Post on 16-Jan-2016
description
transcript
PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE V BOTANICE
1) Princip metody
Petr Koutecký, 2012
Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických
oborů PřF JU
Turn on lasers, turn on flow,
Turn on lasers, turn on flow.
…
When not at leisure, here’s what I treasure:
It gives me plesure quickly to measure
Cell as they go, cells as they go,
…
They scatter light, and absorb, and fluoresce;
All this can be quantified with sucess.
…
(H. Shapiro, 2003,“Largo al FACStotum“)
3 / 51
Průtoková cytometrie
► Metoda studující optické vlastnosti částic (cyto- = buňky) při ozáření určitým světlem» typicky laser (lasery)
» měření rozptylu světla a intenzity fluorescence
► Vzorky jsou ve formě suspenze, částice postupně protékají měřícím bodem
► Metoda vznikla primárně pro analýzu krve v medicíně» dodnes nejčastější použití
» nejvíce ovlivňuje směřování výzkumu a metodické inovace
» … a taky komerčně dostupné aparatury
4 / 51
Historie
► Mějme na paměti: historie FCM je krvavá
http://www.siumed.edu/~dking2/intro/bldcells.htm
5 / 51
Historie
► První přístup - statické metody (scanning cytometry etc.)
► Před: vizuální hodnocení preparátů pod mikroskopem
► Automatizace procesu» měření nějaké optické vlastnosti v malé plošce preparátu
» systematické posouvání („skenování“) preparátu
» složení informace dohromady
► 30. léta 20. stol.» T. Caspersson – microspectrophotometer
» stanovení obsahu nukleových kyselin a případně proteinů měřením absorbance UV světla při 260, resp. 280 nm(primární motivace – odlišný obsah NK v normálních a abnormálních, tj. rakovinných buňkách)
6 / 51
Historie
► 1950, Swift H.: The constancy of desoxyribose nucleic acid in plant nuclei, PNAS 36: 643–654» analýza obsahu DNA v jádrech rostlin (Zea, Tradescantia)
barvených Feulgenovou reakcí, měřena absorbance
» důkaz konstantního množství DNA, násobky u různých typů buněk (gamety, somatické buňky), endopolyploidie [tento název ale později], označování 1C, 2C, 4C,…
» porovnání obsahu DNA dvou druhů [poměr, ne abs. množsví]
► 60. léta – první komerční přístroje (Zeiss), pokusy o auto-matickou klasifikaci krevních buněk a histologických preparátů (diagnóza rakoviny)
► postupně různá řešení rastrování obrazu, nástup fluores-cenčních barviv, zavedení počítačů,…
7 / 51
Historie
► pokud jde o stanovení velikosti genomu, vycházejí z tohoto přístupu 2 v současnosti používané metody:
► Feulgen (micro)densitometry» preparát s jednou vrstvou buněk, barvení Feul-
genovou reakcí (Feulgen & Rossenbeck 1924)• naštěpení DNA silnou kyselinou, na naštěpenou
DNA se váže tzv. Schiffova báze (basic fuschsin), po navázání se mění z bezbarvé na růžovou
» stechiometrický vztah (intenzita ~ obsah DNA)
» měření absorbance (větš. λmax = 560 nm), v mnoha bodech
» porovnání absorbance mimo jádra („blank“) a v jádře
» součet absorbancí přes celé jádro, průměr přes celý preparát
» porovnání se standardem o známém obsahu DNA
jádra Allium cepa a Abies alba
(Greilhuber 2008)
8 / 51
Historie
► pokud jde o stanovení velikosti genomu, vycházejí z tohoto přístupu 2 v současnosti používané metody:
► Image cytometry» podobná logika jako mikrodensitomerie, stejný chemický
princip
» místo měření jednotlivých bodů je CCD kamerou vyfocen obraz celého preparátu
» výpočet založený na porovnání intenzity jednotlivých pixelů
» mnohem rychlejší a asi i přesnější než tradiční mikro-densitometrie
► Greilhuber 2008, Ann. Bot. 101: 791–804 [densitometrie]
► Vilhar et al. 2001, Ann. Bot. 87: 719–728 [image cytom.]
9 / 51
Historie► Druhý přístup = měření částic v roztoku při průchodu měřícím
bodem (flow cytometry, Coulter volume,…)
► teoretický popis základního principu: A. Moldavan 1934
► první funkční přístoj ve 40 letech (Gucker et al. 1947)» počítal bakterie ve vzorku vzduchu, který byl unášen rychlejším
proudem filtrovaného vzduchu, pomocí mikroskopie v temném poli měřen rozpyl světla [v dnešní terminologii SSC]
» vývoj probíhal za 2. svět. války, sponzorován armádou USA
► od přelomu 40. a 50. let podobné přístroje na počítání krvinek (bez odlišení jednotlivých typů)
► ve 40. letech vyvinutí fluorescenčně značených protilátek,A. H. Coons (např. Coons et al. 1942, J. Immunol.45: 159–170)
► hydrodynamic focusing: Crosland-Taylor 1953
10 / 51
Historie
► 50. léta – W. Coulter, počítání krevních buněk metodou Coulter volume – měření elektrických, ne optických vlastností» suspenze buněk ve fyziologickém
roztoku
» roztok vodivý (ionty), vodivost buňky skoro nulová
» suspenze protéká malým otvorem → zvýšení odporu ve chvíli, kdy je v něm buňka; závisí na objemu buňky
» dodnes používáno v diagnostice (počítání krevních buněk) i výzkumu (>100 publ. na WOS za poslední 3 roky)
11 / 51
Historie
► 1965 – Rapid Cell Spectrophotometer (RCS), L. Kamentsky, IBM» klasický mikroskop s UV lampou, buňky tekly do zorného pole
kanálkem z boku (bez sheath fluid)
» stanovoval obsah DNA měřením absorbance při 260 nm a později i fluorescenci na 1 nebo 2 vlnových délkách
» z absorbance při 410 nm počítána analogie rozptylu světla [FSC v dnešní terminologii]
» koncem 60. let přidána možnost třídit vybrané buňky (syringe pump sorter)
► 1965 – popsán princip a sestrojen droplet sorter (M. J. Fulwyer)
12 / 51
Historie
► 1969 – fluorimetrické měření obsahu DNA (tj. měření fluorescence)» modifikovaná Feulgenova reakce (Van Dilla et al. 1969)» ethidium bromid (Dittrich & Göhde 1969) –
cytometr ICP (Impulscytophotometer), od roku 1970 komerčně prodávaný společností Phywe AG, Göttingen → dnes Partec
► cca od 1970 – využití laserů jako zdrojů světla, nové fluorescenční látky,… (1973 – PI, 1977 – DAPI)
► od 80. let zejména v medicíně zásadní zavedení fluorescenčně značených monoklonálních protilátek
13 / 51
Historie
► další vývoj už „jenom“ vylepšování» motivace – důkladnější analýzy v medicíně (hl. imunologie,
onkologie)
» výkonnější elektronika, přesnější měření, vyšší rychlost,…
» zavedení počítačů
» nové fluorescenční látky – měření fluorescence několika vlnových délek naráz, excitovaných jedním zdrojem
» zvýšení citlivosti – analýzy organel, virů, dokonce jednotlivých molekul,..
» měření dalších parametrů buněk (enzymová aktivita, pH, charakteristiky membrány, pronikání léčiv do buněk, exprese genů,…)
» zmenšení na „bench-top“ rozměry, nižší cena
14 / 51
► první analýza genomu rostlin (densitometrie) Swift 1950
► první FCM analýza rostliných jader: Heller F. O. (1973): DNS-Bestimmung an Keimwurzeln von Vicia faba L. mit Hilfe der Impulscytophotometrie. – Ber. Deutsch. Bot. Ges. 86: 437–441
» protoplasty připravené enzymatickým odbouráním buněčných stěn
» lýze protoplastů, barvení jader EtBr
» měřeno na ICP od firmy Phywe (Partec)
► popsání přípravy suspenze jader sekáním žiletkou:Galbraith et al. (1983): Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues. – Science 220: 1049–1051
► masivní využití až od poloviny 90. let
Historie – měření rostlin
15 / 51
Průtkový cytometr v kostce
16 / 51
Průtokový cytometr v kostce
vzorek
zdroj světla» laser» UV lampa /
UV dioda
fluidika» pumpa» sheath fluid
kyveta
odpad
optika + počítač
17 / 51
Fluidika
► sheath fluid = destilovaná voda (příp. s trochou detergentu a NaN3)
» nebo fyziologický roztok
► vzorek vytlačován tlakem vzduchu, vyšším než tlak sheath fluid)» alternativa – píst („injekce“)
► v komůrce se vzorek dostávádo proudu sheath fluid
http://flowbook.denovosoftware.com/
18 / 51
Fluidika
Laminární proudění► citlivost na bubliny, nečistoty,…► rychlost hraniční vrstvy = 0,
pak se zvyšuje úměrně (R - r)2
Hydrodynamic focusing► zvýšení rychlosti toku zúžováním
kyvety► velmi úzký (~μm) core stream,
prostorová separace částic
f = rychlost (např. ml/s)
D = průměr kyvety
» zvýšení fsamp vede k rozšíření core stream = menší přesnost
d
Shapiro 2003
pozn.: Partec má opačnou orientaci
D f
fd
sheath
sampcore
19 / 51
Fluidika
Měřící bod (interrogation point)► v kapiláře kyvety (flow cell, flow
chamber), obvykle syntetický amorfní křemen (quartz), obdélní-kový nebo čtvercový průřez, typicky 100-200 x 200-400 μm
► stream-in-air – ve vzduchu pod otvorem komůrky, šířka ~50-100 μm
► microscope based“ uspořádání – vzorek prochází pod objekti-vem mikroskopu kolmo na jeho osu
http://flowbook.denovosoftware.com/
http://flowbook.denovosoftware.com/
20 / 51
Zdroje světla
Laser(Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation)
► různé typy, podle požadované vlnové délky► nejčastěji 488 nm (modrý) argon ion laser, případně
doplněný o 635 nm (červený) dioidový laser» toto uspořádání je dáno použitými fluorescenčními barvami –
většina je vyvíjena tak, aby byly excitovány právě těmito vlnovými délkami
► cytometr Partec CyFlow v naší laboratořimá 532 nm (zelený) frequncy-doubled diode-pumped YAG solid state laser» optimální excitace propidium iodidu,
maximum 536 nm (+ UV oblast)
http://www.mcb.arizona.edu/ipc/spectra_page.htm
21 / 51
Zdroje světla
Laser► monochromatické polarizované světlo► výchozí šířka paprsku ~1 mm► zaostřováno do eliptické oblasti cca 100 × 5-20 μm (delší
rozměr kolmý na směr proudění částic)► důvod: intenzita světla v paprsku laseru je nestejná, zhruba
Gaussova křivka (transverse emission mode: TEM00)
» pro osvětlení core stream je třeba využít jen střed, kde je intenzita ± stejná, aby všechny částice dostaly stejné osvětlení
» jde hlavně o rozměr kolmo na tok částic, aby částice v různě daleko od středu core stream byly osvětleny stejně
• v podélném směru méně důležité, všechny částice jdou stejně
22 / 51
Zdroje světla
Rtuťová výbojka► Mercury arc lamp, používáme typ HBO 100 [výkon 100 W]► Emisní spektrum zahrnuje několik výrazných čar, hlavně v
UV oblasti► Pro použití v cytometrii a
mikroskopii vybíráme jednuvlnovou délku pomocí optických filtrů» náš cytometr
Partec PA II vy- užívá barvivo DAPI, max. excitace při λ = 358 nm
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/lightsources/mercuryarc.html
http://www.mcb.arizona.edu/ipc/spectra_page.htm
23 / 51
Měřené parametry
► Forward scatter (FSC) – rozptyl světla pod malými úhly» původní vlnová délka
• interakce fotonu a elektronu → předání energie elektronu a zánik původního fotonu → okamžité předání (téměř) celé energie novému fotonu → (téměř) stejná vlnová délka, ale „libovolný“ směr a fáze
• rozptyl je obecně do všech směrů, zaznamenáváme vždy jen část prostoru
• obecně platí, že rozptyl je nejsilnější ve vlnových délkách, kde nedochází k absorbci fotonů – a naopak
24 / 51
Měřené parametry
► Forward scatter (FSC) – rozptyl světla pod malými úhly» původní vlnová délka
» malé úhly, cca < 10° od směru původního paprsku• z praktických důvodů se neměří blíž na cca 2°, původní (skoro)
nerozptýlené záření blokováno stínítkem
» informace o velikosti částice• vztah ale není lineární a asi ani monotónní (kromě objemu závisí i
na mnoha dalších vlastnostech částic – indexu lomu, absorbci,…)
► Side scatter (SSC) – rozptyl světla pod velkými úhly» větší úhly než FSC, obecně > cca 20°, typicky kolmo na
původní paprsek (90°)
» souvisí s velikostí částic a jejich vnitřní (např. granularita) a povrchovou strukturou
25 / 51
Měřené parametry
► Absorbance» zeslabení intenzity záření původní vlnové délky
» obvykle počítáno z opaku, tj. transmitance (podíl prošlého záření oproti původnímu)
» dnes v průtokové cytometrii používáno málo, spíš v minulosti (např. měření obsahu DNA pomocí absorbance při λ = 260 nm, měření hemoglobinu při λ = 420 nm)
► Fluorescence» nejdůležitější a nejčastěji používaný parametr
0II
-log T log- A
26 / 51
Měřené parametry
► Fluorescence» absorbce fotonu vhodné vlnové délky,
excitace elektronu do vyšší energe-tické hladiny
» ztráta části energie bez vyzářenífotonu (vibrační stavy apod.) – řádověběhem pikosekund (10-12 s)
» vyzáření fotonu, obvykle menší energie, tedy větší vlnové délky, než měl excitující foton – řádově během nanosekund (10-9 s)
» průchod částice světelným paprskemv cytometru řádově delší (mikrosekundy, 10-6 s)
http://en.wikipedia.org/
27 / 51
fluorescein
http://www.invitrogen.com/
Měřené parametry
► Fluorescence» rozdíl mezi excitačním a emisním maximem = Stokes shift
» emisní a excitační spektrum často zrcadlového tvaru
» potřebujeme, aby emisní spektrum (skoro) nezahrnovalo excitační vlnovou délku (kvůli měření rozptylu)
Stokes shift488 nm laser
28 / 51
Detekce světla
► Ortogonální uspořádání» prakticky všechny cytometry
využívající lasery
► Uspořádání jako fluorescenčnímikroskop» u nás cytometr Partec PA II
» epi-illumination
» světla od zdroje (HBO lampa)prochází stejnou čočkou, kterásbírá signál (objektiv mikroskopu),osvětlení podle Köhlerova principu
http://en.wikipedia.org/
29 / 51
Detekce světla
► objektiv s velkou numerickouaperturou (světelností)» snaha posbírat co nejvíce světla
» většinou „high-dry“ objektivy, schopné posbírat světlo z kuželeo vrcholovém úhlu max. 78°, tj. asi 11% světla vyzářeného doprostoru
» některé cytometry mají kyvetu a objektiv pevně spojený optickým gelem → analogie imerzníhoobjektivu (max. vrcholový úhelcca 134°, tj. cca 30% světla)
Shapiro 2003
30 / 51
Detekce světla
Optické filtry► absorbční
» barevné sklo nebo plast, absorbuje určité vlnové délky» levnější, účinnější, ale nevýhodou je vlastní fluorescence filtru
► interferenční» sklo s tenkými vrstvou (vrstvami) dielektrického materiálu» v závislosti na tloušťce a počtu vrstev a vstupním úhlu světla
dochází k interferenci – některé vlnové délky projdou, některé se odrážejí (resp. v přímém směru se vyruší interferencí)
» často v podobě zrcadla (dichroic mirror) pod úhlem 45° (část záření prochází, část se láme o 90°)
» obvykle menší transmitance a větší propustnost pro filtrované vlnové délky než absorbční filtry, ale bez vlastní fluorescence, přesnější selekce vlnových délek → v praxi někdy doplňována i tenká absorbční vrstva za vlastním filtrem
31 / 51
Detekce světla
Optické filtry
► dělení podle propouštěných vlnovýchdélek» short pass
» long pass
» band pass
» neutral density filter• nemění vlnové délky, pouze celkově
zeslabuje intenzitu
» beam splitters• odráží malou část záření, bez selekce
vlnových délek (v podstatě není filtr;běžná součást cytometrů)
Shapiro 2003
32 / 51
Fluorescenční barviva (odbočka)
Fluorescenční barviva pro stanovení DNA► Propidium jodid
» interkalační barvivo (nespecifické vůči jednotlivím bázím), váže se i k RNA
» v komplexu s dsDNA asi 30× vyššífluorescence než volná látka
» max. excitace v komplexu s DNAλ = 536 nm (zelená), emisní maximum λ = 617 nm (oranžová)
► další DNA barviva bez specifity k jednotlivým bázím» ethidium bromid
» acridine orange (jiná fluorescences dsDNA a ssDNA a RNA!) http://probes.invitrogen.com/
http://www.sigmaaldrich.com
33 / 51
Fluorescenční barviva
Fluorescenční barviva pro stanovení DNA
► DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)
» váže se na skupiny AT párů (nejméně3 nebo 4 za sebou [odhady se různí])v malém žlábku dsDNA
» v komplexu s DNA cca 20× vyššífluorescence než volná látka
» max. excitace (v komplexu s DNA)λ = 358 nm (UV), emisní maximumλ = 461 nm (modrá)
» váže se i s RNA, ale slabší fluores-cence (cca 20%) a λmax ~ 500 nm
» vazba málo ovlivněna strukturouchromatinu – nízká cv
http://www.sigmaaldrich.com
http://probes.invitrogen.com/
34 / 51
Fluorescenční barviva
► další barviva se specifitou k bazím
» AT-selektivní:
Hoechst dyes (Hoehst 33258, 33342, …)
DIPI
» GC-selektivní:
mithramycin A
chromomycin A3 (= CMA)
olivomycin
35 / 51
Detekce světla
Příklady uspořádání filtrů► Partec PA II (HBO 100 lampa, detekce fluorescence DAPI)
» podle webu FCM labora-toře BÚ v Průhonicích
» náš konkrétnípřístroj to mátrochu jinak
435 nm LP
700 nm SP
heat protection
dichroic mirror, LP
400 nm SP
clona
36 / 51
Detekce světla
Příklady uspořádání filtrů► Partec CyFlow SL (532 nm laser, detekce fluorescence PI
+ SSC a FCS + max. 2 další fluorescenční kanály)» podle manuálu
firmy Partec
» náš konkrétnípřístroj to mátrochu jinak
37 / 51
Detekce světla
Fotoelektrický jev
► působením světla (fotonů) o dostatečné energii dochází k uvolňování elektronů do vnějšího prostředí (u vodičů – vnější fotoel. jev) nebo z valenčního do vodivostního pásu (u polovodičů – vnitřní fotoel. jev)
► energie fotonů musí být vyšší než prahová hodnota (energie nutná pro uvolnění elektronů z vazby)
► při zapojení do elektrického obvodu vzniká el. proud, jeho intenzita závisí na intenzitě záření
► právě tohoto jevu se využívá při detekci světla v cytometrii
38 / 51
Detekce světla
Fotonásobiče (photomultiplier tube, PMT)► fotokatoda► série elektrod (dynody) o
vzrůstajícím napětí► anoda
► mnohonásobné zesílení proudu(počet elektronů)» v praxi v FCM až 106×» závisí na rozdílu napětí – ovlivňujeme parametrem gain» kvantový výtěžek (počet elektronů / počet fotonů) do 30%
(pro krátké vlnové délky, pak klesá)
► konverze proudu na napětí → měření → zpracování signálu
Fotodiody – plovodičové, alternativa PMT – vyšší kvantový výtěžek, ale nemají gain → malé výstupní proudy
Shapiro 2003
39 / 51
Detekce světla
Měřené charakteristiky
► pulse heigth» intenzita
► pulse area► pulse width
» obě popisují průběh v čase
» lze použít pro oddělení „slepených“ částic (stejná intenzita, jiný časový průběh)
time
volta
ge
threshold
heig
ht
width
40 / 51
Zobrazení výsledků
► histogram» pro jeden parametr
» osa X = parametr(např. fluorescence)
» osa Y = počet částic
» lineární × logaritmická škála• vzdálenosti píků• CV (na log škále teoreticky
stejné u všech píků)• počty částic (lineární – peak
area; log – peak height)
41 / 51
Zobrazení výsledků
► 2D diagramy» dotplot
» pseudocolour plot
» contour plot
» density plot
» …
► 3D diagramy
► uložení do počítače» .fcs (Flow Cytometry
Standard)
» verze 2.0 × 3.0
42 / 51
Trigerring
► vyhodnocuje se jen signál surčitou intenzitou» vyšší než určitá úroveň
(threshold)
» odfiltrování šumu
► obvykle jeden z měřených parametrů » označován leading trigger nebo discriminator
» částice s nižší intenzitou se nezaznamenávají
» v našich aplikacích fluorescence
» v imunologii často FSC / SSC• při detekci imunofluorescence jsou zajímavé i negativní buňky
43 / 51
Citlivost přístroje
► různé zdroje šumu» fluktuace ve zdroji světla
» fluidika
» autofluorescence
» elektronika
» …
► jednotky MESF» molecules of equivalent soluble fluorochrome
» kalibrační částice se známým počtem molekul → kalibrační přímka → detekce stejných částic bez barviva (např. FSC) → výpočet odpovídající intenzity fluorescence
» možná absolutní jednotka v histogramech (osa X) ?
Shapiro 2003
44 / 51
Přesnost měření
► koeficient variance (CV)» vyjadřuje variabilitu v hodnotách daného parametru
» směrodatná odchylka / průměr
» pro stejné částice teoreticky 0 (žádná variabilita), v praxi >0%; pro měření DNA pokud možno pod 3%
► FWHM (full width at half maximum heigth)» odhad s.d., vychází z tvaru Gaussovy křivky,
s.d. ~ FWHM / 2.36
► linearita» do jaké míry odpovídají naměřené intenzity
skutečným násobkům (např. G1 vs. G2 fáze;„slepená“ jádra či kalibrační částice)
» u našich přístojů do cca ± trojnásobku
45 / 51
Gating
► výběr jen části pozorování podle určitého kriteria» automaticky × ručně
» kombinace různých parametrů
» lze v několika stupních• data → výběr (např. FSC × SSC) → výběr z výběru (např.
fluorescence) → výpočet
► např. výběr určité buněčné populace pro další analýzu
46 / 51
(Spektrální) Kompenzace
► měříme více parametrůnajednou» např. fluorescence
různých látek, překryvspekter, viz příklad:
FITC (fluoresceinisothiocyanate) + R-phycoerythrin
» ve žluté oblasti (PE)má určitou fluorescenci i FITC → signál i v nepřítomnosti PE
• a symetricky naopak
» fluorescenci „nechtěné“ barvy je třeba „odečíst“• z tvaru křivky lze spočítat, kolik světla (% maxima) je na dané
vlnové délce → suma přes rozsah vln. délek → toto se odčítá• vzájemně pro každou barvu – sada n rovnic o n neznámých…
http://www.invitrogen.com/
47 / 51
Třídění (sorting)
► možnost vybrat ze suspenze částice určitých vlasností» na základě rozptylu, fluorescence,…
» definujeme určitý rozsah parametrů (gate) pro vybírané částice
► obecně tři kroky» měření
» rozhodnutí, zda nás daná částice zajímá - sorting decision (na základě daných parametrů)
» vlastní třídění
► třídit lze skoro cokoliv» buňky
» organely
» chromosomy
» …
48 / 51
Třídění (sorting)
Droplet sorting
► stream-in-air uspořádání► proud kapaliny ve vzduchu nestabilní → rozpad na řadu
kapek, ± chaoticky► při aplikaci vibrací určité frekvence vznikají kapky pravidelně
» piezoelektrický jev – mechanická deformace krystalu (určité typybez centra symetrie) → vznikelektrického náboje na plocháchkrystalu → při návratu zpět vznikelektrického proudu
» funguje i opačně – aplikace stří-davého proudu → vibrace o stejné frekvenci
49 / 51
Třídění (sorting)
Droplet sorting
► rozpad proudu na kapky v konstantnívzdálenosti (~ mm)
► konstantní rychlost (~ 10 m / s)
► konstantní vzdálenost mezi kapkami(řádově stovky μm)
► přesná synchronizace» čas od průchodu měřícím bodem
po oddělení kapky » čas mezi oddělením kapek
http://www.gene-quantification.de/single-cell-handling.html
f v
50 / 51
Třídění (sorting)
Droplet sorting
► nabití proudu těsně před oddělením kapky se zájmovou částicí
► po oddělení nese kapka určitý náboj
► rozdělení kapek podle náboje mezidvěma opačně nabitými destičkami(deflection plates)
► současné přístroje řádově 10 000 částic / s (teor. do 100 000 / s)» limit daný rychlostí elektroniky +
vynechání částic (i chtěných) jdoucích těsně za sebou» fyzikální limit pro tvorbu kapek cca 250 000 / s
http://www.gene-quantification.de/single-cell-handling.html
51 / 51
Třídění (sorting)
► droplet sorting» v současnosti nejčastější, nejrychlejší
» nevýhodou tvorba aerosolů (problém u rizikového materiálu, např. nakažlivé choroby v medicíně)
► fluidic switching» několik různých provedení
» principem vždy změna prouděnísheath fluid při třídění
» pomalejší než droplet sorting (stovky částic / s), ale obvykle uzavřené fluidické systémy
Sha
piro
200
3