υμπληρωματικές σημειώσεις εργαστηρίου...

Σχολή Επαγγελμάτων Υγείας και Πρόνοιας Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων

Συμπληρωματικές σημειώσεις εργαστηρίου

κλινικής χημείας Ι και ΙΙ

Οι χρωματομετρικές αναλύσεις της κλασικής κλινικής χημείας

ΠΕΤΡΟΣ Λ. ΚΑΡΚΑΛΟΥΣΟΣ

Βιολόγος Msc, PhD, EurClinChem

Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων

ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΦΑΡΜΟΓΩΝ ΚΛΙΝΙΚΗΣ ΧΗΜΕΙΑΣ AΤΕΙ ΑΘΗΝΩΝ

Έκδοση Τέταρτη

ΑΘΗΝΑ 2014

Εργαστήριο Κλινικής Χημείας Δρ. Πέτρου Καρκαλούσου

2

Πρόλογος

Οι βιοχημικές αναλύσεις είναι οι συχνότερες αναλύσεις που γίνονται στα ιατρικά

εργαστήρια, μαζί με την γενική αίματος και την γενική ούρων. Στην κατηγορία «βιοχημικές

αναλύσεις» ανήκει ένας πολύ μεγάλος αριθμός ποσοτικών προσδιορισμών από τους

οποίους οι σημαντικότερες αναφέρονται σε αυτές τις σημειώσεις. Όλες οι αναλύσεις που

αναφέρονται εδώ ανήκουν στην κατηγορία που είναι γνωστές ως «χρωματομετρικές» ή

«φωτομετρικές» αναλύσεις.

Παλαιότερα εκτελούνταν με ένα μόνο απλό όργανο το φωτόμετρο. Σήμερα όμως

εκτελούνται πλέον σε αυτόματους βιοχημικούς αναλυτές. Παρόλα αυτά η γνώση των

μεθοδολογιών με την βοήθεια του φωτομέτρου είναι ακόμα και σήμερα χρήσιμη για να

κατανοήσει κανείς τον τρόπο λειτουργίας αυτών των αυτόματων μηχανημάτων. Έτσι, ο

χρήστης γνωρίζοντας τον τρόπο λειτουργίας των αυτόματων αναλυτών μπορεί να

παρέμβει αποτελεσματικά όταν υπάρχουν τεχνικά προβλήματα και έτσι να βοηθήσει στην

γρήγορη εξουδετέρωσή τους.

Οι παρούσες σημειώσεις αποτελούν μια εισαγωγή στις φωτομετρικές αντιδράσεις

όπου δίνονται βασικοί ορισμοί και περιγράφονται οι βασικές γνώσεις που θα πρέπει να

γνωρίζει κάποιος που θέλει να ασχοληθεί με τους βιοχημικούς αναλύσεις όχι απλά ως

χρήστης αλλά ως είναι καλό γνώστης της λειτουργίας τους.

Οι σημειώσεις αυτές αποτελούν εισαγωγή στη χρωματομετρική ανάλυση. Στο

φυλλάδιο «βιοχημικοί αναλυτές» ο αναγνώστης θα βρει πολύ περισσότερες λεπτομέρειες

για τις χρωματομετρικές αναλύσεις.

Αθήνα 2014

Καρκαλούσος Πέτρος

Βιολόγος PhD, EurClinChem

Στατιστικολόγος Msc

Τεχνολόγος Ιατρικών Εργαστηρίων

[email protected]

users.teiath.gr/petef


3

Εισαγωγή

Το βιοχημικό εργαστήριο αποτελεί μαζί με το αιματολογικό εργαστήριο και το

εργαστήριο καλλιεργειών τα τρία τμήματα πρώτης γραμμής σε κάθε εργαστήριο. Γι’ αυτό

τον λόγο άλλωστε τα δύο πρώτα βρίσκονται στα τμήματα επειγόντων περιστατικών

(ΤΕΠ). Μεταξύ των πολλών εξετάσεων που διενεργεί σήμερα ένα σύγχρονο βιοχημικό

εργαστήριο την πρώτη θέση σε σημασία και ποσότητα κατέχουν σήμερα οι κλασικές

βιοχημικές αναλύσεις που είναι σήμερα γνωστές και ως «βιοχημικές εξετάσεις». Οι

εξετάσεις αυτές διενεργούνται σήμερα σε αυτόματους βιοχημικούς αναλυτές, μπορούν

όμως και να γίνουν και σε απλά φωτόμετρα.

Οι εξετάσεις αυτές είναι οι εξής:

Γλυκόζη Χοληστερόλη GOT/AST ALP Ολική πρωτεΐνη Σίδηρος

Ουρία Τριγλυκερίδια GPT/ALT Μg Αλβουμίνη Ασβέστιο

Ουρικό οξύ HDL-χοληστερόλη LDH K Ολική χολερυθρίνη Φώσφορος

Κρεατινίνη LDL-χοληστερόλη γ-GT Na Άμεση χολερυθρίνη Αμυλάση

Οι χρωματομετρικές αναλύσεις

Οι χρωματομετρικές αναλύσεις είναι οι προσδιορισμοί που βασίζονται στην μέτρηση

της έντασης του χρώματος που προκαλείται από μία χημική αντίδραση στην οποία

συμμετέχει η προς προσδιορισμό ουσία. Η ονομασία «χρωματομετρικές» οφείλεται σε αυτή

ακριβώς την δημιουργία χρώματος.

Μία απλή φωτομετρική διάταξη


4

Μία απλή χρωματομετρική διάταξη λειτουργεί ως εξής: Το φως που παράγεται από

μια απλή λυχνία περνάει μέσα από μία διάταξη φίλτρων. Tα φίλτρα είναι μια σειρά από μικρά

έγχρωμα γυαλιά, τα οποία αλλάζουν αυτόματα από τον αναλυτή, φιλτράρουν το φως και

επιτρέπουν να βγει από αυτά φως συγκεκριμένου μήκους κύματος1. Το τελευταίο περνά

μέσα από την κυψελίδα όπου βρίσκεται ένα έγχρωμο διάλυμα. Εκεί ένα μέρος του φωτός

απορροφάται από το διάλυμα. Το υπόλοιπο φως βγαίνει από αυτό και μετράται με

κατάλληλο φωτοανιχνευτή.

Η διαφορά μεταξύ του φωτός που εισέρχεται στο διάλυμα και αυτού που βγαίνει

ισούνται με την απορρόφηση του φωτός (Α) η οποία μπορεί να υπολογιστεί και από τον

παρακάτω τύπο, γνωστό και ως νόμο του Lambert-Beer:

A = α b C Όπου:

A: η απορρόφηση. Δεν έχει μονάδες μέτρησης, είναι καθαρός αριθμός.

α: η απορροφητικότητα (σταθερός αριθμός που εξαρτάται από το μήκος κύματος και

διαφέρει για κάθε ουσία).

b: η απόσταση που διανύει το φως μέσα στην κυψελίδα.

C: η συγκέντρωση της μετρούμενης ουσίας. Μετράται σε mg/dL ή moles/L (SI).

Υπάρχουν πολλοί τρόποι φωτομετρικών μετρήσεων στους βιοχημικούς αναλυτές. Ο

απλούστερος από αυτούς είναι η μέτρηση τελικού σημείου. Παρακάτω θα περιγραφούν οι

σχετικές μεθοδολογίες.

Φωτομετρία – ενζυματικές αντιδράσεις

Η μεγάλη πλειοψηφία των χρωματομετρικών αναλύσεων χρησιμοποιούν ένζυμα για

να επιταχυνθούν οι χημικές αντιδράσεις. Οι αντιδράσεις αυτές ονομάζονται ενζυμικές. Η

πορεία τους θα αναλυθεί εδώ.

Ας πάρουμε για παράδειγμα τον προσδιορισμό της γλυκόζης. Αυτή πραγματοποιείται

με την βοήθεια δύο ενζύμων, την οξειδάση (συμβολίζεται GOD) και την υπεροξειδάση

(συμβολίζεται POD) τα οποία καταλύουν τις ακόλουθες αντιδράσεις. Στις χημικές αντιδράσεις

που χρησιμοποιούνται στη κλινική χημεία συνήθως η πρώτη είναι μία χημική αντίδραση

1 Τo μήκος κύματος (συμβολίζεται διεθνώς με το Ελληνικό γράμμα λ) είναι μια περιορισμένη

περιοχή της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας η οποία περιλαμβάνει το ορατό φως αλλά και αόρατες στο μάτι ακτίνες όπως η υπεριώδης ακτινοβολία, οι ακτίνες Χ, τα ραδιοκύματα κ.α. Μετράται σε νανόμετρα (nm).


5

που έτσι και αλλιώς γίνεται στον οργανισμό ενώ η δεύτερη έχει δημιουργηθεί από τους

επιστήμονες.

GOD Γλυκόζη + Ο2 + Η2Ο Γλυκονικό οξύ + Η2Ο2

POD 2Η2Ο2 + 4-αμινοφεναζόνη + p-υδροβενζοικό οξύ κινόνη + 4 Η2Ο

Κατά την διάρκεια της αντίδρασης το αρχικό «υπόστρωμα»2 των δύο ενζυματικών

αντιδράσεων (η β-D-γλυκόζη) μειώνεται σταδιακά ενώ παράλληλα αυξάνει το τελικό προϊόν

(η κινόνη). Η διάρκεια της αντίδρασης ονομάζεται «χρόνος επώασης» και εκτελείται σε

συγκεκριμένη θερμοκρασία π.χ. στους 37ο C. Το προϊόν της αντίδρασης, η κινόνη, είναι μια

ουσία κόκκινου χρώματος η οποία αυξάνει διαρκώς με αποτέλεσμα το διάλυμα της

αντίδρασης κατά την διάρκεια της επώασης να γίνεται όλο και περισσότερο κόκκινο. Όσο πιο

κόκκινο είναι το διάλυμα στο τέλος της επώασης, τόσο περισσότερο κινόνη περιέχει και κατά

συνέπεια τόσο περισσότερο β-D-γλυκόζη υπήρχε αρχικά.

Ενζυμικές αντιδράσεις σαν αυτές του παραδείγματος χωρίζονται σε τρία στάδια: το

αρχικό στάδιο, το κινητικό στάδιο και το στάδιο ισορροπίας. Ας δούμε πως λειτουργούν τα

στάδια αυτά στην δεύτερη ενζυμική αντίδραση προσδιορισμού της γλυκόζης όπου το

υπόστρωμα είναι το υπεροξείδιο του υδρογόνου H2O2 και το προϊόν η κινόνη.

Φάση Ι. Αρχικό στάδιο.

Το «αρχικό» στάδιο είναι μια σύντομη περίοδος στην αρχή του χρόνου όπου η

ενζυματική αντίδραση πραγματοποιείται αργά. Στην φάση αυτή υπάρχει πολύ υπόστρωμα

και (H2O2) και λίγο προϊόν (κινόνη).

Φάση ΙΙ. Κινητικό στάδιο.

Στην συνέχεια η αντίδραση πραγματοποιείται εξαιρετικά γρήγορα. Στη φάση αυτή η

συγκέντρωση του υποστρώματος (H2O2) μειώνεται και η συγκέντρωση του προϊόντος

(κινόνη) αυξάνει ταχύτατα. Το στάδιο αυτό ονομάζεται «κινητικό». Mόνο στο στάδιο αυτό

ισχύει ο νόμος Lambert-Beer (A = α b C).

Φάση ΙΙΙ. Στάδιο ισορροπίας.

Ακολουθεί το στάδιο ισορροπίας όπου ολόκληρη η ποσότητα του υποστρώματος

(H2O2) έχει καταναλωθεί και η ποσότητα του προϊόντος έχει φτάσει στη μέγιστη

συγκέντρωση. Μόλις φτάσει η ενζυμική αντίδραση στο στάδιο ισορροπίας η συγκέντρωση

του προϊόντος θα παραμείνει σταθερή (κινόνη) όσο και να παραταθεί περαιτέρω η επώαση.

2 Η ουσία(ες) που ενώνεται με το ενεργό κέντρο του ενζύμου και καταναλώνεται κατά την διάρκεια της

αντίδρασης. Στα εργαστήρια πολλές φορές το αναφέρουμε με το Αγγλικό όνομα (Substrate).


6

Περιληπτικά τα στάδια μιας χρωματομετρικής ανάλυσης όπου παριστάνεται η μεταβολή της

συγκέντρωσης της μετρούμενης ουσίας σε σχέση με το χρόνο. Εδώ μετράται η συγκέντρωση ενός

προϊόντος και για αυτό η συγκέντρωση του αυξάνει με τον χρόνο. Θα μπορούσε να συμβεί το αντίθετο

δηλαδή η ουσία που μετράμε να βρίσκεται στα αντιδρώντα οπότε η συγκέντρωσή της να μειώνεται με

τον χρόνο.

Σχέση Απορρόφησης και Διαπερατότητας

H σχέση απορρόφησης και διαπερατότητας (transmittance) ισούνται με: A =

1/log(T). Τα φωτόμετρα μετρούν και απορρόφηση και διαπερατότητα αλλά συνήθως

χρησιμοποιείται η απορρόφηση όπως σε αυτό το κείμενο.

Οι κατηγορίες των χρωματομετρικών αναλύσεων

Οι χρωματομετρικές αναλύσεις διακρίνονται σε τρεις μεγάλες κατηγορίες, τις

αναλύσεις «τελικού σημείου», τις αναλύσεις «σταθερού χρόνου» ή «κινητικές δύο σταδίων»

και τις «κινητικές». Μεταξύ τους έχουν διαφορές αλλά και ομοιότητες.

Πρώτα από όλα θα πρέπει να αναφερθεί ότι οι χρωματομετρικές αναλύσεις εκτός

από τα δείγματα των ασθενών χρειάζονται και άλλα δύο διαλύματα τα οποία είναι γνωστά

ως «λευκό» δείγμα και «πρότυπο» δείγμα (βλ. παρακάτω).

Οι διαφορές των τριών αυτών χρωματομετρικών αναλύσεων είναι οι ακόλουθες:

1. Μέτρηση «τελικού σημείου» (End point). Στη μέτρηση αυτή η απορρόφηση του

δείγματος του ασθενούς μετράται μόνο μία φορά αφού προηγηθεί

συγκεκριμένος χρόνος επώασης (βλ. παρακάτω). Με τέτοιες αναλύσεις

προσδιορίζονται η γλυκόζη, η χοληστερόλη, η ουρία και γενικά διάφορες

οργανικές ενώσεις που ονομάζονται υποστρώματα σε αντιδιαστολή με τα ένζυμα.


7

Για την μέτρηση τελικού σημείου εκτός από το δείγμα χρησιμοποιείται «λευκό»

και «πρότυπο».

2. Μέτρηση «σταθερού χρόνου ή κινητική δύο σταδίων» (Fixed time). Στη

μέτρηση αυτή η απορρόφηση του δείγματος μετράται δύο φορές σε

συγκεκριμένα σημεία που βρίσκονται στην αρχή και στο τέλος του κινητικού

σταδίου της ενζυμικής αντίδρασης. Σε αυτή την περίπτωση στον υπολογισμό της

συγκέντρωσης του δείγματος χρησιμοποιείται η διαφορά των δύο

απορροφήσεων (βλ. παρακάτω). Για την μέτρηση «σταθερού χρόνου εκτός από

δείγμα χρειάζεται και «πρότυπο». Η μέτρηση «σταθερού χρόνου» έχει

περιορισμένη σχετικά εφαρμογή και χρησιμοποιείται κυρίως για τον

προσδιορισμό της κρεατινίνης.

3. Μέτρηση «κινητική» (Kinetic). Στη μέτρηση αυτή η απορρόφηση του δείγματος

μετράται αρκετές φορές συνήθως κατά την διάρκεια του κινητικού σταδίου της

αντίδρασης. Στον υπολογισμό της συγκέντρωσης του δείγματος χρησιμοποιείται

η μέση διαφορά μεταξύ διαδοχικών απορροφήσεων (βλ παρακάτω). Στις

κινητικές μετρήσεις δεν χρειάζονται λευκό και πρότυπο δείγμα. Χρησιμοποιούνται

αποκλειστικά για τον προσδιορισμό της ενεργότητας των ενζύμων (π.χ. GOT,

GPT, ALP κ.α.).

Η απλή μέθοδος των τριών και ο νόμος Lambert-Beer

Ο νόμος Lambert-Beer είναι A = αbC. H απορρόφηση έχει γραμμική σχέση3 με

την συγκέντρωση αλλά παρόλα αυτά δεν μπορούμε να ξέρουμε την συγκέντρωση παρά

μόνο την απορρόφηση την οποία μετρά το φωτόμετρο. Η συγκέντρωση είναι άγνωστη

γιατί δεν γνωρίζουμε την σχέση Απορρόφησης/Συγκέντρωσης η οποία είναι διαφορετική

για κάθε μετρούμενη ουσία και αναλυτική μέθοδος. Η σχέση Απορρόφησης/Συγκέντρωσης

ονομάζεται Συντελεστής Προσδιορισμού ή απλούστερα Συντελεστής (στα Αγγλικά

Factor) και υπολογίζεται με απλή μέθοδο των τριών με ένα πρότυπο δείγμα. Το πρότυπο

περιέχει την ίδια ουσία με αυτή που θέλουμε να μετρήσουμε αλλά είναι γνωστής

συγκέντρωσης.

Έστω λοιπόν ότι η απορρόφηση του προτύπου είναι Αstd και η συγκέντρωση του

είναι Cstd καθώς επίσης η απορρόφηση του δείγματος είναι Αsample και του προτύπου Astandard.

Κάνουμε απλή μέθοδο των τριών για να βρούμε την συγκέντρωση του δείγματος,

δηλαδή:

3 Γραμμική σχέση μεταξύ δύο μεγεθών σημαίνει ότι όταν αυξάνει το ένα μέγεθος αυξάνει και το άλλο

ή αντίθετα όταν μειώνεται το ένα μέγεθος μειώνεται και το άλλο, κάθε φορά με μία σταθερή σχέση.


8

H απορρόφηση του προτύπου Αstd αντιστοιχεί σε συγκέντρωση Cstd

H απορρόφηση του δείγματος Asample τι συγκέντρωση έχει; (x).

Άρα:

Επειδή η συγκέντρωση του προτύπου είναι δεδομένη και δεν αλλάζει αλλά και

επειδή την απορρόφηση του προτύπου την μετράμε μία φορά την αρχή των αναλύσεων το

κλάσμα

έχει σταθερή τιμή και για αυτό ονομάζεται συντελεστής

πολλαπλασιασμού (factor). Tην σημασία του την αναλύσαμε προηγουμένως και στη

πράξη είναι η σταθερή τιμή με την οποία θα πολλαπλασιάζονται στο εξής οι απορροφήσεις

κάθε δείγματος προκειμένου να υπολογιστεί η συγκέντρωση τους.

To πρότυπο δείγμα ή αλλιώς Standard

Το «πρότυπο» δείγμα4 είναι ένα διάλυμα που περιέχει συγκεκριμένη ποσότητα

της προς προσδιορισμό ουσίας. Η ποσότητα αυτή έχει μετρηθεί με πρότυπες μεθόδους

στο εργοστάσιο παρασκευής του. Παρόλο όμως που έχει συγκεκριμένη ποσότητα μιας ή και

περισσότερων ουσιών υπάρχει μία μικρή διακύμανση σε αυτή την τιμή η οποία ονομάζεται

«αβεβαιότητα βαθμονομητή». Εκφράζεται σε ποσοστό πχ 2% και συνοδεύει την τιμή του

προτύπου. Το πρότυπο δείγμα βρίσκεται σε ξεχωριστό περιέκτη από τα αντιδραστήρια της

ανάλυσης και μπορεί να είναι σε υγρή μορφή ή σκόνη. Αν είναι σε σκόνη τότε θα πρέπει να

ανασυσταθεί με την προσθήκη κατάλληλου διαλύτη ή απλού αποσταγμένου νερού.

H απορρόφηση του πρότυπου δείγματος μετράται μαζί με την απορρόφηση του

δείγματος του ασθενούς. Η τιμή της συγκέντρωσης (Cπρότυπο) και της απορρόφησης του

προτύπου (Απρότυπο) χρησιμοποιούνται για την μετατροπή της απορρόφησης του δείγματος

(Αδείγμα) σε συγκέντρωση (Cδείγμα) βάση συγκεκριμένου τύπου (βλ. παρακάτω).

Οι κρίσιμες τιμές απορρόφησης

(όριο ανίχνευσης, όριο ποσοτικοποίησης, όριο γραμμικότητας)

Ο νόμος Lambert-Beer δεν ισχύει καθ’όλη τη διάρκεια εξέλιξης της

χρωματομετρικής αντίδρασης δηλαδή μέχρι να εξαντληθεί το υπόστρωμα. Αντίθετα ισχύει

4 Το «πρότυπο» δείγμα (Αγγλικά: Standard) ονομάζεται επίσης και βαθμονομητής (Αγγλικά:

Calibrator).


9

μόνο στο κινητικό στάδιο. Μόνο σε αυτό το στάδιο ισχύει ο τύπος A = α b C δηλαδή η

γραμμική σχέση y = α x ή αλλιώς C = α A. H γραμμική σχέση ξεκινά από το λεγόμενο

«όριο ποσοτικοποίησης» και τελειώνει στο τελικό σημείο. Τιμή συγκέντρωσης κάτω από

το όριο ποσοτικοποίησης δεν δίνεται σε ασθενή.

Το όριο ποσοτικοποίησης είναι η τιμή της απορρόφησης όπου αυτή

«ποσοτικοποιείται» δηλαδή μετατρέπεται σε συγκέντρωση. Άλλο σημαντικό σημείο πάνω

στην καμπύλη Απορρόφηση/Χρόνος είναι το όριο ανίχνευσης. Πρόκειται για εκείνη την

τιμή απορρόφησης όπου το φωτόμετρο διακρίνει ότι μέσα στο διάλυμα υπάρχει κάποια

ουσία με απορρόφηση μεγαλύτερη από το τυφλό. Το όριο ανίχνευσης είναι μικρότερο από

το όριο ποσοτικοποίησης και λίγο μεγαλύτερο από το τυφλό. Η απορρόφηση του τυφλού

ισούνται με την απορρόφηση που έχει το διάλυμα αντίδρασης σε χρόνο μηδέν, δηλαδή

αμέσως μόλις έρθει σε επαφή το δείγμα με το αντιδραστήριο εργασίας.

Ενώ το όριο ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης είναι το ίδιο σε όλες τις αναλύσεις

που γίνονται με την ίδια μέθοδο το τελικό σημείο διαφέρει. Κάθε εξεταζόμενος έχει

διαφορετικό τελικό σημείο ανάλογα με την συγκέντρωση της ουσίας στον οργανισμό του.

Δεν είναι δυνατόν όμως το τελικό σημείο να πάρει άπειρες τιμές. Υπάρχει ένα όριο στη

τιμή της συγκέντρωσης που μπορεί να ποσοτικοποιηθεί από την μία τιμή απορρόφησης,

δηλαδή ο νόμος Lambert-Beer ισχύει μέχρι ένα συγκεκριμένο ύψος απορρόφησης. Η τιμή

αυτής της συγκέντρωσης λέγεται «όριο γραμμικότητας».

Αναλυτικά η εξέλιξη της τιμής της απορρόφησης σε σχέση με το χρόνο. Κατά τη διάρκεια του

κινητικού σταδίου ισχύει ο νόμος Lambert-Beer δηλαδή η απορρόφηση είναι ανάλογη της


10

συγκέντρωσης. Το κινητικό στάδιο ξεκινά από το όριο ποσοτικοποίησης και τελειώνει στο τελικό

σημείο.

Η καμπύλη αναφοράς

Απλοποιημένη καμπύλη αναφοράς η οποία ξεκινά από το σημείο μηδέν. Η εφαπτομένη της γωνίας

φ

Στις χρωματομετρικές αναλύσεις η καμπύλη αναφοράς είναι μία ευθεία γραμμή.

Αντιστοιχεί μόνο στο κινητικό στάδιο της καμπύλης απορρόφησης προς την μεταβολή

του χρόνου. Ξεκινά από το μηδέν ή κοντά στο μηδέν όπου βρίσκεται η απορρόφηση

(κοντά στο μηδέν) και η συγκέντρωση του τυφλού (πάντα μηδέν) και τελειώνει σε ένα

δεύτερο σημείο που αντιπροσωπεύει την απορρόφηση (Astd) και την συγκέντρωση του

προτύπου (Cstd). Στις χρωματομετρικές αναλύσεις αποτελείται δηλαδή από δύο σημεία

που αντιστοιχούν στην μηδενική συγκέντρωση και τη συγκέντρωση του πρότυπου.

H γραμμή αυτή είναι ευθεία και όταν είναι η απορρόφηση του τυφλού μηδέν

ισούνται με y = αx όπου y είναι η συγκέντρωση και x η απορρόφηση. Δηλαδή: C = α Α.

Όταν η απορρόφηση του τυφλού δεν είναι μηδέν τότε η εξίσωση ισούνται με: y =

αx+β. Το β είναι η απορρόφηση του τυφλού και μπορεί να έχει θετική ή αρνητική τιμή

ανάλογα με το αν είναι πάνω ή κάτω από τον οριζόντιο άξονα.

Οπότε ισχύει: C = α Α + Αblank.

Και στις δύο περιπτώσεις το α είναι η κλίση της γωνίας φ η οποία ισούνται με

την εφαπτομένη της γωνίας φ. Στα Αγγλικά το α ονομάζεται slope (κλίση) και έχει όπως θα

δούμε δύο έννοιες:

1. Ισούνται με την εφαπτομένη της γωνίας που σχηματίζει η καμπύλη αναφοράς

με τον οριζόντιο άξονα όπου βρίσκονται οι τιμές απορρόφησης.


11

Δηλαδή

ή αλλιώς

2. Ισούνται με τον συντελεστή πολλαπλασιασμού (factor) με τον οποίο

πολλαπλασιάζονται οι απορροφήσεις των δειγμάτων προκειμένου να

υπολογιστούν οι συγκεντρώσεις τους.

=

Δηλαδή η κλίση (α) ισούνται με τον συντελεστή πολλαπλασιαμού (factor) που

γνωρίσαμε προηγουμένως. Στην πράξη δηλαδή με την κλίση υπολογίζονται όλες οι τιμές

προκειμένου να υπολογιστεί η συγκέντρωση του δείγματος.

To α ονομάζεται και κλίση ή slope και αντιστοιχεί στον συντελεστή (factor) της

μεθόδου. Το β ονομάζεται τομή ή intercept και αντιστοιχεί στο σταθερό συστηματικό

σφάλμα της μεθόδου. Τυπικά το α είναι 1 και το β είναι 0. Συνήθως όμως το α είναι

διαφορετικό από το 1, κοντά όμως σε αυτό π.χ. 1,2, 0,98 και το β είναι λίγο μεγαλύτερο ή

μικρότερο π.χ. 0,012. Πιο ρεαλιστική καμπύλη αναφοράς είναι αυτή που αναφέρεται

παρακάτω.

Όριο γραμμικότητας και καμπύλη αναφοράς

Στις χρωματομετρικές αναλύσεις η καμπύλη αναφοράς είναι ευθεία γραμμή που

παριστάνεται γραφικά σε ένα διάγραμμα όπου στον κάθετο άξονα βρίσκεται η συγκέντρωση

και στον οριζόντιο η απορρόφηση C = f(A). Ξεκινά από την απορρόφηση του ορίου

ποσοτικοποίησης και τελειώνει στο όριο γραμμικότητας. Το τελικό σημείο της απορρόφησης

κάθε εξεταζομένου είναι πάντοτε μικρότερο από το όριο γραμμικότητας. Αν η τιμή

απορρόφησης ή συγκέντρωσης ενός εξεταζομένου είναι υψηλότερα από το όριο

γραμμικότητας τότε κάνουμε αραίωση του δείγματος και νέα μέτρηση.


12

Εύρος μέτρησης και τι κάνουμε αν το υπερβούμε

Το εύρος μέτρησης (measuring range ή MR) δίνει στον εργαστηριακό

επιστήμονα τη συνολική δυνατότητα μέτρησης μιας αναλυτικής μεθόδου. Το κατώτερο όριο

είναι το όριο ποσοτικοποίησης και το ανώτερο το όριο γραμμικότητας π.χ. 0,8 – 600 mg/dL.

Όταν η συγκέντρωση ενός δείγματος είναι μικρότερη από το όριο

ποσοτικοποίησης δεν δίνεται στον ασθενή. Αντιθέτως δίνεται ως μικρότερη του ορίου

ποσοτικοποίησης π.χ. < 0,8 mg/dL.

Όταν η συγκέντρωση ενός δείγματος είναι μεγαλύτερη από το όριο γραμμικότητας,

ομοίως δεν δίνεται στον ασθενή. Σε αυτή την περίπτωση γίνεται αραίωση του δείγματος και

ξανα-αραίωση του δείγματος. Το τελικό αποτέλεσμα πολλαπλασιάζεται επί την αραίωση.

Π.χ. αν η συγκέντρωση στο προηγούμενο παράδειγμα είναι 800 mg/dL γίνεται

αραίωση ½. Η νέα συγκέντρωση έστω ότι είναι 415 mg/dL. Τότε η συγκέντρωση του

ασθενούς είναι 415 x 2 = 820 mg/dL.


13

Το τυφλό και οι τρεις χρήσεις του

To «λευκό» δείγμα5 είναι διάλυμα που περιέχει όλα τα αντιδραστήρια που

χρησιμοποιούνται στην μέθοδο. Το μόνο που δεν περιέχει είναι δείγμα ασθενούς. Στη θέση

του δείγματος του ασθενούς χρησιμοποιείται συνήθως ίση ποσότητα αποσταγμένου νερού.

Ονομάζεται «λευκό» επειδή δεν περιέχει δείγμα ασθενούς και η απορρόφησή του είναι πολύ

μικρή σχεδόν μηδενική.

Μηδενισμός φωτομέτρου. Στις δια χειρός μεθόδους (manual methods)

χρησιμοποιείται για το μηδενισμό του φωτομέτρου δηλαδή για την αφαίρεση της

απορρόφησης του δείγματος όλων των απορροφήσεων που οφείλονται στα συστατικά της

αντιδρώσας ουσίας και της ίδιας της κυβέττας. Στο παράδειγμα με τον προσδιορισμό της

γλυκόζης η απορρόφηση του τυφλού ισούνται:

Ablank = Ap-υδροβενζοικό οξύ + Ααμινοφαιναζόνη + ΑPOD + AGOD + Aνερό + Αγλυκονικό οξύ + Ακυβέττα

Η απορρόφηση αυτή αφαιρείται από όλες τις μετρήσεις.

Δείκτης ποιότητας. Μία άλλη χρήση του τυφλού είναι ως δείκτης ποιότητας της

χρωματομετρικής μεθόδου. Ιδανικά η απορρόφηση του τυφλού ισούνται με το μηδέν. Αυτό

όμως δεν συμβαίνει σχεδόν ποτέ. Έχει πάντα μία έστω και μικρή απορρόφηση. Οι

κατασκευαστές της αναλυτικής μεθόδου μπορεί να δώσουν μία τιμή απορρόφησης για το

τυφλό η οποία λειτουργεί ως όριο ποιότητας. Αν το τυφλό υπερβεί αυτή την τιμή (π.χ. 0,2)

κατά πάσα πιθανότητα η κυβέττα είναι πολύ βρώμικη και πρέπει να αντικατασταθεί.

Έναρξη καμπύλης αναφοράς. Tέλος η απορρόφηση του τυφλού αποτελεί την

έναρξη της καμπύλης αναφοράς πάνω στον κάθετο άξονα της συγκέντρωσης. Δηλαδή το

τυφλό είναι το σημείο β της εξίσωσης y = αx ή όπως αλλιώς ετοιμάζεται η τομή ή

intercept.

Χρωματομετρική ανάλυση «τελικού σημείου»

Η αντίδραση «τελικού σημείου» όταν διενεργείται σε απλό φωτόμετρο6 αποτελείται

από τα ακόλουθα στάδια:

5 Το «λευκό» δείγμα (Αγγλικά: blank) ονομάζονταν παλαιότερα στην Ελληνική βιβλιογραφία «τυφλό» όρος

που χρησιμοποιείται όμως ακόμα και σήμερα. 6 Μπορεί να γίνει και σε αυτόματο βιοχημικό αναλυτή.


14

1. Χρησιμοποιούνται τρία σωληνάρια για την δημιουργία τριών διαλυμάτων. Το

πρώτο είναι το δείγμα (sample), το δεύτερο το λευκό (blank) και το τρίτο το

πρότυπο (standard). Σε όλα τα σωληνάρια τοποθετείται από ίση ποσότητα

αντιδραστηρίου. Στο σωληνάριο του δείγματος τοποθετείται συγκεκριμένη

ποσότητα δείγματος του ασθενούς. Στο σωληνάριο του προτύπου τοποθετείται

αντί δείγματος ίση ποσότητα προτύπου ουσίας και στο σωληνάριο του λευκού

τοποθετείται ίση ποσότητα αποσταγμένου νερού. Η σειρά τοποθέτησης των

σωληναρίων στο φωτόμετρο είναι Λευκό – Πρότυπο – Δείγμα ή δείγματα.

2. Και τα τρία διαλύματα αναδεύονται καλά σε vortex και επωάζονται σε

υδατόλουτρο για συγκεκριμένο χρόνο.

3. Μετά το τέλος του χρόνου επώασης μετράται η απορρόφηση και των τριών

διαλυμάτων σε φωτόμετρο του οποίου η οπτική μονάδα έχει ρυθμιστεί σε

συγκεκριμένο μήκος κύματος.

4. Η συγκέντρωση του δείγματος (Cδείγματος) υπολογίζεται από τον ακόλουθο

τύπο:

Όπου:

Δεδομένου δε ότι μηδενίζουμε με το τυφλό ο τύπος κανονικά θα πρέπει να

συμπεριλάβει και την τιμή του δηλαδή:

Τα στάδια της ενζυμικής αντίδρασης κατά την μέτρηση τελικού σημείου. Στο διάγραμμα εξετάζεται η

περίπτωση όπου η ένταση του χρώματος αυξάνεται όσο εξελίσσεται η ενζυμική αντίδραση.


15

Τα στάδια της ενζυμικής αντίδρασης κατά την μέτρηση τελικού σημείου. Στο διάγραμμα εξετάζεται η

περίπτωση όπου η ένταση του χρώματος ελαττώνεται όσο εξελίσσεται η ενζυμική αντίδραση. O

λόγος φυσικά είναι ότι η έγχρωμη ουσία που μετράμε βρίσκεται στα αντιδρώντα. Αντίστοιχη

εικόνα παρουσιάζεται και κατά την εξέλιξη των χρωματομετρικών αναλύσεων των τύπων «σταθερού

χρόνου» και «κινητικής ανάλυσης».

Χρωματομετρική ανάλυση «σταθερού χρόνου»

Η ανάλυση «σταθερού χρόνου» όταν διενεργείται σε απλό φωτόμετρο αποτελείται

από τα ακόλουθα στάδια.

1. Χρησιμοποιούνται δύο σωληνάρια για την δημιουργία δύο διαλυμάτων, το

δείγμα και το πρότυπο. Και τα δύο περιέχουν από ίση ποσότητα

αντιδραστηρίου. Η διαφορά τους είναι ότι το σωληνάριο του δείγματος περιέχει

συγκεκριμένη ποσότητα δείγματος ενώ το σωληνάριο του προτύπου ίση

ποσότητα προτύπου ουσίας.

2. Και τα δύο διαλύματα αναδεύονται καλά σε vortex και επωάζονται σε

υδατόλουτρο ίσο χρόνο.

3. Στην αρχή του χρόνου επώασης γίνεται μία πρώτη μέτρηση της απορρόφησης

Ααρχ και στο τέλος του χρόνου επώασης μία δεύτερη μέτρηση της

απορρόφησης Ατελ. Οι μετρήσεις αυτές γίνονται τόσο στο δείγμα όσο και στο

πρότυπο.

4. Η συγκέντρωση του δείγματος (Csample) υπολογίζεται από τον ακόλουθο τύπο:


16

Όπου:

Csample: η συγκέντρωση του δείγματος

Cstandard: η συγκέντρωση του προτύπου

Α1sample: η πρώτη απορρόφηση του δείγματος

Α1standarde: η πρώτη απορρόφηση του προτύπου

Α2sample: η δεύτερη απορρόφηση του δείγματος

Α2standard: η δεύτερη απορρόφηση του προτύπου

Τα σημεία μέτρησης σταθερού χρόνου κατά την διάρκεια της ενζυμικής αντίδρασης

«Κινητική» χρωματομετρική ανάλυση

H «κινητική» χρωματομετρική ανάλυση όταν διενεργείται σε απλό φωτόμετρο

αποτελείται από τα ακόλουθα στάδια.

1. Χρησιμοποιείται ένα μόνο σωληνάριο το οποίο περιέχει συγκεκριμένη

ποσότητα αντιδραστηρίου και δείγματος.

2. Το διάλυμα αναδεύεται καλά σε vortex και επωάζεται σε υδατόλουτρο

συγκεκριμένο χρόνο.

3. Στην αρχή του χρόνου επώασης γίνεται η πρώτη μέτρηση της απορρόφησης

Α1 για να ακολουθήσουν τουλάχιστον άλλες δύο Α2 και Α3 σε απόσταση


17

συνήθως ενός λεπτού η μία από την άλλη. Όλες οι μετρήσεις γίνονται στο

λεγόμενο «κινητικό» στάδιο της ενζυμικής αντίδρασης.

4. Η δραστικότητα του δείγματος (Csample) υπολογίζεται από τον ακόλουθο τύπο:

5.

Όπου:

Activityδείγματος: η συγκέντρωση του δείγματος

ΔΑ/min: η μέση διαφορά της απορρόφησης μεταξύ των διαδοχικών

μετρήσεων (Α1, Α2, Α3 …) ανά λεπτό.

Factor: o συντελεστής πολλαπλασιασμού της ΔΑ/min ο οποίος έχει να κάνει

με το πάχος της κυβέττας, τον όγκο του δείγματος και του αντιδραστηρίου και

τις μονάδες μέτρησης.

Οι τρεις μετρήσεις οπτικής απορρόφησης Α1, Α2, Α3 σε διαφορετικούς χρόνους t1, t2, t3 στις κινητικές

χρωματομετρικές μεθόδους.

Οι κινητικές μέθοδοι γίνονται για τον προσδιορισμό των ενζύμων. Πρόκειται για

ενζυμικές μέθοδους (όπως άλλωστε και οι μέθοδοι και για τους υπόλοιπους αναλύτες)

όπου άλλα ένζυμα χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των ενζύμων που θέλουμε.

Πρόκειται φυσικά για τις ενζυμικές χημικές αντιδράσεις που γίνονται και στον οργανισμό.

Έχει επικρατήσει οι μέθοδοι αυτοί να παίρνουν το όνομα της επιστημονικής

εταιρείας που έφτιαξε την μέθοδο. Οι μέθοδοι αυτοί διαφέρουν κυρίως στη διαφορετική

θερμοκρασία επώασης.

Αυτές οι επιστημονικές εταιρείες είναι οι ακόλουθες:

SSCC = Scandinavian Federation of Clinical Chemistry

SFBC = Société Française de Biologie Clinique


18

IFCC = International Federation of Clinical Chemistry

DGKC = Deutsche Gesellschaft für Klinische Chemie

Συνήθως στην Ελλάδα χρησιμοποιούνται οι μέθοδοι της IFCC (37ο C).

Όπως φαίνεται και από την προηγούμενη εξίσωση στις κινητικές μεθόδους δεν

προσδιορίζεται η συγκέντρωση αλλά η δραστικότητα ή αλλιώς η ενεργότητα (activity) του

ενζύμου. Η δραστικότητα αντιστοιχεί στη κατανάλωση του υποστρώματος του ενζύμου

από το ένζυμο στη μονάδα του χρόνου. Η μονάδα αναφοράς της ενεργότητας είναι η IU/L

ή U/L. Μία διεθνής μονάδα (IU ή πιο απλά U) είναι η ποσότητα του ενζύμου που

καταλύει 1 μmol υποστρώματος σε 1 min.

Τα ένζυμα βαθμονομούνται;

Εδώ θα πρέπει να τονιστεί ότι τα τελευταία χρόνια υπάρχει μία σημαντική αλλαγή

στον προσδιορισμό των ενζύμων. Παλαιότερα και σε πολλές περιπτώσεις - ακόμα και

σήμερα - δεν υπήρχαν πρότυπα για τον προσδιορισμό των ενζύμων (σε αντίθεση δηλαδή

με τον προσδιορισμό των υποστρωμάτων). Τον ρόλο του ενζύμου τον είχε ο Factor ο

οποίος είναι πάντα ένας σταθερός αριθμός.

Σήμερα όμως υπάρχουν πρότυπα και για τις κινητικές μεθόδους. Tα πρότυπα

(standards) μετρώνται με κινητική μέθοδο (τρεις μετρήσεις ανά λεπτό) όπως και τα

δείγματα. Η ενεργότητα του προτύπου Activitystd είναι γνωστή, υπολογίζεται επομένως η

μέση διαφορά απορρόφησης των τριών διαδοχικών απορροφήσεων του προτύπου. μόνο

η ΔΑstd από τις τρεις μετρήσεις απορρόφησης. Πριν από κάθε μέτρηση μηδενίζεται το

φωτόμετρο. Στη συνέχεια για κάθε δείγμα υπολογίζεται η ΔΑsample. H ενεργότητα κάθε

δείγματος υπολογίζεται στη συνέχεια από τον παρακάτω τύπο:

ή

stdsample ActivityActivitystd

sample

sample

std

sample

ActivityActivity


19

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΩΝ

Γλυκόζη (Glucose)

Διαγνωστική αξία

Η γλυκόζη αυξάνει στο αίμα κυρίως στον σακχαρώδη διαβήτη (τύπου Ι και ΙΙ), αλλά και

σε άλλες παθήσεις όπως είναι οι διαταραχές της υπόφυσης και των επινεφριδίων

(ορμονικές διαταραχές), σε παθήσεις του παγκρέατος (επειδή στο πάγκρεας

παράγεται η ινσουλίνη) αλλά και μετά ένεση αδρεναλίνης, καταπληξία, εγκαύματα κ.α.

Ελάττωση της γλυκόζης παρατηρείται όταν υπάρχει περίσσεια ινσουλίνης, ηπατική νόσος

(σε οξείες λοιμώξεις, ιογενή ηπατίτιδα, δηλητηριάσεις) κ.α.

Αρχή μεθόδου

Μέθοδος Ι: GOD/POD

Η πιο διαδεδομένη μέθοδος προσδιορισμού της γλυκόζης είναι η μέθοδος της οξειδάσης

που χρησιμοποιείται ακόμα και στις ταινίες ούρων.

Οξειδάση της γλυκόζης Γλυκόζη + Ο2 + Η2Ο Γλυκονικό οξύ + Η2Ο2

Υπεροξειδάση 2Η2Ο2 + φαινόλη + 4-αμινοαντιπυρίνη κινόνη + 4 Η2Ο

Tελικού σημείου. λ = 510 nm.

Μέθοδος ΙΙ: Εξοκινάσης

Άλλη μέθοδος είναι αυτή της εξοκινάσης

Eξοκινάση (HK) Γλυκόζη + ATP γλυκόζη-6-P + ADP Γλυκονικό οξύ + Η2Ο2

G6P-DH γλυκόζη-6-P + NAD+ γλυκονικό-6-P + NADH + Η+

Tελικού σημείου. λ = 340 nm.


20

Δείγμα

Ορός, πλάσμα, ούρα, ΕΝΥ. Ο ορός ή το πλάσμα πρέπει να διαχωρίζονται από τα ερυθρά

όσο γίνεται πιο σύντομα για εμποδιστεί η γλυκόλυση και η μείωση της τιμής της γλυκόζης.

Ο εξεταζόμενος πρέπει να είναι νηστικός τουλάχιστον 8 ώρες. Η μέτρηση της γλυκόζης

στο ΕΝΥ θα πρέπει να γίνεται αμέσως γιατί η τιμή της γλυκόζης πέφτει πολύ γρήγορα.

Τιμές αναφοράς

Ορός: 70 – 105 mg/dL

Ούρα: 0 – 0,5 g/24h

ENY: 40 – 70 mg/dL

Συντελεστής μετατροπής στο SI: x 0,0555 mmol/L

Ουρία (Urea)


Η ουρία (NH2CONH2) του αίματος αυξάνει στους φυσιολογικούς ανθρώπους αυξανομένου

του περιεχομένου της πρωτεΐνης (π.χ. κρέας) στη δίαιτα. Για τον λόγο αυτό μειώνεται κατά

την διάρκεια της εγκυμοσύνης. Επιπλέον αυξάνει όταν υπάρχει αυξημένος καταβολισμός

(δηλαδή καταστροφή) των πρωτεϊνών π.χ. στον πυρετό και στην σηψαιμία.

Ιδιαίτερα όμως επικίνδυνη είναι η αύξηση της ουρίας προκαλούμενη από προβλήματα του

νεφρού. Συγκεκριμένα η ουρία του αίματος αρχίζει να αυξάνει όταν χαθεί το ισοδύναμο

ενός νεφρού (νεφρική ανεπάρκεια). Η ουρία του αίματος αυξάνει επίσης σε αποφράξεις

του ουροποιητικού αλλά και στο έμφραγμα του μυοκαρδίου.

Μέθοδος: GIDH – GLDH (Σταθερού χρόνου)


Ουρεάση NH2CONH2 + 2Η2Ο 4NH4

+ + CO32-

Γλουταμινική δευδρογενάση 2-οξογλουταρικό οξύ + 2NH4

+ + 2NADH 2ΝΑD+ + 2Η2Ο + (GLDH) + 2-L-γλουταμινικό

Μέθοδος σταθερού χρόνου. Λαμβάνονται δύο μετρήσεις σε απόσταση 1 min. λ = 340 nm


21

Μέθοδος: o-Φαινυλοφθαλδεύδης 23ο CGLDH (σταθερού χρόνου)


Η+ NH2CONH2 + o-Φαινυλοφθαλδεύδη Ισοινδόλη Μέθοδος σταθερού χρόνου. Λαμβάνονται δύο μετρήσεις σε απόσταση 1 min. λ = 510 nm

Μέθοδος: Berthelot


Ουρεάση NH2CONH2 + 2Η2Ο 4NH4

+ + CO32-

νιτροπρωσσικό

4NH4+ + σαλυκιλικό οξύ + NaClO ινδοφαινόλη

Μέθοδος τελικού σημείου. λ = 580 nm

Δείγμα

Ορός ή πλάσμα (το μόνο αντιπηκτικό που δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί είναι το

ηπαρινισμένο αμμώνιο). O ορός ή πλάσμα συντηρούνται για 4 ημέρες στους 2 – 8ο C ή για

3 μήνες -20ο C. Η μέτρηση της ουρίας μπορεί να γίνει και σε φυγοκεντρημένα ούρα μετά

από αραίωση.


Ορός: 10 – 50 mg/dL

Oύρα 24h: 19 – 36 g/24h


Ουρικό οξύ (UA)

Μέθοδος: Uricase/POD



22

Το ουρικό οξύ προέρχεται από τον καταβολισμό των νουκλεϊνικών οξέων (DNA).

Φυσιολογικά το ουρικό οξύ αυξάνει μετά από βαριά άσκηση, νηστεία και δίαιτα πλούσιο σε

λίπος. Μειώνεται στην φυσιολογική εγκυμοσύνη.

Παθολογικά το ουρικό οξύ αυξάνει όταν υπάρχει μεγάλη καταστροφή των νουκλεινικών

οξέων (π.χ. πνευμονία) αλλά και στην λευχαιμία. Επιπλέον αυξάνει όταν υπάρχει νεφρική

νόσος, δηλαδή μειωμένη επαναρρόφηση του ουρικού οξέος από τα νεφρικά σωληνάρια,

καθώς και στην ουρική αρθρίτιδα. Αυξάνει επίσης στην στεφανιαία αρτηριακή νόσο, στην

δηλητηρίαση από μόλυβδο, στην αιμολυτική αναιμία κ.α.


Ουρικάση ουρικό οξύ + Ο2 + Η2Ο αλλαντοίνη + CO2 + H2O2 Υπεροξειδάση 2Η2Ο2 + 4-αμινοφαιναζόνη + 2,4,6 διβρωμο-3-υδροξυβενζοικό οξύ

(AP) (DCPS)

+ κινόνη + 4H2O

Tελικού σημείου. λ = 510 nm

Δείγμα

Μη αιμολυμένος ορός ή πλάσμα. Το ουρικό οξύ παραμένει σταθερό στον ορό για τρείς

ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου και για έξι μήνες στην κατάψυξη. Αν το ουρικό οξύ

μετρηθεί στα ούρα θα πρέπει να θερμανθεί στους 60ο C για 10 λεπτά για να διαλυθούν οι

κρύσταλλοι ουρικού οξέος.


Ορός:

Άνδρες: 3,8 – 7,2 mg/dL

Γυναίκες: 2,2 – 6,0 mg/dL

Ούρα 24h: 250 – 750 mg/24h



23

Κρεατινίνη (CREAT)


Η κρεατινίνη σχηματίζεται από την κρεατίνη (συστατικό των μυών) και διαχέεται ελεύθερα

δια μέσου του νερού του σώματος. Ως ουσία είναι ένα προϊόν άχρηστο, η μέτρηση της

όμως στον αίμα και στα ούρα δίνει πολύτιμες πληροφορίες για την λειτουργία του νεφρού.

Φυσιολογικά αυξάνει μετά λήψη κρεατινίνης (π.χ. ψητό κρέας).

Παθολογικά αυξάνει όταν υπάρχει υπερβολική σωματική αύξηση (π.χ. στον γιγαντισμό και

στην μεγαλακρία) αλλά και στην νεφρική ανεπάρκεια.

Για κάθε 50% ελάττωση στο ρυθμό της σπειραματικής διήθησης, η κρεατινίνη του ορού

διπλασιάζεται.

Μέθοδος Ι: Jaffé σε πικρικό


NaOH Κρεατινίνη + πικρικό οξύ ερυθρό σύμπλοκο

Κινητική μέθοδος δύο σημείων. λ = 492 nm.

Μέθοδος ΙI: Ενζυματική


A’ στάδιο

Kρεατινάση Κρεατίνη + H2O Ουρία + Σαρκοσίνη SOD Σαρκοσίνη + H2O + O2 Γλυκίνη + HCHO + H2O Kαταλάση 2H2O2 2H2O + O2

B’ στάδιο

Kρεατινάση Κρεατινίνη + H2O Ουρία + Σαρκοσίνη Kρεατινάση Κρεατίνη + H2O Ουρία + Σαρκοσίνη SOD Σαρκοσίνη + H2O + O2 Γλυκίνη + HCHO + H2O POD 2H2O2 +Trinder έγχρωμο προϊόν


24


Δείγμα

Ορός μη αιμολυμένος, πλάσμα με ηπαρίνη ή EDTA ή ούρα αραιωμένα κατά 1/100. Ο ορός

ή πλάσμα αποχωρίζεται αμέσως και συντηρείται για 5 ημέρες στη ψύξη ή για 3 μήνες στην

κατάψυξη. Ο εξεταζόμενος πρέπει να είναι νηστικός πριν την αιμοληψία τουλάχιστον 2

ώρες. Τα ούρα διατηρούνται στην κατάψυξη για 2 μήνες.


Ορός ή πλάσμα (οι τιμές αναφοράς εξαρτώνται από την επιφάνεια του σώματος):

Άνδρες: 0,80 – 1,30 mg/dL


Ούρα: 3 – 8 ετών: 110 – 680 mg/24h

9 – 12 ετών: 170 – 1410 mg/24h

13 – 178 ετών: 300 – 1800 mg/24h

Ενήλικες άνδρες: 800 – 1800 mg/24h

Ενήλικες γυναίκες: 600 – 1600 mg/24h


Tριγλυκερίδια (TG ή Trig)

Μέθοδος: GPO


Η μέση τιμή των τριγλυκεριδίων είναι υψηλότερη στους Δυτικούς βιομηχανοποιημένους

πληθυσμούς. Τα επίπεδά τους είναι φυσιολογικά αυξημένα κατά τη διάρκεια της

εγκυμοσύνης. Παθολογικά τα τριγλυκερίδια αυξάνονται: στη παχυσαρκία, στη μεγάλη

λήψη οινοπνεύματος, στη λήψη αντισυλληπτικών, στους βαρείς καπνιστές, στο

σακχαρώδη διαβήτη, στη νεφρική νόσο, στο οξύ stress, στη ηπατική νόσο, στη

δυσπρωτειναιμία, στη οικογενή υπερτριγλυκεριδαιμία κ.α. Μείωση παρατηρείται σε

νόσους όπως στη α-βηταλιποπρωτειναιμία.


25


Λιποπρωτεινική λιπάση τριγλυκερίδια γλυκερόλη + λιπαρά οξέα Κινάση της γλυκερόλης γλυκερόλη + ΑΤΡ 3-φωσφορική γλυκερόλη + ADP γλυκερολ-3-φωσφορική οξειδάση 3-φωσφορική γλυκερόλη + O2 Η2Ο2 + φωσφορική-

διυδροξυακετόνη

Υπεροξειδάση Η2Ο2 + 4-αμινοαντιπυρίνη + 4-χλωροφαινόλη κινόνη + 4 H2O


Δείγμα

O εξεταζόμενος πρέπει να είναι νηστικός για 12 ώρες πριν την αιμοληψία καθώς επίσης να

απέχει από τη λήψη αλκοολούχων ποτών για 3 ημέρες. Ορός ή πλάσμα με ηπαρίνη ή

EDTA. Το δείγμα παραμένει σταθερό στους -20o C για ένα χρόνο, για μία εβδομάδα στην

συντήρηση (-4 έως -8o C) και για δύο ημέρες στη θερμοκρασία δωματίου.


Φυσιολογικό: 0 – 150 mg/dL

Μέσος κίνδυνος: 150 – 200 mg/dL

Υψηλός κίνδυνος: 200 – 400 mg/dL


Oλική Χοληστερόλη (Chol)

Μέθοδος: CΕ/CO


Η χοληστερόλη του ορού σχετίζεται ευθέως προς τον ρυθμό σύνθεσης των

λιποπρωτεινών που μεταφέρουν τη χοληστερόλη (HDL, LDL). H χοληστερόλη βρίσκεται

σε δίαιτες με πολύ ζωικό λίπος ή δίαιτες με κεκορεσμένο φυτικό λίπος που οδηγούν σε

αύξηση της χοληστερόλης του ορού. Εκτός από την διατροφή άλλα αίτια αύξησης της


26

χοληστερόλης είναι: o αποφρακτικός ίκτερος, η ηπατίτιδα, η νεφρική νόσος, η παγκρεατική

νόσος, η νόσος του θυρεοειδούς κ.α. Φυσιολογικά αυξάνεται στην εγκυμοσύνη.

Ελάττωση της χοληστερόλης παρατηρείται στην ηπατική νόσο, στην ασιτία, στην

στεατόρροια, στην αναιμία, στην ανεπάρκεια φυλλικού, στην αιμοφιλία κ.α.


Εστεράση χοληστερόλης εστέρας χοληστερόλης + Η2Ο χοληστερόλη + λιπαρά οξέα Οξειδάση χοληστερόλης χοληστερόλη + Ο2 χοληστ-4-εν-3-όνη + Η2Ο2

Υπεροξειδάση 2Η2Ο2 + 4-αμινοαντιπυρίνη + φαινόλη κινόνη + 4Η2Ο

Mέθοδος τελικού σημείου. λ = 510 nm.

CE: Cholesterol Esterase: Ολική χοληστερόλη,

CO: Cholesterol Oxidase: Οξειδάση χοληστερόλης

Δείγμα

O εξεταζόμενος πρέπει να είναι νηστικός για 12 ώρες πριν την αιμοληψία. Επίσης πρέπει

να βρίσκεται σε σταθερό διαιτολόγιο τις 3 τελευταίες εβδομάδες πριν την αιμοληψία.

Απαγορεύεται επίσης η χρήση αλκοόλ 3 ημέρες πριν την αιμοληψία. Το δείγμα είναι ορός

ή πλάσμα (με ηπαρίνη ή EDTA) χωρίς αιμόλυση. Αποχωρίζεται εντός 2 ωρών και

συντηρείται για 7 ημέρες στους 2 – 8ο C ή για 3 μήνες στους -20ο C.


Φυσιολογικό: ≤ 200 mg/dL


Υψηλός κίνδυνος: ≥ 240 mg/dL


Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη (HDL)

Μέθοδος: CHE/CHO


27


Όσο περισσότερη αυξημένη είναι η HDL τόσο λιγότερο κινδυνεύει το άτομο από

αθηρωμάτωση. Γι’ αυτό τον λόγο ονομάζεται καλή χοληστερόλη. Παράγοντες που

επηρεάζουν την αύξηση του HDL είναι το φύλο (είναι περισσότερη στις γυναίκες), η ηλικία

(αυξάνει με την ηλικία) και την φυσική αύξηση.

Η HDL μειώνεται με την παχυσαρκία, την δίαιτα πλούσια σε ζωικά λίπη και υδατάνθρακες,

το κάπνισμα, τον σακχαρώδη διαβήτη, την νέφρωση και την κυστική ίνωση.

Μέθοδος: Άμεση HDL-Cholesterol (DHDL) με καταβύθιση


Αρχικά απομακρύνονται τα υπόλοιπα λιπίδια LDL, VLDL και χυλομικρά. Ο διαχωρισμός

μπορεί να γίνει είτε με αντισώματα που δεσμεύουν τα υπόλοιπα λιπίδια. είτε με την

προσθήκη αντιδραστηρίου του φωσφοβολφραμικού ιόντος που καταβυθίζει τα υπόλοιπα

λιπίδια.

Καταβύθιση με αντισώματα

αντισώματα LDL, VLDL, χυλομικρά σύμπλοκο αντιγόνου/αντισώματος αντι-αντιανθρώπινης β-λιποπρωτείνης To σύμπλοκο καταβυθίζεται και παίρνουμε το υπερκείμενο όπου επιπλέουν τα μικρού

μοριακού βάρους HDL. Τα μόρια HDL έχουν την αποπρωτείνη Α (ApoA) που δεν αντιδρά

με τα αντισώματα.

Καταβύθιση με φωσφοβολφραμικό οξύ (PTA)

LDL, VLDL, χυλομικρά, HDL + PTA + Mg++ Ίζημα + υπερκείμενο

To σύμπλοκο καταβυθίζεται και παίρνουμε το υπερκείμενο όπου επιπλέον τα μικρού

μοριακού βάρους HDL.

Mετά την καταβύθιση προσδιορίζεται η χοληστερόλη που υπάρχει μέσα στη ΗDL με την

γνωστή από την ολική χοληστερόλη μέθοδο (CE/CO).

Εστεράση χοληστερόλης εστέρας χοληστερόλης + Η2Ο χοληστερόλη + λιπαρά οξέα


28

Οξειδάση χοληστερόλης χοληστερόλη + Ο2 χοληστ-4-εν-3-όνη + Η2Ο2

Υπεροξειδάση 2Η2Ο2 + 4-αμινοαντιπυρίνη + φαινόλη κινόνη + 4Η2Ο

Mέθοδος τελικού σημείου. λ = 510 nm.

Μέθοδος: Άμεση HDL-Cholesterol (DHDL) με χρήση διαβρεκτών


Στο πρώτο στάδιο η χοληστερόλη που περιέχεται στις LDL, τις VLDL και στα χυλομικρά

διασπάται από το σύστημα των ενζύμων χοληστερόλο-εστεράση (CE) και χοληστερόλο-

οξειδάση (CO) και το παραγόμενο Η2Ο2 καταστρέφεται. Αντίθετα το κλάσμα των HDL

προστατεύεται από ειδικούς διαβρέκτες και δεν είναι προσβάσιμο από τα ένζυμα. Σε

δεύτερο στάδιο αποδεσμεύεται η χοληστερόλη των HDL, υφίσταται την επίδραση του

ενζυμικού συστήματος CE/CO και το παραγόμενο Η2Ο2 παρουσία υπεροξειδάσης αντιδρά

με χρωστική προς έγχρωμο προϊόν. Η αύξηση της απορρόφησης στα 600 nm είναι

ανάλογη της συγκέντρωσης της χοληστερόλης στο κλάσμα των LDL στο δείγμα.

Δείγμα

Ορός ή πλάσμα. Αν η ποσότητα των τριγλυκεριδίων είναι πάνω από 1000 mg/dL θα

πρέπει να γίνει αραίωση με φυσιολογικό ορό και επαναπροσδιορισμός.



Άνδρες

Φυσιολογικό: ≥ 65 mg/dL


Υψηλός κίνδυνος: ≤ 35 mg/dL

Γυναίκες

Φυσιολογικό: ≥ 55 mg/dL


Υψηλός κίνδυνος: ≤ 25 mg/dL


29

Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη - LDL


Η χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη ονομάζεται αλλιώς «κακή χοληστερόλη». Όσο

αυξάνεται τόσο αυξάνεται ο κίνδυνος για αθηρωμάτωση, δηλαδή για έμφραγμα. Είναι ο

σημαντικότερος δείκτης για την αθηρωμάτωση. Φυσιολογικά η LDL αυξάνεται με την

ηλικία. Παθολογικά η LDL αυξάνει στον υποθυρεοειδισμό, στην νέφρωση, στην

χολόσταση, στην ηπατική νόσο, στην οικογενή υπερχοληστερολαιμία κ.α. Η LDL μειώνεται

στην υπερτιγλυκεριδαιμία, αβηταλιποπρω-τειναιμία, υποβηταλιποπρωτειναιμία κ.α.

Μέθοδος: Friedewald


Ο προσδιορισμός της LDL – χοληστερόλης έγινε συνήθως υπολογιστικά με βάση τον τύπο

του Friedewald:

LDL χοληστερόλη = Ολική χοληστερόλη – (HDL χοληστερόλη) –(VLDL χοληστερόλη)

Επειδή όμως VLDL = Τριγλυκερίδια/5 ισχύει:

LDL χοληστερόλη = Ολική χοληστερόλη – (HDL χοληστερόλη) – Τριγλυκερίδια / 5

Οι υπολογισμοί της LDL-χοληστερόλης έγιναν λαμβάνοντας υπ' όψη ότι: α) η εφαρμογή

του τύπου προϋποθέτει σταθερή σχέση τριγλυκεριδίων και VLDL – χοληστερόλης και β)

όσο αυξάνει η συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων τόσο η εξίσωση χάνει την ισχύ της, ενώ η

εξίσωση παύει να ισχύει όταν η συγκέντρωση των τριγλυκεριδίων είναι μεγαλύτερη των

400 mg/dL.

Μέθοδος: LDL - Direct με διαβρέκτες


O άμεσος προσδιορισμός των LDL ακολουθεί δύο στάδια.

Στο πρώτο στάδιο η χοληστερόλη που περιέχεται στις HDL, τις VLDL και στα χυλομικρά

διασπάται από το σύστημα των ενζύμων χοληστερόλο-εστεράση (CE) και χοληστερόλο-

οξειδάση (CO) και το παραγόμενο Η2Ο2 καταστρέφεται. Αντίθετα το κλάσμα των LDL

προστατεύεται από ειδικούς διαβρέκτες και δεν είναι προσβάσιμο από τα ένζυμα.

Σε δεύτερο στάδιο αποδεσμεύεται η χοληστερόλη των LDL, υφίσταται την επίδραση του

ενζυμικού συστήματος CE/CO και το παραγόμενο Η2Ο2 παρουσία υπεροξειδάσης αντιδρά


30

με χρωστική προς έγχρωμο προϊόν. Η αύξηση της απορρόφησης στα 600 nm είναι

ανάλογη της συγκέντρωσης της χοληστερόλης στο κλάσμα των LDL στο δείγμα.

Εστεράση χοληστερόλης Eστέρας χοληστερόλης + H2O Χοληστερόλη + λιπαρά

οξέα + H2O2

Χοληστερόλο-οξειδάση

Χοληστερόλη + Ο2 Προϊόν + H2O2

Υπεροξειδάση 2Η2Ο2 + αμινοφαιναζόνη + φαινολικό παράγωγο κινόνη + 4Η2Ο


Δείγμα

O εξεταζόμενος πρέπει να είναι νηστικός για 12 ώρες πριν την αιμοληψία. Επίσης πρέπει

να βρίσκεται σε σταθερό διαιτολόγιο τις 3 τελευταίες εβδομάδες πριν την αιμοληψία.

Απαγορεύεται επίσης η χρήση αλκοόλ 3 ημέρες πριν την αιμοληψία. Το δείγμα είναι ορός

ή πλάσμα (με ηπαρίνη ή EDTA) χωρίς αιμοληψία. Αποχωρίζεται εντός 2 ωρών και

συντηρείται για 7 ημέρες στους 2 – 8ο C ή για 3 μήνες στους -20ο C. Ορός, ηπαρινισμένο

πλάσμα. Δεν πρέπει να χρησιμοποιείται πλάσμα με EDTA και οξαλικό ή κιτρικό νάτριο.


Ιδανική τιμή: < 100 mg/dL

Σχεδόν φυσιολογικός: 100 – 130 mg/dL


Υψηλός κίνδυνος: > 160 mg/dL

Δείκτης αθηρωμάτωσης

Αρχή μεθόδου: Υπολογιστική μέθοδος

Ο δείκτης αθηρωμάτωσης υπολογίζεται με δύο διαφορετικές εξισώσεις:

1oς τύπος: Chol/HDL

Οι τιμές αναφοράς του είναι:

Φυσιολογικό: ≤ 3,3


31

Χαμηλός κίνδυνος: 3,4 – 4,4

Μέσος κίνδυνος: 4,5 – 7,1

Υψηλός κίνδυνος: ≥ 7,2

2oς τύπος: LDL/HDL

Οι τιμές αναφοράς της είναι:

Φυσιολογικό: 0,5 – 3,0

Μέσος κίνδυνος: 3,1 – 6,0

Υψηλός κίνδυνος: ≥ 6,0


Ολική χολερυθρίνη (TBILI)


Στον ορό κυκλοφορεί η άμεση ή συνδεδεμένη χολερυθρίνη και η έμμεση ή μη συνδεδεμένη

χολερυθρίνη. Η συνδεδεμένη χολερυθρίνη πήρε το όνομα της από την σύνδεσή της με το

γλυκουρονικό οξύ στο ήπαρ. Στην πράξη στα βιοχημικά εργαστήρια προσδιορίζονται η

ολική και η άμεση χολερυθρίνη οπότε η έμμεση προκύπτει από την διαφορά τους.


Χρησιμοποιούνται ευρέως δύο μέθοδοι για τον προσδιορισμό της χολερυθρίνης.

Μέθοδος Ι: DPD σε αλκαλικό περιβάλλον

Η αλβουμίνη δεσμεύει την έμμεση χολερυθρίνη. Το σύμπλοκο αυτό μαζί με την διαλυτή

άμεση χολερυθρίνη σχηματίζει ένα σύμπλοκο μπλε χρώματος με το 3,5 διχλωροφαινολ-

διαζωτωμένο-τετραφθοροβοραικό οξύ (DPD).

καφείνη

ολική χολερυθρίνη + DPD αζωχολερυθρίνη



32

Μέθοδος ΙΙ: DMSO σε αλκαλικό περιβάλλον

H δεσμευμένη με την αλβουμίνη χολερυθρίνη δηλαδή ή έμμεση χολερυθρίνη

αποδεσμεύεται με τη χρήση διαβρέκτη (διμευθυλσουλφοξίδιο – DMSO). Οπότε άμεση και

έμμεση χολερυθρίνη δίνουν μαζί ως ολική χολερυθρίνη την αντίδραση Diaso.

H+

DBILI + διαζωτωμένο σουλφανιλικό οξύ αζωχολερυθρίνη


Δείγμα

Ο εξεταζόμενος πριν την αιμοληψία πρέπει να είναι νηστικός για τουλάχιστον 2 ώρες.

Μπορεί να χρησιμοποιηθεί ορός ή πλάσμα με ηπαρίνη και EDTA. Το δείγμα πρέπει να

διατηρείται μακριά από το άμεσο φως. Σε θερμοκρασία δωματίου διατηρείται μόνο 12

ώρες, στην ψύξη διατηρείται δύο ημέρες και στην κατάψυξη για 1 μήνα. H τιμή της

χολερυθρίνης αυξάνει μετά την λήψη τροφής και την φυσική άσκηση.


Νεογέννητα: 0,5 – 12,6 mg/dL

Ενήλικες: 0,1 – 1,2 mg/dL

Συντελεστής μετατροπής στο SI: x 17,1 μmol/L

Άμεση χολερυθρίνη (DBILI)

Μέθοδος: Diazo


Η άμεση ή συνδεδεμένη χολερυθρίνη κυκλοφορεί στο αίμα όταν το επίπεδο της στη ήπαρ

ξεπεράσει κάποιο συγκεκριμένο όριο. Η άμεση χολερυθρίνη αυξάνει στις διάφορες

ηπατίτιδες, στη λήψη διαφόρων φαρμάκων, σε μεταβολικές διαταραχές, σε κίρρωση, σε

καρκίνο του ήπατος, σε χολόσταση κ.α. Η έμμεση χολερυθρίνη αυξάνει στην αιμόλυση,

στον νεογνικό ίκτερο, στην ηπατίτιδα κ.α.


33


H+

DBILI + διαζωτωμένο σουλφανιλικό οξύ αζωχολερυθρίνη


Δείγμα

Ο εξεταζόμενος πριν την αιμοληψία πρέπει να είναι νηστικός για τουλάχιστον 2 ώρες. Το

δείγμα μπορεί να είναι ορός ή πλάσμα με ηπαρίνη και EDTA και διατηρείται μακριά από

το άμεσο φως. Σε θερμοκρασία δωματίου διατηρείται μόνο 12 ώρες, στην ψύξη

διατηρείται δύο ημέρες και στην κατάψυξη για 1 μήνα. H τιμή της χολερυθρίνης αυξάνει

μετά την λήψη τροφής και την φυσική άσκηση.


0 – 0,4 mg/dL


Έμμεση χολερυθρίνη (IBILI)

Υπολογιστική μέθοδος

IBILI = TBILI – DBILI

Ολική πρωτεΐνη (TP)

Μέθοδος: Biuret


Στον ορό υπάρχουν πολλές πρωτεΐνες οι οποίες διακρίνονται σε δύο μεγάλες κατηγορίες

την λευκωματίνη και τις σφαιρίνες. Στους ενήλικες η έντονη άσκηση προκαλεί μια

προσωρινή αύξηση στη συγκέντρωση της πρωτεΐνης του ορού. Παθολογικά αύξηση της

πρωτεΐνης στον ορό παρατηρείται στην αφυδάτωση καθώς και σε καταστάσεις που

αυξάνουν οι σφαιρίνες (οι σφαιρίνες αυξάνουν σε ανοσολογικές διαταραχές) π.χ. στις

λοιμώξεις, σε αυτοάνοσα νοσήματα, στην σαρκοείδωση, στην κίρρωση του ήπατος και

στην παραπρωτειναιμία.


34


ΟΗ- Πολυπεπτίδιο (πρωτεΐνη) + θειικός χαλκός μωβ σύμπλοκο


Δείγμα

Ορός ή πλάσμα (με EDTA) χωρίς αιμόλυση. Συντηρείται στη ψύξη (2 – 8ο C) για 20 ημέρες

ή για 6 μήνες στους -20ο C. Προσοχή η παρατεταμένη στάση πριν την αιμοληψία προκαλεί

την αύξηση της συγκέντρωσης της πρωτεΐνης στον ορό.

H μέτρηση της πρωτεΐνης μπορεί να γίνει και ούρα 24ώρου. Το δείγμα των ούρων πριν

την ανάλυση φυγοκεντρείται.


Περιπατητικός ασθενής: 6,2 – 8,5 g/dL

Κατακεκλεισμένος ασθενής: 6,0 – 8,0 g/dL


Αλβουμίνη (ALB)

Μέθοδος: BCG


H αλβουμίνη είναι η πιο διαδεδομένη πρωτεΐνη που απαντάται στον ορό. Ελαττώνεται

όταν δεν προσλαμβάνεται επαρκής πρωτεΐνη με την τροφή (για ιατρικούς ή διαιτητικούς

λόγους), όταν υπάρχει απώλεια πρωτεΐνης (σε αιμορραγία, νεφρική βλάβη κ.α.), όταν

υπάρχει αυξημένος καταβολισμός (π.χ. σε λοιμώξεις, τραυματισμούς) καθώς και σε

διάφορες παθήσεις (κίρρωση, μυέλωμα κ.α.).


αλβουμίνη + πράσινο της βρωμοκρεζόλης σύμπλοκο αλβουμίνης – πράσινο

βρωμοκρεζόλης



35

Με την επίδραση της αλβουμίνης η χρωστική «πράσινο της βρωμοκρεζόλης» αλλάζει

χρώμα από κίτρινο σε πράσινο. Η ένταση του πράσινου χρώματος είναι ανάλογη με την

συγκέντρωση της αλβουμίνης.

Δείγμα

Ορός ή πλάσμα με ηπαρίνη. Η αλβουμίνη είναι σταθερή στον ορό ή πλάσμα για ένα μήνα

σε συνθήκες ψύξης (2 – 8ο C) και για ένα μήνα στους -20ο C.


3,5 – 5,0 g/dL

Συντελεστής μετατροπής στο SI: x 1 mmol/L

Σφαιρίνες (GLOB)

Υπολογιστική μέθοδος

GLOB = TP – ALB


36

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΝΖΥΜΩΝ

γ-γλουταμινική τρανσφεράση (γ-GT)

Μέθοδος: Szasz


Το ένζυμο γ-GT παράγεται σε πολλά όργανα (νεφροί, πάγκρεας, ήπαρ, σπλήνα κ.α.) αυτό

όμως που κυκλοφορεί στο αίμα προέρχεται από το ήπαρ και την χολή.

Έτσι η ενεργότητα της γ-GT αυξάνεται σε αποφρακτικό ίκτερο, ενδοηπατική χολόσταση,

κίρρωση, ηπατίτιδα, λοιμώδη μονοπυρήνωση, υπερθυρεοειδισμό, παγκρεατίτιδα, ηπατική

νόσο λόγω αλκοολισμού. Μείωση παρατηρείται σε υποθυρεοειδισμό ενώ αύξηση

παρατηρείται και στον αλκοολισμό.

H γ-GT είναι χρήσιμος δείκτης παγκρεατικού ή ηπατικού καρκίνου γιατί τα επίπεδά της

αντανακλούν την έκταση του καρκίνου και την απάντηση του οργανισμού στη θεραπεία.


Η παρουσία του ενζύμου καταλύει την μεταφορά της ομάδας L-γ-Γλουταμύλο από το μόριο

του L-γ-Γλουταμύλο 3-καρβόξυ 4-νιτρανιλίδιο (GLUPA-C) στο μόριο της γλυκυλογλυκίνης.

Η αύξηση της απορρόφησης στα 405 nm οφείλεται στo παραγόμενο 5-άμινο-2-

νίτροβενζοϊκο οξύ και είναι ανάλογη της δραστικότητας της γ-GT στο δείγμα.

γ-GT L-γ-γλουταμυλο-3-καρβοξυ-4-νιτροανιλίδη + γλυκυλογλυκίνη ===== L-γ-γλουταμυλο-γλυκυλογλυκίνη + 5-αμινο-2-νιτροβενζοϊκό οξύ

Κινητική μέθοδος: Factor = 1158, λ = 405 nm.

Δείγμα

Ορός μη αιμολυμένος. Εναλλακτικά, μπορεί να χρησιμοποιηθεί πλάσμα με EDTA. Tα

φθοριούχα, οξαλικά και κιτρικά άλατα πρέπει να αποφεύγονται γιατί μειώνουν την

δραστικότητα της γ-GT. Το δείγμα διατηρείται επί μία εβδομάδα στους 2 έως 8o C και επί 5

ημέρες στη θερμοκρασία δωματίου.


37


Ορός, πλάσμα Άνδρες: 10 – 49 U/L

Γυναίκες: 7 – 32 U/L

Γαλακτική αφυδρογονάση (LDH)

Μέθοδοι L -> P, P -> L


Η LDH είναι ένα μόριο τετραμερές, δηλαδή αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές

αλυσίδες. Συγκεκριμένα αποτελείται από τις αλυσίδες Η που υπερτερούν στην καρδιακή

μορφή και τις αλυσίδες Μ που υπερτερούν στη σκελετική μυϊκή μορφή. Έτσι υπάρχουν

πέντε πιθανή τετραμερή (ισοένζυμα) τα: Η4 (LDH1), Η3Μ (LDH2), Η2Μ2 (LDH3), ΗΜ3 (LDH4),

Μ4 (LDH5). Τα κλάσματα του LDH απαντούν στην καρδιά, στα ερυθρά, στους νεφρούς και

μέτρια στα περισσότερα όργανα. Το ολικό LDH αυξάνει στο έμφραγμα του μυοκαρδίου,

στην οξεία ηπατίτιδα, σε μυϊκή βλάβη (π.χ. εγχείρηση), σε λευχαιμία, πνευμονία κ.α. H

διάκριση των κλασμάτων της LDH γίνεται με ηλεκτροφόρηση.


Χρησιμοποιούνται δύο διαφορετικές μέθοδοι για τον προσδιορισμό της ολικής LDH οι

οποίες έχουν και διαφορετικές τιμές αναφοράς. Οι μέθοδοι L-> P και P-> L.

Μέθοδος Ι. L-> P (DGKC 25ο C)

LDH L-γαλακτικό + NAD+ πυροσταφυλικό + NADH + H 25ο C


Μέθοδος ΙΙ. P-> L (SFBC 37o C)

LDH πυροσταφυλικό + NADH + Η L-γαλακτικό + NAD+ 37o C



38

Δείγμα

Μη αιμολυμένος ορός ή πλάσμα από ηπαρίνη ή EDTA. To δείγμα διατηρείται στη ψύξη επί

3 ημέρες και στην κατάψυξη (- 20ο C) για 6 μήνες.


25o C (L -> P): 120 – 240 U/L

37o C (P -> L): 225- 450 U/L

Αλκαλική φωσφατάση (ALP)

Μέθοδος: p-νιτροφαινόλη


Η αλκαλική φωσφατάση (ALP) είναι ένα ένζυμο το οποίο κυκλοφορεί στο αίμα με την

μορφή τριών ισοενζύμων7: το οστικό, το εντερικό και το ηπατικό. Τα ονόματα τους

οφείλονται στο όργανο από το οποίο παράγονται. Το οστικό (80%) και το εντερικό κλάσμα

(20%) υπάρχουν φυσιολογικά σε όλους τους ανθρώπους σε αντίθεση με το ηπατικό που

μετράται κυρίως σε παθολογικές καταστάσεις. Φυσιολογικά το οστικό κλάσμα είναι πολύ

αυξημένο στα παιδιά λόγω της ταχείας ανάπτυξης των οστών τους.

Παθολογικά το οστικό κλάσμα αυξάνει σε οστικές παθήσεις και στον

υπερπαραθυρεοειδισμό, το εντερικό κλάσμα στην κίρρωση του ήπατος και το ηπατικό

κλάσμα σε παθολογικές καταστάσεις του ήπατος και της χολής (π.χ. λοιμώδη

μονοπυρήνωση, εξωηπατική απόφραξη των χοληφόρων). Η διάκριση των κλασμάτων της

ALP γίνεται με ηλεκτροφόρηση.


H ολική αλκαλική φωσφατάση προσδιορίζεται δύο διαφορετικές χημικές μεθόδους που

διαφέρουν ως προς την θερμοκρασία επώασης.

7 Τα ισοένζυμα είναι ένζυμα τα οποία ενώ καταλύουν την ίδια χημική αντίδραση έχουν διαφορετική χημική

δομή.


39

Μέθοδος Ι: 37o C (DGKC)

ALP p-νιτροφαινυλοφωσφατάση + H2O p-νιτροφαινόλη + HPO4

2-

Zn2+ Mg2+

Κινητική μέθοδος: Factor = 2759, λ = 405 nm

Μέθοδος Ι: 25o C (DGKC)

ALP p-νιτροφαινόλη + HPO4

2- p-νιτροφαινυλοφωσφατάση + H2O

Zn2+ Mg2+


Δείγμα

To δείγμα είναι ορός χωρίς αιμόλυση. Το δείγμα διατηρείται στους 2-8o C για 5 ημέρες ή

για 4 μήνες στους -20ο C. O εξεταζόμενος πρέπει να είναι νηστικός πριν την αιμοληψία.

Tιμές αναφοράς

Οι τιμές αναφοράς της ALP εξαρτώνται από το φύλο, την μέθοδο αλλά και από την ηλικία.

Ασπαρτική αμινοτρανσφεράση (AST) ή

Οξαλοξική αμινοτρανσφεράση (GOT)

Μέθοδος: IFCC χωρίς 5 φωσφορική πυριδοξάλη (P-5-P)


Η GOT αυξάνει δραματικά στο έμφραγμα του μυοκαρδίου όπου τα επίπεδα της GOT

αυξάνουν τέσσερις ώρες μετά και παραμένουν σε αυξημένο επίπεδο για τρεις ημέρες.

Μέθοδος 25ο C 37o C

Γυναίκες: 40 – 190 U/l 64 – 306 U/l

Άνδρες: 50 – 190 U/l 80 – 306 U/l

Παιδιά κάτω των 15 ετών: > 400 U/l > 644 U/l

Παιδιά 15 – 17 ετών: > 300 U/l > 483 U/l


40

Επιπλέον αυξάνει στην οξεία ρευματική καρδίτιδα, στην εγχείρηση καρδιάς, σε

προβλήματα του ήπατος (ηπατίτιδα, καρκίνος κ.α.), στη μεγάλη κατανάλωση

οινοπνεύματος, στη λοιμώδη μονοπυρήνωση, σε δηλητηρίαση με σαλικυλικά, στην οξεία

παγκρεατίτιδα κ.α.


Η παρουσία του ενζύμου καταλύει την μεταφορά μιας αμινομάδας από το μόριο του L-

ασπαρτικού στο μόριο του α-κετογλουταρικου οξέος. Το παραγόμενο οξαλοξικό οξύ

παρουσία του ενζύμου μηλική αφυδρογονάση (MDH) ανάγεται προς L-μηλικό οξύ με

ταυτόχρονη οξείδωση του συνενζύμου NADH σε NAD+. Η ελάττωση της απορρόφησης

στα 340 nm είναι ανάλογη της δραστικότητας της GOT στο δείγμα.

AST α-κετογλουταρικό + L-ασπαρτικό === L-γλουταμικό + οξαλοξικό MDH οξαλοξικό + NADH + H+ ===== L-μηλικό + NAD+


Δείγμα

Μη αιμολυμένος ορός ή πλάσμα (με ηπαρίνη, οξαλικό ή κιτρικό). Ο ορός ή πλάσμα πρέπει

να διαχωρίζονται γρήγορα από τα ερυθρά γιατί οι τιμές του GOT αυξάνουν. To δείγμα

διατηρείται για 7 ημέρες στους 2 – 8ο C. Ο εξεταζόμενος πρέπει να είναι νηστικός

τουλάχιστον 2 ώρες πριν την αιμοληψία.


Οι τιμές αναφοράς εξαρτώνται από την φύλο την μέθοδο και την θερμοκρασία επώασης.

Άνδρες: 0 – 35 U/L (στους 37o C)

0 – 24 U/L (στους 30o C)

0 – 18 U/L (στους 25o C)

Γυναίκες: 0 – 29 U/L (στους 37o C)

0 – 20 U/L (στους 30o C)

0 – 15 U/L (στους 25o C)


41

Aμινοτρανσφεράση της αλανίνης (ALT) ή

Πυροσταφυλική τρανσαμινάση (GPT)

Μέθοδος: IFCC χωρίς 5 φωσφορική πυριδοξάλη (P-5-P)


Η GPT αυξάνει στην κυρίως στην οξεία ηπατίτιδα, αλλά και στην κίρρωση του ήπατος,

στο έμφραγμα του μυοκαρδίου, στη λοιμώδη μονοπυρήνωση, μετά την λήψη φαρμάκων

(κυρίως σαλικυλικά) κ.α.


Η παρουσία του ενζύμου καταλύει την μεταφορά μιας αμινομάδας από το μόριο της L-

αλανίνης στο μόριο του α-κετογλουταρικού οξέος. Το παραγόμενο πυροσταφυλικό οξύ

παρουσία του ενζύμου γαλακτική αφυδρογονάση (LDH) ανάγεται προς L-γαλακτικό οξύ με

ταυτόχρονη οξείδωση του συνενζύμου NADH σε NAD+. Η ελάττωση της απορρόφησης

στα 340 nm είναι ανάλογη της δραστικότητας της GPT στο δείγμα.

ALT α-κετογλουταρικό + L-αλανίνη === L-γλουταμικό + πυροσταφυλικό LDH πυροσταφυλικό + NADH + H+ === L-γαλακτικό + NAD+

Κινητική μέθοδος: Factor = 1746 (37o C) ή 952 (25o C), λ = 340 nm.

Δείγμα

Μη αιμολυμένος και μη λιπαιμικός ορός, πλάσμα με ηπαρίνη ή EDTA. Η αιμόλυση

αυξάνει την τιμή του GPT και γι’ αυτό θα πρέπει να αποφεύγεται. To δείγμα διατηρείται

για 7 ημέρες στους 2 – 8ο C. Ο εξεταζόμενος πρέπει να είναι νηστικός τουλάχιστον 2 ώρες

πριν την αιμοληψία.


Οι τιμές αναφοράς εξαρτώνται από την φύλο την μέθοδο και την θερμοκρασία επώασης.

Άνδρες: 0 – 43 U/lt (στους 37o C)

0 – 30 U/lt (στους 30o C)


Γυναίκες: 0 – 28 U/lt (στους 37o C)


42



Αμυλάση ή Διάσταση Ορού (AMΥ)

Μέθοδος: CNP-Maltotrioside


Η αμυλάση αυξάνει κυρίως στην οξεία παγκρεατίτιδα. Επιπλέον αυξάνει στη

χολοκυστίτιδα, στο διαβητικό κώμα, σε νόσους των σιελογόνων αδένων κ.α.


α-αμυλάση 5CNP-G3 3CNP + 2CNPG2 + 2Μαλτοτριοσίδη + 2Γλυκόζη

Κινητική μέθοδος: Factor = 3954 για ορό και 7908 για ούρα, λ = 405 nm

Δείγμα

Ορός ή πλάσμα με ηπαρίνη ή EDTA χωρίς αιμόλυση ή λιπαιμικότητα. Συντηρείται για 2

ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου, για 7 ημέρες στη ψύξη (2 – 8ο C) ή για 6 μήνες στους -

20ο C.

H αμυλάση μπορεί να μετρηθεί σε πρωινά ούρα ή ούρα τυχαίας συλλογής. Τα ούρα

μπορούν να συντηρηθούν για 2 ημέρες σε θερμοκρασία δωματίου, για 7 ημέρες σε ψύξη

και για ένα μήνα σε κατάψυξη (- 20ο C).


Ορός ή πλάσμα: 0 – 110 U/L

Τυχαίο δείγμα ούρων: 0 – 400 U/L

Κινάση της κρεατίνης (CK)

Μέθοδος: UV 37o C (DGKC) (N-ακετυλο-κυστείνης - NAC)


43


Το ένζυμο κινάση της κρεατίνης βρίσκεται στον καρδιακό μυ (ισοένζυμο CK-MB), στους

σκελετικούς μύες (ισοένζυμο CK-MM) και στον εγκεφαλικό ιστό (ισοένζυμο CK-BB). H

αύξηση του ενζύμου στο αίμα μπορεί να οφείλεται σε ένα από τα τρία αυτά ισοένζυμα.

Ιδιαίτερα σημαντικό είναι το ένζυμο CK-MB το οποίο αυξάνει 3 ώρες μετά το έμφραγμα

του μυοκαρδίου φτάνοντας μέχρι 25 φορές ψηλότερα από το φυσιολογικό. Το CK-MB

αυξάνει όμως και μετά από έντονη άσκηση και γι’αυτό θα πρέπει από το ιστορικό να

ξεχωρίζουν αυτές οι δύο καταστάσεις.

Το CK-MM αυξάνει σε μυϊκές παθήσεις, στον τυφοειδή πυρετό ακόμα και στον παραμικρό

τρύπημα των μυών (π.χ. σε ενέσεις).

Το CK-BB αυξάνει σε παθήσεις του εγκεφάλου όπως είναι το εγκεφαλικό επεισόδιο,

σχιζοφρένεια αλλά και σε κρανιακά χτυπήματα (π.χ. στην πυγμαχία).

Από τα τρία συνένζυμα το CK-MM καταλαμβάνει το 96 – 100% του ολικού CK, το CK-MB

το 0 – 4% του ολικού CK ενώ το CK-BB έχει μηδενικό ποσοστό.


H παρουσία του ενζύμου CK καταλύει την απόσπαση μιας φωσφορικής ομάδας από το

μόριο της φωσφορικής κρεατίνης και το σχηματιζόμενο ATP με την βοήθεια του ενζύμου

εξοκινάση (ΗΚ) οδηγεί σε φωσφορυλίωση της γλυκόζης. Η παραγόμενη 6-φωσφορική

γλυκόζη παρουσία του ενζύμου αφυδρογονάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης (G6P-DH)

οξειδώνεται προς 6-φωσφορικό γλυκονικό οξύ με ταυτόχρονη αναγωγή του συνενζύμου

NADP+ σε NADPH. Η αύξηση της απορρόφησης στα 340 nm είναι ανάλογη της

δραστικότητας της CK στο δείγμα.

CK φωσφορική κρεατίνη + ADP === κρεατίνη + ATP HK γλυκόζη + ATP === 6-P-γλυκόζη + ADP G6P-DH 6-P-γλυκόζη + NADP+ ====== 6-P-γλυκονικό + NADPH + H+


Δείγμα

Ορός μη αιμολυμένος, πλάσμα με ηπαρίνη και EDTA. Το δείγμα διατηρείται επί μία

εβδομάδα στους 2 έως 8o C και επί μία ημέρα στη θερμοκρασία δωματίου.


44


Παιδιά: 72 – 367 U/L

Ενήλικες άνδρες: 24 – 195 U/L

Ενήλικες γυναίκες: 22 – 170 U/L

Ισοένζυμο της κινάσης της κρεατίνης MB (CK-MB)

Μέθοδος: UV 37o C (DGKC) Ανοσοδέσμευση - Κινητική UV – NAC


Όταν η τιμή του CΚ είναι αυξημένη, δηλαδή αρκετά υψηλότερη από την ανώτερη τιμή

αναφοράς τότε συνίσταται ο προσδιορισμός του ισοενζύμου CK-MB. Ο λόγος είναι ότι

πρέπει να αποκλειστεί ένα πιθανό έμφραγμα που ενδεχομένως έχει προηγηθεί. Σε αυτή

την περίπτωση η αύξηση του ολικού CK οφείλεται πιθανότατα στο μυϊκό κλάσμα (το CK

αυξάνει μετά από έντονη μυϊκή άσκηση λόγω δραματικής αύξησης του κλάσματος CK-

MM).


Η ανθρώπινη CK-MB αποτελείται από δύο υπομονάδες, CK-M και CK-B,οι οποίες

διαθέτουν αμφότερες ενεργό κέντρο. Με τη βοήθεια ειδικών αντισωμάτων έναντι της CK-

M, η καταλυτική δραστικότητα των υπομονάδων CK-M στο δείγμα αναστέλλεται κατά

99,6% χωρίς να επηρεάζονται οι υπομονάδες CK-B. Η δραστικότητα της υπόλοιπης CK-B,

η οποία αντιστοιχεί στο ήμισυ της δραστικότητας της CK-MB, προσδιορίζεται με τη μέθοδο

CK-NAC με πολλαπλασιασμό του αποτελέσματος επί 2.

Δείγμα

Ορός μη αιμολυμένος, πλάσμα με ηπαρίνη και EDTA. Το δείγμα διατηρείται επί μία

εβδομάδα στους 2 έως 8o C, για 3 μήνες στους -20ο C και επί μία ημέρα στη θερμοκρασία

δωματίου.


0 – 24 U/L

Αξιολογείται κλινικά η σχέση του CK-MB ως προς το ολικό CK ως εξής:


45

CK-MB% = (CK-MB / CK) x 100

Τότε οι τιμές αναφοράς είναι: < 6,0 % φυσιολογικό

6,0 – 20% πιθανό έμφραγμα

> 20% συνιστάται έλεγχος με ηλεκτροφόρηση


46

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΙΟΝΤΩΝ ΚΑΙ ΗΛΕΚΤΡΟΛΥΤΩΝ

Μαγνήσιο (Mg)

Μέθοδος: Calmagite ή Xylidyblue


Η αύξηση του μαγνησίου προκαλεί την καταστολή του κεντρικού νευρικού

συστήματος και της καρδιάς. Καθώς τα επίπεδα του μαγνησίου αυξάνουν εμφανίζεται

διαδοχικά υπνηλία και απώλεια των αντανακλαστικών.

Παθολογικά αύξηση του μαγνησίου παρατηρείται στη νεφρική ανεπάρκεια, στην

ηπατική νόσο κ.α.

Ελάττωση του μαγνησίου παρατηρείται στη στέρηση μαγνησίου (π.χ. σε σοβαρά

εγκαύματα), νεφρική νόσο, αλκοολισμό, εντερική δυσαπορρόφηση, έμφραγμα καθώς και

σε νεογνά με έλλειψη μαγνησίου.


Μέθοδος Ι: Calmagite

ΟΗ- Καλμαγίτης + Mg++ Mg++ - Καλμαγίτης

Μέθοδος ΙΙ: Xylidyblue

OH - Xylidyblue + Mg++ Mg++ - Xylidyblue GEDTA

Μέθοδος τελικού σημείου, λ = 545 nm.

Δείγμα

Ορός μη αιμολυμένος, πλάσμα με ηπαρίνη, εγκεφαλονωτιαίο υγρό και ούρα. Πρέπει να

αποφεύγεται κατά την αιμοληψία η στάση αίματος. Ο αποχωρισμός από τα ερυθρά πρέπει

να γίνεται εντός 2 ωρών. Ο ορός και το πλάσμα διατηρούνται για 2 ημέρες σε θερμοκρασία

δωματίου, για 7 ημέρες στους 2 – 8ο C ή για 6 μήνες στους -20ο C. Τα ούρα οξινίζονται και

αραιώνονται 1/3 με αποσταγμένο νερό.


47


Ορός: Άνδρες: 1,7 – 2,2 mg/dL


ΕΝΥ: 2,4 – 3,2 mg/dL

Ούρα: 75 – 125 mg/24h


Ασβέστιο (Ca)

Μέθοδος: o-cresolphthalein ή Arsenazo III


Φυσιολογικά το επίπεδο του ασβεστίου στον ορό είναι μεγαλύτερο το καλοκαίρι παρά το

χειμώνα. Παθολογικά αυξάνεται σε παθήσεις των οστών. Τέτοιες μπορεί να είναι ο

καρκίνος στα οστά, ο υπερπαραθυρεοειδισμός, η υπερβιταμίνωση με βιταμίνες Α και D,

στην οικογενή υποασβεστιουρική υπερασβεστιαμία (κληρονομική νόσος) κ.α.

Ελάττωση του ασβεστίου παρατηρείται στον υποπαραθυρεοειδισμό, στην ανεπάρκεια της

βιταμίνης D, στην οξεία παγκρεατίτιδα κ.α.

Το ασβέστιο προσδιορίζεται όμως και πολύ συχνά στα ούρα κυρίως για τον έλεγχο της

οστεοπόρωσης.


Μέθοδος Ι: o-κρεζοφθαλείνης

ΟΗ- Ασβέστιο + ο – σύμπλοκο κρεζοφθαλείνης ροζ σύμπλοκο

Μέθοδος ΙΙ: Arsenazo III

Τα ιόντα ασβεστίου αντιδρούν με τη χρωστική Arsenazo III σε όξινο περιβάλλον, προς

έγχρωμο πορφυρό σύμπλοκο.


Δείγμα

Ορός χωρίς αιμόλυση ή λιπαιμικότητα. Το δείγμα συντηρείται στη ψύξη (2 – 8ο C) για μία

εβδομάδα ή για τρεις μήνες σε ψύξη -20ο C.


48

H αιμοληψία πρέπει να γίνεται το πρωί, λόγω των ημερήσιων διακυμάνσεων, σε

εξεταζόμενο νηστικό τουλάχιστον 8 ώρες. Στα παιδιά η αιμοληψία πρέπει να γίνεται από τη

πτέρνα και όχι από το δάκτυλο. Κατά την αιμοληψία στους ενήλικες δεν επιτρέπεται η

περίδεση (η απόφραξη της ροής του αίματος για περισσότερο χρόνο από ένα λεπτό δίνει

ψευδή αποτελέσματα).

Προσοχή δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί πλάσμα. Επιπλέον επειδή το νερό περιέχει

ασβέστιο όλα τα σκεύη που χρησιμοποιούνται θα πρέπει να είναι επιμελώς πλυμένα

(προτιμώνται τα πλαστικά μιας χρήσεως).


Ορός: Παιδιά: 10 ημερών – 2 ετών: 9,0 – 10,4 mg/dL

2 – 12 ετών: 8,8 – 10,8 mg/dL

Ενήλικες: 8,4 – 10,4 mg/dL

Ούρα (προηγείται οξίνιση με HCl): Δίαιτα χωρίς Ca: 5 – 40 mg/24h

Χαμηλή δίαιτα Ca: 50 – 150 mg/24h

Συνήθης δίαιτα Ca: 100 – 300 mg/24h

Συνιστάται η μέτρηση του ασβεστίου να συνοδεύεται με μέτρηση της αλβουμίνης ώστε να

γίνεται διόρθωση του ασβεστίου με τον τύπο:

Διορθωμένο Ca = Ca ορού (mg/dL) – Αλβουμίνη (g/dL) + 4,0


Φώσφορος (Ph)

Μέθοδος: Modybdate UV


O φώσφορος στον ορό αυξάνει στη περίσσεια βιταμίνης D, στα θεραπευόμενα

κατάγματα, στη νεφρική ανεπάρκεια, στον υποπαραθυρεοειδισμό, στη μεγαλακρία, στη

διαβητική κέτωση, στη γαλακτική οξέωση.

Ελάττωση του φωσφόρου παρατηρείται στην υπερβολική χορήγηση ινσουλίνης, στον

υπερπαραθυρεοειδισμό, στην οστεομαλακία, στην στεατόρροια (χαμηλή απορρόφηση

βιταμίνης D) κ.α.


49

Σε νεαρά άτομα υφιστάμενα δοκιμασίες ανοχής γλυκόζης, ο ανόργανος φώσφορος του

ορού διαγράφει μία αντίστροφη καμπύλη από τις τιμές του σακχάρου του αίματος. Η

καμπύλη είναι επίπεδη στους διαβητικούς.


Θειικό οξύ ανόργανος φώσφορος + μολυβδαινικό αμμώνιο σύμπλοκο φωσφομολυβδαινίου

Μέθοδος τελικού σημείου. λ = 340 nm.

Δείγμα

Ορός ή πλάσμα με EDTA και ηπαρίνη χωρίς αιμόλυση. Αποχωρίζεται ο ορός ή το πλάσμα

εντός 1 ώρας και συντηρείται για 7 ημέρες στους 2 – 8ο C ή για 3 μήνες στους -20o C.


Νεογέννητα: 4,6 – 8,0 mg/dL

1 – 3 ετών: 3,9 – 6,5 mg/dL

4 – 6 ετών: 4,0 – 5,6 mg/dL

7 – 11 ετών: 3,7 – 5,6 mg/dL

12 – 13 ετών: 3,3 – 5,4 mg/dL

14 – 15 ετών: 2,9 – 5,4 mg/dL

16 – 19 ετών: 2,8 – 4,8 mg/dL

< 60 ετών: 2,7 – 4,7 mg/dL

> 60 ετών: 2,4 – 4,3 mg/dL


Σίδηρος (IRON ή Fe)

Μέθοδος: TPTZ


Στο αίμα ο σίδηρος κυκλοφορεί στην τρισθενή του μορφή προσκολλημένος στην πρωτεΐνη

του ορού σιδηροφυλλίνη. Φυσιολογικά ο σίδηρος του ορού ελαττώνεται στην


50

εγκυμοσύνη. Παθολογικά ο σίδηρος ελαττώνεται στην σιδηροπενική αναιμία, στην

οξεία και χρόνια λοίμωξη, στον καρκίνο κ.α.

Παθολογικά ο σίδηρος αυξάνει στην υπερβολική θεραπεία με σίδηρο, στον αυξημένο

ρυθμό καταστροφής των ερυθρών (αιμολυτική αναιμία), στην οξεία λευχαιμία και τέλος

στον κορεσμό με βιταμίνη C.


Ασκορβικό οξύ, Ρυθμιστικό διάλυμα τρανσφερίνη (Fe3+) 2 Fe2+ + τρασφερίνη

Fe2+ + 2, 4, 6 Τρι [2-πυριδυλ]-5-τριαζίνη μπλε σύμπλοκο


Δείγμα

Ορός, ηπαρινισμένο πλάσμα. Δεν πρέπει να χρησιμοποιείται πλάσμα με EDTA και

οξαλικό ή κιτρικό νάτριο. Δεν πρέπει επίσης να χρησιμοποιούνται αιμολυμένα δείγματα

(δίνουν χαμηλότερες τιμές από το κανονικό).


Άνδρες: 49 – 151 μg/dL

Γυναίκες: 53 – 167 μg/dL



51

ΑγγλοΕλληνικό Λεξιλόγιο

2,4,6 tribromo-3-hydroxybenzoic acid (TBHB)

2,4,6 διβρωμο-3-υδροξυβενζοικό οξύ

2-chloro-4-nitrophenyl-α-D-maltotrioside (CNP)

2-χλωρο-4-νιτροφαινόλη-α-D-μαλτοτριοσίδη

4-aminoantipyrine (4-AAP) 4-αμινοαντιπυρίνη

5-amino-2-nitrobenzoate 5-αμινο-2-νιτροβενζοικό

Activity Ενεργότητα

Alanine Αλανίνη

Alanine aminotransferase Αμινοτρανσφεράση της αλανίνης

Ammonium molybdate Αμμώνιο του μολυβδαινίου

Amylase (ΑΜΥ) Αμυλάση

Aspartate aminotransferase Ασπαρτική αμινοτρανσφεράση

Azobilirubin Αζωχολερυθρίνη

Calcium (Ca) Ασβέστιο

Cholesterol (CHOL) Χοληστερόλη

Cholesterol esterase (CHOE) Εστεράση χοληστερόλης

Cholesterol oxidase (CHOD) Οξειδάση χοληστερόλης

Colorimetric analysis Χρωματομετρική ανάλυση

Complex Σύμπλοκο

Creatinine (CREAT) Κρεατινίνη

Cupric sulfate Θειικός χαλκός

Direct bilirubin (DBILI) Άμεση χολερυθρίνη


52

End point analysis Ανάλυση τελικού σημείου

Gluconic acid Γλυκονικόοξύ

Glucose (GLUC) Γλυκόζη

Glucose oxidase (GOD) Οξειδάση της γλυκόζης

Glutamate Γλουταμινικό

Glutamate dehydrogenase (GLDH) Γλουταμινική δευδρογενάση

Glycerol – 3 – phosphate oxidase (GPO)

Γλυκερόλ-3-φωσφορική οξειδάση

Glycerol Kinase (GK) Κινάση της γλυκερόλης

Glycyglycine Γλυκυλγλικίνη

High Density Lipoprotein (HDL) Υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεΐνη

Kinetic analysis Κινητική ανάλυση

Lactate dehydrogenase (LDH) Γαλακτική δευδρογενάση

Lipoprotein lipase (LPL) Λιποπρωτεινική λιπάση

L-lactate L-λακτάση

Low Density Lipoprotein (LDL) Χαμηλής πυκνότητας λιποπρωτείνη

L-γ-glutamyl-3-carbocy-4-nitroanilide

L-γ-γλουταμυλ-3-καρβο-4-νιτροανιλλίνη

Magnesium (Mg) Μαγνήσιο

Malate dehydrogenase (MDH) Μηλική δευδρογενάση

Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)

Νικοτινάμιδο-αδένινο-δινουκλεοτίδιο

o-cresolphthalein complexone Σύμπλοκο ο-κρεζοφθαλείνης

Oxalacetate Οξαλοξικό


53

Oxoglutarate Οξογλουταρικό

Peroxidase (POD) Υπεροξειδάση

Phenol Φαινόλη

Phosphate (Ph) Φώσφορος

Picric acid Πικρικό οξύ

p-nitrophenyl phosphate (pNPP) p-φωσφορική νιτροφαινόλη

Polypeptide Πολυπεπτίδιο

Protein (TP) Πρωτεΐνη

Pyruvate Πυροσταφυλικό

Quinomeimine Κινόνη

Sulfuric acid Θειικό οξύ

Total bilirubin (TBILI) Ολική χολερυθρίνη

Triglycerides (Trig) Τριγλυκερίδια

Urease Ουρεάση

Uric acid (UA) Ουρικό οξύ

Βιβλιογραφία

1. Eastham, Φυσιολογικές τιμές στην Κλινική Χημεία, Εκδόσεις Παρισιάνος, 1995

2. Αποστολόπουλος, Τ. Οδηγός εργαστηριακών εξετάσεων, Εκδόσεις In Vitro, Biochem

3. Γιαλεράκη Α, Ιωαννίδης Ι, Κοτσιφάκης Θ, Κλινική Βιοχημεία ΙΙ, Εκδόσεις Παιδαγωγικού

Ινστιτούτου.

4. Ιστοσελίδα των εταιρειών Biosis, SpinReact, Roche (Hitachi).


54

ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ – ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΑΣΚΗΣΕΩΝ

Υπολογισμός τιμών αναφοράς π.χ. τριγλυκεριδίων σε συγκεκριμένο

πληθυσμό

Έστω ότι συγκεντρώσαμε τις παρακάτω τιμές

112 121 113 118 118

111 105 111 121 116

120 105 99 124 118

98 105 100 126 119

111 111 121 111 121

120 110 120 115 122

98 110 111 99 123

112 111 115 154 124

120 120 116 98 125

111 115 114 11 125

111 118 113 85 111

120 114 111 111 110

116 112 112 118

115 116

116 114

115

116

Κομβικό σημείο είναι ο προσδιορισμός της θέσης των εκατοστημορίων

(percentiles). Ως εκατοστημόριο είναι μία θέση στην αύξουσα σειρά των τιμών που

χωρίζει τις τιμές ανάλογα με το ποσοστό που δηλώνει.

H θέση των εκατοστημορίων συμβολίζεται ως P π.χ. 3P, 5P, 50P. Π.χ. το

εκατοστημόριο 3P δηλώνει την τιμή που χωρίζει τις τιμές που έχουν ταξινομηθεί σε

αύξουσα σειρά σε δύο μέρη, αυτές που είναι κάτω από το 3% και αυτές που είναι

πάνω από το 97%. Π.χ. το εκατοστημόριο 50P είναι η διάμεσος (Μ) που χωρίζει τις

τιμές σε δύο ίσα μέρη, αυτές που είναι κάτω ή πάνω από την τιμή της διαμέσου.

Λύση

Το πρώτο βήμα είναι εξακριβωθεί αν οι τιμές ακολουθούν την κανονική κατανομή.

Για να ακολουθούν την κανονική κατανομή θα πρέπει η επικρατούσα τιμή (Μο) να


55

είναι ίση με την μέση τιμή (μ) ή ακόμα καλύτερα η επικρατούσα να είναι ίση με τη

μέση τιμή και την διάμεση τιμή.

Για να βρούμε την διάμεσο (50Ρ) και την επικρατούσα θα πρέπει να τοποθετηθούν

οι τιμές σε αύξουσα σειρά.

Η αύξουσα σειρά φαίνεται παρακάτω (η μικρότερη τιμή είναι η 85 και η μεγαλύτερη

η 154):

85 111 115 120

98 111 115 120

98 111 115 120

98 111 115 120

99 111 115 120

99 111 116 120

100 111 116 121

105 111 116 121

105 111 116 121

105 112 116 121

110 112 116 122

110 112 118 123

110 112 118 124

111 113 118 124

111 113 118 125

111 114 118 125

111 114 119 126

114

154

H επικρατούσα τιμή είναι η τιμή 111 η οποία εμφανίζεται 11 φορές. Η μέση τιμή

είναι: 114 και η διάμεσος 114. Μια τέτοια κατανομή θα μπορούσε να θεωρηθεί

ακόμα και κανονική.

Στις κανονικές κατανομές τα όρια αναφοράς είναι το εύρος: μέση τιμή - 2 τυπικές

αποκλίσεις έως μέση τιμή + 2 τυπικές αποκλίσεις. Στο παράδειγμα μας η μέση

τιμή είναι 114 mg/dL και η τυπική απόκλιση είναι: 8,9 mg/dL.

Άρα τα όρια αναφοράς είναι: 96,2 - 134 mg/dL.

Mπορεί όμως να θεωρηθεί και μη κανονική. Σε αυτή την περίπτωση τα όρια

αναφοράς είναι το εύρος: 2,5P έως 97,5P.


56

H θέση της τιμής των εκατοστημορίων είναι (Ν+1)P/100. Όπου Ν ο αριθμός των

τιμών και P το εκατοστημόριο. Στο παράδειγμα μας ο αριθμός των τιμών είναι: N =

70.

Οπότε η θέση του εκατοστημορίου 2,5P είναι: (70+1)x2,5/100 = 1,7 δηλαδή

περίπου 2. Η δεύτερη δηλαδή τιμή είναι το 2,5P. Στο παράδειγμα μας η δεύτερη

τιμή είναι η 98.

Αντίστοιχα η θέση του εκατοστημορίου 97,5P είναι (100 - 97,5 = 2,5) δηλαδή

αντιδιαμετρικά η δεύτερη τιμή από το τέλος. Στο παράδειγμα μας η δεύτερη τιμή

από το τέλος είναι η 126.

Κατά συνέπεια η τιμή αναφοράς είναι 98 - 126 mg/dL.

Μετατροπή από mg/dL σε moles/L

Π.χ. έστω ότι θέλουμε να μετατρέψουμε σε mg/dL συγκέντρωση 0,2 mmoles/L UA.

Ο Μοριακός Τύπος του ουρικού οξέος είναι: C5H4N4O3

Aπάντηση

Tα 0,2 mmole είναι 0,2 x 10-3 moles

Το βάρος ενός mole είναι το ΜΒ εκφρασμένο σε gr.

Bρίσκουμε επομένως πρώτα το ΜΒ του ουρικού οξέος. Tα ατομικά βάρη των

ατόμων του είναι C = 12, H =1, N = 14, O = 16. Κατά συνέπεια το ΜΒ είναι: 5 x 12

+ 4 x 1 + 4 x 14 + 3 x 16 = 168

Άρα το mole είναι 168 gr

Κατά συνέπεια τα 0,2 mmoles = 0,2 x 168 x 10-3 gr = 33,6 x 10-3 gr

To 1 gr ισούνται με 1000 mg

Κατά συνέπεια τα 33,6 x 10-3 gr που βρήκαμε προηγουμένως ισούνται με 33,6 x

10-3 gr = 33,6 x 10-3 x 103 mg = 33,6 mg


57

Στην εκφώνηση είδαμε ότι η συγκέντρωση που θέλουμε να μετατρέψουμε σε

mg/dL είναι 0,2 mmoles/L. Kατά συνέπεια τα 33,6 mg αντιστοιχούν σε 1 L δηλαδή

1000 ml ή αλλιώς 10 dL

Eμείς όμως θέλουμε mg/dL άρα λέμε ότι:

Tα 33,6 mg αντιστοιχούν σε 10 dL

Πόσα mg αντιστοιχούν σε 1 dL;

Aπάντηση: 33,6 / 10 = 3,3.

Δηλαδή τα 0,2 mmoles/L αντιστοιχούν σε 3,3 mg/dL

Προσδιορισμός κάθαρσης κρεατινίνης με την μέθοδο Jaffe.

Δεδομένα άσκησης

Όγκος ούρων 24ώρου: V24h = 2 L

Συγκέντρωση προτύπου: Cst = 4 mg/dL

Απορρόφηση ούρων: A1s = 0,300 A2s = 0,450

Απορρόφηση ορού: A1u = 0,680 A2u = 0,685

Απορρόφηση προτύπου: A1st = 0,800 A2st = 0,900

Tα ούρα πριν τον προσδιορισμό της κρεατινίνης είχαν αραιωθεί 1/50.

Απάντηση

Μετατρέπουμε τα 2 L σε mL γιατί η GFR υπολογίζεται σε mL/min. Άρα V = 2000

mL

H τιμή του φάκτορα είναι η ίδια και για τις αναλύσεις των ούρων και του ορού αφού

το πρότυπο είναι το ίδιο.

Οπότε F = Cst /(A2st - A1st) = 400 mg/dL (o φάκτορας έχει μονάδες μέτρησης).

Creatu = F (A2u - A1u) = 60 mg/dL

Creats = F (A2s - A1s) = 2 mg/dL


58

GFR = (Creatu V24h)/(Creats 1440) = (60 x 2000)/(2 x 1440) = 52 mL/min

O ασθενής έχει νεφρική ανεπάρκεια.

Σημείωση: Στην εξίσωση της κάθαρσης κρεατινίνης μπαίνει η τιμή της κρεατινίνης

ορού και ούρων όπως ακριβώς προσδιορίζονται χωρίς προαραίωση.

Προσδιορισμός κρεατινίνης ούρων 24ώρου με την μέθοδο Jaffe.

Δεδομένα άσκησης

Όγκος ούρων 24ώρου: V24h = 2 L

Συγκέντρωση προτύπου: Cst = 4 mg/dL

Απορρόφηση ούρων: A1s = 0,300 A2s = 0,450

Απορρόφηση προτύπου: A1st = 0,800 A2st = 0,900


Απάντηση

Μετατρέπουμε τα 2 L σε mL. Άρα V = 2000 mL

H τιμή του φάκτορα είναι η ίδια και για τις αναλύσεις των ούρων και του ορού αφού

το πρότυπο είναι το ίδιο.

Οπότε F = Cst /(A2st - A1st) = 400 mg/dL (o φάκτορας έχει μονάδες μέτρησης).


Creatu = F (A2u - A1u) = 60 mg/dL

Creatu 24h = Creatu x V24h / αραίωση = 60 mg/dL x 2000 /100 = 1200 mg/mL

Date post:	14-Mar-2021
Category:	Documents
Upload:	others
View:	4 times
Download:	0 times

υμπληρωματικές σημειώσεις εργαστηρίου...

Documents