Buffy coat preparation & examination

transcript

Buffy coat preparation &

examination

ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร. นพมาศ เข็มทองหลาง กลุ่มวิชาจุลทรรศน์คลินิก

คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น E mail : noppamat@kku.ac.th

Bone marrow examination

วิชา 463 212 ปฏิบัติการโลหิตวิทยาพื้นฐาน ปีการศึกษา 2563

Buffy coat preparation เป็นวิธีการเพิ่มจ านวนเม็ดเลือดขาวหรือเซลล์ทีผ่ิดปกต ิทีม่ีจ านวนน้อยจากเลือด โดยทั่วไปจะเตรียมเมื่อ มีเม็ดเลือดขาวน้อยกว่า 1,000 /ul กรณี Hairy cell leukemia ที่มีเซลล์เม็ดเลือดทุกสายต่ ากว่าปกติ (pancytopenia) กรณีเตรียม LE cell ช่วยในการตรวจหา bacteria fungus หรือ parasite ทีอ่ยู่ ใน neutrophil หรือ monocyte

ตัวอย่างเลือดที่ใส่สารกันเลือดแข็ง เมื่อน าไปปั่นจะแยกเป็น 3 ชั้น จากด้านบน คือ พลาสมา เม็ดเลือดขาวและเกล็ดเลือด (buffy coat) และเม็ดเลือดแดง ชั้น buffy coat จะดูดออกมาเพื่อเตรียมสเมียร ์ย้อมส ีและนับแยกชนิดเม็ดเลือดขาวหรือท าการทดสอบอื่นๆ ต่อไป

หลักการ

https://vcahospitals.com/know-your-pet/buffy-coat-examination-for-mast-cells

ตัวอย่างรายงานการพบเซลล์ผิดปกติจากการเตรียม buffy coat

Buffy coat film. From blood of a patient with pancytopenia showing two hairy cells, an erythroblast and a bare nucleus. Only rare cells resembling hairy cells were seen in the conventional film, whereas the buffy coat film showed many such cells.

Dacie and Lewis Practical Haematology . Barbara J. BAIN 2017

Atlas of peripheral blood, the primary of diagnostic tool. Pereira I et al 2012

(a) Circulating Tumor Cells (CTCs) detach from primary tumor as single cells and clusters, shed into the bloodstream, and migrate to colonize in distant organs, known as metastasis. It is assumed 1 ml of blood can comprise 1e10 single CTCs and roughly one CTC cluster, millions of WBCs and billions of RBCs. Copyright © 2017 Vortex Biosciences

Figure 2. Illustration of current and potential applications of CTC technologies. The peripheral blood of a cancer patient is collected and processed through various CTC isolation technologies. CTCs are captured along with contaminating leukocytes. Immunostaining for specific markers and FISH for genomic amplification and translocation can be applied to CTCs. DNA or RNA can be extracted from the CTCs and subjected to sequencing, quantitative RT-PCR (qRT-PCR), and potential expression profile analysis. Viable cells can be released and propagated in cell culture.

สิง่สง่ตรวจ ( specimen ) ใช้เลือดปริมาตร 3 มิลลิลิตร ทีม่ีสารกันเลือดแข็งชนิด EDTA

วิธีการเตรียม buffy coat

การเตรียม smear

Push wedge technique

Squash technique

Coverslip method

การเตรียม buffy coat

Wintrobe tube

Microhematocrite tube

Wintrobe tube Microhematocrit tube

8 7 6 5

4 3 2 1

10 9 8 7

6 5 4 3

Plasma Buffy coat Red blood cell

Wintrobe tube ใช้ pasteur pipette ดูดเลือดใส่ Wintrobe tube ป่ัน 2,000-2,500 rpm (1500 g) นาน 5-10 นาที ใช้ pasteur pipette ดูดพลาสมาออกทิง้ ดูดส่วน buffy coat ทีเ่ป็นรอยตอ่ระหวา่งพลาสมากบัเม็ดเลอืดแดง หยด buffy coat ลงบน slide หรือ cover slip

ดูดเลือดเข้า pasteur pipette ระวังอย่าให้มีฟอง แหย่ปลาย pasteur pipette ลงไป ที่ก้น Wintrobe tube แล้วบีบลูกยางแดงเบาๆ เลือดจะไหลลงมา พร้อมกับค่อยๆดึง pasteur pipetteขึ้นช้าๆ

น าไปปั่น หลังการปั่น

ใช้ pasteur pipette ดูดพลาสมาออกทิง้ ดูดส่วน buffy coat

Microhematocrit tube ดูดเลือดใส่ microhematocrit tube อุดด้วยดนิน้ามนัทีป่ลายด้านหนึ่ง ป่ันด้วย microhematocrit centrifuge 12,500 rpm for 4-5 นาที ใช้ใบเลื่อยตัดรอยตอ่ของ plasma กับ red blood cell แตะ buffy coat ลงบน slide หรือ cover slip

Wedge technique Squash technique Coverslip method

https://clinicalgate.com/examination-of-the-peripheral-blood-film-and-correlation-with-the-complete-blood-count/

การเตรียมสเมียร์

การย้อมสเมียร์

ผู้ช่วยศาสตราจารย์ ดร. นพมาศ เข็มทองหลาง กลุ่มวิชาจุลทรรศน์คลินิก

คณะเทคนิคการแพทย์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น E mail : noppamat@kku.ac.th

Bone marrow examination

สรุปวิธีการเตรียมไขกระดูก

Aspiration Biopsy

Smear Squash Clot section Touch preparation Biopsy section

การตรวจและการรายงานการตรวจไขกระดูก 1. Cellularity assessment

2. Megakaryocyte assessment

3. Myeloid : Erythroid ratio (M : E ratio)

4. Bone marrow differential count 5. Other finding

Morphology examination of the bone marrow

Adequacy bone marrow

Low power examination (10x) ตรวจหา marrow particle ตรวจหา megakaryocytes (ปกติพบ 1 cell/LPF) ตรวจหา clumps of abnormal cell ชึ่งอาจเกิดจาก metastatic tumor cell หรือกลุ่มเซลล์ผิดปกติอื่น

Bone marrow (Objective lensx10)

Marrow particle

Low power examination (10x) ประเมิน cellularity The ratio of marrow space occupied by hematopoietic

cells to the total available marrow space

การรายงาน Normocellular marrow หรือ bone marrow normal cellularity

Hypocellular marrow หรือ bone marrow hypocelluarity

Hypercellular marrow หรือ bone marrow hypercellularity

Cellularity ranges for various age groups

Age Cellularity

Newborn to 3 month 80-100

Childhood 60-80

20-40 years 60-70

40-70 years 40-50

>70 years 30-40

Porwit A et al. Blood and bone marrow pathology Edinburgh : Livingstone,2011

The bone marrow differential count from aspirated from 12 healthy men

Wintrobe’s Clinical Hematology 14th Edition 2018

Hypocellular Normocellular Hypercellular

ใช่ไขกระดูก? รายงาน cellularity

Megakaryocyte

รายงาน cellularity Bone marrow (Objective lensx10)

Plasma cell

Fat cell

Megakaryocyte

Basophil Erythroid precursor

Promyelocyte

(Granulocyte) Erythroid precursor

Erythroid precursor

Plasma cell

Neutrophilic myelocyte

(Granulocyte)

Erythroid precursor

Megakaryocyte

Mast cell

Macrophage

Single cells or small groups

Ovoid or elongated, single small

eccentric nucleus with small quantities

of condensed chromatin

and one to three nucleoli

Abundant lightly basophilic cytoplasm

with indistinct

margins.

Osteoblasts

Resemble plasma cells

They are larger and their Golgi zone is not

immediately adjacent to the nucleus.

The nucleus of an osteoblast does not show

the heavily-stained coarse clumps of

condensed chromatin that are

characteristic of plasma cells.

Blood and Bone Marrow Pathology 2nd Edition 2011

Plasma cells

Osteoclasts

Giant multinucleate cells with abundant

pale-staining cytoplasm containing

many fine azurophilic granules

Nuclei within a single cell are small, round

or oval, are uniform in size, single

prominent nucleolus.

Must be distinguished from

megakaryocytes

Unlike multinucleated osteoclasts, normal

megakaryocytes have a single large

lobulated nucleus.

Megakaryocyte

Blood and Bone Marrow Pathology 2nd Edition 2011

Myeloid : erythroid ratio (M : E)

Bone marrow nucleated differential cell count (NDC)

Morphologically recognizable cells blast cells, promyelocytes, myelocytes, metamyelocytes, band forms, neutrophil, eosinophils,basophils, promonocytes and monocytes, lymphocytes,

plasma cells erythroblasts

It does not include megakaryocytes, macrophages, mast cells, osteoblasts, osteoclasts,

stromal cells, smudged cells or non-hemopoietic cells such as metastatic tumor cells.

Neonate : M : E ratio is 1 : 3–4

Adults: 2–5 : 1.

Cell type Report (%) 95% Range

Myeloblast 60 0.2-1.5

Promyelocyte 5 2.1-4.1

Myelocyte (neutrophilic)

5 8.2-15.7

Metamyelocyte 5 9.6-24.6

Neutrophil 15 6-12

Myelocyte (eosinophil)

10 0.2-1.3

Eosinophil 0-1.3

Basophil 0-0.2

Lymphocyte 11.1-23.2

Monocyte 0-0.8

Plasma cell 0.4-3.9

Erythroblast 10 18.4-33.8

Megakaryocyte 0-0.4

M:E ratio = 90/10 = 9/1 (ปกติ 1.5-3.3 : 1)

ตัวอย่างการรายงาน

Bone marrow iron staining

Prussian blue reaction (Perl’s reaction)

Theml H et al. Color atlas of hematology [electronic resource] : practical microscopic and clinical diagnosi. Stuttgart ; New York : Georg Thieme Verlag, c2004.s

Bone marrow storage iron located in macrophages. A, Iron stores 1+ (1000×). B, Iron stores 2+ (1000×). C, Iron stores 3+ (1000×). D, Iron stores 4+ (1000×). E, Iron stores 5+ (500×).

HENRY’S CLINICAL DIAGNOSIS AND MANAGEMENTBY LABORATORY METHODS, 2017

Ring sideroblast. Siderotic granules form a perinuclear ring spanning

more than half of the nuclear diameter (Prussian blue stain, 1000×).

HENRY’S CLINICAL DIAGNOSIS AND MANAGEMENTBY LABORATORY METHODS, 2017

Reticulin stain of marrow myelofibrosis.

Silver stain of a myelofibrotic marrow showing an increase in reticulin fibers (black-staining threads).

Silver impregnation

Objective lens x10 เห็น marrow particle? เห็น fat cell? เห็น megakaryocyte? เห็น hematopoietic cell? ประเมิน cellularity Hypocellular Normocellular Hypercellular

Objective lens x100 ศึกษา blood cell ในบริเวณที่สเมียร์ไม่หนาเกินไป

ในชั่วโมงปฏิบัติการ

Buffy coat preparation & examination

Documents