Efeito da desnaturação térmica na transição vítrea mecânica temperatura dos sistemas de proteína / co-soluto globular

Resumo

O trabalho elaborado misturas de alto sólidos de proteínas de soro ou albumina do soro bovino com um amorfo co-solutos (xarope de glicose) e examinou o seu comportamento de transição do vidro a temperaturas abaixo de zero. O interesse nestas matrizes condensado foi em relação a que ponto desnaturação térmica e subsequente agregação das moléculas proteicas afeta vitrificação e, por conseguinte, eles foram submetidos a regimes distintos de aquecimento seguido de arrefecimento. Pequeno-deformação oscilação dinâmica em cisalhamento é conhecida para responder a alterações na formação da rede como uma função do tratamento térmico, embora relatórios publicados se concentrado em amostras aquosas de hidro coloide de baixa sólidos, e foi escolhido para examinar presentemente a viscoelasticidade dos seus homólogos de alto sólidos. Os resultados foram ainda mais em comparação com aqueles a partir de um micromolecular técnica, isto é, calorimetria diferencial de varrimento modulado. Parece que termicamente induzido ligação cruzada é facilmente registada no que é conhecido na literatura como o mecânico ou rede temperatura de transição de vidro, enquanto que a Tg calorimétrico não é afetada pela extensão de associações poliméricas nestas misturas. Além disso, o protocolo térmico empregues presentemente resulta em consideráveis diferenças nas previsões sobre o Tg mecânica, que devem refletir três morfologias dimensionais distintas nestes sistemas de proteína globular e co-solutos.

1. Introdução

A transição vítrea pode ser descrita como a transformação reversível de um material amorfo de líquido para a consistência vítrea que exibe uma reduzida mobilidade molecular (Badii,Macnaughtan, & Farhat, 2005). Normalmente, uma matriz vítrea é caracterizada por uma elevada viscosidade de cerca de 1012 Pa.s, o que significa que fluxo residual é através de uma velocidade de difusão muito baixa (Slade & Levine,1991). A vitrificação é um processo cineticamente presos dependendo o tipo de soluto e fatores externos, incluindo a temperatura, estresse mecânico, pressão hidrostática ou escala de tempo de medição (Goff, 1994). Propriedades características de uns submetidos materiais de transição de vidro são a energia livre, mudança no volume e estresse /relaxamento entalpia que permitem medições com as técnicas espectroscopia de mecânica, calorimetria de varrimento diferencial, dilatometria, ressonância magnética nuclear e outros (Kasapis,2008). Em materiais alimentares, o conceito de transição de vidro tem sido considerado como um índice de comportamento físico-químicas que reflete as taxas de processos moleculares de deterioração (Vrentas & Duda,1978). Tem sido argumentado que a arquitetura de uma amorfa matriz em alimentos congelados ou desidratados influencia a sua estabilidade, bem como atributos organolépticas durante o processamento e armazenamento. Este levou a estudos intensivos para desvendar a relação função de estrutura em biomateriais sólidos elevados que vão desde pequenas orgânica moléculas de açúcares (por exemplo) para os hidros coloides e suas misturas, (aglutinante Baschnagel, e Paul, 2003). Convencionalmente, a técnica de calorimetria diferencial de varrimento no modo de micro ou modulada tem sido utilizado para seguir o processo de vitrificação e estimar a temperatura de transição vítrea (Tg) de um bi material

(Mazzobre, Aguilera, & Buera, 2003). Este é conseguida através da medição da diferença de absorção de energia por uma substância e sua referência. Na ausência de uma teórica robusta estrutura para atribuir significado físico para um determinado ponto de a alteração na capacidade calorífica sigmoidal, isto é, identificar um único valor de Tg, uma série de marcadores empíricos tem sido utilizada para demarcar a início, meio e conclusão da mudança no fluxo de calor. Ele também tem observou-se que a Tg calorimétrico de açúcares, por exemplo, uma alta-dextrose equivalente de xarope de glicose, depende da concentração do agente de volume, com o pequeno, mas industrialmente relevantes para o desenvolvimento do produto, as adições de proteína de gelificação ou agindo polissacarídeo como uma mera contaminação cruzada (Kasapis &Sablani, 2005). Recentemente, a gelificação hidro coloides acima mencionada / misturas de açúcar foram examinados para relaxamento de tensão sobre o vidro região de transição usando deformação pequena oscilação dinâmica cisalhamento (Kasapis, 2008). Gravação propriedades visco elásticas via armazenamento (G0) e o módulo de perdas (G00) e utilizando a chamada "Princípio da superposição temperatura tempo" (TTS) permite a sincronização do tempo experimental e a temperatura em intervalos para além dos limites da tecnologia atual ou disponibilidade de laboratório instalações (Ferry, 1980). Além disso, a abordagem tem sido amplamente utilizada por cientistas de materiais para adquirir entendimento mecanicista de vidro transição fenômenos através do conceito de volume livre. A teoria defende que a embalagem irregular cria espaços vazios ou buracos entre os segmentos poliméricos adjacentes, conhecidas como volume livre, que facilitam movimentos moleculares. Em volume médio, livre dentro polímeros fundidas contagens para até 30% do volume total, e ele colapsa até cerca de 3% do volume total durante o arrefecimento numa nomeadamente temperatura conhecida como a temperatura de transição vítrea (Cangialosi, Schut, van Veen, e Picken, 2003). Mais cedo, Jiang, Kasapis e Kontogiorgos (2011) demonstraram que o peso molecular do soluto é um dos fatores que regulam que afeta a temperatura de transição vítrea mecânica. Ao fazê-lo, empregaram quatro frações moleculares distintos de gelatina (Mw ¼ 318, 284, 229 e 197 kDa), em mistura com o xarope de glicose como co-solutos. As fracções com peso molecular mais elevado apresentaram anteriormente vitrificação, por oposição aos homólogos de baixo peso molecular, a um nível total de sólidos de 80% em preparações (variação de Tg de cerca de dezesseis graus centígrados vistos na tan d máximos). O efeito de o aumento da concentração de sistemas hidro coloidais individuais no temperatura de transição de vidro também foi examinada como é o reológico padrão de vitrificação em misturas binárias de hidro coloide (Altay & Gunasekaran, 2012; Whitehouse, Ashby, Abeysekera, & Robards, 1996). Tanto quanto sabemos, este é o primeiro estudo que explora a relação entre Tg mecânica e extensão da ligação cruzada na rede proteína globular como um resultado dos distintos regimes de desnaturação térmica.

2. Materiais e métodos

2.1. Materiais

2.1.1. Isolado proteico de soro (WPI)

O pó utilizado na presente investigação foi adquirido a partir de Mg Nutritionals, Murray Goulburn Co-operative Co. Ltd., Vic, Austrália. Ingrediente composição de acordo com o fornecedor foi de 91,3% de proteína, 0,7% de gordura, 3,5% de humidade, 3,8% de cinzas e 0,44% de lactose.

2.1.2. Albumina de soro bovino (BSA)

Isso foi um produto do SigmaeAldrich Pty. Ltd., NSW, Austrália. Veio sob a forma de um pó liofilizado de albumina a partir de soro de bovino, com 98% de pureza e peso molecular de aproximadamente 66 kDa, como observado por eletroforese.

2.1.3. Xarope de glicose

A solução de alta viscosidade foi adquirida a partir de Cerestar (Manchester, UK) com um equivalente de dextrose (DE) de 42. De acordo com informação do fornecedor, o nível de sólidos era de 82% (w / w) e a solução permaneceu amorfo após arrefecimento até abaixo de zero temperaturas devido à sua natureza polidispersa. Isso foi confirmado a partir da relação entre o grau de polimerização e a superfície Área (%) do espectro de xarope de glicose utilizando permeação em gel cromatografia (Tsoga, Kasapis, e Richardson, 1999). Percentagens em preparações desta investigação referem-se a secar sólidos (w / w).

2.2. Métodos

2.2.1. Preparação de amostra

Sistemas sólidos elevados de isolado proteico de soro / xarope de glicose e albumina de soro bovino / xarope de glicose foram formuladas com 15% (W / w) de proteína com 65% (w / w) de co-solutos. Um teor total de sólidos oitenta por cento em formulações foi utilizado para alcançar grande vitrificação a uma taxa de arrefecimento de baixa (1? C / min) deste estudo, e ele baseou-se em observações anteriores de que os níveis mais baixos de sólidos (<70%) em hidro coloide misturas / co-soluto deu parcialmente amorfa matriz devido à formação de gelo (Kasapis & Al-Marhoobi, 2005). O xarope de glucose foi misturado com 10 mM de uma solução de CaCl2 usando um obteve-se um agitador magnético até que uma solução clara. Para isso, quantidades requeridas de WPI ou BSA foram adicionados à temperatura ambiente em lotes temperatura. As soluções de proteína / co-soluto foi ainda agitado durante um par de horas para facilitar a dispersão e refrigerado durante a noite para garantir a hidratação adequada. Todas as amostras foram analisadas usando reologia ou calorimetria após o armazenamento durante a noite, tal como detalhado abaixo:

2.2.2. Reologia

Três experiências distintas foram realizadas na reológica parte do trabalho:

i) misturas de proteína / co-solutos foram aquecidos a 85? C a 1? C / minuto seguido de um período isotérmico a essa temperatura durante 30 min e uma corrida de arrefecimento a temperaturas abaixo de zero na mesma taxa de varredura. Este protocolo de trabalho assegurado extensa desnaturação e subsequente agregação das globulares moléculas de proteína.

ii) para obter uma rede proteína parcialmente desnaturada, materiais foram aquecidos a 85? C, sem implementar a isotérmica executar, e arrefeceu-se a temperaturas abaixo de zero a 1? C / min.

iii) amostras naturais desprovidas de qualquer tipo de tratamento térmico foram arrefeceu-se desde a temperatura ambiente para temperaturas abaixo de zero a 1? C / min. Durante essas rotinas experimentais, as medidas foram tomadas usando deformação pequena oscilação dinâmica em cisalhamento com uma controlada estirpe rheometer AR-G2 (TA Instruments, New Castle, DE). Uma geometria de placas paralelas de 10mmdiameterwas envolvidos, e as arestas de amostras foram cobertas com óleo de silicone (50 CS) para minimizar a perda de

umidade. A frequência constante de 1 rad / s e tensão de 0,01% (ou seja, dentro da região visco elástica linear) foram aplicados em todo o aquecimento seguido de arrefecimento-por-rotina. Finalmente, amostras foram aquecidos mais uma vez a partir de temperaturas abaixo de zero, e frequência varreduras foram realizadas dentro do experimentalmente Acessível Faixa de 0.1e100 rad / s em um intervalo de temperatura de quatro graus centígrados. Na discussão do manuscrito, as abreviaturas seguintes são utilizadas: extensivamente desnaturada, parcialmente desnaturada e nativa sistemas de proteína / co-solutos do soro do leite são: W1, W2 e W3, respectivamente. Da mesma forma, extensivamente desnaturada, parcialmente desnaturada e nativa sistemas de albumina / co-solutos de soro bovino são: B1, B2 e B3, respectivamente. Todas as rotinas térmicas (testes isócronos) foram complementadas por varreduras de frequência (testes isotérmicos) e realizada em duplicado para produzir traços efetivamente sobrepostas. Para cada preparação experimental (por exemplo W1), houve arrefecimento e aquecimento corridas e uma adição de oito varrimentos de frequência elevando o total número de réplicas para todas as amostras a cento e vinte. Este bom volume de resultados experimentais permitiu a implementação válida do princípio da temperatura tempo superposição de derivar curvas mestre de viscoelasticidade para a previsão de transição vítrea temperaturas. Modelação na região de transição de vidro foi efetuada com a estrutura combinada de volume livre / WLF equação e no estado vítreo usando o Arrhenius modificado equação. Repetições de cada concentração experimental produzida uma variação de temperatura de transição vítrea de um ou dois graus. Considerando que o período de previsões de Tg para extensivamente desnaturada redes de proteínas globulares nativas foi de cerca de quarenta graus (Tabela 1).

2.2.3. Calorimetria exploratória diferencial modulada (MDSC)

A análise térmica foi realizada utilizando Q2000 (instrumentos de AT, New Castle, DE) anexado com um RCS90 sistema de refrigeração refrigerado. Pequenas quantidades de amostra (W15 mg) foram carregados em herméticas panelas de alumínio à temperatura ambiente, arrefecida a? 90? C, aquecida a 90? C, arrefeceu-se novamente para? 90? C, e aqueceu-se mais uma vez a 90? C a 1? C / min para igualar a velocidade de varrimento de as rotinas reológicas. Inicial passo de arrefecimento permite a observação da Tg calorimétrica na proteína / mistura de co-solutos, enquanto a proteína é no estado nativo, enquanto o segundo passo de arrefecimento monitores de entalpia com a relaxações proteína a ser extensivamente desnaturada. A taxa de modulação de 0,53? C a cada 40 s foi implementada em toda a experimentação corre. O fluxo de calor calorimétrico foi calibrado utilizando uma rastreável padrão de índio (FHD ¼ 28,3 J / g) de resposta e a capacidade de calor com um padrão de safira. Três corridas foram geralmente tomadas e a média de traços que se sobrepõem essencialmente em termos de temperatura banda de alterações sigmoidal foi considerada como a transição vítrea região a temperaturas abaixo de zero.

3 Resultados e discussão

3.1. Vitrificação de sistemas de proteína / co-soluto globular observado através de uma janela térmica como mencionado nas observações introdutórias desta investigação, literatura tem discutido amplamente os padrões de vitrificação em sistemas de polissacarídeos e gelatina em relação ao processamento e ambiente físico, mas é desprovido de tratados sobre vidro fenómenos de transição em proteínas globulares como uma função da extensão do tratamento térmico. Para facilitar a discussão sobre o assunto, o atual inquérito optou por trabalhar em dois globulares distintas proteínas, isto é, proteína de soro de leite e albumina de soro bovino. O antigo contém cerca de cinquenta por cento beta-lactoglobulina (em vaca e

ovelha leite), que inclui uma parte relativamente pequena (3-volta) a-hélice e apenas duas ligações dissulfureto que conduzem a um hidrofóbico facilmente deformável núcleo sob tratamento térmico ou pressurização (Kontopidis, Holt, e Sawyer, 2004). Em contraste, este último é mantido no lugar por dezessete ligações dissulfureto e um teor de alfa-hélice estimado de cinquenta e quatro por cento em vez de fazer a sua molécula resistente aos estímulos externos (Hines & Foegeding, 1993). Estudos anteriores em níveis baixos e intermediários de sólidos (10e70%, w / w) em proteína de soro de leite / xarope de glucose e albumina de soro bovino /misturas de xarope de glicose demonstraram uma progressão na mecânica resistência com o aumento da concentração de co-solutos devido interações proteína-proteína aprimorados (George, Lundin, & Kasapis 2013; Savadkoohi, Bannikova, Kasapis, & Adhikari, 2014).

Tabela 1

Os valores dos parâmetros de volume WLF / livre e previsão da transição vítrea temperaturas para as amostras globulares proteína / xarope de glicose desta investigação tratados com regimes térmicos distintos.

Além disso, adição do co-solutos resultou em uma melhor estabilidade térmica de moléculas de proteína, deslocando o processo de desnaturação a temperatura mais elevada. As observações foram apoiadas por microscopia eletrônica mostrando redes coerentes com tamanho reduzido de proteína agrega na presença de níveis crescentes de xarope de glicose, como oposição aos grupos de espessura e aleatórios para sistemas de globular proteína por si só. O trabalho foi restrito a temperaturas experimentais entre as congelamento e ebulição pontos de água. Na principal série de experiências no presente trabalho, foram utilizadas concentrações fixas de WPI e BSA em mistura com xarope de glucose a um nível total de sólidos de 80% (w / w) e procurado sua mecânica resposta a um regime térmico variável que chega a temperaturas abaixo de zero. Melhoria da discussão dos espectros mecânica que exige uma linha de base da propriedade estrutural for identificada para estas misturas, e este é comumente fornecida pelo trabalho de exploração diferencial calorimetria (Rahman, 1999). Cuidados devem ser tomados para que experimentais configurações estão alinhadas, por exemplo, em termos de banda e temperatura taxa de varredura, de modo que as comparações significativas de eventos moleculares podem ser levadas a cabo entre as duas técnicas. FIG. 1 (a, b) explorar o comportamento térmico da proteína de 15% / 65% amostras de xarope de glicose em dois estados termodinâmicos distintas. Arrefecimento a partir de temperatura ambiente até temperaturas abaixo de zero, seguido por aquecimento dentro destas folhas faixa de temperatura, é claro, intacto a globular conformação da proteína. Além disso aquecimento a 90? C extensivamente desnatura a molécula de proteína, e subsequente arrefecimento e passos de aquecimento com a mesma taxa de digitalização (1? C / min) refletir as mudanças no fluxo de calor das matrizes desnaturadas. Em ambos os casos, existe uma trace sigmoidal óbvia dentro da faixa de temperatura plotados presentemente, i? 20 a? 60? C. vestígios de fluxo de calor, tanto para nativos e proteínas desnaturadas extensivamente são

efetivamente idênticas confirmando uma passagem pela região de transição vítrea. Como antes, o ponto médio da temperatura tem sido considerado como um índice de empírica conveniência para o calorimétrico Tg (Ngai & Roland, 2002). Aquilo foi verificou-se que- 47,5? 1,0? C para todos os replicados de ambos nativos e extensivamente desnaturado WPI ou BSA preparações à co-soluto. Deve notar-se que há observações na literatura de as temperaturas de transição de vidro calorimétricos para 80% (w / w) xarope de glicose, e misturas de gelificação polissacárido (até 2%, w / W) com o xarope de glucose a um nível total de sólidos de 80%, que eram verificou-se que cerca de? 46? C (Kasapis & Srinivas, 2010). Os resultados são consistentes com um protocolo de sondagem em DSC que monitora em grande parte a relaxação térmica de pequena molécula co-solutos, como oposição ao longo movimentos segmentares a estes níveis de adição de proteína. A rede morfologia de preparações sólidas elevadas de proteína globular com cosolute será examinada nas seções a seguir usando pequenos deformação oscilação dinâmica.

3.2. Efeito do tratamento térmico sobre a viscoelasticidade de alta-sólido

Sistemas de proteína / co-soluto globular uma vez que o perfil micromolecular de vitrificação foi gravado usando MDSC na seção anterior, voltamos nossa atenção para macromoleculares aspectos do desenvolvimento estrutura nestas misturas. Recentemente, a técnica de oscilação dinâmica de cisalhamento tem foi utilizada para proporcionar o armazenamento (G0) e perda (G00) do módulo altas matrizes sólidas da borracha para Glassy estado principalmente em açúcares, polissacáridos e gelatina (Mitchell, 2000). A abordagem ajudará presentemente na elucidação do efeito de termicamente ativado reticulação na relaxação estrutural de condensados sistemas de proteínas globulares. FIG. 2a reproduz a variação na viscoelasticidade do soro misturas de xarope de glicose-proteína que foram aquecidos a 85? C durante 30 min (W1), apenas aquecida a 85? C (W2), ou diretamente a partir arrefecida ambiente até temperaturas abaixo de zero (W3).

Um desenvolvimento espetacular na formação da estrutura foi registado mais cedo após arrefecimento a partir de 85? C (Amostras W1 e W2) que abrange as cinco ordens de grandeza na extremidade da rotina experimental. Por exemplo, os valores de armazenamento abordagem módulo assintoticamente 109,5 Pa, a? 20? C na proteína / amostra de co-solutos (W2) que foi aquecida a 85? C e em seguida arrefeceu-se imediatamente a temperaturas abaixo de zero. A essa temperatura, haja uma separação máxima entre os dois traços e módulo um componente elástico dominante, o que significa o advento do estado vítreo (Ward & Hadley, 1993). Os altos valores de cisalhamento módulo dentro do estado vítreo refletir a difusão limitada mobilidade do biomaterial, o alongamento e flexão de química títulos e transições b das cadeias poliméricas (Rahman, Al- Marhubi, e Al-Mahrouqi, 2007). Observações qualitativas congruentes foram obtidos para bovinos albumina de soro em mistura com o xarope de glucose submetidos a tratamentos e dos níveis de ligação cruzada para produzir os térmicos similares perfis de vitrificação de amostras B1, B2 e B3 (Fig. 2B). Por exemplo, Conjuntos de alta densidade de moléculas globulares que mantêm a conformação nativa em B3 mostram um aumento acentuado na viscoelasticidade de cerca de seis ordens de grandeza a partir de 104,5 Pa à temperatura ambiente (20? C) a Pa w1010 no ambiente abaixo de zero da parte inferior da experimentação (? 50? C). Em ambas as proteínas globulares, O tratamento prolongado resultados térmicos em formação da estrutura início e acelerada vitrificação, com W1 a entrada no estado vítreo a cerca de 0? C, enquanto que a mesma está atrasada na W3 (cerca de? 40? C). Uma similar diferença de cerca de trinta e cinco graus centígrados na vitrificação foi observada nas proteínas BSA totalmente curado e nativas. O aumento da reticulação com resultados prolongados de tratamento térmico num rastreio do módulo de armazenamento dominante, com os valores de d tan (G00 / G0), sendo bem abaixo de um, por exemplo, a 30? C, o que está dentro a região de transição de vidro de B1 (Fig. 2b). Em contraste, reduzida reticulação em redes proteína nativa produz vestígios quase sobrepostos na região de transição de vidro do B3 (por exemplo,? 10? C), com o valor de tan

sendo quase um d. Os resultados estão de acordo, em termos de deslocamento da banda e da temperatura visco elástico magnitude da vitrificação, com o trabalho relatado na introdução do papel em quatro fracções moleculares distintas de gelatina. Ele apresentou o conceito da morfologia da rede, induzida presentemente por desnaturação térmica, aumentando molecular polimérico peso e adição de contra íons em polissacarídeos iônicos (Kasapis, Al-Marhoobi, & Giannouli, 1999), como um importante parâmetro na análise do vidro transição mecânica comportamento em biomateriais.

3.3. Aspectos teóricos sobre o efeito do tratamento térmico sobre a propriedades mecânicas de sistemas de proteína / co-soluto globular

Trabalhar aspectos qualitativos até agora abordados do molecular comportamento nas amostras sólidas altas desta investigação usando análise termomecânica. Observações empíricas pode ser tratada com abordagens teóricas bem estabelecidos de "sintética pesquisa de polímeros "que a tentativa de distinguir entre as contribuições da temperatura experimental e tempo (ou seja, 1 / frequência) de observação para a resposta mecânica geral (Ronan, Alshuth, Jerrams, & Murphy, 2007). A utilidade de os dois deconvoluting contribuições encontra-se na estimativa de uma transição vítrea teórica temperatura que se baseia nos índices empíricos de conveniência relatado anteriormente, isto é, tan d maxima, queda nos valores de G0 do estado vítreo após arrefecimento, etc (Peleg, 1992). O primeiro passo nesta abordagem envolve a gravação de uma série de varreduras de armazenamento de frequência e o módulo de perdas entre 0,1 e 100 rad / s à temperatura conveniente intervalos de, por exemplo, quatro graus centígrados. FIG. 3 (a, b) (reproduzir leituras selecionados a partir de? 24 a? 52? C) durante a amostra de isolado proteico de soro de leite e xarope de glicose, que foi arrefeceu-se diretamente a partir de temperatura ambiente até temperaturas abaixo de zero (W3). Resultados foram também obtidos para as duas preparações que restantes foram aquecidos a 85? C com e sem pistas isotérmicas (W1 e W2, respectivamente), mas não estão representados aqui, para evitar a desordem. Semelhante trabalhar em xarope de albumina bovina / rendimentos xarope de glicose mecânica os espectros de G0 G00 e que são ilustrados de? 21 a? 49? C durante a amostra nativa (B3) na fig. 4 (a, b). Também foram recolhidos dados para os materiais correspondentes que foram submetidos a aquecimento distintos regimes de (B1 e B2) mas não são mostrados presentemente. A uniformidade da resposta nas propriedades mecânicas observadas para as amostras de proteína de soro de albumina de soro bovino a e vários tratamentos térmicos defende um molecular subjacente processo na vitrificação de misturas de proteína / co-soluto globular. Assim, na extremidade de baixa temperatura, o módulo de armazenamento de rastreio permanece plana como uma função da frequência de valores de oscilação alcançar de cerca de 109,8 Pa na Fig. 4a, ambas características da mecânica propriedades no estado vítreo (Kasapis, Al-Marhoobi, & Mitchell, 2003). No final de temperatura elevada da mesma figura, os valores de módulo de armazenagem mostram a dependência de frequência forte, para exemplo, 107,3-108,4 Pa dentro da frequência experimental gama de? 21? C, um resultado que indica um processo mecanicista dentro da região de transição vítrea (Kilburn, Claude, Schweizer, Alam, & Ubbink, 2005). A multiplicidade de dados acima mencionada mecânica, obtida em duplicar para os seis tratamentos térmicos desta investigação, permite modelagem válido usando o princípio da superposição temperatura tempo (TTS em van der Put, 2010). Isto implica horizontal deslocando e superposição dos dados de armazenamento e de módulo de perda em FIG. 3 (a, b) e 4 (a, b) Espectro de mecânica com um arbitrário escolhido dentro da região de transição vítrea da proteína globular / co-soluto matrizes utilizadas como a temperatura de referência (A) O resultado é uma curva de viscoelasticidade mestre (ou compósito) que estende ao longo

de uma ampla escala de tempo de observação, isto é, para além dos limites de instrumentação atual. Ao fazer isso, o trabalho realizado boa sobreposição de ambos os dados de armazenamento e de módulo de perda, que é um pré-requisito para a interpretação significativa dos resultados (Huang, Szleifer, e Peppas, 2002).

FIG. 5 (a, b) mostram o resultado desta análise para condensado WPI ou BSA na presença de xarope de glicose obtidos para o temperaturas de referência de 2 (W1),? 9 (W2),? 36 (W3), 6 (B1),? 13 (B2) e? 37? C (B3). Ambas as representações cobrir uma ampla faixa de frequência (A partir de? 4-6 na escala de log) com os dados de módulo que varia entre cerca de 107-1010 Pa para identificar a extremidade da região de transição do vidro e o aparecimento do estado vítreo. Deslocamento horizontal dos experimentais módulos de cisalhamento para criar as curvas mestre em Fig. 5 (a, b) gera um conjunto de fatores de desvio (AT) que adquirem significado físico sendo empregada em quadros teóricos utilizados para racionalizar medições visco elásticas (Tsui, Paraskos, Torun, Swager, & Thomas, 2006).

Em particular, a teoria de volume livre tem sido amplamente utilizada por cientista de materiais para descrever a ocupação de volume de polímeros amorfos, como uma função da temperatura. Como mencionado na introdução, o volume livre surge a partir das irregularidades de embalagem de segmentos poliméricos que facilitam stringlike movimentos, e o conceito pode ser capturado na matemática expressão de Williams, Landel e Ferry (Ferry, 1991):

Em que, o volume livre fraccionada, FO, é a razão de livre para totalizar volume da molécula, AF é o coeficiente de expansão térmica, e B é geralmente definida como um. Peças da Equação (1), B / 2.303fo e fo / af, são conhecidos como os parâmetros WLF sendo representado como Co1 e Co2, respectivamente, e fazer a ligação entre equação WLF e teoria de volume livre. Como mencionado anteriormente, esta é experimentalmente conseguida deslocando as varreduras de módulo de cisalhamento de frequência em torno de uma temperatura de referência, To, gerando, assim, um conjunto de fatores, aT, para permitir modelagem teórica. Um protocolo de trabalho alternativa, também empregada amplamente na interpretação mecanicista das alterações físico-químicas em alta sistemas sólidos, defende uma operação estrutura termodinâmica durante a vitrificação e baseia-se nas previsões da reação teoria das taxas (Alves, Mano, Gomez Ribelles, & Gomez Tejedor, 2004). Isto está descrito na expressão matemática de Andrade,

que é uma equação de Arrhenius modificado com dois temperaturas termos, como se segue (Gunning, Parker, & Ring, 2000):

Onde, a energia de ativação (Ea) reflete um fluxo elementar associada a movimentos moleculares de um conformacional estado para outro, e R é a constante dos gases. As equações acima fornecem uma relação entre empiricamente fatores de desvio derivados e as temperaturas experimentais. Aplicação de teste das duas escolas de pensamento para a totalidade do nosso reológico Resultados gera Fig. 6a de isolado proteico de soro / glucose xarope e a Fig. 6b para albumina de soro bovino / xarope de glicose. Claramente, modelagem com a equação WLF descreve bem a progressão na viscoelasticidade no intervalo de temperatura superior de experimentais observações e retorna valores de volume livre fracionada na temperatura de transição vítrea de cerca de três por cento do total o volume de polímero (fg ¼ 0,033? 0,05 para ambos WPI e BSA mostrado na Tabela 1), um resultado que é previsto pela teoria de volume livre. Além disso, os valores de Co1 (13,0? 2), Co2 (52,0? 1 °) e AF (6.5? 1.1? 10? 4 1 deg?) Para as preparações de xarope de seis proteína / glicose desta investigação, também apresentados na Tabela 1, estão de acordo com a experiência de estudos anteriores de polímeros sintéticos amorfos e sistemas, e de alta sólida gelificação polissacarídeo / cosolute diluída e misturas de gelatina / co-soluto (Ferry, 1991; Kasapis, 2008). Em contraste, os dados encaixem na faixa inferior de experimentais temperaturas na fig. 6 (a, b) indica uma relação exponencial entre fator em temperatura e reversa, que é descrito pela A equação (2). O ponto de descontinuidade entre os dois tratamentos demarca uma passagem de efeitos gratuitos de volume impulsionado na região de transição vítrea a considerações energéticas para micromolecular movimento no estado vítreo e pode ser usado para identificar a rede ou temperatura de transição vítrea mecânica. Nesta base, existe um efeito dramático sobre a relaxação de tensões de redes de proteínas globulares induzida pelo tratamento térmico variável para as preparações sólidas elevadas na Tabela 1. Tg estimativas variam de 2? 1? C durante o extensivamente desnaturada moléculas de proteína WPI e BSA ter sido submetido a um tratamento térmico considerável (85? C durante 30 min), através de? 13? 2? C para as amostras W2 e B2 (85? C não isotérmicos executar), para? 38,5? 0,5? C para as conformações globulares nativas (Passo de arrefecimento apenas) na presença de xarope de glicose. Resultados argumentam que o mecanismo molecular que regula na determinação da mecânica temperatura de transição vítrea é a extensão da térmica desnaturação levando à formação de peso molecular elevado sequências que são incorporados em uma estrutura tridimensional. Formação de redes eficientes produz padrões de vitrificação comparáveis em sistemas de alta-sólido de proteína de soro de leite e submetidos a BSA regimes térmicos semelhantes. Deve notar-se que o efeito bastante dramático de temperatura tratamento na formação de rede, com características estruturais distintas foi conseguido mantendo a concentração de proteína fixada em 15% de sólidos. Isto encontra-se acima da concentração mínima crítica de gelificação da proteína (Chronakis & Kasapis, 1993; Manoj, Kasapis, & Hember, 1997), garantindo assim a formação de um contínuo plastificado fase de proteína na região de transição para vidro pela alta níveis de xarope de glicose suspenso.

4. Conclusões

Um objetivo central do trabalho é para ter sucesso na apresentação do desenvolvimento de viscoelasticidade em pequena deformação para os sistemas de proteína / co-soluto globular

condensadas desta investigação com uma curva principal durante a vitrificação. Isto é documentado na fig. 2 (a, b) e 5 (a, b)

como uma função da temperatura e do tempo de observação para as características físico-químicas distintas de proteína de soro de leite e albumina de soro bovino que conduz a um razoável pressuposto para a universalidade desta abordagem em outros globulares sistemas de proteínas que devem ser examinados no futuro. A descrição acima Observações experimentais de reologia são combinados com modelação teórica do polímero sintético estabelecida aproximar para identificar a temperatura de transição vítrea mecânica. Este é um conceito de significado físico estar no limiar de dois processos distintos moleculares que governam a mecânica manifestação de relaxamento do polímero em matrizes condensadas e

possui sido propostos na literatura como alternativa aos indicadores empíricos de transição vítrea.

Trabalho culmina na Fig. 6 (a, b), o que demonstra o efeito de tratamentos térmicos distintos, isto é, densidade variável de associações poliméricas, sobre a faixa de temperatura e viscoelástico magnitude a região de transição de vidro nas proteínas globulares desta investigação. Desnaturação extensivo de WPI BSA ou moléculas na presença de resultados xarope de glicose em vitrificação acelerado (Tgw2? C). Por outro lado, a redução do volume de rede associações em amostras que preservam a conformação nativa, devido a resfriamento imediato do ambiente para temperaturas abaixo de zero, atrasos dramaticamente a manifestação mecânica de vitrificação (Tg é? 38,5? C). A última estimativa aproxima as previsões da temperatura do vidro calorimetria de transição (cerca de? 47,5? C) para estes sistemas, portanto, ainda mais defendendo a predominância de cadeia segmentos com peso molecular reduzida em preparações que manter a conformação nativa. Também constitui um indício dos processos de relaxação distintos monitorados em misturas de polímero e pequena molécula co-soluto pôr as duas técnicas.