06-Desarrollo de la t cnicaÉ Sis Sa...coz del cáncer de pulmón y los crecientes esfuerzos de...

305ANALES Sis San Navarra 2002, Vol. 25, Nº 3, septiembre-diciembre

REVISIONES

Desarrollo de la técnica de FICTION como nueva herramienta para eldiagnóstico precoz de cáncer de pulmónFICTION as a new tool to early lung cancer diagnosis

I. Zudaire1,2, R. Pío2,3 , I. Martín-Subero4, M.D. Lozano5, D. Blanco2, J.J. García López6, M.D.Odero de Dios1, N. Rey2 , J. Zulueta6 , R. Siebert4, M.J. Calasanz1, L. Montuenga2,5

CorrespondenciaIsabel Zudaire RipaDepartamento de GenéticaUniversidad de NavarraIrunlarrea s/n31008 PamplonaTfno: 948 425600 Ext. 6214Fax 948 425649E-mail: [email protected]

Becas y ayudas a la investigación:El proyecto presentado en esta revisión está sien-do subvencionado por el Gobierno de Navarra, laFundación para la Investigación Médica Aplicaday por el Centro Interdisciplinar para la Investiga-ción Clínica del Cáncer (IZKF, Kiel, Alemania).

RESUMENEl cáncer de pulmón es una de las causas de muerte más

frecuentes en el mundo occidental. La supervivencia global delos pacientes no supera el 15% a los 5 años, debido principal-mente a que la mayor parte de los casos se diagnostican enestadios avanzados. Además de la prevención primaria, median-te la reducción del consumo de tabaco, son necesarias nuevastecnologías para el diagnóstico precoz de la enfermedad.

Estudios recientes han demostrado que el TAC helicoidaldel tórax es efectivo en la detección de nódulos pulmonaresmalignos en estadios precoces. En la actualidad se está valoran-do su eficacia en series amplias de pacientes de alto riesgo.

Recientemente se ha desarrollado una nueva técnica decitogenética molecular, el FICTION (Fluorescence Immunophe-notyping and Interphase Cytogenetics as a Tool for the Investiga-tion of Neoplasms). Esta técnica permite el análisis simultáneode marcadores inmunofenotípicos y alteraciones genéticas pre-sentes en las células tumorales. El objetivo de nuestro proyectoes su puesta a punto para el estudio de muestras de esputo ylavado broncoalveolar de pacientes con cáncer de pulmón. El finúltimo es estudiar la posibilidad de que esta técnica pueda serutilizada, junto con el TAC helicoidal, en programas de detec-ción precoz de cáncer de pulmón, para pacientes de alto riesgo.

En este trabajo presentamos una revisión de la contribu-ción de las distintas técnicas de citogenética al estudio del cán-cer de pulmón y la metodología de trabajo que vamos a llevar acabo en nuestro proyecto.

Palabras clave. Cáncer de pulmón. Detección precoz. Cito-genética. FICTION. Esputo. Lavado broncoalveolar.

ABSTRACTLung cancer is one of the most frequent causes of cancer

death in Western countries. Overall 5-year survival rate islower than 15% mainly due to the late diagnosis of the disease.Primary prevention (reduction of tobacco consumption) andmore effective methods for early detection are needed.

Some studies have recently shown that low-dose spiralcomputed tomography (CT) is a useful technique to thedetection of pulmonary malignant nodules in early stages.Studies are developing to evaluate its efficacy in series of high-risk patients.

A new cytogenetic technique has been developed: theFICTION technique (Fluorescence Immunophenotyping andInterphase Cytogenetics as a Tool for the Investigation ofNeoplasms). This technique allows the simultaneous study ofimmunophenotypic markers and genetic abnormalities presentin tumour cells. The goal of our project is optimise thistechnique in sputum and bronchoalveolar lavage specimensfrom lung cancer patients. The overall goal of this project isevaluate the usefulness of this technique, together with the newradiological techniques, in early detection programs of lungcancer in high-risk patients.

In the present study we review the cytogenetic studies onlung cancer carried out in the recent years. We also introducethe basic methodological aspects that will be developed in ourproject.

Key words. Lung cancer. Early detection. Cytogenetics.FICTION. Sputum. Bronchoalveolar lavage.

1. Departamento de Genética. Universidad deNavarra. Pamplona.

2. Unidad de Carcinogénesis. Centro de Investi-gación Médica Aplicada. Universidad deNavarra. Pamplona.

3. Departamento de Bioquímica. Universidadde Navarra. Pamplona.

4. Instituto de Genética Humana. Hospital Uni-versitario de Kiel. Kiel, Alemania.

5. Departamento de Histología y Anatomía Pato-lógica. Universidad de Navarra. Pamplona.

6. Departamento de Neumología. Clínica Univer-sitaria. Universidad de Navarra. Pamplona.

Aceptado para su publicación el 4 de septiem-bre de 2002.

ANALES Sis San Navarra 2002; 25 (3): 305-315.

INTRODUCCIÓN

El cáncer de pulmón es la causa másfrecuente de muerte por cáncer en elmundo occidental. Se estima que en el año2000 se produjeron más de 1.300.000 muer-tes. A pesar de los importantes avancesrealizados en el tratamiento de estadiosavanzados, la supervivencia global delcáncer de pulmón en las mejores series,sigue siendo menor del 15% a los 5 años1.Todavía más preocupante es el hecho deque esta supervivencia no haya mejoradosustancialmente desde la década de los 70.

Este estancamiento se debe a múltiplesfactores pero, en contraste con otras neo-plasias epiteliales como el cáncer demama, no hay duda de que la falta de téc-nicas de diagnóstico precoz del cáncer depulmón, ha contribuido a este retraso. Así,aproximadamente 80% de los pacientescon cáncer de pulmón son diagnosticadoscuando la enfermedad está avanzada y sinposibilidades reales de curación. Teniendoen cuenta que tan sólo el 15-20% de lospacientes son diagnosticados en estadioIA, con una supervivencia a los 5 años del80%, es lógico pensar que si mejoraranuestra capacidad de detectar tumores deforma precoz en personas de alto riesgo,conseguiríamos disminuir la mortalidadpor esta enfermedad. La combinación denuevas tecnologías para la detección pre-coz del cáncer de pulmón y los crecientesesfuerzos de prevención primaria realiza-dos para reducir la exposición al tabaco,pueden sin duda suponer una mejora sus-tancial en la batalla por controlar esta epi-demia de los tiempos modernos2.

Estudios iniciales realizados en losaños 70 desaconsejaron la combinacióndel análisis citológico del esputo y la radio-grafía de tórax como herramienta para ladetección precoz de cáncer de pulmón enpacientes de alto riesgo; sin embargo, estu-dios recientes han demostrado que el TAChelicoidal del tórax es efectivo en la detec-ción de nódulos pulmonares malignos enestadios precoces3 y puede ser una buenaherramienta para estrategias de cribadoen poblaciones de alto riesgo. Grupos mul-ticéntricos están llevando a cabo estudiosaleatorios para determinar si el uso delTAC helicoidal en protocolos de cribado a

nivel población de alto riesgo disminuyesignificativamente la mortalidad por cán-cer de pulmón.

La línea de investigación que llevamosa cabo en nuestro grupo parte de la hipó-tesis de que la combinación de las técnicasradiológicas con técnicas de detección demarcadores moleculares permitirá mejo-rar sustancialmente el diagnóstico precozdel cáncer de pulmón.

Es evidente que, para poder aplicar elestudio de marcadores moleculares en elcontexto de la detección precoz en elámbito poblacional, se requiere desarro-llar técnicas poco invasivas, sencillas,rápidas y de bajo coste. Es conocido que alo largo de la carcinogénesis pulmonar,algunas células del tumor son liberadas alárbol bronquial y pueden detectarse en loscorrespondientes fluidos biológicos, comoel lavado broncoalveolar o esputo4,5. Tam-bién se ha publicado la detección de célu-las cancerosas, ARN, ADN y proteínas deorigen tumoral en la sangre de los pacien-tes con cáncer de pulmón, especialmenteen los tumores más avanzados6. La presen-cia de moléculas del tumor en elsuero/plasma del paciente en el caso deestadios más precoces es todavía tema dediscusión. La detección de células tumora-les o preneoplásicas en esputo o lavadobroncoalveolar podría en teoría adelantarel diagnóstico del tumor antes de la apari-ción de los síntomas clínicos, o comple-mentar los datos obtenidos mediante elTAC helicoidal, por lo que resultan de graninterés para la puesta en marcha de unprograma de detección precoz.

El análisis citológico es la técnica con-vencional para el estudio de la presenciade células malignas en el esputo o el lava-do broncoalveolar. En teoría, en estadiosmuy precoces de la carcinogénesis pulmo-nar, es posible encontrar en estos fluidosbiológicos células fenotípicamente norma-les que presenten marcadores molecularesespecíficos de la transformación o de pre-malignidad. Por ello, un estudio multidisci-plinar de las muestras que combine elestudio fenotípico y de marcadores mole-culares, puede mejorar significativamentela calidad del diagnóstico.

I. Zudaire y otros

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En este contexto, el objetivo principalde nuestro proyecto es la puesta a puntode una nueva tecnología diagnóstica, latécnica de FICTION (Fluorescence Immu-nophenotyping and Interphase Cytogeneticsas a Tool for the Investigation of Neo-plasms)7 para el estudio de células exfolia-tivas presentes en el esputo y el lavadobroncoalveolar de pacientes con alto ries-go de padecer cáncer de pulmón.

Para comprender mejor la necesidaddel desarrollo de esta técnica en carcino-mas de pulmón, exponemos brevemente lacontribución de las distintas técnicas decitogenética al estudio de esta neoplasia.

CITOGENÉTICA EN CÁNCER DEPULMÓN

Citogenética convencionalEl análisis citogenético convencional

consiste en el estudio de las alteracionescromosómicas presentes en las metafasesde las células obtenidas a partir de un cul-tivo in vitro del tejido a estudiar. El estudiode la morfología de los cromosomas selleva a cabo mediante el tratamiento contripsina y posterior tinción con Giemsa,generando un patrón de bandas, denomi-nadas bandas G, que permite detectar lasalteraciones, tanto numéricas comoestructurales, presentes en el genoma8.

La citogenética convencional ha expe-rimentado un importante desarrollo en elcampo de la hematología, incorporándosea la rutina diagnóstica; sin embargo en elcaso de los tumores sólidos, las dificulta-des técnicas encontradas la han relegadoal campo de la investigación. Los principa-les problemas residen en la escasa dispo-nibilidad de tejido fresco, la contamina-ción de los cultivos in vitro por célulasnormales, el bajo índice mitótico deltumor in vitro y principalmente, debido altiempo de manifestación clínica de lostumores, la complejidad de los cariotipos,que impide identificar alteraciones cromo-sómicas específicas de un grupo diagnósti-co o con una evolución clínica determina-da9.

A pesar de todo, la citogenética con-vencional ha permitido describir alteracio-nes específicas de los distintos tipos his-

tológicos de cáncer de pulmón. Así los car-cinomas microcíticos o de células peque-ñas (Small Cell Lung Carcinoma; SCLC) secaracterizan por las pérdidas en 3p, 5q,13q y 17p. En carcinomas no microcíticoso de células no pequeñas (Non-Small CellLung Carcinoma; NSCLC) son frecuenteslas pérdidas en 3p, 9p, 17p, la trisomía delcromosoma 17 y la presencia de i(5)(p10)e i(8)(q10). Dentro de este subgrupo, lapérdida de 3p y los reordenamientos afec-tando a 2p y 3q son significativamente másfrecuentes en carcinomas escamosos(Squamous Cell Carcinoma; SCC) que enadenocarcinomas (ADC), en los que sonmás frecuentes las ganancias en 1q, 7p y11q10-12.

Algunas de estas alteraciones se hanasociado a factores pronósticos tradicio-nales; así Feder y col encontraron que enNSCLC los reordenamientos en 17p se aso-ciaban a tumores de menor grado. Asimis-mo, las reordenaciones en Xq y las pérdi-das de los cromosomas 4 ó 22 seasociaban a peor pronóstico12.

Ya en 1993, la citogenética convencio-nal hizo su primera aportación al estudiode células exfoliativas de pulmón. El traba-jo de Lukeis y col describió alteracionescitogenéticas numéricas y estructurales enefusiones pleurales de 11 pacientes conNSCLC. Las alteraciones más frecuentesfueron las reordenaciones afectando a labanda 1p10-p13, las ganancias de los cro-mosomas 7 y 20, y las pérdidas de 4, 9, 10,13, 15, 16, 18, 19, 21 y 2213.

Citogenética molecularLa citogenética molecular engloba a

todas las técnicas cromosómicas basadasen la hibridación in situ con sondas fluo-rescentes. En función de la sonda utilizaday la diana que se pretende estudiar se handesarrollado diferentes metodologías:FISH, CGH, SKY, M-FISH, etc. y finalmente elFICTION.

FISH convencionalSe consideran técnicas de FISH conven-

cional, aquellas técnicas que utilizan son-das de ADN normal marcadas con fluores-cencia sobre metafases o núcleos eninterfase procedentes del tumor. La posibi-lidad de estudiar núcleos en interfase abre


DESARROLLO DE LA TÉCNICA DE FICTION COMO NUEVA HERRAMIENTA PARA EL …

un enorme campo al estudio de tumorescon un bajo índice mitótico y al estudio dematerial archivado, bien congelado oincluido en parafina8.

Al igual que la citogenética convencio-nal, las técnicas de FISH permiten detectartodo tipo de alteraciones, tanto numéricascomo estructurales. Uno de sus inconve-nientes es que sólo permite estudiar aque-lla secuencia para la que se dispone sonda,quedando el resto del genoma oculto.

La región más frecuentemente analiza-da mediante FISH en cáncer de pulmón hasido 3p. En este brazo, se han descritodeleciones frecuentes en diferentes regio-nes como 3p25-p26, 3p21.3-p22, 3p14 y3p1214. El gen FHIT (Fragile Histidine Triad)en 3p14.2 es uno de los genes más estudia-dos. Se han descrito transcritos anómalosde este gen en un 80% de los SCLC y en un40% de los NSCLC. La pérdida de heteroci-gosidad (LOH) es más frecuente en fuma-dores que no fumadores, sugiriendo queeste gen es una diana para las sustanciascarcinogénicas del tabaco15. Además, laLOH no es exclusiva de células tumorales:se ha descrito alteración de este gen en elepitelio morfológicamente normal defumadores y mediante FISH, Caballero ycol describieron la pérdida de este gen enel epitelio normal de pacientes con tumo-res primarios16. Su implicación en los esta-dios iniciales del desarrollo del tumor seconfirma con la descripción de delecionesen lesiones preneoplásicas como la fibro-sis idiopática pulmonar17.

La elevada frecuencia de deleciones en3p21 ha generado multitud de estudios enbusca de posibles genes supresores locali-zados en esta región. Estudios medianteRFLPs, RT-PCR y marcadores de LOH18-20han sugerido el posible papel supresor devarios genes localizados en 3p21.3. Así, sehan descrito deleciones homocigóticas enuna región de 120kb en 3p21.3 afectando aCACNA2D2, 101F6, NPRL2, BLU, FUS1,HYAL2, HYAL1, SEMA3B, SEMA3F yRBM5/H37 entre otros21,22. Sin embargo, latasa de mutación para estos genes es muybaja (menos de 5% de los casos) en lamayoría de los estudios, sugiriendo que,en el caso de ser supresores tumorales, lavía de inactivación no es la mutación genó-

mica. Uno de los mecanismos de inactiva-ción de genes supresores frecuente en pul-món es la hipermetilación del promotor,descrita en genes como RASSF1A (tambiénen 3p21)23, RARß, TIMP-3, CDKN2A/p16,MGMT, DAPK, ECAD, GSTP1 y tambiénFHIT15. En el caso de CDKN2A/p16, se hadescrito también metilación en un 92% delas muestras de esputo obtenidas depacientes con NSCLC24, por lo que el estu-dio de la metilación de este gen se ha pro-puesto como herramienta de detecciónprecoz.

El brazo largo del cromosoma 3 tam-bién ha sido objeto de estudio medianteFISH, confirmando la implicación de múlti-ples genes en las ganancias encontradasen 3q25-q27 en carcinomas escamosos25.En 3q21, se ha identificado un posibleoncogén, AIS, frecuentemente amplificadoen este tipo histológico26.

La primera y, hasta la fecha, única par-ticipación de la citogenética en el diagnós-tico de los tumores sólidos ha sido el estu-dio de la amplificación del oncogén ERBB2(17q12) mediante FISH. ErbB2 es una pro-teína transmembrana con actividad tirosínkinasa, cuya sobrexpresión se ha descritoen multitud de tumores, principalmente encarcinomas de mama. En esta neoplasia, lasobrexpresión de la proteína se asocia a unpeor pronóstico27. Recientemente se hadesarrollado un tratamiento específicopara los casos ErbB2 positivos, un anti-cuerpo monoclonal denominado Trastuzu-mab (Herceptin“), que en combinación conla quimioterapia tradicional mejora signifi-cativamente la supervivencia de lospacientes. Debido a los importantes efec-tos cardiotóxicos derivados del tratamien-to y su elevado coste, es esencial conse-guir una elevada sensibilidad yespecificidad en el diagnóstico de lasobrexpresión de ErbB2. En mama, lasobrexpresión de la proteína es resultadode la amplificación del gen en un 80% delos casos, por lo que la combinación delanálisis imnunohistoquímico rutinario dela proteína y la confirmación medianteFISH de los casos de sobrexpresión dudosaha mejorado sensiblemente la calidad deldiagnóstico28.

I. Zudaire y otros


La sobrexpresión de ErbB2 en cáncerde pulmón se ha descrito principalmenteen NSCLC con porcentajes que varíanentre el 5 y 50%, siendo mucho más fre-cuente en ADC y carcinomas de célulasgrandes (Large Cell Carcinoma; LCC) queen SCC29. La sobrexpresión en SCLC ha sidomucho menos estudiada, con porcentajesentre el 13 y el 30%30,31. A diferencia de loque ocurre en mama, existe una importan-te controversia respecto a la implicaciónde ErbB2 en la supervivencia de lospacientes con cáncer de pulmón. En elestudio de 187 NSCLC llevado a cabo porHirsch y col29 no se encontraron diferen-cias significativas en la supervivenciaentre los paciente positivos y negativospara la sobrexpresión de la proteína, aun-que se observó una ligera menor supervi-vencia en los pacientes con niveles 3 desobrexpresión32. Sin embargo, Potti y colen el estudio de 223 SCLC sí describieronuna menor supervivencia en los pacientesErbB2 positivos30.

Los primeros estudios mediante FISHde la amplificación del gen ERBB2 mues-tran que, a diferencia del cáncer de mama,la amplificación del gen en pulmón es muypoco frecuente (solo un 4% en NSCLC), deforma que sólo un 25% de los casos positi-vos para la sobrexpresión presentanamplificación del gen. La polisomía delcromosoma 17 es muy frecuente en NSCLC(alrededor de un 84% de los casos) y éstaparece no corresponderse con la sobrex-presión de la proteína32,33. La implicaciónde este gen en el pronóstico del cáncer depulmón todavía no se ha estudiado.

No hay estudios de amplificación entumores primarios de SCLC pero sí en líne-as celulares donde no se han descrito laamplificación de ERBB234.

No se ha desarrollado un protocoloestándar en pulmón que defina los crite-rios para la evaluación inmunohistoquími-ca y/o mediante FISH de este gen. Sinembargo, ya se están desarrollando ensa-yos en fase II y en fase III en pacientes conNSCLC con Trastuzumab en combinacióncon los tratamientos estándar de quimio-terapia29. Los primeros resultados indicanque los pacientes con NSCLC y niveles 3 desobrexpresión y/o amplificación del gen

presentan una mayor respuesta al trata-miento y mayor supervivencia; sin embar-go, dado el escaso número de pacientescon estas características, los resultadosson poco esclarecedores35.

Otros genes estudiados mediante latécnica de FISH en pulmón han sido MLL(11q23), cuya amplificación se ha asociadocon resistencia al tratamiento con inhibi-dores de la TOPOIIα36 y un posible gen rela-cionado con la represión de la expresiónde la telomerasa en 10p15.137.

Hibridación Genómica Comparada(CGH)

Debido a los problemas técnicos de lacitogenética convencional, una nueva téc-nica ha experimentado un enorme augeentre los tumores sólidos: la CGH. El fun-damento de esta técnica es el marcaje delADN en estudio mediante un fluorocromode emisión verde y de un ADN normal dereferencia con un fluorocromo de emisiónroja. Mezclados en cantidades equimole-culares, los dos ADNs se utilizan comosondas en la hibridación sobre una meta-fase normal. Cuando existe ganancia dematerial en la muestra test, en un cromo-soma (o en parte de él) se detectará en esazona una mayor intensidad verde; serároja en el caso de la detección de pérdidas.La cuantificación de esa diferencia deintensidades se realiza mediante un equi-po informático que calcula el cociente deintensidades verde/rojo a lo largo de cadacromosoma de la metafase38. Al igual que lacitogenética convencional, y a diferenciadel FISH convencional, la CGH tiene la ven-taja de que proporciona información detodo el genoma en un único experimentode hibridación. Además, permite trabajarcon el ADN del tumor sin tener que recu-rrir al tejido fresco. Su gran inconvenientees, sin embargo, el hecho de detectar úni-camente ganancias y pérdidas, pero noalteraciones equilibradas como transloca-ciones o inversiones.

Los trabajos de CGH en pulmón publi-cados hasta el momento describen altera-ciones recurrentes en un gran número decromosomas. En el carcinoma escamososon frecuentes las pérdidas en 2q, 3p, 3q,4q, 7p, 9q, 13q, 16q, 17p y 21q, así como lasganancias en 3q. Las ganancias en 1q23,



7p, 15q y 20q y la deleción en 6q, 13q, 18qy 19q22 se han asociado a adenocarcino-mas39. Los carcinomas de células pequeñasse caracterizan por pérdidas en 3p, 13q14-q21, 4p, 4q y 2q22-q24, mientras las ganan-cias afectan principalmente a 19p, 19q,1p31-p35, 17q22-q25 y 5p14-p15.3. De espe-cial interés es la descripción de regionesamplificadas en 1p32-p33 y 2p22-p24. En1p32 se localiza el gen LMYC y en 2p24.1NMYC, dos genes cuyas proteínas estánsobrexpresadas en este tipo histológico40.

En otro trabajo posterior, Petersen ycol describieron como alteraciones asocia-das al proceso metastático las pérdidas en3p12-p14, 3p21, 4p15-p16, 6q24-qter, 8p22-p23, 10q21-qter y 21q22, y las ganancias en1q21-q25, 8q, 9q34, 14q12 y 15q12-q1541.

La CGH también ha permitido describiralteraciones asociadas a quimiorresisten-cia. Amplificaciones en 11q23-qter, la pér-dida del cromosoma 17 y deleciones en2p14-pter y 2q23-q24 se presentan deforma específica en líneas celulares resis-tentes al tratamiento con VP16, un inhibi-dor de la Topoisomerasa IIα36.

A pesar de todas estas ventajas, la CGHsolamente se ha utilizado en el campo dela investigación. Es una técnica compleja,laboriosa, de elevado coste y que requierepersonal altamente cualificado, lo quehace inviable su utilización como técnicade cribado.

SKY y M-FISHLas técnicas de cariotipo spectral

(SKY)42 y multi-FISH43 están basadas en elpintado de los cromosomas del tumor conuna mezcla de 24 sondas fluorescentes quepermiten identificar cada cromosoma porsu color específico. Presenta todas las ven-tajas de la citogenética convencional, conla ventaja añadida de permitir caracterizartranslocaciones complejas y reordena-mientos crípticos que se escapan a la reso-lución de las bandas G. En tumores sóli-dos, su uso es limitado por la necesidad detrabajar con metafases de alta calidadobtenidas del tumor fresco. En pulmón latécnica de M-FISH se ha utilizado en elestudio de líneas celulares de NSCLC44. Losresultados obtenidos son de gran interésya que, mostraron como en pulmón, a dife-rencia de lo que ocurre en las neoplasias

hematológicas, son muy poco frecuenteslas translocaciones equilibradas, mientrasque se describieron un gran número dealteraciones numéricas y estructurales noequilibradas.

FICTIONLa técnica de FICTION consiste en la

detección simultánea de antígenos celula-res mediante inmunofluorescencia y dealteraciones cromosómicas mediante latécnica de FISH en un solo experimento dehibridación. El desarrollo de nuevas sus-tancias fluorescentes y nuevos sistemas defiltros ha permitido la puesta en marcha deuna variante, el M-FICTION, con el que pue-den llegar a detectarse simultáneamentehasta 5 alteraciones cromosómicas45. En elartículo de Martín Subero y col publicadoen esta revista se detalla el fundamentotécnico del FICTION46.

El FICTION es una técnica mucho másrápida y menos compleja que la citogenéti-ca convencional o el CGH. Además, dado elbajo porcentaje de células tumorales quecabe esperar en las muestras de esputo ylavado bronquial, la técnica del FICTIONresulta más apropiada por su elevada sen-sibilidad. En comparación con el FISH, elFICTION aporta la ventaja de poder identi-ficar el tipo celular que lleva la alteracióncitogenética, en medio de una poblaciónheterogénea de células.

Tal y como se ha mostrado en el artí-culo de Martín Subero y col, el FICTION haresultado de gran utilidad en el estudio deneoplasias hematológicas. Sin embargo,sólo se ha publicado un trabajo en tumo-res sólidos en el que se ha estudiado larelación existente entre la expresión delreceptor de estrógenos y la deleción delgen en 6 líneas celulares de cáncer demama47. No existe ningún trabajo previo deFICTION en carcinomas pulmonares.

ESTUDIOS CON TECNOLOGIAMICROARRAY

Las nuevas tecnologías de microchipstambién han sido puestas al servicio delcáncer de pulmón. Uno de los esfuerzosmás importantes realizados ha sido elestudio de Garber y col. El estudio de laexpresión de 24.000 elementos en unmicroarray de cDNA les permitió describir

I. Zudaire y otros


tres subgrupos de adenocarcinomas, conpatrones de expresión diferentes y diferen-cias significativas en la supervivencia48.

ESTUDIOS Y RESULTADOS PREVIOSOBTENIDOS HASTA LA FECHA

Tal y como hemos señalado anterior-mente, el objetivo de nuestro grupo de tra-bajo es la puesta a punto de la técnica deFICTION para el estudio de células exfolia-tivas en esputo y lavado broncoalveolar.

Para este proyecto, se han selecciona-do pacientes diagnosticados de carcinomaprimario de pulmón en estadios que per-mitan su resección quirúrgica.

Después de obtener el correspondienteconsentimiento informado, de cadapaciente se han obtenido muestras detumor primario, tejido “normal” adyacen-te, tejido normal distante, lavado bronco-alveolar, esputo y sangre. Como muestrascontrol, muestras de esputo y sangre deindividuos sanos y tejido pulmonar normalde autopsias por traumatismos. Los miem-bros clínicos del equipo de investigaciónse encargan de llevar a cabo esta parte delproyecto.

El primer paso para la puesta a puntode la técnica de FICTION es la optimiza-ción de protocolos de recogida de lasmuestras. Es imprescindible que la recogi-da se realice de forma estandarizada, deforma que los resultados del ensayo no sevean modificados por variaciones en lostiempos y procedimientos de extracción yconservación.

En segundo lugar, es imprescindible laidentificación de un marcador citoplasmá-tico que permita identificar las célulastumorales entre la población de célulasepiteliales normales, macrófagos, linfoci-tos, células orales, etc., que pueden pre-sentarse en las muestras. Con este objeti-vo, nuestro grupo está investigando elpapel de miembros de la familia hnRNP,miembros de la familia de cadherinas yfactores de crecimiento o sus receptorescomo potenciales marcadores específicospara el fenotipo tumoral.

En tercer lugar, la selección de los mar-cadores genéticos objeto de estudio.Basándonos en las alteraciones genéticas

recurrentes en cáncer de pulmón conoci-das por la bibliografía (Tabla 1), nuestroobjetivo es el estudio de las regiones 3p,9p21 (P16), 17p13 (TP53), 13q14 (RB1),8q24 (CMYC) y 2p23-24 (NMYC). Para algu-na de ellas existen sondas comercialescomo TP53, RB1, CMYC y NMYC. Sin embar-go, no están disponibles comercialmentesondas para otras regiones. Utilizando losrecursos bioinformáticos derivados delproyecto genoma humano, hemos diseña-do sondas de ADN para el estudio de losgenes VHL en 3p25.3, MLH1 en 3p22.3,PCBP4 en 3p21.1, FHIT en 3p14.2, DUTT1 en3p12.1 y CDKN2A/p16 en 9p21.

Los primeros ensayos realizados sehan llevado a cabo sobre líneas celularesde cáncer de pulmón. Esto ha permitidoestablecer las condiciones de fijación,tiempo y temperatura de los distintospasos de la técnica de FICTION. En la figu-ra 1 se muestra una imagen de FICTIONsobre células de la línea celular de ADCpulmonar H23. El antígeno de superficieutilizado fue el pull de citoqueratinasMNF116; para el estudio del número decromosomas 17 se utilizó una sonda alfasatélite de dicho cromosoma de Q-Biogeney como sonda para el estudio del gen TP53se utilizaron los BACs RPCI-11 199F11 yRPCI-11 404G1.

Actualmente hemos comenzado aponer a punto la tecnología FICTION enmuestras de lavado broncoalveolar depacientes, utilizando sondas dirigidas con-tra algunas de las regiones mencionadasmás arriba. Asimismo, estamos llevando acabo estudios correlativos de esos marca-dores genéticos, en concreto los localiza-dos en 3p, entre las muestras de célulasexfoliativas y las biopsias de los respecti-vos tumores pulmonares incluidas enparafina.

APLICACIONES PREVISTASEste proyecto se enmarca dentro de un

proyecto financiado por el V ProgramaMarco de la UE en el que participan untotal de 11 centros, representando a sietepaíses (España, Reino Unido, Francia,Dinamarca, Holanda, Italia y Alemania). Suobjetivo es la identificación de marcadoresmoleculares para la detección precoz del



cáncer de pulmón en individuos de altoriesgo. El estudio se está llevando a cabocon pacientes que ya han sufrido un pri-mer cáncer de pulmón o de cabeza y cue-llo. La razón de ello es que el riesgo deestos pacientes de desarrollar un nuevotumor pulmonar es muy alto, de 1 al 3%anual. El proyecto europeo propone larecogida de muestras a partir de más de1.000 individuos con alto riesgo de presen-

tar un segundo tumor primario de pulmón(unos 100 por cada centro que forma partedel proyecto) y hacer su seguimientodurante 5 años para estudiar periódica-mente en ellos una batería de marcadoresy técnicas de detección. El objetivo final esdeterminar los marcadores que puedanpredecir la aparición de un segundo tumorprimario de pulmón.

I. Zudaire y otros


Tabla 1. Resumen de las alteraciones citogenéticas más frecuentes descritas en cáncer de pulmón ylos genes presentes en las regiones afectadas.

*NSCLC: Non-Small Cell Lung Carcinoma. SCC: Squamous Cell Carcinoma. ADC: Adenocarcinoma. SCLC: Small CellLung Carcinoma.

TIPO PÉRDIDAS GENES GANANCIAS GENESHISTOLÓGICO*NSCLCSCC 2q 3q AIS

3p12.1 DUTT1 5p3p14.2 FHIT 8q3p21.1 PCBP4, ACY1, BAP1 17 ERBB23p21.31 RASSF1A, HMLH1,

SEMA3B/SEMA3F, FUS1, CACNA2D2, H37/RBM5,

101F63p24 RARb3p25 VHL, hOGG13q4q7p9p CDKN2A/ p169q13q16q17p TP5321q

ADC 6q 1q13q RB1 7p EGFR18q BCL2 11q23-qter MLL

19q22 15q20q

SCLC 2q22-q24 1p31-p35 LMYC3p 2p22-p24 NMYC4p 5p14-p15.34q 8q CMYC

13q14-q21 RB1 17q22-q2519p NOTCH319q

Por ahora, ninguno de los biomarcado-res que se han estudiado en cáncer de pul-món ha sido validado en series suficiente-mente numerosas de pacientes. Lacooperación entre un número tan impor-tante de centros es, por lo tanto, esencialpara conseguir una serie con el suficientetamaño como para obtener resultadosestadísticamente significativos. Además,el estudio de un número alto de pacientespermitirá estandarizar los protocolos derecogida, procesamiento, almacenamientoy análisis de las muestras.

Los resultados preliminares son alen-tadores; es de esperar que los nuevoshallazgos permitan disponer de herra-mientas eficaces para una detección másprecoz del carcinoma pulmonar. El desa-rrollo de nuevos biomarcadores puedecomplementar la eficacia de las estrate-gias radiológicas para la detección pre-coz, que están ya siendo evaluadas enensayos randomizados. Si finalmente sedemuestra que los protocolos de detec-ción precoz reducen la mortalidad porcáncer de pulmón, se habrá dado un pasode gigante en la batalla contra la epidemiade cáncer de pulmón que está viviendo lasociedad occidental desde mediados delsiglo XX.

BIBLIOGRAFÍA1. PASTORINO U. Lung cancer: diagnosis and

surgery. EJC 2001; 37 (7 Suppl): 75S-90S.

2. ZULUETA J, MONTUENGA JM. Detección precozde cáncer de pulmón: el momento oportuno.Med Clin (Barc) 2002; 118: 460-462.

3. HENSHCKE CI, MACCAULEY DI, YANKELEVITZ DF,NAIDICH DP, MCGUINESS G, MIETTINEN OS et al.Early Lung Cancer Action Project: overalldesign and findings from baseline screening.Lancet 1999; 354: 99-105.

4. SACCOMANNO GA, AUERBACH O, SAUNDERS RP,BRENNAN LM. Development of carcinoma ofthe lung as reflected in exfoliated cells.Cancer (Phila) 1974; 32: 256-370.

5. TOCKMAN MS, MULSHINE JL. The earlydetection of occult lung cancer. ChestSurg Clin N Am 2000; 10: 737-749.

6. SOZZI G. Molecular biology of lung cancer.EJC 2001; 37 (7 Suppl): 63S-73S.

7. WEBER-MATTHIESEN K, WINKEMANN M, MÜLLER-HERMELINK A, SCHLEGELBERGER B, GROTE W.Simultaneous fluorescenceimmunophenotyping and interphasecytogenetics: a contribution to thecharacterization of tumor cells. J HistochemCytochem 1992; 40: 171-175.

8. CALASANZ MJ. Revisión de técnicas decitogenética convencional y molecular y suimplicación en el diagnóstico y pronósticodel cáncer. ANALES Sis San Navarra 2001; 24:17-29.

9. JAMES LA. Comparative genomichybridization as a tool in tumourcytogenetics. J Pathol 1999. 187: 385-395.



Figura 1. (A) Imagen de FICTION sobre la línea celular de ADC H23. La tinción azul corresponde al antí-geno de superficie MNF116. La señal roja corresponde al gen TP53 y la verde al cromosoma17. (B) Imagen en blanco y negro resultado de la inversión del color de la figura 1.A, que per-mite distinguir el contorno nuclear.

A Bcitoplasma

núcleo

10.JOHANSSON M, JIN Y, MANDAHL N, HAMBRAEUS G,JOHANSSON L, MITELMAN F et al. Cytogeneticanalysis of short-term cultured squamouscell carcinomas of the lung. Cancer GenetCytogenet 1995; 81: 46-55.

11. TESTA JR, LIU Z, FEDER M, BELL DW, BALSARA B,CHENG JQ et al. Advances in the analysis ofchromosome alterations in human lungcarcinomas. Cancer Genet Cytogenet 1997;95: 20-32. Review.

12. FEDER M, SIEGFRIED JM, BALSHEM A, LITWIN S,KELLER SM, LIU Z et al. Clinical relevance ofchromosome abnormalities in non-small celllung cancer. Cancer Genet Cytogenet 1998;102: 25-31.

13. LUKEIS R, BALL D, IRVING L, GARSON OM,HASTHORPE S. Chromosome abnormalities innon-small cell lung cancer pleural effusionscytogenetic indicators of disease subgroups.Genes Chromosomes Cancer 1993; 8: 262-269.

14. HIBI K, TAKAHASHI T, YAMAKAWA K, UEDA R, SEKIDOY, ARIYOSHI Y et al. Three distinct regionsinvolved in 3p deletion in human lungcancer. Oncogene 1992; 7: 445-449.

15. ZÖCHBAUER-MÜLLER S, GAZDAR AF, MINNA JD.Molecular pathogenesis of lung cancer. AnnuRev Physio 2002; 64: 681-708.

16. CABALLERO OL, COHEN D, LIU Q, ESTELLER M,BONACUM J, WHITE P et al. Loss ofchromosome arms 3p and 9p andinactivation of P16 (INK4a) in normalepithelium of patients with primary lungcancer. Genes Chromosomes Cancer 2001;32: 119-125.

17. UEMATSU K, YOSHIMURA A, GEMMA A, MOCHIMARUH, HOSOYA Y, KUNUGI S et al. Aberrations in thefragile histidine triad (FHIT) gene inidiopathic pulmonary fibrosis. Cancer Res2001; 61: 8527-8533.

18. JI L, NISHIZAKI M, GAO B, BURBEE D, KONDO M,KAMIBAYASHI C et al. Expression of severalgenes in the human chromosome 3p21.3homozygous deletion region by anadenovirus vector results in tumorsuppressor activities in vitro and in vivo.Cancer Res 2002; 62: 2715-2720.

19. WISTUBA II, BEHRENS C, VIRMANI AK, MELE G,MILCHGRUB S, GIRARD L et al. High resolutionchromosome 3p allelotyping of human lungcancer and preneoplastic/preinvasivebronchial epithelium reveals multiple,discontinuos sites of 3p allele loss and threeregions of frequent breakpoints. Cancer Res2000; 60: 1949-1960.

20. GIRARD L, ZÖCHBAUER-MÜLLER S, VIRMANI AK,GAZDAR AF, MINNA JD. Genome-wide

allelotyping of lung cancer identifies newregions of allelic loss differences betweensmall cell lung cancer and non-small celllung cancer, and loci clusering. Cancer Res2000; 60: 4894-4906.

21. OH JJ, WEST AR, FISHBEIN MC, SLAMON DJ. Acandidate tumor suppressor gene, h37, fromthe human lung cancer tumor suppressorlocus 3p21.3. Cancer Res 2002; 62: 3207-3213.

22. XIANG R, DAVALOS AR, HENSEL CH, ZHOU XJ, TSEC, NAYLOR SL. Semaphorin 3F gene fromhuman 3p21.3 suppresses tumor formationin nude mice. Cancer Res 2002; 62: 2637-2643.

23. DAMMANN R, TAKAHASHI T, PFEIFER GP. The CpGisland of the novel tumor suppressor geneRASSF1A is intensely methylated in primarysmall cell lung carcinomas. Oncogene 2001;20: 3563-3567.

24. CHEN JT, CHEN YC, WANG YC, TSENG RC, CHENCY, WANG YC. Alterations of the p16(ink4a)gene in resected nonsmall cell lung tumorsand exfoliated cells within sputum. Int JCancer 2002; 98: 724-731.

25. KETTUNEN E, EL-RIFAI W, BJORKQVIST AM, WOLFFH, KARJALAINEN A, ANTTILA S et al. A broadamplification pattern at 3q in squamous celllung cancer-a fluorescence in situhybridization study. Cancer Genet Cytogenet2000; 117: 66-70.

26. HIBI K, TRINK B, PATTURAJAN M, WESTRA WH,CABALLERO OL, HILL DE et al. AIS is anoncogene amplified in squamous cellcarcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97:5462-5467.

27. HAYES DF, THOR AD. c-erbB-2 in breast cancer:development of a clinically useful marker.Semin Oncol 2002; 29: 231-245.

28. MCCORMICK SR, LILLEMOE TJ, BENEKE J,SCHRAUTH J, REINARTZ J. HER2 assessment byimmunohistochemical analysis andfluorescence in situ hybridization:comparison of HercepTest and PathVysioncommercial assays. Am J Clin Pathol 2002;117: 935-943.

29. HIRSCH FR, FRANKLIN WA, BUNN PA JR. What isthe role of Her-2/neu and trastuzumab(Herceptin“) in lung cancer? Lung cancer2002; 36: 263-264.

30. POTTI A, WILLARDSON J, FORSEEN C, KISHOR GANTIA, KOCH M, HEBERT B et al. Predictive role ofHER-2/neu overexpression and clinicalfeatures at initial presentation in patientswith extensive stage small cell lungcarcinoma. Lung Cancer 2002; 36: 257-261.

31. MICKE P, HENGSTLER JG, ROS R, BITTINGER F, METZT, GEBHARD S et al. c-erbB-2 expression in

I. Zudaire y otros


small-cell lung cancer is associated withpoor prognosis. Int J Cancer 2001; 92: 474-479.

32. HIRSCH FR, VARELLA-GARCÍA M, FRANKLIN WA,VEVE R, CHEN L, HELFRICH B et al. Evaluation ofHER-2/neu gene amplification and proteinexpression in non-small cell lungcarcinomas. Br J Cancer 2002; 86: 1449-1456.

33. COX G, VYBERG M, MELGAARD B, ASKAA J, OSTERA, O’BYRNE KJ. Herceptest: HER2 expressionand gene amplification in non-small cell lungcancer. Int J Cancer 2001; 92: 480-483.

34. BUNN PA JR, HELFRICH B, SORIANO AF, FRANKLINWA, VARELLA-GARCÍA M, HIRSCH FR et al.Expression of Her-2/neu in human lungcancer cell lines by immunohistochemistryand fluorescence in situ hybridization andits relationship to in vitro cytotoxicity bytrastuzumab and chemotherapeutic agents.Clin Cancer Res 2001; 7: 3239-3250.

35. ZINNER RG, KIM J, HERBST RS. Non-small celllung cancer clinical trials with trastuzumab:their foundation and preliminary results.Lung Cancer 2002; 37: 17-27.

36. STRUSKI S, DOCO-FENZY M, TRUSSARDI A, MASSONL, GRUSON N, ULRICH E et al. Identification ofchromosomal loci associated with non-P-glycoprotein-mediated multidrug resistanceto topoisomerase II inhibitor in lungadenocarcinoma cell line by comparativegenomic hybridization. GenesChromosomes Cancer 2001; 30: 136-142.

37. MIURA N, ONUKI N, RATHI A, VIRMANI A,NAKAMOTO S, KISHIMOTO Y et al. hTR repressor-related gene on human chromosome10p15.1. Br J Cancer 2001; 85: 1510-1514.

38. KALLIOMIEMI A, KALLIOMIEMI OP, SUDAR D,RUTOVITZ D, GRAY JW, WALDMAN F et al.Comparative genomic hybridization formolecular cytogenetic analysis of solidtumors. Science 1992; 258: 818-821.

39. LUK C, TSAO MS, BAYANI J, SHEPHERD F, SQUIRE JA.Molecular cytogenetic analysis of non-smallcell lung carcinoma by spectral karyotypingand comparative genomic hybridization.Cancer Genet Cytogenet 2001; 125: 87-99.

40. LUI WO, TANENBAUM DM, LARSSON C. High levelamplification of 1p32-33 and 2p22-24 in small

cell lung carcinomas. Int J Oncol 2001; 19:451-457.

41. PETERSEN S, ANINAT-MEYER M, SCHLUNS K,GELLERT K, DIETEL M, PETERSEN I. Chromosomalalterations in the clonal evolution to themetastatic stage of squamous cellcarcinomas of the lung. Br J Cancer 2000; 82:65-73.

42. SHROCK E, DU MANOIR S, VELDMAN T, SHOELL B,WIENBERG J, FERGUSON-SMITH MA et al.Multicolor spectral karyotyping of humanchromosomes. Science 1996; 273: 494-497.

43. SPEICHER MR, GWYN-BALLARD S, WRAD DC.Karyotyping human chromosomes bycombinatorial multi-fluor FISH. Nat Genet1996; 12: 368-375.

44. SPEICHER MR, PETERSEN S, UHRIG S, JENTSCH I,FAUTH C, EILS R et al. Analysis ofchromosomal alterations in Non-small celllung cancer by multiplex-FISH, comparativegenomic hybridization, and multicolour barcoding. Lab Invest 2000; 80: 1031-1041.

45. MARTIN-SUBERO JI, CHUDOBA I, HARDER L, GESK S,NOVO FJ, CALASANZ MJ et al. Multicolor-FICTION: Expanding the possibilities ofcombined morphologic, immunophenotypicand genetic single cell analyses. Am J Pathol(en prensa).

46. MARTIN-SUBERO I, SIEBER R, CALASANZ MJ.FICTION convencional y multicolor comoherramientas para el estudiointerdisciplinar de las neoplasiashematológicas. Enviado a ANALES Sis SanNavarra.

47. ZHANG Y, SIEBERT R, MATTHIESEN P, HARDER S,THEILE M, SCHERNECK S et al. Feasibility ofsimultaneous fluorescenceimmunophenotyping and fluorescence insitu hybridization study for the detection ofestrogen receptor expression and deletionsof the estrogen receptor gene in breastcarcinoma cell lines. Virchows Arch 2000;436: 271-275.

48.GARBER ME, TROYANSKAYA OG, SCHLUENS K,PETERSEN S, THAESLER Z, PACYNA-GENGELBACH Met al. Diversity of gene expression inadenocarcinoma of the lung. Proc Natl AcadSci USA 2001; 98: 13784-13789.



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