01 Das zentrale Dogma der Molekularbiologie (VO1) · 2012-06-14 · A complete draft of the...

Molekulare Diagnostik

1Institute for Genomics and Bioinformatics, TU Graz / Austria Dr. Andreas Prokesch

Molekulare DiagnostikAndreas Prokesch, Dipl.-Ing. Dr.techn.



Kurative Therapie

Palliative Behandlung

Präventivmedizin(=>Personalisierte

Medizin)Molekulare Diagnostik

Molekulare Diagnostik in der MedizinMolekulare Diagnostik in der Medizin









Inhalt•• Das zentrale Dogma der MolekularbiologieDas zentrale Dogma der Molekularbiologie•• PolymerasePolymerase--Kettenreaktion (PCR)Kettenreaktion (PCR)•• Real time PCR und digitale PCRReal time PCR und digitale PCR•• Rekombinante DNARekombinante DNA•• DNADNA--FingerprintFingerprint•• DNADNA--ChipChip--TechnologieTechnologie•• SequenziermethodenSequenziermethoden•• Single nucleotide polymorphism (SNP) GenotypisierungSingle nucleotide polymorphism (SNP) Genotypisierung•• EnzymeEnzyme--linked immunosorbent assay (ELISA)linked immunosorbent assay (ELISA)•• Proteinbestimmung (Massenspektrometrie...)Proteinbestimmung (Massenspektrometrie...)•• Western blotWestern blot•• ImmunohistochemieImmunohistochemie



Das zentrale Dogma der Molekularbiologie:

DNATranskription

RNATranslation

Protein



Begriffserklärungen• GENOM: Ist die allgemeine Bezeichnung für die

Gesamtheit aller Gene eines Organismus• GEN: Ist ein Abschnitt aus dem Genom einer Zelle oder

eines Virus, der für die Synthese einer Polypeptidkette, einer Transfer-RNA oder einer ribosomalen RNA verantwortlich ist (etwa 23 000 humane Gene).

• Gen besteht aus codierenden Regionen (Exons) und nicht codierenden Regionen (Introns-nicht immer)

• Gemeinsame Transkription von Introns und Exons! Durch das Splicing: Entfernung der Introns, funktionelle mRNA beinhaltet nur noch zusammenhängende Exons



The Human Genome ProjectA complete draft of the nucleotide sequence of one copy of a human genome

But how to read these instructions....?

3 x 109 nucleotides in the human genome

Average gene ~ 10 kb

Number of genes now estimated at 20 000 – 25 000 (~ 10% of the genome)

Global colaboration: 2,500 scientists, 20 institutions

Lander et al., Nature 409:860-921 2001

Venter et al., Science 291:1304-1351, 2001

Kevin Davies: Die Sequenz: Der Wettlauf um das menschliche Genom

J. Craig Venter: Entschlüsselt: Mein Genom, mein Leben



DNA: Desoxyribonukleinsäuren

• DNA beinhaltet die Erbinformation der meisten Organismen

• In Prokaryoten ist die DNA meist ein membrangebundener Faden, zusammengehalten durch RNA und Proteinmoleküle.In Eukaryoten sind DNA Moleküle immer mit Proteinen komplexiert (Chromatin) und befinden sich im Zellkern (Chromosom).

• Karyotyp: ist der vollständige Chromosmensatz in den Körperzelleneines Individuums!Jede Spezies hat eine charakteristische Form und Anzahl von Chromosomen (Mensch 44 XX, 44 XY).



Karyotyp, weiblich



Karyotyp, männlich



DNA: DesoxyribonukleinsäurenRNA: Ribonukleinsäuren

• DNA/RNA ist ein lineares, hochmolekulares Polymer aus Nukleotiden

• Nukleotid: besteht aus Base, DesoxyRibose und Phosphatgruppe

DNA/RNA-Basen: Purinbasen: Adenin, Guanin,Pyrimidinbasen: Thymin (Uracil) und Cytosin

DesoxyRibose: Zucker mit 5-C Atomen!

Phosphatgruppe (Phosphoratom, umgeben von 4-O)



Bausteine der DNANukleosid: Base & Zucker

AdenosinGuanosinCytidinThymidin

Nukleotid: Base & Zucker & PhosphatAdenosinmonophosphat (AMP)Guanosinmonophosphat (GMP)Cytidinmonophosphat (CMP)Thymidinmonophosphat (TMP)

DNA ist in wäßriger Lösung pH neutral wegen ihrer negativ geladenen Phosphatgruppen!!!



Basenpaarung: A:T und G:CChargaff-Regel: A+G=T+C=1

Doppelstrang: ist die antiparalleleAnordnung der Einzelstränge

Doppelhelix: Sekundärstruktur der DNA!!



Mononukleotide bilden über Phosphodiesterbrücken Polynukleotide

Basenfolge der Nukleinsäure nennt manPrimärstruktur: immer 5´nach 3´!!!



Chemische Eigenschaften der DNA• Purin- und Pyrimidinbasen sind planare und relativ

hydrophobe Strukturen.• Basen liegen im Zentrum der Doppelhelix und stabilisieren

diese.• Peripherie der DNA besteht aus Zucker und Phosphatresten

und ist somit hydrophil.• DNA Basen absorbieren Licht im UV (Max. 260nm)• Antiparallele Doppelhelixstränge können durch Erhitzen oder

durch Behandlung mit NaOH getrennt werden (denaturierenoder schmelzen der DNA)

• Der Schmelzpunkt der DNA (ist jene Temp, bei der die Hälfte der DNA als Einzelstrang vorliegt) ist abhängig vom G+C Gehalt (sind stabiler als A+T) und von der Salzkonzentration der Lösung.



Superstruktur der DNA• Primärstruktur: Basenfolge• Sekundärstruktur: Helixausbildung• Tertiärstruktur: Bindung der DNA an Proteine

Tertiärstruktur: Nukleosomen• DNA negativ in wäßriger Lösung (Phosphatgruppen)• In Eukaryoten Ladungsausgleich durch Histone (kleine

basische Proteine)• Histone binden an DNA und bilden ein HISTON-Octamer!!• Nukleosomen: sind Komplexe aus Histonen und DNA

• In Nukleosomen windet sich die DNA Helix um den Histonkomplex• DNA ist nur während der Replikation und Transkription histonfrei!



Replikation der DNA• Zellen replizieren ihre DNA bevor sie sich teilen• Bei Eukaryonten in der S (Synthese)-Phase des Zellzyklus• Replikation erfolgt semikonservativ, sprich Doppelhelix wird getrennt und zu

jedem alten Strang wird ein neuer komplementärer Strang synthetisiert.



Transkription• Ist der Vorgang der Überschreibung der genetischen Info

von DNA auf RNA!!• Grundliegend in Pro- und Eukaryoten gleich• Transkription kann sowohl negativ (Repression) als auch

positiv (Stimulation) reguliert werden: Transkriptionsfaktoren!!!

• Transkriptionsfaktoren regulieren den Zugang der Polymerasen an die Promotoren.

• TATA-Box am Promoter bestimmt den Transkriptionsstart bei Position +1



Some important gene-features, transcription

Terminology:

•Nontemplate strand/upper strand/+ strand/coding strand/Watson strand

•Template strand/lower strand/- strand/noncoding strand/Crick strand

Recognition site for transcriptional PIC



Transkription (RNA Synthese)

The principle of the Transcription Bubble



RNA processing in eukaryotes

• Capping

• Poly-adenylation

• Splicing (leaving only exons)



Modifikation von RNA

• Splicing: DNA beinhaltet Introns, diese werden auch noch transkribiert (Primärtranskript: hnRNA) aber noch im Kern aus der RNA entfernt. Manche Gene können unterschiedlich gesplict werden (alternative splicing).

• RNA-Editing:nur in Eukaryoten, verändert meist die mRNA, damit sie danach translatiert werden kann (Insertion und Deletion von Basen, Austausch von Basen-kann zu Stopcodon führen, ApoB hat z.B. zwei verschiedene Proteingrößen.



The three roles of RNA in protein synthesis

• Three types of RNA molecules perform different but complementary roles in protein synthesis (translation)

• Messenger RNA (mRNA)carries information copied from DNA in the form of a series of three base “words” termed codons

• Transfer RNA (tRNA)deciphers the code and delivers the specified amino acid

• Ribosomal RNA (rRNA)associates with a set of proteins to form ribosomes, structures that function as protein-synthesizing machines

Translation



Translation

• 3 Basen kodieren eine Aminosäure• 4 hoch 3 Möglichkeiten der Basenkombination:

64!! (gibt allerdings nur 20)• Es gibt 20 Aminosäuren (sprich mehrere Codes

für eine AS)• Startkodon: AUG (immer Methionin als Start der

Proteinsynthese)• Terminationskodons: UAA, UAG, UGA



The triplet code( = always made of a string of 3-base-sequences (=codons))

- And can be read in different frames:

Translation



Translation (Synthese von Proteinen)

Translation involves:• RNA (mRNA, tRNA, rRNA)• Codons-anticodons• Activated tRNAs (aa-tRNA)• Initiation factors• Ribosomes• Termination factors



Proteins functions

So Proteins have structure and function... Fine!

-Why do we care to know more????

Understanding functional architechture gives us POWERto:•Diagnose and find reasons for diseases•Create modifying drugs•Engineer our own designer-proteins



DNA

(mRNA)

Translation:

Translation into 3D structure:

3D structure determines function:

Modifications:Chemical modification of aminoacids

Interaction with other molecules

Proteolytic cleavage

(Location)

New 3D structure

New functionProteins are single, unbranched chains of amino acid monomersThere are 20 different amino acidsThe amino acid sidechains in a peptide can become modified, extending the functional repetoire of aminoacids to more than hundred different amino acids.A protein’s amino acid sequence determines its three-dimensional structure (conformation) In turn, a protein’s structure determines the function of that proteinConformation (=function) is dynamically regulated in several different ways

Protein structure determines function



All amino acids have the same general structure but the side chain (R group) of

each is different

Cα

R: Hydrophilic:

Basic

Acidic

Non-charged

Hydrophobic

“Special”



Hydrophilic amino acids



Hydrophobic and “special” amino acids



Backbone

Side-chains

Peptide bonds connect amino acids into linear chains



Four levels of structure determine the shape of proteins

• Primary: the linear sequence of amino acids peptide bonds

• Secondary: the localized organization of parts of a polypeptide chain (e.g., the α helix or β sheet)backbone hydrogen bonds

• Tertiary: the overall, three-dimensional arrangement of the polypeptide chainhydrophobic interactions, hydrogen bonds (non-covalent bonds in general) and sulfur-bridges

• Quaternary: the association of two or more polypeptides into a multi-subunit complex



Aberrantly folded proteins are implicated in slowly developing diseases

An amyloid plaque in Alzheimer’s disease is a tangle of protein filaments



Quaternary structure of antibodies

CDR:



Fab

Fc



V(D)J-Rekombination

• Im humanen Genom: 65 V-, 27 D- und 6 J-Regionen• Theoretisch 10^8 Kombinationsmöglichkeiten• Zufällige Mutationen in diesen Genen erhöhen die Varianz ( 10 Mrd)





Herstellung monoklonare Antikörper



Diagnostische Anwendungen monoklonaler Antikörper

• Serologie:– Schwangerschaftshormone (Gonadotropin)– Eppstein-Barr virus– Borreliose

• Diagnostic Imaging– Erkennung von Tumor-Antigenen mit 131I Markierung

• Weiters: – ELISA– Antikörper-Chip– Immunohisotchemie– …

Date post:	04-Feb-2020
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