Lez 12

• Protein folding• Intracellular Compartments and

Protein Sorting• Nucleo, mitocondri, perossisomi,

reticolo endoplasmico• Meccanismi di trasporto

• Il peptide sintetizzato deve ripiegarsi (folding)

• poi può andare incontro a modificazioni covalenti (es. fosforilazione, glicosilazione) e legarsi a metalli o altre subunità

Sintesi di una proteina funzionale

Folding è co-traduzionale

• Il folding avviene durante la sintesi, inizia dal N-terminale, ed è in gran parte spontaneo

Molten globule• Nel refolding in

vitro in molte proteine si forma rapidamente un intermedio: il molten globule, che ha alta struttura secondaria, ma manca di molte interazioni stabilizzanti. Ha zone indrofobiche esposte.

Protein folding

• Il passaggio da molten globule a struttura corretta è critico e può essere assistito da chaperoni

Molecular chaperones: hsp70

• Una classe di chaperoni assiste il folding coprendo le zone idrofobiche

Hsp60 chaperones

• Un’altra classe di chaperoni crea le condizioni per la “denaturazione” e refolding

Controllo di qualità della sintesi di proteine

Ubiquitina

Catene di ubiquitine

• La ubiquitinizzazione prevede l’azione dell’enzima di attivazione, la ligasi il riconoscimento della proteina bersaglio e la formazione della catena di ubiquitine

Meccanismi per degradare le proteine

• Sia le ubiquitine ligasi che i segnali di degradazione devono essere attivati. Usano meccanismi in parte simili

Produzione di una proteina in

eucarioti

• Le proteine vanno ad occupare vari compartimentidella cellula

Compartimenti di una cellula eucariota

Schema del possibile sviluppo di organelli

• Nucleo e mitocondrio hanno origini molto diverse

Comunicazioni tra organelli

Traffico di proteine

• Schema semplificato

• Tipi di trasporto:– Gated – Transmembrana– vescicolare

Trasporto vescicolare

• Il trasporto vescicolare usa gemmazione e fusione di vescicole. I componenti solubili sono trasportati insieme a membrane. La orientazione delle molecole transmembrana e delle membrane è conservata

I segnali possono essere di sequenza di zone

unite nella struttura

Trasporto attraverso il nuclear envelope

• Il nucleo è separato da citoplasma da una doppia membrana: il nuclear envelope

• Esso ha dei pori: nuclear pores che sono fatti da strutture chiamate Nuclear Pore Complex (NPC)

• NPC sono grossi, c.a. 125 MDa, e composti da copie multiple di nucleoporine

• La struttura è stata in parte determinata

Trasporto nucleare

• NPC ha una struttura a tre anelli • Gli anelli sono coassiali e sono collegati alle

braccia radiali. Il poro centrale è all’interno

• The nuclear pore complex.

A: scanning electron microscopy del complesso di Xenopus

B: schema del complesso

Nuclear localization signal

(NLS)

• Per essere importate le proteine debbono avere un segnale NLS signal, e per essere esportate un NES (nuclear export signal)

• NLS e NES consistono di corte sequenza che sono necessarie e sufficienti alle proteine per essere trasportate attraverso i pori dentro o fuori dal nucleo

Enzima fuso a NLS

Trasporto nel nuclear pore complex

• Molecole <50 kDa diffondono liberamente.

• Le altre sono trasportate da nuclear import receptors

Ran GTPase dirige il trasporto • Compartimentalizzazione di

Ran-GDP e Ran-GTP• GAP (GTPase activating

protein: Ran-GTPRan-GDP) è citosolica

• GEF (Guanine Exchange Factor: Ran-GDPRan-GTP) è nucleare

Idrolisi di GTP da la direzione del trasporto

Il legame con Ran-GTP induce il rilascio del cargo

Le membrane nucleari si rompono nella mitosi

Trasporto nei mitocondri

• Mitocondri e plastidi hanno 2 membrane diverse: interna ed esterna

Trasporto nei mitocondri

• Le tre proteine traslocatori nella membrana mitocondriale

La sequenza segnale ha la conformazione di un’alfa elica con una superficie basica

Trasporto nei mitocondri

• Il trasporto attraverso le due membrane avviene probabilmente nei contact sites

Trasporto nei mitocondri: energia• Il rilascio delle hsp70 citosoliche consuma ATP• Il trasferimento richiede pontenziale elettrochimico• Le hsp70 mitocondriali consumano ATP

Hsp70 guida l’importazione delle proteine

Trasporto mitocondriale: proteine di membrana

Trasporto nei peroxisomi

• Il trasporto è guidato da una sequenza di 3 amino acidi di solito at C-terminale

Trasporto nel reticolo endoplasmico

• ER rugoso di una cellula pancreatica Colorazione

di proteine dell’ER

Ribosomi liberi e legati alle membrane

• Gli stessi ribosomi ciclano tra poliribosomi liberi e di membrana.

• L’ancoraggio alla membrana avviene ad opera della proteina nascente

Separazione del poliribosomi

Trasporto nell’ ER

• Ipotesi originaria e semplificata.

• La sequenza segnale porta il ribosoma al traslocatore

• Il segnale è poi tagliato

Signal-recognition particle (SRP)

• SPR lega la sequenza segnale ed anche SPR receptor sulla membrana ER• Il legame al segnale induce una pausa nella sintesi, per facilitare l’interazione

con il recettore. • Il complesso viene poi portato al traslocatore.

Meccanismo di trasporto nell’ER

Ribosoma legato la traslocatore

• Il poro del traslocatore si allinea con il tunnel del ribosoma da cui esce il peptide

Trasporto di una proteina solubile

• Il poro del traslocatore si apre dopo il legame con la leader sequence.

• Dopo la traslocazione il poro si chiude ed il traslocatore si apre lateralmente e rilascia il peptide segnale

Trasporto di una proteina transmembrana, N-terminal signal

• Quando il traslocatore incontra la sequenza stop-transfer, si apre e rilascia il peptide

Proteina transmembrana: internal signal

• Le cariche elettriche intorno al segmento transmembrana determinano la polarità della proteina.

• Il C-terminale può essere esterno o citosolico

Proteine di membrana• Contengono da sequenze start e stop.

Glicosilazione delle proteine • La parte esterna delle proteine di membrana

è spesso glicosilata. Un meccanismo (N-glycosilation) usa la asparagina (Asn o N)

Ruolo di N-linked glycosilation nel folding

• La calnexina lega e trattiene proteine che non sono completamente foldate ed hanno un glucosio esposto.

• La glucosyl transferase riconosce le protiene unfolded, e le le glicosila

Esportazione e degradazione di proteine dell’ER misfolded

• Le proteine misfolded vengono traslocate al citosol per la degradazione

Unfolded protein response nel lievito

GPI anchor proteins