etapas: Preparação da Biblioteca, preparação
dos moldes e carregamento do chip. As amostras foram carregadas em um chip Ion 314 (Life
Technologies) com capacidade para 100mb de leitura no sequenciamento.
2.8 ANÁLISE DAS SEQUÊNCIAS NUCLEOTÍDICAS
2.8.1 Edição e alinhamento das sequências
A revisão e alinhamento nucleotídicos para a obtenção das sequências consensos
foram realizadas com auxílio do programa Geneious 8.1.2 (Kearse et al., 2012) e o genoma
foi posteriormente curado manualmente, tendo como referência utilizada para o mapeamento
o genoma viral do HIV-1 (NC_001802).
44
Quadro 3 – Sequência dos iniciadores utilizados para a amplificação do genoma do HIV-1 (Sierra, Thomson, Ríos et al., 2005).
Iniciadores Sequência (5’-3’) Posição
(nt)
Tamanho do produto
(pb)
Temperatura de
hibridização
A1F
A1R
GGGACTTTCCGCTGGGGACTTTC
TTTATGGCAAATACTGGAGTATTGTATGGA
350–372
2711–2740 2.391
55°C A2F
A2R
CGAGCCCTCAGATGCTGCATATAAGC
CTTTTGGGCCATCCATTCCTG
408–433
2590–2610 2.203
B1F
B1R
GCTAATTTTTTAGGGAAGATCTGGCCTT
TCTCCTGTATGCAGACCCCAATATGT
2080–2107
5242–5267 3.188
57°C
B2F
B2R
AGCCCCACCAGAAGAGAGCTT
CCCTAGTGGGATGTGTACTTCTGAACTTA
2157–2177
5192–5220 3.064
C1F
C1R
TACAGTGCAGGGGAAAGAATAATAGACATAATA
TGTCTGGCCTGTACCGTCAGCG
4809–4891
7831–7852 3.044
C2F
C2R
CAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACA
GCTTCCTGCTGCTCCCAAGAACC
4890–4917
7786–7808 2.919
D1F
D1R
TTGAACCAYTAGGAGTAGCACCCAC
AGTCACACAACAGACGGGCACACAC
7696–7720
9641–9665 1.970
58°C D2F
D2R
ACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTG
ACGTGCCCTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGCT
7719–7742
9606–9630 1.911
nt, nucleotídeos, bp, pares de bases.
45
2.8.2 Análise filogenética
Para a determinação dos subtipos do HIV-1 as sequências geradas foram submetidas à
análises filogenéticas. As inferências filogenéticas foram realizadas pelo método de análise
Beasiana, através do programa Beast 1.8.2 (Drummond et al., 2012) com um bootstrap
baseado em 1000 reamostragens para determinação da consistência dos ramo.
2.8.3 Identificação de mutações de escape
A seleção das mutações relacionadas à resposta CTL foi realizada com base no banco
de dados de epítopos disponível em Los Alamos HIV Immunology Database
(https://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/index.html) e através de artigos disponíveis
na literatura. Para cada indivíduo, foram realizados alinhamentos das sequências de
aminoácidos e analisados manualmente para cada epítopo escolhido. As tabelas com a
descrição as mutações selecionadas para análise seus respectivos epítopos e localizações estão
representados nos quadros 4 e 5.
A qualidade do sequenciamento variou entre as regiões gênicas, o que influenciou no
quantitativo de amostras analisadas, sendo: 16 amostras para o gene gag, 10 para o gene rev,
9 para tat, 10 para o gene nef, 9 para vif , 11 para vpr e 9 para o gene vpu.
2.8.4 Modelagem tridimensional de proteínas
A estrutura proteica tridimensional foi construída utilizando-se a modelagem de
proteínas por homologia através do software Modeller 9.15 (Sali & Blundell, 1993). Com
uma busca inicial e seleção de templates utilizando o Protein Database Bank
(https://www.rcsb.org/pdb/home/home.do), aplicando a sequência da proteína p24 do HIV
como parâmetro inicial. O template selecionado foi o 5HGK. A visualização e produção das
imagens foram realizadas utilizando-se o software PYMOL 1.8 (Delano, 2002).
46
Quadro 4 – Epítopos proteicos do gene gag do HIV que apresentam mutações relacionadas
(aminoácido variante) ao escape CTL e seus HLA relacionados.
Gene Epítopo Posição Aminoácido
original
Aminoácido
variante HLA associado
gag
IW9
146 A P/S B*57, B*13
147 S T B*57
148 I X B*57; B*13
163 A N/G B*57
KF11 166 P Q B*57
TL9
182 Q E/G/T/S B*07; B*42; B*81
184 L X B*81
186 T S B*07; B*42; B*81
TW10
242 T N B*57; B*58
244 Q A B*57; B*58
247 I X B*57; B*58
248 A/G Q/T B*58
NY10 256 I V B*35
KK10
260 E D B*27; B*35
264 R X B*27
268 L M B*27
QW9 310 T S B*57
312 D E B*57
NI9 326 A S B*51
GL9 357 S G B*07
QK10 380 R K B*27
383 F Y B*27
RI9 436 K L/R B*13
437 I X B*13
47
Quadro 5 – Epítopos proteicos dos genes rev, tat, nef,vif, vpr e vpu do HIV que apresentam
mutações relacionadas (aminoácido variante) ao escape CTL e seus HLA relacionados.
Gene Epítopo Posição Aminoácido
original
Aminoácido
variante HLA associado
rev
TY9 17 R K/Q A*03
LI9 21 I F B*57
SL9 71 V G Cw*05
QV9
105 E G A*02
106 P H A*02
108 T P A*02
tat
PW9 7 R S/K A*25
9 E D A*25
NF9
24 N X A*29
29 K R/Q A*29
30 C Y A*29
32 Y/F C/L A*29; Cw*12
CC8 36 V X Cw*12
nef
RM9 71 R T B*07
77 R K B*42
QY9
78 P A B*35
80 T N A*03
81 Y F/H A*03; B*07; B*35
KF9 83 A G B*57; B*58
90 F X B*08; B*57
FT9 120 F Y B*51
125 K X B*51
VL10 184 R K A*02; B*15; B*27
WF9 188 R X B*27
vif
RK10 13 V I
A*03 19 R S/N
SY9 33 K G/Q/R B*15
HI10 50 R K B*07
SV10 55 V T B*07
LL9 81 L M B*35
KK11 159 R T/G A*03; B*27
RK11 166 I V A*03
167 A T A*03
vpr
VL9 32 R K B*27
36 R G/X/W B*27
EI9 37 I L/P/A/V B*07; B*51; B*57
AL9 63 I S/M A*02
vpu
Sítio
conservado
52 S X
56 S X
AA9 75 A V A*2
HL9 82 L M Cw*0102
48
2.11 MÉTODOS ESTATÍSTICOS
A análise estatística foi realizada utilizando dois softwares, GraphPad Prism versão
5.0 e BioEstat versão 5.3 (Ayres et al., 2011).
Todas as contagens de LTCD4+, LTCD8
+ e carga viral disponíveis para todos os
indivíduos foram utilizadas para as comparações. Para comparar as contagens de LTCD4+,
LTCD8+
e suas razões entre os grupos, assim como as diferenças dos níveis de citocina foi
utilizado o Teste Mann-Whitney. O Teste Qui-quadrado e Análise de resíduos foram
utilizados para avaliar a associação da carga viral plasmática de HIV-1 entre os grupos de
controladores (CV) e não controladores (NC).
Para todos os testes estatísticos utilizados o nível de significância considerou-se o
valor de p <0,05.
2.12 ASPECTOS ÉTICOS
O presente projeto foi submetido a aprovação no Comitê de Ética em Pesquisas do
Núcleo de Medicina Tropical – NMT da Universidade Federal do Pará e obedeceu as
resoluções vigentes 196/1996 e 347/2005, ambas do Conselho Nacional de Saúde, conforme
cópia de parecer em anexo (Anexo).
49
3 RESULTADOS
3.1 CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA DOS PORTADORES DE HIV-1
3.1.1 Avaliação das quantificações de linfócitos TCD4+ e TCD8
+ e da carga viral
plasmática
As características de sexo e idade dos 30 portadores de HIV-1 que participaram desta
pesquisa estão demonstradas no quadro 6. Para o grupo CV1 o sexo estava distribuído em
uma proporção 1:1 com idade de 52 anos para o homem e 45 anos para a mulher. Em CV2, o
sexo feminino foi o mais numeroso (4/7) com faixa etária de 35 a 53 anos. Já para NCV o
sexo masculino foi o mais encontrado (11/21) com faixa etária de 28 a 68 anos. Estas
informações de sexo e idade foram utilizadas como base para o pareamento dos controles
saudáveis não infectados com HIV como modo de comparação com as quantificações de
linfócitos TCD4+, TCD8
+ e relação entre as contagens de linfócitos TCD4
+/TCD8
+.
Quadro 6 – Distribuição em sexo e faixa etária dos indivíduos portadores de HIV de acordo
como o perfil de progressão para a AIDS.
Grupos de progressão para
a AIDS
Sexo Faixa etária
masculina
Faixa etária
feminina Masculino Feminino
CV1 1 1 52 45
CV2 3 4 34 – 47 35 – 53
NCV 11 10 28 – 68 24 – 68
Foram considerados todos os valores individuais das quantificações de linfócitos
TCD4+ e TCD8
+ presentes no histórico dos pacientes do estudo até o momento do início da
TARV, desta forma, constou no gráfico das quantificações de linfócitos mais de um ponto
(valor da quantificação) por indivíduo. Foram também avaliadas as contagens de linfócitos,
após o pareamento de sexo e idade, de um ou mais indivíduos controles não infectados com
HIV-1. As medianas das contagens de LTCD4+ nos controladores de viremia, tanto CV1 e
CV2, apresentaram valores maiores (839 e 673, respectivamente) em comparação com o NCV
(370; p<0,0001), embora ainda fossem significativamente menores (p=0,0350 e p<0,0001)
quando comparados aos seus controles individuais não infectados (1166, 1114 e 1110,
50
respectivamente, Figuras 11A e 11B), sendo observada diferença estatística, também, entre os
níveis de TCD4+ dos dois grupos de progressão lenta, CV1 e CV2 (p=0,0155; Figura 11A).
Para os linfócitos TCD8+ os maiores valores de quantificações encontravam-se no
grupo CV1 (mediana 1014). Contudo, somente foi observada diferença estatística quando
comparado às medianas dos grupos de portadores de HIV-1 (CV1, 1014; CV2, 903; NC,
915,5) e com seus controles (660, 674, 660, respectivamente), estes últimos apresentando
menores níveis de linfócitos T citotóxicos (Figura 11C e 11D).
A relação de TCD4+/TCD8
+ foi maior e estatisticamente significativa nos grupos de
progressão lenta CV1 (0,73) e CV2 (0,82) quando comparado ao grupo de progressão rápida
NCV (0,42; p<0,0001). Ademais, as medianas dos grupos controles mostraram valores
significativamente maiores que os de seus grupos infectados (1,83, 1,64, 1,76; p<0,0001,
Figura 11E e 11F).
51
Figura 11 – Quantificação de LTCD4+, LTCD8
+ e a relação de LTCD4
+/TCD8
+ entre os
grupos investigados. A, C e E comparação entre os grupos virais (CV1, CV2 e NC); B, D e F
comparação entre grupos virais e um grupo controle não infectado (CTRL) pareado quanto
sexo e idade. *Mann-Whitney (p<0,05).
52
A carga viral plasmática do HIV-1 de CV1 foi consistentemente abaixo do limite de
detecção dos testes utilizados para a quantificação de ácido nucléico viral ao longo do período
de observação. A Tabela 1 mostra a distribuição de frequência de CV (CV1 e CV2) e NCV de
acordo com quatro categorias, variando de indetectável a valores superiores a log104 (>10.000
cópias/mL). A frequência de valores de carga viral indetectáveis e mais baixas (até log102) foi
significativamente diferente entre os dois grupos (análise de resíduos p>1,96, indicando que
há um número menor de pessoas do que o esperado). A frequência de cargas virais mais altas
foi significativamente diferente (análise de resíduos p<1,96, indicando que há um número
maior de pessoas do que o esperado) entre o grupo NCV, conforme medido pela análise de
resíduos.
Tabela 1 – Frequência da carga viral plasmática de acordo com os grupos infectados pelo
HIV-1 (controlador de viremia – CV e não controlador de viremia – NCV) investigados.
Carga viral CV (1+2) % NCV % χ
2 (p)
< 50 13 (+) 22 8 (-) 5
57,01
(<0,0001)
51 – 1000 19 (+) 32 14 (-) 10
1001 – 10000 28 (+) 46 45(-) 32
> 10000 0 (-) 0.0 75 (+) 53
Total 60 100 142 100
Análise de resíduos (para o nível de significância, os valores devem ser > 1,96 ou <-1,96;
nível alfa 0,05); (+) Associação significativa positiva; (-) associação negativa significativa;
CV (1 + 2): controlador de viremia 1 e controlador de viremia 2; NCV: não controlador de
viremia.
3.1.2 Avaliação dos níveis plasmáticos das citocinas
Para a avaliação quanto aos níveis plasmáticos das citocinas IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5,
IL-9, IL-10, IL-13 e IL-17, os indivíduos portadores de HIV foram divididos em dois grupos
53
com relação à progressão da doença, CV (CV1 e CV2) e NC, para que fosse possível
comparação e a aplicação de teste estatístico.
O grupo NCV apresentou níveis mais altos para quase todas as citocinas analisadas,
com significância estatística para IL-4 (p=0,0362). No entanto, os níveis plasmáticos de IFN-γ
(mediana de 1 pg/L) foram significativamente mais elevados no grupo CV quando
comparados ao NCV (2,5 pg/L; p= 0,0393; Figura 12A).
Para a avaliação das citocinas em conjunto foi realizada a análise heatmap por perfil
Th1 (IFN-γ e IL-2), Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, IL-13) e Th17 (IL-17) entre os grupos
estudados, sendo possível observar que as maiores concentrações do perfil Th1 (IFN-γ)
ocorreram no grupo dos CV, enquanto que o perfil Th2 foi predominante no grupo NCV. O
perfil Th17 não mostrou concentração acentuada em ambos os grupos, sendo apenas
observadas dosagens aumentadas em amostras pontuais no grupo NCV (Figura 12B).
A comparação entre os perfis imunológicos, Th1 e Th2, dentro do grupo CV não
mostrou significância estatística quando avaliados (Figura 12C). Entretanto para NCV, as
concentrações do perfil Th1 (IFN-γ1 e IL-2
2) apresentaram menores níveis e foram
estatisticamente significativas quando comparado com Th2 entre as citocinas IL-4 (15 pg/L;
p<0,00011; p<0,0001
2), IL-5 (2 pg/L; p=0,0372
1; p=0,0033
2), IL-9 (4 pg/L; p=0,0060
1;
p<0,00012) e IL-10 (4 pg/L; p 0,0157
1; p=0,0025
2; Figura 12D).
54
Figura 12 - Concentração plasmática e comparação das citocinas Th1, Th2 e Th17 nos grupos
investigados. Concentração plasmática de citocinas entre os grupos CV e NCV (A);
comparação dos perfis Th1, Th2 e TH 17 nos dois grupos (B); Comparação dos perfis Th1e
Th2 em cada grupo (C e D). *Mann-Whitney (p<0,05). CV (controladores de viremia); NCV
(não controladores de viremia).
55
3.2 CARACTERIZAÇÃO VIROLÓGICA DOS PORTADORES DE HIV-1
3.2.1 Análise filogenética
A filogenia das 16 amostras sequenciadas foi realizada através da análise da região do
gene estrutural gag, pela comparação entre si das sequências analisadas e com a sequência de
referência, sendo classificadas nos subtipos B (68,75%) e F (31,25%). O grupo CV totalizou 7
amostras sequenciadas que estavam distribuídas em 57,14% (4/7) no subtipo B e 42,86%
(3/7) no subtipo F. Já no grupo NCV foram 9 amostras sequenciadas, sendo 77,78% (7/9) do
subtipo B e 22,22% do subtipo F (Figura 13).
Figura 13 – Distribuição filogenética das amostras dos grupos CV (controlador de viremia) e
NCV (não controlador de viremia).
56
3.2.2 Avaliação das mutações de escape imunológico
Foi analisada a presença de mutações de escape CTL dentro dos genes gag, rev, tat,
nef, vif, vpr e vpu em coletas pontuais de cada indivíduo no período dos anos 2007 a 2011
antes do início de TARV. As sequências obtidas a partir do processamento na plataforma Ion
PGM™ System foram avaliadas para mutações a nível aminoacídico, descritas na literatura e
que conferem escape imunológico durante a infecção pelo HIV.
Para o gene gag foram obtidas 16 amostras de boa qualidade no sequenciamento,
constituindo de 7 sequências do grupo CV e 9 do NCV. Estas sequências foram avaliadas para
24 sítios de mutações selecionados na literatura, onde 12 (50%) foram encontradas em cada
grupo do presente estudo. Além disso, foram identificadas duas mutações novas para esse
gene, uma troca de Alanina para Treonina na posição 146 da proteína p24 (A146T; Figura 14)
em dois indivíduos do grupo CV, tendo esta mutação apenas uma descrição em um trabalho
experimental em 2013 em cultura celular (Martrus et al.) e outra mutação com troca de
Fenilalanina para Leucina na posição 383 da proteína p7 (F383L) em NCV sem descrição na
literatura (Quadro 7).
57
Quadro 7 – Mutações de escape imunológico encontradas no gene gag do HIV-1. CV
(controladores de viremia); NCV (não controladores de viremia). Quadros em azul sinaliza
troca de aminoácidos. *Mutação nova encontrada com descrição na literatura. **Mutação
nova sem descrição na literatura.
58
Figura 14 – Localização da mutação A146T na proteína P24 do gene gag do HIV-1. A –
ampliação do sítio de troca dos aminoácidos Alanina (A146) para Treonina (T146) na posição
146. B – representação tridimensional da proteína P24 com a localização da mutação A146T.
Para os genes regulatórios rev e tat, o número de sequências analisadas variou em
virtude da qualidade do sequenciamento obtido. Para o gene rev foram analisadas 10
59
sequências (4 CV e 6 NCV) para um total de 6 mutações descritas na literatura, sendo
encontradas duas mutações nas posições 17 e 21 do gene em CV, representando um
percentual de 33,34% e uma mutação na posição 21 em NCV (16,66%). Para tat foram
analisadas 9 sequências (4 CV e 5 NCV) para 7 principais mutações descritas na literatura,
onde foram localizadas 6 mutações nas posições 7, 9, 24, 29, 32 e 36 do gene com
distribuição nos grupos de 85,71% (6/7) em CV e 42,86% (3/7) em NCV (Quadro 8).
Assim como para os genes regulatórios, os genes acessórios sofreram variação na
qualidade do sequenciamento, variando o número de sequências analisadas individualmente.
Para o gene nef foi realizada a análise de 10 sequências (5 CV e 5 NCV), sendo pesquisadas
11 mutações de escape e encontradas 6 delas com uma distribuição de 54,55% (6/11) em CV
e 45,45% (5/11) em NCV. Para o gene de infectividade vif, 9 (3 CV e 6 NCV) amostras foram
analisadas para a presença de 9 mutações de escape descritas na literatura, sendo encontrado
66,67% (6/9) de mutações nas sequências analisadas em ambos os grupos. O gene vpr foi o
que apresentou maior número de sequências analisadas com um total de 11 (5 CV e 6 NC),
para a pesquisa de 4 mutações descritas na literatura, tendo sido encontradas 25% em CV
(1/2) e 50% em NCV (2/2). O último gene analisado foi vpu, não sendo encontrada nenhuma
das 4 mutações entre as 9 (3 CV e 6 NCV) amostras analisadas, mostrando-se bem
conservado nos dois grupos (Quadro 8).
60
Quadro 8 – Mutações de escape imunológico encontradas nos genes regulatórios e acessórios do HIV-1. CV (controladores de viremia); NCV (não
controladores de viremia). Quadros em azul sinaliza troca de aminoácidos. Traços indicam a ausência de sequência para o gene.
61
4 DISCUSSÃO
Os indivíduos infectados pelo HIV-1 que permanecem assintomáticos por longos
períodos de tempo e que conseguem manter as contagens de linfócitos TCD4+ normais e
carga viral baixa, estando sem tratamento, são denominados de Não-progressores de longo
prazo – LTNP (Okulicz et al., 2009). Para explicar esse perfil de progressão existem duas
principais teorias: a primeira de que os LTNP estão infectados com uma cepa viral defeituosa
e uma segunda teoria que sustenta uma maior eficácia da resposta imune ao HIV-1 por esses
indivíduos (International HIV Controllers Study, 2010; Martrus et al., 2013). No entanto,
nenhuma das duas hipóteses foi ainda comprovada como responsável por essa forma de
progressão (Pereyra et at., 2008).
Estudos com controladores de elite oferecem uma oportunidade única para
compreender os mecanismos envolvidos no controle natural da infecção pelo HIV e entender
os fatores que afetam o modo de progressão dos indivíduos portadores, fornecendo
conhecimentos cruciais para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas mais eficazes e,
principalmente, de mecanismos que bloqueiem a infecção viral, principalmente para o
desenvolvimento de uma vacina eficaz (Blankson et al., 2007; Abdel-Mohsen et al., 2013).
Contudo, os critérios de classificação dos controladores de viremia, incluindo os
controladores de elite, ainda não estão bem estabelecidos (Gurdasani et al., 2014). A
caracterização deste fenótipo raro de pessoas infectadas pelo HIV-1 auxiliaria não somente na
estimativa das prevalências reais desses indivíduos, mas também, na elucidação dos
mecanismos biológicos envolvidos no controle viral (Mellors et al., 1997; Lambotte et al.,
2005; Deeks et al., 2007; Olson et al., 2014).
4.1 FATORES IMUNOLÓGICOS DOS PROGRESSORES E NÃO PROGRESSORES
Após a infecção pelo HIV-1, ocorre a destruição progressiva dos linfócitos TCD4+,
que leva a imunodeficiência severa e, consequentemente, a progressão para a AIDS (Kagan et
al., 2015). Sendo assim, a quantificação dos linfócitos TCD4+ representa uma variável
altamente relevante para o monitoramento dos resultados clínicos das pessoas infectadas com
HIV-1 e de progressão da doença, além, de ser uma ferramenta para a avaliação da
recuperação imunológica após o início da TARV (Hulgan et al., 2007; Eholié et al., 2016).
Para o grupo de controladores de viremia (CV1 e CV2) foram observados níveis
elevados de LTCD4+ em relação ao grupo de progressão típica NC. Os mecanismos
62
envolvidos na lenta progressão da doença nos CV ainda não são totalmente conhecidos, no
entanto, a classificação em não progressores está diretamente ligada a baixos níveis de carga
viral do HIV, o que foi observado para esse grupo, além de níveis aumentados de linfócitos
TCD4+ (International HIV Controllers Study, 2010). O menor nível de linfócitos TCD4
+ nos
NCV pode ser consequência da alta e contínua replicação viral que leva a destruição dessas
células através da ação direta do vírus (Ogg et al., 1998) ou pela ação de células T citotóxicas
sobre as células infectadas, através da liberação de suas enzimas (Hersperger et al., 2010) ou
pelo desencadeamento de mecanismos apoptóticos (Ji et al. 2007; Hermes et al., 2015).
Ademais, os níveis desses linfócitos foram maiores no grupo controle não infectado,
reforçando ainda mais esse conceito.
Dentro dos mecanismos citotóxicos, os linfócitos TCD8+ apresentam a função de um
importante fator relacionado ao controle viral (Schellens et al., 2008; Tansiri et al., 2015).
Para as contagens de LTCD8+, os grupos CV e NCV apresentaram níveis maiores quando
comparados aos dos controles não infectados, devido à estimulação constante do agente viral
(Lambotte et al., 2005). Estudos recentes mostraram que a atividade de supressão mediada
por LTCD8+ in vitro foi significativamente maior nas células do grupo de controladores do
HIV do que em células de indivíduos de progressão típica, demonstrando uma relação inversa
entre a atividade supressora e a carga viral plasmática (Hersperger et al., 2010; Tansiri et al.,
2015; Noel et al., 2016).
Além das contagens de LTCD4+ e LTCD8
+ individuais, outro parâmetro avaliado foi a
relação (razão) entre essas duas contagens. A razão TCD4+/TCD8
+ pode ser entendida como
uma relação entre as características imunológicas versus a sobrevivência do indivíduo, onde
em alguns trabalhos as porcentagens de LTCD8+ aumentam, enquanto que as contagens de
LTCD4+ diminuem com o aumento da idade ou certas doenças (Ferguson et al., 1995; Wikby
et al., 1998). Na população em geral, uma razão TCD4+/TCD8
+ inferior a 1,0 é considerada
como um marcador de imunossenescência e pode representar um preditor da ocorrência de
mortalidade celular, independente da presença de infecção viral (Hadrup et al., 2006),
entretanto, uma razão TCD4+/TCD8
+ invertida é característica da infecção pelo HIV e está
ligada tanto à depleção de células TCD4+
como à expansão da ativação de linfócitos T
citotóxicos (LTCD8+) contra as células infectadas pelo vírus (Sauce et al., 2011; Triplette et
al., 2017). Ainda, valores baixos da razão TCD4+/TCD8
+ (<0,5) estão associados com risco
aumentado de "Eventos não relacionados à AIDS" como doenças cardiovasculares, renais,
enfisema pulmonar e neoplasias (Serrano-Villar et al., 2014; Triplette et al., 2017).
63
Os resultados do presente estudo mostraram que nos grupos virais existe uma inversão
clara da razão TCD4+/TCD8
+, embora em um nível menor entre os controladores de viremia
(CV1 e CV2) quando comparado ao NC, demonstrando a influência de maiores níveis de
carga viral no aumento da atividade citotóxica dos linfócitos TCD8+, intensificando a
depleção dos linfócitos TCD4+ (Hersperger et al., 2010; Tansiri et al., 2015; Noel et al.,
2016). Assim como evidenciado pela diferença estatística entre os grupos controles não
infectados com os seus respectivos grupos virais no presente estudo.
A infecção pelo HIV resulta em uma desregulação dos perfis de citocinas (Kedzierska
& Crowe, 2001). Clerici & Shearer (1994) descreveram que uma ativação das citocinas
associadas ao perfil Th1 (resposta imune celular) desempenha efeitos protetores contra a
infecção pelo HIV, enquanto que uma mudança para uma resposta Th2 aumentada (resposta
imune humoral) pode ser adversa e levar à progressão da infecção para a AIDS, tendo outros
trabalhos corroborando essa hipótese (Klein et al., 1997; Orsilles et al., 2006; Osakwe et al.,
2010). Neste estudo, foi possível observar que as concentrações plasmáticas das citocinas Th2
eram superiores no grupo NCV e citocinas Th1 maiores no grupo CV, confirmando que uma
resposta imune centrada em citocinas Th1, como IFN-γ, resulta em um portador de HIV-1 que
progride mais lentamente para a AIDS, indicando uma provável proteção, pode promover a
fagocitose das células infectadas, estimulando células NK, linfócitos T e uma consequente
eliminação do vírus, além da persistência e replicação viral de baixo nível. A exacerbação do
perfil de citocinas Th2, principalmente IL-4, leva a um aumento da resposta humoral que não
é suficiente para a contenção de agentes infecciosos intracelulares, contribuindo para
multiplicação e uma progressão mais rápida para a AIDS (Clerici & Shearer, 1994; Fenoglio
et al., 2009; Medeiros et al., 2016).
O IFN-γ foi a única citocina que apresentou um nível mais alto no grupo CV. Esta
citocina é secretada, principalmente, pelos LTCD8+
e células NK e desempenha um efeito
importante na ativação direta de células fagocíticas e na regulação da apresentação de
antígenos pelos macrófagos e células dendríticas (Roff et al., 2014), além de indutor de
quimiocinas inflamatórias (MIG e IP-10) que são responsáveis pelo recrutamento de
leucócitos para o local da inflamação e atua na ativação imunológica crônica (Kamat et al.,
2012; Noel et al., 2014). Estudos comparando diferentes grupos mostraram que as citocinas e
quimiocinas inflamatórias eram produzidas em níveis mais baixos entre os controladores de
elite em relação a outros grupos, tais como: controladores de viremia do HIV-1, indivíduos
não infectados pelo vírus e portadores do HIV-1 sob TARV; no entanto, em progressores
64
típicos, os níveis plasmáticos desses marcadores eram sempre mais elevados (Gorenec et al.,
2016; Platten et al., 2016). Ademais, o IFN-γ apresenta alta relevância na diminuição dos
níveis plasmáticos de carga viral, tendo sido sugerido como biomarcador da progressão da
infecção pelo HIV (Sarol et al., 2002; Lambotte et al., 2005).
Foi avaliado o perfil Th17, um subconjunto distinto de células TCD4+, representado
pela citocina pró-inflamatória IL-17, que tem como função a manutenção da integridade da
superfície gastrointestinal, através do recrutamento de neutrófilos e da produção de
antimicrobianos como defensina e mucina (Ndhlovu et al., 2008; Schuetz et al., 2014).
Apesar disso, IL-17 já foi correlacionada a vários distúrbios de natureza autoimunes e
inflamatórios, incluindo asma e alergia (Wong et al., 2001; Molet et al., 2001), psoríase (Li et
al., 2007) e doença inflamatória do intestino (Fujino et al., 2003).
No presente trabalho não foi encontrada significância estatística entre os grupos CV e
NC, o que é contraditório com outros estudos, tendo em vista que os níveis dessa citocina já
foram correlacionados a indivíduos LTNP, a altas contagens de LTCD4+ e baixas de carga
viral (Macal et al., 2008; Ndhlovu et al., 2008; Ciccone et al., 2011), características
compreendidas no grupo CV. Ainda, células TCD8+ que apresentaram medianas maiores nos
grupos de controladores de viremia também são capazes de produzir IL-17 (Huber et al.,
2013). Uma justificativa para esse baixo nível plasmático é que mesmo os indivíduos que
progridem lentamente para a AIDS apresentaram, na fase aguda da infecção, uma depleção
das células TCD4+, principalmente as localizadas na mucosa gastrointestinal, fonte principal
da produção de IL-17, levando à perda da imunidade da mucosa que, por sua vez, se torna
uma fonte de ativação contínua do sistema imunológico inato, mantendo um estado
inflamatório sistêmico persistente (Vidal et al., 2012; Krishnan et al., 2014; Ipp et al., 2014).
4.2 CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DOS PROGRESSORES E NÃO PROGRESSORES
4.2.1 Análise filogenética
A análise filogenética das sequências de progressores (NCV) e não progressores (CV)
foi realizada a partir da região gênica gag. As 16 amostras estavam distribuídas entre os
subtipos B e F, onde as sequências de progressores lentos não apresentaram uma origem
comum, descartando uma ancestralidade compartilhada de virulência reduzida (De Maio et
al., 2012). O subtipo B é o mais prevalente em regiões como o Leste Europeu, América,
Austrália e em alguns países asiáticos (Louwagie et al., 1994; Kitsutani et al., 1998; Se-thoe
65
et al., 1998; Herring et al., 2003). No Brasil este subtipo também é o mais prevalente, sendo o
subtipo F o segundo de maior predominância (Soares et al., 2003; Bello et al., 2006; Almeida
et al., 2011). Para a região norte o trabalho de Machado et al. (2009) descreveu a ocorrência
do subtipo B e F em amostras de indivíduos atendidos em uma unidade de referência nos
Estados do Pará e Amapá, analisando as regiões gênicas env e pol.
4.2.2 Mutações de escape imunológico
Para a maioria dos portadores de HIV na ausência de TARV, a infecção progride para
a AIDS em um período de, aproximadamente, 2 a 4 anos. No entanto, outros perfis de
progressão podem ser observados (Saag & Deeks, 2010). Essas diferentes formas de
progressão são determinadas pela complexa interação entre fatores genéticos do hospedeiro e
características intrínsecas do vírus ainda não muito conhecidas (Cao et al., 1995; Paxton et
al., 1996; Miura et al., 2009; Abdel-mohsen et al., 2013).
Indivíduos portadores de HIV que demonstram um controle sobre a progressão da
doença na ausência de TARV, como o grupo CV1 e CV2, são raros e os mecanismos
envolvidos no estabelecimento desse fenótipo ainda não foram completamente entendidos.
Contudo, mesmo demonstrando níveis de carga viral indetectáveis no plasma (<50
cópias/mL), metodologias ultrassensíveis evidenciaram que estes pacientes apresentam níveis
basais de replicação, o que permite algum nível de evolução viral, devido ao alto potencial de
variabilidade genética do HIV (Pereyra et al., 2009).
Nesse contexto, um perfil de resposta imunológica Th1 mais robusta nesse grupo,
como evidenciado neste trabalho e em outros, deve refletir numa maior pressão seletiva na
população viral desses indivíduos controladores (Klein et al., 1997; Pereyra et al., 2008;
Platten et al., 2016). Dessa forma, a pressão seletiva da resposta CTL atuaria como uma força
contínua ao longo de toda a infecção, implicando no surgimento de mutações de escape da
resposta imunológica, principalmente nos pacientes com alelos HLA relacionados a não
progressão clínica (Coffin, 1995; Friedrich et al., 2004; International HIV Controllers Study,
2010).
Desta forma, foi possível observar que de uma forma geral, as mutações de escape
imunológico pesquisadas no presente estudo estavam em maior frequência no grupo de
controladores de viremia (CV1 e CV2) para todos os genes estudados, com exceção para o
gene gag que apresentou igual distribuição em CV e NC. As mutações analisadas estão
66
relacionadas a escapes na apresentação de antígenos pelo MHC de classe I, que ativa a
resposta dos linfócitos TCD8+ (Kløverpris et al., 2016).
As mutações analisadas no gene gag, estão situadas principalmente na região da
proteína p24 do capsídeo viral, que consiste em uma proteína conservada, sendo assim, as
mutações de escape CTL que ocorrem nessa região estão sob forte pressão de seleção (Yusim
et al., 2002). Foram pesquisadas 24 mutações de maior relevância na literatura, sendo
encontradas 12 delas nos grupos analisados. A mutação na posição 146 (A146X/P/S) está
relacionada ao escape de processamento dos epítopos virais (Draenert et al., 2004; Naruto et
al., 2011). No entanto, a mudança encontrada nessa região de alanina para treonina, no
presente trabalho, não foi ainda descrita espontaneamente em amostras humanas. Matrus et al.
(2013) através de manipulação genética do vírus, observou que diferentes graus de
modificações no gene de gag, incluindo a mutação em questão, produziu um vírus com
capacidade replicativa significativamente menor em culturas de células.
Entre as mutações encontradas no epítopo TW10, a substituição de treonina por
asparagina no resíduo 242 (T242N) representa um escape CTL bem conhecido e importante
ligado ao HLA-B*57B e resulta na perda do reconhecimento do epítopos pela resposta CTL,
contudo, a sua presença implica em um vírus com capacidade de replicação comprometida
(Martinez-Picardo et al., 2006). Estudos anteriores identificaram a mutação A/G248 associada
à compensação do escape induzido por T242N, por induzir parcialmente a recuperação da
aptidão replicativa, no entanto, a mutação T242N não foi encontrada neste trabalho (Leslie et
al., 2004; Martinez-Picado et al., 2006; Brockman et al., 2007).
A variação A/G248 quando sozinha acarreta pouco ou nenhum custo para o vírus, não
sendo uma variante efetiva de escape, o que traz apenas uma perda parcial de reconhecimento
do epítopo, o que ocorre geralmente em infecções pelo subtipo B e quando o tipo de HLA não
apresenta grande pressão de seleção do sistema imunológico. Esta mutação também está
associada à troca de isoleucina na posição 256, independentemente do tipo de HLA, a
associação das duas mutações é forte, porém, ambas com baixo custo replicativo para o vírus
(Martinez-Picado et al., 2006).
O epítopo KK10 de p24 é uma região imunodominante particular relacionada ao HLA
B*27, onde o surgimento de mutações de fuga dentro deste epítopo tem sido relacionado ao
aumento da replicação viral e a progressão para a AIDS (Goulder et al., 1997; Kelleher et al.,
2001). Mutação nesse epítopo foi encontrada em dois indivíduos todos do grupo CV, sendo
um deles CV1, o que vai de encontro ao perfil de progressão em que eles foram classificados.
67
Porém, já foi relatado que indivíduos HLA B*57 são capazes de controlar o vírus mesmo na
presença da mutação (Leslie et al., 2004), uma indicação de que esses dois controladores
apresentam um HLA protetivo, o que não pôde ser investigado no presente estudo.
O epítopo QW9 diminui o reconhecimento pelo LTCD8+ (Sanchez-Merino et al.,
2005) e estão mais presentes entre as sequências do subtipo B com maior ocorrência em
progressores do que em LTNP. Porém, Migueles et al. (2003) não encontraram diferenças de
resposta citotóxica entre LTNP e progressores, sendo possível que as diferenças possam estar
na sinergia com a resposta específica para outros epítopos mutantes já que a resposta a um
único epítopo pode não ser uma representação precisa do panorama global da resposta T
CD8+ do paciente ao HIV.
O epítopo RI9 é intimamente relacionado ao HLA B*13 e está localizado dentro da
proteína p1 em gag, sem apresentar função específica atribuída. No entanto, a sequência p1
faz parte do RNA ribossomal viral que atua diretamente na clivagem da poliproteína
precursora Gag-Pol, onde se supõem que mudanças nessa região afetaria a montagem da
partícula viral, gerando um acúmulo de precursores Gag-Pol não processados (Fellay et al.,
2007; Goonetilleke et al., 2009). Estudo anterior mostrou que a variação de aminoácidos nos
resíduos 436 e 437 de gag é responsável por reduzir o reconhecimento de CTL, apesar de
ocorrer perda significativa de aptidão replicativa nos mutantes (Prado et al., 2009).
A troca aminoacídica de fenilalanina para leucina na posição 383 de p7 em gag ainda
não apresenta descrição na literatura, tendo sido encontrada em um indivíduo NCV no
presente trabalho. No entanto, a troca na mesma posição de fenilalanina para tirosina já está
documentada e relacionada à perda de reconhecimento pela resposta CTL (Kløverpris et al.,
2016). Com base no conhecimento de que esta proteína apresenta papel estrutural na
formação do nucleocapsídeo do HIV, além de funções adicionais críticas para a replicação
viral, modificações nessa região podem resultar em um vírion defectivo, com montagem
anormal que podem ocasionar a internalização ou maior exposição dos epítopos virais,
dificultando o reconhecimento ou ainda aumentando a reatividade da proteína, impactando
diretamente na interação com sistema imunológico (Maynard et al., 1998; Goel et al., 2002).
Os genes acessórios e regulatórios também foram analisados para mutações de escape
CTL. O gene rev é essencial para replicação viral, pois é o responsável pela exportação de
RNA viral não processado ou incompletamente processado do núcleo para o citoplasma.
Neste trabalho foram encontradas duas modificações nas posições 17 e 21 em um domínio
básico, originalmente rico em arginina, que tem a função de ligação especifica a uma região
68
do complexo secundário do RNA, denominado RRE, que medeia a exportação do mRNA do
núcleo para o citoplasma, onde são traduzidos para produzir proteínas virais essenciais
(Fernandes et al., 2012). A maior diversidade de mutações estava presentes no grupo CV na
posição 17, que apresentam menor carga viral, o que corrobora com o trabalho de Rousseau et
al., (2008) que associou a presença da variante com menores cargas virais, sugerindo um
custo de aptidão da mutação para o vírus.
Para o gene tat foram encontradas seis das sete mutações pesquisadas, com maior
frequência no grupo CV. Os estudos mostram que a proteína Tat é particularmente eficaz no
controle replicação do vírus in vivo (Allen et al., 2000; O’Connor et al., 2002; Stittelaar et al.,
2002). O epítopo CC8 foi indicado como indutor de escape imunológico da resposta CTL,
onde os mutantes apresentaram aumento de 41% na probabilidade de sobrevivência e
replicação em relação ao tipo selvagem em um estudo longitudinal que analisou 15 diferentes
momentos de coleta de amostras nos primeiros três anos de infecção de um portador de HIV
(Liu et al. 2006). Para a mutação na posição 32 (NY9) na sequência da proteína Tat ocorre o
bloqueio do processamento da Epítopo MY9 adjacente à região, este epítopo apresenta alta
imunogenicidade para indivíduos com o HLA B*15 relacionado. As respostas CTL que
dirigiram seleção completa mais rápida para mutações de escape foram direcionadas contra os
epítopos NY9 e MY9 no trabalho de Jones et al. (2004).
A proteína Nef está envolvida na baixa expressão do receptor CD4 na superfície da
célula infectada e, consequentemente, contribui para a rápida progressão à AIDS (Hua et al.,
1997). Foi observado que as amostras analisadas do grupo NCV estão mais conservadas em
relação às sequências dos CV, uma vez que essas últimas apresentaram maior número de
mutações. Esta maior frequência de mutações em não progressores também foi demonstrada
por Kirchhoff et al. (1995) que analisaram sequências gênicas de nef de cinco pacientes
LTNP, encontrando elevado número de formas mutantes, gerando a atenuação da partícula de
HIV-1. Esses resultados indicam que a presença de mutações de escape imunológico nessa
região gera um vírus com baixo fitness, contribuindo para a ausência da progressão da doença
em algumas pessoas (Deacon et al., 1995).
O gene vif codifica uma proteína que é central para a replicação do vírus devido a sua
capacidade de neutralizar a proteína antiviral APOBEC3 do hospedeiro (De Maio et al.,
2012). Esta proteína apresenta grande importância para a otimização da capacidade
replicativa, atuando como componente integral do complexo de transcrição reversa na função
de co-fator da atividade da enzima transcriptase reversa, dessa forma, sendo relevante para a
69
determinação do tempo de progressão para a AIDS (Kataropoulou et al., 2009). No trabalho
de Hassaïne et al. (2001) foi demonstrado que a proteína tirosina quinase (Hck) foi capaz de
inibir produção e a infectividade do vírus vif mutante, mas não do vírus do tipo selvagem,
demonstrando, o papel de algumas mutações na perda da efetividade da proteína. Ronsard et
al. (2015) observaram que as mutações nas posições 166 e 167 de Vif podiam afetar a
infecciosidade viral quando analisaram sequências de indivíduos do norte da Índia. Rousseau
et al. (2008) associaram a variante da posição 33 a menores cargas virais, sugerindo um custo
da mutação na aptidão do vírus. De maneira semelhante, um estudo de caso nos Estados
Unidos mostrou o mapeamento viral de mãe e filha (transmissão congênita) progressoras
lentas, sendo identificada uma inserção de dois aminoácidos em Vif, que reduz, em 20x, a
capacidade replicativa do vírus em PBMC in vitro. No entanto, após a remoção da mutação a
eficiência de replicação foi restaurada para níveis equivalentes ao do vírus selvagem,
sugerindo um mecanismo de perda de função de Vif. Além disso, o mapeamento mostrou que
os vírus de mãe e filha apresentavam alta identidade, apesar de passados 15 anos da gestação,
evidenciando a manutenção do vírus mutante, provavelmente por este causar uma infecção
mais branda (Alexander et al., 2002).
A proteína Vpr está associada a uma variedade de funções biológicas, incluindo a
permanência da célula na fase G2 do ciclo celular, indução de apoptose, importação nuclear
do complexo pré-integração, modulação da expressão gênica e supressão da ativação imune
(Andersen et al., 2008). Para esta proteína foram analisadas quatro mutações descritas na
literatura, sendo encontradas modificações nas posições 37 e 63.
Assim como no presente trabalho, estas mutações foram observadas no estudo de Hadi
et al., (2014) que analisaram 192 sequências de indivíduos LTNP e 102 de progressores
rápidos contidas no banco de sequências Los Alamos e encontrou a troca de Isoleucina para
Serina (posição 63) somente em progressores rápidos, porém, na posição 37 não houve
diferença na frequência da mutação entre os grupos, semelhante a distribuição observada aqui
para ambas as mutações. Esses resultados indicam que as mutações associadas no gene vpu
podem prejudicar o bloqueio da célula no estado estacionário G2 do ciclo celular, que estão
mais frequentes em LTNP do que em progressores rápidos, já que o bloqueio em G2,
provavelmente, proporciona condições favoráveis para expressão viral, o que facilita a
replicação viral, além de induzir ao escape imunológico, evadindo da detecção,
principalmente, por células NK, por facilitar a formação de reservatórios virais. No entanto,
os mecanismos envolvidos nos fenômenos acima ainda não estão bem esclarecidos.
70
Pacientes infectados com o HIV-1 que apresentam mutação em Vpr apresentam
progressão mais lenta para a AIDS (Lum et al., 2003; Saksena et al., 1996; Wang et al.,
1996), em consequência do seu efeito na desregulação das principais vias imunológicas,
incluindo apresentação de antígeno, produção de citocinas e ativação de células T (Majumder
et al., 2005; Muthumani et al., 2002). No entanto, o efeito direto de Vpr em células T
infectadas e suas funções imunes não são claramente compreendidos.
Por fim, a análise de mutações no gene vpu para ambos os grupos de progressão,
demonstrou alto índice de conservação das sequências, não sendo encontradas alterações
aminoacídicas. A proteína Vpu possui um domínio citoplasmático hidrofílico que consiste em
duas alfas hélices unidas por uma região de dobradiça formada pelo motivo DSGNES
conservado (serinas S52 e S56) que necessita ser fosforilado para exercer a função de
degradação de moléculas CD4 recém-sintetizadas ainda no citoplasma da célula (Janvier et
al., 2011; González et al., 2015). Além disso, a Vpu exerce um papel de potente antagonista
do fator de restrição CD317/tetherina que evita a liberação de partículas virais e de modulação
da expressão receptores de MHC I na superfície celular e ainda diminui a ativação de células
NK. No estudo de Chen et al. (2015) também não foi possível demonstrar diferenças
significativas entre as sequências de indivíduos com formas diversas de progressão, dessa
forma, os autores sugerem que ausência de diferenças entre os dois grupos se deve a ampla
importância da função exercida pela proteína Vpu, onde qualquer mutação ocorrida na região
sofreria grande pressão de seleção do sistema imunológico sobre a proteína mutante,
dificultando o seu estabelecimento.
A partir dos resultados obtidos no presente trabalho é possível sugerir que a
progressão da doença induzida pelo HIV-1 é regulada por vários fatores virais e do
hospedeiro que trabalham em sinergia. A grande ocorrência de mutações de escape em
controladores a infecção pelo HIV, em parte, está relacionada aos custos acumulativos dessas
mutações na aptidão viral. Vários estudos associaram mutações de escape CTL em p24 Gag
com progressão lenta da doença como resultado dos custos no fitness incorridos por essas
mutações (Schneidewind et al., 2009; Brockman et al., 2007; Miura et al., 2009).
Este estudo demonstra que as respostas de CTL nos hospedeiros, provavelmente,
influenciam fortemente a evolução viral durante a infecção pelo HIV-1. Esse tipo de cenário
fornece alguma indicação de que as vacinas terapêuticas que induzem respostas robustas para
epítopos conservados, como a p24, podem aumentar a pressão de seleção para os vírus,
conseguindo, dessa forma, diminuir a replicação viral em longo prazo.
71
Apesar de não conseguir detectar uma associação entre o número de mutações e a
progressão da doença, o panorama da associação de altas frequências de mutações de escape
de CTL, níveis elevados de linfócitos TCD8+ e o predominante perfil de citocinas Th1
observadas em CV, sugerem que nesses indivíduos a resposta CTL exerce pressão de seleção
considerável sobre o vírus e que essa pressão, pode contribuir para o acúmulo de mutações
que, consequentemente, levam a um controle efetivo da viremia durante a infecção, pela
diminuição do fitness viral, como evidenciado no trabalho de Goonetilleke et al. (2009). No
entanto, a subtipagem do HLA proporcionaria uma importante ferramenta de análise da
pressão seletiva do sistema imunológico desses indivíduos.
A falta de consenso na classificação dos indivíduos de progressão lenta impossibilita,
muitas vezes, a correlação de resultados de pesquisas científicas pela heterogeneidade nos
critérios empregados pelos autores (Okulicz et al., 2009). Com base nisso, este trabalho
propôs o estabelecimento de critérios unificados no estudo deste tipo de população e
conseguiu demonstrar diferenças claras entre os grupos estabelecidos.
72
5 CONCLUSÕES
- Os maiores níveis de TCD4+ e TCD8
+ foram associados aos controladores de viremia (CV1
e CV2);
- Os níveis de linfócitos TCD4+ foram superiores no grupo controle (não infectado) quando
comparados aos dos grupos de portadores do HIV (CV e NCV), enquanto que os níveis de
linfócitos TCD8+ foram maiores nos grupos virais;
- A relação de LTCD4+/TCD8
+ foi estatisticamente significativa nos grupos de progressão
lenta CV1 quando comparado ao grupo de progressão rápida NCV e nos grupos controles
mostraram valores significativamente maiores que os dos grupos infectados;
- A carga viral plasmática do HIV-1 de CV1 foi consistentemente abaixo do limite dos testes
utilizados para a detecção de ácido nucléico viral ao longo do período de observação,
enquanto que NCV apresentaram cargas virais mais elevadas;
- As concentrações plasmáticas das citocinas Th1 e Th2 foram superiores nos grupos CV e
NCV, respectivamente, no entanto, para o perfil Th17 (IL-17) não houve diferenças
significativas entre os grupos;
- Os subtipos virais B e F foram igualmente encontrados em ambos os grupos CV e NCV, o
que não indica origem filogenética comum entre os progressores lentos;
- Foi observada maior pressão seletiva no grupo de controladores de viremia, caracterizada
por elevada frequência das mutações de escape imunológico pesquisadas;
- As mutações analisadas no gene gag estavam em igual número nos dois grupos de
progressão (CV e NCV), porém, essas mutações representam baixo custo replicativo para o
vírus;
- Foram encontradas duas mutações novas nas proteínas p24 e p7 do gene gag, uma
substituição de alanina para treonina na posição 146 e uma de fenilalanina para leucina na
posição 383;
73
- As modificações no gene rev estavam mais presentes no grupo CV que apresenta menor
carga viral, sendo duas modificações, nas posições 17 e 21 em um domínio básico, que
medeia a exportação do mRNA do núcleo para o citoplasma;
- Foi observada uma maior frequência de mutações no gene tat no grupo CV;
- Foi observado que as amostras do grupo NCV estão mais conservadas em relação às
sequências de CV para o gene nef;
- O gene vpr foi o que apresentou maior número de sequências analisadas, onde foram
encontradas 2 mutações tanto em CV quanto em NC;
- A análise de mutações no gene vpu, para ambos os grupos de CV e NCV, demonstrou alto
índice de conservação das sequências, não sendo encontradas alterações aminoacídicas.
74
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APÊNDICE
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ANEXO
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