UNIVERSIDADE D
FACULDADE DE C
DEPARTAMENTO DE Q
D o u t o r a m e n t o eE s p e c i a l i d a d e Q u
Elisa Vaz Morga
Complexos Orga
com PropriedaImagiologia e/
S u p e r v i s o r : D o u t o
C o - s u p e r v i s o r : D o
E DE LISBOA
E CIÊNCIAS
DE QUÍMICA E BIOQUÍMICA
e m Q u í m i c a Q u í m i c a I n o r g â n i c a
orgado de Palma
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i
O trabalho apresentado nesta tese foi realizado no
grupo de Ciências Radiofarmacêuticas do Instituto
Tecnológico e Nuclear (ITN), sob a orientação da
Doutora Isabel Rego dos Santos e co-orientação do
Doutor João Domingos Galamba Correia.
Este trabalho foi financiado pela Fundação para a
Ciência e Tecnologia através da bolsa de
doutoramento SFRH/BD/29527/2006 e do projecto
PTDC/QUI-QUI/115712/2009.
ii
iii
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, a Doutora Isabel Rego dos Santos, agradeço o rigor
científico como me orientou e a forma exemplar, disponível e cuidada como apoiou a
realização deste trabalho, sendo para mim essencial e indispensável para o processo
de aprendizagem. Ao meu co-orientador, o Doutor João Galamba Correia agradeço o
apoio científico e a forma sempre disponível como me ajudou a esclarecer as diversas
questões que surgiram ao longo deste trabalho. A ambos agradeço o bom exemplo e o
entusiasmo científico contagiante que sempre manifestaram.
À Doutora Lurdes Gano agradeço o empenho na realização dos estudos
farmacocinéticos, assim como todo o apoio prestado.
À Doutora Guilhermina Cantinho e ao Sr Vieira Marques agradeço pela
disponibilidade e rigor com que efectuaram as imagens cintigráficas.
À Doutora Paula Campello e à Doutora Célia Fernandes quero exprimir a minha
gratidão pelo apoio científico e técnico e em especial pela amizade demonstrada.
À Doutora Goreti Morais, ao mestre Bruno Oliveira e ao mestre Maurício
Morais, agradeço o entusiasmo manifestado na discussão de diversas questões
científicas e sobretudo o bom ambiente de trabalho, o apoio moral e amizade
manifestados.
À Elisabete e ao Amadeu agradeço o apoio logístico, boa disposição e simpatia.
A todos os outros elementos do Grupo de Ciências Radiofarmacêuticas
agradeço também o excelente ambiente de trabalho, colaboração e amizade.
Ao Doutor Joaquim Marçalo agradeço a realização dos espectros de massa
apresentados neste trabalho, bem como as discussões científicas associadas.
À Doutora Isabel Cordeiro Santos agradeço todo o empenho na resolução das
estruturas moleculares no estado sólido.
Ao Sr. António Soares agradeço a realização das análises elementares e o
espírito bem disposto contagiante.
Ao Instituto Tecnológico e Nuclear agradeço o acolhimento e à Fundação para a
Ciência e Tecnologia o financiamento deste trabalho.
Finalmente, agradeço à minha família pelo apoio e incentivo fundamentais à
realização deste trabalho, e pela compreensão relativamente à minha falta de
disponibilidade, em especial ao João e à Laura.
iv
v
RESUMO
Novos ligandos bifuncionais do tipo pirazolo diamina contendo grupos mono
(L1 - L3) ou bisfosfonato (L4 - L6) foram sintetizados e caracterizados. Estes ligandos
foram utilizados para preparar complexos do tipo fac-[M(CO)3(κ3-L)]+ em que: L = L1,
M = Re (Re1), 99mTc (Tc1); L = L2, M = Re (Re2), 99mTc (Tc2); L= L4 - L6, M = Re (Re4-
Re6), 99mTc (Tc4-Tc6). Os complexos radioactivos foram obtidos com rendimentos e
pureza radioquímica elevados (≥ 95 %), tendo sido identificados por comparação dos
seus cromatogramas de RP-HPLC com os dos respectivos complexos análogos de Re.
Os estudos in vitro de ligação à hidroxiapatite revelaram que os complexos possuíam
potencial osteotrópico e os estudos em ratinhos CD-1 confirmaram que todos eram
resistentes à transmetalação, transquelatação e oxidação e que, principalmente os que
continham a unidade bisfosfonato (Tc4-Tc6), se ligavam ao osso. Os complexos Tc5 e
Tc6 foram os que apresentaram melhor perfil biológico em termos de fixação óssea,
eliminação e razões osso/órgão não alvo pelo que foram escolhidos para prosseguir
estudos noutra estirpe animal. Estudos de biodistribuição em ratinhos Balb-c e as
imagens cintigráficas de Tc5 e Tc6 em ratos Sprague-Dawley confirmaram um
excelente comportamento biológico para estes complexos, que verificámos ser
comparável ou, em alguns casos, melhor do que o encontrado para o composto em
utilização clínica 99mTc-MDP, que estudámos nas mesmas condições experimentais.
Para explorar a síntese de um complexo trifuncional, tentámos sintetizar um
ligando pirazolo-diamina com um composto citostático (docetaxel) e com uma unidade
bisfosfonato. Foram obtidos resultados animadores que terão que prosseguir.
vi
vii
ABSTRACT
New bifunctional ligands comprising a pyrazolyl-diamine backbone for metal
stabilization, and a pendant mono (L1 - L3) or bisphosphonate (L4 - L6) group for bone
targeting were synthesized. Those ligands allowed the prepararion of complexes of
type fac-[M(CO)3(κ3-L)]+ where: L = L1, M = Re (Re1), 99mTc (Tc1); L = L2, M = Re (Re2),
99mTc (Tc2); L= L4 - L6, M = Re (Re4-Re6), 99mTc (Tc4-Tc6). The radioactive species were
obtained in high yield and radiochemical purity (≥ 95%), being identified by
comparison of their RP-HPLC chromatograms with the corresponding Re surrogates. In
vitro hydroxiapatite binding studies revealed that the complexes presented bone
seeking potential and the studies carried out in CD-1 mice showed that all complexes
were resistant to transmetalation, transquelation and oxidation and, manly those
containing a bisphosphonate unit (Tc4 - Tc6), bound to bone tissues. Tc5 and Tc6
showed the best pharmacokinetic profiles in terms of bone uptake, clearance and ratio
bone/non targeting organ and for that reason they were chosen to proceed with
further studies in another animal model. The biodistribution studies in Balb-c mice and
the scintigraphic images of Tc5 and Tc6 in Sprague Dawley confirmed their excellent
biological behaviour, comparable or, in some cases, better compared to the one
observed for the compound in clinical use 99mTc-MDP, studied in the same
experimental conditions.
To explore the synthesis of a trifunctional complex, we tried toprepare a
pyrazolyl-diamine ligand with a cytostatic compound (docetaxel) and a bisphosphonate
unit. The obtained results were encouraging and must be continued.
viii
ix
Palavras-chave
Bisfosfonatos
Docetaxel
Complexos de tricarbonilo de 99mTc/Re
Cintigrafia óssea
Terapia paliativa de metástases ósseas
Keywords
Bisphosphonates
Docetaxel
99mTc/Re tricarbonyl complexes
Bone scintigraphy
Bone metastases palliative Therapy
x
xi
ÍNDICE GERAL
Agradecimentos………………………………………………………………………………………………………….iii
Resumo……………………………………………………………………………………………………………………….v
Abstract………………………………………………………………………………………………………………………vii
Palavras-chave……………………………………………………………………………………………………………ix
Índice Geral………………………………………………………………………………………………………………..xi
Índice de Figuras………………………………………………………………………………………………………xvi
Índice de Tabelas……………………………………………………………………………………………………..xxi
Índice de Esquemas…………………………………………………………………………………………………xxiii
Abreviaturas……………………………………………………………………………………………………………xxv
Preâmbulo…………………………………………………………………………………………………………………….… 1
1. INTRODUÇÃO…………………………………………………………………….……………….…………….. 7
1.1. Medicina Nuclear……………………………………………………….…………………………………… 7
1.1.1. Rádiofármacos: Conceitos Básicos…………………………………………………………….. 7
1.1.2. Radiofármacos de 99mTc………………………………………………..………………………….. 13
1.2. Oncologia e Metastização Óssea…………………………………..……………………………….. 17
1.2.1. Cuidados Paliativos e Tratamento da Dor Relacionada com Metástases
Ósseas………………………………………………………………………………………………………. 19
1.2.2. Bisfosfonatos: Mecanismo de Acção…………………………………..…………………….. 21
1.3. Complexos de 186/188Re e 99mTc para terapia ou diagnóstico de metástases
ósseas…………………………………..………………………………….……………..………………………
24
1.3.1. Considerações Gerais…………………………………..…………………………………………… 24
1.3.2. Complexos para Visualização e/ou Terapia de Metástases Ósseas……………. 27
2. COMPLEXOS DE RE(I) E 99MTC(I) ESTABILIZADOS COM LIGANDOS BIFUNCIONAIS
CONTENDO GRUPOS FOSFONATO…………………………………..…………………………………. 41
2.1. Considerações Gerais…………………………………..…………………………………………………. 41
2.2. Compostos Contendo um Grupo Monofosfonato………………………………………….. 42
2.2.1. Síntese e Caracterização de Ligandos Pirazolo - Diamina Contendo um
Grupo Monofosfonato (L1 - L3) ……………………………………………………………….. 42
2.2.2. Síntese e Caracterização dos Complexos de Rénio Estabilizados por L1 47
xii
(Re1) e L2 (Re2)…………………..…………………………………..…………………………………
2.2.2.1. Caracterização do complexo Re1 por difracção de raios – X ……………………. 54
2.2.3. Síntese e Caracterização dos Complexos Tc1 e Tc2……………………………………… 56
2.2.4. Avaliação Biológica dos Complexos de 99mTc(I)…………………………………………… 60
2.2.4.1. Estudos In Vitro…………………………………………………………………………………………. 60
2.2.4.1.1. Estabilidade em Tampão Fosfato e em Soro Humano…………………………….. 60
2.2.4.2. Estudos In Vivo…………………………………..……………………………………….……………. 62
2.2.4.2.1. Estudos de Biodistribuição em Ratinhos CD-1……………………………………….. 62
2.2.4.2.2. Estabilidade In Vivo……………………………..…………………………………….………….. 64
2.3. Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato………………………………………………… 65
2.3.1. Síntese e Caracterização de Ligandos Pirazolo-Diamina Contendo Grupos
Bisfosfonatos (L4 – L6) ………………………………………………………………….……………. 65
2.3.2. Síntese e Caracterização dos Complexos Re4 - Re6………………………….…………. 79
2.3.3. Síntese e Caracterização dos Complexos Tc4 -Tc6………………………………………. 89
2.3.4. Avaliação Biológica dos Complexos de 99mTc(I) ………………………………….………. 92
2.3.4.1. Estudos In Vitro……………………………………………………………………………….………. 92
2.3.4.1.1. Adsorsão à Hidroxiapatite (HA) …………………………………………………….……… 92
2.3.4.2. Estudos In Vivo……………………………………………………………………………….……….. 93
2.3.4.2.1. Biodistribuição e Estabilidade em Ratinhos CD-1………………………………….. 93
2.3.4.2.2. Biodistribuição e Estabilidade em Ratinhos Balb-C……………………………….. 95
2.3.4.2.3. Estabilidade de Tc5 e Tc6 em Ratinhos CD-1 e Balb-c……………………………. 97
2.3.3. Comparação com o 99mTc-MDP………………………………………………………….……….. 98
2.4. Compostos Multifuncionais Osteotrópicos para Aplicação Terapêutica:
Estratégias de Derivatização de Bisfosfonatos……………………………………………….. 105
2.4.1. Considerações gerais………………………………………………………………………………….. 105
2.4.2. Síntese e Caracterização de Compostos Trifuncionais Contendo Grupos
Bisfosfonato…………………………………………………………………………………………..…….109
2.4.3. Síntese e Caracterização do Complexo Tc7……………………………………………..……125
2.4.4. Avaliação Biológica do Complexo Tc7…………………………………………………..……….127
2.4.4.1. Estudos In Vitro………………………………………………………………………………..………. 127
2.4.4.1.1. Adsorção à hidroxiapatite (HA) ……………………………………………………..……… 127
2.4.4.1.2.Estabilidade em Cisteína e Histidina……………………………………………..…………128
2.4.4.2.Estudos In Vivo………………………………………………………………………………..………… 130
2.4.4.2.1. Biodistribuição em Ratinhos CD-1………………………………………………….……….130
xiii
2.4.4.2.2. Estabilidade In Vivo……………………………………………………………………….………. 131
2.4.4.2.3.Estudos de Inibição da Fixação Renal…………………………………………….………..132
3. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS…………………………………………………………………………… 135
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL……………………………………………………………………….. 153
4.1. Considerações Gerais……………………………………………………………………………….……….153
4.2. Purificação de Solventes e Reagentes…………………………………………………….……….. 153
4.3. Técnicas de Purificação e Caracterização………………………………………………………… 154
4.4. Síntese de Compostos Potencialmente Úteis para Imagiologia Óssea……………. 161
4.4.1. Síntese de Compostos Contendo o Grupo Éster fosfónico………………….…………161
4.4.1.1. Procedimento Geral para a Síntese de (3-Bromopropil)Fosfonato de
Dietilo (1) e de (2-Bromoetil)Fosfonato de Dietilo (2) ……………………….…………161
4.4.1.2. Síntese de t-butil 2-((3-(dietoxifosforil)propil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-
il)etil)amino)etilcarbamato (4) e t-butil 2-((2-(dietoxifosforil)etil)(2-(3,5-
dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)etilcarbamato (5) ………………………………..… 162
4.4.1.3. Síntese de 2-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazolo-1-
il)etil)amino)etilfosfonato de dietilo (L1) …………………………………………..……….. 163
4.4.2. Síntese de Compostos com um Grupo Ácido Fosfónico…………………………………164
4.4.2.1. Síntese de ácido 2-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-
il)etil)amino)etilfosfónico (L2) e ácido 3-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-
pirazol-1-il)etil)amino)propilfosfónico (L3) ………………………………………..………..164
4.4.3. Síntese de Compostos com o Grupo Bisfosfonato……………………………..………….165
4.4.3.1. Síntese do Éster 1-aminometileno-1,1-bisfosfonato de tetraetilo (AMDP)
…………………………………………………………………………………………………………..………… 165
4.4.3.2. Síntese de 7-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)-13,13-dimetil-3,11-dioxo-
12-oxa-2,7,10-triazatetradecano-1,1-diilbisfosfonato de tetraetilo (8) 166
4.4.3.3. Síntese de ácido (4-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-
il)etil)amino)butanamido)metilenobisfosfónico (L4) …………………….………………167
4.4.3.4. Síntese de Pamidronato (PAM) e Alendronato (ALN) ……………………..……..….168
4.4.3.5. Síntese de ácido 8-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)-16-hidroxi-2,2-
dimetil-4,12-dioxo-3-oxa-5,8,13-triazahexadecane-16,16-diilbisfosfónico(10) 170
4.4.3.6. Síntese de ácido 3-(4-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-
il)etil)amino)butanamido)-1-hidroxipropane-1,1-diilbisfosfónico (L5)….………. 171
4.4.3.7. Síntese de ácido 8-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)-17-hidroxi-2,2-
dimetil-4,12-dioxo-3-oxa-5,8,13-triazaheptadecano-17,17-diilbisfosfónico 172
xiv
(11) ………………………………………………………………………………………………….………….
4.4.3.8. Síntese de ácido 4-(4-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-
il)etil)amino)butanamido)-1-hidroxibutano-1,1-bisfosfónico (L6)………………… 173
4.4.4 . Síntese de Derivados do Ácido Glutâmico e da β-alanina……………………………. 174
4.4.4.1. Síntese de ácido 5-(benziloxi)-2-ftalimida-5-oxopentanóico (13)……………….174
4.4.4.2. Síntese de 5,5-bis(dietoxifosforil)-4-ftalimida-5-hidroxipentanoato de
benzilo (16) …………………………………………………………………………………………..………175
4.4.4.3. Síntese de ácido 4-amino-5-hidroxi-5,5-bisfosfonopentanoico (18)………….. 177
4.4.4.4. Síntese de ácido 12-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)-18,18-dimetil-
3,8,16-trioxo-1-fenil-2,17-dioxo-7,12,15-triazanonadecano-6-carboxílico (21) 177
4.4.4.5. Síntese de 3-amino-1-hidroxypropano-1,1-diilbisfosfonato de tetrametilo
(Me-PAM) …………………………………………………………………………………………….…….. 178
4.4.4.6. Síntese de ácido 4-(5-(benziloxi)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-
oxopentanamido)-1-hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (24) …………….….………179
4.4.4.7. Síntese de ácido 4-(5-(benziloxi)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-
oxopentanamido)-1-hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (25) ………………….…….181
4.4.4.8. Síntese de ácido 16-(terc-butoxicarbonilamino)-8-(2-(3,5-dimetil-1H-
pirazol-1-il)etil)-22-hidroxi-2,2-dimetil-4,13,17-trioxo-3-oxa-5,8,12,18-
tetraazadocosano-22,22-diilbisfosfónico (27) ……………………………………….…..… 181
4.4.4.9. Síntese de ácido 4-(2-amino-5-(3-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-
1-il)etil)amino)propilamino)-5-oxopentanamido)-1-hidroxibutano-1,1-
diilbisfosfónico (L7) …………………………………………………………………………….………..183
4.4.4.10. Síntese de ácido 4-(2-amino-5-(benziloxi)-5-oxopentanamido)-1-
hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (28) ……………………………………………….………. 184
4.4.4.11. Síntese de 2’-sulfo-NHS-succinil-DTX (30) …………………………………….………...185
4.4.4.12. Síntese de ALN-Glu-succinil-DTX (31) …………………………………………….………..186
4.4.4.13. Síntese de ácido 4-(2-(((9H-fluoreno-9-il)metoxi)carbonilamino)-5-t-
butoxi-5-oxopentanamido)-1-hidroxibutane-1,1-diilbisfosfónico (32) 187
4.4.4.14. Síntese ácido 4-(2-amino-5-t-butoxi-5-oxopentanamido)-1-
hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (33) …………………………………………..…………… 188
4.4.4.15. Síntese de ácido 4-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-
il)etil)amino)butanoico (34) ………………………………………………………………....………189
4.4.4.16. Síntese de ácido 4-((2-(((9H-fluoreno-9-il)metoxi)carbonilamino)etil)(2-
(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)butanóico (35) ……………………….…………189
4.4.5. Síntese de Derivado do Composto Pirazolo-Diamina Funcionalizado na
Posição 4……………………………………………………………………………………………..………..191
xv
4.4.5.1. Síntese de ácido 4-(2-(1-(2-((2-(t-butoxicarbonilamino)etil)(4-etoxy-4-
oxobutil)amino)etil)-3,5-dimetil-1H-pirazol-4-il)acetamido)-1-hidroxibutano-
1,1-diilbisfosfónico (36) …………………………………………………………………..………….. 191
4.4.6. Síntese e Caracterização de Complexos de Re(I) …………………………….…….……. 193
4.4.6.1. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L1)]+ (Re1) ………………………………………….……….… 193
4.4.6.2. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L2)]+ (Re2) ………………………………………….……….… 195
4.4.6.3. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L4)]+ (Re4) ………………………………………….…………. 195
4.4.6.4. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L5)]+ (Re5) ……………………………………….……………. 199
4.4.6.5. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L6)]+ (Re6) ……………………………………….……………. 201
4.4.7. Síntese dos complexos de 99mTc(I) ………………………………………………………………. 203
4.4.7.1. Preparação do complexo precursor fac-[99mTc(H2O)3(CO)3]+…………………….. 203
4.4.7.2. Procedimento Geral para a Síntese dos Complexos Tc1 – Tc7…………………. 203
4.5. Estudos In Vitro……………………………………………………………………………………..………... 204
4.5.1. Determinação da Carga e da Lipofilía dos Complexos………………………………….. 204
4.5.2. Estabilidade In Vitro…………………………………………………………..…………….…………..205
4.5.3. Ligação à Hidroxiapatite……………………………………………….………………….…………..206
4.6. Estudos In Vivo…………………………………………………………………………..…………….……….206
4.6.1. Ensaios de Biodistribuição e Estabilidade In Vivo……………………………..……....... 207
4.6.2. Cintigrafia em câmara-gama……………………………………………………………..………… 211
Referências Bibliográficas………………………………………………….………………………………..…. 215
Anexo:
Espectros bidimensionais de Ressonância Magnética Nuclear (1H - 1H COSY e 1H - 13C
HSQC…………………………………………….…………………………………….……………………………….. 229
xvi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.1 - (A) Câmara PET; (B) Princípio geral da técnica PET e obtenção de
imagem............................................................................................. 10
Figura 1.2 - Imagem SPECT renal, em função do tempo, após injecção de 99mTc-MAG3...................................................................................... 12
Figura 1.3 - Imagem cerebral obtida por SPECT (em cima) e PET (em baixo),
após injecção de [99mTc]TRODAT e [18F]FDG, respectivamente…... 13
Figura 1.4 - Representação esquemática de um radiofármaco que contém um
elemento de transição ou pós-transição: (A) de perfusão e (B)
específico......................................................................................... 14
Figura 1.5 - Estruturas de ligandos utilizados para preparação de
radiofármacos de 99mTc desenvolvidos antes de 1980.................... 15
Figura 1.6 - Radiofármacos de perfusão em utilização clínica........................... 15
Figura 1.7 - Estruturas de dois radiofármacos específicos em utilização
clínica............................................................................................... 17
Figura 1.8 - Processo de metastização óssea. .................................................... 18
Figura 1.9 - Terapia paliativa de metástases ósseas........................................... 19
Figura 1.10 - Estruturas do EDTMP (ácido etilenodiaminatetrametilenofosfóni-
co) e respectivo complexo com 153Sm……………………………….……………… 21
Figura 1.11 - Estrutura geral dos bisfosfonatos e do ácido pirofosfórico............. 21
Figura 1.12 - Estrutura química de bisfosfonatos.................................................. 22
Figura 1.13 - Processo de renovação óssea promovido pela acção dos
osteoblastos e osteoclastos............................................................. 23
Figura 1.14 - Complexos com a unidade nitreto [M ≡ N]2+…................................ 25
Figura 1.15 - Complexos com a unidade [99mTc-HYNIC]. ..................................... 26
Figura 1.16 - Exemplos de complexos de tricarbonilo de Tc(I) com ligandos
tridentados……................................................................................. 26
Figura 1.17 - Fracções do polímero [Tc(MDP)(OH)-]∞. (A) O ligando MDP
estabelecendo a ponte entre dois centros Tc; (B) O metal
estabelece a ligação entre dois ligandos de MDP........................... 28
Figura 1.18 - (A) Imagem de corpo inteiro de coelho, 1 h após a injecção do
complexo 99mTc-EC-1 e 99mTc-MDP; (B) Imagem de corpo inteiro
de macaco, 2 h após a injecção do complexo 99mTc-EC-1 e de 99mTc-MDP………………………………………………………………………………….
30
xvii
Figura 1.19 - Imagem planar obtida 24 h após injecção de 186Re-MAG3-HBP
(222 MBq/kg) (A) e 186Re-HEDP (55,5 MBq/kg) (B). As setas
indicam o local onde foram injectadas as células do cancro da
mama MRMT-1………………………………………………………………………….. 31
Figura 1.20 - Sondas osteotrópicas Pam78 e Pam800 para imagem óptica……… 34
Figura 1.21 - Imagem bimodal SPECT (a cores)/CT (cinzento) obtida após
injecção de 99mTc-MDP (A) e de 99mTc-dpa-ALN (B) em ratinhos
Balb-c………………………………………………………………………………………….. 37
Figura 2.1 - Ligando bifuncional e respectivo complexo de tricarbonilo de Re
ou 99mTc, com um grupo R com afinidade para o osso.................... 41
Figura 2.2 - Esquema representativo de complexos trifuncionais com o
quelato pirazolo-diamina, contendo um grupo com afinidade
para o osso (R1) e uma molécula citótoxica (R2). .......................... 42
Figura 2.3 - Espectros de RMN de 1H (A), 13C (B) e 31P (C) do composto L2 em
D2O……………………………………………………............................................ 45
Figura 2.4 - Espectro de IV de L2 entre 1900 – 500 cm-1 (KBr)………………………… 46
Figura 2.5 - Espectros de IV do complexo [ReBr(CO)5] e de Re1 em KBr, entre
2300 – 500 cm-1................................................................................ 48
Figura 2.6 - Espectros de 1H-RMN dos compostos L1 e Re1 em CD3OD............. 50
Figura 2.7 - Espectro de 13C-RMN do composto Re1 em CD3OD........................ 51
Figura 2.8 - Espectros de RMN de 31P do complexo Re1, em CD3OD (A), do
composto L1, em CD3OD (B), do complexo Re2 na presença de
ligando livre L2, em D2O (C) e, do ligando L2, em D2O (D)……………. 52
Figura 2.9 - Cromatogramas analíticos de RP-HPLC do composto L2 e do
complexo Re2................................................................................... 53
Figura 2.10 - Diagrama ORTEP do catião do complexo Re1. Os elipsóides
vibracionais foram desenhados com uma probabilidade de 30 %.. 54
Figura 2.11 - Caracterização do precursor fac-[99mTc(H2O)3(CO)3]+ por RP-HPLC
após a sua preparação a partir de [99mTcO4]-. Detecção γ................ 57
Figura 2.12 - Cromatogramas de RP-HPLC obtidos durante a optimização da
preparação do complexo Tc1........................................................... 58
Figura 2.13 - Cromatogramas de RP-HPLC de Re1 (detecção UV) e Tc1
(detecção γ)………………………………………………………………….................. 59
Figura 2.14 - Cromatograma de HPLC de Tc1 (detecção γ) antes (A) e após (B)
incubação em soro humano............................................................. 61
Figura 2.15 - Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) dos complexos Tc1
e Tc2................................................................................................. 63
Figura 2.16 - Cromatogramas de RP-HPLC do complexo Tc2 e amostras 64
xviii
biológicas de ratinho CD-1 (detecção γ)...........................................
Figura 2.17 - Unidade quelante pirazolo-diamina funcionalizada com um grupo
carboxilato para conjugação a um bisfosfonato através de uma
função amida.................................................................................... 66
Figura 2.18 - ESI-MS do composto L5: (A) modo negativo; (B) modo positivo..... 78
Figura 2.19 - Espectros de IV do precursor [Re(CO)3 (H2O)3]Br e dos complexos
Re5 e Re6 em KBr, na região 2100 – 1500 cm-1............................... 87
Figura 2.20 - ESI-MS do complexo Re6: (A) modo negativo; (B) modo positivo... 88
Figura 2.21 - Cromatogramas de RP-HPLC dos complexos Re4, Re5 e Re6
(detecção UV, 254 nm), e os respectivos complexos análogos Tc4,
Tc5 e Tc6 (detecção γ)...................................................................... 90
Figura 2.22 - Distribuição de actividade na tira de electroforese para Tc6.......... 91
Figura 2.23 - Percentagem de ligação de Tc5 e Tc6 à HA (1 h de incubação, a 37
°C) (n = 3)………………………………………………………………………………..…… 92
Figura 2.24 - Fixação de Tc4 - Tc6 nos órgãos mais representativos de ratinhos
CD-1…………………………………………………………………………………………….. 94
Figura 2.25 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) dos complexos Tc5 e Tc6, em
ratinhos Balb-C……………………………………………………………….……………. 96
Figura 2.26 - Cromatogramas de RP-HPLC da preparação inicial de Tc4 e de
urina e soro de ratinho CD-1, recolhidos 1 h após injecção deste
complexo (detecção γ)…………………………………………………….…………… 98
Figura 2.27 - Radiocromatograma de 99mTc-MDP em (A) acetona e (B) NaCl 0,9
%............................................................................................................... 99
Figura 2.28 - Percentagem de ligação de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP à HA. A) 1h, 37
°C e B) 20 mg HA, 37 °C (n = 3)……………………………………………………. 99
Figura 2.29 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) de Tc5 - Tc6 e 99mTc-MDP, em
ratinhos CD-1 (A) e Balb-C (B)……………………………………………………… 101
Figura 2.30 - Razões de actividade no órgão alvo (osso) vs órgão não alvo para
Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP: A) ratinhos CD-1; B) Balb-c……….…………….. 102
Figura 2.31 - Excreção total (% A.I.) de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP, em ratinho CD-1
(n = 4)………………………………………………………………………………………….. 103
Figura 2.32 - Excreção total (% A.I.) de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP, em ratinho Balb-c (n =
4)…………………………………………………………………………………………………………… 104
Figura 2.33 - Imagem de corpo inteiro de rato Sprague Dawley, 2 h após
injecção de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP, obtidas em câmara γ................ 104
Figura 2.34 - Estrutura química do docetaxel (taxotere) e do paclitaxel (taxol)… 107
Figura 2.35 - (A) Estrutura de raios-X do heterodímero de tubulina com um
molécula de placlitaxel; (B) interacções determinadas por 108
xix
modelação molecular entre resíduos da unidade β-tubulina do
cérebro (B-brain) e uma molécula de placlitaxel ou docetaxel……..
Figura 2.36 - Estratégias para a síntese de ligandos trifuncionais a partir do
ácido glutâmico……………………………………………………………………………. 110
Figura 2.37 - Unidades para a funcionalização do ácido glutâmico…………………… 111
Figura 2.38 - Espectros de RMN de 31P em CDCl3, dos compostos 16 e 17………… 113
Figura 2.39 - ESI-MS (-) dos compostos 18, 19 e 20………………………………………………. 114
Figura 2.40 - Espectro de massa no modo negativo do composto 31 (impuro),
obtido com ionização por electrospray………………………………………… 121
Figura 2.41 - Espectro de RMN de 1H do composto 33 em D2O………………………… 123
Figura 2.42 - ESI-MS (+) do composto 33………………………………………………………….. 124
Figura 2.43 - Cromatogramas de RP-HPLC do complexo Tc7 (detecção γ)………… 126
Figura 2.44 - Estrutura química da cisteína e da histidina…………………………………. 128
Figura 2.45 - Cromatogramas de RP-HPLC obtidos após injecção do complexo
Tc7, na presença de A) cisteína e B) histidina (detecção γ)………….. 129
Figura 2.46 - Cromatogramas de RP-HPLC obtidos após injecção do complexo
Tc7, em amostras de urina de ratinho CD-1 (detecção γ)…………….. 131
Figura 3.1 - Estrutura de raios - X do catião do complexo Re1 e ângulos e
distâncias de ligação……………………………………………………………………. 138
Figura 3.2 - Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) dos complexos Tc1
e Tc2……………………………………………………………………………………………. 140
Figura 3.3 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) de Tc4 - Tc6 e 99mTc-MDP, em
ratinhos CD-1……………………………………………………………………………….. 141
Figura 3.4 - Imagem de corpo inteiro de rato Sprague Dawley, 2 h após
injecção de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP, obtidas em câmara γ……………… 144
Figura 3.5 - Representação das duas estratégias utilizadas para a síntese de
complexos trifuncionais……………………………………………………………….. 145
Figura 3.6 - Síntese do composto L7 (η = 10 %)……………………………………………….. 145
Figura 3.7 - Estrutura química do intermediário ALN-Glu-succinil-DTX……………. 146
Figura 3.8 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) de Tc7 em ratinhos CD-1…………….. 147
Figura 3.9 - Perspectiva para a funcionalização do ácido glutâmico……………….. 148
Figura 3.10 - Alternativa para a funcionalização do ácido glutâmico……………….. 148
Figura 3.11 - Síntese de um complexo trifuncional a partir de pz4-COOH 149
Figura A.1 - Ampliação do espectro de 1H - 1H COSY de L5, na zona δ 4,4 - 1,6
(D2O)……………………………………………………………………………………………. 229
Figura A.2 - Espectro de 1H – 13C HSQC de L5 (D2O)…………………………………………. 230
xx
Figura A.3 - Espectro de 1H – 1H COSY de Re5 (D2O)……………………………………….. 231
Figura A.4 - Ampliação do espectro de 1H - 1H COSY de Re5 na zona δ 4,5 - 1,7. 232
Figura A.5 - Espectro de 1H – 13C HSQC de Re5 (D2O)………………………………………. 233
xxi
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1.1 - Tipo de partículas, características físicas e aplicação terapêutica....... 9
Tabela 1.2 - Tumores primários com incidência de metástases ósseas ................. 18
Tabela 1.3 - Características físicas dos radionuclídeos utilizados para terapia e
eficácia dos respectivos radiofármacos................................................ 20
Tabela 2.1 - Comprimentos (Å) e ângulos (°) de ligação mais significativos para o
catião do complexo Re1………………………………………………………………….. 55
Tabela 2.2 - Rendimentos e condições experimentais na síntese de
Tc1…...................................................................................................... 58
Tabela 2.3 - Tempos de retenção (min) obtidos nos cromatogramas de HPLC e
valores de Log D…………………………………………………………………….………… 60
Tabela 2.4 - Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) e excreção total (%
A.I.) para os complexos Tc1 e Tc2 em ratinhos CD-1 fêmea................ 62
Tabela 2.5 - Condições experimentais estudadas para a síntese de 10 e 11 e
rendimentos das reacções………………………………………………………………. 71
Tabela 2.6 - Dados de RMN dos compostos 8 e L4 em CDCl3 e D2O,
respectivamente……….......................................................................... 74
Tabela 2.7 - Dados de RMN dos compostos 10 e L5 em D2O………........................... 75
Tabela 2.8 - Dados de RMN dos compostos 11 e L6 em D2O................................... 76
Tabela 2.9 - Dados de RMN dos compostos [Re(CO)3(κ3-pzAMDP)]+ e Re4 em
D2O....................................................................................................... 83
Tabela 2.10 - Dados de RMN dos compostos Re5 e Re6 em D2O…………………………… 84
Tabela 2.11 - Dados de RMN de 31P de L4 - L6 e Re4 - Re6……………………………………. 86
Tabela 2.12 - Percentagem de ligação a 20 mg de HA, determinada para Tc5 e Tc6,
em função do tempo de incubação a 37 °C.......................................... 93
Tabela 2.13 - Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) e excreção total (%
A.I.) para os complexos Tc4 - Tc6 em ratinhos CD-1............................ 94
Tabela 2.14 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) e excreção total (% A.I.) para os
complexos Tc5 e Tc6 em ratinhos Balb-c………….................................. 96
Tabela 2.15 - Fármacos conjugados a uma unidade bisfosfonato e correspondente
indicação terapêutica……………………………………….................................. 106
Tabela 2.16 - Percentagem de ligação à hidroxiapatite determinada a 37 °C para o
complexo Tc7, em função da massa de HA, e do tempo de
incubação……………………………………………………….……………………….………. 127
Tabela 2.17 - Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) e excreção total (% 130
xxii
A.I.) para o complexo Tc7 em ratinhos CD-1…………………………..…………
Tabela 2.18 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) e excreção total (% A.I.) de Tc7, com
e sem injecção de probenecide em ratinhos CD-1………………….………… 132
Tabela 3.1 - Avaliação biológica in vivo de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP em ratinho CD-
1…………………………………………………………………………………………….………… 142
Tabela 3.2- Avaliação biológica in vivo de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP em ratinho
Balb-c………………..…………………………………………………………………..………… 143
Tabela 4.1- Dados cristalográficos do composto fac-[Re(CO)3(κ3-L1)]Cl (Re1)……. 192
Tabela 4.2- Resultados de biodistribuição (% A.I./órgão) após administração dos
complexos Tc1 e Tc2 em ratinhos CD-1 fêmea…………………………………. 205
Tabela 4.3- Resultados de biodistribuição (% A.I./órgão) após administração dos
complexos Tc4, Tc5 e Tc6 em ratinhos CD-1…………………………………….. 206
Tabela 4.4- Resultados de biodistribuição (% A.I./órgão) após administração dos
complexos Tc5 e Tc6 em ratinhos Balb-c…………………………….……………. 206
Tabela 4.5- Resultados de biodistribuição (% A.I./órgão) após administração do
complexo Tc7 em ratinhos CD-1……………………………………….……………… 207
Tabela 4.6- Resultados de biodistribuição (% A.I./órgão) após administração do
complexo 99mTc-MDP em ratinhos CD-1 e Balb-C……………………………… 207
Tabela 4.7- Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) após administração
do complexo 99mTc-MDP em ratinhos CD-1 e Balb-C……………………….. 208
xxiii
ÍNDICE DE ESQUEMAS
Esquema 1.1 - Síntese de oxo-complexos de 186
Re, 99m
Tc e Re.............................. 29
Esquema 1.2 - Síntese do complexo 99m
Tc-HYNIC-HP (η = 39 %).......................... 32
Esquema 1.3 - Síntese dos complexos Pam-M-800 (M = Re, 99mTc)...................... 33
Esquema 1.4 - Síntese dos complexos M-CpTR-Gly-PAM (M = Re, η = 21 %, 186Re, η = 8 %)............................................................................... 35
Esquema 1.5 - Síntese dos complexos M-dpa-ALN (M = 99mTc, 188Re, Re)............ 37
Esquema 2.1 - Síntese dos compostos com grupos éster e ácido
monofosfónico.............................................................................. 43
Esquema 2.2 - Síntese dos complexos Re1 e Re2...................................................... 47
Esquema 2.3 - Síntese do precursor organometálico fac-[99m
Tc(CO)3(H2O)3]+..... 56
Esquema 2.4 - Síntese dos complexos Tc1 e Tc2................................................... 57
Esquema 2.5 - Síntese de aminobisfosfonatos: (A) AMDP; (B) PAM e ALN……….. 66
Esquema 2.6 - Síntese dos conjugados com bisfosfonatos L4 – L7……………….…… 68
Esquema 2.7 - Síntese dos intermediários 10 e 11……………………………………………. 69
Esquema 2.8 - Vias de síntese dos complexos Re4 - Re6…………………………………… 79
Esquema 2.9 - Síntese dos complexos Tc4 - Tc6……………………………………………….. 89
Esquema 2.10 - Síntese do ácido 4-amino-5-hidroxi-5,5-difosfonopentanoico
(18)…………………………………………………………………………………………. 111
Esquema 2.11 - Síntese do intermediário 21 e tentativas de síntese dos
compostos a - d………………………………….…………………………………… 115
Esquema 2.12 - Síntese do Me-PAM………………………………………………………………… 116
Esquema 2.13 - Tentativa de síntese do composto d………………………………..………. 117
Esquema 2.14 - Síntese do composto L7…………………………………………………………… 118
Esquema 2.15 - Síntese do intermediário 31 e estratégias para a síntese dos
compostos f - g que não foram testadas…………………………………. 120
Esquema 2.16 - Síntese dos compostos 33 e 35 e estratégia para a síntese do
composto j………………………………………………………………………………. 122
Esquema 2.17 - Síntese do composto 36…………………………………………………………. 125
Esquema 2.18 - Síntese do complexo Tc7…………………………………………………………. 126
Esquema 3.1 - Síntese dos ligandos bifuncionais L1 - L6…………………………………. 136
Esquema 3.2 - Síntese dos complexos Re1, Re2, Tc1 e Tc2 com a unidade
monofosfonato…………………………………………………………………..…… 137
Esquema 3.3 - Síntese de Re4 - Re6 com unidades bisfosfonato…………………….. 137
Esquema 3.4 - Síntese dos complexos Tc1, Tc2, Tc4 - Tc6……………………….………. 139
xxiv
xxv
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
ADN Ácido desoxiribonucleico
A.I./g Actividade injectada por grama de órgão
ALN Alendronato
BF Bisfosfonato
BM Biomolécula ou molécula biologicamente activa
Boc terc-butoxicarbonilo
Bq Becquerel
d Dupleto
DCC N,N’-diciclohexilcarbodiimida
DCU N,N’-diciclohexilureia
DIPEA Diisopropiletilamina
DMAP 4-(dimetilamino)piridina
DMF N,N-dimetilformamida
DMSA Ácido dimercapto-succínico
DMSO Dimetilsulfóxido
DOTP Ácido 1,4,7,10–tetraazaciclododecano-1,4,7,10–tetrafosfónico
DTPA Ácido dietilenotriaminopentaacético
DTX Docetaxel
ECD Dímero de etilcisteína
EDC N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida cloridratada
EDTMP Ácido etilenodiaminatetrametilenofosfónico
ESI-MS Espetrometria de massa com ionização por electrospray
Et Etilo
fac Facial
[18F]FDG [18F]-2-fluoro-2-deoxi-D-glicose
Fmoc 9-Fluorenylmetoxicarbonilo
g gramas
Glu Ácido glutâmico
h Hora
HA Hidroxiapatite
HATU Hexafluorofosfato de 2-(1H-7-azabenzotriazolo-1-il)-1,1,3,3-
tetrametiurónio
xxvi
HBTU Hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazolo-1-il)-1,1,3,3-tetrametiurónio
HEDP Ácido 1-hidroxietano-1,1-difosfónico ou etidronato
HMDP Ácido 1-hidroximetano-1,1-difosfónico
HMPAO Hexametilopropilenoamino oxima
HOBt Hidroxibenzotriazolo
His Histidina
HYNIC Ácido hidrazinonicotínico
Hz Hertz
ITLC Cromatografia em camada fina instantânea
IV Infravermelho
J Constante de acoplamento (em Hertz) entre dois núcleos
L Ligando
Log D logaritmo do coeficiente de partição octanol-água
LET Transferência linear de energia
m Multipleto
MAG3 Mercaptoacetiltriglicina
MAMA Monoaminamonoamida
MAS3 S-acetilmercaptotriserina
MDP Ácido metilenodifosfónico ou medronato
Me Metilo
MeOH Metanol
min Minuto
MRI Imagiologia por ressonância magnética
NEt3 Trietilamina
NHS N-hidroxisuccinimida
NHS-sulfo N-hidroxi-3-sulfo-succinimida
NMM N-metilmorfolina
PAM Pamidronato
PBS Tampão fosfato salino
PET Tomografia de emissão de positrões
PFF Pentafluorofenol
Ph Grupo fenilo
p.i. Após injecção (post-injection)
Po/w Coeficiente de partição octanol/água
ppm partes por milhão
xxvii
q Quarteto
RMN Ressonância magnética nuclear
RP-HPLC Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa
rpm Rotações por minuto
s Singuleto
SPECT Tomografia computorizada de fotão único
t Tripleto
t.a. Temperatura ambiente
t1/2 Periodo de semi-desintegração
TFA Ácido trifluoroacético
TFF Tetrafluorofenol
THF Tetrahidrofurano
TLC Cromatografia em camada fina
tR Tempo de retenção
TSTU tetrafluoroborato de N,N,N’,N’-Tetrametil-O-(N-succinimidil)uronio
UV Ultravioleta
Å Angstron
αααα Alfa
°C Graus centigrados
δδδδ Desvio químico
γγγγ Gama
ηηηη Rendimento
kn Hapticidade de um ligando
νννν Frequência de vibração
xxviii
1
PREÂMBULO
O equilíbrio dinâmico entre a reabsorção e a formação óssea mediada pelos
osteoclastos e pelos osteoblastos, respectivamente, é a base fisiológica da
remodelação do osso, que é regulada por um sistema complexo de factores locais e
sistémicos [1-3]. A perturbação deste equilíbrio origina patologias metabólicas
benignas e malignas osteo-articulares, como por exemplo a osteoporose, a doença de
Paget, o tumor ósseo e outras doenças associadas à destruição do osso [1, 2, 4].
A osteoporose, patologia caracterizada pela perda de massa óssea e pela
fragilização do osso, é considerada um problema grave de saúde pública e afecta
milhões de pessoas em todo o mundo. Devido ao aumento da esperança de vida esta
patologia está a aumentar, principalmente nas mulheres.
No domínio da oncologia, os avanços terapêuticos têm também contribuído
para o aumento da esperança média de vida, pelo que melhorar a qualidade da mesma
tornou-se um desafio. Neste contexto, as metástases ósseas provocadas pelas doenças
oncológicas têm merecido especial atenção visto que provocam complicações severas
tais como dor óssea, fracturas patológicas, hipercalcémia e compressão da medula
espinal. As metástases ósseas ocorrem em quase todos os tumores primários, sendo o
tumor da próstata e o da mama os que mais metastizam (65 a 75 %) [5, 6]. Tendo em
conta a elevada frequência com que ocorre a metastização e a diminuição da
qualidade de vida daí decorrente, as metástases ósseas constituem também um
problema de saúde pública de grande relevância.
Durante os últimos 30 anos, os bisfosfonatos (BFs) estabeleceram-se como uma
nova e eficaz classe de fármacos para o tratamento de patologias metabólicas
benignas ou malignas do sistema osteo-articular. Com o objectivo de aumentar a
potência dos BFs, como agentes de anti-reabsorção óssea, várias alterações na
estrutura química destes compostos foram realizadas. Os aminobisfosfonatos (e.g.
pamidronato e alendronato, figura 1) que, tal como o seu nome indica, possuem uma
função amina para além da unidade BF, têm demonstrado uma potência anti-
Preâmbulo
2
reabsortiva muito superior á dos BFs de primeira geração, como por exemplo o
medronato (MDP) que só contém a função BF (figura 1). Devido à sua acção, estes
compostos são reconhecidos como drogas efectivas na prevenção e na atenuação do
aparecimento de fracturas ósseas, na compressão da medula espinal e na atenuação
da dor associada ao aparecimento de metástases ósseas [7-11].
Figura 1
A acção in vivo destas moléculas deve-se à sua forte afinidade para ligação à
hidroxiapatite (HA), nomeadamente para a apatite biológica cristalizada
(Ca10(PO4)6(OH2)2, Ca / P = 1,66), que é o principal componente da matriz inorgânica do
osso (69 %). Essa elevada afinidade é explicada pela possibilidade que têm para se
coordenar aos iões Ca2+, através dos oxigénios desprotonados das unidades fosfonato.
A ligação dos BFs ao osso previne o crescimento de cristais e também a dissolução da
HA (modelos in vitro e in vivo), à semelhança do que já tinha sido observado para os
pirofosfatos [7, 8, 12]. Para além destes efeitos, as propriedades anti-reabsortivas dos
BFs têm sido correlacionadas com efeitos celulares nos osteoclastos.
O sucesso clínico dos BFs está também associado à sua utilização como
radiofármacos, que são compostos que têm na sua composição um elemento
radioactivo e são utilizados para o diagnóstico ou terapia de certas patologias. No caso
específico dos BFs, quando marcados com 99mTc foram utilizados na clínica para o
diagnóstico de metástases ósseas. As imagens do osso são obtidas devido à presença
do radionúclideo 99mTc, que no seu processo de desintegração emite radiação γ. Assim,
após injecção intravenosa dos BFs marcados com 99mTc eles localizam-se no osso e a
radiação emitida pelo radionuclídeo atravessa os tecidos e é detectada no exterior do
corpo do paciente. Esta técnica nuclear, designada por Tomografia Computorizada de
Preâmbulo
3
Fotão Único (SPECT), permite a obtenção de imagens designadas por cintigrafia óssea
[13].
Os BFs para cintigrafia começaram a ser estudados, no início dos anos 70, por
Subramanian, Perez, Yano e colaboradores. Estes investigadores sintetizaram e
avaliaram in vivo vários compostos contendo grupos fosfonato, nomeadamente 99mTc-
HEDP (HEDP: ácido 1-hidroxietano-1,1-difosfónico), 99mTc-MDP (MDP: ácido
metilenodifosfónico) e 99mTc-HDP (HDP: ácido 1-hidroximetano-1,1-difosfónico) [14-
17]. Alguns destes compostos foram aprovados nessa altura para utilização clínica, mas
actualmente só o 99mTc-MDP e o 99mTc-HDP continuam a ser utilizados para obtenção
de cintigrafias ósseas. Estes exames são normalmente recomendados para a detecção
de metástases ósseas mas também para o estadiamento de tumores ou para a
detecção de infecções ou de outras lesões traumáticas do osso [18]. Uma vantagem
importante da utilização destes compostos é a elevada sensibilidade da técnica de
imagem SPECT. A introdução nessa época destes radiofármacos sob a forma de kits
contribuiu também para a sua popularidade. Os centros Medicina Nuclear recebiam
uma mistura de reagentes liofilizados (kits) à qual adicionavam uma solução de
[99mTcO4]- e a formação do complexo final ocorria quando o metal se coordenava ao
bisfosfonato. Embora a verdadeira estrutura química destes compostos não seja
conhecida, pensa-se que, após adição do [99mTcO4]-, se forma uma mistura de espécies
[19, 20]. A fixação ao osso tem sido explicada considerando que após ligação do BF ao
99mTc ainda restam alguns grupos BFs livres para ligação aos iões Ca2+, que se
encontram expostos na superfície da HA. Esta fixação é mais significativa em zonas
metabolicamente activas da matriz óssea o que permite a visualização de locais de
elevada remodelação óssea [21].
A utilização de BFs como transportadores de radiação β- também foi aplicada
com sucesso na preparação de radiofármacos para tratamento paliativo da dor óssea.
Encontram-se actualmente em utilização clínica alguns compostos, como por exemplo
o 153Sm-EDTMP (EDTMP: ácido etilenodiaminatetrametilenofosfónico), o 186Re-HEDP e
o 188Re-HEDP [22-25].
Preâmbulo
4
Recentemente, os BFs têm também sido considerados bons veículos para
diferentes tipos de fármacos que, após conjugação à unidade bisfosfonato, têm sido
utilizados para tratamento específico de patologias osteo-articulares, como a
osteoporose, a osteoartrite, infecções crónicas e tumor ósseo [26, 27].
O trabalho apresentado nesta tese tinha como principal objectivo explorar a
química, radioquímica e o comportamento biológico, incluindo a afinidade para o osso,
de novos complexos de 99mTc contendo BFs. Pretendíamos explorar complexos deste
metal com estrutura química bem definida e os que apresentassem boa afinidade para
o osso deveriam ser ligados a moléculas citotóxicas. A síntese dos complexos análogos
de 188Re ou de 186Re era também um dos objectivos. Assim, os novos complexos seriam
constituídos por uma unidade BF, que conferia afinidade para o osso, uma molécula
com acção citotóxica e um elemento radioactivo emissor de radiação ionizante (β) com
capacidade para destruir células cancerígenas. Esperávamos que a utilização destes
complexos multifuncionais pudesse apresentar vantagens sobre a utilização das
actuais terapias múltiplas: quimioterapia seguida de radioterapia sistémica com um
radiofármaco.
No capítulo 1 apresenta-se uma introdução geral sobre medicina nuclear,
oncologia e metastização óssea. Faz-se também uma breve referência ao tratamento
paliativo da dor óssea e apresentamos os complexos de 186/188Re e 99mTc explorados
até ao momento para terapia e diagnóstico de metástases ósseas.
No capítulo 2 descreve-se a síntese, caracterização e avaliação biológica dos
novos complexos de Re e 99mTc contendo uma unidade monofosfonato ou
bisfosfonato. Descrevemos ainda as vias de síntese exploradas para a obtenção de
compostos contendo uma unidade citotóxica, um grupo bisfosfonato e um
radionuclídeo emissor de radiação β.
No capítulo 3 apresentam-se as conclusões finais e as perspectivas para
continuar este trabalho.
Finalmente, no capítulo 4 são apresentados todos os detalhes experimentais.
5
Nova secção
Introdução
Capítulo 1
7
1 - Introdução
1.1 – MEDICINA NUCLEAR
1.1.1 – Radiofármacos: Conceitos Básicos
A medicina nuclear é uma especialidade da medicina que recorre à
administração de radiofármacos para diagnóstico ou terapia de certas patologias. Os
radiofármacos são compostos sem acção farmacológica que contêm na sua
composição um radionuclídeo emissor de radiação electromagnética e/ou partículas
ionizantes.
De um modo geral, os compostos concebidos para aplicação radiofarmacêutica
deverão possuir determinadas propriedades, tais como: serem adequados para a
administração em pacientes, serem estáveis in vivo e, idealmente, serem selectivos
para o órgão alvo. Estes compostos são geralmente preparados sob a forma de uma
solução injectável e a estabilidade é avaliada face à hidrólise, oxidação, redução,
transquelatação e transmetalação. A selectividade e a farmacocinética dos compostos
são avaliadas através de estudos de biodistribuição in vivo. No que diz respeito à
farmacocinética, ela depende de vários factores, nomeadamente, solubilidade/lipofilía,
carga ou peso molecular [28-31].
A selecção do radionuclídeo, em função das suas características nucleares, é
fundamental pois determina a aplicabilidade do radiofármaco em diagnóstico ou
terapia.
Os radionuclídeos são nuclídeos instáveis que se transformam noutros
elementos emitindo radiação γ e/ou partículas α, β-, β+ ou electrões Auger. A selecção
de um radionuclídeo para diagnóstico ou terapia depende de diferentes parâmetros,
tais como a natureza da radiação e/ou partículas emitidas, a sua energia, o período de
semi-desintegração, o modo de produção, a pureza radionuclídica com que podem ser
obtidos e o seu custo/disponibilidade. O período de semi-desintegração (t1/2) é o
1.Introdução
8
tempo necessário para que o número de átomos radioactivos existentes num dado
instante se reduza a metade [28, 32].
Os compostos radioactivos para terapia deverão possuir na sua composição um
radionuclídeo emissor de partículas α, β- ou electrões Auger, pois este tipo de
partículas é ionizante e permite a destruição dos tecidos alvo. O radionuclídeo deve
possuir um período de semi-desintegração adequado à duração do tratamento e as
partículas emitidas devem ter uma energia adequada às dimensões do tumor e à
farmacocinética do radiofármaco. Os emissores β- têm sido os mais explorados, até ao
momento, para a aplicações terapêuticas, sendo alguns exemplos o 32P (t1/2 = 14,3
dias; Eβ-(max) = 1,71 MeV), 90Y (t1/2 = 2,7 dias; Eβ
-(max) = 2,27 MeV), 131I (t1/2 = 8,0 dias; Eβ
-
(max) = 0,81 MeV), 153Sm (t1/2 = 1,9 dias; Eβ-(max) = 0,8 MeV), 166Ho (t1/2 = 1,12 dias; Eβ
-(max)
= 1,86 MeV) e 177Lu (t1/2 = 6,7 dias; Eβ-(max) = 0,5 MeV).
A emissão de raios γ pode acompanhar a emissão de partículas, como acontece
por exemplo com o 131I, 153Sm, 166Ho e 177Lu, mas não contribui para a eficácia da
terapia, aumentando apenas a dose de radiação para o paciente. No entanto, sempre
que essa radiação γ tenha energia adequada para a obtenção de imagem pode tornar-
se vantajosa pois permite acompanhar in vivo a biodistribuição do radiofármaco e
seguir a sua acção terapêutica [25, 33].
A investigação de radiofármacos com radionuclídeos emissores de partículas α
ou electrões Auger encontra-se ainda numa fase inicial de investigação. No que diz
respeito aos radionuclídeos emissores de partículas α, a maioria tem períodos de semi-
desintegração demasiado longos para serem compatíveis com a sua aplicação
terapêutica. Por outro lado, a sua produção em larga escala e com pureza aceitável é
ainda difícil, pelo que apenas o 211At (t1/2 = 7,2 h, Eα(média) = 6,8 MeV) e o 212Bi (t1/2 = 1
h, Eα(média) = 7,8 MeV) têm sido considerados para terapia.
Os emissores de electrões Auger, tais como o 125I (t1/2 = 60,5 d, 20
electrões/decaimento), 111In (t1/2 = 67,9 h, 15 electrões/decaimento), 195mPt (t1/2 = 4 d,
36 electrões/decaimento) e 99mTc (t1/2 = 6,02 h, 4 electrões/decaimento), têm vindo a
ser investigados para possível aplicação em terapia [25]. Os compostos com emissores
Capítulo 1
9
Auger, devido ao curto alcance destas partículas, têm que ser concebidos por forma a
entrarem no núcleo das células tumorais e interactuarem com o ADN [34].
Como podemos observar através dos dados da tabela 1.1, a cada tipo de
partícula (α, β- ou electrões Auger) está associado um determinado valor de
transferência linear de energia (LET) e, consequentemente, um determinado alcance
médio nos tecidos. Por esta razão, o tipo de partículas a seleccionar deverá depender
das características do tumor. As partículas α ou os electrões Auger são mais
adequados para o tratamento de pequenos aglomerados de células tumorais,
enquanto as partículas β serão apropriadas para massas tumorais de maior dimensão.
Tabela 1.1 – Tipo de partículas, características físicas e aplicação terapêutica [34, 35].
Tipo de partículas
Alcance médio nos tecidos
Transferência linear de energia
Tipo de tratamentos
ββββ 1 – 12 mm
(>50 diâmetros celulares) 0,2 KeV/µm Massas tumorais
αααα 40 – 100 µm (algumas células)
80 keV/µm Células
individuais ou clusters
Electrões Auger
<1 µm (núcleo celular)
4 keV/µm Células
individuais
Os radiofármacos utilizados para diagnóstico têm na sua composição
radionuclídeos emissores de radiação γ ou de partículas β+. Idealmente, esses
radionuclídeos devem ter periodos de semi-desintegração relativamente curtos, para
minimizar a dose de radiação para o paciente, mas suficientemente longos para
permitirem a preparação, administração, distribuição e acumulação do radiofármaco
nos órgãos ou tecidos alvo e para permitir a aquisição da imagem [28].
1.Introdução
10
Em medicina nuclear existem duas técnicas para obtenção de imagem: a
Tomografia de Emissão de Positrões (PET – Positron Emission Tomography) e a
Tomografia Computorizada de Fotão Único (SPECT – Single Photon Emission
Computerized Tomography). A técnica PET utiliza radiofármacos emissores de
positrões (β+) e a SPECT utiliza radiofármacos emissores de radiação γ.
Na técnica PET, a detecção simultânea de dois fotões γ de 511 KeV emitidos
em direcções opostas, e que resultam de uma reacção de aniquilação entre o positrão
emitido pelo radiofármaco e os electrões dos tecidos circundantes, permite a
localização in vivo do radiofármao. Usando múltiplos detectores dispostos de um
modo circular é possível adquirir imagens tridimensionais (figura 1.1).
Figura 1.1 –(A) Câmara PET; (B) Princípio geral da técnica PET e obtenção de imagem.
Os radionuclídeos usados em PET são na sua maioria produzidos por ciclotrão,
sendo os mais utilizados o 18F (t1/2 = 110 min; Eβ+
(max) = 0,64 MeV), 15O (t1/2 = 2 min;
Eβ+
(max) = 1,72 MeV), 13N (t1/2 = 10 min; Eβ+
(max) = 1,19 MeV), e 11C (t1/2 = 20 min; Eβ+
(max)
= 0,96 MeV). Todos estes radionuclídeos apresentam um período de semi-
desintegração curto, o que é uma desvantagem, especialmente para os centros de
medicina nuclear que não possuam um ciclotrão [28, 36, 37]. O aparecimento recente
de geradores de radionuclídeos emissores de positrões, tal como o gerador 68Ge/68Ga,
aumenta a possibilidade de utilização da técnica PET. O 68Ge, a partir do qual se obtém
(A) (B)
Capítulo 1
11
o 68Ga, possui um período de semi-desintegração de 270,8 dias o que permite a
manufactura de sistemas de geradores de longa duração (entre 1 a 2 anos) [38-40].
A técnica SPECT utiliza radiofármacos que têm na sua composição
radionuclídeos emissores γ como o 99mTc (t1/2 = 6,02 h, Eγ (89 %) = 140 KeV), 111In (t1/2 =
67,9 h, Eγ (90 %) = 245 KeV), 123I (t1/2 = 13,20 h, Eγ (84 %) = 159 KeV), 67Ga (t1/2 = 78,26 h,
Eγ = 92 KeV (64 %), 180 KeV (24 %), 300 KeV (22 %)), e 201Tl (t1/2 = 72 h, Eγ = 167 KeV (10
%), 135 KeV (3 %)). A energia da radiação γ emitida por estes radionuclídeos está
compreendida entre 80 e 300 KeV, valores que são adequados para que sejam
detectados com eficiência pela câmara SPECT actualmente em utilização [41-43].
As técnicas PET e SPECT, quando comparadas com outras técnicas
convencionais de imagem, nomeadamente com a tomografia computorizada (CT) e a
imagiologia por ressonância magnética (MRI), possuem uma sensibilidade superior.
Além disso, uma vantagem fundamental associada às técnicas nucleares relaciona-se
também com a possibilidade de, simultaneamente, se poder obter informação
morfológica e funcional dos órgãos e tecidos alvo em estudo. Por exemplo, a função
cardíaca pode ser avaliada após administração de um dado radiofármaco e a aquisição
de imagem pode ser realizada em situação de repouso ou de esforço físico. Outro
exemplo consiste na avaliação da função renal, após administração de um
radiofármaco e aquisição de imagens ao longo do tempo [28]. Como exemplo,
apresentam-se na figura 1.2 imagens renais e um renograma, obtidos após
administração de 99mTc-MAG3, que é um radiofármaco de perfusão utilizado para
estudar a morfologia e a função renal. A avaliação das imagens, em conjugação com o
renograma, permite concluir que o rim esquerdo apresenta uma anomalia de
funcionamento.
1.Introdução
12
Figura 1.2 - Imagem SPECT renal, em função do tempo, após injecção de 99mTc-MAG3 [44].
Qualquer uma destas técnicas, SPECT e PET, permite também obter informação
in vivo, ao nível molecular, podendo quantificar a sobre-expressão de receptores,
enzimas ou outros alvos moleculares [45]. Na figura 1.3, podem observar-se as
imagens obtidas por SPECT e PET, após injecção de [99mTc]TRODAT e [18F]FDG,
emissores γ e β+, respectivamente. O [99mTc]TRODAT possui especificidade para os
transportadores da dopamina, permitindo detectar a sub-expressão destes alvos
moleculares nos pacientes com a doença de Parkinson. A [18F]FDG permite a detecção
de determinadas patologias onde o metabolismo da glucose é alterado relativamente
ao normal. Como se mostra na figura 1.3, apesar deste composto não ser específico
para nenhum receptor ou alvo molecular, permite a detecção da doença de Alzheimer
pelo facto do metabolismo da glucose estar diminuído.
Rim Esquerdo
Rim Direito
minutos
Contagens/min
2 - 3 minutos - Captação 19 - 20 minutos - Excreção
Rim Direito
Rim Direito
Rim Esquerdo
Rim Esquerdo
Capítulo 1
13
Figura 1.3 - Imagem cerebral obtida por SPECT (em cima) e PET (em baixo), após injecção de [99mTc]TRODAT e [18F]FDG, respectivamente [46, 47].
1.1.2 - Radiofármacos de 99mTc
O tecnécio – 99m é o radioisótopo mais utilizado em exames de diagnóstico, o
que se deve essencialmente às propriedades nucleares acima referidas (t1/2, Eγ(max)), à
sua disponibilidade a baixo custo, ao modo de fornecimento (gerador de 99Mo/99mTc) e
à sua química variada.
Os radiofármacos que têm este elemento na sua composição, podem ser
classificados genericamente de acordo com as suas características de biodistribuição
como agentes de perfusão (figura 1.4, A) ou como agentes específicos (figura 1.4, B).
Os radiofármacos de perfusão são compostos cujas propriedades físico-químicas,
nomeadamente o tamanho, carga e lipofilia, determinam a sua biodistribuição. Os
radiofármacos específicos são compostos cuja biodistribuição depende das suas
propriedades físico-químicas, mas também da natureza da biomolécula que existe na
sua composição. Quando um radiofármaco específico contém na sua composição um
elemento de transição ou de pós-transição é normal que este seja estabilizado por um
ligando bifuncional. O ligando bifuncional é um composto orgânico que
PACIENTE COM PARKINSON
INDIVÍDUO SAUDÁVEL
SPECT: [99mTc]Trodat
PET: [18F]FDG
PACIENTE COM ALZHEIMER
INDIVÍDUO SAUDÁVEL
1.Introdução
14
simultaneamente estabiliza o elemento de transição ou pós-transição, ao qual se
coordena, mas também estabelece a ligação desse elemento a uma biomolécula que
pode ser, por exemplo, um péptido, um anticorpo monoclonal ou uma pequena
molécula com especificidade para um dado alvo [43].
((AA)) Radiofármaco de perfusão
((BB)) Radiofármaco específico
Figura 1.4 - Representação esquemática de um radiofármaco que contém um elemento de
transição ou pós-transição: (A) de perfusão e (B) específico.
O pertecnetato de sódio (Na[99mTcO4]) foi o primeiro composto de tecnécio a
ser administrado a doentes para visualização da tiróide, onde se fixava devido ao facto
de ter uma carga idêntica à do ião iodeto, que também se acumula preferencialmente
nesta glândula [48].
De seguida, surgiram outros radiofármacos de perfusão de 99mTc, onde o metal,
num estado de oxidação reduzido, era estabilizado por ligandos com estruturas
conhecidas (figura 1.5). Por exemplo, os complexos 99mTc-gluconato, 99mTc-
glucoheptonato, 99mTc-DMSA e 99mTc-DTPA localizavam-se nos rins e serviam para o
estudo da função renal. Os complexos 99mTc-MDP, 99mTc-HMDP e 99mTc-HEDP surgiram
também nessa época para o estudo do osso [49].
Capítulo 1
15
Figura 1.5 – Estruturas de ligandos utilizados para preparação de radiofármacos de 99mTc desenvolvidos antes de 1980. (DMSA, ácido dimercapto-succínico, DTPA, ácido dietilenotriaminapentaacético, MDP, ácido metilenodifosfónico ou medronato, HMDP, ácido 1-hidroximetano-1,1-difosfónico e HEDP, ácido 1-hidroxietano-1,1-
difosfónico ou etidronato).
Quando surgiram estes radiofármacos a química básica do tecnécio não estava
muito desenvolvida e a caracterização estrutural dos novos complexos não era um
requisito indispensável para a sua aprovação clínica.
Na década de 80 do século passado, outros radiofármacos de perfusão com
estrutura bem definida foram introduzidos no mercado. Por exemplo, os complexos
neutros e lipofílicos 99mTc-ECD e 99mTc-HMPAO são agentes de perfusão cerebral, os
complexos catiónicos e lipofílicos 99mTc-Sestamibi e 99mTc-Tetrofosmina são agentes de
perfusão do miocárdio e o 99mTc-MAG3 aniónico é um agente de perfusão renal (figura
1.6) [49].
Figura 1.6 – Radiofármacos de perfusão em utilização clínica.
99m
Tc-ECD (Neurolite®) Uso clínico: perfusão cerebral
99mTc-
HMPAO (Ceretec®) Uso clínico: perfusão cerebral
99mTc-MAG3
(Technescan® MAG3) Uso clínico: imagem renal
99mTc-
Tetrofosmina (Myoview®) Uso clínico: perfusão do miocárdio
99mTc-Sestamibi
(Cardiolite®) Uso clínico: perfusão do miocárdio; tumor da mama
Tc
C
C
C
C
C
C
N
N
N
N
N
N
R
R
R
RR
R
OMeR =
1.Introdução
16
Mais recentemente, tem-se desenvolvido uma investigação intensa no sentido
de encontrar radiofármacos específicos. Os avanços científicos conseguidos devem-se
em parte à intensa investigação em biologia molecular e, consequentemente, à
identificação e compreensão dos mecanismos moleculares responsáveis pelo
aparecimento de determinadas patologias. De toda esta temática surgiu o conceito de
imagiologia molecular que consiste na visualização, caracterização e medição in vivo e
em tempo real de processos biológicos que decorrem ao nível celular ou molecular.
Comparativamente a outras técnicas convencionais, a Imagiologia Molecular pode
permitir um diagnóstico precoce de certas patologias, visto que as alterações a nível
molecular precedem as alterações anatómicas. [38, 50-57].
Na figura 1.7 apresentam-se as estruturas químicas de dois exemplos de
radiofámacos específicos de 99mTc, nomeadamente o 99mTc-Depreotide (NeoTect®) e o
99mTc-Apcitide (Acutect®) [32]. O 99mTc-Depreotide é um oxo-complexo de 99mTc(V)
estabilizado por um ligando tetradentado ligado a um péptido análogo da
somatostatina. Este radiofármaco permite a localização de tumores pulmonares
porque reconhece os receptores da somatostatina, que estão sobreexpressos neste
tipo de tumores.
O 99mTc-Apcitide é um oxo-complexo monoaniónico de 99mTc(V) estabilizado por
um ligando tetradentado ligado a um péptido sintético que permite a visualização de
tromboses venosas agudas nas extremidades inferiores. A especificidade deste
radiofármaco advém da sua interacção específica com os receptores GPIIb/IIIa que
estão sobreexpressos nas plaquetas activadas, componente principal na formação
activa de trombos.
Capítulo 1
17
Figura 1.7 - Estruturas de dois radiofármacos específicos em utilização clínica.
1.2 - ONCOLOGIA E METASTIZAÇÃO ÓSSEA
A diferença essencial entre tumores benignos e malignos reside no facto dos
primeiros serem facilmente controláveis e não cancerígenos, enquanto os segundos
têm a capacidade de metastizar ou invadir outros tecidos. A probabilidade de
formação de metástases ósseas, após o aparecimento de um tumor primário maligno,
depende do tipo de tumor diagnosticado. Na tabela 1.2 apresentam-se alguns tumores
primários bem como a sua probabilidade de metastização óssea. Por exemplo, a
percentagem de incidência de metástases ósseas encontra-se entre 65 e 75 % nos
pacientes com cancro de mama ou próstata e entre 70 e 95 % nos pacientes com
mieloma. Outros tumores primários estão também associados ao aparecimento de
metástases ósseas embora com menor incidência, nomeadamente o tumor da tiróide
(60 %), do pulmão (30 – 40 %), do rim (20 – 25 %), melanoma (14 - 45 %) e da bexiga
(40 %) [58].
99mTc-Depreotide (NeoTect®)
99mTc-Apcitide (Acutec®)
1.Introdução
18
Como esquematizado na figura 1.8, a metastização óssea ocorre quando as
células tumorais conseguem separar-se de um tumor primário (A), seguindo-se a
angiogénese, isto é, a formação de novos vasos sanguíneos que facultam o
fornecimento de nutrientes e oxigénio às células do tumor (B), a invasão de células
malignas através da circulação sanguínea (C), embolismo (D), retenção das células
malignas seguida da adesão em capilares do tecido ósseo distante (E e F), extravasão
(G) e a proliferação no microambiente ósseo.
Figura 1.8 – Processo de metastização óssea. Adaptado de [59].
Tabela 1.2 – Tumores primários com incidência de metástases ósseas.
Tumor primário Incidência Metastização Óssea (%)
Mieloma 70 - 95
Mama 65 - 75
Próstata 65 - 75
Tiróide 60
Pulmão 30 - 40
Rim 20 - 25
Melanoma 14 - 45
bexiga 40
A. Tumor primário B. Formação de novos vasos sanguíneos C. Invasão de tecidos adjacentes D. Embolismo E. Retenção em capilares de tecidos ósseos distantes
F. Adesão G. Extravasão do caplilar sanguíneo
A metastização ósse
um conjunto de patologi
compressão da medula espin
Frequentemente, a do
seguem as fracturas, a lib
ocorrer a compressão da m
com que ocorrem e a diminu
metástases ósseas constitue
1.2.1 - Cuidados Paliativos e
A terapia das metásta
fracturas patológicas e
sobrevivência. De acordo co
local, através de cirurgia
analgésicos, hormonoterap
(figura 1.9) [6, 22, 60].
Figura 1.9 – Terapia paliativa d
LOCAL
RadioteraExterna
Cirurgi
ssea provoca o enfraquecimento sucessivo do
logias, tais como dor óssea, fracturas, hip
espinal.
a dor óssea é o primeiro sinal de metastizaçã
libertação de cálcio (hipercalcémia) e final
a medula espinal [58]. Tendo em conta a eleva
minuição da qualidade de vida que provocam no
ituem um problema de saúde pública de grande
os e Tratamento da Dor Relacionada com Metá
tástases ósseas tem como objectivo aliviar a do
conservar a actividade e mobilidade, a
o com a avaliação clínica do paciente o tratam
gia e radioterapia externa, ou sistémico, isto
erapia, quimioterapia, radiofármacos ou bisfo
iva de metástases ósseas. Adaptado de [61].
TRATAMENTO PALIATIVO DE METÁSTASES ÓSSEAS
terapiaterna
urgia
SISTÉMICO
Analgésicos
Hormonotera
Quimioterap
Bisfosfonato
Radiofármac
Capítulo 1
19
do osso e origina
hipercalcémia e
ização, ao qual se
inalmente poderá
elevada frequência
nos pacientes, as
nde relevância.
etástases Ósseas
dor, prevenir as
, aumentando a
tamento pode ser
isto é utilizando
bisfosfonatos (BF)
sicos
terapia
erapia
natos
macos
1.Introdução
20
A utilização de analgésicos e anti-inflamatórios é recomendada como primeira
abordagem pela Organização Mundial de Saúde sendo utilizada rotineiramente no
combate à dor [62, 63]. Porém, a utilização de analgésicos origina efeitos secundários,
que podem ser mais graves do que a própria dor óssea. Além disso, como esses
fármacos não agem directamente sobre a evolução das metástases, recomenda-se
frequentemente a utilização de doses crescentes ou a utilização de abordagens
terapêuticas diferentes, como a cirurgia, terapia hormonal, quimioterapia e/ou
utilização de bisfosfonatos. A radioterapia externa é frequentemente utilizada, com
efeitos paliativos consideráveis da dor localizada, sendo particularmente útil no
tratamento da compressão da medula óssea, ou sempre que existam fracturas de risco
elevado. No entanto, esta modalidade terapêutica envolve toxicidade medular e
alguma incerteza quanto à natureza dos efeitos na estrutura do osso [58].
Para tratamento paliativo da dor óssea os radiofármacos utilizados são emissores
β-. Na tabela 1.3 apresentam-se algumas das características físicas dos radionúclideos
que são considerados como paliativos da dor óssea. A eficácia deste tipo de
tratamento no alívio da dor óssea foi avaliada para alguns dos radiofármacos em
utilização clínica e oscila entre 50 e 92 % [22-25].
Tabela 1.3 – Características físicas dos radionuclídeos utilizados para terapia e eficácia
dos respectivos radiofármacos.
Radionuclídeo Radiofármaco Meia-Vida
t1/2 (d) EnergiaMax(β)
(MeV) Energia (γ)
(MeV)
Alcance máximo
(mm) Alívio da dor
32P Na332PO4 14.3 1.71 --- 8 57 – 92 %
89Sr 89SrCl2 50.5 1.46 0.91 (0.01%) 6.7 57 – 83.6 % 153Sm 153Sm-EDTMP 1.9 0.81 0.103 (28%) 3.4 61.5 – 84% 186Re 186Re-HEDP 3.7 1.07 0.137 (9%) 4.7 50 – 92 % 188Re 188Re-HEDP 0.7 2.12 --- 3 60 – 92%
177Lu 177Lu-EDTMP
177Lu-DOTP 6.7 0.497 0.208 (11%) 1.8 Avaliação pré-clinica
166Ho 166Ho-DOTP 1.1 1.86 0.081 (6.2%) 8.6 Avaliação pré-clinica
Capítulo 1
21
O Fósforo-32 (Na332PO4) e o estrôncio-89 (89SrCl2) foram os primeiros compostos
aprovados para o tratamento paliativo da dor óssea. A sua afinidade natural para o
osso metabolicamente activo com actividade osteoblástica elevada permite que sejam
incorporados na HA após injecção intravenosa [22]. Devido a várias limitações,
incluindo elevada mielotoxicidade, a utilização clínica do 32P diminuiu
consideravelmente desde os anos 80. Desde então têm sido mais utilizados o 89Sr
(89SrCl2), 153Sm (153Sm-EDTMP), 186Re (186Re-HEDP) e 188Re (188Re-HEDP) [22].
Complexos contendo os radionuclídeos 177Lu e 166Ho estão ainda numa fase de
avaliação clínica. Ao contrário do 32P e do 89Sr, os restantes radioisótopos são utilizados
após coordenação a ligandos polidentados contendo grupos fosfonato. Na figura 1.10
apresenta-se a estrutura proposta para o complexo 153Sm-EDTMP [25].
Figura 1.10 – Estruturas do EDTMP (ácido etilenodiaminatetrametilenofosfónico) e respectivo
complexo com 153Sm.
1.2.2. - Bisfosfonatos: Mecanismo de Acção
Como se mostra na figura 1.11 os bisfosfonatos (BFs) são análogos do
pirofosfato endógeno.
P
OH
OH
OP
OH
OH
O
R1
R2
OH
O
OH
O P
OH
P
OH
Bisfosfonato
Constituinte Fisiológico
Ácido pirofosfórico
C O
Figura 1.11 – Estrutura geral dos bisfosfonatos e do ácido pirofosfórico. (R1 = H ou OH, R2 =
grupo substituinte que interfere na acção biológica dos BFs).
1.Introdução
22
Na estrutura dos BFs, a ligação entre os dois grupos fosfato é feita através de
um átomo de carbono (P – C – P), enquanto no pirofosfato esta ligação é feita através
de um átomo de oxigénio (P – O – P). Esta diferença química torna os BFs resistentes à
degradação enzimática in vivo, e por isso adequados para utilização clínica.
As propriedades como agentes inibidores da calcificação, bem conhecidas para
os pirofosfatos, foram pela primeira vez observadas para os análogos BFs por Fleisch
em 1968 [64]. Após esta descoberta, foram ainda necessários vários anos até que os
BFs fossem introduzidos na clínica como agentes de anti-reabsorção óssea.
Actualmente, esta classe de compostos encontra-se bem estabelecida e a sua acção é
utilizada em desordens comuns do esqueleto, nomeadamente na osteoporose, doença
de Paget e metástases ósseas [1-4].
Desde a sua introdução, a estrutura básica dos BFs (R1 = R2 = H) tem vindo a ser
alterada por forma a aumentar a sua eficiência clínica [65]. Na figura 1.12 mostram-se
os diferentes BFs sintetizados até ao momento (R1 ≠ R2).
Figura 1.12 – Estrutura química de bisfosfonatos.
Os BFs de primeira geração, considerados os menos potentes, são o
medronato, clodronato, etidronato e tiludronato (figura 1.12). Posteriormente,
Tiludronato
OHP
OH
OHP
OH
O
O
HO
S
ClOH
POH
OHP
OH
O
O
Medronato(MDP)
OHP
OH
OHP
OH
O
O
Cl
Cl
Clodronato
OHP
OH
OHP
OH
O
O
HO
CH3
Etidronato(HEDP)
OHP
OH
OHP
OH
O
O
HO
H2N
Pamidronato
OHP
OH
OHP
OH
O
O
HO
H2N
Alendronato
OHP
OH
OHP
OH
O
O
HO
N
Ibandronato
Zoledronato
NN
OHP
OH
OHP
OH
O
O
HO
N
OHP
OH
OHP
OH
O
O
HO
RisedronatoMinodronato
N
N
OHP
OH
OHP
OH
O
O
HO
Capítulo 1
23
verificaram que a afinidade dos BFs para a hidroxiapatite (HA) era mais elevada
quando R1 = OH, o que se deve provavelmente à coordenação tridentada dos BFs ao
Ca2+ da HA [66]. Assim, os BFs das gerações seguintes possuem todos um grupo
hidroxilo (R1 = OH). O grupo R2 tem vindo a ser modificado, sendo a sua natureza
aparentemente determinante para a potência destes compostos enquanto inibidores
da reabsorção óssea [8, 67, 68].
Nos aminobisfosfonatos, tais como o pamidronato e alendronato, os grupos
aminoetil ou aminopropil torna-os 10 a 100 vezes mais potentes do que os compostos
de primeira geração. Posteriormente, demonstraram que os compostos de terceira
geração, risedronato [69] e zoledronato [70], são ∼ 10 000 vezes mais potentes do que
os de primeira geração, o que parece estar relacionado com a presença de aminas
cíclicas na sua estrutura.
Apesar da estrutura óssea parecer sólida e estável, está sujeita a uma constante
renovação. Existem determinadas células, os osteoclastos, que removem cálcio do
osso, enquanto outras células, os osteoblastos, repõem esse cálcio (figura 1.13). Em
certas patologias, este processo fica desequilibrado e quando o cálcio é removido da
estrutura óssea mais rapidamente do que é substituído surge a osteoporose. A acção
dos BFs reduz este problema inibindo a actividade dos osteoclastos [3, 71, 72].
Figura 1.13 – Processo de renovação óssea promovido pela acção dos osteoblastos e osteoclastos. (Representação esquemática de reabsorção óssea excessiva, mediada por osteoclastos, não compensada pela formação óssea mediada por osteoblástos, que se pode verificar, por exemplo, na presença de patologias como a osteoporose). Adaptado de [73].
Matriz orgânica do osso Matriz inorgânica do osso
Formação Reabsorção
Osteoblastos Osteoclastos
1.Introdução
24
De acordo com Rogers e colaboradores [74], os bisfosfonatos de primeira
geração actuam como pró-drogas, sendo convertidos em metabolitos activos, que
sofrem acumulação intracelular in vivo nos osteoclastos inibindo a sua acção e
provocando a apoptose destas células. Os aminobisfosfonatos não sofrem
metabolização mas actuam como inibidores dos componentes da via de biossíntese do
colesterol.
Existe também evidência pré-clinica da acção antitumoral dos BFs, mas este
princípio é ainda controverso na classe médica, necessitando de confirmação adicional
[67, 75-78].
1.3 - COMPLEXOS DE 186/188Re e 99mTc PARA TERAPIA OU DIAGNÓSTICO
DE METÁSTASES ÓSSEAS
1.3.1 – Considerações Gerais
O Re e Tc têm propriedades químicas semelhantes formando complexos
estruturalmente análogos. No entanto, existem diferenças significativas entre estes
dois elementos, nomeadamente a maior facilidade de oxidação e inércia cinética dos
complexos de Re. Na literatura podemos encontrar vários exemplos onde a mesma
estrutura é atribuída a complexos de 99mTc, 186/188Re ou Re natural [38, 41, 79-81]. Os
radionuclídeos 99mTc e 188Re são obtidos a partir dos geradores 99Mo/99mTc e
188W/188Re, respectivamente. O 186Re é um radionuclídeo produzido em reactores
nucleares por irradiação de 185Re com neutrões (185Re(n,γ)186Re). O 99mTc, 188Re e o
186Re são obtidos sob a forma de permetalatos [MO4]- (M = 99mTc, 188Re e o 186Re)
encontrando-se o metal no estado de oxidação +7. Para a preparação de muitos dos
complexos destes elementos, que estão em utilização clínica ou pré-clínica, o
permetalato tem que ser reduzido a um estado de oxidação mais baixo. O estado de
oxidação final depende do agente redutor, das condições reaccionais e da natureza do
agente quelante.
Capítulo 1
25
Da gama de estados de oxidação possíveis (-1 a +7) para o Re e Tc, o +5 tem
sido o mais explorado para aplicações radiofarmacêuticas. Um dos redutores mais
utilizados para a preparação de compostos de 99mTc(V) tem sido o cloreto estanoso
(SnCl2.2H2O). Podem ainda utilizar-se outros redutores, tais como o borohidreto de
sódio (NaBH4), o ditionito de sódio (Na2S2O4), as hidrazinas ou as fosfinas terciárias,
dependendo do estado de oxidação final pretendido. O pH, temperatura e
concentração dos reagentes têm também que ser optimizados [28].
O Re e Tc no estado de oxidação +5 podem formar complexos com os seguintes
fragmentos metálicos: [M = O]3+, trans-[MO2]+, [M ≡ N]2+ e [M-HYNIC](HYNIC = ácido
6-hidrazinonicotinico) [79].
Os complexos com a unidade [M = O]3+ apresentam normalmente uma
geometria de coordenação do tipo pirâmide quadrangular e os ligandos mais utilizados
para estabilizar esta unidade têm sido do tipo diaminaditiol, diamidaditiol,
monoamidamonoaminaditiol ou triamidatiol. Muitos dos radiofármacos em utilização
clínica possuem esta unidade e são estabilizados por ligandos deste tipo: 99mTc-ECD,
99mTc-HMPAO e 99mTc-MAG3, 99mTc-Depreotide e 99mTc-Apcitide (figuras 1.6 e 1.7).
Os complexos com a unidade trans-[MO2]+ apresentam normalmente uma
geometria de coordenação octaédrica. Os dois ligandos oxo ocupam as posições axiais
e as equatoriais são ocupadas por quatro ligandos monodentados, ou por um ligando
tetradentado doador de N.
Os complexos com a unidade nitreto [M ≡ N]2+ podem ser estabilizados por dois
ligandos bidentados ou por uma bisfosfina do tipo PXP (X = S ou NR) e por um ligando
bidentado doador de S, N ou O, que pode eventualmente estar ligado a uma
biomolécula. Na figura 1.14 mostra-se a estrutura de alguns destes complexos [38, 82].
Figura 1.14 - Complexos com a unidade nitreto [M ≡ N]2+.
1.Introdução
26
Os complexos com a unidade [M-HYNIC] são normalmente estabilizados
utilizando co-ligandos do tipo ácido etilelenodiaminadiacético, tricina, ou ligandos
monodentados do tipo piridina, imidazol ou fosfina hidrossolúvel. Na figura 1.15
apresentam-se exemplos de complexos com a unidade [Tc-HYNIC] explorados nos
estudos que envolvem a concepção de radiofármacos específicos [79].
Figura 1.15 - Complexos com a unidade [99mTc -HYNIC].
Recentemente, foi introduzido o precursor organometálico fac-
[99mTc(H2O)3(CO)3]+, por Alberto e colaboradores, que desencadeou o interesse pela
investigação de novos complexos no estado de oxidação +1. A facilidade de preparação
deste precursor, a robustez química da unidade fac-[99mTc(CO)3]+ e a labilidade das três
moléculas de água tornaram esta química aliciante para aplicações médicas [83]. O
precursor fac-[99mTc(H2O)3(CO)3]+ reage com uma série de ligandos de denticidade
variável por substituição de uma, duas ou três moléculas de água. Os estudos
realizados mostraram que a unidade fac-[99mTc(CO)3]+ forma complexos estáveis
quando é estabilizada por ligandos tridentados, independentemente da sua carga ou
conjunto de átomos doadores. Através da escolha criteriosa dos ligandos, os
complexos formados apresentam um carácter catiónico, neutro ou aniónico, o que
pode facilitar o controlo das suas propriedades físico-químicas e da sua
farmacocinética (figura 1.16) [41, 81, 84, 85].
Figura 1.16 – Exemplos de complexos de tricarbonilo de Tc(I) com ligandos tridentados.
Capítulo 1
27
1.3.2 – Complexos para Visualização e/ou Terapia de Metástases Ósseas
Tal como já foi referido anteriormente, o 99mTc-MDP (Technescan MDP®) e o
99mTc-HDP (Osteoscan HDP®) são os dois radiofármacos, em utilização clínica para o
diagnóstico de metástases ósseas, especialmente em casos de cancro da próstata e da
mama [22-25, 60]. Complexos análogos de 186/188Re foram também preparados e
avaliados para a terapia paliativa da dor óssea. O 186Re-HEDP já foi aprovado em alguns
países da Europa [60] e o 188Re-HEDP encontra-se em ensaios clínicos [86-90].
Apesar do sucesso obtido com estes radiofármacos eles apresentam várias
limitações que estão relacionadas com a sua falta de especificidade, lenta depuração
sanguínea e desconhecimento da sua real estrutura química [91]. Com base em
estudos de HPLC (Cromatografia líquida de alta eficiência), sabe-se que estes
complexos não são uma espécie única e bem definida. Em solução existe uma mistura
de espécies, cuja composição varia ao longo do tempo e cada uma dessas espécies
possui propriedades biológicas diferentes, tais como selectividade e estabilidade [92,
20].
Na tentativa de compreender qual a estrutura química do complexo 99mTc-
MDP, vários esforços têm sido realizados a nível macroscópico utilizando 99Tc ou Re.
Num desses estudos obtiveram monocristais adequados à análise de raios-X e com
base nessa análise demonstraram a existência de um polímero com composição
estequiométrica [Tc(MDP)(OH)-]∞. Verificaram que cada ligando MDP estabelecia uma
ponte entre dois átomos de tecnécio [figura 1.17 (A)] e cada Tc estava ligado a dois
ligandos MDP [figura 1.17 (B)]. A repetição polimérica completava-se com um átomo
de oxigénio, provavelmente um hidroxilo, que estabelecia a ponte entre dois átomos
de Tc. A geometria de coordenação era aproximadamente octaédrica, mas o estado de
oxidação continua incerto, pois não foi possível concluir se seria um grupo oxo ou um
grupo hidroxilo que estabelecia a ponte entre os dois átomos de Tc [21].
1.Introdução
28
Figura 1.17 - Fracções do polímero [Tc(MDP)(OH)-]∞. (A) O ligando MDP estabelecendo a ponte entre dois centros Tc; (B) O metal estabelece a ligação entre dois ligandos de MDP. Adaptado de [93].
Uma outra desvantagem relacionada com o 99mTc-MDP e 99mTc-HDP é o facto
dos BFs serem ligandos fracos, pelo que estes complexos se oxidam in vivo,
regenerando [MO4]- (M = 99mTc, Re). Esta oxidação contribui para diminuir a fixação
óssea e para aumentar a dose acumulada nos tecidos moles [94].
No sentido de ultrapassar algumas das desvantagens do 99mTc-MDP, 99mTc-HDP
e 186/188Re-HEDP, vários investigadores têm tentado conceber novos complexos de
99mTc e 188/186Re contendo bisfosfonatos para diagnóstico e/ou terapia de metástases
ósseas.
De todas as estratégias adoptadas, as mais bem sucedidas foram as que
utilizaram ligandos bifuncionais que permitem, estabilizar o metal de forma eficaz e
bem definida, e ligar este ao grupo bisfosfonato, que fica totalmente disponível para
ligação ao osso. Com este tipo de aproximação bifuncional seria de esperar que fossem
sintetizados complexos com estrutura bem definida e que a afinidade para o osso
fosse superior, comparativamente à afinidade dos complexos em que o bisfosfonato é
utilizado simultaneamente para estabilizar o radionuclídeo e para ligação ao osso.
No caso concreto do Tc(V) todos os complexos isolados e avaliados
biologicamente contêm as unidades metálicas [M = O]3+ e [M]HYNIC (M = 99mTc e/ou
186/188Re) (esquema 1.1, 1.2 e 1.3).
Capítulo 1
29
No esquema 1.1 apresentam-se os oxo-complexos que foram estudados para
visualização e/ou terapia de metástases ósseas. Nestes complexos a unidade [M = O]3+
é estabilizada por ligandos tetradentados, do tipo N2S2 e N3S.
Esquema 1.1 - Síntese de oxo-complexos de 186
Re, 99m
Tc e Re.
i) Ligando correspondente, SnCl2.2H2O, pH ~12, temperatura ambiente;
ii)186Re-MAMA-BP (η = 30 %) 1. síntese de 186
Re-glucoheptonato: glucoheptonato, SnCl2.2H2O, pH 8.6, a) 80 °C, 10 min; b) temperature ambiente, 50 min;
2. MAMA-BP, tampão acetato (pH 3.0), 80 °C, 10 min;
186Re-MAMA-HBP (η = 54 %)
186Re-MAG3-HBP (η = 76 %)
99mTc-MAG3-HBP (η = 73 %)
L (L = MAMA-HBP ou MAG3-HBP);
SnCl2.2H2O e tampão citrato; 90-95°C, 1h.
Re-MAG3-HBP (η = 2 %) 1. síntese de Re-MAG3: Bz-MAG3, SnCl2.2H2O, tampão citrato, refluxo, 1h;
2. a) EDC/tetrafluorofenol, pH 6, r.t., 30 min;
b) Alendronato, NEt3, pH 9, temperatura ambiente, 3 h.
Verbruggen e colaboradores utilizaram a L,L-etileno dicisteina (EC) como
ligando bifuncional para estabilização da unidade [Tc = O]3+ e para a ligação a uma ou
duas unidades bisfosfonato (99mTc-EC-1; 99mTc-EC-2; 99mTc-EC-3; esquema 1.1) [95, 96,
20]. Os complexos de 99mTc foram sintetizados através da reacção directa dos
diferentes ligandos funcionalizados com Na[TcO4], na presença de SnCl2.2H2O em meio
alcalino e à temperatura ambiente. Estes complexos, não caracterizados ao nível
1.Introdução
30
macroscópico, foram obtid
99mTc-EC-2. Do ponto de v
acumulação no osso mais e
órgão 2 h p.i.). A razão oss
que se encontrava nos rins
em comparação com o 99m
imagens de cintigráficas em
99mTc-EC-1 e 99mTc-MDP, ap
como se pode verificar na fig
Figura 1.18 - (A) Imagem de co1 e 99mTc-MDP; (complexo 99mTc-
Oxo-complexos de
MAMA-HBP [98] e 186Re-MA
foram sintetizados por Saji
(esquema 1.1). O complexo
186Re(V)-glucoheptonato, po
pelo ligando MAMA-BP. Os
preparados por reacção dire
de SnCl2 e tampão citrat
relativamente baixos (186Re
HBP: 76 %) tendo sido nece
Para o 186Re-MAMA-HBP, a
99mTc-MDP 99m
(A)
tidos como uma mistura de isómeros no caso d
de vista biológico, o 99mTc-EC-1 foi o que ap
is elevada (99mTc-EC-1: 29,4 % vs 99mTc-MDP: 1
osso/sangue (98,0) e a percentagem de activi
rins e urina dos animais em estudo eram tamb
9mTc-MDP [osso/sangue = 48,4; % A.I (rins + uri
em coelho e macaco, obtidas após injecção d
apresentaram boa qualidade e foram muito
figura 1.18.
e corpo inteiro de coelho, 1 h após a injecção do comP; (B) Imagem de corpo inteiro de macaco, 2 h apó
-EC-1 e de 99mTc-MDP.
de 186Re(V), nomeadamente o 186Re-MAMA-
MAG3-HBP (MAG3 = mercaptoacetilglicilglicilglic
Saji et al., e avaliados para o tratamento paliativ
lexo 186Re-MAMA-BP foi obtido por transquelata
, pois o glucoheptonato é lábil, sendo facilmen
. Os complexos 186Re-MAMA-HBP e 186Re-MA
directa dos respectivos ligandos com [186ReO
itrato. Estes complexos foram obtidos com
Re-MAMA-BP: 32 %, 186Re-MAMA-HBP: 54 %
ecessário purificá-los antes da realização dos e
, a percentagem de actividade injectada por g
99mTc-MDP 99mTc-EC-1 99mTc
(B)
so de 99mTc-EC-1 e
apresentou uma
: 15,4 % A.I./g de
ctividade injectada
ambém favoráveis,
+ urina) = 24,2]. As
ão dos complexos
uito semelhantes,
complexo 99mTc-EC- após a injecção do
-BP [97], 186Re-
ilglicina) [99, 100],
iativo da dor óssea
latação a partir do
lmente substituído
MAG3-HBP foram
eO4]-, na presença
com rendimentos
4 % e 186Re-MAG3-
os estudos in vivo.
or grama de osso
Tc-EC-1
Capítulo 1
31
(25,25 ± 2,04 %, 3 h p.i.) era comparável à obtida para o 186Re-MAG3-HBP (28,78 ± 3,46
%, 3 h p.i.), mas superior aos valores obtidos para 186Re-MAMA-BP (19,78 ± 1,37%, 3 h
p.i.) e 186Re-HEDP (16,65 ± 3,16%, 3h p.i.). Os três complexos apresentavam valores
elevados para a razão fémur/sangue quando comparados com o 186Re-HEDP, e os
melhores resultados foram obtidos para 186Re-MAG3-HBP e 186Re-MAMA-HBP.
O complexo 186Re-MAG3-HBP foi ainda avaliado em animais com tumor
induzido pela injecção de células de cancro da mama (MRMT-1). Foi encontrada uma
fixação específica do complexo (figura 1.19) e demonstraram que o complexo inibia o
crescimento do tumor, ao contrário do observado quando o mesmo tipo de animais foi
tratado com 186Re-HEDP. O fenómeno allodyna induzido pelo tumor ósseo foi
atenuado após tratamento com ambos os complexos, mas o 186Re-MAG3-HBP foi
ligeiramente mais eficaz. Os efeitos secundários, tais como a mielosupressão não
foram significativos [101].
Figura 1.19 - Imagem planar obtida 24 h após injecção de 186Re-MAG3-HBP (222 MBq/kg) (A) e
186Re-HEDP (55,5 MBq/kg) (B). As setas indicam o local onde foram injectadas as células do cancro da mama MRMT-1.
Saji et al. sintetizaram também os complexos 99mTc-MAG3-HBP e 99mTc-HYNIC-
HBP. 99mTc-MAG3-HBP foi obtido por reacção directa do ligando com [99mTcO4]- na
presença de SnCl2, como redutor (esquemas 1.1). O complexo 99mTc-HYNIC-HBP
também foi sintetizado a partir do precursor [99mTcO4]-, na presença do mesmo
redutor (SnCl2) e dos três co-ligandos: tricina, 3-acetilpiridina e HYNIC-HBP (esquema
1.2). Os rendimentos com que foram obtidos 99mTc-MAG3-HBP (73%) e 99mTc-HYNIC-
HBP (39 %) não foram quantitativos e os complexos tiveram que ser purificados antes
da avaliação biológica [102].
1.Introdução
32
Esquema 1.2 - Síntese do complexo 99m
Tc-HYNIC-HBP (η = 39 %).
i) Tricina, 3-acetilpiridina, HYNIC-HBP, SnCl2.2H2O, 95 °C, 35 min.
Ambos os complexos apresentavam uma acumulação óssea em ratos (60 min
p.i.) comparável à do 99mTc-MDP (99mTc-MAG3-HBP: 4,2 ± 0,2 %; 99mTc-HYNIC-HBP: 4,0 ±
0,4 % e 99mTc-MDP: 3,2 ± 0,5 %). A ligação às proteínas era elevada (97,7 %, 99mTc-
MAG3-HBP e 88,7 %, 99mTc-HYNIC-HBP), mas o 99mTc-HYNIC-HBP possuía uma razão
osso/sangue superior à do 99mTc-MDP.
Os complexos 99mTc-MAG3-HBP e 186Re-MAG3-HBP foram caracterizados por
comparação dos cromatogramas obtidos no HPLC com o obtido para o complexo não
radioactivo Re-MAG3-HBP. O complexo Re-MAG3-HBP (esquema 1.1) foi sintetizado
por reacção de Re-MAG3 com o alendronato, utilizando EDC (1-etil-3-(3’-
dimetilamino)carbodiimida clorohidratada) e TFF (tetrafluorofenol) como reagentes de
activação, mas o rendimento da reacção foi muito baixo (2 %). Os complexos Re-
MAMA-BP e Re-MAMA-HBP foram unicamente caracterizados com base em estudos
de transquelatação, que indicaram que o 186Re se encontrava coordenado ao ligando
MAMA.
Recentemente, tem sido realizada uma intensa investigação no sentido de
encontrar sondas multimodais [103]. Neste domínio, Frangioni et al sintetizaram o
composto osteotrópico Pam-99mTc-800 e avaliaram-no como sonda óptica e nuclear
(esquema 1.3) [104].
CH3
O
N
NNH
P
P
O
O
OHOH
OH
OH
OH
O
NNTcO
N O
O
HO
HO
99mTc-HYNIC-HBP
[99mTcO4]-
i)
Capítulo 1
33
Esquema 1.3 - Síntese dos complexos Pam-M-800 (M = Re, 99mTc).
i) Resina Chelex 100, [MO4]-, SnCl2; (M = Re, 90 °C, 1h; M = 99mTc, 100 °C, 8 min);
ii) TSTU, DIPEA, DMSO, (M = Re, t.a., 40 min; η = 20 %; M = 99mTc, 60 °C, 10 min; η = 75 %);
iii) Trietilamina, DMSO, t.a., 1h (M = Re; η = 83 %; M = 99mTc, pureza radioquímica 98 %).
Como se pode ver no esquema 1.3, este complexo contém uma unidade
bisfosfonato, um fluoróforo orgânico IRDye800CW (excitação máxima: 778 nm;
emissão máxima: 799 nm) e uma unidade quelante para a estabilização dos metais
Tc(V)/Re(V). A sua síntese foi realizada através da reacção em fase sólida utilizando a
resina Chelex 100. Os grupos carboxilato dessa resina vão estabelecer coordenação ao
centro metálico que é reduzido na presença de SnCl2. A formação do complexo 99mTc-
MAS3 termodinâmicamente mais estável ocorre por adição de MAS3 (S-
acetilmercaptotriserina). Esta técnica permitiu obter o complexo 99mTc-MAS3 com
elevado rendimento (99 %), evitando a metodologia de transquelatação com tartarato
de Na+/K+, que levaria á obtenção do composto final com rendimento e actividade
específica inferiores. O complexo M-MAS3 foi posteriormente activado com
HN
HN
S N
N
OHO
ON
OOH
M
O
HO
O
Pam-M-800
(M = Re, 99mTc)
i)
P(O)(OH)2
OH
P(O)(OH)2NHH2N
OHN
O Ra
O
HN
P(O)(OH)2
HO P(O)(OH)2
O
sonda de Fluorescência(IRDye800CW)
HO
S N
N
OHO
ON
OOH
M
O
HO
O
O
S N
N
OHO
ON
OOH
M
O
HO
O
N
O
O
iii)
HO
HS HN
HN
OHO
ONH
OOH
HO
O
ii)
N+N
O
SO2NaSO3Na SO3
-
NaO3S
R
R
M-MAS3-NHS
(M = Re, 99mTc)
M-MAS3
(M = Re, 99mTc)
1.Introdução
34
tetrafluoroborato de N,N,N’,N’-Tetrametil-O-(N-succinimidil)uronio (TSTU), na
presença de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) em DMSO à temperatura ambiente
durante 40 min (M = Re) ou com aquecimento a 60 °C durante 10 min (M = 99mTc). A
ligação do fragmento metálico (M - MAS3) ao fragmento que contém o BF e o
fluoróforo (a) (esquema 1.3), na presença de trietilamina em DMSO, decorreu à
temperatura ambiente durante 1h (η = 83 % ,M = Re; η = 98 %, M = 99mTc).
O complexo Pam-99mTc-800 demonstrou selectividade para regiões onde
existem microcalcificações do cancro da mama, tal como observado para os
compostos Pam78 e Pam800 (figura 1.20) que eram constituídos apenas por uma
unidade bisfosfonato e um fluoróforo que emitia na zona do infravermelho próximo.
Figura 1.20 - Sondas osteotrópicas Pam78 e Pam800 para imagem óptica.
Convém referir que as imagens obtidas após administração de Pam78 [105] e
Pam800 [106] apenas são detectadas in vivo a uma profundidade na ordem dos
milímetros ou centímetros, isto é, só servem para estudos pré-clinicos com animais.
Além disso, a associação da imagem óptica com a imagiologia nuclear SPECT apresenta
vantagens, não só pelo acréscimo na sensibilidade, mas também pela possibilidade de
quantificação da actividade nos diferentes órgãos e/ou tecidos ósseos ao longo do
tempo.
Quando já estava a decorrer o trabalho apresentado nesta tese e uma parte
dele até já tinha sido publicado [107], foram descritos alguns complexos
organometálicos de 186Re contendo BF. Especificamente, Hideo Saji e colaboradores
isolaram e caracterizaram complexos organometálicos de Rénio estabilizados por um
ciclopentadienilo contendo um BF (esquema 1.4) [101].
P(O)(OH)2
OH
P(O)(OH)2
N
-O
SO
N
O
SO3Na
SO3Na
SO3Na
O
O
NH
Pam78
N+N
O
SO3Na
SO3Na
SO3Na
HN
O
P(O)(OH)2
P(O)(OH)2
HO
SO3Na
Pam800
Capítulo 1
35
Esquema 1.4 - Síntese dos complexos M-CpTR-Gly-PAM (M = Re, η = 21 %, 186Re, η = 8 %).
i) NH4[ReO4], Cr(CO)6, CrCl3, metanol, 180 °, 60 min
ii) Re-CpTR-COOH
Re-CpTR-Gly
1. NaOH 2M, dioxano, 30 min, temperatura ambiente;
2. HCl conc., pH 3,0, 0 °C;
iii) Fer-Gly-OMe (3 h, -5 °C + 6 h, t.a.)
Re-CpTR-Gly-OMe (noite, t. a.) Gly-OMe, NEt3, HOBt, EDC, N,N-dimetilformamida;
iv) 186
Re-CpTR-Gly 1. 186ReO4-, SnCl2.2H2O, 95 °C, 35 min; Cr(CO)6;
2. 2N NaOH, 10 min, temperatura ambiente;
v) DCC/tetrafluorophenol diclorometano ou N,N-dimetilformamida;
vi) 186
Re-CpTR-Gly-PAM
Re-CpTR-Gly-PAM
pamidronato, acetonitrilo, 0.2 M tampão borato pH 9.5 (M = 186Re), H2O ( M = Re) , temperatura ambiente, 30 min (M = 186Re), 2h (M = Re).
Como indicado no esquema 1.4, os complexos M-CpTR-Gly-PAM (M = Re, 186Re)
foram sintetizados partir do precursor M-CpTR-Gly (M = Re, 186Re). Estes precursores
foram sintetizados por reacção de NH4[ReO4] ou [186Re]HReO4 com diferentes
derivados do ferroceno, na presença de cloreto de crómio, cloreto estanoso, e de
hexacarbonilo de crómio, conforme descrito por Katzenellenbogen em 1998 [108].
A conjugação de M-CpTR-Gly (M = Re, 186Re) ao pamidronato foi realizada
utilizando como activadores DCC (N,N’-diciclohexilcarbodiimida) e TFF
1.Introdução
36
(tetrafluorofenol). Os complexos M-CpTR-Gly-PAM (M = Re, 186Re) foram obtidos com
um rendimento global de 21 % (Re-CpTR-Gly-PAM) e 8 % (186Re-CpTR-Gly-PAM).
Após um estudo comparativo entre o complexo 186Re-CpTR-Gly-PAM e o 186Re-
HEDP, Arano et. al. investigaram o efeito da actividade específica e do pré-tratamento
com HEDP no perfil biológico, incluindo a fixação óssea de ambos os complexos. A
fixação óssea do complexo 186Re-CpTR-Gly-PAM, com elevada actividade específica
(23,4 ± 4,6 % A.I./g osso, 3 h p.i.), era superior à do 186Re-HEDP (13,2 ± 3,2 % A.I./g
osso, 3 h p.i.), enquanto a acumulação óssea de 186Re-CpTR-Gly-PAM com baixa
actividade específica [186Re-CpTR-Gly-PAM + HEDP (9 mg/Kg): 12,88 ± 2,28 % A.I./g
osso, 3 h p.i.] era comparável à do 186Re-HEDP. No entanto, o pré-tratamento com
HEDP não afectava a fixação óssea de 186Re-CpTR-Gly-PAM (22.5 ± 4,9 % A.I./g osso, 3
h p.i.) e 186Re-HEDP (14,0 ± 3,3 % A.I./g osso, 3 h p.i.), o que é concordante com a
existência de sinergismo quando se utilizam protocolos terapêuticos com
administração alternada de bisfosfonatos e radioterapia sistémica (e.g. pamidronato
alternado com 188Re-HEDP) [109].
Recentemente, foram também descritos os complexos M-dpa-ALN (M = 99mTc,
188Re e Re) (esquema 1.5) [110, 111]. Estes complexos foram sintetizados por reacção
dos precursores fac-[M(H2O)3(CO)3]+ (M = 188Re, 99mTc, Re) com dpa-ALN, sendo
isolados como espécies únicas e bem definidas, com rendimentos elevados (> 96 %) e
elevada pureza radioquímica. No entanto, enquanto o precursor fac-
[99mTc(H2O)3(CO)3]+ é obtido com elevado rendimento (>99 %) e sem qualquer passo de
purificação, adicionando apenas [99mTcO4]- a um Kit (Isolink®) com reagentes
liofilizados (secção 2.2.3), a síntese do precursor fac-[188Re(H2O)3(CO)3]+ não é tão
directa. O precursor de 186Re é sintetizado com um rendimento de 80 % por redução
de [188ReO4]- na presença de BH3NH3/CO (g) embora apresente uma pureza
radioquímica superior a 99 % após purificação por cromatografia iónica [111].
Capítulo 1
37
Esquema 1.5 - Síntese dos complexos M-dpa-ALN (M = 99mTc, 188Re, Re).
99mTc-dpa-ALN (tampão carbonato, pH 9,0; 100 °C; 30 min, η > 98 %);
Re-dpa-ALN (tampão carbonato, pH 9,0; 100 °C; 30 min, η ~100 %, síntese em tubo de RMN); 188
Re-dpa-ALN (tampão fosfato; 75 °C; 30m min, η > 96 %).
A fixação óssea de 99mTc-dpa-ALN (27 % A.I/g osso) era comparável à do 99mTc-
MDP (30 % A.I/g osso), resultados posteriormente confirmados por imagens SPECT/CT
de ratinhos Balb-c injectados com estes complexos (figura 1.21). A acumulação óssea
do complexo 188Re-dpa-ALN (21,2 ± 6,6 % A.I./g osso) revelou-se superior à do 188Re-
HEDP (13,4 ± 0,2 % A.I./g osso).
Tanto o complexo de 99mTc como o de 188Re apresentavam uma acumulação
reduzida nos tecidos moles, sofrendo acumulação preferencial nos locais do osso com
elevada actividade metabólica.
Figura 1.21 - Imagem bimodal SPECT (a cores)/CT (cinzento) obtida após injecção de 99mTc-MDP (A) e de 99mTc-dpa-ALN (B) em ratinhos Balb-c.
N s
39
Complexos de Re(I) e 99m
Tc(I) estabilizados
com ligandos multifuncionais contendo
grupos fosfonato
Capítulo 2
41
2. COMPLEXOS DE Re(I) e 99mTc(I) ESTABILIZADOS COM LIGANDOS BIFUNCIONAIS CONTENDO GRUPOS FOSFONATO
2.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS
Tal como foi referido anteriormente, os fosfonatos marcados com 99mTc (MDP e
HEDP) em utilização clínica consistem numa mistura de espécies. Além disso, não está
completamente definido o estado de oxidação do metal e os grupos fosfonato têm
uma função dupla: estabilização do metal e promovem a coordenação ao Ca2+ da HA.
Para obviar alguns destes problemas, o trabalho proposto para esta tese
consistia em preparar ligandos bifuncionais cuja função era a estabilização do metal e
a ligação deste a grupos funcionais com afinidade para o osso.
Os ligandos a sintetizar eram do tipo pirazolo-diamina que se sabia
apresentarem propriedades notáveis no que diz respeito à estabilização in vitro e in
vivo de complexos tricarbonilo de 99mTc ou Re (figura 2.1) [84].
Figura 2.1 – Ligando bifuncional e respectivo complexo de tricarbonilo de Re ou 99mTc, com um grupo R com afinidade para o osso.
Os grupos funcionais com afinidade para o osso eram do tipo mono- ou
bisfosfonato.
NNH2
N
N
R
N
NH2
N
N
R
M
OC COCO
M = Re. 99mTc
Compostos Contendo um Grupo Monofosfonato
42
M = 99mTc, 186Re ou 188Re
R2 R2
Os compostos com melhores características biológicas sintetizados na primeira
fase do trabalho, deveriam servir de base para preparar complexos de Tc(I) com
afinidade para o osso e com uma molécula citotóxica (figura 2.2).
Figura 2.2 - Esquema representativo de complexos trifuncionais com o quelato pirazolo-diamina, contendo um grupo com afinidade para o osso (R1) e uma molécula citótoxica (R2).
2.2. COMPOSTOS CONTENDO UM GRUPO MONOFOSFONATO
2.2.1. Síntese e caracterização de ligandos pirazolo - diamina contendo
um grupo monofosfonato (L1 - L3)
Os compostos contendo grupos monofosfato L1 – L3 foram obtidos de acordo
com as vias de síntese apresentadas no esquema 2.1.
Capítulo 2
43
Esquema 2.1 – Síntese dos compostos com grupos éster e ácido monofosfónico. (i) 1.refluxo,
2. destilação; (ii) K2CO3/KI, acetonitrilo, refluxo; (iii) ácido trifluoroacético; (iv)
1. Me3SiBr/diclorometano; 2. metanol/água.
Assim, começámos por sintetizar os compostos (3-bromopropil)fosfonato de
dietilo (1) e (2-bromoetil)fosfonato de dietilo (2) que foram obtidos após refluxo de
trietilfosfito seco (em excesso) com dibromoetano ou dibromopropano secos. O
refluxo decorreu durante 8 a 17 horas, após o que se separou o dibromoalcano em
excesso por destilação a pressão reduzida. Este tipo de reacção, designada Michaelis–
Arbuzov [112, 113], permitiu a obtenção dos compostos 1 e 2 com rendimentos da
ordem de 56 % e 85 %, respectivamente.
De seguida, sintetizou-se o precursor t-butil 2-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-
il)etilamino)etilcarbamate (3), conforme descrito na literatura [114]. Os compostos 4 e
5 foram preparados por alquilação directa da amina secundária do precursor 3 com 1
Compostos Contendo um Grupo Monofosfonato
44
ou com 2, respectivamente. As reacções decorreram em acetonitrilo e com refluxo
durante 20 (composto 4) ou 10 dias (composto 5). O progresso destas reacções foi
seguido por TLC (10 % metanol/diclorometano). Quando a reacção estava completa,
filtrou-se a mistura reaccional e o sobrenadante foi seco em vazio. Os resíduos sólidos
obtidos foram tratados com água e as soluções foram extraídas com diclorometano. As
fases orgânicas foram secas em vazio e os compostos 4 e 5 foram obtidos após
purificação por cromatografia. Nesta purificação utilizamos uma coluna de sílica gel e
na fase móvel um gradiente de 8 - 50 % metanol/acetato de etilo. Os compostos 4 e 5
foram obtidos sob a forma de óleos viscosos de cor amarelo pálida, com rendimentos
de 11 % e 35 %, respectivamente.
O composto L1 foi obtido com elevado rendimento (aproximadamente 90 %),
após remoção selectiva do grupo Boc do composto intermediário 5 com ácido
trifluoroacético. L1 foi obtido sob a forma de um óleo amarelo pálido, que é solúvel na
maioria dos solventes orgânicos e praticamente insolúvel em água.
O tratamento dos compostos 4 e 5 com brometo de trimetilsilano e com
metanol/água permitiu a remoção simultânea dos grupos Boc e Et. Os resíduos obtidos
foram lavados com diclorometano e secos em vazio. Os sólidos brancos daí resultantes
foram formulados como L2 (50 %) e L3 (46 %). Estes compostos são muito solúveis em
H2O.
Os compostos L1, L2 e L3, foram obtidos a partir do composto 3 com
rendimentos globais de 32, 18 e 5 %, respectivamente.
L1 e L2 foram caracterizados por espectroscopia multinuclear de RMN, e por
espectroscopia de infravermelho (IV). A título de exemplo apresentam-se na figura 2.3
os espectros de RMN de 1H, 13C e 31P do composto L2.
Capítulo 2
45
102030 ppm
Figura 2.3 – Espectros de RMN de 1H (A), 13C (B) e 31P (C) do composto L2 em D2O.
Como se pode ver na figura 2.3, L2 apresentava no espectro de RMN de 1H
cinco tripletos entre 4,35 e 3,15 ppm. O sinal dos protões do grupo CH2 mais próximo
do grupo ácido fosfónico aparecia a campo mais alto (1,89 – 1,83 ppm) e com maior
multiplicidade devido ao acoplamento adicional com o núcleo de fósforo. O protão
H(4) e os dois grupos metilo do anel pirazolilo originaram três singuletos a 6,03, 2,19 e
2,12 ppm, respectivamente. O espectro de RMN de 13C de L2 também é coerente com
a sua estrutura, pois apresentava três sinais referentes aos átomos de carbono do anel
2.03.04.05.06.0 ppm
255075100125150 ppm
NH2N
NN
POH
HO
O
H(4)pza
b c
f
de
H2O
2 x CH3pz
CH2a
CH2f
H(4)pz
C(4)pz C(3/5)pz
H
2 x CH3pz
6 x CH2 (a, b, c, d, e, f)
31P
4 x CH2 (b, c, d, e)
A)
B) C)
Compostos Contendo um Grupo Monofosfonato
46
pirazolilo a campo baixo (151 – 109 ppm), seis sinais distintos para os átomos de
carbono etilénicos (55 – 25 ppm) e, finalmente, a campo mais alto apareciam as duas
ressonâncias devidas aos grupos metilo do anel de pirazolilo (14,2 e 12,7 ppm). No
espectro de RMN de 31P observava-se um único singuleto a 20,3 ppm.
Como exemplo, apresenta-se na figura 2.4 o espectro de IV do composto L2, na
zona de frequências 1900 – 500 cm-1.
Figura 2.4 – Espectro de IV de L2 entre 1900 – 500 cm-1 (KBr).
Uma das bandas mais intensas que se observa neste espectro de IV aparece a
1136 cm-1, região onde, geralmente, se observam as frequências ν(P = O) de grupos
ácidos fosfónicos. Este espectro apresenta também uma banda de intensidade média a
1634 cm-1 associada, possivelmente, à vibração de extensão ν(P - OH) [112] e/ou à
vibração de deformação δ(N - H) da amina primária [115]. A banda forte a 1059 cm-1
está associada às vibrações de extensão das ligações P – OH e C – N das aminas
primária e terciária [112, 115].
50070090011001300150017001900
Transmitância (%)
ν(P = O)
δ(N - H) e
ν(P - OH)
ν(P - OH)
e ν(C-N)
ν (cm-1)
Capítulo 2
47
2.2.2. Síntese e caracterização dos complexos de Rénio estabilizados
por L1 (Re1) e L2 (Re2)
Os compostos L1 e L2, que continham simultaneamente uma unidade
monofosfonato e um conjunto de átomos doadores (N,N,N), foram obtidos com os
rendimentos mais elevados e por isso foram seleccionados para a síntese dos
respectivos complexos de Re e 99mTc.
Tendo em conta que a funcionalização com um grupo monofosfato da unidade
quelante pirazolo-diamina (N,N,N) poderia alterar a coordenação ao centro metálico e
considerando ainda as propriedades coordenantes do grupo monofosfato, decidimos
estudar reacções do precursor [ReBr(CO)5] com os compostos L1 e L2. Tal como se
indica no esquema 2.2, os compostos L1 e L2 reagiram com [ReBr(CO)5] em metanol
ou em água. Após refluxo, durante uma noite, observou-se a formação dos complexos
catiónicos Re1 e Re2 que permaneciam em solução.
Esquema 2.2 – Síntese dos complexos Re1 e Re2. (i) L1 ou L2, refluxo em metanol ou H2O.
O complexo Re1 foi obtido sob a forma de um sólido branco, após evaporação
do solvente da mistura reaccional e lavagem do resíduo com n-hexano. Este complexo,
estável ao ar e solúvel em água, foi caracterizado por espectroscopia multinuclear de
RMN, por espectroscopia de IV e por difracção de raios-X de cristal único. Os
resultados obtidos permitiram demonstrar que a unidade pirazolo-diamina do ligando
L1 coordenava ao centro metálico funcionando como ligando neutro e tridentado.
Como se pode observar no espectro de IV do complexo Re1, apresentado na
figura 2.5, as bandas intensas devidas às vibrações de extensão ν(C≡O), que para
Compostos Contendo um Grupo Monofosfonato
48
[ReBr(CO)5] apareciam na região 2100 - 1900 cm-1, apresentavam um perfil diferente e
característico do arranjo facial dos grupos tricarbonilo [116, 117].
Figura 2.5 – Espectros de IV do complexo [ReBr(CO)5] e de Re1 em KBr, entre 2300 – 500 cm-1.
No espectro de IV do complexo Re1 verificou-se ainda que as bandas ν(C≡O)
(2098, 2027, 1901 cm-1) apareciam desviadas para frequências inferiores, quando
comparadas com as do precursor [ReBr(CO)5] (2153, 2035, 1964 cm-1). Conclui-se
portanto que a ligação C – O nos ligandos carbonilo era mais fraca em Re1 do que no
precursor. Estes resultados confirmaram uma retrodoação π do metal para os ligandos
carbonilo mais significativa em Re1, do que no precursor. Este efeito pode estar
relacionado com o carácter doador σ dos átomos de azoto do ligando tridentado em
Re1 e com a maior densidade electrónica em torno do átomo de Re, no complexo Re1.
Ao contrário do que se verifica no complexo Re1, no precursor [ReBr(CO)5] existem
uma competição maior entre os grupos C ≡ O para a retrodoação π do centro metálico
para os ligandos carbonilo.
5007009001100130015001700190021002300
ν(cm-1)
[ReBr(CO)5]
Re1
ν(C≡O)
ν(P=O)
ν(P – O – Califático)
Capítulo 2
49
No espectro de IV de Re1 observavam-se ainda bandas relativamente fortes a
1023 cm-1 e a 1263 cm-1, provavelmente associadas a ν(P – O – Califático) e a ν(P = O),
respectivamente [112].
Na figura 2.6 apresentam-se os espectros de RMN de 1H do ligando L1 e do
respectivo complexo Re1. O espectro de RMN de L1 é semelhante ao obtido para L2
(figura 2.3), à excepção das ressonâncias devidas aos grupos OEt [CH2, δ 4,65
(multipleto) e CH3, δ 1,32 (tripleto)]. As principais diferenças entre os espectros de
RMN de 1H de L1 e Re1, estão relacionadas com o carácter diastereotópico observado
para os protões da amina primária (δ 5,57; 1H; δ 3,74; 1H), e para a maioria dos
protões metilénicos de L1 após coordenação ao centro metálico (δ 4,54; 1H; δ 3,92;
1H; δ 3,43; 1H; δ 3,21; 1H; δ 2,96; 1H e δ 2,30; 1H). Este resultado é típico para todos
os ligandos pirazolo-diamina do tipo N,X,N (X = S ou N) e respectivos complexos de
Re(I) [114, 117, 118].
Os sinais devidos aos protões H(4)pz e aos protões metilénicos 3/5Mepz em
Re1 sofreram um desvio significativo para campo mais baixo (H(4)pz, ∆ = 0,39 ppm,
3/5Mepz, ∆ = 0,21 ppm) relativamente às mesmas ressonâncias em L1 (figura 2.6). Os
desdobramentos e desvios químicos observados no espectro de Re1 confirmam a
coordenação tridentada do ligando através dos três átomos de azoto, como observado
no estado sólido (secção 2.2.2.1).
Compostos Contendo um Grupo
50
Figura 2.6 - Espectros de 1H-RM
Na figura 2.7 aprese
Re1.
H
H(4)pz
H(4)pz
NH
H
po Monofosfonato
RMN dos compostos L1 e Re1 em CD3OD.
resenta-se também o espectro de RMN de 13
CH
H2O
CD3OD CH2 + 2xCH2, OEt
CH
2 x CH3pz
2xC
2 x CH2
2 x CH2
H2O
2 x CH2, OEt
CH CH
CD3OD
CH NH CH
2 x CH2
CH
2 x CH3pz 2 x CH
13C do complexo
CH2
2xCH3, OEt
CH3, OEt
Capítulo 2
51
Figura 2.7 - Espectro de 13C-RMN do composto Re1 em CD3OD. * Solvente.
O espectro de RMN de 13C obtido para Re1 é relativamente simples e
concordante com a formulação proposta. A campo mais baixo (δ 195 - 194)
encontraram-se três sinais de fraca intensidade atribuídos aos ligandos carbonilo,
observando-se também os três sinais do anel pirazolilo [C(3/5)pz, δ 155,3; δ 145,6 e
C(4)pz, δ 109,3]. Entre δ 64 - 21 encontravam-se oito sinais dos grupos CH2 [Ca - Cf + 2 x
CH2(OEt)] e entre δ 17 - 11 observavam-se as restantes quatro ressonâncias dos grupos
CH3 [2 x CH3pz + 2 x CH3 (OEt)].
Em CD3OD, os espectros de RMN de 31P de L1 e de Re1 apresentavam apenas
um singuleto a 32,8 ppm e 29,4 ppm, respectivamente (figura 2.8: A e B). O singuleto
observado no espectro de Re1 (δ 29,4) está ligeiramente desviado para campo mais
alto (∆ = 3,4 ppm) relativamente ao desvio químico do ligando livre L1 (δ 32,8). Esse
valor ∆ era bastante inferior aos que foram encontrados para os complexos
organometálicos de Re(I) directamente estabilizados por grupos ácido fosfónicos (∆ =
16 – 30 ppm) [119]. Este resultado corrobora a inexistência de interacções entre o
grupo ácido fosfónico e o centro metálico, o que também é evidente através da análise
de RMN de 1H e da difracção de raios-X (secção 2.2.2.1).
255075100125150175200 ppm
3 x C ≡ Ο
*
C(3/5)pz C(4)pz
Compostos Contendo um Grupo Monofosfonato
52
Figura 2.8 – Espectros de RMN de 31P do complexo Re1, em CD3OD (A), do composto L1, em CD3OD (B), do complexo Re2 na presença de ligando livre L2, em D2O (C) e, do ligando L2, em D2O (D). *Referência externa (H3PO4, 85%).
Apesar de terem sido realizadas várias tentativas, nunca foi possível isolar o
complexo organometálico Re2 numa forma pura. Após o refluxo de quantidades
estequiométricas de L2 com [Re(CO)5Br] em água, durante 18 horas, obtiveram-se
sempre misturas contendo Re2 e L2. Estes dois compostos foram identificados por
RMN de 1H e 31P e por RP-HPLC (Cromatografia Líquida de Elevada Eficiência de Fase
Reversa). Nos espectros de RMN de 31P [figura 2.8 (C) e (D)] foi possível identificar uma
das espécies como L2 (δ 20,3; espectros C e D) e outra espécie como Re2 (δ 23,4;
espectro C), resultado que foi confirmado por RP-HPLC. Como se mostra na figura 2.9,
o ligando livre L2 tem um tempo de retenção de 8,0 min, enquanto no cromatograma
010203040 ppm
+
*
Re1 δ 29,4
L1 δ 32,8
Re2
δ 23,4
L2 δ 20,3
L2 δ 20,3
A
B
C
D
Capítulo 2
53
da mistura reaccional detectámos sempre duas espécies: o complexo Re2 com um
tempo de retenção 10,8 min e o ligando livre L2 com um tempo de retenção 8,0 min.
Figura 2.9 – Cromatogramas analíticos de RP-HPLC do composto L2 e do complexo Re2.
Nos espectros de RMN de 1H foram também identificadas as ressonâncias
devidas à presença de L2 e de Re2.
O espectro de RMN de 31P de Re2, em D2O, apresentava apenas um singuleto a
23,4 ppm, que foi desviado para campo baixo (∆ = 3,1 ppm) relativamente ao desvio
químico de L2 (δ 20,3 ppm). Este desvio é da mesma ordem de grandeza do observado
em CD3OD (∆ = 3,4 ppm) para o complexo Re1 caracterizado no estado sólido e em
solução. Estes dados levam-nos a concluir que, nas condições estudadas, o ligando L2
coordena ao centro metálico muito provavelmente através do conjunto de átomos
doadores N,N,N não ocorrendo interacções entre o grupo ácido fosfónico e o centro
metálico. Em ambos os complexos (Re1 e Re2) o metal é estabilizado pelo mesmo
ligando e a única diferença entre eles deve-se à natureza do grupo que tem fósforo:
P(O)(OEt)2 em Re1 e P(O)(OH)2 em Re2. O desvio das ressonâncias de 31P em Re1 e
Re2, relativamente ao dos respectivos ligandos livres L1 e L2, dá-se em sentidos
opostos. Esta inversão deve-se, certamente, ao efeito electro indutor dos grupos OEt
(Re1) quando comparado com os grupos OH (Re2).
tr = 10,8 min tr = 8,0 min
Tempo de retenção (min)
Compostos Contendo um Grupo Monofosfonato
54
As espécies químicas L2 e Re2 eram ambas muito solúveis em água não tendo
sido possível separar o ligando livre por lavagem com solventes ou por cromatografia
em coluna de sílica gel. A purificação por cromatografia em coluna preparativa de RP-
HPLC seria a mais adequada, mas não foi possível devido ao baixo rendimento com
que Re2 se formava.
2.2.2.1. Caracterização do complexo Re1 por difracção de raios – X
A recristalização de Re1 de uma mistura de clorofórmio e n-hexano originou
monocristais incolores que se revelaram adequados para análise por difracção de
raios-X de cristal único. Na figura 2.10 apresenta-se o diagrama ORTEP para o catião de
Re1 e na tabela 2.1 os ângulos e comprimentos de ligação mais significativos.
Figura 2.10 – Diagrama ORTEP do catião do complexo Re1. Os elipsóides vibracionais foram desenhados com uma probabilidade de 30 %.
Capítulo 2
55
No catião de complexo Re1, o centro metálico apresenta um número de
coordenação seis e geometria de coordenação octaédrica distorcida. Os três átomos
de carbono dos ligandos carbonilo definem uma das faces triangulares do octaedro e
as restantes três posições são ocupadas pelos três átomos de azoto do ligando
tridentado L1. Os valores dos ângulos cis e trans em torno do átomo de Re encontram-
se entre 86,0(42) - 98,4(4)° e 174,2(3) - 178,1(3)°, respectivamente.
Os comprimentos das ligações Re – CO são praticamente idênticos, variando
entre 1,876(11) e 1,895(9) Å. Os valores encontrados são comparáveis aos descritos
na literatura para outros complexos com a unidade fac-[Re(CO)3]+ estabilizada por
ligandos análogos [114, 117, 118]. O comprimentos da ligação Re – N4 [2,176(6) Å] é,
como esperado, ligeiramente mais curto do que o da ligação Re – N(3) [2,258(6) Å]. O
valor encontrado para Re – N1 [2,201(6) Å] é comparável aos publicados para outros
complexos de Re(I) com ligandos análogos [114, 117, 118].
Os dados de difracção de raios-X apresentam ainda um pico residual que foi
atribuído a um átomo de oxigénio de uma molécula de água. O oxigénio foi refinado
anisotropicamente e os correspondentes átomos de H foram ignorados.
Tabela 2.1 – Comprimentos (Å) e ângulos (°) de ligação mais significativos para o catião do
complexo Re1.
Re(1) – C(3) 1,876(11) Re(1) – C(2) 1,895(10)
Re(1) – C(1) 1,895(9) Re(1) – N(4) 2,176(6)
Re(1) – N(1) 2,201(6) Re(1) – N(3) 2,258(6)
C(1) – O(1) 1,159(9) C(2) – O(2) 1,155(10)
C(3) – O(3) 1,159(11)
C(3) – Re(1) – C(2) 87.3(4) C(3) – Re(1) – C(1) 88.5(4)
C(2) – Re(1) – C(1) 86.6(4) C(3) – Re(1) – N(4) 174.2(3)
C(2) – Re(1) – N(4) 98.4(4) C(1) – Re(1) – N(4) 93.0(3)
C(3) – Re(1) – N(1) 92.4(3) C(2) – Re(1) – N(1) 95.1(3)
C(1) – Re(1) – N(1) 178.1(3) N(4) – Re(1) – N(1) 86.0(2)
C(3) – Re(1) – N(3) 95.8(3) C(2) – Re(1) – N(3) 176.1(4)
C(1) – Re(1) – N(3) 91.2(3) N(4) – Re(1) – N(3) 78.5(2)
N(1) – Re(1) – N(3) 87.1(2)
Compostos Contendo um Grupo
56
Na estrutura de raios
conta que o precursor de
certamente ao processo de
hexano. O ião Cl- interage c
N4…Cl e o ângulo (N
°, respectivamente.
2.2.3. Síntese e cara
Os complexos de
precursor fac-[99mTc(H2O)3
único passo por redução
(K2[H3BCO2]) [120]. Este últim
como redutor do metal e com
Esquema 2.3 – Síntese do precu
A recente introdução
à síntese permite a obtençã
radioquímica. Para tal adici
mistura a 98 °C durante 2
po Monofosfonato
raios-X o contra-ião foi identificado como sendo
de Rénio tinha como contra-ião Br-, este resu
o de recristalização, que foi feito a partir de
ge com N4 através de uma ponte de hidrogén
N – H – Cl) encontrados são 3,153(6)
caracterização dos complexos Tc1 e Tc2
e 99mTc(I) foram preparados em meio aquos
3(CO)3]+. Este precursor organometálico é p
ção do Na[99mTcO4] com o boranocarbonato
último reagente, em meio alcalino, funciona sim
e como fonte de monóxido de carbono (esquem
precursor organometálico fac-[99m
Tc(CO)3(H2O)3]+.
ção de um “kit” contendo os reagentes liofilizad
nção do precursor, com elevado rendimento e e
diciona-se uma solução de Na[99mTcO4] ao ki
te 20 minutos. Após a redução do 99mTc(VII) a
“Kit” Isolink ®
ndo Cl-. Tendo em
resultado deve-se
de clorofórmio/n-
génio. A distância
6) Å e 158,1(4)
uoso a partir do
é preparado num
nato de potássio
simultaneamente
ema 2.3).
lizados necessários
o e elevada pureza
kit e aquece-se a
II) a 99mTc(I), que
Capítulo 2
57
decorre em meio alcalino, o excesso de boranocarbonato é destruído por
neutralização com uma solução de HCl/tampão fosfato pH 7,4. A pureza radioquímica
do precursor foi confirmada por RP-HPLC, imediatamente antes da preparação dos
complexos (figura 2.11).
[99mTcO4]-
Figura 2.11 – Caracterização do precursor fac-[99mTc(H2O)3(CO)3]
+ por RP-HPLC após a sua preparação a partir de [99mTcO4]
-. Detecção γ.
A preparação dos complexos Tc1 e Tc2 foi realizada fazendo reagir o precursor
fac-[99mTc(H2O)3(CO)3]+ com os ligandos L1 e L2 (esquema 2.4). As condições
reaccionais foram optimizadas em termos da concentração final do ligando [L] e do
tempo de reacção, mantendo a temperatura a 100 °C e o pH próximo de 7,4.
Esquema 2.4 – Síntese dos complexos Tc1 e Tc2. (i) Condições optimizadas de acordo com a tabela 2.2.
Tempo (min) 25 20 15 10 5
“Kit” Isolink
98 °C, 20 min
Rad
ioac
tivi
dad
e
tR = 5,8 min
Compostos Contendo um Grupo Monofosfonato
58
A título de exemplo apresentam-se na tabela 2.2, os rendimentos de Tc1
quando se variou a concentração de L1 e a temperatura da reacção. Na figura 2.12
apresentam-se alguns dos cromatogramas obtidos durante esse processo de
optimização.
Figura 2.12 – Cromatogramas de RP-HPLC obtidos durante a optimização da preparação do complexo Tc1 (100 °C; 60 min e concentração [L] variável). A: [L1] = 5 x 10-6 M; B: [L1] = 8 x 10-6 M; C: [L1] = 1 x 10-5 M; D: [L1] = 5 x 10-5 M e; E: [L1] = 1 x 10-4 M.
Após optimização das condições reaccionais para a síntese de Tc1 e Tc2, estes
foram obtidos com rendimentos de 96 % e 98 %, respectivamente. A concentração de
Tabela 2.2 – Rendimentos e condições experimentais na síntese de Tc1.
Rendimento (%) [L1] Tempo e Temperatura
41 5 x 10-6 M
60 min; 100 °C 76 8 x 10-6 M
92 1 x 10-5 M
96 5 x 10-5 M
97 1 x 10-4 M
67 8 x 10-6 M
30 min; 100 °C 82 1 x 10-5 M
96 5 x 10-5 M
96 1 x 10-4 M
E D
C B
A
Capítulo 2
59
ligando utilizada em ambos os casos foi 5 x 10-5 M. As reacções decorreram a 100 °C,
durante 30 min e em tampão PBS pH 7,4.
A caracterização dos complexos de 99mTc não pode ser efectuada pelos
métodos usuais em química inorgânica, devido às baixas concentrações dos complexos
em solução. Convém recordar, que a concentração de metal em [99mTcO4]- é da ordem
dos 10-9 - 10-12 M. Assim, admite-se que os complexos de 99mTc tenham a mesma
estrutura dos análogos de Re se apresentarem idêntico comportamento
cromatográfico, quando analisados por HPLC, nas mesmas condições experimentais.
Um detector de radiação γ permite a detecção dos complexos de 99mTc e um detector
de radiação ultravioleta-visível (UV/Vis) permite a detecção dos complexos de Re. A
título exemplificativo, apresentam-se os cromatogramas dos complexos Tc1 e Re1 na
figura 2.13.
Figura 2.13 – Cromatogramas de RP-HPLC de Re1 (detecção UV) e Tc1 (detecção γ).
Como se pode verificar na tabela 2.3, os valores dos tempos de retenção
obtidos para os complexos análogos de 99mTc e de Re são semelhantes. O ligeiro
desfasamento observado entre os tempos de retenção deve-se à ligeira diferença de
M = Re, (Re1)
tr = 15,8 min
M = 99mTc, (Tc1)
tr = 16,3 min
Compostos Contendo um Grupo Monofosfonato
60
percurso entre o detector de radiação γ utilizado para detectar o 99mTc e o detector UV
(254 nm) utilizado para detectar os complexos de Re.
Na tabela 2.3 apresentam-se também os valores de log D, através dos quais
geralmente se avalia a lipofilia/hidrofilia dos compostos. Os valores de log D para os
complexos Tc1 e Tc2 foram calculados com base no coeficiente de partição destes
complexos no sistema n-octanol/tampão PBS (pH=7.4), de acordo com o procedimento
experimental descrito na secção 4.5.1 [121]. Os valores de log D encontrados
indicaram que o complexo Tc1 era moderadamente lipofílico (log D = 0,08), enquanto
o complexo Tc2 era bastante hidrofílico (log D = -1,67), com seria de esperar devido à
presença do grupo P(O)(OH)2 livre.
2.2.4. Avaliação biológica dos complexos de 99mTc(I)
2.2.4.1. Estudos in vitro
2.2.4.1.1. Estabilidade em tampão fosfato salino e em soro humano
A determinação da estabilidade dos complexos de 99mTc in vitro é importante
na medida em que permite prever a viabilidade e o interesse dos estudos in vivo.
Através dos estudos de estabilidade in vitro é possível prever se os complexos sofrem
reoxidação ou degradação em condições fisiológicas. Os meios fisiológicos testados
foram o tampão fosfato salino (pH 7,4) e o soro humano.
Tabela 2.3 – Tempos de retenção (min) obtidos nos cromatogramas de HPLC e valores de Log D.
Complexo Tempos de retenção (min) Log D
Tc1 16,3 (15,8)a 0,08 ± 0,04
Tc2 11,4 (10,8)a -1,67 ± 0,03
a Tempos de retenção obtidos para os complexos análogos de Re.
Capítulo 2
61
Os estudos de estabilidade em tampão fosfato salino foram realizados
aquecendo a 37 °C as preparações, que já se encontravam neste meio. Nos ensaios
realizados em soro humano adicionaram-se 100 µl de uma solução do complexo
radioactivo a 900 µl de soro e as misturas foram aquecidas a 37 °C. Alíquotas das
misturas reaccionais foram sendo retiradas ao longo do tempo (0, 1, 2 e 4 horas),
tratadas com etanol, para precipitação das proteínas, centrifugadas e o sobrenadante
foi analisado por HPLC.
Os compostos demonstraram ser estáveis, pois não se observou decomposição
ou reoxidação a pertecnetato por HPLC. Como exemplo, na figura 2.14 apresentam-se
os cromatogramas de HPLC obtidos para o complexo Tc1 antes e após 4 horas de
incubação em soro humano.
Figura 2.14 – Cromatograma de HPLC de Tc1 (detecção γ) antes (A) e após (B) incubação em soro humano.
Estes resultados incentivaram a realização dos estudos biológicos in vivo e a
avaliação destes complexos em termos da sua afinidade para o osso, fixação em
órgãos não alvo e excreção.
após 4 horas de incubação em soro humano
A)
B)
Compostos Contendo um Grupo Monofosfonato
62
2.2.4.2. Estudos in vivo
2.2.4.2.1. Estudos de biodistribuição em ratinhos CD-1
O perfil biológico dos complexos Tc1 e Tc2 em ratinhos CD-1 foi estudado com
a finalidade de avaliar o efeito dos grupos éster e ácido fosfónico.
Os ensaios de biodistribuição foram realizados com grupos de quatro a cinco
ratinhos CD-1 fêmea (Charles River), com pesos de aproximadamente 20 – 25 g cada.
Os animais foram injectados com 100 µl (7,0 – 18,5 MBq) dos complexos radioactivos
na veia da cauda. Em seguida, os animais foram sacrificados por deslocação cervical,
aos 5 min, 1 e 4 horas após administração. Os órgãos foram removidos, lavados,
pesados e a sua actividade medida. A excreção total foi assumida como a diferença
entre a actividade injectada no animal e a actividade medida imediatamente após o
seu sacrifício. A actividade total no sangue, osso e músculo foi calculada assumindo
que estes órgãos constituíam 6, 10 e 40% do peso total do animal, respectivamente.
Os resultados de distribuição nos tecidos, expressos em percentagem da actividade
injectada por grama de órgão (% A.I./g órgão) e, a excreção total expressa em % A.I.,
encontram-se sumarizados na tabela 2.4
Tabela 2.4 – Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) e excreção total (% A.I.) para
os complexos Tc1 e Tc2 em ratinhos CD-1 fêmea.
Tc1 Tc2
5 min 1 h 4 h 5 min 1 h 4 h
Sangue 2,8 ± 0,2 0,8 ± 0,2 0,6 ± 0,1 4,6 ± 1,5 0,5 ± 0,2 0,20 ± 0,04
Rim 19,0 ± 4,9 4,1 ± 1,8 1,3 ± 0,4 17,8 ± 3,1 2,8 ± 0,1 1,2 ± 0,3
Fígado 17,2 ± 1,9 5,6 ± 1,4 4,5 ± 0,26 19,3 ± 4,0 10,1 ± 1,4 3,5 ± 1,4
Intestino 9,3 ± 1,1 20,4 ± 2,9 18,5 ± 4,5 2,7 ± 0,5 10,1 ± 1,7 13,8 ± 6,2
Baço 2,4 ± 0,7 2,0 ± 0,6 2,2 ± 0,1 1,4 ± 0,2 0,11 ± 0,02 0,4 ± 0,2
Coração 0,8 ± 0,2 0,32 ± 0,05 0,28 ± 0,03 1,9 ± 0,5 0,22 ± 0,05 0,17 ± 0,02
Pulmões 0,6 ± 0,1 0,8 ± 0,3 0,8 ± 0,1 3,6 ± 0,9 0,4 ± 0,1 0,23 ± 0,05
Estômago 1,5 ± 1,0 0,7 ± 0,3 0,37 ± 0,06 1,0 ± 0,1 0,8 ± 0,3 0,42 ± 0,05
Músculo 0,8 ± 0,2 0,12 ± 0,02 0,10 ± 0,07 1,3 ± 0,1 0,04 ± 0,02 0,02 ± 0,01
Osso 0,6 ± 0,1 0,18 ± 0,04 0,12 ± 0,01 2,1 ±±±± 0,2 0,21 ±±±± 0,04 0,12 ±±±± 0,01
Excreção total 21,8 ± 3,4 31,7 ± 3,0 40,8 ± 5,6 20,2 ± 4,4 52,7 ± 2,5 64,0 ± 6,3
Capítulo 2
63
Na figura 2.15 apresentam-se alguns destes valores sob a forma de histograma.
Figura 2.15 – Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) dos complexos Tc1 e Tc2.
Os resultados obtidos permitiram concluir que não houve acumulação
relevante de nenhum dos compostos nos órgãos ou tecidos, em particular no osso. Os
complexos apresentaram rápida depuração sanguínea, e rápida eliminação dos órgãos
não alvo, exceptuando os relacionados com a via de excreção, nomeadamente o
fígado, o intestino e o rim.
Em relação à via de eliminação, observámos que ambos os complexos eram
eliminados pelas vias renal e hepatobiliar. A eliminação de complexos Tc1 e Tc2 por via
hepatobiliar reflete-se na acumulação inicial da actividade no fígado (17 % e 19,3 %
A.I./g órgão 5 min p.i., respectivamente). Estes valores diminuiem à medida que os
compostos passam para o intestino. A excreção total foi mais rápida para Tc2 (52,7 ±
2,5 e 64,0 ± 6,3 %, 1h e 4h p.i., respectivamente) do que para Tc1. Estes resultados
correlacionam-se com o carácter mais hidrofílico de Tc2 (Log D = -1,67 ± 0,03) em
comparação com Tc1 (Log D = 0,08 ± 0,04).
Nenhum dos complexos apresentou níveis elevados de fixação no estômago, o
que indica que não sofreram reoxidação in vivo a [99mTcO4]-.
0
5
10
15
20
25
1 h4 h
1 h4 h
% A
.I./
g ó
rgão
Osso
Músculo
Sangue
Rim
Fígado
Intestino
Tc1
Tc2
Compostos Contendo um Grupo Monofosfonato
64
2.2.4.2.2. Estabilidade in vivo
Para confirmar a estabilidade de Tc1 e Tc2 in vivo foram analisadas, por RP-
HPLC, amostras de soro e urina de ratinho recolhidas no momento do sacrifício. O soro
recolhido 60 min após injecção intravenosa dos complexos não apresentou nenhuma
impureza radioquímica. Como se mostra na figura 2.16 para Tc2, observou-se no
sangue um pico que foi atribuído ao complexo injectado inicialmente. A análise da
urina recolhida 1 hora após injecção comprovou também a elevada estabilidade in vivo
destes complexos, pois não foram detectadas quaisquer outras espécies radioquímicas
resultantes de degradação e/ou metabolização (figura 2.16).
Figura 2.16 – Cromatogramas de RP-HPLC do complexo Tc2 e amostras biológicas de ratinho CD-1 (detecção γ).
Tc2
Análise da urina de ratinho 1h
após administração de Tc2
Análise de soro de ratinho 1h
após administração de Tc2
Tempo de retenção (min)
Capitulo 2
65
2.3. COMPOSTOS CONTENDO UM GRUPO BISFOSFONATO
Os resultados descritos na secção 2.2, mostraram ser possível, a partir dos
ligandos contendo a unidade pirazolo-diamina e um grupo monofosfónico (L1 e L2),
preparar complexos estáveis do tipo fac-[M(CO)3(κ3-L)]+ (L = L1, L2, M = Re e 99mTc).
Os estudos biológicos realizados com estes complexos em ratinhos CD-1
(Charles River), revelaram que, apesar de não se fixarem significativamente em
nenhum órgão ou tecido, e em particular no osso, a excreção total foi relativamente
rápida, especialmente no caso de Tc2. Tc1 e Tc2 eram preferencialmente eliminados
pela via hepatobiliar.
Nesta secção, é descrita a síntese e caracterização química de ligandos
bifuncionais análogos a L1 e L2 mas com unidades bisfosfonato. As propriedades de
coordenação face à unidade [M(CO)3]+ (M = Re e 99mTc) são também apresentadas.
Serão também apresentados e discutidos os resultados de estabilidade, as
propriedades físico-químicas, a afinidade de ligação à hidroxiapatite e o
comportamento biológico in vivo.
2.3.1. Síntese e caracterização de ligandos pirazolo-diamina contendo
grupos bisfosfonatos (L4 – L6)
Os compostos L4 – L6 foram sintetizados a partir de um ligando pirazolo-
diamina funcionalizado com um grupo carboxilato. Os aminobisfosfonato AMDP [(1-
amino-1,1-metileno)bisfosfonato de etilo], PAM (pamidronato) e ALN (alendronato)
ligaram-se a esse grupo carboxilato através de uma ligação amida (figura 2.17).
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
66
Figura 2.17 – Unidade quelante pirazolo-diamina funcionalizada com um grupo carboxilato
para conjugação a um bisfosfonato através de uma função amida.
Começámos por sintetizar os derivados bisfosfonato AMDP, PAM e ALN como
indicado no esquema 2.5.
Esquema 2.5 – Síntese de aminobisfosfonatos: (A) AMDP; (B) PAM e ALN. (i) refluxo; (ii) Pd/C, etanol, refluxo; (iii) 1. PCl3, H3PO3; 2. H2O.
O AMDP foi sintetizado de acordo com o método descrito na literatura, através
da síntese do aminobisfosfonato 6, seguido da remoção dos grupos benzilo no
segundo passo [122, 123]. O éster dibenzilaminobisfosfonato de etilo (6) foi preparado
por aquecimento de uma solução de dibenzilamina, trietilortoformato e dietilfosfito. À
medida que a reacção decorria formava-se etanol que era necessário remover para
manter a temperatura da mistura reaccional elevada. Este procedimento seguido da
purificação por cromatografia em coluna de sílica gel, utilizando um gradiente (100 – 0
%) de n-hexano/etanol como eluente, levou à obtenção do composto 6, sob a forma
de um óleo, com um rendimento de 43 %. A remoção dos grupos benzilo do composto
6 foi realizada por hidrogenação com refluxo metanólico, na presença de ciclohexeno e
H2NP
P
OEtOEtOEtOEt
O
O
H2N P
OHPO
OHOH
OHO OH
n
n = 1, PAMn = 2, ALN
H2N
O
n OH
(i)PhNH2
PhEtO P
O
OH
OEt
OEt
EtOOEt
HN
P
P
OEtOEtOEtOEt
O
O
Ph
Ph
AMDP6
(ii)
(iii)
n = 1, -alaninan = 2, ácido 4-aminobutírico
A)
B)
2
Capítulo 2
67
catalizador de Pd/C. A suspensão obtida foi filtrada e após evaporação do solvente o
composto AMDP foi obtido quantitativamente sob a forma de um óleo.
O pamidronato (PAM) e o alendronato (ALN) foram obtidos conforme descrito
por Kieczykowski [124]. Aqueceu-se a 65 °C uma mistura de H3PO3, ácido
metanosulfónico e β – alanina ou ácido 4-aminobutírico. Após adição lenta de PCl3, as
misturas reaccionais permanecem em aquecimento (65 °C) e em agitação contínua
durante a noite. As misturas reaccionais foram arrefecidas até à temperatura
ambiente, adicionou-se H2O fria (0 - 5 °C) e refluxou-se durante mais 5 h. Após o
refluxo, as soluções foram arrefecidas até 20 °C e o pH foi ajustado a 4 - 5, por adição
de uma solução aquosa de NaOH a 50 %. As suspensões obtidas permaneceram no
congelador durante a noite e os produtos PAM e ALN precipitaram sob a forma de
sólidos brancos. Após filtração e secagem em vazio os sólidos brancos obtidos PAM (50
%) e ALN (87 %) foram analisados. A análise elementar mostrou que o composto PAM
foi obtido sob a forma de ácido (3-amino-1-hidroxipropilideno)bisfosfónico
monohidratado e o composto ALN foi obtido sob a forma de sal de (4-amino-1-
hidroxibutilideno)bisfosfonato de trisódio tetrahidratado.
Os compostos L4 – L6 foram obtidos fazendo reagir o composto 7 com o
correspondente aminobisfosfonato, como se mostra no esquema 2.6. A síntese do
composto 7 foi realizada conforme descrito na literatura [114].
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
68
Esquema 2.6 – Síntese dos conjugados com bisfosfonatos L4 – L7. i) AMDP, HOBt/DCC, acetonitrilo; ii) 1. Me3SBr/diclorometano, 2. metanol/água; iii) NHS/DCC, diclorometano; iv) PAM, NEt3, acetonitrilo/H2O; v) ácido trifluoroacético vi) ALN, HOBt/HBTU, NMM, N,N-dimetilformamida/água.
Para obter o composto L4, sintetizou-se o composto intermediário 8 através da
reacção de conjugação do aminobisfosfonato AMDP com o composto 7 utilizando
como activadores N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC) e 1-hidroxibenzotriazolo (HOBt)
e acetonitrilo como solvente. No decorrer da reacção observou-se a formação de um
sólido branco correspondente à N,N’-diciclohexilureia (DCU), que foi eliminado por
NNH
NN
(i)
(iv)
L4
COOH
NNH
O
NN O
O
O N
O
O
8
N
HN
O
POH
P
OHOOH
O OHOH
NN
NH
O
O
N
HN
O
POH
P
OHOOH
O OHOH
NN
NH2POH
P
O
HO
HO
OOHOH
N
HN
O
NN
NH
O
O
POH
P
O
HO
HO
OOHOH
N
HN
O
NN
NH2
L5
N
O
NH
P
P
OEtOEtOEtOEt
NN
NH
O
O
N
O
NH
P
P
O
O
OHOHOHOH
NN
NH2
7
9
11
(ii)
(vi)
(v)
L6
(iii)
O O
O O
10
(v)
Capítulo 2
69
filtração. O sobrenadante obtido foi seco em vazio e o sólido foi purificado por
cromatografia em coluna de sílica gel, com um gradiente de 2,5 – 15 %
etanol/diclorometano, originando o composto 8 com um rendimento de 58 %. O
tratamento do intermediário 8 com brometo de trimetilsilano, seguido de hidrólise em
metanol permitiu a remoção do grupo Boc e Et. O composto L4 foi obtido, sob a forma
de um sólido branco, por precipitação de uma mistura de metanol e éter etílico, com
um rendimento de 73 %. O composto L4 é muito solúvel em água e álcoois, e é
insolúvel na maioria dos solventes orgânicos.
As reacções de conjugação de 7 com PAM e ALN levaram à obtenção dos
respectivos conjugados L5 e L6, com rendimentos inferiores. A principal dificuldade
durante a preparação destes compostos foi a insolubilidade de PAM e ALN nos
solventes orgânicos normalmente utilizados nas reacções de conjugação [125], uma
vez que estes compostos são muito solúveis em água.
Nas experiências realizadas durante a optimização da síntese dos
intermediários 10 e 11 utilizaram-se dois tipos de estratégias que se apresentam no
esquema 2.7.
Esquema 2.7 - Síntese dos intermediários 10 e 11.
i) pré-activação do ácido carboxílico com NHS, PFF, TFF, DCC ou EDC; ii) conjugação do ácido bisfosfónico com adição de base; iii) reacção directa com adição simultânea de reagentes de activação (e.g. HATU, HOBt e
HBTU), ácido bisfosfónico (PAM ou ALN) e base.
N
HN
O
P OHP
OHOOH
O OH
OH
NN
NH
O
O
n
N NHNN
COOH
7O O
N NH
O
NN O
O
R
Éster activado
n = 1 (10)n = 2 (11)
O
N OO
FF
F
FF
FF
FOO
F
R
i)
ii)
iii)
PAM ou ALNBase
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
70
Como se mostra no esquema 2.7, essas estratégias consistiram no seguinte:
1) Pré-activação do ácido carboxílico do precursor 7 (1º passo), seguida da
conjugação com o ácido aminobisfosfónico (PAM ou ALN) em meio alcalino (2º
passo).
2) Reacção directa do precursor 7 com os ácidos aminobisfosfónicos (PAM ou
ALN) na presença de agentes de acoplamento e em meio alcalino.
Em ambas as estratégias, o meio manteve-se aproximadamente a pH 9 - 10,
quando se utilizaram bases como a trietilamina (NEt3), a diisopropiletilamina (DIPEA)
ou a N-metilmorfolina (NMM). Os reagentes de activação utilizados na primeira
estratégia, foram a N-hidroxisuccinimida (NHS), o pentafluorofenol (PFF) ou o
tetrafluorofenol (TFF) que, foram utilizados juntamente com N,N’-
diciclohexilcarbodiimida (DCC) ou N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida
cloridratada (EDC), para formação de um éster activado intermediário. Nas reacções
directas utilizaram-se os reagentes de acoplamento, hexafluorofosfato de 2-(1H-7-
azabenzotriazolo-1-il)-1,1,3,3-tetrametiurónio (HATU), 1-hidroxibenzotriazolo (HOBt)
ou hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazolo-1-il)-1,1,3,3-tetrametiurónio (HBTU).
Na tabela 2.5 apresentam-se as diferentes condições experimentais exploradas
para a síntese dos intermediários 10 e 11 a partir do composto 7 e do PAM e ALN, bem
como os rendimentos obtidos.
Capítulo 2
71
Geralmente, as reacções de conjugação realizam-se em solventes orgânicos
apróticos pois estas reacções envolvem a formação de um éster activado que, por ser
muito reactivo, é instável em solventes como a água ou álcoois. No entanto, para
resolver o problema de insolubilidade do PAM e ALN em solventes orgânicos
utilizaram-se misturas de água e solventes orgânicos.
Apesar de ser pouco comum em reacções de conjugação, também foram
realizadas experiências utilizando exclusivamente água como solvente, ou misturas de
água/i-propanol (iPrOH), ou tampão borato pH 9,5 (0,1 M)/CH3CN, conforme descrito
na literatura para conjugações com ALN ou PAM [98, 101, 126-130]. No entanto, a
maioria destas reacções não foi bem sucedida.
Tabela 2.5 – Condições experimentais estudadas para a síntese de 10 e 11 e rendimentos das reacções.
Síntese dos Intermediários
10 e 11
Reagentes de Acoplamento
Solventes Ácido
Bisfosfónico/Base
Rendimento
10
HBTU CH3CN PAM/NEt3 c)
PFF/DCC a)
CHCl3 a)
CH3CN/H2O b) PAM/NEt3 c)
CHCl3 a)
THF/H2O b) PAM/NEt3 c)
NHS/DCC a)
CH2Cl2 a)
iPrOH/H2O b) PAM/DIPEA c)
CH2Cl2 a)
DMSO b) PAM/DIPEA c)
CH2Cl2 a)
CH3CN b) PAM/NEt3 c)
CH2Cl2 a)
CH3CN/H2O b)
PAM/NEt3 ηηηη = 22 %
11
NHS/DCC a) CH2Cl2 a)
CH3CN/H2O b) ALN/NEt3 η = 5 %
NHS/EDC a) H2O a)
H2O b) ALN/DIPEA η = 6 %
TFF/DCC a)
CH2Cl2 a)
CH3CN/ Tampão pH 9.5 b)
ALN/NEt3 c)
CH3CN a)
CH3CN/ Tampão pH 9.5 b)
ALN/NMM c)
HATU DMF/H2O ALN/NMM c)
HOBt/HBTU DMF/H2O ALN/NMM ηηηη = 12 %
a) Reagentes ou solventes utilizadas na pré-activação da função ácido carboxílico do composto 7; b) Solventes utilizados na reacção de conjugação com PAM ou ALN; c) Rendimento não determinado devido à ausência de produto ou produto não isolado puro.
N
HN
O
POH
P
OHOOH
O OH
OH
N
N
NH
O
O
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
72
Os melhores resultados foram obtidos utilizando as condições experimentais
apresentadas no esquema 2.6.
O intermediário 10 foi obtido por reacção de activação do grupo ácido
carboxílico do precursor 7 com NHS e DCC, em diclorometano seco, à temperatura
ambiente, observando-se a formação de DCU, sob a forma de um precipitado branco.
Após 5 h, praticamente todo o precursor 7 tinha sido consumido e removeu-se o
precipitado por filtração. De seguida, fez-se reagir o éster activado 9 com PAM numa
mistura de CH3CN/H2O e NEt3 à temperatura ambiente durante 24 h. No final o PAM
que não reagiu foi removido por centrifugação. A purificação por cromatografia de
sílica gel, utilizando como eluentes o diclorometano, um gradiente de 10 – 100 % de
metanol/clorofórmio e um gradiente de 25 – 100 % de solução aquosa concentrada de
amónia/metanol, levou à obtenção do composto 10 com um rendimento de 22 %. O
compostos L5 foi obtido após remoção do grupo Boc do composto intermediário 10
com ácido trifluoroacético, e foi purificado por cromatografia de troca iónica. Esta
purificação envolveu a utilização de duas colunas diferentas, uma de troca catiónica,
fortemente acídica (DOWEX 50 x 4), eluída com água e uma solução aquosa 10 % de
piridina e uma outra coluna de troca catiónica, fracamente acídica (Amberlite GC50),
eluída com água. O composto L5 foi obtido com um rendimento de 30 %.
O intermediário 11 foi obtido através da reacção directa do precursor 7 com o
ALN na presença de HOBt/HBTU numa mistura de N,N-dimetilformamida/H2O e N-
metilmorfolina. Após 5 dias em agitação à temperatura ambiente o ALN, que não
reagiu foi removido por filtração. O solvente do filtrado foi evaporado e o resíduo foi
dissolvido em água, levando à precipitação de HOBt e HBTU em excesso. O precipitado
foi removido por filtração e o filtrado foi aplicado numa coluna SEP-PAK® C18 para
remover o restante ALN que não reagiu. Após remoção do solvente, o resíduo obtido
foi purificado por cromatografia de sílica gel, utilizando como eluentes o
diclorometano, um gradiente de 10 – 100 % de metanol/clorofórmio e um gradiente
de 25 – 100 % de solução aquosa concentrada de amónia/metanol. O composto 11 foi
obtido com um rendimento de 12 %.
Capítulo 2
73
O composto L6 foi obtido puro e com um rendimento de 40 % após remoção do
grupo Boc do composto 11 com ácido trifluoroacético, neutralização com uma solução
de NaOH 0,1 M e purificação utilizando uma coluna Sep-Pak® C18 para remoção de
sais.
Os compostos L4 – L6 foram caracterizados por análise elementar C, H, N e por
espectroscopia de RMN multinuclear. L4 foi também caracterizado por espectroscopia
de IV e os compostos L5 e L6 foram caracterizados por espectrometria de massa com
ionização por electrospray (ESI-MS).
Relativamente à análise elementar, os valores encontrados eram concordantes
com as formulações C16H32N5NaO8P2∙2H2O para o composto L5 e C17H34N5NaO8P2∙H2O
para o composto L6. Este resultado, juntamente com os dados obtidos através das
restantes análises efectuadas, permitiu caracterizar de forma inequívoca todos os
compostos sintetizados.
Nas tabelas 2.6, 2.7 e 2.8 apresentam-se os dados espectroscópicos de RMN de
1H, 13C e 31P dos compostos intermediários 8, 10, 11 e dos compostos finais L4 – L6.
Para a atribuição dos sinais de RMN realizaram-se experiências de 1H – 1H COSY
e 1H – 13C HSQC e a título exemplificativo apresentam-se em anexo os espectros de L5
nas figuras A.1 e A.2.
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
74
Tabela 2.6 – Dados de RMN dos compostos 8 e L4 em CDCl3 e D2O, respectivamente.
8
δ 17,5 (31P)
L4
δ 13,7 (31P)
δ δ δ δ (1H) δδδδ (1H) δδδδ (13C)
a – e, g
4,12 (m, 2H)* 2,86 (q largo, 2H) 2,64 (t largo, 2H) 2,45 (t largo, 2H)
2,38 (m, 4H)
3,68–3,07 (m largo, 10H)
2,38 (s largo, 2H)
55,5; 53,5; 49,7; 44,4; 37,6; 34,6;
21,6
f 1,71 (m, 2H) 1,94
(s largo, 2H)
h 5,19
(td, 1H, 2JPH = 22,2, 3JHH = 10,2) 4,38 (t, 1H) 47,9
(4)pz 5,82 (s, 1H) 6,07 (s, 1H) 109,8
(3/5)pz 2,23; 2,21 2 x (s, 3H)
2,20; 2,15 2 x (s, 3H)
150,1 (-C-) 147,6 (-C-) 13,1 (-CH3) 12,4 (-CH3)
C = O - - 175,9
BOC 1,38 (s, 9H) - -
OEt 4,12 (m, -O-CH2-, 8H)*
1,26 (m, -O-CH2-CH3, 12H) - -
NH 8,73
(d largo, NH, 1H, 3JHH = 9.0) 4,69 (s largo, NH, 1H);
- -
* Ressonâncias sobrepostas.
Capítulo 2
75
Tabela 2.7 – Dados de RMN dos compostos 10 e L5 em D2O.
10
δ 18,3 (31P)
L5
δ 18,2 (31P)
δ δ δ δ (1H) δδδδ (1H) δδδδ (13C)
a 4,07 (s largo, 2H) 4,21 (t, 2H) 45,13
b
3,32 (t largo, 2H) 3,12 (m, 2H) 2,76 (m, 4H) 2,11 (m, 2H)* 2,02 (m, 2H)* 2,24 (m, 2H); 1,69 (m, 2H)
3,34 (m, 2H)* 54,34
c 3,19 (m, 2H)* 52,07
d 3,19 (m, 2H)* 36,79
e 2,19 (t, 2H) 34,74*
f 1,76 (m, 2H) 22,0
g 2,92 (t, 2H) 55,30
h 3,34 (m, 2H)* 37,48
i 1,99 (m, 2H) 34,74*
j - - 74,85
(4)pz 5,82 (s, 1H) 5,88 (s, 1H) 108,2
(3/5)pz 2,11*; 2,02* 2 x (m, 3H)
2,14; 2,04 2 x (s, 3H)
151,6 (-C-) 144,1 (-C-) 14,2 (-CH3) 12,0 (-CH3)
C = O - - 176,5
BOC 1,25 (s, 9H) - -
*Ressonâncias sobrepostas.
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
76
Tabela 2.8 – Dados de RMN dos compostos 11 e L6 em D2O.
11
δ 18,6 (31P)
L6
δ 18,3 (31P)
δ δ δ δ (1H) δδδδ (13C) δδδδ (1H)
a 4,07 (t, 2H) 46,1 3,92 (t, 2H)
b - j
3,09 (m, 6H) 2,78 (t, 2H) 2,68 (t, 2H)
2,14 (m, 2H)* 1,74 (m, 6H)
54,5 (3 x C); 42,2; 38,7; 35,0; 33,3; 25,5; 23,3
3,04 (m, 2H) 2,72 (m, 4H) 2,51 (m, 2H) 2,36 (m, 2H)
2,01 (m, 2H)* 1,66 (m, 6H)
k - 83,2 -
(4)pz 5,84 (s, 1H) 107,4 5,79 (s, 1H)
(3/5)pz 2,14 (m, 3H)*
2,04 (s, 3H)
151,2 (-C-) 143,7 (-C-) 14,2 (-CH3) 12,1 (-CH3)
2,11 (s, 3H) 2,01 (m,3H)*
C = O - 177,4 -
BOC 1,28 (s, 9H) 160,08 -
*Ressonâncias sobrepostas.
Todos os compostos apresentaram um único singuleto nos espectros de RMN
de 31P. Nestes espectros, salienta-se que as ressonâncias dos compostos com AMDP [δ
17,5 (8); δ 13,5 (L4)] apareciam a campo mais alto do que as observadas para os
compostos com PAM [δ 18,3 (8); δ 18,2 (L4)] e ALN [δ 18,6 (8); δ 18,3 (L4)]. Estes
resultados correlacionam-se, muito provavelmente, com a presença do grupo hidroxilo
no carbono geminal de PAM e ALN.
Capítulo 2
77
Os espectros de RMN de 1H dos compostos L4 – L6 possuem um conjunto de
ressonâncias semelhantes entre si, devido à presença da unidade pirazolo-diamina.
Assim, o anel pirazolilo foi identificado em todos os compostos, através da presença no
espectro de RMN de 1H de três singuletos atribuídos ao protão 4, próximo de δ 5,8 e
aos grupos metilo 3 e 5 com desvios químicos entre δ 2,2 – 2,0. Os seis tripletos (Ha –
He, Hg) e um multipleto (Hf) devidos aos protões alifáticos do ligando pirazolo-diamina,
apareciam entre δ 4 – 1,6, sendo os desvios químicos dos protões Ha aqueles que
apareciam a campo mais baixo e os protões Hf aqueles que apareciam a campo mais
alto. Nos espectros de RNM de 13C de L4, L5 e 11, o anel pirazolilo foi identificado pela
existência de 5 sinais: dois devidos aos carbonos 3 e 5 do anel que apareciam entre δ
143 -152 ppm, um devido ao carbono 4 que aparecia entre δ 110 – 107 ppm e dois
devidos aos grupos metilo nas posições 3 e 5 que apareciam entre δ 12 – 14 ppm.
Foram também observados sinais distintos para cada um dos átomos de carbono das
cadeias alifáticas entre δ 55 – 21 ppm e os carbonos geminais dos grupos BF (PAM e
ALN) apareciam para campo mais baixo (δ 83 – 74 ppm), certamente devido ao efeito
desblindante do grupo hidroxilo.
No espectro de IV do composto L4 observou-se uma banda a 1154 cm-1
atribuída à vibração de extensão da ligação P = O do grupo ácido fosfónico, tal como
observado para L2 (secção 2.2). Observou-se ainda outra banda a 1647 cm-1, na região
onde geralmente se observam as frequências ν(C = O) e δ(N – H), dos grupos amida e
aminas primárias, respectivamente.
As formulações propostas para os compostos L5 e L6 foram também
confirmadas por ESI-MS. A título de exemplo, mostram-se na figura 2.18 os espectros
de massa obtidos em modo positivo e em modo negativo para o composto L5.
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
78
Figura 2.18 – ESI-MS do composto L5: (A) modo negativo; (B) modo positivo.
Para L5, o pico maioritário observado a m/z = 484,1, obtido em modo negativo
(figura 2.18 - A) corresponde ao ião molecular [M - H]-. Para o mesmo composto, em
modo positivo (figura 2.18 - B) encontrou-se um pico maioritário a m/z 486,0
correspondente ao ião molecular [M + H]+. Neste espectro, foram ainda identificados
outras espécies catiónicas, nomeadamente, [M + K]+ a m/z 523,9 e [M + Na]+ a m/z
507,9.
m/z484,00 486,00
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0484,2
485,2
486,2
m/z mais abundante calculado para: C16H32N5O8P2 [M-H]-
m/z486,00 487,00 488,00
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
m/z calculado C16H34N5O8P2
486,2
487,2 488,2
Capítulo 2
79
2.3.2. Síntese e caracterização dos complexos Re4 - Re6
Os complexos organometálicos fac - [Re(CO)3(κ3-L)]+ (Re4, L = L4 ; Re5, L = L5 e
Re6, L = L6) foram obtidos a partir dos precursores (NEt4)2[ReBr3(CO)3] ou
[Re(H2O)3(CO)3]Br como se indica no esquema 2.8. Os precursores de Re(I) foram
sintetizados a partir do complexo [ReBr(CO)5], conforme descrito na literatura [131-
133].
Esquema 2.8 – Vias de síntese dos complexos Re4 - Re6.
(i) HOBt/DCC/acetonitrilo, AMDP; (ii) 1. Me3SiBr/diclorometano; 2. metanol; (iii) TFF/DCC, acetonitrilo; (iv) PAM, NEt3, acetonitrilo/tampão borato pH 9,4; (v) HOBt/HBTU, NMM, ALN, DMF - H2O.
iii) iv)
v)
Re5
Re
OCCO
CO
NN N
NH2
O
HN
PP
OH
O
OHO
-O
O-
HO
+
Re6
Re
OCCO
CO
NN N
NH2
O
PP
OH
O
OHO
-O
O-
OH
HN
+
Re
OCCO
CO
NN N
NH2
O
OH
+
X = H2O, Br [Re(CO)3( 3-pzCOOH)]+
ReOC
COCO
X
X
X
+/-2
Re
OCCO
CO
NN N
NH2
O
HN P
POO
EtO OEt
OEtOEt
+
L4H2O/refluxo
i)
Re4
Re
OCCO
CO
NN N
NH2
O
HN P
POO
HO OH
OHOH
+
ii)
[Re(CO)3( 3-pzAMDP]+
afe
dcb
g
54
3
pz-COOHH2O/refluxo
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
80
O composto Re4 foi obtido por reacção de [Re(H2O)3(CO)3]Br com L4 em H2O
durante uma noite. O solvente da mistura reaccional foi removido por evaporação e o
resíduo foi dissolvido numa mistura de H2O/acetonitrilo (90/10) que, permitiu a
precipitação de uma parte dos reagentes de partida que não reagiram. O
sobrenadante foi purificado por HPLC - RP permitindo isolar o complexo Re4 puro com
um rendimento de aproximadamente 50 %.
Com a finalidade de confirmar o modo de coordenação do ligando L4 face à
unidade fac - [M(CO)3]+ (M = Re, 99mTc), e provar que a unidade bisfosfonato não
estava coordenada ao metal, foi desenvolvida uma segunda via de síntese que
também permitiu isolar Re4 puro e com um rendimento superior. Essa via de síntese
consistiu em sintetizar o composto intermediário [Re(CO)3(κ3-pzCOOH)]Br a partir do
precursor (NEt4)2[ReBr3(CO)3] conforme descrito na literatura [107]. A conjugação da
unidade bisfosfonato com o ácido carboxílico foi realizada através da reacção do
precursor [Re(CO)3(κ3-pzCOOH)]+ com o éster (1-amino-1,1-metileno)bisfosfonato de
etilo, na presença dos reagentes de acoplamento HOBt e DCC durante 20 h. A N,N’-
diciclohexilureia (DCU) que precipitou foi removida por centrifugação. O solvente do
sobrenadante foi evaporado e o resíduo seco foi suspendido numa mistura de
H2O/acetonitrilo (90/10). Esta mistura foi novamente filtrada para remover a DCU
insolúvel e o complexo intermediário [Re(CO)3(κ3-pzAMDP)]+ foi obtido com um
rendimento de 66 %, após purificação por cromatografia preparativa de RP- HPLC. O
complexo Re4 foi obtido por hidrólise dos ésteres etílicos de [Re(CO)3(κ3-pzAMDP)]+
com brometo de trimetilsilano. O rendimento desta reacção, calculado com base no
espectro de 1H RMN, foi quantitativo. O complexo Re4 foi obtido, através das duas
vias, sob a forma de um óleo amarelo pálido estável ao ar.
Para a síntese de Re5, começámos por conjugar PAM ao grupo ácido
carboxílico do precursor [Re(CO)3(κ3-pzCOOH)]Br pré-activado com NHS e DCC, em
diclorometano seco, à temperatura ambiente. No passo seguinte, a conjugação com
PAM decorreu numa mistura de acetonitrilo/tampão borato pH 9,5 (0,1 M) e
trietilamina, à temperatura ambiente durante 24 h. No entanto, este procedimento
levou à obtenção do complexo Re5 com um rendimento muito baixo (8 %).
Capítulo 2
81
Com o objectivo de optimizar este rendimento, a síntese de Re5 foi realizada
por um processo análogo, mas utilizando DCC e TFF para activação do grupo
carboxilato. O éster activado fez-se reagir com PAM em acetonitrilo/tampão borato pH
9,5 (0,1 M) e trietilamina, mantendo o pH = 9. Após 5 dias em agitação, à temperatura
ambiente, o solvente da mistura reaccional foi seco em vazio e o produto foi extraído
com água. O solvente foi evaporado novamente e o excesso de trietilamina foi
removido através da lavagem do resíduo seco com acetonitrilo. O resíduo obtido foi
dissolvido em água e purificado por SEP-Pak C18. A lavagem com água, seguida da
eluição com um gradiente de 27 - 75 % metanol/água, levou à obtenção de Re5 com
um rendimento de 24 %.
O complexo Re6 foi obtido por reacção do precursor [Re(CO)3(κ3-pzCOOH)]Br
com ALN na presença de HOBt/HBTU, numa mistura de N,N-dimetilformamida/H2O e
N - metilmorfolina, mantendo o pH próximo de 8. A reacção decorreu com agitação
constante à temperatura ambiente durante 5 dias. Após evaporação do solvente da
mistura reaccional na linha de vazio, o produto foi extraído com água. O volume da
solução aquosa foi concentrado e aplicado numa coluna Sep-Pak C18. O complexo Re6
foi obtido sob a forma de óleo incolor com um rendimento de 40 %, após lavagem da
coluna Sep-Pak com uma pequena quantidade de H2O, 20 % metanol/H2O e 30 %
metanol/H2O e eluição com 50 % metanol/H2O.
O complexo intermediário [Re(CO)3(κ3-pzAMDP)]+ e os complexos Re4 - Re6
foram caracterizados por espectroscopia de ressonância magnética multinuclear. Os
complexos Re5 e Re6 foram também caracterizados por análise elementar,
espectroscopia de IV e por espectrometria de massa (ESI-MS).
Relativamente à análise elementar, os valores encontrados eram concordantes
com as formulações C19H31N5Na2O11P2ReBr∙CH3OH para o complexo Re5 e
C20H33N5Na2O11P2ReBr∙CH3OH para o complexo Re6 (ver estruturas no esquema 2.8).
Este resultado, juntamente com os dados obtidos através das restantes análises
efectuadas, permitiu caracterizar de forma inequívoca todos os compostos
sintetizados.
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
82
A atribuição das ressonâncias nos espectros de RMN de 1H e 13C dos complexos
[Re(CO)3(κ3-pzAMDP)]+, Re4 - Re6 foi realizada com base em experiências
bidimensionais de 1H – 1H COSY e 1H – 13C HSQC, como exemplificado para Re5 (figuras
A.3 e A.4 e A.5) em anexo.
Nas tabelas 2.9 e 2.10 apresentam-se os dados espectroscópicos de RMN de
1H, 13C e 31P do complexo intermediário [Re(CO)3(κ3-pzAMDP)]+ e dos complexos Re4 -
Re6.
Capítulo 2
83
Tabela 2.9 – Dados de RMN dos compostos [Re(CO)3(κ3-pzAMDP)]+ e Re4 em D2O.
[Re(CO)3(κκκκ3-pzAMDP)]+
Re4
δ δ δ δ (1H) δδδδ (13C) δδδδ (1H) δδδδ (13C)
a 4,28 (d largo, 1H) 49,0
4,29 (d largo, 1H) 49,0
a’ 3,94 (m,1H) 4,07 (m largo, 1H)
b 3,29 (m largo, 1H)* 54,5
3,26 (m largo, 1H)* 54,6
b’ 2,54 (t largo, 1H) 2,55 (t largo,1H)
c/c’ 2,71 (s largo, 2H) 63,1 2,71 (s largo, 2H) 63,2
d 3,00 (m largo, 1H) 44,1
3,01 (m largo, 1H) 44,2
d’ 2,35 (m largo, 2H) 2,34 (m largo, 2H)
e/e’ 2,33 (t, 2H) 32,7 2,20 (s largo, 2H) 33,9
f 2,04 (m largo, 1H) 21,3
2,03 (m, 1H) 22,1
f’ 1,83 (m largo, 1H) 1,88 (m largo,1H)
g 3,54 (m largo, 1H) 67,7
3,50 (m largo, 1H) 67,7
g’ 3,29 (m largo, 1H)* 3,26 (m largo, 1H)*
h 4,51 (m, 1H) 50,1 4,53 (m, 1H) 50,9
O-CH2- 4,08 (m, 8H) 67,5 - -
O-CH2-CH3 1,15 (m, 12H) 17,7 - -
NH2 5,04; 3,64 2 x (s largo) - 5,04; 3,64
2 x (s largo) -
(4)pz 6,01 (s, 1H) 109,7 6,01 (s, 1H) 109,7
(3/5)pz 2,25; 2,13 2 x (s, 3H)
155,6 (-C-) 146,2 (-C-) 17,3 (-CH3) 12,8 (-CH3)
2,24; 2,13 2 x (s, 3H)
155,6 (-C-) 146,2 (-C-) 17,3 (-CH3) 12,9 (-CH3)
C = O - 179,5 - 180,4
C ≡ O - 196,1** - 196,5; 196,1; 194,9
* Ressonâncias sobrepostas. ** Não foi possível distinguir os outros dois sinais da linha de base.
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
84
Tabela 2.10 – Dados de RMN dos compostos Re5 e Re6 em D2O.
Re5
Re6
δ δ δ δ (1H) δδδδ (13C) δδδδ (1H) δδδδ (13C)
a 4,36 (dd, 1H) 47,2
4,31 (dd, 1H) 47,1
a’ 4,13 (dd, 1H) 4,08 (dd, 1H)
b 3,40 (m, 1H)* 52,8
3,28 (m largo, 1H)* 52,8
b’ 2,60 (dd, 1H) 2,56 (m,1H)
c/c’ 2,76 (s largo, 2H) 61,3 2,71 (s largo, 2H) 61,3
d 3,11 (m largo, 1H) 42,2
3,07 (m largo, 1H)* 42,2
d’ 2,43 (m largo, 1H) 2,38 (m largo, 2H)
e/e’ 2,19 (m, 2H)* 33,1* 2,14 (m, 2H)* 32,8
f/f’ 2,01 (m largo, 2H)* 20,7 2,07 (m, 1H) 20,7
g 3,54 (dd, 1H) 66,0
3,50 (m, 1H) 65,9
g’ 3,40 (m largo, 1H)* 3,28 (m largo, 1H)*
h/h’ 3,40 (m, 2H)* 36,1 (t) JCP = 7,9 Hz 3,07 (m largo, 1H)* 40,0
i/i’ 2,01 (m largo, 2H)* 33,1* 1,71 (m, 2H) 23,3
j - 73,2 (t) JCP = 129,4 Hz 1,82 (m, 2H) 31,1
k - - 71,8
NH2 5,11; 3,64 2 x (s largo) - 5,06; 3,64
2 x (s largo) -
(4)pz 6,07 (s, 1H) 107,8 6,02 (s, 1H) 107,7
(3/5)pz 2,30; 2,19* 2 x (s, 3H)
153,7 (-C-) 144,3 (-C-) 15,4 (-CH3) 10,9 (-CH3)
2,26; 2,14* 2 x (s, 3H)
153,7 (-C-) 144,3 (-C-) 15,3 (-CH3) 10,9 (-CH3)
C = O - 174,9 - 175,4
C ≡ O - 194,6; 194,2; 193,1 - 194,5; 194,2;
193,1
* Ressonâncias sobrepostas. ** Não foi possível distinguir os outros dois sinais da linha de base.
Capítulo 2
85
Como se pode concluir por análise dos resultados compilados nas tabelas 2.9 e
2.10, o perfil dos espectros de 1H-RMN e 13C-RMN dos complexos são semelhantes
entre si, com desvios químicos praticamente sobreponíveis.
No espectro de RMN de 1H observaram-se três singuletos atribuídos ao protão
4, próximos de δ 6 ppm e aos grupos metilo 3 e 5 do anel pirazolilo com desvios
químicos entre δ 2,3 – 2,1 ppm. A presença de 4 pares de multipletos (a - a’, b - b’, d -
d’, g - g’), integrando cada um deles para um protão é compatível com a coordenação
tridentada da unidade quelante pirazolo-diamina ao centro metálico fac - [Re(CO)3]+.
Os protões f e f’, no caso do complexo Re5 e Re6, não se puderam distinguir um do
outro devido à sobreposição ocasional com os protões Hi da unidade pamidronato ou
alendronato. Em Re5 e Re6 as ressonâncias devidas ao PAM e ALN não sofrem desvio
significativo face às mesmas ressonâncias nos respectivos ligandos L5 e L6. Este
resultado confirma que a unidade bisfosfonato, apesar de possuir grupos
potencialmente coordenantes, não se encontra envolvida na ligação ao centro
metálico. Nos espectros de RMN de 1H surgem também dois sinais largos, atribuídos
aos protões da amina primária NH2 que aparecem próximo de δ 5 e 3,6 ppm. Este
desdobramento deve-se ao carácter diastéreotépico detes protões, após coordenação
da amina ao centro metálico.
No espectro de RMN de 13C dos complexos [Re(CO)3(κ3-pzAMDP)]+, Re4 - Re6
foi possível observar todas as ressonâncias esperadas, nomeadamente, dos ligandos
carbonilo (C≡O), entre δ 196 e δ 193 ppm, do grupo C = O entre δ 180 e δ 175 ppm e
do anel pirazolilo [C(3/5)pz] entre δ 156 e δ 144 ppm. Salienta-se ainda o facto de ter
sido possível observar, no caso do complexo Re5, a ressonância do carbono Cj, da
unidade pamidronato, a δ 73,2 na forma de tripleto, devido ao acoplamento ao núcleo
de fósforo (JCP = 129,4 Hz).
Na tabela 2.11 apresentam-se os desvios químicos do 31P para os compostos L4
- L6 e para os complexos Re4 - Re6.
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
86
A diferença entre os desvios do 31P nos ligandos e respectivos complexos foi de:
∆ = 2,6 (L4/Re4), ∆ = 6,5 (L5/Re5) e ∆ = 1,3 (L6/Re6). Estas diferenças (∆) são da
mesma ordem de grandeza das observadas para o complexo Re1 caracterizado
estruturalmente por difracção de raios - X.
Os complexos Re5 e Re6 também foram caracterizados por espectroscopia de
IV. A característica mais significativa destes espectros é a presença de bandas
atribuíveis às vibrações de extensão ν(C≡O), que apareciam a frequências comparáveis
às encontradas para o complexo Re1, na região de 2100 - 1900 cm-1 e apresentavam
um perfil característico do arranjo facial dos grupos carbonilo (figura 2.19). Estas
bandas aparecem numa região entre 2033 e 1912 cm-1, ligeiramente desviadas para
frequências superiores relativamente ao precursor (NEt4)2[ReBr3(CO)3] (2000, 1869
cm-1), o que é indicativo da coordenação ao centro metálico.
Tabela 2.11 – Dados de RMN de 31P de L4 - L6 e Re4 - Re6.
LIG
AN
DO
S
L4
L5
L6
δ(31P)� 13,7 18,2 18,3
CO
MP
LEX
OS
Re4
Re5
Re6
δ(31P)� 11,1 24,7 19,6
N
HN
O
POH
P
OHOOH
O OH
OH
N
N
NH2
Figura 2.19 – Espectros de IV
KBr, na região 2
Na figura 2.19 apr
característica da vibração d
Re6, cujos ligandos continha
ou 1650 cm-1, respectivamen
As formulações pro
confirmadas por ESI-MS. A
espectros de massa obtidos
Re6.
ν(C≡O)
ν2100 1900
IV do precursor [Re(CO)3 (H2O)3]Br e dos complexoão 2100 – 1500 cm-1.
apresenta-se também a zona onde aparece
o de extensão ν(C=O) da função amida. Os com
inham um grupo destes, apresentavam uma ban
mente.
propostas para os compostos Re5 e Re6
. A título de exemplo, estão representados na
idos em modo positivo e em modo negativo pa
Re5
Re6 ν(C=O)
ν(cm-1) 00 1700 1500
Capítulo 2
87
lexos Re5 e Re6 em
rece a frequência
s complexos Re5 e
banda a 1686 cm-1
foram também
na figura 2.20 os
o para o composto
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
88
Figura 2.20 – ESI-MS do complexo Re6: (A) modo negativo; (B) modo positivo.
No espectro de massa do complexo Re6, obtido em modo negativo detectou-se
um pico maioritário a m/z = 768,0 que corresponde ao ião molecular [M - 2H]- e um
pico de menor intensidade a m/z = 383,4 correspondente ao ião [M - 3H]2- (figura 2.20
- A). No espectro de massa deste composto obtido em modo positivo (figura 2.20 - B)
detectaram-se as espécies catiónicas correspondentes a [M]+ a m/z 770,1, [M - H +
Na]+ a m/z 792,1, [M - 2H + 2Na]+ a m/z 814,1 e [M - 2H + Na + K]+ a m/z 830,0.
Capítulo 2
89
2.3.3. Síntese e caracterização dos complexos Tc4 - Tc6
Os complexos organometálicos Tc4 - Tc5 foram preparados por reacção dos
compostos L4 - L6 com uma solução contendo o precursor fac - [99mTc(H2O)3(CO)3]+
(esquema 2.9).
Esquema 2.9 - Síntese dos complexos Tc4 - Tc6.
O precursor fac - [99mTc(H2O)3(CO)3]+ foi preparado a partir de um kit Isolink®
contendo reagentes liofilizados, conforme descrito na secção 2.2.3. As reacções do
precursor com os compostos L4 - L6 foram optimizadas em termos de concentração
final do ligando, tempo de reacção e temperatura.
As melhores condições reaccionais para a obtenção do complexo Tc4, obtido
com elevado rendimento e pureza radioquímica (>96 %), consistiram no aquecimento
a 100 °C, em meio de NaCl 0,9% e a pH 7,4, durante 30 min, utilizando uma
Tc5
Tc
OCCO
CO
NN N
NH2
O
HN
PP
OH
O
OHO
-O
O-
HO
+
Tc6
Tc
OCCO
CO
NN N
NH2
O
PP
OH
O
OHO
-O
O-
OH
HN
+
L4Tc
OCCO
CO
H2OOH2
OH2
+
L5
Tc4
Tc
OCCO
CO
NN N
NH2
O
HN P
POO
HO OH
OHOH
+
L6
99m99m 99m
99m
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
90
concentração final de ligando L4 de 5 x 10-5 M. Para a síntese de Tc5 e Tc6 foram
utilizadas as mesmas condições reaccionais, mas a concentração final dos ligandos L5 e
L6 foi de 1x10-4 M, para a obtenção dos complexos com rendimentos e pureza
radioquímica elevados (> 95%).
Os complexos Tc4 - Tc6 foram caracterizados por comparação dos seus
cromatogramas de HPLC, obtidos com detecção γ, com o dos respectivos complexos
análogos de Re, obtidos com detecção UV.
Figura 2.21 - Cromatogramas de RP-HPLC dos complexos Re4, Re5 e Re6 (detecção UV, 254
nm), e os respectivos complexos análogos Tc4, Tc5 e Tc6 (detecção γ).
Como se conclui da análise da figura 2.21, os compostos apresentaram picos
bem definidos com diferenças mínimas nos tempos de retenção obtidos para os
complexos de 99mTc [Tc4 (tR = 13,2 min), Tc5 (tR = 12,0 min), Tc6 (tR = 14,2 min)] e para
os complexos análogos de Re [Re4 (tR = 13,9 min), Re5 (tR = 11,9 min), Re6 (tR = 13,8
min)].
Tempo (min) 15 20 25 10
Tempo (min) 15 20 25 10
Tempo (min) 15 20 25 10
Tc6 14,2 min
Re6 13,8 min
Tc5 12,0 min
Re5 11,9 min
Tc4 13,2 min
Re4 13,9 min
No caso dos comple
através da determinação do
literatura [121]. Os valores
indicando um forte carác
certamente à presença dos g
A determinação da c
7,2 (tampão fosfato salino 0
4.5.1 [49, 134]. Como exem
obtido quando Tc6 foi analis
Figura 2.22 - Distribuição de ac
Como se pode ver, o
positivo. A migração de amb
de migração de 1,2 cm e de
A migração para o pó
apresentam carga negativa.
ambos os complexos, no es
leva-nos a concluir que ex
(esquema 2.8).
plexos Tc5 e Tc6, a lipofilia/hidrofilia também
o dos valores de Log D, de acordo com o méto
ores obtidos foram -2,00 ± 0,02 (Tc5) e -1,94
arácter hidrofílico destes complexos (log D
os grupos ácido bisfosfónico.
da carga dos complexos foi efectuada por elect
ino 0,2M), de acordo com o procedimento desc
exemplo, apresenta-se na figura 2.22 o radio
nalisado por electroforese, a pH 7,2.
e actividade determinada por electroforese para Tc6
r, o composto migra do ponto de aplicação no s
ambos os complexos Tc5 e Tc6 é semelhante, sen
de 1,3 cm para Tc5 e Tc6, respectivamente.
o pólo positivo permite concluir que, a este pH
tiva. Tendo em conta que o metal radioactivo se
o estado de oxidação +1, a carga global negativ
e existem pelo menos dois grupos hidroxilo
Capítulo 2
91
bém foi avaliada,
étodo descrito na
1,94 ± 0,02 (Tc6),
D < 0), devido
lectroforese, a pH
descrito na secção
adiocromatograma
Tc6.
no sentido do pólo
, sendo o percurso
pH, os complexos
o se encontra, em
ativa do complexo
ilo desprotonados
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
92
2.3.4. Avaliação biológica dos complexos de 99mTc(I)
2.3.4.1. Estudos in vitro
2.3.4.1.1. Adsorção à hidroxiapatite (HA)
Como foi referido no preâmbulo e na secção 1.2, a HA é o principal
componente da matriz inorgânica do osso. Deste modo, o objectivo dos estudos de
adsorção à HA, consistiram em avaliar se a afinidade dos aminobisfosfonatos PAM e
ALN, para o osso, foi afectada pela incorporação do complexo organometálico. Os
ensaios de adsorção dos complexos Tc5 e Tc6 à HA, após incubação a 37 °C, em função
da massa de HA permitiram obter os resultados apresentados na tabela 2.12 e na
figura 2.23 [135, 136].
Figura 2.23 - Percentagem de ligação de Tc5 e Tc6 à HA (1 h de incubação, a 37 °C) (n = 3).
A análise dos resultados de adsorção apresentados na figura 2.23, permitiu
concluir que ambos os complexos se ligavam à HA de modo semelhante, apresentando
um valor máximo próximo de 75 % quando utilizámos 20 mg de HA.
Fomos então analisar a adsorção de Tc5 e Tc6 a 20 mg de HA em função do
tempo de incubação (tabela 2.12).
HA [mg]
Ad
sorç
ão [
%]
Tc5
Tc6
Capítulo 2
93
A análise dos resultados de adsorção à HA obtidos em função do tempo de
incubação (0, 1, 2 e 4 horas) permitiu concluir que, o processo de ligação é igualmente
rápido, para ambos os complexos, atingindo o seu valor máximo rapidamente.
2.3.4.2. Estudos in vivo
2.3.4.2.1. Biodistribuição em ratinhos CD-1
O comportamento biológico dos complexos Tc4 - Tc6 foi avaliado em ratinhos
CD-1 (Charles River), injectados com 100 µl (22 - 32 MBq) de cada complexo, na veia da
cauda, de acordo com o procedimento descrito anteriormente para os complexos Tc1
e Tc2. O objectivo deste estudo era avaliar a farmacocinética e a estabilidade in vivo de
Tc4 - Tc6.
Os resultados de biodistribuição nos tecidos, expressos em percentagem da
actividade injectada por grama de órgão (% A.I./g órgão) e a excreção total expressa
em % A.I. encontram-se compilados na tabela 2.13.
Tabela 2.12 - Percentagem de ligação a 20 mg de HA, determinada para Tc5 e Tc6, em
função do tempo de incubação a 37 °C.
Tempo (h) % ligação à HA
Tc5 Tc6
0 68,4 ± 0,4 69,3 ± 2,7
1 76,2 ± 0,9 75,3 ± 0,9
2 77,8 ± 0,4 76,4 ± 1,0
4 81,6 ± 1,5 80,4 ± 1,4
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
94
Na figura 2.24 apresenta-se um histograma que mostra mais claramente qual o
comportamento dos complexos nos órgão mais representativos.
Figura 2.24 - Fixação de Tc4 - Tc6 nos órgãos mais representativos de ratinhos CD-1.
0
2
4
6
8
10
12
14
1 4 1 4 1 4
Sangue Músculo Intestino Rim Fígado Osso
Tabela 2.13 – Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) e excreção total (% A.I.) para
os complexos Tc4 - Tc6 em ratinhos CD-1.
Tc4 Tc5 Tc6
1 h 4 h 1 h 4 h 1 h 4 h
Sangue 0,47 ± 0,08 0,17 ± 0,01 0,32 ± 0,01 0,12 ± 0,03 0,44 ± 0.08 0,19 ± 0,03
Rim 1,9 ± 0,5 1,5 ± 0,6 2,15 ± 0,02 1,3 ± 0,3 1,9 ± 0,2 1,8 ± 0,3
Fígado 0,9 ± 0,1 0,8 ± 0,3 1,1 ± 0,3 0,7 ± 0,3 1,5 ± 0,3 1,1 ± 0,2
Intestino 0,4 ± 0,1 0,6 ± 0,2 0,5 ± 0,1 0,7 ± 0,2 0,6 ± 0,1 0,8 ± 0,1
Baço 0,5 ± 0,2 0,19 ± 0,07 0,3 ± 0,2 0,10 ± 0,04 0,34 ± 0,01 0,2 ± 0,1
Coração 0,19 ± 0,02 0,10 ± 0,02 0,11 ± 0,01 0,06 ± 0,01 0,20 ± 0,01 0,13 ± 0,02
Pulmões 0,48 ± 0,06 0,31 ± 0,19 0,30 ± 0,02 0,14 ± 0,04 0,6 ± 0,1 0,32 ± 0,08
Estômago 0,5 ± 0,3 0,5 ± 0,3 0,08 ± 0,03 0,20 ± 0,07 0,4 ± 0,3 0,23 ± 0,01
Músculo 0,13 ± 0,04 0,08 ± 0,06 0,17 ± 0,08 0,09 ± 0,03 0,4 ± 0,1 0,21 ± 0,04
Osso 2,7 ± 0,7 3,0 ± 0,5 4,6 ±±±± 0,7 4,7 ±±±± 0,9 12,7 ±±±± 0,9 9,7 ±±±± 1,7 Excreção total 72,0 ± 1,8 74,1 ± 1,2 64,5 ± 1,4 67,3 ± 3,6 58,2 ± 1,1 63,6 ± 2,2
Tc4 Tc5 Tc6
Tempo [h]
% A
.I./
g ó
rgão
Capítulo 2
95
Os resultados de biodistribuição de Tc4 - Tc6, em ratinhos CD-1, apresentaram
uma fixação preferencial no osso, com um longo tempo de permanência neste tecido.
A fixação óssea é particularmente elevada, para Tc6 (12,72 ± 0,99 % A.I./g, 1 h p.i.),
sendo Tc4 o que apresentou menor fixação óssea (2,74 ± 0,71 % A.I./g, 1 h p.i.).
Da análise dos resultados de biodistribuição obtidos após injecção dos
complexos Tc4 - Tc6 concluímos ainda que, de uma maneira geral, a depuração
sanguínea e a consequente distribuição para os tecidos é rápida. A via de eliminação
principal para estes três complexos é renal, provavelmente devido ao seu carácter
predominantemente hidrofílico. Além disso, não houve fixação nem retenção
significativa no estômago, indicando que, in vivo, a dissociação do 99mTc e a reoxidação
a [99mTcO4]-, é inexistente.
No que diz respeito à excreção total, os complexos Tc4 -Tc6, são rapidamente
excretados. Ao fim de 4 horas a actividade excretada variou entre 64 - 74 % da
actividade inicial injectada.
2.3.4.2.2. Biodistribuição em ratinhos Balb-c
Os complexos Tc5 e Tc6, que apresentaram resultados biologicamente mais
promissores em ratinho CD-1 foram escolhidos para prosseguir estudos noutra estirpe
de ratinho (Balb-c, Charles River). Estes estudos, tiveram como objectivo avaliar as
diferenças entre as duas estirpes animais e facilitar a comparação com alguns
resultados descritos na literatura para complexos análogos.
Os resultados de distribuição nos tecidos, expressos em percentagem da
actividade injectada por grama de órgão (% A.I./g órgão) e a excreção total expressa
em % A.I., encontram-se compilados na tabela 2.14.
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
96
Apresentamos ainda a fixação de Tc5 e Tc6 em órgãos mais significativos, sob a
forma de histograma na figura 2.25.
Figura 2.25 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) dos complexos Tc5 e Tc6, em ratinhos Balb-C.
0
4
8
12
16
20
1 h 4 h 6,5 h 1 h 4 h 6,5 h
Sangue Músculo Intestino Rim Fígado Osso
Tabela 2.14 – Biodistribuição (% A.I./g órgão) e excreção total (% A.I.) para os complexos
Tc5 e Tc6 em ratinhos Balb-C.
Tc5 Tc6
1 h 4 h 6,5 h 1 h 4 h 6,5 h
Sangue 0,52 ± 0,01 0,18 ± 0,03 0,14 ± 0,03 0,6 ± 0,1 0,20 ± 0,02 0,22 ± 0,03
Rim 4,2 ± 0,4 3,2 ± 0,2 3,3 ± 0,4 3,3 ± 1,1 2,7 ± 0,4 2,6 ± 0,6
Fígado 2,1 ± 0,3 1,5 ± 0,1 1,2 ± 0,3 2,8 ± 0,6 1,8 ± 0,8 2,3 ± 0,6
Intestino 1,52 ± 0,04 0,7 ± 0,1 0,4 ± 0,1 1,3 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,3 ± 0,1
Baço 0,71 ± 0,08 0,64 ± 0,05 0,6 ± 0,1 1,6 ± 0,3 0,9 ± 0,4 1,3 ± 0,2
Coração 0,5 ± 0,2 0,22 ± 0,02 0,2 ± 0,1 0,4 ± 0,2 0,3 ± 0,1 0,17 ± 0,04
Pulmões 0,46 ± 0,07 0,34 ± 0,05 0,34 ± 0,06 1,8 ± 0,3 1,6 ± 0,7 1,1 ± 0,5
Estômago 0,5 ± 0,2 0,27 ± 0,05 0,19 ± 0,08 0,40 ± 0,07 0,11 ± 0,04 0,2 ± 0,2
Músculo 0,4 ± 0,1 0,32 ± 0,05 0,2 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,22 ± 0,02 0,20 ± 0,05
Osso 18,3 ± 0,6 15,3 ± 0,8 8,7 ± 2,4 17,3 ± 1,5 15,2 ± 1,4 13,4 ± 2,1 Excreção total 65,6 ± 1,2 74,1 ± 0,9 74,3 ± 2,5 66,8 ± 7,6 77,2 ± 0,5 78,2 ± 1,6
Tc5 Tc6
Tempo [h]
% A
.I./
g ó
rgão
Capítulo 2
97
Os resultados de biodistribuição de Tc5 e Tc6, em ratinhos Balb-c, revelaram
fixação preferencial no osso, com um longo tempo de permanência neste tecido.
Ambos os complexos sofreram uma rápida depuração sanguínea, e rápida eliminação
dos principais órgão, exceptuando os que estão relacionados com a via de excreção
(rim, fígado e intestino). Ao fim de 4h p.i., a excreção total de Tc5 e Tc6 nos ratinhos
Balb-c era muito elevada (74,1 - 77,2 %).
Comparando estes resultados com os descritos na secção 2.3.4.2.1, conclui-se
que em Balb-c a fixação no osso foi significativamente superior à determinada para os
ratinhos CD-1. A excreção total em Balb-c foi também ligeiramente superior. Dos
complexos avaliados o Tc6 era o que permanecia mais tempo fixado no osso.
2.3.4.2.3. Estabilidade de Tc5 e Tc6 em ratinhos CD-1 e Balb-C
Paralelamente aos ensaios de biodistribuição, foi também estudada in vivo a
estabilidade dos complexos Tc5 - Tc6 (ratinhos CD-1 e Balb-C). A estabilidade do
complexo Tc4 foi apenas avaliada em ratinho CD-1, pois devido ao modesto valor de
fixação óssea nesta espécie animal não prosseguimos com os estudos de
biodistribuição nos ratinhos Balb-C.
Recolheram-se amostras de urina e sangue dos ratinhos 1 h após
administração. Depois de tratamento adequado, conforme descrito na secção 4.5.4.1,
fez-se a análise das amostras biológicas por RP-HPLC. De um modo geral, podemos
concluir que todos os complexos apresentaram um comportamento semelhante em
ratinhos CD-1 e Balb-C, Como exemplo, apresentam-se os cromatogramas das
amostras de urina e soro de ratinho CD-1, recolhidas 1h após administração do
complexo Tc4 (figura 2.26).
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
98
Figura 2.26 - Cromatogramas de RP-HPLC da preparação inicial de Tc4 e de urina e soro de
ratinho CD-1, recolhidos 1 h após injecção deste complexo (detecção γ).
Como se pode concluir da análise dos cromatogramas o complexo não é
oxidado ou metabolizado in vivo.
2.3.3 – Comparação com o 99mTc-MDP
Como ficou certamente patente no capítulo introdutório, são grandes as
diferenças de fixação óssea encontradas em diferentes espécies animais, mas também
para a mesma espécie. As diferenças encontradas para a mesma espécie pode ser
devida à idade e/ou peso dos animais utilizados. Assim, constitui prática corrente que
cada laboratório analise na mesma espécie animal os novos compostos em simultâneo
com o radiofármaco 99mTc-MDP que, como já se disse, é o que se encontra em
utilização clínica. Assim, o 99mTc-MDP foi avaliado em Balb-c, utilizando condições
experimentais idênticas às utilizadas para Tc5 e Tc6.
O radiofármaco 99mTc-MDP foi preparado utilizando um kit fornecido pela GE
Healthcare ou pela Nordion. Este Kit contém ácido metilenodifosfónico, cloreto
estanoso (redutor) e ácido ascórbico (antioxidante). A estes reagentes adicionam-se 2 -
Tempo (min)
Preparação inicial de Tc4
Urina
Soro
25 20 15 10 5
Capítulo 2
99
8 ml de uma solução de [99mTcO4]-. Esta mistura é agitada vigorosamente durante
algum tempo, após o que permanece em repouso durante aproximadamente 10 min, à
temperatura ambiente.
A pureza radioquímica da preparação 99mTc-MDP foi controlada por ITLC-SG
(cromatografia instantânea de camada fina, em sílica-gel), como referido na secção 4.3
[28]. Os radiocromatogramas obtidos após eluição em acetona ou em NaCl 0,9 %
mostraram um único pico correspondente ao complexo 99mTc-MDP com Rf = 0 e 1,
respectivamente (figura 2.27).
Figura 2.27 - Radiocromatograma de 99mTc-MDP em (A) acetona e (B) NaCl 0,9 %.
Esta análise permitiu concluir que não existia [99mTcO4]- (Rf = 1 em acetona e
NaCl 0,9 %), nem quaisquer espécies coloidais (Rf = 0 em acetona e NaCl 0,9 %).
De modo semelhante ao que foi descrito para os complexos Tc5 e Tc6, na
secção 2.3.4.1.1, foram também realizados estudos de ligação à HA para o 99mTc-MDP.
Os resultados obtidos mostram-se na figura 2.28, juntamente com os obtidos para os
complexos Tc5 e Tc6.
Figura 2.28 - Percentagem de ligação de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP à HA. A) 1h, 37 °C e B) 20 mg
HA, 37 °C (n = 3).
HA [mg] Tempo [h]
99mTc-MDP Tc5 Tc6
Ad
sorç
ão [
%]
Ad
sorç
ão [
%]
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
100
Da análise dos resultados apresentados na figura 2.28, conclui-se que a cinética
de ligação à HA é rápida para o 99mTc-MDP, uma vez que o valor máximo de ligação,
(ca. 95 %) foi atingido quase instantaneamente. A cinética de ligação à HA dos
complexos Tc5 e Tc6 é também bastante rápida, mas o valor máximo atingido é um
pouco mais baixo (80 %) do que o encontrado para o 99mTc-MDP nas mesmas
condições.
O 99mTc-MDP foi avaliada in vivo em ratinho CD-1 e Balb-c e na figura 2.29 esses
resultados são apresentados sob a forma de histograma, juntamente com os
resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) obtidos para Tc5, Tc6, já descritos na
secção 2.3.4.2.2..
Capítulo 2
101
0
4
8
12
16
20
24
1 4 1 4 1 4
0
2
4
6
8
10
12
14
16
1 4 1 4 1 4
Sangue Músculo Intestino Rim Fígado OssoA)
B)
Figura 2.29 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) de Tc5 - Tc6 e 99mTc-MDP, em ratinhos CD-1 (A) e
Balb-C (B).
Da análise dos dados apresentados na figura 2.29, concluímos que em ratinho
CD-1 o complexo 99mTc-MDP é o que apresenta maior acumulação no osso às 4h p.i.
(12,7 ± 1,4 % A.I/g), sendo a fixação óssea à 1 h p.i. comparável ao Tc6 [Tc6 (12,7 ±
0,9% A.I./g) e 99mTc-MDP (12,7 ± 2,7 % A.I./g)]. O valor de acumulação no osso do
% A
.I./
g ó
rgão
Tempo [h]
Tc6 Tc5 99mTc-MDP
Tempo [h]
% A
.I./
g ó
rgão
Tc5 Tc6 99mTc-MDP
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
102
0
20
40
60
80
100
1 h 4 h 1 h 4 h 1h 4h
Osso/Músculo
Osso/Sangue
complexo Tc5, 1h e 4 h p.i., manteve-se praticamente constante e inferior
relativamente aos complexos Tc6 e 99mTc-MDP.
Em ratinho Balb-c, a acumulação no osso dos complexos Tc5 (18,3 ± 0,6 %
A.I./g), Tc6 (17,3 ± 1,4 % A.I./g) e 99mTc-MDP (17,1 ± 2,4 % A.I./g) é comparável.
Na figura 2.30 apresentam-se as razões osso/sangue e osso/músculo, para os
complexos Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP, em ratinhos CD-1 e Balb-c.
A)
B)
Figura 2.30 - Razões de actividade no órgão alvo (osso) vs órgão não alvo para Tc5, Tc6 e 99mTc-
MDP: A) ratinhos CD-1; B) Balb-c.
De um modo geral, para ambas as estirpes, e para todos os complexos observa-
se um aumento dessas razões em função do tempo.
0
20
40
60
80
100
1 h 4 h 1 h 4 h 1h 4h
Osso/Músculo
Osso/Sangue
Tc5
Raz
ão
oss
o/ó
rgão
não
alv
o
Tempo [min] 99mTc-MDP Tc6
Tempo [min] Tc5 99mTc-MDP Tc6
Raz
ão
oss
o/ó
rgão
não
alv
o
Capítulo 2
103
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 50 100 150 200 250 300
Tc5Tc699mT
Em ratinho CD-1 a razão osso/músculo foi, em geral, comparável para os três
complexos, sendo ligeiramente superior para Tc5 4h p.i. [Tc5 (56,3 ± 10,5), Tc6 (46,6 ±
3,5) e 99mTc-MDP (45,6 ± 8,6)].
Em Balb-c, as razões osso/músculo e osso/ sangue encontradas para Tc5 e Tc6
são comparáveis e as diferenças mais relevantes, relativamente ao 99mTc-MDP,
observaram-se para a razão osso/músculo, 4 h p.i. [Tc5 (77,0 ± 4,2); Tc6 (79,0 ± 2,9) e
99mTc-MDP (47,9 ± 13,6)].
Relativamente à excreção total em ratinhos CD-1, os valores determinados para
os três complexos são próximos como se pode verificar através da figura 2.31.
Figura 2.31 - Excreção total (% A.I.) de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP, em ratinho CD-1 (n = 4).
A excreção total observada após injecção de Tc5 e Tc6 (Tc5: 66,8 ± 7,6 % A.I.;
77,2 ± 0,5% A.I. e Tc6: 65,6 ± 1,2 % A.I.; 74,1 ± 0,9 % A.I., 1 h e 4 h p.i.,
respectivamente), nos ratinhos Balb-c, foi significativamente mais elevada do que a
observada após injecção do 99mTc-MDP (49,0 ± 6,1 % A.I.; 56,8 ± 0,9 % A.I., 1 h e 4 h
p.i., respectivamente) (figura 2.32).
Tempo [min]
Tc6 Tc5
99mTc-MDP
% A
ctiv
idad
e in
ject
ada
Compostos Contendo um Grupo Bisfosfonato
104
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 50 100 150 200 250 300
Tc5Tc699mTc
Figura 2.32 - Excreção total (% A.I.) de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP, em ratinho Balb-c (n = 4).
Para confirmar o potencial de Tc5 e Tc6 como radiofármacos de imagem óssea,
injectaram-se ratos Sprague Dawley, com estes complexos e com 99mTc-MDP e
registaram-se imagens 2h após a injecção dos complexos (figura 2.33).
Figura 2.33 - Imagem de corpo inteiro de rato Sprague Dawley, 2 h após injecção de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP, obtidas em câmara γ.
Os resultados obtidos foram concordantes com os valores de biodistribuição. As
imagens eram elucidativas e mostraram uma elevada fixação óssea, especialmente nas
articulações, zona de maior remodelação. As imagens obtidas com os três complexos
eram semelhantes e a sua qualidade era boa, pois a fixação em órgãos não alvo era
muito baixa e a excreção total de Tc5 e Tc6 elevada. Com estes estudos pré-clínicos
confirmámos o interesse de Tc5 e Tc6 como radiofármacos para obtenção de
cintigrafias ósseas.
Tc6 Tc5
Tempo [min]
% A
ctiv
idad
e in
ject
ada
Tc6 Tc5
99mTc-MDP
Capitulo 2
105
2.4 COMPOSTOS MULTIFUNCIONAIS OSTEOTRÓPICOS PARA APLICAÇÃO
TERAPÊUTICA: ESTRATÉGIAS DE DERIVATIZAÇÃO DE BISFOSFONATOS
2.4.1 Considerações Gerais
De acordo com o que foi referido no capítulo introdutório, os BFs têm sido
utilizados não só como fármacos para terapia mas também têm sido considerados
úteis como veículo de transporte para o osso de moléculas citotóxicas e de radiação γ
ou partículas β (e.g. 188Re-HEDP). Este conceito aplicado através da ligação de unidades
BF a diferentes tipos de fármacos e a radionuclídeos tem sido referido em vários
artigos de revisão [12, 26, 27, 137-142]. Esta aproximação tem como principal
vantagem promover uma elevada concentração local de fármaco ou de radionuclídeo,
minimizando os efeitos adversos em tecidos não alvo e podendo por vezes minimizar
problemas de resistência aos fármacos, observados após longos períodos de
tratamento.
Na tabela 2.15 encontram-se exemplos de moléculas com acção terapêutica
ligadas a um BF, avaliadas para o tratamento específico de diversas patologias osteo-
articulares. As patologias consideradas foram a osteoporose, por conjugação à
prostaglandina E2 ou ao estradiol, a osteoartrite conjugando o diclofnac [143-146], a
infecção crónica conjugando a fluoroquinolona [147] e o tumor ósseo por conjugação à
gemcitabina [148-150] ou ao 5-fluoruraracilo [151]. De um modo geral confirmou-se
que todos os compostos conjugados possuíam um carácter osteotrópico, atribuído à
presença da unidade BF. À excepção do conjugado 5-fluorouracilo demonstrou-se
também que a actividade biológica continuava a observar-se após a conjugação ao BF.
No caso do derivado Fluoroquinolona/BF demonstrou-se que o ligeiro decréscimo da
actividade bactericida era compensado pela sua capacidade para ligação ao osso.
O sucesso deste conceito poderia ser previsível, uma vez que o efeito sinérgico
resultante da combinação de BFs e vários fármacos, utilizando protocolos terapêuticos
onde estes são administrados alternadamente já é bem conhecido [152].
Compostos Multifuncionais Osteotrópicos para Aplicação Terapêutica: Estratégias de Derivatização de Bisfosfonatos
106
O sinergismo entre o tratamento com BFs e radioterapia externa, quando
utilizados alternadamente, foi igualmente confirmado [109]. No caso de pacientes com
metástases ósseas múltiplas, resistentes ao tratamento convencional, foi também
reconhecida a vantagem da utilização BFs e radioterapia sistémica, por exemplo
através de protocolos terapêuticos utilizando alternadamente o pamidronato e o
188Re-HEDP ou o zolendronato com o estrôncio-89 [153-155].
Assim, seria de esperar que os complexos [188Re]-gemcitabina/BF [149] e
[188Re]-5-Fluoruracilo/BP [151] tivessem capacidades terapêuticas acrescidas devido à
Tabela 2.15 – Fármacos conjugados a uma unidade bisfosfonato e correspondente indicação terapêutica.
Fármaco/Bisfosfonato (BF) Indicação
Prostaglandina E2/BF Estradiol/BF
Osteoporose
Diclofnac/BF
Anti-Inflamatório Não Esteróide
Osteoartrite
Fluoroquinolonas/BF
Infecção Crónica
Gemcitabine/BF 5-Fluoruracil/BF
Tumor Ósseo
Capítulo 2
107
emissão de radiação β, com capacidade de destruir células cancerígenas. No entanto,
não existe na literatura qualquer referência relativamente à eficácia terapêutica destes
complexos. Os complexos [188Re]-gemcitabina/BF e [188Re]-5-Fluoruracilo/BP não
foram caracterizados estruturalmente, pois muito provavelmente é a unidade BF que
se coordena ao metal. Como já foi referido, a estabilização do metal 188Re por grupos
BF (e.g. 188Re-HEDP) não proporciona complexos com uma estrutura bem definida.
Nesta aproximação a dupla função do BF de coordenação ao metal e ligação ao Ca2+ da
HA vai certamente comprometer a ligação ao osso.
Nunca foi sintetizado um composto com uma estrutura bem definida, contendo
um grupo bisfosfonato, uma molécula citotóxica e um elemento radioactivo emissor
de radiação ionizante (β). O trabalho proposto nesta tese visava também preparar e
avaliar compostos deste tipo. Devido às limitações de tempo e às dificuldades de
síntese química encontradas, só parcialmente avançámos neste domínio. De qualquer
modo, nesta secção descrevemos os avanços conseguidos e que obviamente tiveram
como base os resultados obtidos nas secções anteriores.
Para a síntese do composto trifuncional considerou-se o docetaxel cujas
propriedades citotóxicas são conhecidas e utilizadas na clínica. O docetaxel é um dos
fármacos anticancerígenos mais potentes utilizado para o tratamento de tumores,
especialmente para pacientes com metástases ósseas provocadas pelo cancro da
mama, ovários, pulmões, cabeça e pescoço [156]. A estrutura química do docetaxel é
semelhante à do fármaco anticancerígeno placlitaxel (figura 2.34), sendo o docetaxcel
é mais potente como citostático [157].
Figura 2.34 - Estrutura química do docetaxel (taxotere) e do paclitaxel (taxol).
Compostos Multifuncionais Osteotrópicos para Aplicação Terapêutica: Estratégias de Derivatização de Bisfosfonatos
108
O modo de acção destes fármacos baseia-se principalmente na formação de um
heterodímero de α - e β - tubulina [158]. Na figura 2.35 (A) apresenta-se a estrutura
desse heterodímero com a molécula de placlitaxel, determinada por cristalografia de
raios-X.
Figura 2.35 - (A) Estrutura de raios-X do heterodímero de tubulina com um molécula de placlitaxel; (B) interacções determinadas por modelação molecular entre resíduos da unidade β-tubulina do cérebro (B-brain) e uma molécula de placlitaxel ou docetaxel [159-161].
Através da figura 2.35 (B) podem visualizar-se interacções identificadas, com
base em estudos de modelação molecular, entre resíduos da unidade β-tubulina e uma
molécula de placlitaxel ou docetaxel. Algumas regiões activas das moléculas citotóxicas
estão identificadas nessa figura como, por exemplo, a 3’-benzamidofenil (a) do
placlitaxel, 3’-fenil (b), e o anel 2-benzoil fenil (c) que apresentaram interacções
hidrofóbicas com as hélices H1 e H7 (roxo), as folhas β B8 e B10 (amarelo) e loop entre
as hélices H6 e H7 (azul claro).
A formação deste heterodímero leva à estabilização de microtúbulos
impedindo a sua desagregação. A inibição da desagregação dos microtúbulos impede o
processo de divisão celular (actividade anti-mitótica) e consequentemente, a
(Os resíduos a preto pertencem à molécula de placlitaxel sobreposta à molécula de docetaxel, a verde).
A) B)
Capítulo 2
109
multiplicação das células tumorais. Além disso, este mecanismo leva à acumulação de
microtúbulos na célula promovendo a apoptose celular [162].
Esta acção citostática dos taxanos, por estabilização dos microtúbulos, é o
principal mecanismo de acção destes fármacos. No entanto, existem na literatura
estudos in vitro indicativos da sua acção como inibidor da reabsorção óssea [163]. O
efeito sinérgico resultante da administração, em separado, de um BFs e do docetaxel
também já foi demonstrado [164].
2.4.2 Síntese e Caracterização de Compostos Trifuncionais Contendo
Grupos Bisfosfonato
Nas primeiras sínteses realizadas com a finalidade de sintetizar compostos
trifuncionais utilizou-se o ácido glutâmico uma vez que este aminoácido possui dois
grupos carboxilato (α-COOH e γ-COOH) e uma função amina (α-NH2) através das quais
poderia ser feita a sua funcionalização. Esse objectivo poderia ser conseguido por
conversão da função α-COOH ou γ-COOH em BF e conjugação da unidade quelante e
da molécula citotóxica através das restantes posições (estratégia I e II, figura 2.36).
Alternativamente, a funcionalização do ácido glutâmico poderia ser feita por
conjugação dos três constituintes: unidade quelante, aminobisfosfonato e molécula
citotóxica (docetaxel) (estratégias II - V, figura 2.36).
Compostos Multifuncionais Osteotrópicos para Aplicação Terapêutica: Estratégias de Derivatização de Bisfosfonatos
110
Figura 2.36 - Estratégias para a síntese de ligandos trifuncionais a partir do ácido glutâmico. DTX = docetaxel; ALN =alendronato; BF = bisfosfonato.
i), ii), iii) - ordem de conjugação e/ou conversão de carboxilato em BF
i) α – COOH � conversão em BF
ii/iii) α – NH2 � pz-COOH
ii/iii) γ – COOH �DTX
O
NH
O
O
O
O
O
HN O
HO
OHO
O
OH
O
O
OO
NH
NNH2
NN
O
P
POH
O
O
OHOH
HO OH
i) α – NH2 � pz-COOH
ii) α – COOH�Conjugação
com BF
iii) γ – COOH � DTX
ii) α – COOH�Conversão
em BF
iii) γ – COOH � DTX
i) α – COOH � ALN
ii) γ – COOH � pz-NH2
iii) α – NH2 � DTX
O
NH
O
O
O
O
O
HN O
O
HN
P
POH
O
O
OHOH
OHOH
HO
OHO
O
OH
O
O
OO
NH
NNH2
NN
O
i) α – COOH � ALN
ii) α – NH2 � DTX
iii) γ –COOH� pz-NH2
i) α – COOH � ALN
ii) α – NH2 � pz-COOH
iii) γ – COOH � DTX
HN
O
O
NNH2
NN
O
HN
O O
O
O
HO
O
OH
O
OH
O
O
OO
O
NH
P
PHO
O
O
OHHO
HOHO
I
V
IV
III
II
Capítulo 2
111
Na figura 2.37 mostram-se as estruturas moleculares dos compostos utilizados
nas vias de síntese.
Figura 2.37 - Unidades para a funcionalização do ácido glutâmico.
De acordo com a estratégia I (figura 2.36), o ligando trifuncional seria
sintetizado por transformação da função α-COOH do ácido glutâmico em BF, seguido
da conjugação do composto pz-COOH à função α-NH2 e conjugação do DTX à função γ-
COOH.
A função α-COOH do ácido glutâmico foi convertida em ácido bisfosfónico,
conforme indicado no esquema 2.10, utilizando um procedimento descrito na
literatura [165-167].
Esquema 2.10 - Síntese do ácido 4-amino-5-hidroxi-5,5-difosfonopentanoico (18).
i) N-(etoxicarbonil)ftalimida, K2CO3, acetonitrilo, refluxo, noite; ii) SOCl2, t.a., noite
iii) P(OEt)3, tolueno,1h, 0 °C;
iv) HP(O)(OEt)2, trietilamina, tolueno, 1h, 0 °C; v) 1. HCl 6N, refluxo, noite.
Compostos Multifuncionais Osteotrópicos para Aplicação Terapêutica: Estratégias de Derivatização de Bisfosfonatos
112
Resumidamente, no primeiro passo protegeu-se a função amina com um grupo
ftalimida através da reacção do precursor 12 com a N-(etoxicarbonil)ftalimida, na
presença de K2CO3, em acetonitrilo e em refluxo, durante uma noite [168]. A activação
do ácido carboxílico do composto 13 com SOCl2, decorreu em diclorometano e em
refluxo, durante uma noite. O bisfosfonato (16) foi obtido através das reacções de
condensação de tri- e dietilfosfito com os compostos 14 e 15, respectivamente. Todos
os compostos foram purificados e caracterizados de acordo com os procedimentos
descritos na literatura, com algumas modificações no caso do composto 16. Após a
purificação do resíduo que continha o bisfosfonato 16, por cromatografia em coluna
de sílica gel, com gradiente de 0 - 3 % metanol/clorofórmio, ainda se observa a
presença do composto 17 resultante do rearranjo do grupo bisfosfonato em fosfato-
fosfonato (esquema 2.10).
A ocorrência deste rearranjo já tinha sido observada por vários autores [165,
169] que concluíram que este seria promovido preferencialmente, na presença de
bases (alquilaminas) e/ou com temperaturas elevadas (> 80 °C). O solvente utilizado
nas reacções também foi considerado importante, não sendo adequados, por
exemplo, o éter etílico e o diclorometano. No nosso caso, o rearranjo ocorreu mesmo
na presença de tolueno e à temperatura ambiente na presença de trietilamina.
O composto 16 foi isolado puro, com um rendimento total de 28 %, após
cromatografia por RP-HPLC em coluna semi-preparativa, utilizando um sistema
isocrático, 55 % A; 45 % B; A - solução aquosa com 0,1% de ácido fórmico; B - solução
de 0,1 % de ácido fórmico em acetonitrilo.
Os compostos 16 e 17 foram identificados por RMN, sendo as diferenças mais
relevantes observadas nos respectivos espectros de 31P (figura 2.38).
Capítulo 2
113
0.05.010.015.0
Figura 2.38 - Espectros de RMN de 31P em CDCl3, dos compostos 16 e 17.
No espectro de RMN de 31P do composto 17 observou-se um par de dobletos a
ca. δ -1 (fosfato) e ca. δ 17 (fosfonato) ppm, com constante de acoplamento de 16,0
Hz. Enquanto o bisfosfonato 16 apresentava um par de dobletos a 17 ppm, com
constante de acoplamento 14,4 Hz.
Após várias tentativas para remover os grupos protectores do composto 16,
não foi possível isolar o composto final 18 numa forma pura. Um dos procedimentos
utilizados foi a hidrólise com HCl 6N, em refluxo durante a noite, conforme descrito
por Mizrahi et. al. [165]. No entanto, o composto pretendido 18 foi obtido como
15,0 10,0 5,0 0,0 ppm
31P-RMN
(CDCl3)
31P-RMN
(CDCl3)
17
,3
17
,2
-0,8
-1,0
17
,5
17
,4
17
,0
16
,9
Compostos Multifuncionais Osteotróp
114
composto minoritário, tend
compostos 19 e 20 (figura 2.
Figura 2.39 - ESI-MS (-) dos com
Também tentámos
com NaBH4, seguida do tra
bisfosfónico por reacção co
em ambos os casos não foi p
Uma vez que a síntes
sucedida, optou-se por sint
(figura 2.36). De acordo co
por conjugação do compos
seguida da conjugação ou co
função γ-COOH.
212,0 [M - H]-
220 0,0
Intens. x105
2,0
1,5
1,0
0,5
2,5
trópicos para Aplicação Terapêutica: Estratégias de Derivatizaç
endo sido identificado apenas por ESI-MS, junta
ra 2.39).
compostos 18, 19 e 20.
os a desprotecção selectiva do grupo amina atra
tratamento com ácido acético [170], e a hid
o com Me3SiBr, seguido do tratamento com M
foi possível obter os produtos pretendidos.
íntese do bisfosfonato a partir do ácido glutâmic
sintetizar o composto trifuncional adoptando
com esta estratégia, o ligando trifuncional se
posto pz(Boc)-COOH (7) à função α-NH2 do ác
u conversão em BF da função α-COOH e conjug
[M -
[M - H]-
273,9
280 260 240
tização de Bisfosfonatos
untamente com os
através da reacção
hidrólise do éster
MeOH [20], mas
âmico não foi bem
ndo a estratégia II
al seria sintetizado
o ácido glutâmico,
njugação do DTX à
- H]-
291,9
m/z
Capítulo 2
115
Assim, começámos pela conjugação do ácido glutâmico ao composto pirazolo-
diamina 7, conforme indicado no esquema 2.11.
Esquema 2.11 - Síntese do intermediário 21 e tentativas de síntese dos compostos a - d.
i) NHS/DCC, diclorometano, 18 h; ii) ácido glutâmico(OBz), NEt3, DMF/H2O, 18 h; iii) 1. TFF/DCC, acetonitrilo, noite; 2. PAM, NEt3, acetonitrilo/tampão borato pH 9,4 (0,1 M), 18 h; iv) Me-PAM, HBTU, N-metilmorfolina, DMF, 18 h;
v) 1. SOCl2, t.a., 18 h; 2. P(OEt)3, tolueno, 30 min, 0 °C; 3. HP(O)(OEt)2, NEt3, tolueno, 30 min, 0 °C; vi) 1. SOCl2, tolueno, t.a., ; 2. P(OSiMe3)3; 3. metanol, t.a. 1 h.
O composto 9 foi sintetizado de acordo com o procedimento descrito
anteriormente na secção 2.3.1 (esquema 2.6). A reacção de conjugação do ácido
glutâmico com o éster activado (9) foi realizada utilizando uma mistura de
dimetilformamida (DMF) e água, na presença de trietilamina (NEt3), durante
aproximadamente 18 h. No final filtrou-se a mistura reaccional para remover uma
parte do ácido glutâmico que não reagiu e que se encontrava em suspensão. O
solvente do filtrado foi removido por evaporação e o resíduo foi purificado por
cromatografia em coluna de sílica gel, com um gradiente de 15 - 40 % de metanol em
Compostos Multifuncionais Osteotrópicos para Aplicação Terapêutica: Estratégias de Derivatização de Bisfosfonatos
116
diclorometano. O composto 21 foi obtido sob a forma de um óleo, com um
rendimento global de 75 %.
A reacção de conjugação deste intermediário com o pamidronato (PAM) foi
testada utilizando condições experimentais semelhantes às que foram descritas na
secção 2.3 para o mesmo BF. No entanto, nunca foi possível obter o composto
pretendido, uma vez que ao fim de algum tempo de reacção o PAM precipitava. Para
resolver este problema de solubilidade experimentou-se a conjugação com o éster
bisfosfónico Me-PAM que, de acordo com a literatura [104], permitia a obtenção de
melhores resultados. O Me-PAM foi sintetizado como indicado no esquema 2.12 [171,
172].
Esquema 2.12 - Síntese do Me-PAM.
i) HCl 6N, 15 min, t.a.;
ii) SOCl2, tolueno, 50 °C, 24 h; iii) 1. P(OMe)3, tolueno, 30 min, 0 °C; 2. HP(O)(OMe)2, tolueno, 30 min, 0 °C.
Começámos por protonar a função amina da β-alanina através do tratamento
com HCl 6N, à temperatura ambiente, durante 15 min. O excesso de ácido foi
removido por evaporação, repetindo-se o procedimento de dissolução em tolueno e
evaporação do solvente três vezes. A activação do ácido carboxílico com SOCl2
decorreu com aquecimento a 50 °C, durante 24 h e em tolueno seco. O bisfosfonato
Me-PAM foi obtido após a adição de tri- e dimetilfosfito, a baixa temperatura,
utilizando uma quantidade mínima de tolueno como solvente. O produto foi purificado
por cromatografia em coluna de sílica gel utilizando como eluente uma mistura de
acetato de etilo: n-butanol: i-propanol: H2O: ácido acético a) 4:1:1:1:0,3 e b)
N+H
H P
PO
OH
O
OMeOMe
OMeOMe
-Alanina
22 23
Me - PAM
Cl-H
H2N
O
OH
N+ O
OH
Cl-H
H
H N+ O
Cl
Cl-H
H
H
i)
ii) iii)
Capítulo 2
117
4:1,1:0,9:2:1,1. O Me-PAM foi obtido na forma de um óleo com um rendimento de 40
%.
A reacção de conjugação do Me-PAM ao composto 21 foi realizada com HBTU e
N-metilmorfolina em DMF, durante aproximadamente 18 h. Nesta reacção não se
verificou a precipitação de nenhum dos reagentes, mas não foi possível obter o
composto desejado, pois ocorreu o rearranjo fosfato-fosfonato, semelhante ao que se
observou com o composto 16 (esquema 2.10).
Como se indica no esquema 2.11, foram também realizadas tentativas de
conversão do grupo ácido carboxílico do composto 21, em éster bisfosfónico
(composto c) [165] ou em ácido (composto d) [169], conforme descrito na literatura,
mas também não foi possível obter os compostos pretendidos (esquema 2.11).
Após a reacção de síntese do ácido c (esquema 2.11), verificou-se que o grupo
Boc foi removido, muito provavelmente, por não ser resistente às condições acídicas
da activação com cloreto de tionilo. Além disso, a condensação sucessiva de di- e
trietilfosfito levava à obtenção do composto fosfato-fosfonato, que se identificava por
análise de RMN de 31P.
Para a obtenção do ácido bisfosfónico d (esquema 2.11), tentou-se evitar a
remoção do grupo Boc na reacção de activação do carboxilato por adição cloreto de
tionilo previamente destilado e tolueno como solvente. Após a condensação do cloreto
de acilo com dois equivalentes de tris(trimetilsilil)fosfito [P(OSiMe3)3] e sucessiva
hidrólise com metanol (esquema 2.13) observou-se novamente a ausência do grupo
Boc e no espectro de RMN de 31P observavam-se várias espécies de fósforo.
Esquema 2.13 - Tentativa de síntese do composto d.
Compostos Multifuncionais Osteotrópicos para Aplicação Terapêutica: Estratégias de Derivatização de Bisfosfonatos
118
Outra tentativa de síntese do ligando trifuncional foi através da estratégia III
(figura 2.36). De acordo com esta via de síntese a função α-COOH do ácido glutâmico
dever-se-ia ligar a um BF, seguindo-se a conjugação do composto pz(Boc)-NH2 à função
γ-COOH e conjugação do DTX à função α-NH2 (esquema 2.14).
Esquema 2.14 - Síntese do composto L7.
i) 1. TFF/DCC, diclorometano, 18 h; 2. ALN, NEt3, acetonitrilo/tampão borato pH 9,4 (0,1 M), 2 d; ii) NaOH (aq), pH 12, t.a., 30 min; iii) HOBt/HBTU, N-metilmorfolina, DMF/H2O, 5 d; iv) TFA, t.a., 2 h.
Deste modo, começámos por sintetizar o composto intermediário 24 activando
previamente o α-COOH no ácido glutâmico OBz-Glu-Boc utilizando DCC e TFF, em
diclorometano seco durante 18 h. A reacção de conjugação com o alendronato (ALN)
foi realizada numa mistura de acetonitrilo e tampão borato pH 9,4 (0,1 M), na
presença de trietilamina durante 2 dias. Depois de evaporado o solvente da mistura
reaccional, o produto foi extraído com água e o solvente do sobrenadante foi
removido na linha de vazio. O resíduo foi lavado com clorofórmio e o composto 24 foi
obtido, após a purificação numa coluna Sep-Pak C18, com um rendimento de 64 %.
Capítulo 2
119
O grupo benzilo do composto 24 foi removido após a dissolução deste
composto em água, adição de NaOH 1N, até pH ca. 12 e agitação à temperatura
ambiente durante 30 min. O composto 25 foi obtido puro, com um rendimento
quantitativo, após purificação por Sep-Pak C18 para a remoção de sais.
O composto intermediário 27 foi sintetizado por conjugação do precursor
pz(Boc)-NH2 (26) à função γ-COOH no composto 25. O precursor 26 foi sintetizado
conforme descrito na literatura [114] e a reacção de conjugação utilizando HOBt/HBTU
e N-metilmorfolina em DMF/H2O decorreu à temperatura ambiente durante 5 dias.
Após evaporação do solvente da mistura reaccional o produto foi extraído com água. O
volume de água foi concentrado e foi purificado por Sep-Pak C18, pré-condicionada
com metanol e água. Após lavagem com água e extracção com 50 % de metanol/água
o produto foi obtido, juntamente com algum produto de partida (26). O solvente foi
evaporado e o resíduo foi aplicado numa coluna HLB C18, pré-condicionada e eluída
com água. O composto 27 foi obtido com rendimento de 23 %.
O composto L7 foi obtido com rendimento quantitativo, após hidrólise dos
grupos BOC das funções amina por reacção com ácido trifluoruacético e agitação à
temperatura ambiente durante 2 h.
Apesar de não ser o composto trifuncional pretendido, o composto L7 foi
utilizado para a síntese do respectivo complexo organometálico de 99mTc(I), com a
finalidade de avaliar a sua capacidade para a estabilização do fragmento fac-
[99mTc(CO)3]+, o seu perfil farmacocinético in vivo, e principalmente a sua afinidade
para o osso (secção 2.4.3).
Uma vez que a estratégia III da figura 2.36, foi bem sucedida, permitindo a
síntese dos compostos 27 e L7, reestruturou-se esta estratégia de modo a obter o
composto 27 com o grupo protector Fmoc na amina primária da unidade quelante,
que seria ortogonal do grupo Boc que existe na estrutura do docetaxel. Segundo a
estratégia IV (figura 2.36) sugerida, a função α-COOH do ácido glutâmico conjuga-se a
um BF, seguindo-se a ligação do DTX através da função α-NH2 e conjugação do
composto pz(Fmoc)-NH2 à função γ-COOH (esquema 2.15).
Compostos Multifuncionais Osteotrópicos para Aplicação Terapêutica: Estratégias de Derivatização de Bisfosfonatos
120
Esquema 2.15 - Síntese do intermediário 31 e estratégias para a síntese dos compostos f - g que não foram testadas.
i) TFA, t.a., 2 h; ii) Anidrido succinico, 4-(dimetilamino)piridina, piridina seca, t.a., 24 h; iii) NHS-sulfo, EDC, DMSO:DMF (7:3), t.a., 24 h; iv) DMSO:DMF: tampão fosfato 7,4; t.a., 18 h; v) HBTU/HOBt, DMF/H2O, NMM;
vi) 20 % piperidina, DMF, t.a..
Esta via de síntese iniciou-se com a hidrólise do grupo Boc da função amina do
composto 24, por reacção com ácido trifluoroacético. A neutralização da mistura
reaccional foi efectuada tendo em atenção a elevada sensibilidade do grupo benzilo
que é facilmente removido em meio alcalino, à temperatura ambiente. Por isso, essa
neutralização foi realizada a frio (0 °C) e agitação vigorosa da mistura reaccional, com a
adição de uma solução aquosa de NaOH 1N, e a purificação em Sep-Pak para remoção
de sais, levando à obtenção do composto 28 com um rendimento de 96 %. O
A O
N NHFmocNN
NH2
O
NH
O
NO
O
O
P OH
POH
O OH
OHOH
OH
24
i)
O
NH2
O
NO
P OH
POH
O OH
OHOH
OH
28
iv)
HO
HN
O O
O
O
Docetaxel (DTX)
O
HN
O O
O
OO
HO
O
AO
HN
O O
O
OO
OO
NO
SO3H
AO
HN
OO
O
OO
HNO
O
O
O
A
29 (2'-succinil-DTX) 30 (2'-sulfo-succinil-DTX)31 (ALN-Glu-succinil-DTX)
f
ii)
iii)
v)
vi)
e
HO
OOH
O
OH
O
O
OO
3' 2'
13
10
2
7
NH
P
POH
O
O
OHOH
OHOH
A
O
NH
O
O
O
O
O
HN O
NH
O O
HN
P
POH
O
O
OHOH
OHOH
NNHFmoc
N
N
g
A
O
NH
O
O
O
O
O
HN O
NH
O O
HN
P
POH
O
O
OHOH
OHOH
NNH2
N
N
Capítulo 2
121
intermediário 2’-succinil-DTX (29) foi sintetizado através da reacção do docetaxel com
anidrido succínico, na presença de DMAP [4-(dimetilamino)piridina] e piridina seca,
durante 24 h à temperatura ambiente [173]. Após a adição de acetato de etilo e de
uma solução de H2SO4 0,01 % (m/v) e agitação durante 30 min, a fracção orgânica foi
separada e lavada com H2SO4 0,01 % (m/v) e água. O composto 29 foi obtido, com um
rendimento de 42 %, após purificação por cromatografia de sílica gel, com um
gradiente de 50 - 100 % de acetato de etilo/n-hexano. A activação do ácido carboxílico
após reacção com NHS-sulfo (N-hidroxi-3-sulfo-succinimida) e EDC (1-etil-3-(3’-
dimetilamino)carbodiimida clorohidratada) em DMSO:DMF (70:30) foi seguida por TLC
(30: Rf = 0,52 em clorofórmio:metanol, 80:20). A conjugação através da função α-NH2
de 28 foi realizada numa mistura de DMSO, DMF e tampão fosfato pH 7,4, à
temperatura ambiente, durante 18 h [173]. O composto ALN-Glu-succinil-DTX (31) foi
identificado por ESI-MS, juntamente com algum DTX ([M - H]- 806,6) e outros produtos
secundários (29: [M-H]- 906,5) (figura 2.40).
Figura 2.40 - Espectro de massa no modo negativo do composto 31 (impuro), obtido com
ionização por electrospray.
O espectro de ESI-MS, em modo negativo, mostra a presença de dois picos
devidos ao composto ALN-Glu-succinil-DTX (31): [M-H]-, a m/z = 1356,7 e [M - 2H]2-, a
m/z
(29) [M - H]
- 906,5
(31) [M - H]
- 1356,7
(Docetaxel) [M - H]
- 806,6
(31) [M - 2H]
2- 677,9
(?) 1057,7
0
Intens. x105
4
2
1200 1000 800 600 1400
Compostos Multifuncionais Osteotrópicos para Aplicação Terapêutica: Estratégias de Derivatização de Bisfosfonatos
122
m/z = 677,9. As impurezas encontradas foram: o docetaxel a m/z 806,6 e o composto
29 [M - H]- a m/z 906,5.
O baixo rendimento de 31 e o número de passos envolvidos nesta estratégia,
fizeram-nos abandoná-la.
A estratégia V foi a última estratégia explorada para a síntese do ligando
trifuncional utilizando o ácido glutâmico. Nesta via de síntese, a função α-COOH do
ácido glutâmico conjuga-se ao alendronato, seguindo-se conjugação do composto
pz(Fmoc)-COOH à função α-NH2 e a ligação do DTX através da função γ-COOH
(esquema 2.16).
Esquema 2.16 - Síntese dos compostos 33 e 35 e estratégia para a síntese do composto j.
i) 1. TFF/DCC, diclorometano, 18 h; 2. ALN, NEt3, acetonitrilo/tampão borato pH 9,4 (0,1 M), 2 d; ii) 20 % piperidina, DMF, t.a., 30 min; iii) TFA, t.a., 2 h. iv) 9-fluorenilmetilcloroformato, Na2CO3, THF/H2O, 24 h; v) HBTU/HOBt, DMF/H2O, NMM; t.a., 24 h; vi) Docetaxel, DCC, 4-(dimetilamino)piridina, DMF, 24 h. vii) TFA, t.a..
Começámos por sintetizar o composto 32 por activação do carboxilato α-COOH
do precursor tBu-Glu-Fmoc, e conjugação sucessiva com o aminobisfosfonato (ALN),
N NH
FmocNN
COOH
O
NH
O
NO
P OH
POH
O OH
OHOH
OH
32
Fmoc
O
NH
O
OHO
Fmoc
tBu-Glu-Fmoc
O
NH2
O
NO
P OH
POH
O OH
OHOH
OH
33
N NH2NN
COOH
NNHBoc
NN
COOH
7 34 35
i) ii)
iii) iv) v)
NNHFmoc
N
N
h
HN
NH
O
O
P
P
OHOH
OHO
HO
OOH
O
O
na presença de trietilamina,
dias. A purificação da mistur
para o composto 24, permit
77 %. A reacção de hidrólise
de 20 % de piperidina em D
acético - 80:8:2) e após 3
evaporação do solvente e la
33 com um rendimento de 8
Na análise por RMN
espécies, que com base na
figura 2.41 encontra-se o es
Figura 2.41 - Espectro de RM
A pureza deste comp
(figura 2.42). Neste espectro
435,3 do composto 33 [m/z
3.504.00
f f
ina, em acetonitrilo e tampão borato pH 9,4 (0,1
istura reaccional foi realizada conforme descrito
rmitindo a obtenção do composto 32 com um
ólise do grupo Fmoc foi realizada na presença d
m DMF. Esta reacção foi seguida por TLC (CHCl
s 30 min à temperatura ambiente, estava co
e lavagem do resíduo com clorofórmio, obteve
de 85 %.
MN de 1H do composto 33 foi observada a exis
na estrutura do composto assumimos serem
o espectro de RMN de 33.
e RMN de 1H do composto 33 em D2O.
omposto pôde ser confirmada por ESI-MS, em
ectro aparece um único pico correspondente a
m/z (calculado) = 435,1 para C13H29N2O10P2].
1.52.002.503.00
c/b
t-Bu
d, h
g g’
Capítulo 2
123
(0,1 M), durante 2
rito anteriormente
um rendimento de
ça de uma solução
HCl3:metanol:ácido
a completa. Após
eve-se o composto
existência de duas
em rotâmeros. Na
em modo positivo
a [M + H]+ a m/z
1.50 ppm
c/b
Bu
t-Bu
Compostos Multifuncionais Osteotrópicos para Aplicação Terapêutica: Estratégias de Derivatização de Bisfosfonatos
124
Figura 2.42 - ESI-MS (+) do composto 33.
Este comportamento não foi observado para nenhum dos compostos ácido
glutâmico/alendronato (32, 24 e 25), porque provavelmente a presença de grupos
protectores (Boc ou Fmoc) impede a rotação em torno da ligação C-N do grupo amida.
A reacção de conjugação do composto 33 através da função α-NH2 com o
composto pz(Fmoc)-COOH (35) (esquema 2.16) foi efectuada utilizando HBTU, HOBt e
N-metilmorfolina, em DMF/H2O, à temperatura ambiente durante 24 h. A tentativa de
purificação por Sep-Pak não permitiu garantir com certeza a formação do composto
conjugado pretendido.
Como alternativa estudámos esta reacção em micro-ondas, e testámos um
conjunto de condições reaccionais, nomeadamente a composição do solvente,
temperatura, potência e tempo de reacção. No entanto, também não foi possível
obter o produto h (esquema 2.16) pois este não se formou em quantidade suficiente
para a sua caracterização.
Foi ainda efectuada uma última experiência utilizando o composto pirazolo-
diamina funcionalizado com um carboxilato na posição 4. A conjugação do
m/z
434,00 436,00 438,000,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
200 450 400 350 300 250
[M + H]+
435,3
Intens. x105
6
4
1
0
m/z
2
5
3
500 550 600 650
m/z mais abundante
calculado para C13H29N2O10P2
435,1
436,1 437,1
Capítulo 2
125
aminobisfosfonato ao composto pz4-COOH foi realizada conforme indicado no
esquema 2.20.
Esquema 2.17 - Síntese do composto 36.
i) 1. TFF/DCC, diclorometano, 18 h; 2. ALN, NEt3, DMF/tampão borato pH 9,4 (0,1 M), 2 d;
Começámos por sintetizar o precursor pz4-COOH conforme descrito na
literatura [174]. A activação do carboxilato de pz4-COOH foi realizada por reacção com
DCC e TFF, em diclorometano e à temperatura ambiente durante 24 h. A solução
sobrenadante foi separada da N,N’-diciclohexilureia que precipitou e o solvente
evaporado em vazio. O sólido obtido reagiu com o alendronato em
acetonitrilo/tampão borato pH 9,4 (0,1 M), na presença de trietilamina durante 4 dias.
A mistura reaccional foi seca em vazio e o sólido obtido foi purificado por Sep-Pak C18
levando à obtenção do composto 36 com um rendimento de 49 %. Por questões de
tempo não nos foi possível avançar com este composto, mas os resultados obtidos
indicam que esta estratégia parece viável para que possamos chegar a um dos
produtos finais desejados.
2.4.3 Síntese e caracterização do complexo Tc7
A capacidade de estabilização do fragmento fac-[99mTc(CO)3]+ utilizando o
ligando L7 foi avaliada e estudado o comportamento biológico do produto final.
A síntese do complexo Tc7 foi realizada conforme indicado no esquema 2.18
através da reacção do ligando L7 com o precursor fac - [99mTc(H2O)3(CO)3]+.
NHN
O
ON
O NH
P
P
OHO
O
OHOH
OHOH
N
O
OEt
36
N
pz4-COOH
HN
O
ON
O OH
N
O
OEt
i)
Compostos Multifuncionais Osteotrópicos para Aplicação Terapêutica: Estratégias de Derivatização de Bisfosfonatos
126
Esquema 2.18 - Síntese do complexo Tc7.
Esta reacção foi optimizada em termos da concentração de ligando,
temperatura e tempo de reacção. O complexo Tc7 foi obtido com um rendimento
superior a 92 %, utilizando uma concentração final de ligando de 1 x 10-4 M,
temperatura igual a 100 °C, meio salino durante 30 min. Após injecção no HPLC da
preparação obtida, imediatamente após o arrefecimento da mistura reaccional em
banho de gelo, obteve-se um pico (tR = 12,3 min) correspondente a ca. 92 % da
actividade injectada e aos 14 minutos observa-se uma espécie não identificada que
correspondia a ca. de 8 % de actividade injectada (figura 2.43).
Figura 2.43 - Cromatogramas de RP-HPLC do complexo Tc7 (detecção γ). *impureza.
Uma vez que o complexo análogo de Re não foi sintetizado não foi possível
confirmar a identidade estrutural do complexo Tc7. No entanto, os resultados obtidos
Tc7
Tc
OCCO
CO
N
N
NH2TcOC
COCO
H2OOH2
OH2
+
L799m
N
NH
NH
O
NH2
O
P OH
P
OHO
OH
OH
OHO
+
ácidoglutâmico
Tc7
12,3 min
5 10 15 20 25 Tempo (min) 0
* (tR = 14,0 min)
Capítulo 2
127
com os complexos anteriores Tc1 - Tc2 e Tc4 - Tc6 indicaram que a unidade pirazolo -
diamina estabilizava o fragmento organometálico de Tc(I), mesmo quando ligada a
grupos fosfonatos que poderiam, eventualmente, competir na ligação ao metal.
A lipofilia/hidrofilia (Log D) do complexo Tc7 também foi determinada através
do cálculo dos coeficientes de partição no sistema n-octanol/solução tampão fosfato
salino, utilizando o método descrito na literatura [121]. O valor determinado (-2,66 ±
0,06) indicou que Tc7 era fortemente hidrofílico.
Por electroforese, realizada a pH 7,2 (tampão fosfato salino 0,2 M), concluiu-se
que a carga global de Tc7 era negativa, uma vez que o complexo migrou (1,2 cm) para
o pólo positivo.
2.4.4. Avaliação biológica do complexo Tc7
2.4.4.1. Estudos in vitro
2.4.4.1.1. Adsorção à hidroxiapatite (HA)
Os ensaios de adsorção à hidroxiapatite foram realizados para avaliar o efeito
do ácido glutâmico. Os resultados de ligação à HA encontram-se resumidos na tabela
2.16.
Tabela 2.16 - Percentagem de ligação à hidroxiapatite determinada a 37 °C para o
complexo Tc7, em função da massa de HA, e do tempo de incubação.
HA (mg)
% Ligação à HA 1h após incubação
Tempo (h)
% Ligação a 15 mg de HA
2,5 60,6 ± 4,06 0 71,75 ± 0,64
10 70,7 ± 2,26 1 82,35 ± 4,31
50 74,85 ± 5,44 2 82,3 ± 2,83
4 82,05 ± 1,48
Compostos Multifuncionais Osteotrópicos para Aplicação Terapêutica: Estratégias de Derivatização de Bisfosfonatos
128
À semelhança do que se concluiu anteriormente para Tc5 e Tc6, o complexo Tc7
também apresentou uma ligação à HA elevada e rápida, atingindo valores da ordem de
grandeza dos encontrados para Tc5 e Tc6.
2.4.4.1.2. Estabilidade em Cisteína e Histidina
Determinou-se também a estabilidade de Tc7 na presença de cisteína e
histidina (figura 2.44).
Figura 2.44 – Estrutura química da cisteína e da histidina.
Estes dois aminoácidos existem na composição de proteínas em circulação
sanguínea e possuem na sua estrutura grupos funcionais susceptíveis de coordenar à
unidade fac-[99mTc(CO)3]+.
Analisando se ocorre transquelatação do ligando L7 com a cisteína ou a
histidina, é possível prever a potencial instabilidade in vivo do complexo Tc7. Para esse
efeito, adicionou-se ao complexo Tc7, em condições fisiológicas (tampão fosfato, pH
7,4; 37 °C), um grande excesso de cisteína ou histidina (100:1). Na realização destes
ensaios utilizaram-se alíquotas de 100 µl do complexo Tc7 e 900 µl de uma solução de
cisteína ou histidina (10-3 M) em tampão PBS (pH 7,4). A estabilidade do complexo Tc7
foi monitorizada através da análise por HPLC de alíquotas retiradas após 1, 3 e 24
horas (figura 2.45).
Figura 2.45 - Cromatogramas
histidina (detecçã
Os cromatogramas o
retenção era idêntico ao do
este complexo era estável na
Estas conclusões for
retenção dos complexos d
transquelatação com as mo
reacção do precursor
concentração final 10-4 M, c
retenção para os complexos
9,95 min, respectivamente.
A) tR = 12,3 min
5 10 15 0
as de RP-HPLC do complexo Tc7, na presença de
ecção γ).
as obtidos apresentaram um pico maioritário c
o do complexo Tc7 (tR = 12,3 min), pelo que
el na presença de ambos os aminoácidos.
foram confirmadas através da determinação
s de 99mTc que eventualmente se formariam
s moléculas de cisteína e histidina. Para isso,
r fac-[99mTc(H2O)3(CO)3]+ com estes amino
M, com aquecimento a 75 °C durante 30 min.
exos formados com a cisteína e a histidina eram
te.
B) tR = 12,3 min
1 h
3 h
24 h
5 10 15 0 20 25 Tempo (min)
Capítulo 2
129
de A) cisteína e B)
rio cujo tempo de
concluímos que
ção do tempo de
riam se ocorresse
so, procedeu-se à
inoácidos numa
in. Os tempos de
ram de 6,30 min e
1 h
3 h
24 h
20 25 Tempo (min)
Compostos Multifuncionais Osteotrópicos para Aplicação Terapêutica: Estratégias de Derivatização de Bisfosfonatos
130
2.4.4.2. Estudos In Vivo
2.4.4.2.1. Biodistribuição em ratinhos CD-1
O comportamento biológico do complexo Tc7 foi avaliado em ratinhos CD-1
(Charles River), injectados com 100 µl (7,0 – 18,5 MBq) de uma solução de Tc7, na veia
da cauda, de acordo com o procedimento descrito anteriormente para Tc5 e Tc6.
A distribuição nos tecidos, expressa em percentagem da actividade injectada
por grama de órgão (% A.I./g órgão), e a excreção total expressa em % A.I., encontram-
se na tabela 2.17.
A característica mais relevante observada, através da análise destes resultados,
diz respeito à fixação preferencial de Tc7 no osso e no rim. A fixação óssea de Tc7 foi
significativamente superior [14,7 ± 2,5 % A.I./g osso 4 h p.i.], à encontrada para Tc5
[4,7 ± 0,9 % A.I./g osso 4 h p.i.] e Tc6 [9,7 ± 1,7 % A.I./g osso 4 h p.i.] na mesma espécie
animal. No entanto, ao contrário do que se verificou para Tc5 e Tc6, Tc7 apresentou
uma fixação renal demasiado elevada [16,2 ± 1,1 % A.I./g órgão 1 h p.i.; 13,8 ± 3,0 %
A.I./g órgão 4 h p.i.]. Apesar de Tc7 ser fortemente hidrofílico (Log D = -2,66 ± 0,06),
este resultado pode ser devido à presença de uma função amina livre.
Tabela 2.17 – Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) e excreção total
(% A.I.) para o complexo Tc7 em ratinhos CD-1.
Tc7 1 h 4 h
Sangue 0,4 ± 0,1 0,12 ± 0,03
Rim 16,2 ±±±± 1,1 13,8 ±±±± 3,0
Fígado 2,8 ± 0,7 2,3 ± 0,8
Intestino 0,7 ± 0,2 1,5 ±0,4
Baço 0,5 ± 0,2 0,7 ± 0,3
Coração 0,33 ± 0,06 0,18 ±0,03
Pulmões 0,8 ± 0,2 0,9 ± 0,2
Estômago 1,0 ± 0,3 0,8 ± 0,5
Músculo 0,4 ± 0,1 0,34 ± 0,04
Osso 14,5 ±±±± 1,0 14,7 ±±±± 2,5
Excreção total
49,6 ± 5,1 57,0 ± 3,4
Capítulo 2
131
Relativamente aos restantes resultados de biodistribuição podemos concluir
que a depuração sanguínea foi rápida. No entanto, devido à elevada retenção renal
observada para o complexo Tc7, a sua excreção total era inferior à encontrada para
Tc5 e Tc6.
2.4.4.2.2. Estabilidade In Vivo
A estabilidade de Tc7 foi avaliada em ratinhos CD-1. Após injecção de Tc7,
foram recolhidas amostras de urina que foram avaliadas por RP-HPLC, após
tratamento adequado (figura 2.46).
Figura 2.46 - Cromatogramas de RP-HPLC de urina de ratinho CD-1, após injecção de Tc7
(detecção γ).
Nos cromatogramas obtidos para as amostras de urina, recolhidas 1 hora
depois da injecção de Tc7, verificámos que o pico principal correspondia ao complexo
inicial, sendo observadas apenas pequenas quantidades de outras espécies
possivelmente resultantes da metabolização do complexo
Tc7
12,3 min
14,0 min
1 h p.i.
4 h p.i
5 10 15 20 25 Tempo (min) 0
Compostos Multifuncionais Osteotrópicos para Aplicação Terapêutica: Estratégias de Derivatização de Bisfosfonatos
132
Tabela 2.18 –Biodistribuição (% A.I./g órgão) e excreção total (% A.I.) de Tc7, com e sem
injecção de probenecide em ratinhos CD-1.
Osso Rim Fígado Excreção
1h 4h 1h 4h 1h 4h 1h 4h
Controlo 14,5 ± 1,0
14,7 ± 2,5
16,2 ± 1,1
13,8 ± 3,0
2,8 ± 0,7
2,3 ± 0,8
49,6 ± 5,1
57,0 ± 3,4
Co-injecção (Probenecide)
5,2 ± 0,9
9,2 ± 0,6
14,0 ± 2,7
9,3 ± 2,2
3,0 ± 0,7
3,5 ± 0,2
54,2 ± 3,6
65,1 ± 2,5
2.4.4.2.3. Estudos de Inibição da Fixação Renal
Uma vez que a fixação óssea do complexo Tc7 foi significativamente superior à
de Tc5 e Tc6, concluímos que a presença do ácido glutâmico não parecia contrariar o
objectivo final do trabalho. Considerámos ainda que, uma vez que Tc7 possuía uma
carga global negativa, a elevada retenção renal deste complexo poderia ser diminuída
através da co-injecção de probenecide, pois existem dados na literatura relativos à sua
acção de inibição da retenção renal [175]. Um dos mecanismos propostos refere a
acção do probenicide como inibidor dos transportadores de aniões orgânicos como
sendo a responsável pela diminuição da reabsorção renal.
Na tabela 2.18 apresentam-se os resultados de biodistribuição nos principais
órgãos envolvidos na eliminação do complexo Tc7 e no osso, expressos em
percentagem da actividade injectada por grama de órgão e a excreção total expressa
em % A.I..
Os resultados obtidos revelaram que apesar de não se ter observado inibição
significativa da fixação renal 1 hora p.i., às 4 horas verificou-se um decréscimo de ca.
30 % da fixação renal. No entanto, também se verificou um decréscimo na fixação
óssea na mesma ordem de grandeza, pelo que este método de inibição com
probenecide não foi conclusivo.
NS
Conclusões e Perspectivas
135
3 – CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Os radiofármacos 99mTc-HDP, 99mTc-MDP e [188/186Re]HEDP estão indicados na
detecção e tratamento de metástases ósseas, especialmente em casos de cancro da
próstata e da mama. Apesar do seu sucesso clínico, estes radiofármacos apresentam
limitações clínicas e químicas. Sob o ponto de vista clínico, essas desvantagens estão
relacionadas com o tempo de espera até à aquisição da imagem (associado à
eliminação lenta destes radiofármacos), à falta de especificidade para determinadas
doenças e à sua instabilidade in vivo. Ao nível químico, destaca-se o facto destes
radiofármacos serem constituídos por uma mistura de espécies de composição
variável ao longo do tempo. Cada uma dessas espécies possui propriedades biológicas
diferentes, tais como selectividade e estabilidade. Além disso, não está
completamente definido o estado de oxidação do metal e os grupos fosfonato têm
uma função dupla, estabilizando simultaneamente o metal radioactivo e ligando-se ao
Ca2+ da hidroxiapatite, que constitui a matriz inorgânica do osso.
Com vista a obviar estas limitações a estratégia aplicada na concepção de novos
radiofármacos específicos para o osso foi a chamada aproximação bifuncional. Nesta
aproximação utilizou-se um “ligando bifuncional” que contém uma unidade quelante
do tipo pirazolo-diamina para estabilização eficiente do metal e um grupo funcional
para ligação a uma unidade bisfosfonato (BF) com afinidade para o tecido ósseo. Deste
modo, esperava-se que a afinidade para o osso fosse superior, comparativamente à
dos complexos em que o BF é utilizado simultaneamente para estabilizar o metal
radioactivo e ligar-se ao osso.
Assim, o primeiro objectivo deste trabalho era a síntese e a caracterização
biológica de complexos de M(CO)3 (M = 99mTc, Re) contendo um grupo funcional, com
propriedades químicas e biológicas adequadas para a imagiologia óssea. Para o
concretizar, prepararam-se os ligandos bifuncionais L1 - L6 (esquema 3.1), que contêm
uma unidade quelante do tipo pirazolo-diamina para estabilização do fragmento
metálico M(CO)3 (M = 99mTc, Re) e uma unidade com capacidade osteotrópica.
Conclusões e Perspectivas
136
Os compostos L1 - L3 contendo uma unidade monofosfonato foram obtidos por
alquilação da amina secundária do precursor 3 com os respectivos
bromoalquilfosfonatos. Os compostos L4 - L6, com uma unidade bisfosfonato foram
sintetizados por conjugação dos aminobisfosfonatos AMDP (1-amino-1,1-
metileno)bisfosfonato de etilo, PAM (pamidronato) e ALN (alendronato) ao carboxilato
do precursor 7, através de uma ligação amida (esquema 3.1).
Esquema 3.1 - Síntese dos ligandos bifuncionais L1 - L6.
Complexos do tipo fac-[Re(CO)3(κ3-L)]+ (Re1, L = L1; Re2, L = L2; Re4, L = L4;
Re5, L = L5; Re6, L = L6) foram sintetizados por reacção directa dos respectivos
ligandos com os precursores [ReBr(CO)5] (Re1 e Re2, esquema 3.2) ou por via
indirecta, por conjugação do aminobisfosfonato correspondente à função carboxilato
do precursor fac-[Re(CO)3(κ3-pzCOOH)]Br (Re4 - Re6, esquema 3.3).
O complexo Re4 foi também sintetizado por reacção directa do ligando L4 com
o precursor (NEt4)2[ReBr3(CO)3], afastando-se assim a hipótese de qualquer interacção
entre o metal e a unidade bisfosfonato.
Capítulo 3
137
Esquema 3.2 - Síntese dos complexos Re1, Re2, com a unidade monofosfonato.
Esquema 3.3 - Síntese de Re4 - Re6 com unidades bisfosfonato.
CO
Re
Br
OC CO
OC CO
Re
OCCO
CO
NN N
NH2
P
+
O OEtOEt
Re
OCCO
CO
NN N
NH2
P
+
O OHOH
Re1
Re2
= 96 %
= ~36 %
L1
L2
[Re(CO)3( 3-pzCOOH)]+
Re4
Re
OCCO
CO
NN N
NH2
O
HN P
POO
HO OH
OHOH
+
Re5
Re
OCCO
CO
NN N
NH2
O
HN
PP
OH
O
OHO
-O
O-
HO
+
Re6
Re
OCCO
CO
NN N
NH2
O
PP
OH
O
OHO
-O
O-
OH
HN
+
Re
OCCO
CO
NN N
NH2
O
OH
+X
X XRe
OC COCO
Re
OCCO
CO
NN N
NH2
O
HN P
POO
EtO OEt
OEtOEt
+
[Re(CO)3( 3-pzAMDP]+
AMDP ALNPAM
pzCOOH
= 54 % = 24 % = 40 %
~ 100 %(RMN)
L4
= 66 %
= 71 %
+/-2
X = H2O, Br
Conclusões e Perspectivas
138
Os complexos Re1
analíticas usuais em química
RMN, espectroscopia de IV
alta eficiência em fase reve
adequados para análise p
estrutura de raios - X do c
ligação relevantes.
Figura 3.1 - Estrutura de raios
Os resultados obtido
resultados obtidos pelas o
ligando L2 coordena ao cen
metálico apresenta um núm
octaédrica distorcida. Nessa
definem uma das faces tri
ocupadas pelos três átomos
Por reacção de L1, L2
precursor fac-[99mTc(H2O)3(C
fac-[99mTc(CO)3(κ3-L)]+ (Tc1
rendimentos e pureza radioq
Re
N3
N1 N
N2
C2
C3O3
O2
e1, Re2, Re4 - Re6 foram caracterizados
mica inorgânica, nomeadamente através de esp
e IV, análise elementar C,H,N e por cromatogr
reversa (RP-HPLC). No caso de Re1, foi possíve
e por difracção de raios-X. Na figura 3.1
o catião do complexo Re1 e alguns ângulos e
ios - X do catião do complexo Re1 e ângulos e distân
tidos por cristalografia de raios-X foram consis
as outras técnicas de caracterização, conclui
centro metálico através dos três átomos de a
número de coordenação seis e geometria de
essa estrutura, os três átomos de carbono do
s triangulares do octaedro e as restantes três
mos de azoto do ligando tridentado.
L2, L4 - L6 (concentração final: 5 x 10-5 M - 1 x
(CO)3]+ (100 °C, 30 min), obtiveram-se os com
c1, L = L1; Tc2, L = L2; Tc4, L = L4; Tc5, L = L5; Tc
dioquímica elevados (95 - 98 %) (esquema 3.4).
Re – C1: 1,895(9) Å C2 – Re1
Re –C2: 1,895(10) Å C1 – Re1
Re –C3: 1,876(11) Å C1 – Re1
Re –N1: 2,201(6) Å
Re –N3: 2,258(6) Å
Re –N4: 2,176(6) Å
P
N4
C1 O1
2
os pelas técnicas
espectroscopia de
tografia líquida de
sível obter cristais
apresenta-se a
los e distâncias de
stâncias de ligação.
nsistentes com os
luindo-se que o
e azoto. O centro
a de coordenação
o dos ligandos CO
três posições são
1 x 10-4 M) com o
complexos do tipo
Tc6, L = L6), com
).
e1 – N3: 176,1(4)°
e1 – N1: 178,1(3)°
e1 – N3: 91,2(3)°
Capítulo 3
139
Esquema 3.4 - Síntese dos complexos Tc1, Tc2, Tc4 - Tc6.
A caracterização estrutural dos complexos de 99mTc efectuou-se por comparação
dos seus tempos de retenção nos cromatogramas de RP-HPLC com os dos complexos
análogos de Re [Tc1/Re1: 16,3 min/15,8 min; Tc2/Re2: 11,4 min/10,8 min; Tc4/Re4:
13,2 min/13,9 min; Tc5/Re5: 12,0 min/11,9 min; Tc6/Re6: 14,2 min/13,8 min].
Os valores de log D encontrados indicaram que o complexo Tc1 era
moderadamente lipofílico (log D = 0,08), enquanto Tc2, Tc5 e Tc6 apresentavam maior
hidrofilía [log D = -1,67 (Tc1); -2,00 (Tc5); -1,94 (Tc6)], certamente devido à presença
dos ácidos mono- e bisfosfónicos.
Os complexos Tc1 e Tc2 revelaram-se bastante estáveis in vitro, tal como
demonstrado por estudos de estabilidade em tampão fosfato salino, NaCl 0,9 % e soro
humano. O comportamento biológico de Tc1 e Tc2 foi avaliado em ratinhos CD-1 e os
resultados obtidos são apresentados sob a forma de histograma na figura 3.2.
Tc
OCCO
CO
NN N
NH2
P
+
O OEtOEt
Tc
OCCO
CO
NN N
NH2
P
+
O OHOH
Tc1 Tc2
= 96 % = 98 %
OH2H2O OH2Tc
OC COCO
99m
99m 99m
Tc5
Tc
OCCO
CO
NN N
NH2
O
HN
PP
OH
O
OHO
-O
O-
HO
+
Tc4
Tc
OCCO
CO
NN N
NH2
O
HN P
POO
HO OH
OHOH
+
99m 99m
= 96 % = 95 %
Tc6
Tc
OCCO
CO
NN N
NH2
O
PP
OH
O
OHO
-O
O-
OH
HN
+
99m
= 95 %
L4 L5L6L1
L2
Conclusões e Perspectivas
140
Figura 3.2 – Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) dos complexos Tc1 e Tc2.
Os complexos Tc1 e Tc2 não possuem capacidade de fixação óssea, nem sofrem
acumulação em nenhum órgão ou tecido em particular, à excepção dos que estão
relacionados com as vias de excreção, nomeadamente o fígado, o intestino e o rim. A
depuração sanguínea foi rápida para ambos, mas a excreção da actividade total foi
mais rápida para Tc2 (52,7 ± 2,5 e 64,0 ± 6,3 %, 1h e 4h p.i., respectivamente). Estes
resultados correlacionam-se com o carácter mais hidrofílico de Tc2 em comparação
com Tc1.
Quanto a Tc5 e Tc6, os estudos de adsorção à HA in vitro, permitiram concluir
que a capacidade osteotrópica destes complexos era semelhante à de 99mTc-MDP
estudado nas mesmas condições. Os valores da percentagem de ligação encontrados
para 20 mg de HA após 4h de incubação a 37 °C foram próximas: 81,6 ± 1,5 % para Tc5,
80,4 ± 1,4 % para Tc6 e 97,7 ± 1,2 % para 99mTc-MDP.
A farmacocinética dos complexos Tc4 - Tc6 e do composto padrão 99mTc-MDP
(gold standard) foi avaliada em ratinhos CD-1 (figura 3.3).
0
5
10
15
20
25
1 h4 h
1 h4 h
% A
.I./
g ó
rgão
Osso
Músculo
Sangue
Rim
Fígado
Intestino
Tc2
Tc1
Capítulo 3
141
Figura 3.3 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) de Tc4 - Tc6 e 99mTc-MDP, em ratinhos CD-1.
Concluímos que os complexos Tc4 - Tc6 e 99mTc-MDP apresentavam uma
fixação preferencial no osso, com um longo tempo de permanência neste tecido e a via
de eliminação dos quatro complexos era essencialmente renal. O complexo Tc6 foi o
que apresentou uma acumulação óssea mais próxima do 99mTc-MDP, principalmente
1h p.i. (17,3 ± 1,5 %, Tc6 e 17,1 ± 2,4 %, 99mTc-MDP).
Através dos resultados de fixação óssea, das razões alvo/não alvo e da excreção
total da actividade injectada apresentados na tabela 3.1 podemos ainda fazer uma
comparação entre os três complexos Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP que apresentaram maior
fixação óssea.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1 4 1 4 1 4 1 4
Sangue Músculo Intestino Rim Fígado Osso
Tc4
Tc5
Tc6
Tempo [h]
% A
.I./
g ó
rgão
99mTc-MDP
Conclusões e Perspectivas
142
Apesar dos complexos Tc5 e Tc6 possuírem uma unidade bisfosfonato com um
grupo hidroxilo na posição geminal, verificou-se que a acumulação óssea de Tc5 foi
inferior à de Tc6 [Tc5: 4,6 ± 0,7 % A.I./g, 1h p.i.; 4,7 ± 0,9 % A.I./g, 4h p.i.; Tc6: 12,7 ±
0,9 % A.I./g, 1h p.i.; 9,7 ± 1,7 % A.I./g, 4h p.i.]. Deve salientar-se o facto dos estudos
de biodistribuição de Tc5 terem sido obtidos em ratinhos com massa superior aos
utilizados para os ensaios com os restantes complexos. As diferenças observadas
reflectem-se sobretudo nos valores de acumulação da actividade injectada expressos
em % A.I./g órgão. Tendo em conta este facto e comparando os valores obtidos em
termos de % A.I., concluimos que as diferenças observadas entre os valores de fixação
óssea, em ratinhos CD-1, dos complexos Tc5 [18,5 ± 1,2 % A.I. 1h p.i.; 18,7 ± 2,8 % A.I.
4h p.i.] e Tc6 [30,3 ± 1,3 % A.I. 1h p.i.; 22,8 ± 2,2 % A.I. 4h p.i.] são inferiores.
Em ratinhos CD-1, apesar da acumulação óssea de Tc5 ser inferior à de Tc6 e de
99mTc-MDP, verificou-se uma razão osso/músculo ligeiramente superior para Tc5 às 4h
p.i. [Tc5: 56,3 ± 10,5; Tc6: 46,6 ± 3,5; 99mTc-MDP: 45,6 ± 8,6]. A excreção total da
actividade injectada foi elevada e comparável para os três complexos, sendo também
ligeiramente superior para Tc5 [64,5 ± 1,4 % A.I. 1h p.i.; 67,3 ± 3,6 % A.I. 4h p.i.]. O
facto de Tc5 e Tc6 serem eliminados essencialmente por via renal, apresentarem uma
excreção total favorável e rápida depuração sanguínea está provavelmente
relacionado com o seu forte carácter hidrofílico [Log D (Tc5) = -2,00 ± 0,02; Log D (Tc6)
= -1,94 ± 0,02].
Tabela 3.1 – Avaliação biológica in vivo de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP em ratinho CD-1.
Tc5 Tc6 99mTc-MDP
Fixação Óssea
(% A.I./g)
1h 4,6 ± 0,7 12,7 ± 0,9 12,7 ± 2,7
4h 4,7 ± 0,9 9,7 ± 1,7 12,7 ± 1,4
Osso
Sangue
1h 14,5 ± 2,4 29,3 ± 2,2 67,6 ± 9,0
4h 40,4 ± 10,7 51,7 ± 5,5 84,5 ± 10,4
Osso
Músculo
1h 29,8 ± 8,2 34,6 ± 6,1 34,8 ± 6,6
4h 56,3 ± 10,5 46,6 ± 3,5 45,6 ± 8,6
Excreção total
(% A.I.)
1h 64,5 ±±±± 1,4 58,2 ± 1,1 53,1 ± 5,0
4h 67,3 ± 3,6 63,6 ± 2,2 57,6 ± 1,7
Capítulo 3
143
Pelo facto de Tc5 e Tc6 terem apresentado resultados biológicos mais
promissores em ratinho CD-1, foram escolhidos para prosseguir estudos noutra estirpe
de ratinho (Balb-c, Charles River) (tabela 3.2).
Ao contrário do que se tinha observado em ratinho CD-1, em Balb-c as
diferenças encontradas na fixação óssea de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP foram menos
significativas, principalmente 1h p.i. (18,3 ± 0,6 %, Tc5; 17,3 ± 1,5 %, Tc6 e 17,1 ± 2,4
%, 99mTc-MDP). A via de eliminação era também essencialmente renal e a eliminação
sanguínea e dos tecidos moles era rápida. Os valores das razões osso/músculo para
Tc5 e Tc6 foram significativamente superiores às 4h p.i. (Tc5: 77,7 ± 4,2 ; Tc6: 79,0 ±
2,9) à do 99mTc-MDP (47,9 ± 13,6) e as razões osso/sangue eram próximas,
observando-se para Tc5 um valor ligeiramente superior às 4h p.i. (Tc5: 86,2 ± 9,4; Tc6:
74,7 ± 6,9; 99mTc-MDP: 70,9 ± 9,2).
Em ratinhos Balb-c, os valores de excreção total da actividade injectada
também foram superiores para Tc5 e Tc6, comparativamente ao 99mTc-MDP,
principalmente às 4h p.i. (Tc5: 74,1 ± 0,9; Tc6: 77,2 ± 0,5; 99mTc-MDP: 56,8 ± 0,9).
Os complexos Tc1, Tc2, Tc4 - Tc6 demonstraram elevada estabilidade e
resistência à metabolização em amostras biológicas (urina e soro de ratinho)
recolhidas após injecção destes complexos. Além disso, os complexos não sofreram
Tabela 3.2 – Avaliação biológica in vivo de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP em ratinho Balb-c.
Tc5 Tc6 99mTc-MDP
Fixação Óssea
(% A.I./g)
1h 18,3 ± 0,6 17,3 ± 1,5 17,1 ± 2,4
4h 15,3 ± 0,8 15,2 ± 1,4 19,8 ± 1,5
Osso
Sangue
1h 35,4 ± 0,3 29,8 ± 7,2 41,9 ± 8,1
4h 86,2 ± 9,4 74,7 ± 6,9 70,9 ± 9,2
Osso
Músculo
1h 44,0 ± 8,1 45,5 ± 14,4 31,7 ± 4,0
4h 77,7 ± 4,2 79,0 ± 2,9 47,9 ± 13,6
Excreção total
(% A.I.)
1h 65,6 ± 1,2 66,8 ± 7,6 49,1 ± 6,1
4h 74,1 ± 0,9 77,2 ± 0,5 56,8 ± 0,9
Conclusões e Perspectivas
144
retenção significativa no estômago, indicando que não ocorreu, in vivo, a dissociação
do 99mTc do ligando pirazolilo, com reoxidação a [99mTcO4]-.
As imagens obtidas 2h após administração de Tc5, Tc6 e 99mTc-MDP em ratos
Sprague Dawley, confirmaram o seu potencial como radiofármacos por imagem óssea
(figura 3.4).
Figura 3.4 - Imagem de corpo inteiro de rato Sprague Dawley, 2 h após injecção de Tc5, Tc6 e
99mTc-MDP, obtidas em câmara γ.
Tirando partido dos resultados promissores de Tc5 e Tc6, em termos de
estabilidade in vivo, perfil farmacocinético e fixação óssea, passámos à segunda parte
do trabalho que consistiu na tentativa de síntese de um complexo trifuncional para
aplicação terapêutica. O complexo seria constituído por um ligando tridentado, do tipo
pirazolo-diamina, para estabilizar o fragmento fac-[M(CO)3]+ (M = 188Re ou 186Re)
(emissor β), e teria na sua composição um BF e uma molécula citotóxica (docetaxel).
Esperávamos que a utilização destes complexos multifuncionais pudesse
apresentar vantagens sobre a utilização das actuais terapias múltiplas: quimioterapia
seguida de radioterapia sistémica com um radiofármaco.
Para a síntese dos complexos trifuncionais utilizámos dois tipos de estratégias:
na primeira utilizámos uma molécula de ácido glutâmico para ligação das unidades BF
e docetaxel (DTX) à amina secundária da unidade quelante (figura 3.5 - A) e na
segunda tentámos a ligação destas unidades directamente ao ligando pirazolo
diamina, isto é, à posição 4 do anel pirazolilo e ao carboxilato do braço pendente da
unidade quelante pz4-COOH (figura 3.5 - B).
Tc5 Tc6 99mTc-MDP
Capítulo 3
145
Figura 3.5 - Representação das duas estratégias utilizadas para a síntese de complexos
trifuncionais.
Os resultados obtidos na estratégia com ácido glutâmico conduziram à síntese
do composto L7, (η = 10 %). Neste composto, o BF foi ligado à função α-COOH do
ácido glutâmico e este ligou-se através da função γ-COOH ao grupo NH2 do ligando
pz(Boc)-NH2 (26) (figura 3.6).
Figura 3.6 - Síntese do composto L7 (η = 10 %).
A função NH2 do ácido glutâmico seria para ligaçõa ao docetaxel. O rendimento
da reacção foi relativamente baixo (10 %), mas como a aproximação funcionou
decidiu-se então recomeçar este método utilizando pz(Fmoc)-NH2 e conjugando a este
ligando o ácido glutâmico já com o BF e o docetaxel. O grupo protector Fmoc na amina
primária da unidade quelante, sendo ortogonal do grupo Boc que existe na estrutura
A) B)
Conclusões e Perspectivas
146
do docetaxel, seria facilmente removido sem que tal acontecesse ao grupo Boc do
docetaxel. Assim, de acordo com esta nova estratégia o alendronato ligou-se à função
α-COOH do ácido glutâmico e o docetaxel à função α-NH2 conduzindo à obtenção do
composto ALN-Glu-succinil-DTX (figura 3.7) com baixo rendimento (η = ca. 15 %).
Figura 3.7 - Estrutura química do intermediário ALN-Glu-succinil-DTX.
O baixo rendimento com que obtivemos ALN-Glu-succinil-DTX, e a falta de
tempo, impediram a continuação desta via de síntese e a concretização deste
objectivo.
A reacção de L7 com o precursor fac - [99mTc(H2O)3(CO)3]+ permitiu a síntese do
complexo fac-[99mTc(CO)3(κ3-L)]+ (Tc7, L = L7) com um rendimento superior a 92 % e o
comportamento biológico in vitro e in vivo deste complexo foi avaliado. Os resultados
de adsorção à HA permitiram concluir que a percentagem de ligação de Tc7 a 15 mg de
HA, após 1h de incubação a 37 °C, era 82,4 ± 4,3 %. O composto era também estável in
vitro, na presença de histidina e cisteína. Deste modo, concluimos que a presença do
ácido glutâmico, entre a unidade quelante e o bisfosfonato, não impedia a fixação
óssea desse complexo e levava à obtenção de um complexo estável.
A avaliação deste complexo em ratinhos CD-1 permitiu obter os resultados de
biodistribuição que se mostram na figura 3.8.
Capítulo 3
147
Figura 3.8 - Biodistribuição (% A.I./g órgão) de Tc7 em ratinhos CD-1.
Concluímos que a capacidade de fixação óssea era muito elevada (14,5 ± 1,0
A.I./g osso, 1 h p.i.; 14,7 ± 2,5 % A.I./g osso, 4 h p.i.) e superior a Tc6 (12,7 ± 0,9 %
A.I./g osso, 1 h p.i.; 9,7 ± 1,7 % A.I./g osso, 4 h p.i.). No entanto, observou-se também
uma retenção renal demasiado elevada (16,2 ± 1,1 % A.I./g, 1 h p.i.; 13,8 ± 3,0 %
A.I./g, 4 h p.i.). Este facto poderá estar relacionado com a carga global do complexo e
para investigar isso realizámos estudos de biodistribuição com co-injecção com
probenecide, pois este composto tem sido utilizado como inibidor dos transportadores
de aniões orgânicos levando à diminuição da retenção renal. O estudo de
biodistribuição não foi conclusivo uma vez apesar de termos verificádo um decréscimo
de ca. 30 % na fixação renal 4 horas p.i., também observámos um decréscimo na
fixação óssea na mesma ordem de grandeza.
Uma vez que os resultados biológicos obtidos com Tc7 foram favoráveis, em
termos de fixação óssea e de estabilidade in vitro e in vivo, consideramos que
futuramente deve ser explorada e concretizada a aproximação que iniciámos e que
deverá envolver: a ligação do alendronato à função α-COOH do ácido glutâmico, a
conjugação do pz(Fmoc)-NH2 à função γ-COOH e finalmente a ligação do 2’-succinil-
DTX através da função α-NH2 (figura 3.9).
0
4
8
12
16
20
1 4
Sangue
Músculo
Intestino
Rim
Fígado
Osso
Tempo [h]
% A
.I./
g ó
rgão
Conclusões e Perspectivas
148
Figura 3.9 - Perspectiva para a funcionalização do ácido glutâmico.
A principal dificuldade que encontrámos nesta aproximação foi a ligação do
ácido glutâmico ao aminobisfosfonato, devido à baixa reactividade destes compostos.
Os baixos rendimentos obtidos estão certamente relacionados com a baixa
solubilidade dos BFs em solventes orgânicos e também com o facto do carboxilato α
do ácido glutâmico poder estar sujeito a impedimentos estéreoquímicos devido à sua
proximidade da função α-NH2.
No caso da estratégia do ácido glutâmico, outra via a explorar seria a ligação da
função NH2 de pz(Fmoc)-NH2 ao grupo α-COOH do ácido glutâmio, conjugação do
aminobisfosfonato à função γ-COOH do ácido glutâmico (estereoquimicamente menos
impedida) e finalmente a conjugação do docetaxel ao NH2 do ácido glutâmico (figura
3.10).
Figura 3.10 - Alternativa para a funcionalização do ácido glutâmico.
O
O
NH
O
NNH2
N
N
NH
NH
O
O
P OH
P
OHO
OH
OH
OHO
HN
O O
O
O
HO
O
OH
O
OH
AcOOO
Ph
NNHN
N
NH2
pz(Fmoc)-NH2
NH2
O O
OHHO
ALENDRONATO
H2NP OH
POH
O OH
OHOH
O
3
21
Fmoc
O
HN
O O
O
OO
HO
O
2'-succinil-DTX
HO
OOH
O
OH
O
O
OO
O
O
NH
O
NH
NH
O
O
HN
O
O
O O
HO
O
OH
O
OHAcO
O
O
Ph
P OH
P
OHO
OH
OH
OHO
NNH2
N
N
NNHN
N
NH2
pz(Fmoc)-NH2
NH2
O O
OHHO
ALENDRONATO
H2NP OH
POH
O OH
OHOH
O
21
3
Fmoc
O
HN
O O
O
OO
HO
O
2'-succinil-DTX
HO
OOH
O
OH
O
O
OO
Capítulo 3
149
DTX
Finalmente, ainda nos foi possível explorar outra alternativa para a síntese do
composto trifuncional. Esta alternativa consistiu em utilizar o composto pz4-COOH
(figura 3.11) e em ligar o alendronato ao grupo 4-COOH. Esta síntese foi possível e o
produto resultante dessa conjugação (36) foi obtido com rendimento razoável (49 %).
Figura 3.11 - Síntese de um complexo trifuncional a partir de pz4-COOH.
O passo seguinte seria a remoção do grupo etilo do ligando pirazolo-diamina e
conjugação do carboxilato livre ao docetaxel. Por questões de tempo, este segundo
passo não foi realizado, mas consideramos que é bastante viável e que deverá ser
prosseguido trabalho neste sentido. Obviamente, após a síntese dos ligandos
bifuncionais (pirazolo-diamina/BF/docetaxel) por qualquer das vias atrás referidas
dever-se-ão sintetizar os respectivos complexos de Re e 99mTc(I) e avaliar o
comportamento destes complexos com células e in vivo. Finalmente, dever-se-á
escolher o melhor complexo, preparar o correspondente complexo de 188Re e avaliar o
seu efeito terapêutico face à terapia combinada em utilização.
Conclusões e Perspectivas
150
NS
Procedimento Experimental
Procedimento Experimental
152
Capítulo 4
153
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
4.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS
A manipulação de reagentes e compostos sensíveis ao ar e à humidade foi
efectuada sob atmosfera inerte, recorrendo à utilização da linha de vazio e de técnicas
de schlenk.
Os compostos precursores t-butil 2-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-
il)etilamino)etilcarbamate (3), ácido 4-((2-(t-butoxicarbonilamino)etil)(2-(3,5-dimetil-
1H-pirazol-1-il)etil)amino)butanoico (7), ácido 4-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-
pirazol-1-il)etil)amino)butanoico (pz-COOH), [ReBr(CO)5], fac-[Re(Br)3(CO)3](NEt4)2 e
fac-[Re(H2O)3(CO)3]Br foram sintetizados de acordo com os métodos descritos na
literatura [117, 114, 131, 132, 120].
4.2. PURIFICAÇÃO DE SOLVENTES E REAGENTES
Os reagentes e solventes foram utilizados tal como adquiridos sem qualquer
purificação, excepto o trietil fosfito, o diclorometano, o tolueno, a N,N-
dimetilformamida, o metanol e a trietilamina que foram secos e destilados de acordo
com procedimentos descritos na literatura [176], que a seguir se descrevem de forma
resumida.
���� Acetonitrilo: O solvente foi submetido a pré-secagem com CaH2 e destilado, sob
atmosfera inerte, de P2O5 e colocado em contacto prolongado com peneiros
moleculares 3 Å.
���� Diclorometano: O solvente permaneceu em pré-secagem em contacto com CaCl2 e
foi destilado, sob atmosfera inerte, de P2O5 e colocado em contacto prolongado com
peneiros moleculares 3 Å.
���� Metanol: O solvente permaneceu em pré-secagem com peneiros moleculares 4 Å e
foi destilado, sob atmosfera inerte, na presença de magnésio metálico e de iodo
Procedimento Experimental
154
molecular. O solvente destilado manteve-se em contacto com peneiros moleculares
4 Å.
���� Piridina: o solvente manteve-se em pré-secagem com KOH e foi destilado, sob
atmostfera inerte. O solvente destilado manteve-se em contacto com peneiros
moleculares 4 Å.
���� Tolueno: Os solventes permaneceram em pré-secagem com peneiros moleculares 4
Å e foi destilado, sob atmosfera inerte, na presença de sódio usando benzofenona
como indicador.
���� Trietilamina: foi destilada de peneiros moleculares 4 Å, sob atmosfera inerte, e
colocada em contacto com peneiros moleculares 4 Å.
���� Trietilfosfito: Após o tratamento com sódio, para remover água e/ou dialquil
fosfonatos, decanta-se e destila-se a pressão reduzida. Armazena-se em atmosfera
de azoto.
4.3. TÉCNICAS DE PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO
Cromatografia em coluna
A cromatografia em coluna foi usada para purificar alguns dos compostos
sintetizados. Utilizou-se sílica-gel (MercK) com granulometria 0,060 mesh. O
enchimento das colunas de vidro foi preparado com uma mistura de sílica-gel e
eluente adequado para permitir a separação do composto pretendido. As fracções
foram separadas através do controlo por TLC e foram concentradas recorrendo a um
evaporador rotativo e à linha de vazio.
Cromatografia em camada fina (TLC)
A cromatografia em camada fina (TLC) foi utilizada para seguir as reacções de
síntese química e para identificar os produtos da reacção. Foram usadas tiras de sílica-
gel F254 em suporte de alumínio (MercK). Foi efectuada a localização e visualização das
manchas dos compostos por irradiação no Ultra-violeta (254 nm), por revelação com
vapor de iodo, com reagente de Dittmer ou com permanganato de potássio. A
detecção de compostos com função amina foi realizada utilizando um revelador de
ninidrina. A detecção de compostos com bisfosfonatos foi realizada com o reagente de
Capítulo 4
155
Dittmer. A detecção de compostos derivados do docetaxel foi realizada com revelador
de permanganato de potássio.
O revelador de ninidrina foi preparado e utilizado da seguinte forma [177]:
A uma solução de ácido acético (5 ml) em metanol (100 ml) adicionam-se 3 g de
ninidrina. Esta solução utiliza-se sob a forma de spray sobre as tiras de TLC que foram
posteriormente aquecidas numa placa de aquecimento (100 ᵒC) até ao aparecimento
das manchas dos compostos com funções amina com cor vermelho-violeta.
O reagente de Dittmer foi preparado e utilizado da seguinte forma [178]:
Solução I: Uma mistura de óxido molibdico (4 g) em ácido sulfúrico
concentrado (100 ml) foi fervida, com agitação contínua, até à dissolução completa
dos reagentes.
Solução II: À solução I (50 ml) foi adicionado molibdénio em pó (0,180 g) que foi
dissolvido com aquecimento.
Solução III: Após arrefecimento das soluções anteriores, adiciona-se 50 ml de
cada uma das soluções I e II. Esta solução permanece estável pelo menos durante um
ano num recipiente fechado.
A detecção de compostos com bisfosfonatos foi realizada utilizando a solução
III (2,5 ml) diluída com água destilada (5 ml) e etanol (7,5 ml). As tiras de TLC foram
levemente humedecidas por vaporização uniforme com esta solução. Após
aquecimento (100 ᵒC) as manchas dos compostos com bisfosfonatos apareciam com
uma cor azul escura que aumentava de intensidade durante o arrefecimento até à
temperatura ambiente após 10 a 15 min. A cor de fundo azul escura desaparece
totalmente e aparecem as manchas azuis intensas.
O revelador de permanganato de potássio foi preparado e utilizado da seguinte
forma [179]:
Dissolvem-se 3 g de KMnO4, 10 g K2CO3 e 300 ml de água. Este revelador é
estável em média durante três meses.
Procedimento Experimental
156
Após mergulhar a placa de TLC nesta solução, compostos do tipo alcenos e
alcino são detectados imediatamente, como manchas amarelas claras num fundo de
cor púrpura claro. Os álcoois, aminas, sulfuretos, mercaptanos e outras funções,
susceptíveis de serem oxidadas, podem ser visualizados após o aquecimento das
placas de TLC depois de imersas na solução de permanganato. As manchas observadas
são amarelas ou castanhas claras num fundo de cor púrpura, ou cor de rosa.
Este revelador foi utilizado para a detecção de compostos derivados do
docetaxel.
Cromatografia instantânea de camada fina - sílica gel (ITLC-SG)
A cromatografia instantânea de camada fina foi utilizada para seguir a cinética
e a eficiência das reacções de síntese dos complexos radioactivos bem como avaliar a
pureza radioquímica das soluções com os complexos de 99mTc. Foram utilizadas tiras de
sílica-gel (Polygram, Macherey-Nagel).
A distribuição da radioactividade nas tiras foi analisada utilizando um detector
Berthold LB 505 acoplado a um radiocromatógrafo.
Os eluentes utilizados para o controlo da pureza radioquímica do 99mTc-MDP
foram a acetona ([99mTcO4]-, Rf = 1; 99mTc-MDP, Rf = 0; espécies hidrolisadas de 99mTc, Rf
= 0) e uma solução de NaCl 0,9% ([99mTcO4]-, Rf = 1; 99mTc-MDP, Rf = 1; espécies
hidrolisadas de 99mTc, Rf = 0) [28].
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
A cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) foi usada para efeitos de
purificação e controlo analítico de compostos orgânicos, dos complexos de Re, e
dos complexos de 99mTc. As análises de HPLC foram realizadas num sistema
cromatográfico equipado com uma bomba Perkin-Elmer LC 200 acoplado a dois
detectores em série: um detector UV/Vis regulável LC 290 e a um detector de radiação
γ Berthold LB-507A. As análises químicas e radioquímicas foram feitas utilizando uma
coluna Macherey-Nagel de fase reversa C-18 (nucleosil 10 µm, 250 x 4mm - fluxo: 1
mL/min). As purificações dos compostos foram realizadas utilizando uma coluna semi-
preparativa, EP 250/8 Nucleosil 100-7 C18, Macherey Nagel e uma pré – coluna EP
30/8 Nucleosil 100-7 C18, Macherey Nagel; fluxo 2 ml/min.
Capítulo 4
157
Todos os solventes utilizados eram de qualidade HPLC. A água utilizada foi
bidestilada em aparelho de quartzo. Os solventes utilizados foram filtrados por filtro
Millipore de 0,22 µm e desarejados com hélio ou em banho de ultrassons.
Na sequência de eluição, utilizando os métodos 1, 2 e 3, os gradientes de
utilizados foram os seguintes:
Método 1:
Passo Tempo (min) % A % B
1 0 - 3 100 0
2 3 - 3,1 100 → 75 0 → 25
3 3,1 - 9 75 25
4 9 - 9,1 75 → 66 25 → 34
5 9.1 - 20 66 → 0 34 → 100
6 20 - 24 0 100
7 24 - 26 0 → 100 100 → 0
8 26 - 30 100 0
Método 2:
Passo Tempo (min) A % B
1 0 - 5 90 10
2 5 - 30 90 → 0 10 → 100
3 30 - 34 0 100
4 34 - 35 0 → 90 100 → 10
5 3 - 40 90 10
Método 3:
Passo Tempo (min) % A % B
1 0 - 25 100 0
2 25 - 27 100 → 75 0 → 25
3 27 - 28 75 25
4 28 - 30 75 → 66 25 → 34
Procedimento Experimental
158
Nas análises dos compostos L1, L2, Re1, Tc1, Re2 e Tc2, utilizou-se a sequência
de eluição do método 1. Os eluentes utilizados foram uma solução 0,1 % de ácido
Trifluoroacético (eluente A) e acetonitrilo (Eluente B).
Nas análises dos compostos Re4, Tc4, Re5, Tc5, Re6, Tc6 e Tc7 utilizaram-se
solventes diferentes e a sequência de eluição do método 1. Os eluentes utilizados
foram uma solução aquosa com 0,5 % de ácido trifluoroacético (eluente A) e uma
solução 0,5 % de ácido trifluoroacético em acetonitrilo (eluente B).
Nas análises e/ou purificação dos compostos fac-[Re(CO)3(κκκκ3-pz-COOH)]+
utilizou-se a sequência de eluição do método 2. Os eluentes utilizados foram uma
solução aquosa com 0,5 % de ácido trifluoroacético (eluente A) e metanol (eluente B).
As misturas reaccionais das sínteses do composto 32 com irradiação por micro-
ondas foram analisadas utilizando a sequência de eluição do método 3. Os eluentes
utilizados foram uma solução aquosa com 0,5 % de ácido trifluoroacético (eluente A) e,
uma solução 0,5 % de ácido trifluoroacético em acetonitrilo (eluente B).
Os cromatogramas dos compostos não radioactivos foram todos obtidos
monotorizando a absorção de UV a λ = 254 nm, à excepção do composto 32 que
apresentava maior absorção de UV a λ = 280 nm.
Purificação utilizando cartuchos Sep Pak C18
A purificação de alguns compostos contendo bisfosfonatos foi realizada
utilizando cartuchos Sep Pak de fase reversa C18 (Waters Co., 12 cc/2 g ou 0,85 cc/360
mg) pré-condicionados de acordo com o protocolo do fabricante. Isto é, os cartuchos
são previamente lavados primeiro com metanol (10 ml, para os de 12 cc/2 g ou 2 ml,
para os de 0,85 cc/360 mg) e depois com H2O (50 ml, para os de 12 cc/2 g ou 5 ml,
para os de 0,85 cc/360 mg). A eluição é feita utilizando um gradiente de metanol/H2O,
começando com H2O, utilizando posteriormente misturas de metanol/H2O (20 – 100
%). A presença de compostos contendo bisfosfonatos foi monitorizada por TLC,
utilizando o reagente de Dittmer como agente de revelação.
Capítulo 4
159
Espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1H, 13C e 31P
Os espectros de RMN foram obtidos num espectrómetro Varian Unity Inova-
300, com uma frequência de ressonância de 300 MHz para o 1H, de 121,5 MHz para o
31P e de 75,5 MHz para o 13C. Os solventes deuterados utilizados foram o CD3OD, o
CDCl3, e D2O. Os desvios químicos dos sinais de 1H e de 13C foram medidos utilizando
como referência interna o desvio químico residual do solvente relativamente ao
tetrametilsilano [CDCl3, δ (ppm): 7,24 (1H); 77,0 (13C)] e [CD3OD, δ (ppm)): 3,30 (1H);
49,0 (13C)]. Os desvios químicos dos sinais de 13C, das amostras dissolvidas em D2O,
foram obtidos usando como referência externa uma solução de 1,4-dioxano (90 %)
[δ (ppm): 69,2]. Os desvios químicos dos sinais de 31P foram obtidos usando como
referência externa uma solução de H3PO4 (85%) [δ (ppm): 0,00].
A atribuição dos desvios químicos foi feita com a ajuda de experiências
bidimensionais de espectroscopia de RMN (correlação homonuclear 1H – 1H, COSY, e
correlação heteronuclear 1H – 13C, HSQC).
Espectroscopia de Infra Vermelho (IV)
Os espectros de IV foram obtidos num espectrómetro Perkin-Elmer 577. As
amostras foram preparadas sob a forma de pastilhas de KBr.
Espectrometria de massa
Os espectros de massa ESI-MS foram obtidos num espectrómetro Bruker HCT
(ITN, Sacavém) pelo Doutor Joaquim Marçalo. O instrumento foi adquirido com o
apoio do Programa Nacional de Reequipamento Científico da Fundação para a Ciência
e Tecnologia e, faz parte da Rede Nacional de Espectrometria de Massa – RNEM.
Análise Elementar C, H, N
A análise elementar de C, H, N foi efectuada através de um analisador
automático Perkin-Elmer 240 ou EA 1110 CE Instruments. As análises foram efectuadas
pelo Sr. António Soares (ITN).
Procedimento Experimental
160
Cristalografia de raios-X de cristal único
Os dados de difracção de raios-X, do complexo Re1, foram obtidos à
temperatura ambiente, num difractómetro automático Enraf-Nonius CAD-4, com
radiação monocromática de Mo Kα (λ = 0,71073 Å). Os cristais foram montados em
capilares de vidro. A correcção empírica da absorção (ψ scans) e a redução de dados
foi efectuada com o programa WINGX [180]. As estruturas foram resolvidas
utilizando métodos directos (SIR97 [181]) e o refinamento foi efectuado com a ajuda
do programa SHELXL–97 [182]. Todos os átomos à excepção do hidrogénio foram
refinados com parâmetros térmicos anisotrópicos, enquanto os átomos de hidrogénio
foram colocados em posições geometricamente idealizadas. A representação gráfica
das estruturas foi efectuada com o programa ORTEP-3 [183].
A resolução e refinamento das estruturas foi da responsabilidade da Doutora
Isabel Cordeiro Santos da Unidade de Ciências Químicas Radiofarmacêuticas do ITN.
Medição da actividade das soluções radioactivas
A actividade das soluções de 99mTc foi medida numa câmara de ionização
(Aloka, Curiemeter IGC-3, Tokyo, Japan). As amostras com menor actividade foram
medidas num contador gama (Berthold, LB2111, Alemanha).
Electroforese [49, 134]
A carga dos complexos radioactivos foi determinada por electroforese.
Foi aplicada uma gota da solução dos complexos radioactivos em tiras de papel
(Whatman 3MM). As tiras de papel foram expostas a uma tensão constante (300 V) e
em contacto com uma solução 0,1M de tampão fosfato salino (pH = 7,2) durante uma
hora. A distribuição da radioactividade nas tiras foi analisada utilizando um detector
Berthold LB 505 acoplado ao radiocromatógrafo, para determinar a migração dos
complexos.
Capítulo 4
161
4.4. SÍNTESE DE COMPOSTOS POTENCIALMENTE ÚTEIS PARA IMAGIOLOGIA ÓSSEA
4.4.1. Síntese de Compostos Contendo o Grupo Éster Fosfónico
4.4.1.1. Procedimento Geral para a Síntese de (3-Bromopropil)Fosfonato de Dietilo (1) e de (2-Bromoetil)Fosfonato de Dietilo (2) [113]
Uma mistura constituída por dibromopropano (0,175 mol; 18 ml) ou
dibromoetano (0,058 mol; 5 ml), e trietilfosfito (POEt3; 1: 0,0175 mol, 3 ml; 2: 0,0117
mol; 2 ml) foi refluxada durante duas (1) ou 17 (2) horas. Os compostos pretendidos
foram obtidos após destilação fraccionada e com controlo de temperatura. Este
procedimento permitiu remover o dibromoalcano em excesso, no caso do
dibromoetano destilou aproximadamente entre os 30 e os 40 ᵒC a pressão
atmosférica, o dibromopropano destilou á mesma temperatura, mas com pressão
reduzida. Os compostos pretendidos destilaram-se no fim aproximadamente entre os
70 e os 90 ᵒC a pressão reduzida.
Br(CH2)3P(O)(OEt)2 (1): (2,53 g, η= 56 %)
1H - RMN (CDCl3, δ (ppm)): 4,11 – 4,02 [m, OCH2CH3, 4H]; 3,43 (t, CH2, 2H); 2,14
– 2,06 (m, CH2, 2H); 1,90 – 1,79 (m, CH2, 2H); 1,28 (t, OCH2CH3, 6H).
31P - RMN (CDCl3, δ (ppm)): 31,19.
Br(CH2)2P(O)(OEt)2 (2): (12,00 g; η= 85 %)
1H - RMN (CDCl3, δ (ppm)): 4,12 – 4,00 [m, OCH2CH3, 4H]; 3,52 – 3,44 (m, CH2,
2H); 2,39 – 2,28 (m, CH2, 2H); 1,28 (t, OCH2CH3, 6H).
31P - RMN (CDCl3, δ (ppm)): 26,16.
Procedimento Experimental
162
4.4.1.2. Síntese de t-butil 2-((3-(dietoxifosforil)propil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)etilcarbamato (4) e t-butil 2-((2-(dietoxifosforil)etil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)etilcarbamato (5)
A uma solução de t-butil 2-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-
il)etilamino)etilcarbamate (3) (1,76 g, 6,23 mmol) e 20,40 mmol de (2-
bromoetil)fosfonato de dietilo ou (3-bromopropil)fosfonato de dietilo em acetonitrilo
(40 mL) foram adicionados K2CO3 (1,37 g; 9,91 mmol) e uma quantidade catalítica de
KI. Após refluxo [4: 20 dias, ou 5: 10 dias], as soluções foram filtradas através de Celite,
e adicionaram-se H2O e diclorometano ao filtrado. A fase orgânica foi separada, e a
fase aquosa foi posteriormente extraída (duas vezes) com diclorometano.
As fases orgânicas foram reunidas, secas com MgSO4 anidro e filtradas, e o
solvente foi evaporado até se obter um resíduo viscoso. Este resíduo foi purificado por
cromatografia em coluna de sílica - gel e o produto foi eluído com um gradiente de 8 –
50 % metanol/acetato de etilo e os compostos foram obtidos na forma de óleos
viscosos amarelo pálidos.
4: (0,32 g; 11 %)
1H RMN [CDCl3, δ δ δ δ (ppm)]: 5,75 [s, H(4)pz, 1H]; 5,40 (s largo, NH, 1H); 4,13–3,99
(m, CH2, 6H (OEt + CH2); 3,11 (s largo, CH2, 2H); 2,79 (s largo, CH2, 2H); 2,52 (s
largo, CH2, 4H); 2,22 (s, CH3, 3H); 2,18 (s, CH3, 3H); 1,62 (m, CH2, 4H); 1,40 (s,
CH3 (Boc), 9H); 1,28 (t, CH3 (OEt), 6H).
31P NMR [CDCl3, δδδδ (ppm)]: 33,1.
5: (0,96 g; 35 %).
1H RMN [CD3OD, δ δ δ δ (ppm)]: 5,82 [s, H(4)pz, 1H]; 4,05 (m, CH2 (OEt), 6H); 3,03 (t,
CH2, 2H); 2,81 (t, CH2, 2H); 2,73 (q, CH2, 2H); 2,54 (t, CH2, 2H); 2,27 (s, CH3, 3H);
4 5
Capítulo 4
163
2,16 (s, CH3, 3H); 1,87(m, CH2, 2H); 1,42 (s, CH3 (Boc), 9H); 1,31 (t, CH3 (OEt),
6H). 31P NMR [CD3OD, δδδδ (ppm)]: 32,8.
4.4.1.3. Síntese de 2-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazolo-1-il)etil)amino)etilfosfonato de dietilo (L1)
O grupo protector Boc foi removido por dissolução do composto 5 (0,41 g; 0,92
mmol) em CF3COOH (3 mL), com agitação durante 1 hora à temperatura ambiente.
Após evaporação do solvente, o resíduo foi dissolvido em 30 % de NaOH, e a solução
foi extraída com diclorometano (três vezes). As fracções orgânicas foram reunidas e
secas com MgSO4 anidro, filtrou-se, e o solvente do filtrado foi evaporado na linha de
vazio. O composto foi obtido como um óleo amarelo pálido (0,28 g; 88 %)
1H RMN [CD3OD, δ (δ (δ (δ (ppm)]: 5,82 [s, H(4)pz, 1H]; 4,06 (m, CH2, 6H); 2,78 (m, CH2,
4H); 2,59 (m, CH2, 2H); 2,52 (m, CH2, 2H); 2,26 (s, CH3, 3H); 2,16 (s, CH3, 3H);
1,92 (m, CH2, 2H); 1,32 (t, CH3, 6H).
31P RMN [CD3OD, (ppm)]: 32,8.
IV (KBr, νννν/cm–1): 1553, 1464, 1206 (P=O); 1027, 969, 796.
Tempo de retenção (HPLC de fase reversa, RP-HPLC): 9,5 min.
Procedimento Experimental
164
4.4.2. Síntese de Compostos com um Grupo Ácido Fosfónico
4.4.2.1. Síntese de ácido 2-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-
il)etil)amino)etilfosfónico (L2) e ácido 3-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)propilfosfónico (L3)
A uma solução de 5 (0,21 g; 0,48 mmol) ou 4 (0,10 g, 0,22 mmol) em
diclorometano seco (2 - 3 ml) a 0 ᵒC foi adicionado brometo de trimetilsilano (5: 0,5
mL; 3,6 mmol ou 4: 0,25 ml; 1,8 mmol). Após agitação à temperatura ambiente
durante 72 horas, as misturas reaccionais foram evaporadas e adicionaram-se metanol
e H2O aos resíduos. Após agitação durante 1,5 horas, o solvente foi removido por
evaporação. Os óleos obtidos foram lavados com diclorometano e os compostos
pretendidos foram obtidos na forma de sólidos brancos.
L2: (0,11 g; 50 %)
1H RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 6,03 [s, H(4)pz, 1H]; 4,35 (s largo, CH2, 2H); 3,37 (s
largo, CH2, 2H); 3,19 (m, CH2, 6H); 2,19 (s, CH3, 3H); 2,12 (s, CH3, 3H); 1,86 (m,
CH2, 2H).
13C RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 150,9 [C(3/5)pz]; 146,1 [C(3/5)pz]; 109,5 [C(4)pz]; 55,5
(CH2); 52,3 (CH2); 45,9 (CH2); 37,7 (CH2); 26,8 (CH2); 25,1 (CH2); 14,2 (CH3); 12,7
(CH3).
31P RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 20,3.
Análise de C,H,N (%) para C11H23N4O3P.2HBr:
Calculada: C, 29,22; H, 5,57; N, 12,39.
Experimental: C; 29,42; H; 5,40; N; 12,28.
Tempo de retenção (RP-HPLC): 8,0 min (Nucleosil 100-10 C18; 1 mL/min;
Eluentes: A - solução aquosa de TFA 0,1 %; B - CH3CN).
IV (KBr, νννν/cm–1): 1634, 1629, 1473, 1384, 1258, 1136 (P = O), 1059 (P – OH).
L2 L3
Capítulo 4
165
L3: (47 mg; 46 %)
1H RMN [CD3OD, δ δ δ δ (ppm)]: 6,07 [s, H(4)pz, 1H]; 4,53 (t, JHH = 6,2 MHz, CH2, 2H);
3,66 (t, JHH = 6,3 MHz, CH2, 2H); 3,56 (m, CH2, 2H); 3,45 (m, CH2, 2H); 3,38 (t, JHH
= 7,5 MHz, CH2, 2H); 2,38 (s, CH3, 3H); 2,28 (s, CH3, 3H); 2,06 (m, CH2, 2H); 1,82
(m, CH2, 2H).
31P RMN [CD3OD, δ δ δ δ (ppm)]: 20,6.
4.4.3. Síntese de Compostos com o Grupo Bisfosfonato
4.4.3.1. Síntese de éster 1-aminometileno-1,1-bisfosfonato de tetraetilo (AMDP) [122, 123]
AMDP
A. Síntese do éster N,N – dibenzilamino-1,1-metilenobisfosfonato de tetraetilo (6):
Num balão de duas tubuladuras, em atmosfera de azoto, adicionou-se
trietilortoformato (36 mmol; 6,1 ml), dietilfosfito (93 mmol; 12,3 ml) e dibenzilamina
(30 mmol; 6 ml). A mistura reaccional permanece em refluxo durante 5 horas. O etanol
que se forma durante a reacção remove-se por destilação e, a mistura reaccional
permanece em refluxo durante a noite.
No dia seguinte, a mistura foi arrefecida em banho de gelo e adicionou-se 300
ml de CH2Cl2. A solução resultante foi lavada, primeiro com uma solução de NaOH 2M
(3 x 60 ml) e, depois com uma solução saturada de NaCl (2 x 75 ml). A fracção orgânica
resultante foi seca com Na2SO4, filtrada e o solvente foi removido por evaporação. O
resíduo resultante foi purificado por cromatografia em coluna de sílica gel e eluído
com gradiente (100 – 0 %) de n-hexano/etanol. O produto foi obtido na forma de óleo
(6,2 g; 43 %).
Procedimento Experimental
166
1H RMN [CDCl3, δ δ δ δ (ppm)]: 7,26 (m, 10 H, 2 x C6H5-CH2); 4,10 [m, 8H (OEt) + 4H
(C6H5-CH2)]; 3,54 (t, 1H, N-CH-P, 2JPH = 25 Hz); 1,32 (m, 12 H, OEt).
31P RMN [CDCl3, δ δ δ δ (ppm)]: 20,54.
B. Síntese do éster 1-aminometileno-1,1-bisfosfonato de tetraetilo (AMDP):
Dissolveram-se 200 mg (0,207 mmol) de 6 em 10 ml de etanol. De seguida,
adicionaram-se 0,053 g de Pd/C. Esta mistura permaneceu em agitação e em refluxo
em atmosfera de azoto durante 24 horas. A suspensão foi arrefecida à temperatura
ambiente, filtrada e o catalizador foi lavado com etanol. A solução de lavagem foi
adicionada ao filtrado. O solvente foi removido por evaporação e o AMDP foi obtido
como um óleo castanho claro (124 mg; 99 %).
1H RMN [CDCl3, δ δ δ δ (ppm)]: 4,19 (m, 8H, OEt); 3,43 (t, 1H, N-CH-P, 2JPH = 20,7);
2,25 (s largo, 2H, H2N-CH-P); 1,27 (m, 12 H, OEt).
31P RMN [CDCl3, δ δ δ δ (ppm)]: 20,63.
4.4.3.2. Síntese de 7-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)-13,13-dimetil-
3,11-dioxo-12-oxa-2,7,10-triazatetradecano-1,1-diilbisfosfonato de tetraetilo (8)
A uma solução de ácido 4-((2-(t-butoxicarbonilamino)etil)(2-(3,5-dimetil-1H-
pirazol-1-il)etil)amino)butanóico (7) (0,100 g; 0,27 mmol) e 1-hidroxibenzotriazolo
(HOBt: 0,036 g; 0,27 mmol) em acetonitrilo (20 mL) a 0–5 ᵒC foi adicionada N,N’-
diciclohexilcarbodiimida (DCC: 0,055 g; 0,27 mmol), e a mistura foi agitada durante 30
min. Após adição de 1-amino-1,1-metilenodifosfonato de tetraetilo (0,082 g; 0,27
mmol) dissolvido em acetonitrilo (aproximadamente 1 mL), a agitação manteve-se
N
O
NH
P
P
OEtOEt
OEt
OEt
N
N
NHH(4)pza
fed
cb
hg
O
O
O O
Capítulo 4
167
durante a noite à temperatura ambiente. A DCU que precipitou foi removida por
filtração através de celite, e o filtrado foi evaporado. O resíduo obtido foi purificado
por cromatografia em coluna de sílica - gel, o produto foi eluído com um gradiente de
2,5 – 15 % etanol/diclorometano e o composto foi obtido na forma de óleo viscoso
amarelado (0,10 g, 58%).
1H RMN [CDCl3, δδδδ (ppm)]: 8,73 (d largo, NH, 1H, 3JHH = 9.0); 5,82 [s, H(4)pz, 1H];
5,19 (td, P–CH–P, 1H, 2JPH = 22,2, 3JHH = 10,2); 4,69 (s largo, NH, 1H); 4,24 – 4,00
(m, CH2, 10H); 2,86 (q largo, CH2, 2H); 2,64 (t largo, CH2, 2H); 2,45 (t largo, CH2,
2H); 2,38 (m, CH2, 4H); 2,23 (s, CH3, 3H); 2,21 (s, CH3, 3H); 1,71 (m, CH2, 2H);
1,38 (s, CH3, 9H); 1,26 (m, CH2, 12H).
31P RMN [CDCl3, δδδδ (ppm)]: 17,5.
4.4.3.3. Síntese de ácido (4-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)butanamido)metilenobisfosfónico (L4)
A uma solução do composto 8 (0,068 g; 0,104 mmol) em diclorometano seco (5
mL) a 0 ᵒC foi adicionado gota-a-gota brometo de trimetilsilano (1,5 mL; 11 mmol). A
mistura atingiu a temperatura ambiente a foi agitada durante 72 horas. O solvente foi
evaporado, e adicionou-se metanol (15 ml) ao resíduo. Após agitação durante 1,5
horas, o metanol foi removido por evaporação e o resíduo foi purificado por
precipitação em metanol e adição de éter etílico. O precipitado foi separado por
centrifugação, lavado com éter etílico e seco na linha de vazio obtendo-se o composto
L4 como sólido branco (0,046 g; 73 %).
N
O
NH
P
P
O
O
OHOH
OH
OH
N
N
NH2H(4)pz
afe
d
cb
hg
Procedimento Experimental
168
1H RMN [D2O, δδδδ (ppm)]: 6,07 [s, H(4)pz, 1H]; 4,38 (t, CH, 1H); 3,68–3,07 (m
largo, CH2, 10H); 2,38 (s largo, CH2, 2H); 2,20 (s, CH3, 3H); 2,15 (s, CH3, 3H); 1,94
(s largo, CH2, 2H).
13C RMN [D2O, δδδδ (ppm)]: 175,9 (COOH); 150,1 [C(3/5)pz]; 147,6 [C(3/5)pz];
109,8 [C(4)pz]; 55,5 (CH2); 53,5 (CH2); 49,7 (CH2); 47,9 (CH); 44,4 (CH2); 37,6
(CH2); 34,6 (CH2); 21,6 (CH2); 13,1 (CH3); 12,4 (CH3).
31P RMN [D2O, δδδδ (ppm)]: 13,7.
Análise de C,H,N (%) para C14H29N5O7P2.2HBr:
Calculada: C, 27,88; H, 5,18; N, 11,61.
Experimental: C, 28,25; H, 5,13; N, 11,25.
IV (KBr, νννν/cm–1): 1647 (C=O), 1527, 1154 (P=O), 1064, 915.
4.4.3.4. Síntese de pamidronato (PAM) e alendronato (ALN) [124]:
Num balão de 250 mL de 3 tubuladuras equipado com um condensador de
refluxo e uma ampola de adição, sob atmosfera de azoto, adicionaram-se 4g (38,8
mmol) de ácido 4-aminobutírico, 3,2 g (38,8 mmol) de H3PO3 e 16 mL de ácido
metanosulfónico. A mistura foi aquecida a 65 ᵒC durante alguns minutos e adicionou-
se PCl3 gota-a-gota durante aproximadamente 30 min. A mistura manteve-se a 65 ᵒC
durante a noite.
No dia seguinte a mistura arrefeceu até à temperature ambiente. Adicionaram-
se 40 ml de H2O arrefecida a 0 – 5 ᵒC, com agitação vigorosa. Adicionaram-se mais 20
ml de H2O destilada e refluxou-se durante 5 h. Ao fim desse tempo arrefeceu-se a
mistura reaccional até à temperatura ambiente e ajustou-se o pH até 4-5 com adição
de uma solução aquosa de NaOH (50%). A mistura reaccional ficou durante a noite no
Pamidronato Alendronato
Capítulo 4
169
congelador, e no dia seguinte separou-se o composto sob a forma de precipitado
branco lavado com 2x10 ml de H2O e 20 ml de etanol.
Pamidronato (pH = 4 – 5): (5,63 g, η= 50 %)
1H - RMN (D2O, δ (ppm)): 3,18 [t, CH2a, 2H], 2,14 (m, CH2
b, 2H).
31P - RMN (D2O, δ (ppm)): 17,52.
13C – RMN (D2O, δ (ppm): 72,3 (t, JC-P = 148 Hz, Cc), 36,70 (t, JC-P = 8 Hz, Cb),
30,69 (s, Ca).
Análise elementar C,H,N (%) para C3H10NNaO7P2.1H2O:
Calculada: C 13,10 %; H 4,40 %; N 5,09 %.
Experimental: C 13,70 %; H 4,75 %; N 5,31 %.
Alendronato (pH = 4 – 5): (11,00 g, η= 87 %)
1H - RMN (D2O, δ (ppm)): 2,88 [s largo, CH2a, 2H], 1,85 (s largo, CH2
b, CH2c, 4H).
31P - RMN (D2O, δ (ppm)): 18.14.
13C – RMN (D2O, δ (ppm): 75,5 (Cd-OH, t, JC-P = 135 Hz), 41,9 (s, CH2a), 32,5 (s,
CH2b), 24,2 (t, JC-P = 7 Hz, CH2
c-COH).
Análise elementar C,H,N (%) para C4H10NNa3O7P2.4H2O:
Calculada: C 14,78 %; H 5,58 %; N 4,31 %.
Experimental: C 14,79 %; H 7,23 %; N 4,50 %.
Procedimento Experimental
170
4.4.3.5. Síntese de ácido 8-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)-16-hidroxi-2,2-dimetil-4,12-dioxo-3-oxa-5,8,13-triazahexadecane-16,16-diilbisfosfónico (10)
A uma solução de ácido 4-((2-(t-butoxicarbonilamino)etil)(2-(3,5-dimetil-1H-
pirazol-1-il)etil)amino)butanóico (7) (0,200 g; 0,54 mmol) e N-hidroxisuccinimida (NHS)
(0,075 g; 0,65 mmol) em diclorometano seco (4 mL) foi adicionada gota – a – gota
N,N’-diciclohexilcarbodiimida (DCC; 0,134 g; 0,65 mmol) à temperatura ambiente, e a
mistura reaccional foi agitada durante 5 horas. A N,N’-diciclohexilureia (DCU) que
precipitou foi removida por filtração e o solvente do filtrado evaporado. O resíduo
obtido foi dissolvido em acetonitrilo (3,5 ml) e usado na reacção seguinte sem mais
purificação. A solução de acetonitrilo foi adicionada gota – a – gota a uma solução de
PAM (0,209 g; 0,82 mmol) em água (150 µl) e trietilamina (3,5 ml). A mistura
reaccional foi agitada à temperatura ambiente e após 24 horas, o PAM que não reagiu
foi separado por centrifugação. O solvente do sobrenadante foi evaporado e o resíduo
foi purificado por cromatografia em coluna de sílica - gel, o produto foi eluído com
CH2Cl2, gradiente de 10 – 100 % metanol/CHCl3 e gradiente de 25 – 100 % amónia
aquosa/metanol para remoção de reagentes de partida e DCU. O composto 10 foi
obtido na forma de óleo viscoso incolor (0,070 g, 22 %).
1H RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 5,82 [s, H(4)pz, 1H]; 4,07 (s br, CH2, 2H); 3,32 (t, CH2,
2H); 3,12 (m, CH2, 2H); 2,76 (m sobreposto, CH2, 4H); 2,24 (m, CH2, 2H); 2,11 (m
sobreposto, CH2 e CH3, 5H); 2,02 (m sobreposto, CH2 e CH3, 5H); 1,69 (m, CH2,
2H); 1,25 (s, CH3, 9H).
31P RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 18,3.
Capítulo 4
171
4.4.3.6. Síntese de ácido 3-(4-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)butanamido)-1-hidroxipropane-1,1-diilbisfosfónico (L5)
Uma solução do composto 10 (0,070 g; 0,12 mmol) em CF3COOH (2 mL) foi
agitada durante 1 hora à temperatura ambiente. Após evaporação do solvente, o
resíduo foi dissolvido em água (1 ml) e purificado por cromatografia utilizando uma
resina de troca catiónica fortemente acídica (Dowex 50 × 4, a eluição foi efectuada
com água, seguida de uma solução aquosa com 10% de piridina). Após evaporação dos
solventes, o resíduo obtido foi dissolvido em água e purificado por cromatografia com
uma resina de troca catiónica fracamente acídica (Amberlite CG50, a eluição foi
efectuada com água) para remover a piridina. O produto L5 foi obtido na forma de
óleo incolor (0,0176 g, 30 %).
1H RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 5,88 [s, H(4)pz, 1H]; 4,21 (t, CH2a, 2H); 3,34 (m
sobreposto, CH2b e CH2
h, 4H); 3,19 (m sobreposto, CH2c e CH2
d, 4H); 2,92 (t,
CH2g, 2H); 2,19 (t, CH2
e, 2H); 2,14 (s, CH3pz, 3H); 2,04 (s, CH3 pz, 3H); 1,99 (m,
CH2i, 2H); 1,76 (m, CH2
f, 2H).
13C RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 176,5 (C=O); 151,6 [C(3/5)pz]; 144,1 [C(3/5)pz]; 108,2
[C(4)pz]; 74,85 (Cj); 55,30 (Cg); 54,34 (Cb); 52,07 (Cc); 45,13 (Ca); 37,48 (Ch);
36,79 (Cd); 34,74 (Ce + Ci); 22,0 (Cf); 14,2 (CH3pz); 12,0 (CH3pz).
31P RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 18,2.
ESI-MS [+]: valor calculado para C16H34N5O8P2 [M + H]+ 486,2; valor
experimental 486,0. Valor calculado para C16H33N5NaO8P2 [M + Na]+ 508,2;
valor experimental 507,9. Valor calculado para C16H33N5KO8P2 [M + K]+ 524,2;
Procedimento Experimental
172
valor experimental 523,9. ESI-MS [-]: valor calculado para C16H32N5O8P2 [M - H]-
484,2; valor experimental 484,1.
4.4.3.7. Síntese de ácido 8-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)-17-hidroxi-2,2-dimetil-4,12-dioxo-3-oxa-5,8,13-triazaheptadecano-17,17-diilbisfosfónico (11)
Uma solução de ALN (0,092 g; 0,283 mmol) e 4-metilmorfolina (NMM; 190 µl;
1,74 mmol) em H2O (5 mL) foi adicionada gota – a – gota a uma solução de ácido 4-((2-
(t-butoxicarbonilamino)etil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)butanóico (7)
(0,064 g; 0,174 mmol), 1-Hidroxibenzotriazolo hidratado (HOBt; 0,070 g; 0,521 mmol) e
O-Benzotriazol-N,N,N’,N’-tetrametiluronio-hexafluoro fosfato (HBTU; 0,198 g; 0,521
mmol) em N,N-dimetilformamida (5 mL). O pH final foi ajustado até 8 com adição de
NMM (95 µl; 0,87 mmol). A mistura reaccional foi agitada à temperature ambiente
durante 5 dias e no final separou-se por centrifugação o Alendronato livre na forma de
um sólido branco. O solvente do sobrenadante foi evaporado na linha de vazio e o
resíduo foi dissolvido em H2O (2 mL), precipitando material de partida em excesso
(HOBt/HBTU) na forma de cristais finos. O precipitado foi separado por filtração e o
filtrado foi purificado utilizando um cartucho Sep – Pak C18 (Waters, 12 cc, 2 g) pré –
condicionado com metanol e água. Após a lavagem do cartucho com água, o composto
11 e algum material de partida foram eluídos com 50 % de metanol/água. Depois de
remover o solvente, o resíduo obtido foi posteriormente purificado numa coluna de
sílica gel e eluido com a) diclorometano, b) gradiente de 10 – 100 %
metanol/clorofórmio e c) gradiente de 25 – 100 % solução aquosa de amónia
concentrada/metanol, obtendo-se o composto 11 na forma de óleo incolor (0,012 g;
12 %).
Capítulo 4
173
1H RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 5,84 [s, H(4)pz, 1H]; 4,07 (t, CH2a, 2H); 3,09 (m
sobreposto, CH2, 6H); 2,78 (t, CH2, 2H); 2,68 (t, CH2g, 2H); 2,14 (m sobreposto,
CH2e + CH3, 5H); 2,04 (s, CH3pz, 3H); 1,74 (m sobreposto, CH2, 6H); 1,28 (s, CH3
(BOC), 9H).
31P RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 18,6.
13C RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 177,4 (C=O); 160,08 (C=O, BOC); 151,2 [C(3/5)pz];
143,7 [C(3/5)pz]; 107,4 [C(4)pz]; 83,2 (C - OH); 54,5 (sinais sobrepostos CH2c,
CH2d, CH2
g); 46,1 (CH2a); 42,2 (CH2); 38,7 (CH2); 35,0 (CH2
e); 33,3 (CH2); 29,6
(CH3, BOC); 25,5 (CH2); 23,3(CH2); 14,2 (CH3pz); 12,1 (CH3pz).
4.4.3.8. Síntese de ácido 4-(4-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)butanamido)-1-hidroxibutano-1,1-bisfosfónico (L6)
Uma solução do composto intermediário 11 (0,012 g; 0,020 mmol) em
CF3COOH (2 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. De seguida, o
solvente foi evaporado e o resíduo resultante foi dissolvido em água (5 mL) e
neutralizado com NaOH 0,1 M. O volume da solução obtida foi concentrado até 1 mL e
purificado num cartucho Sep Pak C18 (Waters, 12 cc, 2 g) pré-condicionado. Os
primeiros 2 mL eluídos, contendo principalmente sais de CF3COONa, foram eliminados,
e o composto L6 foi eluído com H2O (4 mL) (0,004 g; 40 %).
1H RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 5,79 [s, H(4)pz, 1H]; 3,92 (t, CH2a, 2H); 3,04 (m, CH2,
2H); 2,72 (m sobreposto, CH2, 4H); 2,51 (m, CH2, 2H); 2,36 (m, CH2, 2H); 2,11 (s,
CH3pz, 3H); 2,01 (m sobreposto, CH2e + CH3, 5H); 1,66 (m sobreposto, CH2, 6H).
31P RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 18,3.
Procedimento Experimental
174
ESI-MS [-] m/z: valor calculado para C17H35N5O8P2 [M]- 499,2; valor observado
499,3. Valor calculado para C17H33N5O8P2 [M - 2H]2- 448,6; valor observado
449,1. Valor calculado para C17H34N5NaO8P2 [M - H + Na]- 521,2, valor
observado 521,3.
4.4.4. Síntese de Derivados do Ácido Glutâmico e da ββββ-alanina
4.4.4.1. Síntese de ácido 5-(benziloxi)-2-ftalimida-5-oxopentanóico (13)
O ácido 2-amino-5-(benziloxi)-5-oxopentanoico (12: 1,64 g; 6,9 mmol) e o
reagente N-(etoxicarbonil)ftalimida (1,515 g; 6,9 mmol) foram suspendidos em
acetonitrilo seco e em atmosfera de azoto, na presença de NaHCO3 (0,697 g; 8,3
mmol). A mistura reaccional permaneceu em agitação e em refluxo durante 18 h. A
mistura reaccional foi evaporada e o resíduo foi purifacado por cromatografia em
coluna de sílica gel, com um gradiente de 5 - 10 % de metanol/clorofórmio. O
composto 13 foi obtido na forma de óleo incolor (1,73 g; 68 %).
1H RMN [CDCl3, δ δ δ δ (ppm)]: 7,66 (s largo, Ftalimida, 2H); 7,51 (s largo, Ftalimida,
2H); 7,23 (s largo, C6H5, 5H); 4,91 (s largo, CH2f); 4,07 (s largo, CHb, 1H); 2,34 (m,
CH2c + CH2
d, 4H).
1H RMN [CD3OD, δ δ δ δ (ppm)]: 7,79 (m, Ftalimida, 4H); 7,30 (s largo, C6H5, 5H); 4,97
(s, CH2f, 2H); 4,73 (q, CHb, 1H); 2,49 (m, CH2
c + CH2
d, 4H).
13C RMN [CD3OD, δ δ δ δ (ppm)]: 175,56 (Ca); 174,31 (Ce); 169,68 (Ck); 137,40 (Cg);
135,48 (Cn); 133,31 (Cm); 129,49; 128,14 (Ch + Ci + Cj); 124,22 (Cl); 67,35 (Cf);
54,14 (Cb); 32,35 (Cd); 25,67 (Cc).
IV (KBr, νννν/cm–1): 2021, 1900, 1714, 1609, 1390, 1172, 1114, 722.
ESI- MS m/z (-): valor calculado para C20H17NO6 [M-H]- 366,1; valor observado
365,9.
Capítulo 4
175
4.4.4.2. Síntese de 5,5-bis(dietoxifosforil)-4-ftalimida-5-hidroxipentanoato de benzilo (16) [165]
Uma mistura do composto 13 (0,095; 1,20 mmol) em SOCl2 (9 ml; 0,12 mol) foi
agitada à temperatura ambiente durante 18 h. O excesso do SOCl2 foi evaporado na
linha de vazio, adicionou-se tolueno seco e o solvente foi evaporado a pressão
reduzida. O produto foi utilizado na reacção seguinte sem mais purificação. O
rendimento foi quantitativo com base na análise por RMN.
(14): 1H RMN [CDCl3, δ δ δ δ (ppm)]: 7,88 (m, Ftalimida, 2H); 7,80 (m, Ftalimida, 2H); 7,34
(m, C6H5, 5H); 5,15 (q, CHα, 1H); 5,05 (s, CH2-C6H5, 2H); 2,67 (m, CH2, 1H); 2,64
(m, CH2, 1H); 2,43 (m, CH2, 2H).
13C RMN [CDCl3, δ δ δ δ (ppm)]: 171,50 (Ca); 171,20 (Ce); 166,82 (Ck); 135,43 (Cg);
134,74 (Cn); 131,41 (Cm); 128,59; 128,39; 128,35 (Ch + Ci + Cj); 124,04 (Cl); 66,76
(Cf); 59,39 (Cb); 30,25 (Cd); 24,30 (Cc).
Adicionou-se trietilfosfito (206 µl; 1,2 mmol) a uma solução arrefecida em
banho de gelo do composto 14 em tolueno seco (ca. 1 ml) e em atmosfera de azoto,
mantendo a mistura arrefecida a 0 °C. Após duas horas de reacção adiciona-se
dietilfosfito (0,15 ml; 1,2 mmol) e adiciona-se gota-a-gota trietilamina (168 µl; 1,2
mmol), mantendo a mistura arrefecida em banho de gelo. Depois de 3 h, o tolueno foi
evaporado na linha de vazio. O bisfosfonato pretendido foi purificado por
cromatografia em coluna de sílica gel, com gradiente de 0 - 3 % metanol/clorofórmio,
seguida de cromatografia por RP-HPLC em coluna semi-preparativa, utilizando um
sistema isocrático, 55 % A; 45 % B; A - solução aquosa com 0,1 % de ácido fórmico; B -
solução de 0,1 % de ácido fórmico em acetonitrilo (299 mg; 40 %).
Procedimento Experimental
176
Bisfosfonato (16):
1H RMN [CDCl3, δ δ δ δ (ppm)]: 7,80 (m, Ftalimida, 2H); 7,70 (m, Ftalimida, 2H); 7,27
(m, C6H5, 5H); 5,53 (d, 3JPH = 28 Hz, C-OH, 1H); 4,94 (m sobrepostos, CHb + CH2f,
3H); 4,30 (m, CH2 (OEt), 4H); 4,14 (m, CH2 (OEt), 2H); 4,97 (m, CH2 (OEt), 2H);
2,93 (m, CHc, 1H); 2,55 (m, CHc, 1H); 2,31 (m, CHd, 2H); 1,36 (t, CH3 (OEt), 6H);
1,16 (m, CH3 (OEt), 6H).
31P RMN [CDCl3, δ δ δ δ (ppm)]: 17,44 (d, J = 14,5 Hz); 16,91 (d, J = 14,5).
13C RMN [CDCl3, δ δ δ δ (ppm)]: 172,11 e 171,85 (Ca + Ce); 166,75 (Ck); 135,65 (Cg);
134,34 (Cn); 131,76 (Cm); 128,45; 128,20; 128,15 (Ch + Ci + Cj); 123,61 (Cl); 66,34
(Cf); 64,30 [2 x CH2 (OEt), J=7 Hz]; 64,05 [CH2 (OEt), J=7 Hz]; 64,33 [CH2 (OEt), J =
7 Hz]; 54,08 (Cb, J = 8 Hz); 31,40 (Cd); 22,38 (Cc, J = 7 Hz); 16,40 [m sobrepostos
3xCH3 (OEt)]; 16,05 [d, CH3 (OEt), J = 6 Hz].
Fosfato-fosfonato (17):
1H RMN [CDCl3, δ δ δ δ (ppm)]: 7,81 (m, Ftalimida, 2H); 7,68 (m, Ftalimida, 2H); 7,28
(m, C6H5, 5H); 5,21 (m, CHa, 1H); 4,98 (s, CH2f, 2H); 4,65 (m, CHb, 1H); 4,23 (m,
CH2 (OEt), 4H); 4,16 (m, CH2 (OEt), 2H); 3,74 (m, CH2 (OEt), 2H); 2,51 (m, CH2d,
2H); 2,31 (t, CH2d, 2H); 1,35 (t, CH3 (OEt), 6H); 1,19 (t, CH3 (OEt), 3H); 0,9 (t, CH3
(OEt), 3H).
31P RMN [CDCl3, δ δ δ δ (ppm)]: 17,25 (d, J = 15,8 Hz); -0,891 (d, J = 15,9).
13C RMN [CDCl3, δ δ δ δ (ppm)]: 171,84 (Ca + Ce); 168,15 (Ck); 135,65 (Cg); 133,97 (Cn);
131,92 (Cm); 128,50; 128,28; 128,20 (Ch + Ci + Cj); 123,22 (Cl); 66,45 (Cf); 64,24
[m, 2 x CH2 (OEt)]; 63,64 [m, 2 x CH2 (OEt)]; 51,87 (m, Cb); 31,07 (Cd); 22,92 (Cc);
16,32 [m sobrepostos 2xCH3 (OEt)]; 15,92 [d, CH3 (OEt), J = 7 Hz]; 15,53 [d, CH3
(OEt), J = 7 Hz].
Capítulo 4
177
4.4.4.3. Síntese de ácido 4-amino-5-hidroxi-5,5-bisfosfonopentanoico (18)
O composto 16 (80 mg; 0,13 mmol) foi suspendido em HCl 6N e refluxado
durante 18 h. O ácido ftálico que precipita foi removido por filtração. O solvente do
filtrado foi evaporado e foi dissolvido numa pequena quantidade de água. Foi
adicionada a esta solução uma solução aquosa de NaOH 5N, até atingir o pH próximo
de 4. O composto foi obtido impuro, na presença dos compostos 19 e 20 (esquema
2.13).
ESI-MS [-] m/z: valor calculado para C5H13NO8P2 [M-H]- 292,0; valor observado 291,9.
4.4.4.4. Síntese de ácido 12-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)-18,18-dimetil-3,8,16-trioxo-1-fenil-2,17-dioxo-7,12,15-triazanonadecano-6-carboxílico (21)
Dissolveu-se o ácido 4-((2-(t-butoxicarbonilamino)etil)(2-(3,5-dimetil-1H-
pirazol-1-il)etil)amino)butanoico (7: 0,092 g; 0,25 mmol) e N-hidroxisuccinimida (NHS:
0,029 g; 0,25 mmol) em diclorometano seco (5 ml) e adicionou-se gota-a-gota uma
solução de N,N’-Diciclohexilcarbodiimida (DCC: 0,062 g; 0,30 mmol) em diclorometano
seco (1 ml). A mistura reagiu com agitação à temperatura ambiente, durante 18 h. A
DCU que precipitou foi removida por filtração e o solvente do filtrado evaporado. O
resíduo obtido foi dissolvido em N,N-dimetilformamida (3 ml) e usado na reacção
seguinte sem mais purificação. Esta solução foi adicionada gota – a – gota a uma
Procedimento Experimental
178
suspensão arrefecida de ácido 2-amino-5-(benziloxi)-5-oxopentanoico (0,113 g; 0,475
mmol) previamente suspendido numa mistura de DMF (6 ml), H2O (2 ml) e trietilamina
(73 µl). Após 24 horas esta mistura reaccional estava quase totalmente solúvel. O
solvente da mistura foi evaporado a pressão reduzida e o resíduo foi purificado por
cromatografia em coluna de sílica - gel, através da eluição com um gradiente de 5 - 50
% de metanol/diclorometano (0,110 g; 75 %).
1H RMN [CD3OD, δ δ δ δ (ppm)]: 7,31 (m, C6H5, 5H); 5,80 [s, H(4)pz, 1H]; 5,08 (CH2n,
2H); 4,27 (q, CH2i, 1H); 4,02 (t, CH2
a, 2H); 3,03 (t, CH2d, 4H); 2,81 (t, CH2
b, 2H);
2,53 (m, CH2c + CH2
g, 4H); 2,42 (t, CH2l, 2H); 2,19 (m sobreposto, CH2
e + CHk, 3H);
2,24 (s, CH3pz, 3H); 2,14 (s, CH3 pz, 3H); 1,96 (m, CHk, 1H); 1,69 (m, CH2f, 2H);
1,40 (s, CH3, 9H).
13C RMN [CD3OD, δ δ δ δ (ppm)]: 178,5; 175,4 (Cj + Ch); 174,6 (Cm); 158,3 (C = O,
Boc); 148,7 [C(3/5)pz]; 141,4 [C(3/5)pz]; 137,6 (Co); 129,5; 129,2; 129,1 (Cp + Cq
+ Cr); 106,1 [C(4)pz]; 80,1 [C(Boc)]; 67,3 (Cn); 55,2 (Cb); 54,9 (Cc); 54,6 (Cg); 54,6
(Ci); 47,5 (Ca); 39,3 (Cd); 34,4 (Ce); 31,8 (Cl); 28,9 (Ck); 28,8 [CH3(Boc)]; 24,2 (Cf);
13,3 (CH3pz); 11,2 (CH3pz).
4.4.4.5. Síntese de 3-amino-1-hidroxypropano-1,1-diilbisfosfonato de tetrametilo (Me-PAM)
Após a dissolução de β-alanina (0,294 g; 3,3 mmol) numa solução aquosa de
ácido clorídrico 1N a solução permaneceu em agitação durante 2h. O solvente foi
evaporado, o resíduo foi dissolvido em tolueno seco e voltou-se a evaporar o solvente.
Este procedimento repetiu-se três vezes para remover o excesso de ácido e água. O
produto obtido (22) foi utilizado na reacção seguinte sem mais purificação.
(22): 1H RMN [CD3OD, δ δ δ δ (ppm)]: 3,18 (t, CH2, 2H); 2,72 (t, CH2, 2H).
Capítulo 4
179
O produto obtido anteriormente foi dissolvido em tolueno (4 ml) e adicionou-se
SOCl2 (1,5 ml; 0,020 mol). A mistura foi agitada com aquecimento a 50 °C, durante 24
h. O excesso do SOCl2 e o solvente foram evaporados na linha de vazio, adicionou-se
tolueno seco e o solvente foi evaporado novamente a pressão reduzida. O produto
obtido (23) foi utilizado na reacção seguinte sem mais purificação.
Adicionou-se trimetilfosfito (870 µl; 7,4 mmol) a uma solução arrefecida em
banho de gelo do composto 23 em tolueno seco (ca. 2 ml) e em atmosfera de azoto,
mantendo a mistura arrefecida a 0 °C. Após duas 30 min de reacção adiciona-se
dimetilfosfito (676 µl; 7,4 mmol), mantendo a mistura arrefecida em banho de gelo.
Depois de 30 min, o tolueno foi evaporado na linha de vazio. O bisfosfonato
pretendido foi obtido após purificação por cromatografia em coluna de sílica gel e
eluição com uma mistura de acetato de etilo: n-butanol: i-propanol: H2O: ácido acético
a) 4:1:1:1:0,3 e b)4:1,1:0,9:2:1,1. O Me-PAM foi obtido na forma de óleo, com ácido
acético em contra-ião, de acordo com a análise de RMN (0,464 g, 40 %).
1H RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 3,76 (m, CH3, 12H); 3,15 (t, CH2, 2H); 2,24 (m, CH2, 2H);
1,86 (s, CH3 (ácido acético), 3H).
31P RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 21,69.
13C RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 180,44 [C=O (CH3COO-)]; 74,73 (C-OH, J = 157,5 Hz);
57,07 (m, 4 x C(OCH3); 36,94 (CH2); 32,60 (CH2); 23,48 [CH3 (CH3COO-)].
4.4.4.6. Síntese de ácido 4-(5-(benziloxi)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-oxopentanamido)-1-hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (24)
A uma solução de (ácido 5-(benziloxi)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-
oxopentanoico) (OBz-Glu-Boc: 0,200 g; 0,592 mmol) e tetrafluorofenol (TFF: 0,216 g;
1,30 mmol) em diclorometano seco (10 mL) a 0 – 5 ᵒC foi adicionada gota-a-gota uma
solução de DCC (0,270 g; 1,30 mmol) previamente dissolvida em 5 ml de
diclorometano.
Procedimento Experimental
180
Após alguns minutos a mistura reaccional começa a turvar devido à
precipitação de DCU. A mistura fica em agitação à temperatura ambiente durante 14 h.
A DCU é removida por filtração e o filtrado seca-se e dissolve-se novamente em
acetato de etilo para a precipitação de mais DCU. A suspensão filtra-se, o filtrado seca-
se na linha de vazio e o éster activado obtido utiliza-se na próxima reacção sem mais
purificação.
O resíduo obtido foi dissolvido em acetonitrilo (20 ml), filtrado para eliminar a
DCU residual e adicionado a uma mistura de alendronato, na forma de sal de trisódio
tetrahidratado (ALN; 0,156 g; 0,592 mmol) e trietilamina (NEt3: 0,414 ml, 2,96 mmol, 5
eq.) em 16 mL de tampão borato (pH 9,4). A mistura reaccional ficou em suspensão e
adicionaram-se mais 100 µl de NEt3 que facilitou ligeiramente a dissolução do
alendronato. O pH final era próximo de 10. A reacção decorreu com agitação à
temperatura ambiente e após 3 dias o solvente da mistura foi evaporado na linha de
vazio.
O resíduo foi extraído com H2O e, após remoção do solvente do sobrenadante,
na linha de vazio, o resíduo foi lavado com clorofórmio para remover uma parte do
trietilamónio. O resíduo obtido após lavagem foi seco e dissolvido em 10 ml de água. A
purificação fez-se utilizando cartuchos Sep-Pak C18 (Waters, 12 cc, 2 g), por aplicação
de 2 ml da solução anterior, lavagem do cartucho com 20 ml de H2O extracção com
uma solução de 25% de metanol/H2O (20 ml). Após repetição deste procedimento
cinco vezes obteve-se o composto 24 puro (0,215 g; 64 %). (0,215 g; 64 %).
1H RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 7,27 (m, C6H5, 5H); 4,99 (s, CH2j, 2H); 3,83 (m, CHf, 1H);
3,06 (m, CH2d, 2H); 2,35 (t, CH2
h, 2H); 1,96 (m, CHg, 1H); 1,72 (m sobreposto,
CH2c +CH2
b + CHg, 5H); 1,25 (s, CH3 (Boc), 9H).
31P RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 18,63.
13C RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 176,9; 176,1 (Ce + Ci); 159,3 (C = O, Boc); 137,5 (Ck);
130,9; 130,6; 130,3 (Cl + Cm + Cn); 83,5 [C(Boc)]; 75,8 (t, JCP = 131 Hz, Ca); 69,1
(Cj); 56,1 (Cf); 42,2 (Cd); 33,2 (Cc); 32,4 (Ch); 29,6 [CH3(Boc)]; 28,6 (Cg); 25,6 (t, JCP
= 7 Hz, Cb).
Capítulo 4
181
4.4.4.7. Síntese de ácido 4-(5-(benziloxi)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-oxopentanamido)-1-hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (25)
Após dissolução do composto 24 (0,030 g; 53 µmol) em água, adicionou-se uma
solução aquosa de NaOH 1N até atingir o pH 11-12. A mistura permanece em agitação
à temperatura ambiente durante 30 min. O solvente da mistura reaccional foi
concentrado até 1 ml e a solução foi aplicada num cartucho Sep-Pak C18 (Waters, 0,85
cc/360 mg) para remover os sais. O produto obtido foi utilizado na reacção seguinte
sem mais purificação. O rendimento foi quantitativo com base na análise por RMN.
1H RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 3,78 (m largo, CH2f, 1H); 3,07 (m largo, CHd, 2H); 2,09
(m largo, CH2h, 2H); 1,7 (m largo, CH2
c + CH2b + CH2
g, 6H); 1,26 (s, CH3 (Boc), 9H).
31P RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 18,82.
4.4.4.8. Síntese de ácido 16-(terc-butoxicarbonilamino)-8-(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)-22-hidroxi-2,2-dimetil-4,13,17-trioxo-3-oxa-5,8,12,18-tetraazadocosano-22,22-diilbisfosfónico (27)
Uma suspensão do composto 25 (0,052 g; 0,108 mmol) e 4-metilmorfolina
(NMM; 59 µl; 0,54 mmol) em H2O (2 mL) foi adicionada gota – a – gota a uma solução
NNH
O
N
N O
NH
NH
O
NH
O
P OH
P
OHO
OH
OH
OHO
O O
a
fe
dcb
hg
i
jk l
mno
p
Procedimento Experimental
182
de terc-butil 2-((3-aminopropil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)etilcarbamato
(26) (0,073 g; 0,215 mmol), 1-Hidroxibenzotriazolo hidratado (HOBt; 0,045 g; 0,333
mmol) e O-Benzotriazol-N,N,N’,N’-tetrametiluronio-hexafluoro fosfato (HBTU; 0,122 g;
0,322 mmol) em N,N-dimetilformamida (2 mL). O pH final foi ajustado até 8 com
adição de NMM (59 µl; 0,54 mmol). A mistura reaccional foi agitada à temperatura
ambiente durante 5 dias e no final evaporou-se o solvente da mistura reaccional e
extraiu-se o produto com água. O solvente do sobrenadante foi concentrado até
aproximadamente 2 ml e foi aplicado num cartucho Sep – Pak C18 (Waters, 12 cc, 2 g)
previamente condicionado com metanol e água. Depois de lavar com água (25 ml), o
composto 27 e algum material de partida foram eluidos com 50 % de metanol/água
(30 ml). Depois de evaporado o solvente, metade do resíduo (ca. 38 mg) foi aplicado
num cartucho HLB C18 (Oasis, 12 cc, 500 mg) pré – condicionado com metanol e água
e eluído com 25 ml de água. Repetiu-se este procedimento para purificar o restante
resíduo e obteve-se o composto 27 na forma de óleo incolor (0,020 g; 23 %).
1H RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 5,92 [s, H(4)pz, 1H]; 4,32 (t largo, CH2a, 2H); 3,78 (m
largo, CH2k, 1H); 3,51 (t largo, CHb, 2H); 3,30 (m largo, CH2
d, 2H); 3,25 (m largo,
CH2i, 2H); 3,12 (m largo, CH2
c + CH2g + CH2
m, 6H); 2,19 (m, CH2e, 2H); 2,17 (s,
CH3pz, 3H); 2,07 (s, CH3pz, 3H); 1,76 - 1,68 (m sobrepostos, CH2f + CH2
j + CH2o +
CH2n, 8H); 1,24 (s, CH3 (Boc), 9H).
31P RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 18,58.
13C RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 177,2; 176,0 (Ch + Cl); 160,2; 159,3 (2 x C=O, Boc);
151,4 [C(3/5)pz]; 144,6 [C(3/5)pz]; 108,4 [C(4)pz]; 83,7 [C(Boc)]; 75,5 (t, JCP =
121 Hz, Cp); 56,3 (CHk); 54,7 (CH2b); 54,4 (CH2); 53,2 (CH2); 43,6 (CH2
a); 41,8
(CH2); 38,0 (CH2); 37,2 (CH2); 33,7 (CH2); 33,0 (CH2); 31,7 (CH2); 29,5 [CH2+
CH3(Boc)]; 25,4 (CH2o); 14,3 (CH3pz); 11,9 (CH3pz).
ESI-MS m/z (-): valor calculado para C31H59N7O13P2 [M-H]- 798,3; valor
observado 798,3.
Capítulo 4
183
4.4.4.9. Síntese de ácido 4-(2-amino-5-(3-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)propilamino)-5-oxopentanamido)-1-hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (L7)
Uma solução do composto intermediário 27 (0,020 g; 0,025 mmol) em
CF3COOH (2 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. De seguida, o
solvente foi evaporado e o resíduo resultante foi dissolvido em água (5 mL) e
neutralizado com NaOH 0,1 M. O volume da solução obtida foi concentrado até 1 mL e
purificado num cartucho Sep Pak C18 (Waters, 12 cc, 2 g) pré-condicionado. Os
primeiros 2 mL eluídos, contendo principalmente sais de CF3COONa, foram eliminados,
e o composto L6 foi eluído com H2O (4 mL) (5,2 mg; 70 %).
1H RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 5,82 [s, H(4)pz, 1H]; 3,93 (t largo, CH2a, 2H); 3,21 (t, CH,
1H); 3,09 (t largo, CHb, 2H); 2,95 (m, CH2, 2H); 2,74 (m largo, CH2, 6H); 2,59 (m,
CH2, 2H); 2,36 (m, CH2, 2H); 2,12 (s, CH2e+ CH3pz, 3H); 2,02 (s, CH3pz, 3H); 1,74
(m sobrepostos, CH2, 4H); 1,46 (m, CH2, 2H).
31P RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 18,74.
NNH2
N
N
NH
NH
O
NH2
O
P OH
P
OHO
OH
OH
OHO
a
fe
dcb
hg
i
jk l
mno
p
Procedimento Experimental
184
4.4.4.10. Síntese de ácido 4-(2-amino-5-(benziloxi)-5-oxopentanamido)-1-
hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (28)
Uma solução do composto 24 (0,028 g; 50 µmol) em CF3COOH (1 mL) foi
agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. De seguida, o solvente foi evaporado
e o resíduo resultante foi dissolvido em água (5 mL). Esta solução foi arrefecida em
banho de gelo (0 °C) e adicionou-se NaOH 0,1 M até pH 6-7, com agitação vigorosa. O
solvente foi evaporado e o resíduo foi lavado com clorofórmio. O resíduo insolúvel foi
seco, dissolvido em água (1 ml) e purificado com três cartuchos Sep Pak C18 (Waters,
0,85 cc/360 mg) pré-condicionados. Os primeiros 3 mL eluídos, contendo
principalmente sais de CF3COONa, foram eliminados, e o composto L6 foi eluído com
H2O (8 mL) (22,5 mg; 96 %).
1H RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 7,29 (m, C6H5, 5H); 5,02 (s, CH2j, 2H); 3,80 (t, CHf, 1H);
3,23 (m, CH2d, 1H); 2,90 (m, CH2
d’, 1H); 2,42 (t, CH2h, 2H); 2,01 (q, CHg, 2H); 1,70
(m sobreposto, CH2c +CH2
b, 4H).
31P RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 18,50.
13C RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 175,9; 171,1 (Ce + Ci); 137,4 (Ck); 130,8; 130,7; 130,4
(Cl + Cm + Cn); 75,8 (t, JCP = 132 Hz, Ca); 69,3 (Cj); 54,7 (Cf); 42,0 (Cd); 33,0 (Cc);
31,4 (Ch); 27,5 (Cg); 25,4 (t, JCP = 7 Hz, Cb).
Capítulo 4
185
4.4.4.11. Síntese de 2’-sulfo-NHS-succinil-DTX (30) [173]
Após a secagem de 4-(dimetilamino) piridina (DMAP: 0,22 mg) na linha de vazio
durante 2 horas, adicionaram-se o DTX (16 mg) e o anidrido succínico (3,61 mg)
previamente dissolvidos em 0,2 ml de piridina seca. A mistura foi agitada, à
temperatura ambiente, durante 24 h. A esta mistura foram adicionados 10 ml de
acetato de etilo e 10 ml de uma solução de H2SO4 (0,01 %, m/v) e agitou-se durante 30
min. A fase orgânica foi separada e lavada com 10 ml da solução de H2SO4 (0,01 %,
m/v) e 10 ml de água, respectivamente. A água residual presente na fase orgânica foi
removida com a adição de sulfato de sódio anidro. Esta mistura foi filtrada e
concentrada até obter um volume final de 1 ml. Esta solução foi purificada por
cromatografia de sílica gel, utilizando um gradiente de 50 - 100 % de acetato de
etilo/n-hexano na fase móvel. O composto 29 foi obtido na forma de óleo com um
rendimento de 42 % (7,5 mg).
1H RMN [CD3Cl, δ δ δ δ (ppm)]: 8,10 (s largo, H2,6-OBz, 2H); 7,63 (m, 1H, H4-OBz); 7,52
(t, H3,5-OBz, 2H); 7,38 – 7,44 (m, H4, H3,5 e H2,6-aromático lateral, 5H); 6.14 (s
largo, H13,1H); 5,63 (s largo, H20, 1H); 5,45 - 5,34 (m largo , H20 e H30, 3H); 5,26
(s largo, H10, 1H); 4,96 (m largo, H7, 1H); 3,84 (m, H3, 1H); 3,2 (m, H6, 1H); 2,56
(m, -OCOCH2CH2COOH, 4H); 2,39 (m, H14, 2H); 1,98 (s, OAc, 3H); 1,87 (t, H6,
1H); 1,72 (s, Me18, 3H); 1,33 (s, t-Bu, 9H); 1,27 (s, Me19, 3H); 1,17 (s, Me16, 3H);
1.10 (s, Me17, 3H).
Adicionaram-se 3,1 mg de N-hidroxi-3-sulfo-succinimida e 3,5 mg de N-(3-
dimetilaminopropil)-N’-etilcarbodiimida cloridratada (EDC) a 7,5 mg de succinil-DTX
Procedimento Experimental
186
(29) dissolvido numa mistura de DMSO:DMF (70:30). A mistura permaneceu em
agitação e à temperatura ambiente durante 24 h. O progresso da reacção foi
controlado por TLC (Rf = 0,52 em clorofórmio:methanol, 80:20). Esta solução foi
utilizada na reacção seguinte sem mais purificação.
4.4.4.12. Síntese de ALN-Glu-succinil-DTX (31) [173]
À solução obtida anteriormente contendo o composto 30 foi adicionado o
composto 28 dissolvido numa solução de tampão fosfato pH 7,4. A mistura
permaneceu em agitação à temperatura ambiente, durante 18 h. O composto 31 foi
identificado por ESI-MS, na presença do reagente de partida DTX ([M - H]- 806,6) e
produtos decundários (29: [M-H]- 906,5).
ESI-MS m/z (-): valor calculado para C63H80N3O26P2 [M-H]- 1356,4; valor
observado 1356,7. Valor calculado para C63H79N3O26P2 [M-2H]2- 677,6; valor
observado 677,9.
Capítulo 4
187
4.4.4.13. Síntese de ácido 4-(2-(((9H-fluoreno-9-il)metoxi)carbonilamino)-5-t-butoxi-5-oxopentanamido)-1-hidroxibutane-1,1-diilbisfosfónico (32)
A uma solução de (ácido 5-(benziloxi)-2-(terc-butoxicarbonilamino)-5-
oxopentanoico) (tBu-Glu-Fmoc: 0,400 g; 0,9 mmol) e tetrafluorofenol (TFF: 0,343 g;
2,1 mmol) em diclorometano seco (5 mL) a 0 – 5 ᵒC foi adicionada gota-a-gota uma
solução de DCC (0,427 g; 2,1 mmol) previamente dissolvida em 5 ml de diclorometano.
Após alguns minutos a mistura reaccional começa a turvar devido à
precipitação de DCU. A mistura fica em agitação à temperatura ambiente durante 18 h.
A DCU é removida por filtração e o filtrado seca-se e dissolve-se novamente em
acetato de etilo para a precipitação de mais DCU. A suspensão filtra-se, o filtrado seca-
se a pressão reduzida e o éster activado obtido utiliza-se na próxima reacção sem mais
purificação.
O resíduo obtido foi dissolvido em acetonitrilo (20 ml), filtrado para eliminar a
DCU residual e adicionado a uma mistura de alendronato (ALN; 0,237 g; 0,9 mmol) e
trietilamina (NEt3: 630 µl, 4,5 mmol, 5 eq.) em 20 mL de tampão borato (pH 9,4). A
mistura reaccional ficou em suspensão e adicionaram-se mais 5 ml de tampão borato
pois o pH já estava bastante alto (ca. 11). Adicionei mais 150 ml de NEt3 para facilitar a
dissolução do alendronato. O pH final era próximo de 10. A reacção decorreu com
agitação à temperatura ambiente e 3 dias e depois o solvente da mistura foi removido
a pressão reduzida.
O resíduo resultante foi extraído com H2O e, após evaporação do solvente do
sobrenadante. O volume de água foi reduzido e o composto 32 foi obtido puro após
aplicação num cartucho Sep-Pak C18 (Waters, 12 cc, 2 g) previamente condicionado,
lavado com água e extraído com uma solução de 25% de metanol/H2O (0,458 g; 77 %).
Procedimento Experimental
188
1H RMN [CD3OD, δ δ δ δ (ppm)]: 7,77 (d, H(8)Fmoc, 2H); 7,56 (t, H(5)Fmoc, 2H); 7,33
(m, H(6,7)Fmoc, 4H); 4,37 (m, H(2)Fmoc, 2H); 4,20 (m, H(3)Fmoc, 1H); 3,07 (m,
CHf, 1H); 3,20 (t largo, CH2d, 2H); 2,28 (t, CH2
h, 2H); 2,05 - 1,80 (m, CH2c + CH2
b +
CHg, 6H); 1,42 (s, CH3 (t-Bu), 9H).
31P RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 20,57.
13C RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 174,3; 173,9 (Ce + Ci); 158,4 [C(1)Fmoc];
145,3[C(4)Fmoc]; 145,1 [C(9)Fmoc]; 128,8 [C(7)Fmoc]; 128,2 [C(8)Fmoc]; 126,2
[C(6)Fmoc]; 120,9 [C(5)Fmoc]; 81,8 [C(t-Bu)]; 74,1 (t, JCP = 146 Hz, Ca); 67,9
[C(2)Fmoc]; 55,8 (Cf); 48,4 [C(3)Fmoc]; 41,0 (Cd); 32,7 (Ch); 32,3 (Cc); 28,6 (Cg);
28,3 [CH3(t-Bu)]; 24,8 (Cb).
Tempo de retenção (RP-HPLC): 14,3 min.
4.4.4.14. Síntese ácido 4-(2-amino-5-t-butoxi-5-oxopentanamido)-1-hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (33)
Dissolveu-se o composto 32 (52 mg; 79 µmol) numa solução de 20 % de
piperidina em DMF (1,5 ml) e a mistura permanece em agitação durante 30 min. O
composto 33 foi obtido após evaporação do solvente e lavagem do resíduo com
diclorometano (29 mg, 85 %).
1H RMN [CD3OD, δ δ δ δ (ppm)]: (Rotâmeros) 3,76 (t, CHf, ½H); 3,26 (m, CHf’, ½H);
2,96 (m largo, CH2d + CH2
h, 4H); 2,27 (t, CHg, 1H); 1,95 (t, CHg’, 1H); 1,73 (m,
CH2c/b, 2H); 1,59 [s, CH3 (t-Bu), 9/2H]; 1,49 (m, CH2
c/b, 2H); 1,27 [s, CH3 (t-Bu),
9/2H].
31P RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 18,47.
13C RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 175,5; 171,0 (Ce + Ci); 84,9 [C(t-Bu)]; 75,7 (t, JCP = 135
Hz, Ca); 54,7 (Cf); 46,5; 42,1 (Cd); 32,9; 32,5; 29,2; 27,8 (Cc + Cg); 26,4 (t, JCP = 7
Hz, Cb); 25,2; 24,5 [CH3(t-Bu)].
Capítulo 4
189
ESI-MS m/z (+): valor calculado para C13H29N2O10P2 [M + H]+ 435,1; valor
observado 435,3.
4.4.4.15. Síntese de ácido 4-((2-aminoetil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)butanoico (34) [114]
Uma solução de ácido 4-((2-(t-butoxicarbonilamino)etil)(2-(3,5-dimetil-1H-
pirazol-1-il)etil)amino)butanoico (7: 125 mg; 0,34 mmol) em CF3COOH (2 mL) foi
agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. De seguida, o solvente foi evaporado
e o resíduo resultante foi lavado com diclorometano. O composto 34 foi obtido na
forma de óleo e foi utilizado na reacção seguinte sem mais purificação.
1H RMN [CD3OD, δ δ δ δ (ppm)]: 5,82 (s, H4pz, 1H); 4,05 (t, CH2a, 2H); 2,79 (m
sobreposto, CH2b + CH2
d, 4H); 2,62 (t, CH2c, 2H); 2,52 (m, CH2
g, 2H); 2,26 (s,
MePz, 3H); 2,15 (s, MePz, 3H), 2,05 (t, CH2e, 2H); 1,67 (m, CH2
f, 2H).
4.4.4.16. Síntese de ácido 4-((2-(((9H-fluoreno-9-il)metoxi)carbonilamino)etil)(2-(3,5-dimetil-1H-pirazol-1-il)etil)amino)butanóico (35)
A uma solução do composto 34 (0,34 mmol) e Na2CO3 (72 mg; 0,68 mmol) em 5
ml de H2O em agitação e imersa num banho de gelo, adiciona-se alternadamente
Procedimento Experimental
190
DIPEA (65 µl; 0,54 mmol) e 9-Fluorenilmetil cloroformato (Fmoc-Cl; 0,34 mmol; 88 mg)
dissolvido em 10 ml de THF. O pH final após a adição está próximo de 9. Duas horas
após o fim da adição foi efectuado o controlo por TLC (20% MeOH/CHCl3) e a reacção
estava completa.
Evaporou-se o THF e a solução aquosa obtida acidifica-se até pH 5 - 6 com HCl
1N. Extraiu-se esta solução com 4 x 50 ml de CH2Cl2 e secou-se a fase orgânica com
sulfato de sódio anidro. Após evaporação do solvente a pressão reduzida, o resíduo
obtido é purificado por cromatografia de sílica gel com gradiente de 0 - 50% de
metanol/diclorometano. O composto 35 obteve-se sob a forma de óleo amarelo (0,132
g; 79 %).
1H RMN [CD3OD, δ δ δ δ (ppm)]: 7,70 (d, H(8)Fmoc, 2H); 7,56 (t, H(5)Fmoc, 2H); 7,33
– 7,19 (m, H(6,7)Fmoc, 4H); 5,67 (s, H4pz, 1H); 4,28 (m, H(2)Fmoc, 2H); 4,09 (t,
H(3)Fmoc, 1H); 3,96 (t, CH2a, 2H); 3,10 (t, CH2
b, 2H); 2,83 (t, CH2d, 2H); 2,55 (m,
CH2c + CH2
g, 4H), 2,18 (m sobreposto, CH2e, 2H); 2,12 (s, MePz, 3H); 2,06 (s,
MePz, 3H), 1,62 (m, CH2f, 2H).
13C RMN [CD3OD, δ δ δ δ (ppm)]: 179,1 (C=O); 158,7 [C(1)Fmoc]; 145,3 [C(4)Fmoc];
145,1 [C(9)Fmoc]; 142,6 [C(3/5)pz]; 141,4 [C(3/5)pz]; 128,7 [C(7)Fmoc]; 128,1
[C(8)Fmoc]; 126,1 [C(6)Fmoc]; 120,9 [C(5)Fmoc]; 106,1 [C(4)pz]; 67,6
[C(2)Fmoc]; 55,0; 54,6; 54,5 (Cd + Cc + Cg); 48,4 [C(3)Fmoc]; 47,1 (CH2a); 39,4
(CH2b); 33,7 (CH2
e); 23,5 (CH2f); 13,2 (CH3pz); 11,0 (CH3pz).
Capítulo 4
191
4.4.5. Síntese de Derivado do Composto Pirazolo-Diamina Funcionalizado na Posição 4
4.4.5.1. Síntese de ácido 4-(2-(1-(2-((2-(t-butoxicarbonilamino)etil)(4-etoxy-4-oxobutil)amino)etil)-3,5-dimetil-1H-pirazol-4-il)acetamido)-1-hidroxibutano-1,1-diilbisfosfónico (36)
A uma solução de ácido 2-(1-(2-((2-(t-butoxicarbonilamino)etil)(4-etoxi-4-
oxobutil)amino)etil)-3,5-dimetil-1H-pirazol-4-il)acético (pz4-COOH: 0,045 g; 99 µmol) e
tetrafluorofenol (TFF: 0,216 g; 1,30 mmol) em diclorometano seco (2 mL) a 0 – 5 ᵒC foi
adicionada gota-a-gota uma solução de DCC (0,045 g; 0,22 mmol) previamente
dissolvida em 1 ml de diclorometano.
Após alguns minutos a mistura reaccional começa a turvar devido à
precipitação de DCU. A mistura fica em agitação à temperatura ambiente durante 14 h.
A DCU é removida por filtração e o filtrado seca-se e dissolve-se novamente em
acetato de etilo para a precipitação de mais DCU. A suspensão filtra-se, o filtrado seca-
se na linha de vazio e o éster activado obtido utiliza-se na próxima reacção sem mais
purificação.
O resíduo obtido foi dissolvido em N,N-dimetilformamida (2 ml), filtrado para
eliminar a DCU residual e adicionado a uma mistura de alendronato, na forma de sal
de trisódio tetrahidratado (ALN; 0,156 g; 0,592 mmol) e trietilamina (NEt3: 69 µl, 0,5
mmol) em 2 mL de tampão borato (pH 9,4). A mistura reaccional ficou em suspensão e
adicionaram-se mais 70 µl de NEt3 e umas gotas de água permitindo a dissolução
completa da mistura. O pH final era próximo de 10. A reacção decorreu com agitação à
temperatura ambiente e 3 dias e depois o solvente da mistura foi evaporado na linha
de vazio.
Procedimento Experimental
192
O resíduo resultante foi extraído com H2O (10 ml) e o sobrenadante foi
concentrado na linha de vazio até obter 2 ml. A purificação fez-se por aplicação da
solução obtida num cartucho Sep-Pak C18 (Waters, 12 cc, 2 g) pré-condicionado,
lavado com H2O (20 ml), uma solução de 25 % de metanol/H2O (4 ml) e extraído com
uma solução de 50 % de metanol/H2O (8 ml). O composto 36 foi obtido na forma de
óleo transparente (0,033 g; 49 %).
1H RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 4,34 (t largo, CH2a, 2H); 4,05 (q, O-CH2-, 2H); 3,59 (t
largo, CHb, 2H); 3,34 (m largo, CH2c + CH2
d, 4H); 3,28 (s, CH2i, 2H); 3,22 (t, CH2
g,
2H); 3,10 (t, CH2k, 2H); 2,39 (t, CH2
e, 2H); 2,13 (s, CH3pz, 3H); 2,06 (s, CH3pz, 3H);
1,88 (m sobrepostos, CH2f + CH2
m, 4H); 1,71 (m largo, CH2l, 2H); 1,28 (s, CH3
(Boc), 9H); 1,13 (t, O-CH2-CH3, 3H).
31P RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 19,17.
13C RMN [D2O, δ δ δ δ (ppm)]: 176,8; 175,9 (Ch + Cj); 160,2 (C=O, Boc); 150,8
[C(3/5)pz]; 142,4 [C(3/5)pz]; 112,9 [C(4)pz]; 83,8 [C(Boc)]; 75,5 (t, JCP = 121 Hz,
Cn); 64,1[CH2(Et)]; 55,0 (CH2b); 54,9 (CH2
c/d); 54,4 (CH2g); 43,9 (CH2
a); 42,0 (CHk);
37,3 (CH2c/d); 32,9 (CH2
f/m); 32,5 (CH2e); 32,2 (CH2
i); 29,6 [CH3(Boc)]; 25,4 (CH2l);
20,5 (CH2f/m); 15,4 [CH3(Et)]; 12,9 (CH3pz); 10,7 (CH3pz).
ESI-MS m/z (+): valor calculado para C26H49N5O12P2 [M+H]+ 686,3; valor
observado 686,4.
ESI-MS m/z (-): valor calculado para C26H49N5O12P2 [M-H]- 684,3; valor
observado 684,4.
Capítulo 4
193
4.4.6. Síntese e Caracterização de Complexos de Re(I)
4.4.6.1. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L1)]+ (Re1)
A uma suspensão de [Re(CO)5Br] (0,036 g; 0,089 mmol) em metanol, em
agitação, foi adicionado pz – MPOEt (0,029 g; 0,13 mmol) dissolvido no mesmo
solvente e a mistura reaccional foi refluxada durante a noite. O resíduo obtido, após
evaporação do solvente, foi lavado (três vezes) com n-hexano, obtendo-se um sólido
branco, que foi seco na linha de vazio (0,053 g; 96 %).
1H RMN [CD3OD, δδδδ (ppm)]: 6,21 [s,H(4)pz, 1H]; 5,57 (q largo, NH, 1H); 4,54 (dd,
CH, 1H); 4.19 (m, CH2, 6H); 3,91 (m, CH, 1H); 3,74 (m, NH, 1H); 3,43 (dd, CH,
1H); 3,21 (m, CH, 1H); 2,96 (d largo, CH, 1H); 2,77 (m, CH2, 2H); 2,54 (m, CH2,
2H); 2,45 (s, CH3, 3H); 2,38 (s, CH3, 3H); 2,29 (m, CH, 1H); 1,37 (t, CH3, 6H).
13C RMN [CD3OD, δδδδ (ppm)]: 195,0; 194,7; 193,6 (C ≡ O); 155,3 [C(3/5)pz]; 145,6
[C(3/5)pz]; 109,3 [C(4)pz]; 64,0 (CH2); 63,9 (CH2); 62,1 (CH2); 61,3 (CH2); 53,4
(CH2), 43,5 (CH2); 23,0 (CH2); 21,2 (CH2); 16,8 (CH3), 16,7 (CH3); 16,1 (CH3); 11,6
(CH3).
31P RMN [CD3OD, δδδδ (ppm)]: 29,4.
IV (KBr, νννν/cm–1): 2027 (C ≡ O), 1901 (C ≡ O), 1263, 1023 (P=O), 798, 739.
Análise de C,H,N (%) para C18H31N4O6PBrRe:
Calculada: C, 31,04; H, 4,49; N, 8,04.
Experimental: C, 31,30; H, 4,40; N, 7,89.
Tempo de retenção (RP-HPLC): 15,8 min.
NNN NH2
Re
OC COCO
POEtOEt
O
Procedimento Experimental
194
Dados cristalográficos do complexo fac-[Re(CO)3(κ3-L1)]+ (Re1)
Os cristais foram obtidos por evaporação lenta de uma solução concentrada do
complexo numa mistura de clorofórmio e n-hexano, e a montagem foi feita em
capilares de vidro de parede fina.
Os dados cristalográficos utilizados na resolução e refinamento da estrutura
apresentam-se na tabela 4.1.
Tabela 4.1 – Dados cristalográficos do composto fac-[Re(CO)3(κ3-L1)]Cl (Re1).
Fórmula empírica C18H31ClN4O7PRe Massa molecular 668,09 Sistema cristalográfico Monoclínico
Grupo espacial P21/n
Dimensões da célula unitária a = 13,5880 (17) Å b = 13,7897(10) Å c = 14,870(3) Å
α = 90° β = 106,929(9)° γ = 90°
Volume, Å3 2665,4(7)
Z 4 T, °C 21(2)
ρcalc., gcm-3 1,665
µ(MoKα), mm-1 4,760
Nº reflexões obtidas 5989 Nº reflexões independentes 5745 [R(int) = 0,0355] Ajuste final [I>2σ(I)]a R1 = 0,0551; WR2 = 0,0867 Ajuste final (todos os dados)a R1 = 0,1073; WR2 = 0,1014
a R1 = ΣΣΣΣFo - Fc/ ΣΣΣΣFoe wR2 = [ΣΣΣΣ(w(Fo2 - Fc
2)2) / ΣΣΣΣ(w(Fo2)2)]1/2.
Capítulo 4
195
4.4.6.2. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L2)]+ (Re2)
A uma solução de [Re(CO)5Br] (0,018 g; 0,044 mmol) em água e em agitação foi
adicionada uma solução de pz-MPOH (0,020 g; 0,044 mmol) dissolvido no mesmo
solvente, e a mistura resultante foi refluxada durante a noite. Após evaporação do
solvente, o resíduo obtido foi seco na linha de vazio e analisado por HPLC-RP e
espectroscopia de RMN. O produto bruto consiste numa mistura de pz-MPOH livre e
complexo [Re(CO)3(pz-MPOH)] (36 %, calculado a partir do espectro de 1H RMN).
1H RMN [D2O, δδδδ (ppm)]: 6,01 [s, H(4)pz, 1H]; 5,07 (q largo, NH, 1H); 4,30 (dd, H, 1H);
4,08 (m, CH, 1H); 3,64 (m, CH, NH, 3H); 3,08 (m, CH, 1H); 2,69 (m, CH, 1H); 2,56 (m, CH,
1H); 2,37 (m, CH, 1H); 2,25 (s, CH3, 3H); 2,14 (s, CH3, 3H). 31P RMN [δδδδ (ppm)]: 25,3
(CD3OD); 23,4 (D2O).
Tempo de retenção (HPLC - RP): 10,8 min.
4.4.6.3. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L4)]+ (Re4)
Método directo:
Uma solução de fac - [Re(H2O)3(CO)3]Br (0,011 g, 0,029 mmol) e pz-BPOH (0,010
g; 0,023 mmol) em H2O foi refluxada durante a noite. Após remoção da água na linha
de vazio, o resíduo obtido foi dissolvido numa mistura de H2O/acetonitrilo (90:10). O
NNN NH2
Re
OC COCO
POHOH
O
Procedimento Experimental
196
precipitado foi eliminado por centrifugação e o sobrenadante foi purificado por RP-
HPLC (coluna Macherey-Nagel semipreparativa C18, Nucleosil 100 – 7, 250 nm ∙ 8 mm)
com fluxo de 2 mLmin-1. O produto foi obtido após eluição com gradiente de 0 a 100 %
de acetonitrilo com 0,5 % de CF3COOH/ H2O com 0,5 % CF3COOH. Os cromatogramas
foram obtidos monitorizando a absorção de UV a 254 nm. Após evaporação do
solvente obteve-se o complexo Re4 na forma de um óleo amarelo pálido (8,8 mg; 54
%).
Método indirecto:
A. Síntese de precursor fac-[Re(CO)3(κ3-pzCOOH)]
+ [107, 184]
O composto (NEt4)2[ReBr3(CO)3] (0,100 g; 0,131 mmol) fez-se reagir com uma
quantidade equimolar de pz–COOH (0,050 mg; 0,131 mmol) em H2O e em refluxo
durante 18 horas. De seguida, o solvente foi removido na linha de vazio e o resíduo
resultante foi lavado com clorofórmio para remover o excesso de [NEt4]Br. O resíduo
foi dissolvido em água, e foi purificado por RP-HPLC (coluna Waters l Bondapak C18 (19
mm ∙ 150 mm) com fluxo de 5 mLmin-1. O produto foi obtido utilizando como eluentes
uma solução de 0.1 % de CF3COOH (A) e metanol (B) e a eluição fez-se utilizando o
método 2 descrito na secção 4.3.
Os cromatogramas foram obtidos monitorizando a absorção de UV a 254 nm.
Após evaporação do solvente obteve-se o composto [Re(CO)3(κ3-pz-COOH)]+ na forma
de um óleo incolor transparente (50 mg; 71 %).
1H NMR [D2O, δδδδ (ppm)]: 6,01 [s, 1H, H(4)pz]; 5,07 (q largo, 1H, NH); 4,33 (dd,
1H, CHa); 4,07 (m, 1H,CHa´); 3,62 (s largo, 1H, NH); 3,50 (m, 1H, CHg); 3,37 (m,
2H, CHg’ + CHb); 3,05 (s largo, 1H, CHd); 2,72 (d, 2H,CHc + CHc’); 2,54 (t largo, 1H,
Capítulo 4
197
CHb’); 2,37 (m largo, 1H, CHd’); 2,33 (t, 2H, CHe + CHe’); 2,24 (s, 3H, CH3pz); 2,14
(s, 3H, CH3pz); 2,04 (m, 1H, CHf); 1,88 (m, 1H,CHf’).
13C NMR [D2O, δδδδ (ppm)]: 196,6; 196,2; 196,1 (C ≡ O); 179,8 (C = O); 155,7
[C(3/5)pz]; 146,3 [C(3/5)pz]; 109,8 [C(4)pz]; 67,8 (Cg); 63,2 (Cc); 54,5 (Cb); 49,1
Ca); 44,2 (Cd); 33,1 (Ce); 21,5 (Cf); 17,3 (CH3pz); 12,9 (CH3pz).
IV (KBr, νννν/cm–1): 2031 (C ≡ O), 1974 (C ≡ O), 1901 (C ≡ O), 1686, 1432, 1205,
1143, 848, 800, 728, 588.
ESI-MS (+): Valor calculado para C16H24N4O5Re [M + H]+ 539,1; valor observado
a 539,0.
Tempo de retenção (RP-HPLC): 18,6 min.
B. Síntese do intermediário [Re(CO)3(κ3-pz-AMDP)]
+
A uma solução de [Re(CO)3(κ3-pz-COOH)]+ (0,020 g; 0,037 mmol) e HOBt (8 mg;
0,056 mmol) em acetonitrilo seco (5 mL) a 0 – 5 ᵒC foi adicionada DCC (12 mg; 0,056
mmol), e a mistura foi agitada durante 30 min. Após adição de éster 1-
aminometildifosfonato de tetraetilo (17 mg; 0,056 mmol) dissolvido em acetonitrilo
(aproximadamente 1 mL), a agitação manteve-se à temperatura ambiente. A reacção
estava completa 20 horas depois por controlo através de cromatograma de RP-HPLC. A
DCU que precipita foi removida por centrifugação e o solvente do sobrenadante foi
evaporado. O resíduo obtido foi dissolvido numa mistura de H2O/CH3CN (90:10),
filtrou-se novamente para remover a DCU e, purificou-se por RP – HPLC utilizando uma
coluna Waters l Bondapak C18 (19 mm ∙ 150 mm) com fluxo de 5 mLmin-1 e detecção
UV a 254 nm. Os eluentes utilizados foram uma solução de 0.5 % de CF3COOH (A) e
Procedimento Experimental
198
uma solução de 0.5 % de CF3COOH em acetonitrilo (B) e a e a eluição fez-se utilizando
o método 1 descrito na secção 4.3.
Após evaporação do solvente obteve-se o composto [Re(CO)3(κκκκ3-pz-BPOEt)]+
na forma de um óleo incolor transparente (20 mg; 66 %).
1H NMR [D2O, δδδδ (ppm)]: 6,01 [s, 1H, H(4)pz]; 5,04 (s largo, 1H, NH); 4,51 (m, 1H,
CHh); 4,28 (d largo, 1H, CHa); 4,08 (m, 8H, P – OCH2CH3); 3,94 (m, 1H, CHa’); 3,64
(m largo, 1H, NH); 3,54 (m largo, 1H, CHg); 3,29 (m largo,2H, CHg’ + CHb); 3,00
(m largo, 1H, CHd); 2,71 (s largo, 2H, CHc + CHc’); 2,54 (t largo, 1H, CHb’); 2,35 (m
largo, 1H, CHd’); 2,33 (t, 2H, CHe + CHe’); 2,25 (s, 3H, CH3pz); 2,13 (s, 3H, CH3pz);
2,04 (m largo, 1H, CHf); 1,83 (m largo, 1H, CHf’); 1,15 (m, 12H, P – OCH2CH3).
13C NMR [D2O, δδδδ (ppm)]: 196,1 (3 x C ≡ O); 179,5 (CO); 155,6 [C(3/5)pz]; 146,2
[C(3/5)pz]; 109,7 [C(4)Pz]; 67,7 (Cg); 67,5 (P – OCH2CH3); 63,1 (Cc); 54,5 (Cb);
50,1 (Ch, P–CH–P); 49,0 (Ca); 44,1 (Cd); 32,7 (Ce); 21,3 (Cf); 17,7 (P – OCH2CH3);
17,3 (CH3pz); 12,8 (CH3pz). Os desvios químicos foram atribuídos com a ajuda
de experiências bidimensionais de espectroscopia de RMN (correlação
homonuclear 1H – 1H, COSY, e correlação heteronuclear 1H – 13C, HSQC).
31P RMN [D2O, δδδδ (ppm)]: 17,9.
Tempo de retenção (RP-HPLC): 16,1 min.
C. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L4)]
+ (Re4)
A uma solução de fac-[Re(CO)3(κ3-pz-AMDP)]+ (20 mg; 0,024 mmol) em
diclorometano seco (5 mL) a 0 ᵒC foi adicionado gota – a – gota brometo de
Capítulo 4
199
trimetilsilano (0,5 mL; 3,7 mmol). A mistura atingiu a temperatura ambiente e
permaneceu em agitação durante a noite. O solvente foi evaporado, e dissolvido em
metanol (5 mL) permanecendo em agitação mais 1,5 horas. O solvente foi evaporado e
o resíduo foi lavado com clorofórmio. O produto foi obtido na forma de óleo amarelo
pálido e o rendimento foi quantitativo com base no espectro de 1H RMN.
1H NMR [D2O, δδδδ (ppm)]: 6,01 [s, H(4)pz, 1H]; 5,04 (s largo, NH, 1H); 4,53 (m,
CHh, 1H); 4,29 (d largo, CHa, 1H); 4,07 (m largo, CHa’, 1H); 3,64 (s largo,NH, 1H);
3,50 (m largo, CHg, 1H); 3,26 (m largo,CHg’ + CHb, 2H); 3,01 (m largo, CHd, 1H);
2,71 (s largo, CHc + CHc’, 2H); 2,55 (t largo, CHb’, 1H); 2,34 (m largo, CHd’, 1H);
2,24 (s, CH3pz, 3H); 2,20 (s largo, CHe + CHe’, 2H); 2,13 (s, CH3pz, 3H); 2,03 (m,
CHf, 1H); 1,88 (m largo, CHf’, 1H).
13C NMR [D2O, δδδδ (ppm)]: 196,5; 196,1; 194,9 (C ≡ O), 180,4 (CO); 155,6
[C(3/5)pz]; 146,2 [C(3/5)pz]; 109,7 [C(4)Pz]; 67,7 (Cg); 63,2 (Cc); 54,6 (Cb); 50,9
(Ch, P-CH-P); 49,0 (Ca); 44,2 (Cd); 33,9 (Ce); 22,1 (Cf); 17,3 (CH3pz); 12,9 (CH3pz).
Os desvios químicos foram atribuídos com a ajuda de experiências
bidimensionais de espectroscopia de RMN (correlação homonuclear 1H – 1H,
COSY, e correlação heteronuclear 1H – 13C, HSQC).
31P RMN [D2O, δδδδ (ppm)]: 11,1 (largo).
Tempo de retenção (RP-HPLC): 13,9 min.
4.4.6.4. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L5)]+ (Re5)
A uma solução de fac-[Re(CO)3(κ3-pz-COOH)]Br (I) (0,039 g; 0,063 mmol) e
tetrafluorofenol (TFF; 0,023 g; 0,138 mmol) em acetonitrilo seco (4 mL) a 0 – 5 ᵒC foi
Procedimento Experimental
200
adicionada DCC (0,028 g; 0,138 mmol), e a mistura foi agitada durante 14 horas. A DCU
que precipita foi removida por centrifugação e o solvente do sobrenadante foi
evaporado. O resíduo foi suspendido num volume adequado de acetate de etilo, a DCU
que precipita foi removida por filtração, e o solvente do filtrado foi evaporado na linha
de vazio. O resíduo obtido foi dissolvido em acetonitrilo (2,5 mL), filtrado para eliminar
a DCC – ureia residual e adicionado a uma solução de PAM (0,017 g; 0,067 mmol) em
2,5 mL de tampão borato (pH 9,4) e trietilamina (60 µl). O pH final era próximo de 9 e a
mistura reaccional foi agitada durante cinco dias à temperatura ambiente. A mistura
foi concentrada até estar completamente seca, o resíduo resultante foi extraído com
H2O e, após remoção do solvente do sobrenadante na linha de vazio, o resíduo obtido
foi lavado com acetonitrilo para remover o excesso de trietilamónio. O complexo fac -
[Re(CO)3(κ3-pz-PAM)] foi obtido após purificação com cartuchos Sep-Pak C18 (Waters,
0,85 cc/360 mg) previamente condicionados. O composto fac - [Re(CO)3(pz-PAM)]+ (2)
foi eluído com gradiente de 25 - 75 % metanol/H2O após lavagem com 10 mL H2O
(0,014 g; 24 %).
1H NMR [D2O, δδδδ (ppm)]: 6,07 [s, H(4)pz, 1H]; 5,11 (m, NH, 1H); 4,36 (dd, 2JHH =
15.8 Hz, 3JHH = 3.2 Hz, CHa, 1H); 4,13 (dd, , 2JHH = 15.8 Hz, 3JHH = 10.6 Hz, CHa´,
1H); 3,64 (m, NH, 1H); 3,54 (dd, 2JHH = 12.4 Hz, 3JHH = 3.5 Hz, CHg, 1H); 3,42 -
3.37 (m, CH2h/h’+ CHg’ + CHb, 4H); 3,11 (m, CHd, 1H); 2,76 (m, CH2
c/c’, 2H); 2,60
(dd, 2JHH = 14.4 Hz, 3JHH = 10.8 Hz, CHb’, 1H); 2,43 (m, CHd’, 1H); 2,30 (s, CH3pz,
3H); 2,19 (m, CH3pz + CH2e/e’, 5H); 2,01 (m, CH2
f/f’ + CH2i/i’, 4H).
13C NMR [D2O, δδδδ (ppm)]: 194,6; 194,2; 193,1 (C≡O); 174,9 (C=O); 153,7
[C(3/5)pz]; 144,3 [C(3/5)pz]; 107,8 [C(4)pz]; 73,2 (t, JCP = 129.4 Hz, Cj); 66,0 (Cg);
61,3 (Cc); 52,8 (Cb); 47,2 (Ca); 42,2 (Cd); 36,1 (t, JCP = 7.9 Hz, Ch); 33,1 (Ce + Ci);
20,7 (Cf); 15,4 (CH3pz); 10,9 (CH3pz).
31P NMR [D2O, δδδδ (ppm)]: 24,7.
IV (KBr, νννν/cm–1): 2033, 1927, 1913 (C ≡ O), 1686, 1210, 1141, 845, 803, 726.
ESI-MS [-] m/z: Valor calculado para ReO11N5C19H30P2 [M - 3H]2- 376,5; valor
observado 376,5. Valor calculado para ReO11N5C19H31P2 [M - 2H]- 754,1; valor
observado 753,9. Valor calculado para ReO11N5C19H30P2Na [M – 3H + Na]- 776,1;
Capítulo 4
201
valor observado 775,9. Valor calculado para ReO11N5C19H30P2K [M - 3H + K]-
792,1; valor observado 791,9.
Análise de C,H,N (%) para C19H31N5Na2O11P2ReBr∙CH3OH:
Calculado: C, 26.35 %; H, 3.87 %; N, 7.68 %.
Experimental: C, 26.45 %; H, 3.74 %; N, 7.66 %.
Tempo de retenção (RP-HPLC): 11,9 min.
IV (KBr, νννν/cm–1): 2033 (C ≡ O), 1927 (C ≡ O), 1913 (C ≡ O), 1686, 1442, 1210,
1141, 845, 803, 726.
4.4.6.5. Síntese de fac-[Re(CO)3(κ3-L6)]+ (Re6)
Uma solução de ALN (0,017 g; 0,052 mmol) e NMM (36 µl; 0,325 mmol) em H2O
(2 mL) foi adicionada gota – a – gota a uma solução de fac-[Re(CO)3(κ3-pz-COOH)]Br
(0,025 g; 0,040 mmol), 1-Hidroxibenzotriazolo hidratado (HOBt; 0,013 g; 0,097 mmol)
e O-Benzotriazol-N,N,N’,N’-tetramethyluronium-hexafluoro phosphate (HBTU; 0.037 g,
0,097 mmol) em N,N-dimetilformamida (2 mL). O pH final foi ajustado até 8 com
adição de NMM (18 µl; 0,163 mmol). A mistura reaccional foi agitada à temperature
ambiente e, após cinco dias, o solvent foi evaporado na linha de vazio e o resíduo foi
extraído com H2O (~ 5 mL). Este volume foi reduzido até 2 mL e o concentrado foi
purificado com um cartucho Sep Pak (Waters, 12 cc, 2 g) pré-condicionado. O
composto fac - [Re(CO)3(κ3 - pz-ALN) foi eluído com uma mistura de 50 % Metanol/H2O
Procedimento Experimental
202
após lavagem com pequenas quantidades de H2O, 20 % Metanol/H2O e 30 %
Metanol/H2O (0,015 g; 40 %).
1H NMR [D2O, δδδδ (ppm)]: 6,02 [s, H(4)pz, 1H]; 5,06 (m, NH, 1H); 4,31 (dd, 2JHH =
25.7 Hz , 3JHH = 3.0 Hz CHa, 1H); 4,08 (dd, 2JHH = 15.4 Hz , 3JHH = 11.0 Hz, CHa´,
1H); 3,64 (m, NH, 1H); 3,50 (m, CHg, 1H); 3,27 (m, CH2b + CHg’, 2H); 3,07 (m,
CHh/h’+ CHd, 1H); 2,71 (m, CH2c/c’, 2H); 2,56 (m, CHb’, 1H); 2,38 (m, CHd’, 1H);
2,26 (s, CH3pz, 3H); 2,14 (m, CH2e/e’ + CH3pz, 5H); 2,07 (m, CH2
f/f’, 2H); 1,82 (m,
CH2j, 2H); 1,71 (m, CH2
i, 2H).
13C NMR [D2O, δδδδ (ppm)]: 194,6; 194,2; 193,1 (C≡O); 175,4 (C=O); 153,7
[C(3/5)pz]; 144,3 [C(3/5)pz]; 107,7 [C(4)pz]; 71,8 ( Ck); 65,9 (Cg); 61,3 (Cc); 52,8
(Cb); 47,1 (Ca); 42,2 (Cd); 40,0 (Ch); 32,8 (Ce); 31,1 (Cj); 23,3 (m, Ci); 20,7 (Cf); 15,3
(CH3pz); 10,9 (CH3pz).
31P NMR [D2O, δδδδ (ppm)]: 19,6.
IV (KBr, νννν/cm–1): 2026, 1930, 1912 (C≡O), 1650 (C=ONH), 1172, 1064, 526.
ESI-MS [-] m/z: Valor calculado para C20H32N5O11P2Re [M - 3H]2- 383,5; valor
observado 383,4. Valor calculado para C20H33N5O11P2Re [M - 2H]- 768,1; valor
observado 768,0. ESI-MS [+] m/z: Valor calculado para C20H35N5O11P2Re [M]+
770,1; valor observado 770,1. Valor calculado para C20H34N5O11P2ReNa [M - H +
Na]+ 792,1; valor observado 792,1. Valor calculado para C20H33N5O11P2ReNa2 [M
- 2H + 2Na]+ 814,1; valor observado 814,1. Valor calculado para
C20H33N5O11P2ReKNa [M - 2H + Na + K]+ 830,1; valor observado 830,0.
Análise de C,H,N (%) para C20H33N5Na2O11P2ReBr∙CH3OH:
Calculado: C, 27,25 %; H, 4,03. %; N, 7,57 %.
Experimental: C, 27.76 %; H, 4.19 %; N, 7.31 %.
IV (KBr, νννν/cm–1): 2026 (C ≡ O), 1930 (C ≡ O), 1912 (C ≡ O), 1650 (C=ONH), 1172,
1064, 526.
Tempo de retenção (RP-HPLC): 13,8 min.
Capítulo 4
203
4.4.7. Síntese dos complexos de 99mTc(I)
As manipulações das substâncias radioactivas foram efectuadas utilizando
como protecção uma barreira de chumbo com visor impregnado de sais de chumbo.
Os frascos com produtos radioactivos foram colocados dentro de contentores de
chumbo. A exposição à dose de radiação foi monitorizada por leitura de dosímetro
individual de corpo e de mãos.
4.4.7.1. Preparação do complexo precursor fac-[99mTc(H2O)3(CO)3]+
Após eluição de um gerador de 99Mo/99mTc com uma solução de NaCl 0,9% a
actividade do Na[99mTcO4] eluído foi medida numa câmara de ionização Atomlab 100
plus (Biodex Medical Systems). De seguida, o precursor fac-[99mTc(H2O)3(CO)3]+ foi
preparado utilizando um Kit Isolink®
Mallinckrodt, da seguinte forma:
-adicionaram-se 1 – 2 mL de Na[99mTcO4] ao kit de reagentes liofilizados e agitou-se,
-aqueceu-se num banho termostatizado a 100 ᵒC durante 20 min,
-arrefeceu-se num banho de gelo durante aproximadamente 5 min,
-adicionou-se uma mistura de HCl 1M até atingir um valor de pH entre 6,8 e 7,4.
4.4.7.2 – Procedimento geral para a síntese dos complexos Tc1–Tc7
A uma solução (50 - 100 µl, 10-3 M) de ligando em etanol (L1), ou em H2O (L2,
L4, L5, L6 ou L7), introduzida num frasco de vidro selado e sob atmosfera de azoto,
adicionaram-se 950 – 900 µL de uma solução de fac-[99mTc(CO)3(H2O)3]+ (5 mCi), em
tampão fosfato pH 7,4 (Tc1 e Tc2) ou em NaCl 0,9 % pH 7,4 (Tc4, Tc5, Tc6 e Tc7). A
preparação foi aquecida a 100 ᵒC durante 30 min, arrefecida num banho de gelo e
analizada por RP-HPLC. Os tempos de retenção obtidos para Tc1 - Tc7 e para Re1 - Re6
foram os seguintes:
tR = 16,3 min (Tc1), 15,8 min (Re1);
Procedimento Experimental
204
tR = 11,4 min (Tc2), 10,8 min (Re2),
tR = 13,2 min (Tc4), 13,9 min (Re4);
tR = 12.0 min (Tc5), 11.9 min (Re5);
tR = 14,2 min (Tc6), 13,8 min (Re6);
tR = 12,3 min (Tc7).
4.5. ESTUDOS IN VITRO
4.5.1 - Determinação da Carga e da Lipofilía dos Complexos
A carga dos complexos Tc5, Tc6 e Tc7 foi determinada por electroforese, nas
condições experimentais descritas na secção 4.3.
A lipofilía dos complexos de 99mTc foi determinada através do método
“shakeflask” [121]. Isto é, o radiocomplexo foi adicionado a uma mistura de octanol (1
mL) e uma solução 0,1 M de tampão PBS pH = 7,4 (1 mL). Esta mistura foi agitada no
vortex antes e após a adição do radiocomplexo, e de seguida centrifugou-se (3000
rpm, 10 min, temperatura ambiente) para separação das duas fases. A actividade das
aliquotas de ambas as fases (octanol e tampão PBS) foram contadas no contador
gama, e o coeficiente de partição (Po/w) foi calculado dividindo a actividade no octanol
pela actividade na solução tampão PBS. Os resultados foram expressos como Log D.
Log D = 0,08 ± 0,04 (Tc1)
Log D = -1,67 ± 0,03 (Tc2)
Log D = -2.00 ± 0.02 (Tc5)
Log D = -1,94 ± 0.02 (Tc6)
Log D = -2,66 ± 0.06 (Tc7)
Capítulo 4
205
4.5.2. Estabilidade In Vitro
Estabilidade em PBS
As soluções dos compostos (Tc1 e Tc2) preparados em tampão PBS (pH = 7,4),
foram aquecidas durante 0, 1, 2, 4 e 24 horas em banho termostatizado a 37 ᵒC. Para
os diferentes tempos foram retiradas alíquotas e analisadas por RP-HPLC.
Para os complexos preparados em meio salino (Tc4, Tc5 e Tc6), o estudo de
estabilidade em tampão PBS foi realizado adicionando 900 µL de tampão PBS 0,1 M pH
= 7,4 a uma alíquota de 100 µL do complexo de 99mTc. As soluções obtidas foram
posteriormente sujeitas ao tratamento e análise descritos anteriormente.
Estabilidade em soro humano
Num frasco de vidro selado e com atmosfera de N2, adicionou-se 100 µl de uma
solução do complexo (Tc1 ou Tc2) a 900 µl de soro humano de forma a obter uma
concentração final de 10-3 M. A mistura foi mantida durante 0, 1, 2 e 4 horas em banho
de água a 37 ᵒC e após cada um dos tempos referidos retiraram-se alíquotas de 100 µl
e precipitaram-se as proteínas com etanol (200 µl). As soluções foram centrifugadas a
3000 rpm durante 15 min a 4 ᵒC e procedeu-se à sua análise por RP-HPLC.
Estabilidade na presença de histidina e cisteína
Num frasco de vidro selado e com atmosfera de N2, adicionou-se 100 µl de uma
solução do complexo (Tc6) a 900 µl de uma solução de histidina (ou cisteína) de forma
a obter uma concentração final de 10-3 M destes substratos. A mistura foi mantida
durante 1, 2, 4 e 6 horas em banho de água a 37 ᵒC, após o que se retiraram alíquotas
das soluções e se procedeu à sua análise por HPLC.
Procedimento Experimental
206
4.5.3. Ligação à Hidroxiapatite
A adsorção à hidroxiapatite foi determinada seguindo um método descrito na
literatura [185]. Assim, foram adicionados 50 μL de cada complexo (ca. 300 µCi/500
µL) a 2,5; 10; e 50 mg de HA, em 500 µL de tampão PBS pH = 7,2 (GIBCO®). Esta
mistura foi incubada num banho de água a 37 ᵒC durante 1 h. Imediatamente após a
incubação, a mistura foi centrifugada (7500 rpm/ 3 min) e a fase líquida separada. A
fase sólida foi lavada 2 vezes com 500 µL de tampão PBS (pH = 7,2), e a actividade foi
lida numa câmara de ionização. A ligação à hidroxiapatite calcula-se conforme indicado
na equação 4.1:
% Ligação à hidroxiapatite =�(���)
�(��� �) x 100 (4.1)
A(sol) = actividade da fase sólida; A(total) = actividade total.
Alternativamente, a absorção dos complexos de 99mTc foi também calculada ao
longo do tempo. Para isso, 50 µL de cada complexo (~300 µCi/500 µL) foram incubados
com 15 mg de HA em 500 µL de tampão PBS pH = 7,2, durante 0, 1, 2 e 4 horas num
banho de água a 37 ᵒC. As suspensões obtidas foram tratadas de acordo com o
procedimento descrito anteriormente.
4.6. ESTUDOS IN VIVO
Todas as experiências in vivo foram realizadas de acordo com os padrões da lei
europeia relativos ao alojamento, cuidados e protecção dos animais para fins
científicos (Decreto-lei 129/92 de 6 de Julho e 197/96 de 16 de Outubro da Portaria
1131/97, que transpõem para a ordem jurídica interna a Directiva Comunitária nº
86/609/CEE).
Capítulo 4
207
4.6.1. Ensaios de Biodistribuição e Estabilidade In Vivo
A biodistribuição ex-vivo dos complexos avaliados foi determinada em grupos
de quatro a cinco ratinhos fêmea (Charles River), das estirpes CD-1 (20 – 25 g), e Balb-c
(15 g). Os animais foram injectados por via intravenosa, na veia da cauda, com 100 µL
(7,0 – 32 MBq) de cada preparação, e mantiveram-se em condições controladas de
temperatura, luz e humidade, e com uma dieta normal ad libitum.
Imediatamente após injecção mediu-se a actividade injectada em cada ratinho
na câmara de ionização. Os animais foram depois sacrificados por deslocação cervical,
1 hora e 4 horas após injecção. De seguida, foram dissecados e recolheram-se os
órgãos de interesse. Mediu-se a actividade em cada órgão numa câmara de ionização
ou num contador gama (Berthold) e, após determinação da respectiva massa, os
resultados da biodistribuição foram expressos como uma percentagem da dose
injectada por cada órgão (% A.I./órgão) ou por grama de órgão (% A.I./g órgão).
A excreção total da actividade assume-se como a diferença entre a actividade
injectada no animal e a actividade medida imediatamente após o seu sacrifício do
animal, expressa como percentagem da dose injectada (% A.I.). A actividade total no
sangue, osso e músculo foi calculada assumindo que estes órgãos constituíam 6, 10 e
40 % do peso total do animal, respectivamente.
Procedimento Experimental
208
Tabela 4.3 – Resultados de biodistribuição (% A.I./órgão) após administração dos
complexos Tc4, Tc5 e Tc6 em ratinhos CD-1.
Tc4 Tc5 Tc6
1 h 4 h 1 h 4 h 1 h 4 h
Sangue 0,8 ±±±± 0,1 0,27 ± 0,03 0,77 ± 0,08 0,30 ± 0,05 0,62 ± 0,04 0,27 ± 0,04
Rim 0,7 ± 0,2 0,5 ± 0,2 1,27 ± 0,07 0,8 ± 0,1 0,81 ± 0,05 0,66 ± 0,05
Fígado 1,5 ± 0,4 1,0 ± 0,4 2,6 ± 0,7 1,3 ± 0,5 2,17 ± 0,09 1,43 ± 0,06
Intestino 1,2 ± 0,2 1,5 ± 0,3 1,8 ± 0,6 2,7 ± 1,5 1,6 ± 0,1 1,9 ± 0,2
Baço 0,04 ± 0,02 0,02 ± 0,01 0,06 ± 0,03 0,04 ± 0,02 0,051 ± 0,007 0,03 ± 0,01
Coração 0,02 ± 0,01 0,010 ± 0,005 0,03 ± 0,01 0,01 ± 0,005 0,029 ± 0,004 0,02 ± 0,01
Pulmões 0,11 ± 0,03 0,07 ± 0,04 0,100 ± 0,005 0,06 ± 0,02 0,16 ± 0,02 0,08 ± 0,01
Estômago 0,3 ± 0,2 0,25 ± 0,08 0,12 ± 0,04 0,15 ± 0,07 0,2 ± 0,1 0,14 ± 0,02
Músculo 1,2 ± 0,6 0,9 ± 0,6 1,9 ± 0,3 1,4 ± 0,4 3,6 ± 0,7 1,9 ± 0,3
Osso 7,5 ±±±± 1,8 7,9 ±±±± 1,4 18,5 ± 1,2 18,7 ± 2,8 30,3 ±±±± 1,3 22,8 ± 2,2
Tabela 4.2 – Resultados de biodistribuição (% A.I./órgão) após administração dos
complexos Tc1 e Tc2 em ratinhos CD-1 fêmea.
Tc1 Tc2
5 min 1 h 4 h 5 min 1 h 4 h
Sangue 4,4 ± 0,2 1,1 ±0,3 0,8 ± 0,1 6,4 ± 2,2 0,7 ± 0,3 0,26 ± 0,05
Rim 6,7 ± 1,8 1,5 ± 0,7 0,4 ± 0,2 5,3 ± 0,9 0,8 ± 0,2 0,40 ± 0,06
Fígado 28,2 ± 2,6 8,9 ± 2,7 6,2 ± 0,3 26,2 ± 1,4 14,1 ± 1,7 4,5 ± 1,5
Intestino 23,5 ± 3,9 50,8 ± 5,0 43,3 ± 12,0 5,8 ± 1,3 22,8 ± 1,6 23,9 ± 6,3
Baço 0,3 ± 0,1 0,26 ± 0,03 0,32 ± 0,06 0,18 ± 0,06 0,02 ± 0,01 0,03 ± 0,02
Coração 0,12 ± 0,02 0,04 ± 0,01 0,04 ±0,01 0,25 ± 0,06 0,03 ± 0,01 0,02 ± 0,01
Pulmões 2,3 ± 0,6 0,3 ± 0,1 0,19 ± 0,02 0,7 ± 0,3 0,08 ± 0,03 0,05 ± 0,01
Estômago 0,7 ± 0,4 0,3 ± 0,1 0,22 ± 0,05 0,6 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,17 ± 0,05
Músculo 4,1 ± 0,7 1,1 ± 0,2 0,92 ± 0,07 11,7 ± 0,4 0,6 ± 0,2 0,17 ± 0,04
Osso 1,4 ± 0,2 0,4 ± 0,1 0,38 ± 0,03 4,6 ± 0,4 0,3 ± 0,1 0,22 ± 0,02
Capítulo 4
209
Tabela 4.5 – Resultados de biodistribuição (% A.I./órgão) após administração do
complexo Tc7 em ratinhos CD-1.
Tc7
Sem Probenecide Com Probenecide
1 h 4 h 1 h 4 h
Sangue 0,5 ± 0,1 0,16 ± 0,04 2,3 ± 0,5 0,35 ± 0,09
Rim 5,5 ± 0,6 5,1 ± 0,5 5,6 ± 1,1 3,5 ± 0,8
Fígado 3,7 ± 0,2 3,1 ± 0,8 5,10 ± 0,09 4,5 ± 0,2
Intestino 1,9 ± 0,4 3,8 ± 1,1 3,9 ± 0,2 4,2 ± 0,2
Baço 0,08 ± 0,02 0,09 ± 0,04 0,19 ± 0,01 0,14 ± 0,03
Coração 0,04 ± 0,01 0,03 ± 0,01 0,09 ± 0,05 0,044 ± 0,008
Pulmões 0,24 ± 0,06 0,22 ± 0,02 0,4 ± 0,1 0,235 ± 0,006
Estômago 0,5 ± 0,1 0,3 ± 0,2 0,27 ± 0,06 0,16 ± 0,01
Músculo 3,9 ± 0,6 3,0 ± 0,2 3,5 ± 1,5 1,9 ± 0,3
Osso 33,3 ±±±± 1,1 32,9 ± 5,2 12,5 ±±±± 1,6 21,1 ±±±± 3,1
Tabela 4.4 – Resultados de biodistribuição (% A.I./órgão) após administração dos
complexos Tc5 e Tc6 em ratinhos Balb-c.
Tc5 Tc6
1 h 4 h 6,5 h 1 h 4 h 6,5 h
Sangue 0,48 ± 0,01 0,16 ± 0,04 0,13 ± 0,03 0,43 ± 0,04 0,18 ± 0,04 0,18 ± 0,01
Rim 1,1 ± 0,1 0,90 ± 0,02 0,7 ± 0,2 0,8 ± 0,1 0,6 ± 0,1 0,6 ± 0,1
Fígado 1,82 ± 0,05 1,3 ± 0,1 1,1 ± 0,3 2,3 ± 0,07 1,5 ± 0,6 2,0 ± 0,2
Intestino 3,0 ± 0,2 1,4 ± 0,1 0,73 ± 0,01 2,18 ± 0,02 0,7 ± 0,2 0,7 ± 0,3
Baço 0,06 ± 0,02 0,06 ± 0,01 0,04 ± 0,01 0,11 ± 0,02 0,02 ± 0,04 0,11 ± 0,02
Coração 0,06 ± 0,02 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,002 0,03 ± 0,02 0,02 ± 0,003
Pulmões 0,09 ± 0,02 0,06 ± 0,01 0,05 ± 0,07 0,32 ± 0,04 0,23 ± 0,08 0,20 ± 0,07
Estômago 0,17 ± 0,05 0,06 ± 0,01 0,06 ± 0,01 0,09 ± 0,01 0,05 ± 0,01 0,07 ± 0,05
Músculo 2,6 ± 0,6 2,0 ± 0,4 1,5 ± 0,8 1,9 ± 0,4 1,2 ± 0,1 1,1 ± 0,3
Osso 28,,,,6 ±±±± 0,,,,4 23,,,,2 ±±±± 2,,,,6 12,,,,8 ±±±± 2,,,,4 20,,,,7 ±±±± 4,,,,9 20,,,,9 ±±±± 2,,,,2 18,,,,9 ±±±± 1,,,,5
Procedimento Experimental
210
A estabilidade in vivo dos complexos foi determinada por análise por RP-HPLC
de amostras de urina e sangue. As amostras foram recolhidas após sacrifício dos
ratinhos efectuado 1 hora após injecção dos complexos de 99mTc.
Tabela 4.7 – Resultados de biodistribuição (% A.I./g órgão) após administração do complexo 99mTc-MDP em ratinhos CD-1 e Balb-C.
CD-1 Balb-c
1 h 4 h 1 h 4 h 6,5 h
Sangue 0,19 ± 0,03 0,15 ± 0,01 0,4 ± 0,1 0,28 ± 0,02 0,24 ± 0,02
Rim 1,7 ± 0,3 2,0 ± 0,6 2,4 ± 0,4 2,2 ± 0,3 1,7 ± 0,2
Fígado 4,9 ± 1,9 1,0 ± 0,2 3,7 ± 1,6 3,0 ± 0,5 2,2 ± 0,4
Intestino 0,19 ± 0,05 0,38 ± 0,05 0,24 ± 0,04 0,6 ± 0,1 0,2 ± 0,1
Baço 1,9 ± 1,0 1,7 ± 0,7 2,9 ± 0,6 9,7 ± 0,7 7,6 ± 1,6
Coração 0,21 ± 0,07 0,2 ± 0,1 0,3 ± 0,2 0,6 ± 0,1 0,5 ± 0,2
Pulmões 0,26 ± 0,03 0,4 ± 0,2 0,4 ± 0,3 1,1 ± 0,3 0,7 ± 0,2
Estômago 0,57 ± 0,4 0,4 ± 0,2 1,0 ± 0,7 1,5 ± 0,4 0,4 ± 0,1
Músculo 0,4 ± 0,1 0,3 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,5 ± 0,1
Osso 12,7 ±±±± 2,7 12,7 ±±±± 1,4 17,1 ±±±± 2,4 19,8 ±±±± 1,5 18,2 ±±±± 3,1 Excreção total 53,1 ± 5,0 57,6 ± 1,7 49,1 ± 6,1 56,8 ± 0,9 59,7 ± 1,7
Tabela 4.6 – Resultados de biodistribuição (% A.I./órgão) após administração do
complexo 99mTc-MDP em ratinhos CD-1 e Balb-C.
CD-1 Balb-c
1 h 4 h 1 h 4 h 6,5 h
Sangue 0,23 ± 0,02 0,19 ± 0,02 0,4 ± 0,2 0,25 ± 0,01 0,21 ± 0,02
Rim 0,6 ± 0,1 0,7 ± 0,2 0,7 ± 0,1 0,58 ± 0,05 0,49 ± 0,06
Fígado 5,8 ± 2,1 1,3 ± 0,4 3,8 ± 1,9 2,5 ± 0,2 2,0 ± 0,3
Intestino 0,44 ± 0,05 0,8 ± 0,1 0,4 ± 0,07 0,9 ± 0,2 0,4 ± 0,1
Baço 0,25 ± 0,11 0,19 ± 0,06 0,13 ± 0,06 1,0 ± 0,1 0,8 ± 0,2
Coração 0,03 ± 0,01 0,03 ± 0,01 0,04 ± 0,02 0,06 ± 0,02 0,07 ± 0,03
Pulmões 0,07 ± 0,01 0,10 ± 0,06 0,08 ± 0,02 0,22 ± 0,05 0,14 ± 0,04
Estômago 0,3 ± 0,2 0,3 ± 0,2 0,2 ± 0,2 0,27 ± 0,03 0,18 ± 0,04
Músculo 3,1 ± 0,7 2,4 ± 0,6 3,1 ± 0,7 2,4 ± 0,8 2,7 ± 0,4
Osso 26,0 ± 4,1 25,9 ± 1,9 24,7 ±±±± 5,1 29,2 ±±±± 4,1 26,9 ±±±± 3,8
Excreção total 53,1 ± 5,0 57,6 ± 1,7 49,1 ± 6,1 56,8 ± 0,9 59,7 ± 1,7
Capítulo 4
211
As amostras de urina foram previamente centrifugadas e filtradas (filtro
Millipore 0,22 µm) antes de analisadas por RP-HPLC.
As amostras de sangue foram centrifugadas (3000 rpm, 15 min, 4 ᵒC), o soro foi
tratado com etanol, numa razão de 2:1 (v/v de etanol/soro), para precipitar as
proteínas. As misturas foram novamente centrifugadas (3000 rpm, 15 min, 4 ᵒC) e o
sobrenadante foi filtrado (filtro Millipore 0,22 µm) e analisado por RP-HPLC.
4.6.2. Cintigrafia em câmara - gama
Para a vizualização da biodistribuição in vivo, administraram-se por via
intravenosa ca. 37 MBq de cada um dos complexos Tc5, Tc6, Tc7 e 99mTc-MDP, a
grupos separados de ratos Sprague Dawley. As imagens de corpo inteiro foram obtidas
com uma câmara - gama (GE) equipada com um colimador LEAP e ligada a um
computador Starcam 4000i. Todas as imagens foram obtidas numa matriz de 128 x
128, 2h após injecção dos complexos radioactivos.
A aquisição das imagens cintigráficas foi realizada com o apoio da Drª
Guilhermina Cantinho e do Sr. Vieira Marques, no Instituto de Medicina Nuclear da
Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.
Referências Bibliográficas
Referências
215
REFERÊNCIAS
1. Raggatt, Liza J. and Partridge, Nicola C., Cellular and Molecular Mechanisms of Bone
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Referências
226
Anexos
229
ANEXOS
Espectros Bidimensionais de Ressonância Magnética Nuclear:
1H –
1H COSY e
1H –
13C HSQC.
Figura A.1 – Ampliação do espectro de 1H -
1H COSY de L5, na zona δ 4,4 - 1,6 (D2O).
2.002.503.003.504.00
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
ppm
ppm
a b
a
b + h
b
a
a b
h
h
i
i
i g
g
g
f
f
f
e f
e
e
e
f
f g
h
i c + d
c + d
Mepz Mepz
Mepz
Mepz
L5
Anexos
230
Figura A.2 – Espectro de 1H –
13C HSQC de L5 (D2O).
13253850637588100
2.0
3.0
4.0
5.0
c
ppm
ppm
2 x Mepz
a
b
a
b + h
b
a
d
d
h
h
i
g
g
f
f
f
e i
e
e + i
g c + d
c
C(4)pz
Mepz
Mepz
H(4)pz
H(4)pz
C(4)pz
Mepz
L5
Figura A.3 - Espectro de 1H –
ppm
Re5
1H COSY de Re5 (D2O).
3.04.05.06.0ppm
a’
H(4)pz
a b’
NH
d d’
NH
g
NH
NH d’
d
NH
d’
NH
c + c’
NH
H(4)pz
2 x Mepz
NH NH
h/h’ b g’
Mepz
NH
d
H(4)pz
Zona ampliada Fig. A.4
Anexos
231
2.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
ppm
f/f’ + i/i’
d’
e + e’
2 x Mepz
H(4)pz Mepz
Fig. A.4
Anexos
232
Figura A.4 - Ampliação do espectro de
ppm
Re5
Ampliação do espectro de 1H –
1H COSY de Re5 na zona δ 4,5 - 1,7.
2.503.003.504.00ppm
a’ a b’ d d’ g
c + c’
2 x Mepz
NH
h/h’ b g’
d’ d c d’
NH d’
b’ b
b b’
c d
d c
d’
d
d’
c
ga’
a
a’
a b a
b a
a’ b’
a’ b’
d’ NH
f g
i h
1,7.
2.00
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
ppm
f/f’ + i/i’
e + e’
2 x Mepz
d’
d’
f g
i h
Anexos
233
Figura A.5 – Espectro de 1H –
13C HSQC de Re5 (D2O).
1733506783100
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
ppm
ppm
a’ a
f/f’ + i/i’
b’
d
d’
g
e + e’
c + c’
H(4)pz
2 x Mepz
NH
NH
h/h’ + b + g’
2 x Mepz
a b d
h
g f
e + i
c C(4)pz
j
H(4)pz
C(4)pz
g/g’
a/a’
e + i f/f’ Mepz b’
b
c
d’
d
h
Re5
