Amino acid variants in tha human glucose-dependent

insulinotropic polypeptide (GIP) receptor The impact on the pancreatic ß cell response and functional expression

  INTRODUCCIÓN

  SUJETOS, MATERIALES Y MÉTODOS

  RESULTADOS

  DISCUSIÓN

  CONCLUSIONES

INTRODUCCIÓN INCRETINAS

  Determinar la organización exon-intron del receptor GIP humano

  Variabilidad genética del receptor GIP afecta la respuesta de las células ß pancreáticas

  Receptores GIP alterados exhiben modificaciones en la respuesta a la producción de cAMP

SUJETOS, MATERIALES Y

MÉTODOS SUJETOS

RECEPTOR GIP ALTERACIONES EN LA ESTRUCTURA DE GIP

MATERIALES

Y MÉTODOS

  Organización Exon-Intron en receptor GIP humano

  Análisis de la conformación del polimorfismo de cadena sencilla

  Ensayos de detección de mutaciones identificadas en receptor GIP

  Ensayos para medición de variables en sangre

  Construcción de receptor GIP

  Análisis de cAMP

  Análisis de acoplamiento

MATERIALES Y MÉTODOS

Organización Exon-Intron en receptor GIP humano

• Expand High Fidelity PCR System •  Taq polimerasa

Análisis de la conformación del polimorfismo de cadena sencilla

•  100 ng DNA genómico- 25µl

MATERIALES Y MÉTODOS

Ensayos de detección de mutaciones identificadas en receptor GIP

•  A207V (GcGGTG) 268 bp •  E354Q (GAGCAG) 217 bp

Ensayos para medición de variables en sangre

•  Glucosa, Insulina y Péptido C •  GIP Detección Radioinmunológica

MATERIALES Y MÉTODOS Construcción de receptor GIP •  Sitio de mutagénesis •  Vector pcDNA-3

Análisis de cAMP •  Las células fueron lisadas y el AMPc intracelular

fragmentado con tripsina se separó en Sephadex y columnas de alúmina.

Análisis de acoplamientos •  No aumento la concentración competitiva de GIP

no radioactivo

SEPHADEX

Gel Dextrano utilizado para filtración y cromatografías

RESULTADOS

RESULTADOS

  Caracterización del gen del receptor GIP

  SSCP primarios de exploración de los receptores GIP

  Estudios de asociación de las variantes de aminoácidos en el receptor GIP.

  Características de sujetos tolerantes a la glucosa que poseen alteraciones en el receptor GIP

  GIP estimula la producción de cAMP

  Unión de GIP al receptor GIP

MATERIALES Y MÉTODOS

Caracterización del gen del receptor GIP

•  14 exones + exon 5´no traducido •  100 bp secuencias intronicas en ambos sitios de los exones

Análisis de la conformación del polimorfismo de cadena sencilla

•  GCG heterocigotos GTG para la sustitución en el exón 7 en el codón 207 cambia una alanina a valina (A207V)

•  Polimorfismo en el exón 12 en el codón 354 en el que GAG cambia a CAG provocando una sustitución de ácido glutámico por glutamina (E354Q).

MATERIALES Y MÉTODOS

Estudios de asociación de las variantes de aminoácidos en el receptor GIP.

•  Grupo control: 23.2% •  Pacientes DM II: 24.9%

Características de sujetos tolerantes a la glucosa que poseen alteraciones en el receptor GIP

•  Homocigotos 25%+ en ayuno •  Ambos grupos aumento después de la ingesta de glucosa

(75 grs.)

MATERIALES Y MÉTODOS

GIP estimula la producción de cAMP •  Sujeto con alteración en codon 354 en receptor GIP

muestra disminución de 11% de niveles de GIP en comparación de receptores normales o variante A207V

•  Aunque los niveles de GIP aumenten, receptores con mutación 354 reduce su efecto.

Unión de GIP al receptor GIP •  La unión a receptores normales y mutados se mostro

similar.

DISCUSIÓN

  Mutaciones en el receptor GIP no confiere mayor riesgo

  25% + concentración de GIP en homocigotos 354

  La producción de cAMP fue menor en sujetos con mutación 354

  El efecto dosis-Respuesta no mostró alteración relevante.

  No se evidencia alteraciones de la unión a receptor mutado 354